WO2005010182A1 - コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるジカルボン酸の製造方法 - Google Patents

コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるジカルボン酸の製造方法 Download PDF

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coryneform bacterium
corynebacterium glutamicum
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ldh
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Shikiko Murakami
Kaori Nakata
Shohei Okino
Yuko Ikenaga
Masayuki Inui
Hideaki Yukawa
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present invention relates to a coryneform bacterium transformant and a method for producing a dicarboxylic acid using the same.
  • Dicarboxylic acids are used in a wide variety of fields, such as raw materials for polymer synthesis, raw materials for medicines, cosmetics, and food additives.
  • the demand for succinic acid and its derivatives is expected to be further expanded as a raw material for biodegradable plastics and as a clean washing solvent that does not cause environmental pollution.
  • the present invention relates to a coryneform bacterium transformant and a method for producing a dicarboxylic acid using the transformant. More specifically, the present invention relates to a method for producing dicarboxylic acid with high productivity using a coryneform bacterium subjected to a specific transformation treatment.
  • Patent Document 1 a method of recombining the PEPC gene
  • Patent Document 2 a method of recombining the PC gene
  • patents are the ldh gene and pf Escherichia coli strain (NZN111 strain) lacking one gene (pyruvate formate lyase gene) was further subjected to mutation treatment (the expression of the mutated gene was not specified) or recombination treatment (malate dehydrogenase-mdh- This is an Escherichia coli mutant (AFP 111 strain) transformed into a strain capable of simultaneously producing succinic acid, acetic acid, and ethanol under anaerobic conditions by introducing a plasmid containing a gene).
  • the above Escherichia coli mutant (AFP111) lacks both the ldh gene and the pfl gene, and is mutated into an Escherichia coli strain (NZN111) that cannot be anaerobically grown. Although transformed so as to have an ethanol-producing function, the recombinant coryneform bacterium used in the present invention has no ethanol-producing function.
  • the mutant strain of Escherichia coli does not require the supply of carbonate ions for the production of succinic acid from saccharides.
  • AFP 111 has the ability to produce ethanol and acetic acid. It is presumed that carbon dioxide generated as a by-product of these fermentation products is used).
  • dicarboxylic acids such as succinic acid from saccharides by the coryneform bacterium of the present invention
  • external supply of carbonate ion or bicarbonate ion or gas carbonate is indispensable.
  • ldh gene disruption of Escherichia coli wild strain has little effect on succinic acid production (no effect), and ldh gene disruption has an effect on the enhancement of succinic acid production by high expression of PC gene. It has been shown to exhibit an inhibitory effect.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-196888
  • Patent Document 3 U.S. Patent No. 5,770,435
  • Patent Document 4 U.S. Patent No. 5,869,301
  • Patent Document 5 JP-T-2002-511250
  • the present invention uses a novel aerobic coryneform bacterium transformant by a novel method which has not been known before and uses a high production rate of a dicarboxylic acid such as succinic acid which is interposed in a tricarboxylic acid cycle. It provides a manufacturing technology. That is, the present invention provides a technique capable of creating aerobic coryneform bacteria which have been subjected to a specific transformation treatment, and producing dicarbonic acid from saccharides at high speed and with high reaction selectivity under specific reaction conditions. The purpose is to provide.
  • the present inventors use aerobic coryneform bacteria to produce a dicarboxylic acid intervening in a tricarboxylic acid cycle such as succinic acid from a saccharide at a high production rate. Although various studies were carried out using highly-expressed transformed coryneform bacteria, dicarboxylic acid could not be produced at the desired high production rate. In such a method, the production rate was only as high as that using coryneform bacteria before transformation.
  • ldh gene "disruption" of the present invention refers to all or all of the ldh gene). It does not have ldh expression activity due to partial disruption or mutation, or modification or removal of the gene expression unit such as the promoter or ribosome binding site of the gene). Expression transformants were created and reacted with saccharides under the specific reducing conditions of the present invention. As a result, the ldh gene was not disrupted. The inventors have found that dicarbonic acid is produced at a very high production rate, and have further studied to arrive at the present invention. (In the case of a transformant highly expressing PEPC, such an effect was not observed as clarified in Comparative Examples described later.)
  • the present invention provides:
  • a transformant of an aerobic coryneform bacterium in which the lactate dehydrogenase gene is disrupted and whose pyruvate carboxylase gene is highly expressed wherein the aerobic coryneform bacterium is of the genus Corynebacterium Aerobic coryneform bacterium, characterized in that it is at least one member selected from the group consisting of fungi, Brevibacterium, Arthrobacter, Mycobacterium and Micrococcus. Body,
  • Corynebacterium spp. Corynebacterium glutamicum R, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATC C13058, Corynebacterium glutamicum ATCC13059, Corynebacterium glutamicum ATCC13060, Corynebacterium ATcormicium CC13, Corynebacterium glutamicum ATCC13023 glutamicum ATCC13655, Cor The aerobic coryneform according to (1), which is any one selected from the group consisting of ynebacterium glutamicum shiji 13745, Corynebacterium glutamicum ATCC 13746 ⁇ Corynebacterium glutamicum ATCC13761, Corynebacterium glutamicum ATCC14020 and Corynebacterium glutamicum ATCC31831.
  • Bacterial transformants Bacterial transformants
  • Arthrobacter globiformis ATCC8010, Arthrobacter globiiormis ATCC21056, Arthrobacter globiiormis ATCC2105 6, Arthrobacter globiformis ATCC31250, Arthrobacter globiformis A TCC31738 and Arthrobacter globiformis ATCC35698 are also selected.
  • Micrococcus genus Micrococcus freudenreichii No. 239, Microcoecus luteus No. 240, Micrococcus ureae IAM1010 and Micrococcus roseus IF03764 force which is any one selected from the above-mentioned (1), wherein The aerobic coryneform bacterial transformant described,
  • the lactate dehydrogenase gene is disrupted by a method selected from homologous recombination, transposon insertion and mutagen introduction, or the gene is partially or entirely removed, and the enzyme activity is expressed. Characterized by loss of function The aerobic coryneform bacterial transformant according to any one of (1) to (7),
  • the method comprises the steps of: A method for producing a dicarboxylic acid, which is a transformant of an aerobic coryneform bacterium according to
  • a dicarboxylic acid can be produced from a saccharide at a high production rate.
  • the present invention uses a transformant of an aerobic coryneform bacterium in which the lactate dehydrogenase gene has been disrupted by a genetic engineering technique and the pyruvate carboxylase gene has been recombined to highly express the gene. This means that dicarboxylic acid is produced at twice as high a production rate as when a ldh gene is not disrupted, or when a transformant with high PC expression is used.
  • the aerobic coryneform bacterium used in the present invention a group of microorganisms defined in Bajizu 'manual' Detamine Iaibu ⁇ Kuarioroshi 1 ⁇ (Bargeys Manual of Determinative Bactenolog y, 8, 599, 1974) is there. Specific examples include Corynebacterium, Brevibataterum, Arthrobacter 1, Mycobacterium and Micrococcus.
  • Corynebacterium species include Corynebacterium dartamicum.
  • Corynebacterium glutamicum R Corynebacterium glutamicum R; FERM P-18976
  • Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Corynebacterium glutamicum ATCC 13 058, Corynebacterium glutamicum ATCC13059, Corynebacterium glu tamicum ATCC13060, Corynebacterium glutamicum ATCC13232, Co rynebacterium glutamicum ATCC13286, Corynebacterium glutamicu m ATCC13287, Corynebacterium glutamicum ATCC13655, Coryneba cterium glutamicum ATCC13745, Corynebacterium glutamicum ATC C13746, Corynebacterium glutamicum ATCC13761, Corynebacterium glutamicum ATCC14020 or Corynebacterium glutamicum ATCC3 1831 and the like.
  • Brevibacterium species include Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) or Brevibacterium flavum MJ- 233AB-41 (FERM BP-1498) or Brevibacterium ammoniagenes ATCC6872.
  • Arthrobacter species include Arthrobacter globiformis ATCC8010, Arthrobacter globiformis ATCC4336, Arthrobacter globiformis ATCC21056, Arthrobacter globiformis ATCC3125, Arthrobacter globiformis ATCC31738, and Arthrobacter globifor such as Arthrobacter globiformis.
  • Mycobacterium species include Mycobacterium bovis ATCC19210 and Mycobacterium bovis ATCC27289.
  • Micrococcus spp. include Micrococcus freudenreichii No. 239 (FERM P-13221), Micrococcus noreteus (Micrococcus luteus) No. 240 (FERM P-13222), Micrococcus Coccus ureae (Micrococcus ureae) IAM1010 or Micrococcus roseus (Micrococcus roseus) IF03764.
  • the aerobic coryneform bacteria used in the present invention include Corynebacterium glutamic urn R (FERM P—18976), Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Or Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 or the like.
  • the aerobic coryneform bacterium used in the present invention includes a mutant strain of a wild strain existing in nature (for example, a mutant strain FERM P-18977, FERM P which has acquired the ability to assimilate cellobiose of Corynebacterium glutamicum R strain). -18978 strain; see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-89029), and an artificial strain (for example, a phosphotransferase enzyme of Corynebacterium glutamicum R strain) in which a gene other than the constituent gene of the present invention has been recombined.
  • FERM P-18979 see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-89029 which has been transformed to express the ability to simultaneously utilize glucose and cellobiose by genetic recombination.
  • these aerobic coryneform bacteria are subjected to transformation treatment for disruption of ldh-expressing gene and high PC expression as described below.
  • the disruption of the ldh gene of the present invention is performed by a method selected from homologous recombination, transposon insertion, and mutagen introduction method, in which the gene is disrupted or a part or the whole of the gene is removed, and Although the activity expression function can be lost, the transposon insertion method and the mutagen introduction method are random disruptions of the gene on the chromosome, and homologous recombination is required to efficiently carry out the targeted disruption of the ldh gene. The method is preferred. Since all of these methods are well-established techniques in the past, they may be followed in the present invention.
  • A) DNA extraction from microorganisms used in the present invention A) DNA extraction from microorganisms used in the present invention.
  • Cloning of target ldh gene and preparation of plasmid for disruption Cloning of ldh gene is performed by PCR using primers designed from conserved amino acid sequences between known ldh genes, or by using known ldh gene.
  • the most efficient method is the genomic sequence (Corynebacterium glutamicum R strain, the whole genome is arranged, Hiroshi Nonaka, Kaori Nakata, Naoko Okai, Mariko Wada, Yumiko Sato, Kos Peter, Masayuki Inui, Hideaki Yukawa "Corynebacterium glutamicum R Genome Analysis", Japanese Society of Agricultural Chemistry, April 2003, Yokohama, Japanese Society of Agricultural Chemistry 2003 Annual Meeting Abstracts, p. 20)
  • the primers can also be used to design the genomic DNA of the coryneform bacterium as type III, and amplify the gene containing the full length ldh gene by PCR.
  • the ldh gene-disrupted strain is created by cloning the ldh gene amplified by PCR into an E. coli vector such as PHSG398 that cannot be replicated in coryneform bacteria, and then a unique strain located almost at the center of the ldh gene Create a plasmid for gene disruption by inserting a drug resistance gene such as kanamycin (used as a marker gene for gene disruption) into the restriction enzyme site.
  • kanamycin used as a marker gene for gene disruption
  • the ldh gene disruption was confirmed at the gene level by PCR, Southernno, and the hybridization method, in addition to the ldh gene fragment and a marker gene fragment such as a kanamycin resistance gene inserted into the chromosome. At the protein level, it can be confirmed by the disappearance of the enzymatic activity of lactate dehydrogenase.
  • the ldh-disrupted strain of coryneform bacterium prepared as described above is further transformed to express the PC gene at a high level. That is, a nucleic acid fragment containing a gene sequence encoding an enzyme having PC activity is introduced into an ldh-disrupted strain of the above-mentioned coryneform bacterium, and transformation is performed to express PC activity at a higher level than the ldh-disrupted strain before introduction. Is done.
  • nucleic acid fragment containing a PC gene used for the purpose of the present invention is widely present on chromosomes of microorganisms, animals and plants. Therefore, even if the coryneform bacterium of the present invention itself has a foreign (heterologous) origin, May be.
  • the base sequence is known, a gene synthesized according to the sequence can also be used. Even if the gene sequence is unknown, the enzyme protein can be purified using the PC activity as an index, and the nucleic acid fragment can be isolated from the N-terminal amino acid sequence and partially degraded sequence by ordinary hybridization techniques. . Also, fragments can be obtained by hybridization and PCR based on the amino acid sequence conserved between the PC enzyme proteins. The nucleotide sequence of the obtained fragment can be determined by an ordinary method.
  • PC enzyme proteins or genes whose properties have been clarified include the following.
