WO2005005433A1 - 高カルシウム血症および骨疾患治療剤 - Google Patents

高カルシウム血症および骨疾患治療剤 Download PDF

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Kiyotaka Machida
Takeshi Shimizu
Tadashi Nakata
Toshimasa Shinki
Je-Tae Woo
Kazuo Nagai
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Chubu University
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a novel therapeutic agent for hypercalcemia and bone disease.
  • osteoblasts The amount and function of bone are maintained by a balance between bone formation by osteoblasts and bone resorption (bone destruction) by osteoclasts.
  • Osteoporosis a rapidly increasing number of patients in an aging society, is a disease in which bone metabolism is disrupted due to excessive bone resorption by activated mature osteoclasts, resulting in bone loss. .
  • Non-hormonal drugs that can directly suppress the function of osteoclasts, which are factors of bone resorption, can be expected as clinical drugs with few side effects.
  • a non-hormonal therapeutic agent for bone diseases a therapeutic agent for bone diseases containing riveromycins as an active ingredient is known (see JP-A-7-223945).
  • JP-A-7-223945 a therapeutic agent for bone diseases containing riveromycins as an active ingredient.
  • further development of a therapeutic agent for bone disease is desired.
  • the present invention meets the above-mentioned demands, and has an object to provide a novel therapeutic agent for hypercalcemia and bone disease and a novel compound which can be used as an active ingredient of the therapeutic agent.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, a specific derivative of the natural compound Liberomycin A and a Liberomycin A derivative newly developed based on Liberomycin A have been matured.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • R represents a hydroxyl-protecting group capable of leaving under acidic conditions.
  • a therapeutic agent for hypercalcemia or bone disease comprising a riveromycin A derivative represented by the formula or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a therapeutic agent for hypercalcemia or bone disease comprising the riveromycin A derivative or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to (3) as an active ingredient.
  • the riveromycin A derivative used in the therapeutic agent of the present invention is a compound represented by the following general formula (I) and a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • R represents a hydroxyl-protecting group capable of leaving under acidic conditions.
  • the “protecting group for hydroxyl group” is not particularly limited as long as it is an atomic group capable of temporarily protecting the hydroxyl group from various reactions.
  • the phrase "can be eliminated under acidic conditions” means that the protecting group can be eliminated under acidic conditions, and the protective groups are more neutral under neutral conditions than under acidic conditions. It means that it is difficult to detach.
  • "removable under acidic conditions” means that the protecting group can be removed under an acidic environment created by mature osteoclasts and the like, Under a neutral environment where cells exist, it means that the protecting group is more difficult to be removed.
  • the phrase "protective group is less likely to be removed under neutral conditions” means that the protective group is preferably stable and hardly removed under neutral conditions.
  • the phrase "can be eliminated under acidic conditions” means, for example, that a protective group is eliminated under acidic conditions of pH 4.0 or less, and almost no protective group is eliminated under neutral conditions of pH 7.0.
  • the protecting group “removable under acidic conditions” that can be used in the present invention can be selected, for example, by the following method.
  • the reveromycin A derivative, whose hydroxyl group at position 5 is protected with the protecting group to be tested, is administered to cells that create an acidic environment such as mature osteoclasts and cells that exist in a neutral environment such as osteoclast precursor cells.
  • the cell death inducing activity is measured by counting the number of viable cells or the MTT method, etc., and a derivative that exhibits a higher cell death inducing activity for cells that create an acidic environment than cells that exist in a neutral environment is selected.
  • an acyl group, an alkyl group, a silyl group, or the like can be used, and preferably, an asinole group or a silyl group can be used. More specifically, the alkyl group such as formyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, valeryl group, isovaleryl group, hexanoyl group, etc.
  • Alkyl groups such as alkyl groups such as tetrahydroviranyl group; ethoxyxyl group and methoxymethyl group; arylalkyl (aralkyl) groups such as benzyl group; alkylthioalkyl groups such as methylthiomethyl group;
  • alkyl groups such as alkyl groups such as tetrahydroviranyl group; ethoxyxyl group and methoxymethyl group; arylalkyl (aralkyl) groups such as benzyl group; alkylthioalkyl groups such as methylthiomethyl group;
  • alkyl groups such as alkyl groups such as tetrahydroviranyl group; ethoxyxyl group and methoxymethyl group; arylalkyl (aralkyl) groups such as benzyl group; alkylthioalkyl groups such as methylthiomethyl group;
  • riveromycin A derivative used in the therapeutic agent of the present invention is represented by the general formula:
  • the derivative is a riveromycin A derivative in which R is a tert-butyldimethylsilyl group.
  • Another preferred form of the riveromycin A derivative used in the therapeutic agent of the present invention is a novel riveromycin A derivative in which R is an acetyl group in general formula (I).
  • a pharmaceutically acceptable salt of a riveromycin A derivative can also be used.
  • Pharmaceutically acceptable salts include, for example, minerals such as hydrochlorides and sulfates. Acid salts; or organic acid salts such as P-toluenesulfonate; metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt; ammonium salts; organic ammonium salts such as methyl ammonium salts; amino acids such as glycine salts Power that can include salt etc. It is not limited to these.
  • the riveromycin A derivative represented by the general formula (I) has a plurality of asymmetric carbons, and may further have one or more asymmetric carbons depending on the type of the substituent.
  • the power of the presence of stereoisomers such as optical isomers or diastereomers based on these asymmetric carbons
  • a mixture or racemate of any stereoisomers is used be able to.
  • Liberomycin A derivatives may have olefinic double bonds in some cases, and there are geometric isomers based on double bonds.
  • any geometric isomers A mixture of the above can also be used in the present invention.