  • a part of the base sequence may be replaced with another base, deleted or a new base may be inserted, and furthermore, a part of the base sequence may be deleted. Even if the part is transposed, it is good. Any of these derivatives can be used in the present invention.
  • the above part may be, for example, one or several amino acid residues.
  • the nucleic acid fragment containing the PC gene of the present invention is transformed into the aforementioned coryneform bacterium ldh-disrupted strain by plasmid.
  • the PC gene is introduced under a controllable control sequence.
  • "under the control sequence” refers to the PC gene power, for example, promoter, inducer, operator
  • the plasmid vector used for such a purpose may be any vector that contains a gene that controls the autonomous replication function in the ldh-disrupted strain of the coryneform bacterium.
  • pAM330 Agric. Biol. Chem., Vol. 48, 2901-2903 (1984) and Nucleic Acids Symp Ser., Vol. 16, 265-267 (1985)) (Derived from Brevibacacterium lactofermentum 2256), pHM1519 (Agric.Biol.hem., Vol.
  • the construction of the plasmid used for creating the coryneform bacterium transformant of the present invention includes, for example, when the PC gene derived from Corynebacterium glutamicum R strain is used, it contains the complete PC gene. .8-kb gene fragment [Corynebacterium glutamicum R strain whole genome analysis results (Hiroshi Nonaka, Kaori Nakata, Naoko Okai, Mariko Wada, Yumiko Sato, Kos Peter, Masayuki Inui, Hideaki Yukawa, Hideaki Yukawa "Corynebacterium glutamicum R Genomic analysis ”, Japan Society of Agricultural Chemistry, April 2003, Yokohama, Japanese Society of Agricultural Chemistry 2003 Annual Meeting Proceedings, p.
  • the plasmid is inserted into an appropriate restriction enzyme site of any of the plasmid vectors exemplified above to construct the plasmid vector. I can do it.
  • examples of a promoter for expressing the PC gene include a promoter originally possessed by a coryneform bacterium, but the promoter is not limited thereto and has a function of initiating transcription of a PC gene. If it is a nucleotide sequence, it may be any one.
  • the terminator under the control sequence located downstream of the PC gene also includes the terminator originally owned by the coryneform bacterium.
  • the present invention is not limited thereto, and any sequence may be used as long as it has a function of terminating transcription of a PC gene such as a terminator of a tryptophan operon derived from Escherichia coli.
  • a coryneform bacterium ldh-disrupted strain such as an electric pulse method (elect mouth poration method) or a CaCl method may be used.
  • the method is not particularly limited as long as it can introduce a PC gene into the gene.
  • the electric pulse method is a known method (Agric. Biol. Chem., ⁇ ol. 54, 443-447 (1990), Res. Microbiol., Vol. 144, 181-185 (1993)). Can be used.
  • a plate containing the drug at an appropriate concentration is prepared by incorporating a drug resistance gene or the like into a plasmid vector containing a PC gene in accordance with a conventional method.
  • the transformed coryneform bacterium can be selected by applying the coryneform bacterium of the present invention which has been subjected to the PC gene transfer treatment onto a medium. Specific examples thereof include the method described in Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447 (1990) and Res. Microbiol, vol. 144, 181-185 (1993). Can be used.
  • coryneform bacterium of the present invention which has been created as described above and in which the ldh gene is disrupted and the PC gene is highly expressed, has been transformed into a coryneform bacterium; Corynebacterium glu tamicum R ldh — Deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary under the accession number: FERM BP-10060 under ZpCRBl_PC.
  • Corynebacterium glutamicum Rldh- / pCRBl_PC may be optionally and additionally contributed by an anaplerotic pathway enzyme gene or a tricarboxylic acid cycle that contributes to an increase in the rate of dicarboxylic acid production, for example, A fumarate reductase (FRD) gene or the like can also be introduced.
  • FBD fumarate reductase
  • a coryneform bacterium of the present invention deposited under the Patent Organism Depositary under the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the deposit number: FERM BP-10061 under the name of the cell; Corynebacterium glutamicum R Wh—ZpCRBl_PC_FRD Have been.
  • the coryneform bacterium of the present invention that has been created by force is used in a reaction solution containing a carbonate ion, a bicarbonate ion, or a carbon dioxide gas under a specific reducing state, in other words, a carbonate ion,
  • a reaction solution containing a carbonate ion, a bicarbonate ion, or a carbon dioxide gas under a specific reducing state, in other words, a carbonate ion
  • High production rate of dicarboxylic acids such as succinic acid, fumaric acid or malic acid, from sugars in a reaction solution containing one or more mixtures selected from the group consisting of carbonate ions and carbon dioxide Can be generated.
  • the aerobic coryneform bacterium transformed and created by the above-described method of the present invention is grown and cultured under aerobic conditions.
  • Culture of the aerobic coryneform bacterium of the present invention can be performed using a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like.
  • a carbon source for example, dalcoses or molasses
  • ammonia, ammonium sulfate, ammonium salt, ammonium nitrate, urea, etc. alone or in combination as the nitrogen source.
  • the inorganic salt for example, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate or the like can be used.
  • nutrients such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid or various vitamins such as biotin or thiamine can be appropriately added to the medium.
  • the cultivation can usually be performed at a temperature of about 20 ° C to about 40 ° C, preferably about 25 ° C to about 35 ° C under aerobic conditions such as aeration and stirring or shaking.
  • the pH during the culturing is in the range of about 5-10, preferably about 7-8.
  • the pH during the culturing can be adjusted by adding an acid or an alkali.
  • the carbon source concentration at the start of the culture is about 120% (W / V), preferably about 2-5% (W / V).
  • the culturing period is usually about 117 days.
  • the method for recovering and separating the cultured cells from the culture obtained as described above is not particularly limited, and known methods such as centrifugal separation and membrane separation can be used.
  • the collected cultured cells may be treated, and the resulting treated cells may be used in the next step, a dicarboxylic acid production reaction step.
  • a method of treating the cells any method may be used as long as the cultured cells have been subjected to some treatment. Examples thereof include a method of immobilizing the cells with acrylamide or carrageenan.
  • the cultured cells of the aerobic coryneform bacterium of the present invention recovered or separated from the culture obtained as described above, or the treated cells thereof are treated with the desired dicarboxylic acid in the reaction medium under a reduced state. It is subjected to an acid generation reaction.
  • Dicarboxylic acid generation method is batch type, continuous type Either generation method is possible.
  • the growth and division of the aerobic coryneform bacterium of the present invention can be suppressed, and substantially complete suppression of secretion by-products accompanying the growth can be realized. I can do it.
  • the method and conditions under which the environmental conditions inside and outside the coryneform bacterium during culture are not brought to the reaction medium. It is recommended to use That is, it is preferable that the reaction medium is produced during the growth and culture process and does not substantially contain a product substance existing inside and outside the cells.
  • secretory by-products generated during the growth culture process and released outside the cells, and substances generated by the aerobic metabolic function in the cultured cells and remaining in the cells are substantially contained in the reaction medium. It is recommended that it not be present.
  • Such a state is realized, for example, by a method such as centrifugation and membrane separation of the culture solution after the growth culture and / or by leaving the cells after the culture in a reduced state for about 2 to 10 hours. .
  • reaction medium under a reduced state
  • the reaction medium may have any shape such as solid, semi-solid or liquid as long as it is in a reduced state.
  • One of the requirements of the present invention is to produce a dicarboxylic acid of interest by causing a biochemical reaction due to the metabolic function of coryneform bacteria under reducing conditions.
  • the reduced state in the present invention is defined by the oxidation-reduction potential of the reaction system, and the oxidation-reduction potential of the reaction medium is preferably about _200mV to about 500mV, more preferably about _250mV to about 1-500mV.
  • the reduction state of the reaction medium can be easily estimated to some extent with a resazurin indicator (if it is in a reduced state, decolorization from blue to colorless), but more precisely, an oxidation-reduction potentiometer (for example, ORP Electrodes manufactured by BROADLEY JAMES) Is used.
  • the reduced state is maintained from immediately after the addition of the cells or the treated product to the reaction medium until the dicarboxylic acid is collected, but the reaction medium is reduced at least when the dicarboxylic acid is collected. Any condition is acceptable. It is desirable that the reaction medium is kept in a reduced state for about 50% or more of the reaction time, more preferably about 70% or more, and even more preferably about 90% or more. In particular, the oxidation-reduction potential of the reaction medium is maintained at about 1 200 mV-about 500 mV for about 50% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 90% or more of the reaction time. More desirable. [0048] Specifically, such a reduced state is realized by the above-described method for preparing cultured cells after culturing, adjusting the reaction medium, or maintaining the reduced state during the reaction.
  • a method for preparing the reaction medium under the reducing condition a known method may be used.
  • a method for preparing an aqueous solution for a reaction medium is, for example, a method for preparing a culture solution for an anaerobic microorganism such as a sulfate-reducing microorganism.
  • a method for preparing the aqueous solution for the reaction medium more specifically, for example, a method of removing the dissolved gas by subjecting the aqueous solution for the reaction medium to heat treatment and reduced pressure treatment is exemplified. More specifically, the aqueous solution for the reaction medium is treated under a reduced pressure of about lOmmHg or less, preferably about 5 mmHg or less, more preferably about 3 mmHg or less, for about 116 minutes, preferably about 5-40 minutes. This makes it possible to remove the dissolved gas, particularly dissolved oxygen, to prepare an aqueous solution for the reaction medium under reducing conditions.
  • an appropriate reducing agent for example, thioglycolic acid, ascorbic acid, cysteine hydrochloride, mercaptoacetic acid, thiolacetic acid, daltathione, soda sulfide, etc.
  • an appropriate reducing agent for example, thioglycolic acid, ascorbic acid, cysteine hydrochloride, mercaptoacetic acid, thiolacetic acid, daltathione, soda sulfide, etc.
  • an appropriate combination of these methods is also an effective method for preparing an aqueous solution for a reaction medium in a reduced state.
  • Factors affecting the oxidation-reduction potential of the reaction system include the type and concentration of the atmosphere gas in the reaction system, the reaction temperature, the pH of the reaction solution, and the various inorganic and organic substances used to produce the desired dicarboxylic acid. Compound concentration and composition can be considered.
  • the oxidation-reduction potential of the reaction medium in the present invention is a value obtained by integrating the above various influencing factors.
  • the reaction medium contains a saccharide and a carbonate ion or a bicarbonate ion as a raw material for producing a dicarboxylic acid.
  • saccharides examples include monosaccharides such as glucose, galactose, fructose and mannose, disaccharides such as cellobiose, sucrose or ratatose and maltose, and polysaccharides such as dextrin or soluble starch. Of these, glucose is preferred. In this case, glucose is used in a concentration range of about 0.5-500 g / L (liter).
  • Carbonate ions or bicarbonate ions are supplied from carbonic acid or bicarbonate or salts thereof, or carbon dioxide gas.
  • Specific examples of the carbonate or bicarbonate salts include, for example, ammonium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, ammonium bicarbonate, sodium bicarbonate, and potassium bicarbonate. These carbonate or bicarbonate ions are used in a concentration range of about 11 to 500 mM, preferably about 2 to 300 mM.
  • carbon dioxide gas When carbon dioxide gas is supplied, it is supplied so as to be contained in the solution at a concentration of about 50 mg / L to 25 g / L, preferably about 100 mg ZL to 15 g / L.
  • the composition of the reaction medium used for the dicarboxylic acid production reaction includes components necessary for the coryneform bacterium or its processed product to maintain its metabolic function, that is, a carbon source and a carbon source such as various sugars. Also contains nitrogen sources required for protein synthesis (e.g., ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate or urea), other salts such as phosphorus, potassium or sodium, and trace metal salts such as iron, manganese or calcium. . The amount of these additives can be determined as appropriate depending on the required reaction time, the type of the target dicarboxylic acid product, the type of corn bacteria used, and the like.
  • nitrogen sources required for protein synthesis e.g., ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate or urea
  • other salts such as phosphorus, potassium or sodium
  • trace metal salts such as iron, manganese or calcium.
  • the reaction between the aerobic coryneform bacterium or the processed product thereof and the saccharide is carried out by the aerobic coryneform bacterium of the present invention or the processed product thereof. It can be appropriately selected depending on the type of aerobic coryneform bacterium, which is preferably performed under a temperature condition capable of moving, or the processed product of the bacterium (for details, see Examples).
  • the dicarboxylic acid generated in the reaction medium as described above is collected.
  • a known method used in a bioprocess can be used. Examples of such known methods include salting-out method, recrystallization method, organic solvent extraction method, esterification distillation separation method, chromatographic separation method and electrodialysis method of a dicarboxylic acid production solution, and the like depending on the characteristics of the dicarboxylic acid.