  • the riveromycin A derivative used in the present invention can exist in any crystal form, and may exist as a hydrate or solvate. These substances can also be used in the present invention.
  • the structure of a specific reveromycin A derivative having an effective activity as the therapeutic agent of the present invention has been elucidated by the present invention, and thus known methods, for example, bioorganic and 'medicinal' It can be produced by a method for producing a reveromycin A derivative described in Chemistry's Letters (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Vol. 12, pp 3363-3366 (2002)) or the like and ordinary organic synthesis techniques.
  • specific examples of the method for synthesizing the compound used as the therapeutic agent of the present invention are described, and these synthetic methods can also be referred to.
  • the therapeutic agent of the present invention is a drug containing a specific Liberomycin A derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and is used for the treatment of hypercalcemia and bone disease, and Or can be used for prevention.
  • Bone diseases include both endogenous bone diseases such as bone loss and extrinsic bone diseases such as physical fractures.
  • the drug of the present invention is used for treating and / or preventing the above bone diseases, or for treating the above bone diseases. Can be used to shorten the treatment period.
  • Endogenous bone diseases include excessive formation of osteoclasts in vivo and
  • bone diseases include osteoporosis, bone disease-related hypercalcemia, bone page et al disease, osteoclastoma, osteosarcoma, arthropathy, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, primary These include hyperthyroidism, osteopenia, osteoporosis, osteomalacia, traumatic fractures, fatigue fractures, or weakening and fractures of bone tissue due to other diseases such as malnutrition and malignancy. However, it is not limited to these.
  • the therapeutic agent of the present invention is suitably used for treating and preventing or preventing hypercalcemia and bone disease induced by vitamin D, IL-11 or parathyroid hormone.
  • the administration method, dosage form, and dosage of the therapeutic agent of the present invention can be appropriately determined in accordance with the usual pharmaceutical techniques according to the purpose of use.
  • animals such as humans for the purpose of treatment or prevention, they are administered orally as powders, granules, tablets, capsules, pills, solvents, etc., or as injections, suppositories, transdermal absorbents, etc. It can be administered parenterally as an inhalant or the like.
  • the effective amount of the riveromycin A derivative used in the therapeutic agent of the present invention may be selected from excipients, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants and the like suitable for the dosage form according to ordinary pharmaceutical techniques.
  • These pharmaceutical additives can be mixed as necessary to obtain a pharmaceutical preparation.
  • the preparation is prepared by sterilizing with an appropriate carrier.
  • the dose varies depending on the disease state, route of administration, age and weight of the patient, and is ultimately left to the discretion of the physician. However, when administered to an adult orally as an active ingredient, it is usually 20-500. mg / kg / day, preferably 50-300 mg / kg / day, when administered parenterally, usually 10-300 mg / kg / day, preferably 20-200 mg / kg / day. This may be administered once or in several divided doses.
  • derivatives in which the hydroxyl group at position 5 of Liberomycin A is protected with an appropriate protecting group have a weak cell killing activity S at neutral pH, and are strong against mature osteoclasts that create an acidic environment. It acts as a prodrug having various apoptosis-inducing activities. These derivatives show an excellent selective osteoclast apoptosis-inducing effect, such as a lower apoptosis-inducing activity on cells other than mature osteoclasts. The high selectivity for activated mature osteoclasts suggests that the side effects of these riveromycin A derivatives are minor.
  • riveromycin A derivative capable of inducing selective cell death to mature osteoclasts responsible for bone resorption was found.
  • These riveromycin A derivatives can effectively suppress bone resorption due to parathyroid hormone, and their effects are more persistent than calcitonin, etc., resulting in excessive activation of osteoclasts. It can be expected as an effective therapeutic agent for bone diseases and hypercalcemia induced by such factors.
  • Ph P triphenylphosphine
  • pyrrolidine 7.3 ⁇ ⁇
  • Extract with CO neutralize the aqueous layer with 2N HC1, extract with EtOAc, and wash the organic layer with saturated brine.
  • TRAP tartarate resistant acid phosphatase
  • RAW264 cells were seeded at 40,000 cells / 100 ⁇ l in a 96-well plate, cultured for 24 hours, added with 50 ⁇ l of a medium containing a 3 times concentration of drug, cultured for 24 hours, and examined for cell death inducing activity.
  • MTT-PBS phosphate buffered saline
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the active ED is 24 and acts with high selectivity on mature osteoclasts.
  • riveromycin ⁇ derivatives (compounds 2 and 27) did not inhibit the growth of osteoclast precursor RAW264 even at relatively high concentrations, and were selective for mature osteoclasts. Apoptosis-inducing effect was shown.
  • the surrounding environment becomes acidic due to the secretion of protons by mature osteoclasts, but it is possible that in the acidic environment, the modifying group was eliminated by hydrolysis and returned to the hydroxyl group.
  • the long bones of the forelimbs were removed.
  • the extracted long bone was used as a culture medium in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing 15% heat-inactivated poma serum and 100 U / ml penicillin, and bone absorption factor (PTH 10 " 8 M, IL- 1 0.3 ng / ml, vitamin D 10- 8 M) and reveromycin A derivatives
  • the bone resorption inhibiting effect of the riveromycin A derivative was assayed by measuring the concentration of serum calcium released into the blood by the bone resorption action. After performing thyroid parathyroidectomy (TPTX) on SD rats and confirming a decrease in serum calcium the following day, parathyroid hormone was
  • Rats exhibiting hypercalcemia due to enhanced bone resorption were produced by continuous infusion of (PTH).
  • the present invention provides a novel therapeutic agent for hypercalcemia and bone disease, and a novel compound that can be used as an effective component of the therapeutic agent.

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Description

明 細 書
高カルシウム血症および骨疾患治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、新規な高カルシウム血症および骨疾患治療剤に関する。
背景技術
[0002] 骨の量と機能は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収 (骨破壊）のバラ ンスによって維持されている。高齢化社会の中で患者数が急速に増加しつつある骨 粗鬆症は、活性化した成熟破骨細胞による過剰な骨吸収により骨代謝のバランスが 破綻し、骨量が減少する疾患である。
[0003] 骨粗鬆症の治療薬としての骨吸収抑制剤としては、現在のところ女性ホルモンであ るェストロジェンなどがあり、治療方法としてはこれを直接投与する方法があるが、こ の方法は重篤な副作用を引き起こすことが欠点である。また、ェストロジェンは甲状 腺ホルモンであるカルシトニンの分泌を促進することにより骨吸収を抑制すると考えら れており、カルシトニンなどのペプチドホルモン製剤なども骨吸収抑制剤として使用さ れている。し力 ながら、ペプチドホルモン製剤は、その骨吸収抑制効果の持続性が 短いことや、アレルギーなどの過敏性体質の患者には使用しにくいなどの欠点がある 。従って、これらに代わる新たな骨疾患治療剤の開発が望まれている。
[0004] 骨吸収の要因である破骨細胞の働きを直接抑制できる非ホルモン系の薬剤は、副 作用の少ない臨床薬として期待できる。非ホルモン系の骨疾患治療剤としては、リベ ロマイシン類を有効成分とする骨疾患治療剤が知られている（特開平 7—223945号 を参照）。しかしながら、さらなる骨疾患治療剤の開発が望まれている。
[0005] 上述のとおり、生体内において、骨密度が減少する骨疾患の原因は破骨細胞によ る過剰の骨吸収による。生体内において、例えば、副甲状腺ホルモン（Parathyroid Hormone： PTH)は、破骨細胞の分化を促進するとともに成熟破骨細胞の活性化を 誘導する。従って、副甲状腺ホルモンが作用する破骨細胞に作用する薬剤、例えば 、骨吸収の働きを担う破骨細胞の形成を抑制する薬剤、あるいは破骨細胞の機能を 阻害する薬剤などの開発は、骨粗鬆症などの骨疾患の治療剤、またさらに高カルシ ゥム血症などの治療剤としての臨床応用が大いに期待される。
発明の開示
[0006] 本発明は、上記の希求に応えるものであり、新規な高カルシウム血症および骨疾患 治療剤、該治療剤の有効成分として用いられ得る新規化合物の提供を課題とする。
[0007] 本発明者は、上記課題の解決のために鋭意検討した結果、天然化合物リベロマイ シン Aの特定の誘導体、およびリベロマイシン Aを基に新たに開発されたリベロマイシ ン A誘導体が、成熟破骨細胞に選択的な細胞死を誘導することによって骨吸収作用 を抑制する事実を新たに見いだした。また、これらのリベロマイシン A誘導体が、生体 内にぉレ、て最も重要な骨吸収システムである副甲状腺ホルモン依存的骨吸収を効 果的に抑制できる事実を新たに見いだした。このような知見から、これらのリベロマイ シン A誘導体を高カルシウム血症および骨疾患治療剤として使用できることを見出し 、本発明を完成するに至った。
[0008] すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
(1) 下記一般式 (I)
[0009] [化 1]
Figure imgf000004_0001
(式中、 Rは酸性条件下で脱離し得る水酸基の保護基を示す。 )
で表されるリベロマイシン A誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とす る高カルシウム血症または骨疾患治療剤。
(2) —般式 (I)におレ、て、 R力 Stert-プチルジメチルシリル基である（1)に記載の治療 剤。
(3) 下記一般式 (II) [0011] [化 2]
Figure imgf000005_0001
[0012] で示されるリベロマイシン A誘導体またはその薬学的に許容される塩。
(4) (3)に記載のリベロマイシン A誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効 成分とする高カルシウム血症または骨疾患治療剤。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 以下、本発明を詳細に説明する。
(1)本発明の治療剤に用いられるリベロマイシン A誘導体
本発明の治療剤に用いられるリベロマイシン A誘導体は、下記一般式 (I)で表され る化合物およびその薬学的に許容される塩である。
[0014] [化 3]
Figure imgf000005_0002
[0015] 式中、 Rは酸性条件下で脱離し得る水酸基の保護基を示す。
本発明において「水酸基の保護基」とは、水酸基を一時的に種々の反応から保護 することができる原子団であれば特に限定されない。
[0016] また、本発明において「酸性条件下で脱離し得る」とは、保護基が酸性条件下で脱 離可能であって、中性条件下においては酸性条件下における場合と比較してより脱 離しにくいことを意味する。好ましくは、「酸性条件下で脱離し得る」とは、成熟破骨細 胞などにより作り出される酸性環境下において保護基が脱離可能であって、通常の 細胞が存在する中性環境下においては保護基がより脱離しにくいことを意味する。な お、「中性条件下において保護基がより脱離しにくい」とは、好ましくは中性条件下に おいて保護基が安定でほとんど脱離しないことを意味する。具体的には、「酸性条件 下で脱離し得る」とは、例えば pH4. 0以下の酸性条件下において保護基が脱離し、 PH7. 0の中性条件下において保護基がほとんど脱離しないことを意味する。本発明 に用いることができる「酸性条件下で脱離し得る」保護基は、例えば次のような方法で 選択することができる。試験する保護基で 5位の水酸基を保護したリベロマイシン A誘 導体を、成熟破骨細胞などの酸性環境を作り出す細胞、および破骨細胞前駆細胞 などの中性環境下に存在する細胞に投与し、生存細胞数の計測または MTT法など により細胞死誘導活性を測定し、酸性環境を作り出す細胞に対し、中性環境に存在 する細胞よりもより高い細胞死誘導活性を示す誘導体を選択する。