  • the method of separation and purification can be determined as appropriate.
  • a medium 1L [Composition: urea: 2g, (NH) SO: 7g, KHP ⁇ : 0.5g, KHP ⁇ : 0.5g
  • PCR was performed using the chromosomal DNA prepared in the above section (A) as type III.
  • Each primer has a Sail site added to the end.
  • PCR was performed using "DNA Thermal Cycler” manufactured by Perkin Elmer Cetas, and using the following reagent under the following conditions, using Takara Ex-Taq (TaKaRa Ex Taq) (Takara Shuzo Co., Ltd.) as a reaction reagent. I went in.
  • Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was transformed by the calcium chloride method (Joumal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)).
  • lOOmg tryptone 10 g, yeast extratato 5 g, NaCl 5 g and 16 agar dissolved in 1 L of distilled water.
  • the plasmid containing the ldh gene was designated as pHSG398_LDH.
  • the ligation solution was used to transform calcium chloride method Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] t koyori escherichia ⁇ 3] ⁇ 109 (manufactured by Takatori Corporation), and a medium containing 50 mg of kanamycin [10 g of tryptone, 5 g of yeast extratato, 5 g of NaCl and 16 g of agar were dissolved in 1 L of distilled water].
  • This plasmid was designated as pHSG398_LDHZKm.
  • the growth strain grown on the agar medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin described above was obtained when the plasmid PHSG398-LDHZKm underwent one-point homologous recombination with the wild-type ldh gene on the chromosome. Chloramphenicol resistance by the expression of the chloramphenicol resistance gene on the vector PHSG398 and namycin resistance by the expression of the kanamycin resistance gene in the ldh gene, whereas two-point homologous recombination occurred.
  • the chloramphenicol resistance gene on the vector pHSG398 is lost, indicating chloramphenicol sensitivity and kanamycin resistance due to expression of the kanamycin resistance gene in the ldh gene. Therefore, the target ldh gene-disrupted strain exhibits chloramphenicol sensitivity and kanamycin resistance.
  • the ldh gene disrupted strain thus obtained was named Corynebacterium glutamicum R ldh strain.
  • Corynebacterium glutamicum R Wh— strain was added to 100 ml of A medium (1 L [composition: urea: 2 g, (NH 2) SO: 7 g, KHP ⁇ : 0.5 g, KHP ⁇ :
  • the activity of ldh is measured by measuring the amount of coenzyme NADH that is oxidized to NAD + as a result of lactic acid production using pyruvic acid as a substrate, as a change in absorbance at 340 nm (Bunch, PK, F. Mat-Jan, N.A. Lee, and DP Clark. 1997.
  • the ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187-195.).
  • no ldh activity was detected in the Corynebacteri urn glutamicum Rldh—strain, indicating that the ldh gene was disrupted.
  • Example 2 Creation of a PC gene highly expressing recombinant strain of Corynebacterium glutamicum R 1 dh_ strain.
  • Plasmid pAM330 (Yamaguchi, R. et al., Agric. Biol. Chem. 50, 2771-2778 (1986)) contained in Brevibacterium lactof ermentum AT CC13869, JP-A-58-67679 Publication), a DNA fragment containing ⁇ RF1 (rep) was amplified by the following PCR method.
  • each primer has an Hpal site added to the end.
  • the plasmid pAM330 was used as type I DNA.
  • the reaction solution 10 generated above was subjected to electrophoresis on a 0.8% agarose gel, and a DNA fragment of about 1.8 kb containing the Rep gene was detected.
  • each primer has an EcoRV site added to the end.
  • plasmid pHSG398 was used for type I DNA.
  • the obtained plasmid mixture was used to transform the calcium chloride method, journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] @ koroescherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo).
  • the strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture solution, the plasmid was cut with a restriction enzyme, and the inserted fragment was confirmed. As a result, an inserted DNA fragment having a length of about 1.8 kb was observed in addition to the plasmid pHSG 398 2.2 kb DNA fragment.
  • This coryneform bacterium-E. Coli shuttle vector is referred to as pCRBl.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA prepared in section (A) as type III.
  • the results of whole genome analysis of Corynebacterium glutamicum (R) strain which clones the PC gene, and cloned PC gene (Hiroshi Nonaka, Kaori Nakata, Naoko Okai, Mariko Wada, Yumiko Sato, Kos Peter, Masayuki Inui Hideaki Yukawa, "Coryneb acterium glutamicum R Genome Analysis," Japanese Society of Agricultural Chemistry, April 2003, Yokohama, Japanese Society of Agricultural Chemistry 2003 Annual Meeting Proceedings, p. 20).
  • the primers were synthesized using Applied Biosystems "394 DNA / RNA Synthesizer" and used.
  • the former has an Nspl site and the latter has a SpM site.
  • type I DNA genomic DNA of Corynebacterium glutamicum R strain extracted in the above section (A) was used.
  • the ligation solution was used to transform the calcium chloride method into the calcium chloride method Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)].
  • medium containing gal 5—Bromo—4—chloro—3—mdoxyl—beta—D—galactopyranoside
  • IPTG isopropyl 1—thio—beta—d—galactoside
  • l OOmg tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaC g and 16 g of agar dissolved in 1 L of distilled water.
  • a white growing strain was selected on the above medium, liquid-cultured by a conventional method, and a plasmid DNA was extracted from the culture solution, cut with a restriction enzyme, and the inserted fragment was confirmed.
  • a plasmid DNA was extracted from the culture solution, cut with a restriction enzyme, and the inserted fragment was confirmed.
  • an inserted DNA fragment of about 3.8 kb containing the PC gene was observed.
  • the plasmid containing the PC gene was named pCRBl_PC.
  • the plasmid pCRBl-PC was prepared by the electric pulse method (Y. Kurusu, et al., Agric. Biol. Chem. 54: 443-447. 1990. and AA Vertes, et al., Res. Microbiol. 144). Therefore, the strain was introduced into a strain of Corynebacterium glutamicumj R ldh.
  • Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum
  • R ldh— / pCRB l-PC National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Accession number: FERM BP-10060
  • thiamine hydrochloride 200 ⁇ g of thiamine hydrochloride, 2 g of yeast extract, 7 g of casamino acid, and 500 ml of medium consisting of 1000 ml of distilled water were dispensed into a 1-L flask, sterilized by heating at 120 ° C for 10 minutes, and cooled to room temperature. And Similarly, 1000 ml of a medium having the same composition was placed in a 2 L glass jar armamenter and sterilized by heating at 120 ° C. for 10 minutes to obtain a main culture medium.
  • An undiluted reaction solution consisting of 1000 ml of distilled water was prepared, heated at 120 ° C. for 10 minutes, and then dissolved oxygen was removed under reduced pressure (13 mmHg) for 20 minutes.
  • the reduction state of the undiluted reaction solution can be confirmed by changing the color tone (blue (Change from color to colorless).
  • 500 ml of this reaction stock solution was introduced into a glass reactor under a nitrogen atmosphere of 1 L in volume.
  • This reaction vessel is equipped with a pH adjusting device, a temperature maintaining device, a reaction solution stirring device in the container, and a reduction potential measuring device.
  • the coryneform bacterium prepared after the culturing was calorifically added to 500 ml of a reaction stock solution in a reaction vessel under a nitrogen gas atmosphere. 200 mM of gnorecose and 200 mM of sodium carbonate were added, and the reaction temperature was maintained at 33 ° C to perform an organic compound generation reaction. The oxidation-reduction potential during the reaction was initially -200 mV, but fell immediately after the start of the reaction, and was maintained at -400 mV to continue the reaction. After 3 hours of reaction, the reaction medium solution was analyzed by liquid chromatography to find that 163 mM succinic acid (19.2 g / L) and 5 mM malic acid (0.667 g / L) were produced. Lactic acid was not detected.
  • the coryneform bacterium used in Example 3 was Corynebacterium daltamicum (Corynebacterium glutamicum) R strain (wild type) and Corynebacterium glutamicum glutamicum (Corynebacterium glutamicum) R / pCRBl_PC (wild type (Corynebacterium glutamicum) Corynebacterium glutamicum)! ⁇ *) was transformed into a plasmid pCRBl_PC transformed strain), and an organic compound production reaction was performed in the same manner and under the same conditions as in Example 3. The transformation was performed in the same manner as in Example 2 (B). After 3 hours of reaction, the reaction medium solution was analyzed by liquid chromatography.
  • Corynebacterium glutamicum R strain (wild strain) showed succinic acid 8 ImM (9.6 g / L), lactic acid 200 mM (18. OgZU was produced, and Corynebacterium gonoretamum R / pCRBl_PC produced 82 mM (9.7 g / L) of succinic acid and 202 mM (18. lgZU of lactic acid. No malic acid was detected in any of the strains.
  • Example 3 The same method and conditions as in Example 3 were used, except that the strain used was Corynebacterium glutamicum R ldh- strain prepared by the method described in Example 1 (C). A compound generation reaction was performed.
  • Example 3 An organic compound production reaction was carried out in the same manner and under the same conditions as in Example 3, except that the coryneform bacterium used in Example 3 was changed to Corynebacterium glutamicum Rldh— / pCRBl_PEPC strain. .
  • PEPC-N 5'-CTCTGTCGACAGCACAGCCTTAAAGCA-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • PEPC-C 5, -CTCTGTCGACTTGTGCAGCAAGACGAAA-3, (SEQ ID NO: 10)
  • Transformation into Corynebacterium glutamicum Rldh_ strain was performed according to the method of Example 2.
  • the strain Corynebacterium glutamicum R ldh—ZpCRBl—PEPC was compared with the strain Corynebacterium glutamicum R Wh—J. Bacteriol., 179: 4942—4945 (1997).
  • the PEPC activity was compared by the method of))
  • the PEPC activity was increased 4-fold.
  • the organic compound production reaction was carried out under the same method and conditions as in Example 3, except that the coryneform bacterium used in Example 3 was replaced with Corynebacterium glutamicum Rldh— / pCRBl_PC_FRD strain. Was.
  • the plasmid pCRBl_PEPC_FRD is a plasmid in which the fumarate reductase gene (enzyme name is FRD, gene name is abbreviated as frd) derived from Escherichia coli is connected to the plasmid pCRBlPC constructed in Example 2 (B).
  • Fumarate reductase is an enzyme that catalyzes the conversion of fumarate to succinate in the tricarboxylic acid cycle.
  • the plasmid pCRBl-PEPC-FRD was created by the following method.
  • the cloning of the frd gene derived from Escherichia coli is based on the power amplified by PCR.
  • PCR the results of whole kenom analysis of the Escherichia coli K-12 strain that clones the frd gene (Tne complete genome) Based on the sequence of Escherichia coli K-12 Science, 277 (5331), 1453-1474 (1997)), the following pair of primers were applied to Applied Biosystems' “394
  • Example 1 Total DNA was prepared from Escherichia coli K-12 MG1665 strain in the same manner as in section (A), and used as type I DNA.
  • Electrophoresis was performed on 10 ⁇ l of the reaction solution generated above using a 0.8% agarose gel, and in the case of the frd gene, a DNA fragment of about 3.8 kb was detected.
  • the ligation solution was used to transform Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) by the calcium chloride method Joumal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and a medium containing 50 mg of chloram feniconore. [Dissolve 10 g of tryptone, 5 g of yeast extratato, 15 g of NaC and 16 g of agar in 1 L of distilled water].
  • the plasmid containing the PC gene was named pCRBl-PC-FRD.
  • the plasmid pCRBl-PC-FRD was subjected to the electric pulse method (Y. Kurusu, et al., Agric. Biol. Chem. 54: 443-447. 1990. and AA Vertes, et al., Res. Micr. obiol. 144: 181-185. 1993) (therefore, Cornenobactenum gutamicum) was specialized to the Rldh strain. This strain was designated as Corynebacterium glutamicum R Idh_ZpCRBl_PC_FRD strain.
  • the enzymatic activity of the pathway from fumaric acid to succinic acid in this strain was measured by the method described in (ELENA MAKLASHINA, et al., J. Bacteriology, 180: 5989-5996.1998). The enzymatic activity of this pathway was increased 3-fold as compared to.
  • the dicarboxylic acid produced by the present invention is used in a wide range of fields such as raw materials for polymer synthesis, raw materials for medicines, cosmetics, and food additives.
  • succinic acid and its derivatives are used for raw materials for biodegradable plastics and for cleaning solvents that do not cause environmental pollution.