[0017] Rとしては、ァシル基、アルキル基またはシリル基などを用いることができ、好ましく はアシノレ基またはシリル基を用いることができる。より具体的には、アシノレ基としては ホルミル基、ァセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、 イソバレリル基、へキサノィル基などのアルキルカルボニル基など、アルキル基として はメチル基、ェチル基などのアルキル基；テトラヒドロビラニル基；エトキシェチル基、 メトキシメチル基などのアルコキシアルキル基；ベンジル基などのァリールアルキル（ ァラルキル）基；メチルチオメチル基などのアルキルチオアルキル基など、シリル基と しては tert-ブチルジフヱニルシリル基、 tert-ブチルジメチルシリル基、トリエチノレシリ ル基、トリイソプロビルシリル基、ジメチルェチルシリル基などを用いることができる力 これらに限定されることはない。
[0018] 本発明の治療剤に用いられるリベロマイシン A誘導体の好ましい一形態は、一般式
(I)において、 Rが tert-ブチルジメチルシリル基であるリベロマイシン A誘導体である
[0019] 本発明の治療剤に用いられるリベロマイシン A誘導体の別の好ましい一形態は、一 般式 (I)において、 Rがァセチル基である新規リベロマイシン A誘導体である。
[0020] 本発明の治療剤においてはリベロマイシン A誘導体の薬学的に許容される塩も用 レ、ることができる。薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩などの鉱 酸塩；又は P-トルエンスルホン酸塩などの有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩、カルシ ゥム塩などの金属塩；アンモニゥム塩;メチルアンモニゥム塩などの有機アンモニゥム 塩;グリシン塩などのアミノ酸塩などを挙げることができる力 これらに限定されること はない。
[0021] 一般式 (I)で表されるリベロマイシン A誘導体は複数の不斉炭素を有しており、また 置換基の種類によりさらに 1個以上の不斉炭素を有する場合がある。これらの不斉炭 素に基づく光学異性体またはジァステレオマーなどの立体異性体が存在する力 本 発明においては純粋な形態の立体異性体のほか、任意の立体異性体の混合物また はラセミ体などを用いることができる。また、リベロマイシン A誘導体にはォレフイン性 の二重結合を有する場合も存在し、二重結合に基づく幾何異性体が存在するが、純 粋な形態の幾何異性体のほか、任意の幾何異性体の混合物も本発明に用いること ができる。本発明に用いられるリベロマイシン A誘導体は任意の結晶形として存在す ること力 Sでき、水和物または溶媒和物として存在する場合もある。これらの物質につい ても本発明に用いることができる。
[0022] リベロマイシン Aについては公知方法及びそれに準ずる方法、例えば特公平 6— 33 271号公報、及びジャーナル.ォブ.アンチバイオテイクス（Journal of Antibiotics Vol. 45, No. 9， ppl409-1413 (1992))に記載されているリベロマイシン A生産菌を培養し 、リベロマイシン Aを採取する方法により製造することができる。
[0023] リベロマイシン A誘導体については、本発明により本発明の治療剤として有効な活 性を有する特定のリベロマイシン A誘導体の構造が明らかにされたため、公知方法、 例えばバイオオーガニック ·アンド'メデイシナル 'ケミストリー'レターズ（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Vol. 12, pp3363-3366 (2002))などに記載されているリ ベロマイシン A誘導体の製造方法および通常の有機合成手法により製造することが できる。なお、本発明の実施例には、本発明の治療剤として用いられる化合物の合 成手法の具体例が記載されており、これらの合成手法も参照することができる。
[0024] (2)本発明の高カルシウム血症および骨疾患治療剤
本発明の治療剤は、特定のリベロマイシン A誘導体またはその薬学的に許容される 塩を有効成分とする薬剤であり、高カルシウム血症ならびに骨疾患の治療および Z または予防のために使用することができる。骨疾患としては、骨量減少等の内因性骨 疾患、及び物理的骨折等の外因性骨疾患の両方を含み、本発明の薬剤は上記骨 疾患の治療及び/又は予防、あるいは上記骨疾患の治療期間の短縮のために使用 すること力 sできる。内因性骨疾患としては、生体内での破骨細胞の過剰な形成及び
/又は過剰な機能を伴う全ての疾患が包含される。骨疾患の具体例としては、骨粗 鬆症、骨疾患関連性高カルシウム血症、骨ページエツト病、破骨細胞腫、骨肉腫、関 節症、慢性関節リウマチ、変形性骨炎、原発性甲状腺機能亢進症、骨減少症、骨多 孔症、骨軟化症、外傷性骨折、疲労骨折、又は栄養障害、悪性腫瘍など他の疾病が 原因による骨組織の脆弱化及び骨折などが挙げられるが、これらに限定されるわけ ではない。本発明の治療剤は、ビタミン D、 IL一 1または副甲状腺ホルモンにより誘導 される高カルシウム血症および骨疾患の治療および Zまたは予防のために好適に用 いられる。
[0025] 本発明の治療剤は、その使用目的にあわせて通常の薬学的手法に準じて投与方 法、剤型、投与量を適宜決定することが可能である。例えば治療あるいは予防を目 的としてヒトなどの動物に投与する場合は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、 溶剤等として経口的に、または注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等として非経口 的に投与することができる。また、本発明の治療剤に用いられるリベロマイシン A誘導 体の有効量は通常の薬学的手法に準じてその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤 剤、崩壊剤、滑沢剤等の医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬製剤とすること ができる。注射剤の場合には、適当な担体とともに滅菌処理を行って製剤とする。投 与量は疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、または体重によっても異なり、最終的 には医師の判断に委ねられるが、有効成分量として成人に経口で投与する場合、通 常 20— 500 mg/kg/日、好ましくは 50— 300 mg/kg/日、非経口で投与する場合、通常 10-300 mg/kg/日、好ましくは 20— 200 mg/kg/日を投与する。これを 1回あるいは数 回に分割して投与すればよい。
[0026] 本発明において、種々のリベロマイシン A誘導体を化学合成して、天然型リベロマ イシン Aに比べ、より特異的に細胞培養系における成熟破骨細胞の増殖を抑制でき る化合物の開発を試みた。その結果、一般式 (I)で表される特定のリベロマイシン A 誘導体、特に一般式 (I)における Rが tert-プチルジメチルシリル基である誘導体およ び Rがァセチル基である誘導体力 成熟破骨細胞に対して、天然型リベロマイシン A に比べ、さらに選択的な破骨細胞増殖抑制効果を示すことを新たに見いだした。す なわち、リベロマイシン Aの 5位の水酸基を適当な保護基で保護した誘導体は、中性 pHでは殺細胞活性が微弱である力 S、酸性環境を作り出す成熟破骨細胞に対しては 強力なアポトーシス誘導活性を有するプロドラッグとして働く。これらの誘導体は、成 熟破骨細胞以外の細胞に対するアポトーシス誘導活性がより低いといった優れた選 択的破骨細胞アポトーシス誘導効果を示す。活性化した成熟破骨細胞に対する選 択性が高いことから、これらのリベロマイシン A誘導体の副作用は軽微であると考えら れる。
[0027] また、甲状腺副甲状腺を摘出後、副甲状腺ホルモンを投与することにより高カルシ ゥム血症を呈するラットに対して特定のリベロマイシン A誘導体の投与を行った結果、 これらのリベロマイシン A誘導体は、副甲状腺ホルモンにより誘発される骨吸収作用 を効果的に抑制できることが新たに判明した。また、これらのリベロマイシン A誘導体 の骨吸収抑制効果は、従来のカルシトニンによるものに比べ持続時間の長いもので あった。
[0028] すなわち、本発明において、骨吸収を担う成熟破骨細胞に対して選択的細胞死を 誘導できるリベロマイシン A誘導体が見出された。これらのリベロマイシン A誘導体は 、副甲状腺ホルモンに起因する骨吸収を効果的に抑制でき、さらにその効果はカル シトニンなどに比べ持続性が向上していたことから、破骨細胞の過剰な活性化などに より誘発される骨疾患および高カルシウム血症などの効果的な治療剤として期待でき る。
実施例
[0029] 以下に製造例および実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は これらに限定されるものではない。
種々のリベロマイシン A誘導体をバイオオーガニック'アンド'メディシナル 'ケミストリ ~~ ·レグーズ (Bioorgamc & Medicinalし hemistry Letters Vol. 12, pp«j363_336り (2002))および以下の製造例に記載の方法により合成した。なお、リベロマイシン Aを 特公平 6-33271号公報に記載の方法により製造した。合成した 29種類のリベロマ イシン A誘導体を以下の表 1および 2に示す。なお、表 1および 2において Acはァセ チノレ基、 allylはァリル基、 Etはェチル基、 TBSは tert-ブチルジメチルシリル基、 Meは メチル基、 MTMはメチルチオメチル基を示す。
[表 1]
表
Figure imgf000010_0001
[表 2] 表 2
Figure imgf000011_0001
以下に、化合物 2および 27の製造例を示す。
<製造例 1 > 化合物 2 (C5-シリルエーテル体）の合成
C5-シリルエーテル体 (化合物 2)の合成
窒素雰囲気下、リベロマイシン A (6.6 mg, 0.01 mmol)の DMF (ジメチルホルムアミ ド）（300 μ \)溶液に、室温でイミダゾール (13.6 mg, 0.2 mmol)および TBSC1 (t_プチ ルジメチルシリルクロライド）（18.0 mg, 0.12 mmol)を加えて一昼夜攪拌した。 AcOEt ( 酢酸ェチル）で希釈し、 0 °Cで有機層を IN HC1、飽和食塩水で順次洗浄した。 溶媒 を留去後残渣に MeOH (メタノール） ： THF (テトラヒドロフラン） ： H 0 = 3： 2： 1 (600 μ 1)および K CO (5 mg)を加え室温にて 1時間攪拌した。溶媒を留去後、残渣を SiOカラムクロマトグラフィー（n-へキサン： AcOEt = 1： 1； 1%酢酸）にて精製して、
2
5-シリルエーテル (化合物 2) (無色油状物： 5.0 mg, 71%)を得た。
[0033] ¾ NMR (500 MHz, CD OD) δ = 0.06 (s, 3H), 0.10 (s, 3H)， 0.85 (d, J = 6.4 Hz,
3
3H)， 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 0.95 (s, 9H)， 1.09 (d， J = 6.4 Hz, 3H)， 1.79 (s, 3H), 2.31 (s， 3H)， 2.63 (m, 4H), 3.47 (ddd, J = 10.0, 5.0, 5.0 Hz, 1H)， 4.26 (dd， J = 6.9, 5.5 Hz, 1H), 4.65 (brd, J = 8.2 Hz, 1H)， 5.54 (dd， J = 15.6, 6.9 Hz, 1H), 5.63 (dd, J = 7.3, 7.3 Hz, 1H), 5.82 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.92 (brs, 1H), 6.27 (d, J = 15.6 Hz, 1H)， 6.46 (m, 2H)， 7.03 (dd, J = 15.6, 7.3 Hz, 1H).