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Abstract

　本発明は、遺伝子工学的手法により、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊され、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が高発現すべく組換えられた好気性コリネ型細菌形質転換体を提供するものである。本発明の好気性コリネ型細菌形質転換体は、糖類からジカルボン酸を高生産速度で製造できる。  

Description

明 細 書
コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるジカルボン酸の製造方法 技術分野
[0001] ジカルボン酸は高分子合成原料、医薬原料、化粧品用途そして食品添加剤用途 など広い分野で使用されている。例えば、コハク酸およびその誘導体は生分解性プ ラスチック原料や環境汚染をもたらさないクリーンな洗浄溶剤用途としてその需要が さらに拡大することが期待されている。
本発明はコリネ型細菌形質転換体およびそれを用いるジカルボン酸の製造方法に 関する。さらに詳しくは、特定の形質転換処理が施されたコリネ型細菌を用いるジカ ルボン酸の高生産性製造方法に関する。
背景技術
[0002] 従来より、バイオ手法により目的物質を高い生産速度でもって製造する為に、 目的 物資に至る微生物代謝経路中のいずれかの経路に係わる触媒酵素遺伝子の発現 を強化する方法は多く試みられてレ、る。コハク酸等のトリカルボン酸回路に介在する ジカルボン酸は、糖類の解糖系で生じるホスホェノールピルビン酸やピルビン酸から ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、 PEPCと記す。）やピルビン酸力 ルボキシラーゼ（以下、 PCと記す。）の触媒作用により炭酸イオンを取り込み、ォキザ 口酢酸を経由して還元的トリカルボン酸回路反応により生成するとされている。
[0003] このため、コリネ型細菌を用いるリンゴ酸、フマール酸、コハク酸等の有機酸の製造 方法として PEPC遺伝子を組換える方法（特許文献 1)や PC遺伝子を組換える方法（ 特許文献 2)が提案されている。
し力 ながら、これらレ、ずれの方法によるコハク酸等有機酸の生成速度は充分なも のではなぐさらなる向上が求められている。
[0004] 一方、本発明の要件の一つである乳酸デヒドロゲナーゼ（以下 ldhと記す)遺伝子（ ピルビン酸力 乳酸生成経路に係わる酵素遺伝子）が欠損した大腸菌変異株を用い たコハク酸、酢酸およびエタノールの同時生成技術も提案されている（特許文献 3、 特許文献 4)。これら米国特許で使用されている大腸菌変異株は ldh遺伝子および pf 1遺伝子（ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子）を欠レ、た大腸菌株 (NZN 111株）にさら に変異処理 (変異を受けた発現遺伝子の明記なし)や組換え処理 (リンゴ酸脱水素 酵素一 mdh—遺伝子を含むプラスミド導入処理）により嫌気的条件下で、コハク酸、酢 酸およびエタノールの同時生成が可能なものに形質転換された大腸菌変異株 (AFP 111株）である。
この 2件の米国特許は同一発明者等による類似した技術内容によるものである。本 発明とこれら 2件の米国特許は、本発明の要件である ldh遺伝子発現機能を同じく欠 レ、たそれぞれの微生物種を使用しているとはいえ、それぞれの発明思想に基づく技 術内容やその結果から形質転換される微生物代謝機能内容は全く異なるものである
[0005] 本発明で使用されているコリネ型細菌形質転換株と上記大腸菌変異株の代謝機 能の差異は下記の二つの事より明らかである。
1)上記大腸菌変異株 (AFP 111)は、 ldh遺伝子および pfl遺伝子の両遺伝子を欠 レ、ているため嫌気的増殖が不可能な大腸菌株 (NZN 111株）にさらに変異ゃ組換 え操作によりエタノール生成機能を有するように形質転換されているが、本発明で使 用する組換えコリネ型細菌はエタノール生成機能を全く有していない。
2)上記大腸菌変異株 (AFP 111)は糖類からのコハク酸生成に炭酸イオンの供給 を必須要件としていない（このことは上記 1に関連して、 AFP 111ではエタノールや 酢酸生成機能を有しているのでこれら醱酵産物の副生物として発生する炭酸ガスを 利用しているものと推定される）。本発明のコリネ型細菌による糖類からのコハク酸等 のジカルボン酸生成には外部からの炭酸イオン若しくは重炭酸イオンまたは炭酸ガ スの供給は必須である。
[0006] このように同じく ldh遺伝子を欠いた大腸菌変異株と本発明のコリネ型細菌はそれら の代謝機能、機構は全く異なっていると考えられる。本発明の技術が大腸菌変異株（ AFP 111)に関する二つの米国特許 (本発明ではこれら米国特許の変異処理や組 換え技術は用いられていないが）と前記二つのコリネ型細菌に関する日本公開公報 技術の組み合わせにより、得られるものでなレ、こと、およびその技術構成内容が異な ることは明らかである。 [0007] コハク酸生成に関して、 ldh遺伝子破壊効果は、特許文献 5で明らかにされている。 本公表特許公報は大腸菌野生株 (MG1655)の ldh遺伝子破壊突然変異株および PC遺伝子高発現（大腸菌野生株は本来 PC遺伝子を保有してレ、なレ、が外来 PC遺 伝子の導入も「高発現」と呼ばれる） Zldh遺伝子破壊の二重組換え株それぞれにつ レ、てコハク酸生成挙動が調べられている（特許文献 5、実施例 II、表 4参照）。
同表で大腸菌野生株の ldh遺伝子破壊はコハク酸生成に殆ど影響を与えなレ、こと（ 効果がないこと）、そして、 ldh遺伝子破壊は、 PC遺伝子高発現によるコハク酸生成 増強効果に対して阻害効果を示すことが示されてレ、る。
[0008] これらの結果は、ピルビン酸から目的物質であるコハク酸への代謝経路の炭素質 の流れを増強する為に、ピルビン酸からコハク酸への代謝経路以外の経路 (例えば、 ピルビン酸力 乳酸生成の経路）を破壊、阻害、遮断等を行なうことは目的物質へ流 れるピルビン酸の蓄積効果 (増量効果）が期待できるとして、容易に考えられる手段 の如く考えられる力 事実は逆であることを示している。即ち、 ldh遺伝子の破壊はコ ノ、ク酸生成に対して一義的に正の効果をもたらすとは云えないことを示している。 特許文献 1 :特開平 11-196887号公報
特許文献 2：特開平 11 - 196888号公報
特許文献 3 :米国特許第 5， 770, 435号
特許文献 4 :米国特許第 5， 869, 301号
特許文献 5：特表 2002—511250号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、従来より知られてレ、なかった新規な方法による好気性コリネ型細菌形質 転換体を使用して、コハク酸等のトリカルボン酸回路に介在するジカルボン酸を高生 産速度で製造する技術を提供するものである。すなわち、本発明は、特定の形質転 換処理を施した好気性コリネ型細菌を創製し、特定の反応条件下で糖類からジカル ボン酸を高速度で反応選択性も高く製造することのできる技術を提供することを目的 とする。
課題を解決するための手段 [0010] 本発明者等は好気性コリネ型細菌を使用してコハク酸等トリカルボン酸回路に介在 するジカルボン酸を糖類から高生産速度で製造すベぐ PEPC高発現形質転換コリ ネ型細菌や PC高発現形質転換コリネ型細菌を用いて種々検討を行ったが、 目的と する高生産速度でのジカルボン酸の製造は出来なかった。このような方法ではそれ らの生産速度は形質転換される前のコリネ型細菌を用いた場合の生産速度と同程度 のものに過ぎなかった。
[0011] ところが、思いがけないことに、トリカルボン酸回路とは別の乳酸醱酵経路に関与す る ldh遺伝子破壊コリネ型細菌株 (本発明の ldh遺伝子「破壊」とは、 ldh遺伝子の全 部またはその一部が破壊、変異されたり、該遺伝子のプロモーターやリボソームバイ ンデイングサイト等の該遺伝子発現ユニットの改変または除去により、 ldh発現活性を 有していないことを意味する）を用いて PC高発現形質転換体を創製し、本発明の特 定の還元状態下で糖類を反応させたところ、 ldh遺伝子が破壊されていなレ、、単なる PC高発現形質転換体によるジカルボン酸生産速度の 2倍もの高生産速度でジカル ボン酸が生成することを見出し、さらに検討を重ねて本発明に到達した。 （なお、 PEP C高発現形質転換体の場合には、後記の比較例で明らかにされているように、このよ うな効果は認められなかった。 )
[0012] すなわち、本発明は、
(1) 乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊され、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺 伝子が高発現すべく組換えられた好気性コリネ型細菌形質転換体であって、 好気性コリネ型細菌がコリネバタテリゥム属菌、ブレビバタテリゥム属菌、アースロバク ター属菌、マイコバクテリウム属菌およびマイクロコッカス属菌の群から選ばれるレ、ず れか 1種であることを特徴とする好気性コリネ型細菌形質転換体、
(2) コリ不ノヽクテリゥム属囷力、、 Corynebacterium glutamicum R、 Coryneba cterium glutamicum ATCC 13032、 Corynebacterium glutamicum ATC C13058、 Corynebacterium glutamicum ATCC13059、 Corynebacterium glutamicum ATCC13060、 Corynebacterium glutamicum ATCC1323 2、 Corynebacterium glutamicum ATCC13286、 Corynebacterium gluta micum ATCC13287、 Corynebacterium glutamicum ATCC13655、 Cor ynebacterium glutamicum ΑΊじし 13745、 Corynebacterium glutamicum ATCC 13746^ Corynebacterium glutamicum ATCC13761、 Corynebac terium glutamicum ATCC14020および Corynebacterium glutamicum ATCC31831から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする前記（1)に記載 の好気性コリネ型細菌形質転換体、
(3) ブレビバクテリウム属菌力 Brevibacterium lactofermentum ATCC 138 69、 Brevibacterium flavum MJ— 233、 Brevibacterium flavum MJ— 233A B— 41および Brevibacterium flavum Brevibacterium ammoniagenes AT CC6872から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする前記（1)に記載の好 気性コリネ型細菌形質転換体、
(4) アースロバクター属菌力 Arthrobacter globiformis ATCC8010、 Arthr obacter globiformis ATし C4d3り、 Arthrobacter globiiormis ATCC2105 6、 Arthrobacter globiformis ATCC31250、 Arthrobacter globiformis A TCC31738および Arthrobacter globiformis ATCC35698力も選択されるレヽ ずれかの菌であることを特徴とする前記（1)に記載の好気性コリネ型細菌形質転換 体、
(5) マイコバクテリゥム属菌カ Mycobacterium bovis ATCC19210または My cobacterium bovis ATCC27289であることを特徴とする前記（1)に記載の好気 性コリネ型細菌形質転換体、
(6) マイクロコッカス属菌力 Micrococcus freudenreichii No. 239、 Microco ecus luteus No. 240、 Micrococcus ureae IAM1010および Micrococcus roseus IF03764力、ら選択されるいずれかの菌であることを特徴とする前記（1)に 記載の好気性コリネ型細菌形質転換体、
(7) コリネバクテリウム属菌が Corynebacterium glutamicum Rであることを特 徴とする前記（2)に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体、
(8) 乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊が、相同性組換え法、トランスポゾン揷入 法および変異原導入法から選ばれる方法により該遺伝子が分断もしくは該遺伝子の 一部または全域が除去され、該酵素活性発現機能が喪失していることを特徴とする 前記（1)一 (7)のいずれかに記載の好気性コリネ型細菌形質転換体、
(9) Corynebacterium glutamicum R ldh / pCRBl_PCまたは Coryneba cterium glutamicum R ldh_/pCRBl— PC— FRDであることを特徴とする前記 (1)、（2)、 （7)および（8)のいずれかに記載の好気性コリネ型細菌形質転換体、
(10) 炭酸イオン若しくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する還元状態 下の反応液中で細菌と糖類とを反応させ反応液中に生成するジカルボン酸を採取 する方法において、細菌が前記（1)に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体である ことを特徴とするジカルボン酸の製造方法、
(11) 還元状態下の反応液の酸化還元電位カ 200ミリボルト乃至- 500ミリボルト であることを特徴とする前記（10)に記載のジカルボン酸の製造方法、および
(12) ジカルボン酸がコハク酸、フマール酸およびリンゴ酸から選ばれることを特徴と する前記（10)または（11)に記載のジカルボン酸の製造方法、
に関する。
発明の効果