[0034] 13C NMR (125 MHz, CD OD) δ = 14.2, 14.4, 14.9, 18.1， 19.1, 23.9, 25.1, 25.5,
3
26.4, 28.6, 29.9, 31.1， 32.8, 33.3, 35.3, 36.9, 44.9, 76.2, 78.1, 79.9, 84.3, 97.0, 121.5, 122.3, 128.6, 129.4, 134.1, 135.6， 137.3, 139.3， 152.6， 153.5, 170.2, 170.2, 173.4, 175.9.
[0035] <製造例 2 > 化合物 27 (C5-アセテート体）の合成
トリアリルエステルの合成
リベロマイシン A (66.1 mg, 0.1 mmol), ァリルアルコール (700 μ 1)、 EDCI (1—ェチ ノレ一 3_ (3—ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド）（178.2 mg, 0.6 mmol)および DMAP (4—ジメチルァミノピリジン）（1.2mg， 0.01 mmol)を 2 mlのテフロン（デュポン社 登録商標）製容器に入れ、さらに無水 CH C1で容器を満たし、室温 1.5 GPaで 2日間
2 2
加圧した。反応液を Et 0 (ジェチルエーテル）で希釈し、 2N Na CO aq.、飽和食塩水
2 2 3
で順次洗浄後、 MgSOで乾燥し、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー
4
(n-へキサン： Et 0 = 2： 1)にて精製しトリアリルエステル (28.1 mg, 36%)を得た。
2
[0036] 'Η NMR (500 MHz, CDC1 ) δ = 0.76 (d, J = 6.4 Hz, 3H)， 0.82 (t, J = 6.9 Hz, 3H),
3
1.09 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.72 (s， 3H)， 2.25 (brs, 3H), 2.66 ( m， 4H), 3.41 (ddd, J = 9.9, 4.8, 4.8 Hz, 1H)， 4.11 (dd, J = 7.3, 5.6 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.62 (m, 6H)， 5.24 (dd, J = 10.4, 1.4 Hz, 2H), 5.24 (dd, J = 10.4, 1.4 Hz, 1H)， 5.32 (ddd, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H)， 5.34 (ddd, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H)， 5.35 (ddd, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H)， 5.51 (dd, J = 15.6, 7.3 Hz, 1H), 5.54 (brt, J = 7.3 Hz, 1H)， 5.86 (brs, 1H)， 5.90 (d， J = 16.0 Hz, 1H)， 5.96 (m, 3H)， 6.22 (d， J = 15.6 Hz, 1H)， 6.34 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.38 (dd, J = 15.6, 8.0 Hz, 1H)， 7.04 (dd， J = 16.0， 7.5 Hz, 1H).
[0037] 13C NMR (125 MHz, CDC1 ) δ = 12.6, 14.1, 14.4, 14.7, 17.7, 22.9, 29.4, 30.2,
3
33.9, 34.2, 36.0, 42.7, 64.8, 65.1, 65.5, 74.9, 76.1, 78.2, 83.1, 95.8, 118.1， 118.1， 118.3， 119.7, 121.4, 126.0， 129.4, 132.0, 132.3, 132.3, 133.2, 133.8, 137.4, 137.7, 150.9， 151.9, 166.1, 166.4, 171.2, 171.8.
[0038] 5-ァセトキシ体の合成
窒素雰囲気下、トリアリルエステル (8.5 mg, 10.9 x mol)の CH CI溶液（1 ml)にピリ
2 2
ジン (4.4 μ \, 54.4 x mol)、 DMAP (1 piece), Ac〇（無水酢酸）（2.1 μ \, 21.8 μ mol)
2
を順次カ卩ぇ 0°Cで 3時間攪拌した。溶媒を留去後、残渣をカラムクロマトグラフィー（n_ へキサン： Ac〇Et = 3 : 1)にて精製して、 5 -ァセトキシトリアリルエステル（無色油状 物： 6.8 mg, 76%)を得た。
[0039] JH NMR (500 MHz, CDC1 ) δ = 0.74 (d, J = 6.4 Hz, 3H)， 0.83 (t, J = 6.9 Hz, 3H),
3
1.08 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.70 (bs， 3H)， 2.07 (s, 3H)， 2.28 (d, J = 0.9 Hz, 3H)， 2.67 (m, 4H)， 2.77 (m， 4H)， 3.43 (dt, J = 10.1, 3.7 Hz, 1H)， 4.60 (ddd, J = 6.0， 1.4, 1.4 Hz, 2H), 4.62 (d, J = 8.7 Hz, 1H)， 4.64 (ddd, J = 6.0, 1.4, 1.4 Hz, 2H), 4.65 (ddd, J = 6.0, 1.4, 1.4 Hz, 2H), 5.24 (ddt, J = 10.5， 1.4, 1.4 Hz, 1H)， 5.25 (ddt, J = 10.5, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.25 (ddt, J = 10.5， 1.4, 1.4 Hz, 1H)， 5.27 (dd, J = 8.3， 5.5 Hz, 1H)， 5.32 (ddt, J = 17.2， 1.4, 1.4 Hz, 1H)， 5.34 (ddt, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.34 (ddt, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H)， 5.38 (dd, J = 15.6, 8.3 Hz, 1H), 5.64 (brt, J =
6.9 Hz, 1H), 5.86 (brs, 1H), 5.87 (dd, J = 15.6, 0.9 Hz, 1H)， 6.30 (d, J = 15.6 Hz, 1H)， 6.33 (d， J = 15.6 Hz, 1H)， 6.38 (dd, J = 15.6, 8.7 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 15.6， 7.3 Hz, 1H),7.03 (dd, J = 15.6， 7.3 Hz, 1H).
[0040] 13C NMR (125 MHz, CDC1 ) δ = 12.7, 14.0, 14.4, 15.1, 17.7, 21.4, 22.8
3 ， 29.3,
30.2, 35.8, 40.6, 64.8, 65.2, 65.5, 74.5, 77.6, 78.2, 83.2, 95.9, 118.2, 118.3， 118.5， 120.0, 121.0, 121.9， 130.0, 132.1, 132.3, 132.5, 133.3， 133.9, 137.8， 139.8, 149.6, 151.8, 166.2, 166.6， 170.2, 171.4, 172.0.
[0041] 窒素雰囲気下、 5-ァセトキシトリアリルエステル（5.8 mg, 0.07 μ mol)の CH CI (1 ml)溶液に 0°Cで Pd(Ph P) (テトラキス（トリフエニルホスフィン）パラジウム）（0.41 mg，
3 4
0.35 μ mol), Ph P (トリフエニルホスフィン）（0.19 mg, 0.7 11101)、ピロリジン(7.3 μ \,
3
0.086 mmol)を順次加えた後、 3時間攪拌した。反応溶液を EtOAcで希釈し、 2N Na
2
COで抽出し、水層を 2N HC1で中性にして EtOAcで抽出し、有機層を飽和食塩水で
3
洗浄後、 MgSOで乾燥し溶媒を留去して、 5 -ァセトキシ体 (4.2 mg, 85 %)を得た。
4
[0042] 'Η NMR (500 MHz, CDC1 ) δ = 0.83 (d, J = 6.4 Hz, 3H)， 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H),
3
1.13 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.78 (brs, 3H)， 2.11 (s， 1H), 2.30 (d, J = 1.4 Hz, 3H), 2.63 (m, 4H), 3.49 (dt, J = 10.1 , 5.5 Hz, 1H)， 4.66 (d， J = 6.9 Hz, 1H)， 5.32 (dd， J = 7.3, 6.0 Hz, 1H), 5.51 (dd, J = 15.6, 7.8 Hz, 1H)， 5.69 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 5.88 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.92 (brs, 1H)， 6.33 (d， J = 15.6 Hz, 1H)， 6.46 (d， J = 15.6 Hz, 1H)， 6.48 (dd, J = 15.6, 6.9 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 15.6, 7.3 Hz, 1H).
[0043] 13C NMR (125 MHz, CDC1 ) δ = 12.8, 14.2, 14.7, 15.2, 18.0, 23.8, 25.1， 25.5,
3
28.7， 29.9, 31.1 , 32.8, 32.9, 34.7, 35.2, 36.9， 41.8, 76.2, 78.8， 79.8, 84.3, 97.1 , 121.6， 122.9, 123.4, 130.9, 134.1 , 135.3， 139.3, 140.3, 151.0, 152.5, 170.2， 170.2, 173.4, 176.0.
[0044] <実施例 1 > リベロマイシン Aおよびリベロマイシン A誘導体の成熟破骨細胞に対 する細胞死誘導活性の検討
骨吸収の要因である成熟破骨細胞の増殖に対するリベロマイシン Aおよびその誘 導体の阻害効果を検討した。
[0045] 上記のようにして合成した 29種類のリベロマイシン A誘導体を用いて、成熟破骨細 胞、及びマウス由来未分化マクロファージ様細胞 (RAW264細胞)に対する細胞死誘 導活性の試験を行った。マウスマクロファージ系細胞株である RAW264細胞を 10。/o FBS-ひ MEM (Gibco BRL社製）に懸濁し、 96穴プレートに 12000細胞/ 100 μ 1播種 し、 1時間培養後、 RANKL (100 μ g/ml)、 PD98059 (40 μ Μ)を含む培地を 100 μ 1 加え（終濃度 RANKL 50 μ g/ml、 PD98059 20 μ M)、 4 日間培養して成熟破骨細 胞へ分化させた（J. Biol. Chem. Vol. 277, pp47366-47372 (2002))。なお、培養 2 日 目に培地を半量交換した。成熟破骨細胞へ分化させたプレートから培地を 100 μ 1/ ゥエルずつ除去し、 2倍濃度のリベロマイシン Α誘導体を含む培地を 100 μ 1加えて 24時間培養後、 TRAP (tartarateresistant acid phosphatase：酒石酸耐性酸フォスフ ァターゼ）染色を行い、残存する多核の破骨細胞の数を計測し、細胞死（アポトーシ ス）誘導活性（ED 値）を計算した。アポトーシス誘導活性は、 10 μ M Hoechst 33258
50
で 10分間染色し核の凝集を観察確認した。
[0046] 未分化 RAW264細胞に対する細胞死誘導活性は MTT法（J. Immunol. Methods, Vol. 65, pp55-63 (1983))により検討した。 RAW264細胞を 96穴プレートに 40000細胞 /100 μ 1播種し、 24時間培養後、 3倍濃度の薬物を含む培地 50 μ 1を加え、 24時 間培養して細胞死誘導活性を検討した。細胞死誘導活性を測定する 2時間前に 0.5 % MTT-PBS (リン酸緩衝食塩水) 15 μ 1をカ卩えて培養した後、培養液を除去した 残渣を DMSO (ジメチルスルフォキシド） 100 μ 1に溶解し、 570 nm (レファレンス波長 630 nm)の吸光度を測定し、細胞死誘導活性の ED 値を計算した。
50
[0047] 試験の結果、表 3に示すように、リベロマイシン Aによる成熟破骨細胞に対する細胞 死誘導活性の ED は 0.18 であるのに対して RAW264細胞に対する細胞死誘導