[0013] 本発明によれば、ジカルボン酸が糖類から高生産速度で製造できる。本発明は、 遺伝子工学的手法により、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊され、かつ、ピルビン 酸カルボキシラーゼ遺伝子が高発現すべく組換えられた好気性コリネ型細菌形質転 換体を使用する。これは、 ldh遺伝子が破壊されていなレ、、単なる PC高発現形質転 換体を使用する場合に対比して、 2倍もの高生産速度でジカルボン酸が生成する。 発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明で用いられる好気性コリネ型細菌とは、バージーズ 'マニュアル'デターミネ ィァイブ ヽクァリオロシ1 ~~ (Bargeys Manual of Determinative Bactenolog y, 8, 599、 1974)に定義されている一群の微生物である。具体例を挙げれば、コリ ネバクテリゥム属菌、ブレビバタテリゥム属菌、アースロバクタ一属菌、マイコバクテリウ ム属菌またはマイクロコッカス属菌等が挙げられる。
[0015] さらに具体的には、コリネバクテリウム属菌としては、コリネバタテリゥム ダルタミカム
R (Corynebacterium glutamicum R； FERM P—18976)、 Corynebacteri um glutamicum ATCC 13032、 Corynebacterium glutamicum ATCC 13 058、 Corynebacterium glutamicum ATCC13059、 Corynebacterium glu tamicum ATCC13060、 Corynebacterium glutamicum ATCC13232, Co rynebacterium glutamicum ATCC13286、 Corynebacterium glutamicu m ATCC13287、 Corynebacterium glutamicum ATCC13655、 Coryneba cterium glutamicum ATCC13745、 Corynebacterium glutamicum ATC C13746、 Corynebacterium glutamicum ATCC13761、 Corynebacterium glutamicum ATCC14020または Corynebacterium glutamicum ATCC3 1831等が挙げられる。
[0016] ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバタテリゥム ラタトフアーメンタム（Brevibac terium lactofermentum) ATCC13869、ブレビバタテリゥム フラバム（Breviba cterium flavum) MJ-233 (FERM BP— 1497)もしくは Brevibacterium flavu m MJ-233AB-41 (FERM BP— 1498)、またはブレビバタテリゥム アンモニア ゲネス（Brevibacterium ammoniagenes)ATCC6872等があげられる。
[0017] アースロバクター属菌としては、アースロバクタ一 グロビフオルミス（Arthrobacter globiformis) ATCC8010, Arthrobacter globiformis ATCC4336, Arthr obacter globiformis ATCC21056、 Arthrobacter globiformis ATCC312 50、 Arthrobacter globiformis ATCC31738また ίま Arthrobacter globifor mis ATCC35698等が挙げられる。
[0018] マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリゥム ボビス（Mycobacterium bo vis) ATCC19210または Mycobacterium bovis ATCC27289等が挙げられる
[0019] マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス'フロイデンライヒ（Micrococcus fr eudenreichii) No. 239 (FERM P— 13221)、マイクロコッカス'ノレテウス（Microc occus luteus) No. 240 (FERM P— 13222)、マイクロコッカス ウレァェ（Micro coccus ureae) IAM1010またはマイクロコッカス ロゼウス (Micrococcus roseu s) IF03764等が挙げられる。
[0020] 本発明で用いられる好気性コリネ型細菌としては、 Corynebacterium glutamic urn R (FERM P—18976)、 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 または Brevibacterium lactofermentum ATCC13869など力 S好ましレヽ。
[0021] また、本発明で用いられる好気性コリネ型細菌としては自然界に存在する野生株の 変異株（例えば、 Corynebacterium glutamicum R株のセロビオース資化能を 獲得した変異株 FERM P-18977, FERM P—18978株など；特開平 2004—89 029号公報参照）であってもよく、本発明の構成遺伝子以外の遺伝子が組換えられ た人為株（例えば、 Corynebacterium glutamicum R株のホスホトランスフェラー ゼ系酵素 Πに関する遺伝子組み換えにより、グルコースとセロビオースの同時併行資 化能を発現すべく形質転換された人為株、 FERM P - 18979 ;特開平 2004 - 890 29号公報参照）を用いても良レヽ。
これら上記の好気性コリネ型細菌が本発明の目的のため、下記に詳記する ldh発 現遺伝子の破壊および PC高発現の形質転換処理が施される。
[0022] 本発明の ldh遺伝子の破壊は、相同性組換え法、トランスポゾン挿入法および変異 原導入法から選ばれる方法により該遺伝子が分断もしくは該遺伝子の一部または全 域が除去され、該酵素活性発現機能を喪失させることができるが、トランスポゾン挿 入法および変異原導入法は染色体上の遺伝子のランダムな破壊であり、ターゲットと する ldh遺伝子の破壊を効率よく実施するには相同性組換え法が好ましい。これらの 方法はいずれも自体従来充分に確立された技術であるから、本発明にあっては、そ れらに従ってよい。
相同性組換え法によるコリネ型細菌の ldh遺伝子破壊株作製は、実施例で詳記す るが、通常、以下の操作方法、手順で行なうことができる。
[0023] A)発明に用いる微生物から DNA抽出；コリネ型細菌からのゲノム DNA抽出法は、
4mg/ml濃度のリゾチームで 37°C、 30分間菌体を事前に処理する以外は、 Sambr ookらの方法（Sambrook, J. , E. F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molec ular cloning： a laboratory manual, 2nd ed.し old Spring Harbor Labo ratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. )により行うことができる。
[0024] B)ターゲットとなる ldh遺伝子のクローン化と破壊用プラスミド作製; ldh遺伝子のク ローニングは、既知 ldh遺伝子間の保存アミノ酸配列からデザインしたプライマーを 用いた PCR法や、既知 ldh遺伝子を用いたハイブリダィゼーシヨンにより行うことがで きる力 最も効率的な方法としては、ゲノム配列（コリネバクテリゥム ダルタミカム（Co rynebacterium glutamicum) R株の場合、全ゲノム配歹 lj (野中 寛、中田 かおり 、岡井 直子、和田 真利子、佐藤 由美子、 Kos Peter、乾 将行、湯川 英明「C orynebacterium glutamicum R ゲノム解析」日本農芸化学会、 2003年 4月、 横浜、 日本農芸化学会 2003年度大会講演要旨集、 p. 20 参照）が決定されている ので、利用できる）力もプライマーをデザインし、コリネ型細菌のゲノム DNAを铸型と して、 ldh遺伝子の全長を含む遺伝子を PCRにより増幅 '取得することができる。一方 、 ldh遺伝子の破壊株の作成は、コリネ型細菌内で複製不可能な PHSG398等の大 腸菌ベクター等に、 PCRで増幅した ldh遺伝子をクローニング後、 ldh遺伝子のほぼ 中央に位置するユニークな制限酵素サイトに、カナマイシン等の薬剤耐性遺伝子 (遺 伝子破壊する際のマーカー遺伝子として利用）を挿入した、遺伝子破壊用プラスミド を作製する。
[0025] C)プラスミド導入による相同組換え法; ldh遺伝子破壊株の作成は、上記遺伝子破 壊用プラスミドを、コリネ型細菌への高効率遺伝子導入法〔電気パルス法 (Y. Kurus u, et al. , Agric. Biol. Chem. 54 : 443-447. 1990.および A. A. Vertes, et al. , Res. Microbiol. 144 : 181-185. 1993)の方法〕により糸田胞内に導人し、 染色体への相同性組換えにより、 ldh遺伝子を破壊 (または不活性化）することにより 行うことができる。尚、 ldh遺伝子の破壊の確認は、遺伝子レベルでは PCRやサザン ノ、イブリダィゼーシヨン法により、 ldh遺伝子断片に加えて、カナマイシン耐性遺伝子 などのマーカー遺伝子断片が染色体に揷入されていることで、また、蛋白質レベル では、乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が消失していることにより確認できる。
[0026] 上述の如くして作製されたコリネ型細菌の ldh破壊株は、さらに、 PC遺伝子を高発 現すべく形質転換される。すなわち、 PC活性を有する酵素をコードする遺伝子配列 を含む核酸断片を上記のコリネ型細菌の ldh破壊株に導入し、導入前の ldh破壊株 に比し PC活性をより高く発現すベぐ形質転換される。
[0027] PC遺伝子を含む核酸断片の導入法は後記の実施例にて詳記するが、本発明の 目的で使用される PC遺伝子を含む核酸断片は微生物、動植物の染色体上に広く存 在しており、本発明のコリネ型細菌自身の有するものであっても外来（異種）由来のも のでも良い。
[0028] また、その塩基配列が既知であれば、その配列に従って合成した遺伝子を使用す ることも出来る。遺伝子配列が不明の場合であっても、 PC活性を指標にして酵素蛋 白質を精製し、その N末端アミノ酸配歹 lj、部分分解配列より、通常のハイブリダィゼー シヨンの手法により核酸断片を単離できる。また、 PC酵素蛋白質間で保存されている アミノ酸配列をもとにハイブリダィゼーシヨン、 PCR法により断片を取得することが可 能である。取得した断片は通常の手法により塩基配列を決定することができる。
[0029] 特性が明らかにされている PC酵素蛋白あるいは遺伝子には下記のものがある。
コリネバクテリウム'グルタミクム（C. glutamicum)； (GenBank Y09548) ヒト；（GenBank K02282 ； S. Freytag et al. , J. Biol. Chem. , 259, 1283 1-12837 (1984) )
サッカロミセス.セレビシエー（S. cerevisiae)； (GenBank X59890, J03889, an dM16595 ; R. Stucka et al. , Mol. Gen. Genet. , 229, 305-315 (1991)； F. Lim et al. , J. Biol. Chem. , 263, 11493— 11494 (1988) ; D. Myers et al. , Biochemistry, 22, 5090—5096 (1983) )
リゾビゥム 'ェトリ（R. etli) ; (GenBank U51439 ; M. Dunn et al. , J. Bacterio 1. , 178, 5960-5070 (1996) )
シゾサッカロミツセス'ボンべ（S. pombe)； (GenBank D78170)
バシルス.ステアロサーモフルス（B. stearothermophilus)； ( GenBank D8370
6 ; H. Kondo, Gene, 191 , 47—50 (1997) ; S. Libor, Biochemistry, 18, 364
7-3653 (1979) )
シユードモナス.フルオレセンス（P. fluorescens)； (R. Silvia et al, J. Gen. Mic robiol.， 93, 75-81 (1976) )
[0030] 本発明の PC遺伝子は PC活性が保持される限り、塩基配列の一部が他の塩基と置 換、削除または新たに塩基が揷入されていてもよぐさらには塩基配列の一部が転位 されているものでも良レ、。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記 一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、 1乃至数個であってよい。
[0031] 本発明の PC遺伝子を含む核酸断片は前述のコリネ型細菌 ldh破壊株へ、プラスミ ドベクターを用いて、 PC遺伝子が発現可能な制御配列下に導入される。ここで「制 御配列下」とは PC遺伝子力 例えば、プロモーター、インデューサー、オペレーター
、リボソーム結合部位および転写ターミネータ一等との共同作業により自律複製でき ることを意味する。このような目的で使用されるプラスミドベクターとしては、コリネ型細 菌 ldh破壊株内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例 としては、 ί列えは、、 pAM330 (Agric. Biol. Chem. , vol. 48, 2901-2903 (1984 )ぉよび Nucleic Acids Symp Ser. , vol. 16， 265-267 (1985) ) (Brevibact erium lactofermentum 2256由来)、 pHM1519 (Agric. Biol. hem. , vol. 4 8、 2901— 2903 (1984) ) (Corynebacterium glutamicum ATCC13058由来 )、 pCRY30 (Appl . Environ. Microbiol. , vol. 57, 759— 764 (1991) )、 pEK 0, pEC5, pEKExl (Gene, vol. 102, 93— 98 (1991) )そして pCG4 l. Bacterio 1. , vol. 159, 306-311 (1984) ) (Corynebacterium gluatmicum T250由来 )等が挙げられる。
[0032] 本発明のコリネ型細菌形質転換体創製に使用されるプラスミドの構築は、例えば、 コリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum) R株由来の PC 遺伝子を用いる場合では完全な PC遺伝子を含む 3. 8 - kb遺伝子断片〔コリネバクテ リウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum) R株の全ゲノム解析結果（ 野中寛、中田かおり、岡井直子、和田真利子、佐藤由美子、 Kos Peter,乾将行、 湯川英明「Corynebacterium glutamicum R ゲノム解析」日本農芸化学会、 2 003年 4月、横浜、 日本農芸化学会 2003年度大会講演要旨集、 p. 20参照）を基に PCRで増幅可能（詳細は、実施例に記載）〕を、適当なプロモーター、ターミネータ一 等の制御配列を連結後、上記例示されているいずれかのプラスミドベクターの適当な 制限酵素部位に挿入し、構築することが出来る。
[0033] 上記組換えプラスミドにおいて、 PC遺伝子を発現させるためのプロモーターとして は、コリネ型細菌が元来保有するプロモーターが挙げられるが、それに限られるもの ではなぐ PC遺伝子の転写を開始させる機能を有する塩基配列であればレ、かなるも のであってもよい。また、 PC遺伝子の下流に配置される制御配列下のターミネータ 一についても、コリネ型細菌が元来保有するターミネータ一が挙げられる力 それら に限定されるものではなぐ例えば大腸菌由来のトリプトファンオペロンのターミネ一 ター等の PC遺伝子の転写を終了させる機能を有する塩基配列であれば、いかなる ものであってもよレ、。
[0034] PC遺伝子を含むプラスミドベクターのコリネ型細菌 ldh破壊株への導入方法として は、電気パルス法（エレクト口ポレーシヨン法）や CaCl法等コリネ型細菌 ldh破壊株
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への PC遺伝子導入が可能な方法であれば特に限定されるものではない。
その具体例として、例えば電気パルス法は、公知の方法 (Agric. Biol. Chem. , ν ol. 54, 443— 447 (1990)、 Res. Microbiol. , vol. 144, 181— 185 (1993) )を 用レ、ることができる。
[0035] 本発明のコリネ型細菌形質転換創製体の取得方法としては、常法に従い、 PC遺伝 子を含むプラスミドベクターに薬剤耐性遺伝子等をも組み入れて、適切な濃度の当 該薬剤を含むプレート培地上に PC遺伝子導入処理を行った本発明のコリネ型細菌 を塗布することにより形質転換されたコリネ型細菌を選抜することができる。その具体 ί列としては、 f列えば、、 Agric. Biol. Chem. , vol. 54, 443— 447 (1990)、 Res. Microbiol, vol. 144, 181—185 (1993)に記載の方法等を用いることができる。
[0036] 上記の如くして創製された、 ldh遺伝子が破壊され、そして、 PC遺伝子が高発現す ベく形質転換されている本発明のコリネ型細菌は、菌体名； Corynebacterium glu tamicum R ldh— ZpCRBl_PCのもとに、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号： FERM BP—10060で寄託されてレ、る。
[0037] Corynebacterium glutamicum R ldh— /pCRBl_PCへは、場合により、さら に付加的に本発明のジカルボン酸生成速度の向上に寄与するアナプレロティック経 路酵素遺伝子やトリカルボン酸回路で寄与する、例えば、フマレートレダクターゼ（F RD)遺伝子等を導入することも出来る。そのような本発明のコリネ型細菌の例として、 菌体名； Corynebacterium glutamicum R Wh—ZpCRBl_PC_FRDのもとに 、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号: FERM BP—10061で寄託されている。
[0038] 力べして創製された本発明のコリネ型細菌は特定の還元状態下にある、炭酸イオン 、重炭酸イオンまたは炭酸ガスを含有する反応液中で、換言すれば炭酸イオン、重 炭酸イオンおよび炭酸ガスからなる群から選ばれる 1種類または 2種類以上の混合物 を含有する反応液中で、糖類を原料として、ジカルボン酸、例えばコハク酸、フマー ル酸またはリンゴ酸などを高い生産速度で生成することが出来る。
[0039] 本発明に係るジカルボン酸の製造方法においては、まず上述した本発明の方法で 形質転換創製された好気性コリネ型細菌を好気条件下で増殖培養する。
[0040] 本発明の好気性コリネ型細菌の培養は、炭素源、窒素源および無機塩等を含む通 常の栄養培地を用いて行うことが出来る。培養には、炭素源として、例えばダルコ一 スまたは廃糖蜜等を、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニゥム、 塩ィ匕アンモニゥム、硝酸アンモニゥムまたは尿素等をそれぞれ単独もしくは混合して 用いることが出来る。また、無機塩として、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素 カリウムまたは硫酸マグネシウム等を使用することが出来る。この他にも必要に応じて 、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカ一、カザミノ酸またはビォチン もしくはチアミン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に適宜添加することも出来る。
[0041] 培養は、通常、通気攪拌または振盪等の好気的条件下、約 20°C—約 40°C、好ま しくは約 25°C—約 35°Cの温度で行うことが出来る。培養時の pHは約 5— 10付近、 好ましくは約 7— 8付近の範囲がよぐ培養中の pH調整は酸またはアルカリを添加す ることにより行うことが出来る。培養開始時の炭素源濃度は、約 1一 20% (W/V)、好 ましくは約 2— 5% (W/V)である。また、培養期間は通常約 1一 7日間程度である。
[0042] ついで、本発明の好気性コリネ型細菌の培養菌体を回収する。上記の如くして得ら れる培養物から培養菌体を回収分離する方法としては、特に限定されず、例えば遠 心分離や膜分離等の公知の方法を用いることができる。
[0043] 回収された培養菌体に対して処理を加え、得られる菌体処理物を次工程であるジ カルボン酸生成反応工程に用いてもよい。菌体処理方法としては、培養菌体に何ら かの処理が加えられたものであればよぐ例えば、菌体をアクリルアミドまたはカラギ 一ナン等で固定化する方法等が挙げられる。
[0044] ついで、上記の如くして得られる培養物から回収分離された本発明の好気性コリネ 型細菌の培養菌体またはその菌体処理物は還元状態下の反応培地での目的とする ジカルボン酸の生成反応に供せられる。ジカルボン酸生成方式は、回分式、連続式 いずれの生成方式も可能である。
[0045] 本発明の還元状態下の生化学反応に於いては、本発明の好気性コリネ型細菌の 増殖分裂が抑制され、増殖に伴う分泌副生物の実質的な完全抑制を実現することが 出来る。この観点からは、培養回収されたコリネ型細菌またはその菌体処理物が反 応培地に供せられるときには、コリネ型細菌細胞内外の培養時の環境状態が反応培 地にもたらされない方法や条件を用いることが推奨される。つまり、反応培地は、増殖 培養過程で生成し、菌体内外に存在する生成物質を実質的に含有しないことが好ま しい。より具体的には、増殖培養過程で生成し、菌体外に放出された分泌副生物、 および培養菌体内の好気的代謝機能により生成し菌体内に残存する物質が、反応 培地に実質的に存在しない状態であることが推奨される。このような状態は、例えば、 増殖培養後の培養液の遠心分離、膜分離等の方法および/または培養後の菌体を 還元状態下で約 2時間ないし 10時間程度放置することで実現される。
[0046] 本工程においては、還元状態下の反応培地を用いる。反応培地は、還元状態下に あれば、固体状、半固体状または液体状等いずれの形状を有していてもよい。本発 明の一つの要件は、還元状態下でコリネ型細菌の代謝機能による生化学反応を行 わせしめ、 目的とするジカルボン酸を生成することである。
[0047] 本発明における還元状態とは、反応系の酸化還元電位で規定され、反応培地の酸 化還元電位は、好ましくは約 _200mV — 500mV程度、より好ましくは約 _250mV 一- 500mV程度である。反応培地の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬 (還元状 態であれば、青色から無色への脱色）である程度推定できるが、正確には酸化還元 電位差計（例えば、 BROADLEY JAMES社製、 ORP Electrodes)を用いる。本 発明においては、反応培地に菌体またはその処理物を添加した直後からジカルボン 酸を採取するまで、還元状態を維持していることが好ましいが、少なくともジカルボン 酸を採取する時点で反応培地が還元状態であればよい。反応時間の約 50%以上、 より好ましくは約 70%以上、さらに好ましくは約 90%以上の時間、反応培地が還元 状態に保たれていることが望ましい。なかでも、反応時間の約 50%以上、より好ましく は約 70%以上、さらに好ましくは約 90%以上の時間、反応培地の酸化還元電位が 約一 200mV—— 500mV程度に保たれていることがより望ましい。 [0048] このような還元状態の実現は具体的には、前記の培養後の培養菌体調製方法、反 応培地の調整方法、または反応途中における還元状態の維持方法等によりなされる
[0049] 還元状態下の反応培地の調整方法は、公知の方法を用いてよい。例えば、反応培 地用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の 培養液調整方法
(Pfennig, N et. al. (1981)： The dissimilatory suliate— reducing bacteri a, In The Prokaryotes, A Handbook on Habitats, Isolation and Iden tification of Bacteria, Ed. by Starr, M. P. et. al. p. 926—940, Berlin, S pringer Verlag.や「農芸化学実験書 第三卷、京都大学農学部 農芸化学教室 編、 1990年第 26刷、産業図書株式会社出版」）などが参考となり、所望する還元状 態の水溶液を得ることが出来る。
[0050] 反応培地用水溶液の調整方法として、より具体的には反応培地用水溶液を加熱処 理ゃ減圧処理することにより溶解ガスを除去する方法等が挙げられる。より具体的に は、約 lOmmHg以下、好ましくは約 5mmHg以下、より好ましくは約 3mmHg以下の 減圧下で、約 1一 60分程度、好ましくは 5— 40分程度、反応培地用水溶液を処理す ることにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応培地用水溶液 を作成することができる。また、適当な還元剤（例えば、チォグリコール酸、ァスコルビ ン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、ダルタチオンそして硫化ソ ーダ等）を添加して還元状態の反応培地用水溶液を調整することも出来る。また、場 合により、これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元状態の反応培地用水 溶液を調整する方法となる。
[0051] 反応途中における還元状態の維持方法としては、反応系外からの酸素の混入を可 能な限り防止することが望ましぐ反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で 封入する方法が通常用レ、られる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反 応途中において本発明のコリネ型細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるた めに、反応系の pH維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が 生じる場合もある力 このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが 有効である。
[0052] 反応系の酸化還元電位に影響する因子としては、反応系雰囲気ガスの種類と濃度 、反応温度、反応溶液 pH、 目的とするジカルボン酸生成のために使用される無機お よび有機の各種化合物濃度と組成等が考えられる。本発明における反応培地の酸 化還元電位とは上記各種影響因子が統合されて示されるものである。
[0053] 反応培地には、ジカルボン酸生成の原料となる糖類および炭酸イオンまたは重炭 酸イオンが含まれている。
[0054] 糖類としては、グルコース、ガラクトース、フルクトースもしくはマンノースなどの単糖 類、セロビオース、ショ糖もしくはラタトース、マルトースなどの二糖類、またはデキスト リンもしくは可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。なかでも、グルコースが好ま しい。この場合、グルコースは約 0. 5— 500g/L (リットル）の濃度範囲で使用される
[0055] 炭酸イオンまたは重炭酸イオンは、炭酸または重炭酸もしくはこれらの塩あるいは 炭酸ガスから供給されるものである。炭酸または重炭酸の塩の具体例としては、例え ば、炭酸アンモユウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモユウム、重炭酸ナ トリウム、そして重炭酸カリウム等が挙げられる。これら炭酸イオンまたは重炭酸イオン は約 1一 500mM、好ましくは約 2— 300mMの濃度範囲で使用される。炭酸ガスが 供給される場合は、約 50mg/L— 25g/L、好ましくは、約 lOOmgZL— 15g/Lの 濃度で溶液中に含有するように供給される。
[0056] ジカルボン酸の生成反応に用いられる反応培地組成は、コリネ型細菌またはその 処理物がその代謝機能を維持するために必要な成分、即ち、各種糖類等の炭素源 と炭酸源の他にも、蛋白質合成に必要な窒素源 (例えばアンモニア、硫酸アンモニゥ ム、塩化アンモニゥム、硝酸アンモニゥムまたは尿素等）、その他リン、カリウムまたは ナトリウム等の塩類、さらに鉄、マンガンまたはカルシウム等の微量金属塩を含む。こ れらの添加量は所要反応時間、 目的ジカルボン酸生産物の種類または用いられるコ リネ型細菌の種類等により適宜定めることが出来る。用いるコリネ型細菌によっては 特定のビタミン類の添カ卩が好ましい場合もある。好気性コリネ型細菌またはその菌体 処理物と糖類との反応は、本発明の好気性コリネ型細菌またはその菌体処理物が活 動できる温度条件下で行われることが好ましぐ好気性コリネ型細菌またはその菌体 処理物の種類などにより適宜選択することができる（詳しくは実施例参照）。