50
活性の ED は 24 であり、成熟破骨細胞に高い選択性を持って作用する。これに
50
対し、リベロマイシン Α誘導体 (化合物 2および化合物 27)は、破骨細胞の前駆細胞 RAW264に対しては比較的高濃度においても増殖阻害作用を示さず、成熟破骨細 胞に対して選択的なアポトーシス誘導効果を示した。リベロマイシン A誘導体 2 (C5- シリルエーテル体)、 27(C5_アセテート体）は 5位の水酸基の修飾体である力 成熟 破骨細胞に対して選択的に細胞死を誘導した。成熟破骨細胞によるプロトン分泌に よってその周辺は酸性環境になるが、酸性環境では加水分解により修飾基が脱離し て水酸基に戻ったために活性を示した可能性がある。リベロマイシン A誘導体 (化合 物 2および化合物 27)は、未分化 RAW264細胞に対しては比較的高濃度においても 増殖阻害作用を示さず、成熟破骨細胞に対して選択的なアポトーシス誘導効果を示 すことから、プロドラッグとして有望であることが示された。
[0048] [表 3] 表 3 成熟破骨細胞おょぴ未分化 RAW264細胞に対する細胞死誘導活性の ED ( μ Μ)
Figure imgf000016_0001
n. d.: データなし
[0049] <実施例 2 > マウス長管骨からの45 Ca遊離抑制効果の検討
副甲状腺ホルモン (PTH)による骨吸収促進に対するリベロマイシン A誘導体の効果 を測定した。
[0050] 19日目の妊娠ラットに [45Ca]CaClを皮下注射し、胎児の骨を標識した。 24時間後、
2
前肢長管骨を摘出した。摘出した長管骨は 15%加熱非活性化ゥマ血清と 100 U/ml ペニシリンを含んだ DMEM (ダルベッコ改変イーグル培地）を培地として使用し、骨吸 収因子（PTH 10"8M, IL-1 0.3 ng/ml,ビタミン D 10— 8M)及びリベロマイシン A誘導体
3
と共に 72時間培養した。培養後、 0.1N HC1により骨のカルシウムを溶かし出した溶液 と培養液の45 Ca放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターで計測した。全カルシゥ ム量に対する培養液中に放出されたカルシウム量の比（骨吸収活性 (%))を指標とした PTHによる骨吸収促進に対するリベロマイシン A誘導体の効果を検討した。
[0051] [数 1]
骨吸収活性（％) = 100 X 培養液中への45 Ca放出量/ (培養液中への45 Ca放出量 +骨中の45 Ca残存量） [0052] リベロマイシン A誘導体（ィ匕合物 2、および化合物 27)は、 10— 8M、 10— 7M及び 10— 6M で PTHにより誘発された骨吸収を濃度依存的に抑制した。また、ビタミン Dや IL一 1
3 による骨吸収をも抑制できた。
[0053] く実施例 3 > リベロマイシン A誘導体の副甲状腺ホルモン (PTH)による骨吸収阻害 効果の検討
生体内で最も重要な骨吸収因子として機能している副甲状腺ホルモン (PTH)による 骨吸収に対するリベロマイシン A誘導体の効果を検討した。
[0054] リベロマイシン A誘導体の骨吸収阻害効果は、骨吸収作用により血中に放出される 血清カルシウムの濃度測定により検定した。 SD系のラットに甲状腺副甲状腺摘出手 術 (TPTX)を施し、翌日血清カルシウムの低下を確認した後、副甲状腺ホルモン
(PTH)を持続注入して、骨吸収の亢進により高カルシウム血症を呈するラットを作製し た。
[0055] PTH注入開始後 12時間にリベロマイシン A誘導体 (10 mg/50 μ 1 EtOH (エタノール )， 100 g bw)またはリベロマイシン A誘導体のナトリウム塩 (10 mg/100 μ 1 0.05 Ν NaOH, 100 g bw)を投与して経時的に 24時間まで血清カルシウムの測定を行った。
[0056] SDラットに TPTXを施行すると血清カルシウム濃度が著しく低下した。 TPTXラットに PTHを持続注入すると血清カルシウム濃度が上昇した。一方、リベロマイシン A誘導 体 (化合物 2、および化合物 27) (80 mg/Kg)を投与した個体においては、 PTHによる 血中カルシウム濃度の上昇は、有意に抑制された。リベロマイシン A誘導体は、 PTH による骨吸収を有意に抑制することが明らかとなった。また、リベロマイシン A誘導体 を EtOHに溶解後投与した個体では、投与時に死亡する個体が見られたが、リベロマ イシン A誘導体をナトリウム塩として投与することにより死亡する個体は認められず、 有効な骨吸収抑制作用が発揮された。
[0057] 一方、骨吸収抑制因子として臨床応用されているカルシトニンの骨吸収抑制作用 についても検討して、リベロマイシン A誘導体との相異について調べた。その結果、 カルシトニンは骨吸収抑制作用が短いのに対して、リベロマイシン A誘導体 (ィ匕合物 2 、および化合物 27)による骨吸収抑制作用は長時間維持された。
産業上の利用の可能性 本発明により、新規な高カルシウム血症および骨疾患治療剤、該治療剤の有効成 分として用いられ得る新規化合物が提供される。

Claims

請求の範囲
下記一般式 (I)
Figure imgf000019_0001
(式中、 Rは酸性条件下で脱離し得る水酸基の保護基を示す。 )
で表されるリベロマイシン A誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とす る高カルシウム血症または骨疾患治療剤。
[2] 一般式 (I)におレ、て、 Rが tert-プチルジメチルシリル基で
ある請求項 1に記載の治療剤。
[3] 下記一般式 (II)
[化 2]
Figure imgf000019_0002
で示されるリベロマイシン A誘導体またはその薬学的に許容される塩。
請求項 3に記載のリベロマイシン A誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効 成分とする高カルシウム血症または骨疾患治療剤。
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