[0057] 上述のようにして反応培地で生成したジカルボン酸を採取する。その方法はバイオ プロセスで用いられる公知の方法を用いることが出来る。そのような公知の方法として 、ジカルボン酸生成液の塩析法、再結晶法、有機溶媒抽出法、エステル化蒸留分離 法、クロマトグラフィー分離法または電気透析法等があり、ジカルボン酸の特性に応じ てその分離精製採取法は適宜定めることが出来る。
実施例
[0058] 以下、実施例でもって本発明を説明するが、本発明はこのような実施例に限定され るものではない。なお、「％」は、特に断りのない限り、「重量％」を示す。
[0059] 〔実施例 1〕コリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum) R株
(独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号: FERM P - 18976)の ldh遺伝子破壊株の作製
(A)コリネバタテリゥム グノレタミカム（Corynebacterium glutamicum) R株からの 全 DNAの抽出
A培地 1L [組成： 尿素： 2g， （NH ) SO : 7g, KH P〇 : 0. 5g, K HP〇 ：0. 5g
4 2 4 2 4 2 4
， MgSO - 7H O : 0. 5g, FeSO - 7H〇：6mg， MnSO ·ηΗ 0 : 4. 2mg, D—ビ才
4 2 4 2 4 2
チン： 200 z g,塩酸チアミン： 200 x g，酵母エキス 2g,カザミノ酸 7g,ク、、ノレコース 20 gおよび蒸留水： 1000ml (pH6. 6) ]に、野生株 Corynebacterium glutamicum Rを、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期後期まで 33°Cで培養し、菌体を集めた
[0060] 得られた菌体を 10mg/mlの濃度になるよう、 lOmg/ml リゾチーム、 10mM N aCl、 20mMトリス緩衝液（pH8. 0)および ImM EDTA' 2Naの各成分を含有する 溶液 15ml (各成分の濃度は最終濃度である）に懸濁した。次にプロテナーゼ Kを最 終濃度が 100 / g/mlになるように添加し、 37°Cで 1時間保温した。さらにドデシル 硫酸ナトリウム（SDS)を最終濃度が 0. 5%になるように添加し、 50°Cで 6時間保温し て溶菌した。この溶菌液に、等量のフエノール/クロ口ホルム溶液を添加し、室温で 1 0分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（5, OOO X g, 20分間， 10— 12°C) し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを 0. 3Mとなるよう添加した後、 2 倍量のエタノールをゆつくりとカロえた。水層とエタノール層の間に存在する DNAをガ ラス棒でまきとり、 70%エタノールで洗浄した後、風乾した。得られた DNAに 10mM トリス緩衝液（pH7. 5) _lmMEDTA' 2Na溶液 5mlを加え、 4°Cでー晚静置し、以 後の実験に用いた。
[0061] (B) ldh遺伝子のクローン化と遺伝子破壊用プラスミドの創製
上記 (A)項で調製した染色体 DNAを铸型として、 PCRを行った。
PCRに際しては、 ldh遺伝子をクローン化するベぐコリネバタテリゥム ダルタミカム (Corynebacterium glutamicum) R株の全ゲノム解析結果（野中 寛、中田 力 おり、岡井 直子、和田 真利子、佐藤 由美子、 Kos Peter、乾 将行、湯川 英 明「Corynebacterium glutamicum R ゲノム解析」日本農芸化学会、 2003年 4 月、横浜、 日本農芸化学会 2003年度大会講演要旨集、 p. 20参照）を基に、下記の 1対のプライマーを、アプライド 'バイオシステムズ (Applied Biosystems)社製「39 4 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer)」を用レ、て合成し、使用した。
ldh遺伝子増幅用プライマー
ldh-N； 5 ' -CTCTGTCGACATCAGGAAGTGGGATCGAAA-3 ' (配 列番号 1)，
ldh-C； 5 ' -CTCTGTCGACTTCCATCCAACAGTTTCATT-3 ' (配列 番号 2)
尚、いずれのプライマーも Sail サイトが末端に付加されている。
[0062] PCRは、パーキンエルマーシータス社製の「DNAサーマルサイクラ一」を用い、反 応試薬として、タカラ'ィ一エックス 'タック (TaKaRa Ex Taq) (宝酒造株式会社製 )を用いて下記の条件で行った。
反応液：
( 10 X ) PCR緩衝液 10 μ \
1. 25mM dNTP混合液 16 μ \
鎳型 DNA 10 μ DNA含有量l μ M以下）
上記記載の 2種のプライマー 各々 1 μ 1 (最終濃度 0. 25 μ Μ) タカラ'ィ一エックス'タック DNA'ポリメラーゼ 0. 5 μ 1
滅菌蒸留水 61. 5 μ 1
以上を混合し、この 100 μ 1の反応液を PCRにかけた。
PCRサイクノレ：
デナチユレーシヨン過程： 94°C 60秒
アニーリング過程 : 52°C 60秒
エクステンション過程 ：72°C 120秒
以上を 1サイクルとし、 30サイクル行った。
[0063] 上記で生成した反応液 10 μ ΐを 0. 8%ァガロースゲルにより電気泳動を行い、 ldh 遺伝子の場合、約 1. lkbの DNA断片が検出できた。
次に、上記 ldh遺伝子を含む 1. lkb PCR産物 10 μ ΐおよびクロラムフエ二コール 耐性遺伝子を含有するプラスミド PHSG398 (宝酒造株式会社製） 2 μ 1を各々制限 酵素 Sailで切断し、 70°Cで 10分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者 を混合し、これに T4DNAリガーゼ 10 X緩衝液 1 μ 1、 T4DNAリガーゼ limitの 各成分を添加し、滅菌蒸留水で 10 μ ΐにして、 15°Cで 3時間反応させた。このライゲ ーシヨン液を用レ、、塩化カルシウム法 Joumal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりェシエリヒア'コリ JM109 (宝酒造株式会社製）を形質転換し、ク 口ラムフエニコーノレ 50mg、 X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D- galactopyranoside) 200mg、 IPTLJ usopropyl 1— thio— beta— d— galactoside ) lOOmgを含む培地〔トリプトン 10g、イーストエキストラタト 5g、NaCl 5gおよび 寒天 16gを蒸留水 1Lに溶解〕に塗抹した。
[0064] 上記培地上で白色を呈する生育株を選定し常法により液体培養し、培養液よりブラ スミド DNAを抽出し、制限酵素 Sailで切断し、揷入断片を確認した。この結果、ブラ スミド PHSG398 約 2. 2kbの DNA断片に加え、 ldh遺伝子を含有する長さ約 1. Ik bの揷入 DNA断片が認められた。
該 ldh遺伝子を含むプラスミドを pHSG398_LDHとした。
このプラスミド PHSG398—LDHに含まれる ldh遺伝子のほぼ中央には、制限酵素 部位 EcoRV (本プラスミド内で 1箇所のみ）が存在する。上記のように抽出したプラス ミド PHSG398— LDHの DNA溶液 10 μ 1を EcoRVで完全に切断し、 70°Cで 10分 処理することにより制限酵素を失活させた。
[0065] 一方、プラスミド pUC4K (フアルマシア社製） 2 μ 1を制限酵素 Pstlで切断後、ァガ ロース電気泳動により分離後、ゲルから約 1. 2kbPstI カナマイシン耐性遺伝子を 含む DNA断片を切り出し、精製した。この精製 1. 2kbPstI カナマイシン耐性遺伝 子 DNA断片を DNAブランティングキット（宝酒造株式会社製）により平滑末端処理 を行った。
[0066] 上記 EcoRV切断 pHSG398_LDH DNA溶液と平滑末端処理 1. 2kbPstI 力 ナマイシン耐性遺伝子 DNA溶液を混合し、これに T4DNAリガーゼ 10 X緩衝液 1 μ 1、 T4DNAリガーゼ lunitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で 10 μ 1にして、 15°C で 3時間反応させた。このライゲーシヨン液を用い、塩化カルシウム法 Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕 tこよりェシエリヒア · 3 】Μ109 (宝酉造 株式会社製）を形質転換し、カナマイシン 50mgを含む培地〔トリプトン 10g、ィース トエキストラタト 5g、NaCl 5gおよび寒天 16gを蒸留水 1Lに溶解〕に塗抹した。
[0067] 上記培地上での生育株を選定し常法により液体培養し、培養液よりプラスミド DNA を抽出し、制限酵素 Sailで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミド pHSG 398 約 2. 2kbの DNA断片に加え、 ldh遺伝子の中央にカナマイシン耐性遺伝子 を含有する長さ約 2. 3kbの揷入 DNA断片が認められた。
このプラスミドを pHSG398_LDHZKmとした。
[0068] (C) ldh遺伝子破壊株の創製
プラスミド PHSG398およびその派生物である上記（B)項で得られたプラスミド pHS G398— LDH/Kmは、コリネバタテリゥム属（コリネバクテリゥム グルタミカム（Cory nebacterium glutamicum) R株を含む）内で複製不可能なプラスミドである。プラ スミド PHSG398— LDH/Kmを、電気パルス法（Y. Kumsu, et al. , Agric. Biol . Chem. 54 : 443-447. 1990.および A. A. Vertes, et al.， Res. Microbiol . 144 : 181-185. 1993)の方法 ίこ従って、コリネノ クテリゥム グノレタミカム（Coryn ebacterium glutamicum) R株へ導入し、カナマイシン 50 μ gZmlを含む Α寒天 培地（1L [組成：尿素： 2g, (NH ) SO : 7g, KH PO : 0. 5g, K HPO : 0. 5g, M gS〇 · 7Η O : 0. 5g, FeSO - 7H〇：6mg， MnSO ·ηΗ 0 : 4. 2mg, D_ビォチ
4 2 4 2 4 2
ン： 200 x g，塩酸チアミン： 200 z g,酵母エキス： 2g，カザミノ酸： 7g,グルコース： 2 0g，寒天： 16gを蒸留水に 1000ml溶解（pH6. 6) ] )に塗布した。
[0069] 上記のカナマイシン 50 μ g/mlを含む Α寒天培地上で増殖した生育株は、プラスミ ド PHSG398 - LDHZKmが染色体上の野生型 ldh遺伝子と 1点相同性組換えを起 こした場合、ベクター PHSG398上のクロラムフエ二コール耐性遺伝子の発現による クロラムフエ二コール耐性と、 ldh遺伝子中のカナマイシン耐性遺伝子の発現による力 ナマイシン耐性を示すのに対して、 2点相同性組換えを起こした場合は、ベクター pH SG398上のクロラムフエ二コール耐性遺伝子が脱落するためクロラムフエニコール感 受性と、 ldh遺伝子中のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性を示 す。従って、 目的とする ldh遺伝子破壊株は、クロラムフエ二コール感受性、カナマイ シン耐性を示す。
[0070] クロラムフエ二コール感受性、カナマイシン耐性を示した生育株を常法により液体培 養し、培養液より染色体 DNAを抽出し、以下に述べるゲノミックサザンハイブリダィゼ ーシヨンにより染色体上の ldh遺伝子の破壊を確認した。染色体 DNAを適当な制限 酵素で分解した後、ナイロンフィルター（Hybond N；アマシャム社製）にブロッテイン グし、上記（B)項で得た LDH遺伝子を含む 1 · lkb PCR産物をプローブとして、 DI Gシステム（ベーリンガー社製）によりラベル化し、ゲノミックサザンハイブリダィゼーシ ヨンを行った。野生株より抽出した染色体 DNAを用いたゲノミックサザンハイブリダィ ゼーシヨンのパターンと比較して、遺伝子破壊株のパターンは、上記（B)項に示した 1. 2kbカナマイシン耐性遺伝子分長いバンドが検出され、染色体上の ldh遺伝子の 破壊が確認できた。このようにして得られた ldh遺伝子破壊株をコリネバタテリゥム グ ノレタミカム (Corynebacterium glutamicum) R ldh株と命名した。
[0071] 尚、コリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum) R ldh— 株における ldh活性の消失は、以下の方法により確認した。
コリ不ノ クテリゥム グノレタミカム (Corynebacterium glutamicum) R Wh—株を、 A培地 100ml (1L [組成：尿素： 2g, (NH ) SO : 7g, KH P〇 : 0. 5g, K HP〇 ：
4 2 4 2 4 2 4
0. 5g, MgSO - 7H O : 0. 5g, FeSO - 7H〇：6mg, MnSO ·ηΗ〇：4. 2mg, D —ピオチン： 200 z g，塩酸チアミン： 200 x g,酵母エキス： 2g，カザミノ酸： 7g,ダルコ ース： 20gおよび蒸留水： 1000ml (pH6. 6) ] )に、白金耳を用いて植菌後、対数増 殖期後期まで 33°Cで培養し、菌体を集めた。この菌体をトリス緩衝液（lOOmM Tri s-HCl (ρΗ7. 5) , 20mM KC1, 20mM MgCl， 5mM MnSO， 0. ImM E
2 4
DTA, 2mM DTT)にて 1回洗浄した。この洗浄菌体 0. 5gを同緩衝液 2mlに懸濁 し、氷冷下で超音波破砕機（Astrason model XL2020)を用いて菌体破砕物を 得た。該破砕物を遠心分離（10， 000xg, 4°C, 30分）し、上清を粗酵素液として得 た。対照として野性型コリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacterium glutami cum) R株の粗酵素液も同様に調製し、以下の活性測定に供した。 ldhの活性測定 は、ピルビン酸を基質とした乳酸生成に伴い、補酵素 NADHが NAD+に酸化される 量を、 340nmの吸光度変化として測定する方法（Bunch, P. K. , F. Mat-Jan, N . Lee, and D. P. Clark. 1997. The ldhA gene encoding the fermenta tive lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143 : 18 7-195. )により行った。この結果、コリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacteri urn glutamicum) R ldh—株における ldh活性は検出されなかったことより、 ldh遺 伝子の破壊を確認した。
〔実施例 2〕コリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum) R 1 dh_株の PC遺伝子高発現組換え株創製。
(A)コリネ型細菌—大腸菌シャトルベクター pCRBlの構築
ブレビバタテリゥム ラタトフアーメンタム（Brevibacterium lactof ermentum) AT CC13869に内在するプラスミド pAM330 (Yamaguchi, R. et al.， Agric. Biol. Chem. 50, 2771— 2778 (1986)、特開昭 58— 67679号公報）の〇RF1 (rep)を含 む DNA断片を以下の PCR法により増幅した。
PCRに際しては、下記の 1対のプライマーを、アプライド 'バイオシステムズ (Applie d Biosystems)社製「394 DNAZRN Aシンセサイザー（synthesizer)」を用レヽ て合成し、使用した。
ORFl (rep)遺伝子増幅用プライマー 列番号 3)，
Rep-C； 5 ' -CTCTGTTAACACATGCAGTCATGTCGTGCT-3 ' (酉己 列番号 4)
尚、いずれのプライマーも Hpal サイトが末端に付加されている。
鎳型 DNAは、プラスミド pAM330を用いた。
PCRは、〔実施例 1〕（B)項と同様の条件で行った。
上記で生成した反応液 10 を 0. 8%ァガロースゲルにより電気泳動を行レ、、 Rep 遺伝子を含む、約 1. 8kbの DNA断片が検出できた。
[0073] 一方、コリネ型細菌一大腸菌シャトルベクターを構築する際に、クロラムフエニコーノレ 耐性遺伝子を含む大腸菌ベクター PHSG398 (宝酒造製）の lacZ a遺伝子とその内 部のマルチクローニングサイトを保存するため、 PCRにより新たに EcoRV サイトを 付カロする うに、 PHSG398を増幅した。
PCRに際しては、下記の 1対のプライマーを、アプライド 'バイオシステムズ (Applie d Biosystems) t 「394 DNAZRN Aシンセサイザー (synthesizer)」を用い て合成し、使用した。
プラスミド PHSG398増幅用プライマー 列番号 5)，
398-C ; 5 ' -CTCTGATATCTCCGTCGAACGGAAGATCAC-3 ' (酉己 列番号 6)
尚、いずれのプライマーも EcoRV サイトが末端に付加されている。
鎳型 DNAは、プラスミド pHSG398を用レヽた。
PCRは、〔実施例 1〕（B)項と同様の条件で行った。
[0074] 上記で生成した反応液 10 μ 1を 0. 8%ァガロースゲルにより電気泳動を行レ、、プラ スミド PHSG398全長を含む、約 2. 2kbの DNA断片が検出できた。
次に、 Hpalで切断した上記 Rep遺伝子を含む約 1. 8kbの DNA断片 5 μ 1と EcoR Vで切断したプラスミド pHSG398全長を含む約 2. 2kbの DNA断片を混合し、これ に、 T4 DNAリガーゼ 10 X緩衝液 l /i l、T4 DNAリガーゼ lunitの各成分を添 加し、滅菌蒸留水で 10 μ ΐにして、 15°Cで 3時間反応させ、結合させた。
[0075] 得られたプラスミド混合液を用レ、、塩化カルシウム法 lournal of Molecular Bi ology, 53, 159 (1970)〕ίこょりェシェリヒァ·コリJM109 (宝酒造製）を形質転換し、 クロラムフエ二コール 50mgを含む培地〔トリプトン 10g、イーストエキストラタト 5g、 Na Q5gおよび寒天 16gを蒸留水 1Lに溶解〕に塗抹した。
[0076] この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミド DNAを抽出、 該プラスミドを制限酵素で切断し、揷入断片を確認した。この結果、プラスミド pHSG 398 2. 2kbの DNA断片に加え、長さ約 1. 8kbの挿入 DNA断片が認められた。 このコリネ型細菌-大腸菌シャトルベクターを pCRBlと記する。
[0077] (B) PC遺伝子のクローン化と組換え体の創製
〔実施例 1〕（A)項で調製した染色体 DNAを铸型として、 PCRを行った。 PCRに際しては、 PC遺伝子をクローン化するベぐコリネバタテリゥム ダルタミカム (Corynebacterium glutamicum) R株の全ゲノム解析結果（野中寛、中田かおり 、岡井直子、和田真利子、佐藤由美子、 Kos Peter,乾将行、湯川英明「Coryneb acterium glutamicum R ゲノム解析」日本農芸化学会、 2003年 4月、横浜、 日 本農芸化学会 2003年度大会講演要旨集、 p. 20参照）を基に、下記の 1対のプライ マーを、アプライド 'バイオシステムズ (Applied Biosystems)社製「394 DNA/ RN Aシンセサイザー（synthesizer)」を用レ、て合成し、使用した。
PC遺伝子増幅用プライマー
PC-N； 5 ' -CTCTACATGTTGCAGGTCAGAGGAGTGT-3 ' (配列番 号 7)，
PC-C ; 5 ' -CTCTGCATGCAGGAATCGTGTGCATGGTC-3 ' (配列 番号 8)
尚、前者は Nspl サイトが、後者は SpMサイトがそれぞれ末端に付加されている。 鎳型 DNAは、上記（A)項にて抽出したコリネバタテリゥム ダルタミカム（Coryneb acterium glutamicum) R株のゲノム DNAを用レ、た。
PCRは、〔実施例 1〕（B)項と同様の条件で行った。
上記で生成した反応液 10 μ ΐを 0. 8%ァガロースゲルにより電気泳動を行い、 PC 遺伝子の場合、約 3. 8kbの DNA断片が検出できた。
[0078] 次に、上記 PC遺伝子を含む 3. 8kb PCR産物 Ι Ο μ Ιを制限酵素 Nsplと Sphlで切 断したもの、および上記 (A)項で構築したコリネ型細菌—大腸菌シャトルベクター pC RB I 2 を制限酵素 SpWで切断したものをそれぞれ、 70°Cで 10分処理すること により制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに T4DNAリガーゼ 10 X緩衝 液 1 μ 1、 T4DNAリガーゼ l mitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で 10 μ 1にして、 15°Cで 3時間反応させた。このライゲーシヨン液を用レ、、塩化カルシウム法 Journal of Molecular Biology, 53, 159 ( 1970)〕 tこよりェシエリヒア · 3 】Μ109 (宝酉 造株式会社製）を形質転換し、クロラムフエ二コール 50mg、 X— gal (5— Bromo— 4— chloro— 3— mdoxyl— beta— D— galactopyranoside) 200mg、 IPTG (isopropyl 1— thio— beta— d— galactoside) l OOmgを含む培地〔トリプトン 10g、イーストエキスト ラクト 5g、 NaC gおよび寒天 16gを蒸留水 1Lに溶解〕に塗抹した。
[0079] 上記培地上で白色を呈する生育株を選定し常法により液体培養し、培養液よりブラ スミド DNAを抽出し、制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミド PHSG398約 2. 2kbの DNA断片に加え、 PC遺伝子を含有する長さ約 3. 8kbの揷 入 DNA断片が認められた。
該 PC遺伝子を含むプラスミドを pCRBl_PCと命名した。
[0080] 次に、プラスミド pCRBl— PCを電気パルス法（Y. Kurusu, et al.， Agric. Biol . Chem. 54 : 443-447. 1990.および A. A. Vertes, et al.， Res . Microbiol . 144 : 181-185. 1993)の方法 ίこ従って、コリネノ クテリゥム グノレタミカム（Coryn ebacterium glutamicumj R ldh株へ 入し 7こ。
組み換え菌体名；コリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacterium glutamicu m) R ldh— /pCRB l - PC独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セン ター 受託番号； FERM BP— 10060
[0081] 尚、コリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum) R ldh" ZpCRBl_PCの PC活性は、 PC活性測定法（Uy， D.， S. Delaunay, J. Engas ser, and J. Lioergen. 1999. A method for the determination of pyru vate carboxylase activity during the glutamic acid fermentation wit h Corynebacterium glutamicum. J Microbiol Methods 39 : 91— 96)およ びウェスタンブロット法（Peters—Wendisch, P. G. , V. F. Wendisch, S. Paul, B. J. Eikmanns, and H. Sahm. 1997. Pyruvate carboxylase as an ana plerotic enzyme in Corynebacterium glutamicum. Microbiology, 143 : 1095—1103)により、野生株（コリネバクテリゥム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum) R株）に比べて約 6倍の活性上昇が観察された。
[0082] 〔実施例 3〕組換え株の菌体培養 &コハク酸生成実験
(1)コリネノ クテリゥム グノレタミカム (Corynebacterium glutamicum) R ld ~/ pCRBl— PC株の好気的条件による培養：
(培養基の調製）；尿素 2g、硫安 7g、 KH PO 0. 5g、 K ΗΡΟ 0. 5g、 MgSO · 7Η
2 4 2 4 4
〇0. 5g、 FeSO · 7Η〇6mg、 MnSO · 7Η〇4. 2mg、 Biotin (ピオチン） 200 μ g
2 4 2 4 2
、塩酸チアミン 200 μ g、酵母エキス 2g、カザミノ酸 7g、蒸留水 1000mlからなる培地 500mlを容量 1Lフラスコに分注し、 120°Cで 10分間加熱滅菌後、室温に冷却した 該フラスコを種培養基とした。同じく同組成の培地 1000mlを 2L容ガラス製ジャーフ アーメンターに入れ、 120°C、 10分間加熱滅菌し、本培養基とした。
(培養）：上記種培養基 1ケに、コリネバタテリゥム ダルタミカム（Corynebacterium glutamicum) R ldh / pCRBl_PCを無菌条件下にて接種し、 33°Cにて 12時 間好気的振盪培養を行い、種培養液とした。この種培養液 50mlを上記ジャーファー メンターに接種し、通気量 lwm (Volume/VolumeZMinute)、温度 33°Cで一昼 夜、本培養を実施した。培養液を約 3時間窒素ガス雰囲気下で静置した後、培養液 200mlを遠心分離機にかけ（5000回転、 15分）、上澄み液を除去した。このようにし て得られた wet菌体を、以下の反応に用いた。
[0083] (2)反応用反応培地溶液の調製：
硫安 7g、 KH PO 0. 5g、 K HP〇 0. 5g、 MgSO - 7H〇0. 5g、 FeSO - 7H
2 4 2 4 4 2 4 2
〇6mg、 MnSO - 7H〇4. 2mg、 Biotin (ピオチン） 200 μ g、塩酸チアミン 200〃g
4 2
、蒸留水 1000mlからなる反応原液を調製し、 120°Cで 10分加熱後、減圧条件（一 3 mmHg)にて 20分間、溶解している酸素の除去を行った。反応原液の還元状態の 確認は減圧開始時に反応原液に加えた還元状態指示薬レサズリンの色調変化 (青 色から無色への変化）にて行った。この反応原液 500mlを容量 1Lの窒素雰囲気下 のガラス製反応容器に導入した。この反応容器は pH調整装置、温度維持装置、容 器内反応液攪拌装置および還元電位測定装置を備えている。
[0084] (3)反応の実施：
前記培養後調製されたコリネ型細菌菌体を窒素ガス雰囲気下にある反応容器内の 反応原液 500mlにカロえた。グノレコース 200mM、炭酸ナトリウム 200mMを加え、反 応温度 33°Cに維持し、有機化合物生成反応を行った。反応時の酸化還元電位は初 期- 200mVであったが反応開始後直ちに低下し、 -400mVに維持して反応が継続 された。 3時間反応後、反応培地溶液の液体クロマトグラフィーによる分析をしたとこ ろ、コハク酸 163mM (19. 2g/L)、リンゴ酸 5mM (0· 67g/L)が生成していた。乳 酸は検出されなかった。
[0085] 〔比較例 1〕 ldh遺伝子の破壊効果その 1
実施例 3で使用したコリネ型細菌をコリネバタテリゥム ダルタミカム（Corynebacter ium glutamicum) R株（野生株）とコリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacter ium glutamicum) R/pCRBl_PC (野生株（コリネバクテリゥム グルタミカム（Cor ynebacterium glutamicum) !^*)にプラスミド pCRBl_PCを形質転換した株）に 変えた以外は、実施例 3と同様の方法、条件にて有機化合物生成反応を行った。尚 、形質転換は、実施例 2 (B)項と同様の方法により行った。 3時間反応後、反応培地 溶液の液体クロマトグラフィーによる分析をしたところ、コリネバタテリゥム ダルタミ力 ム（Corynebacterium glutamicum) R株（野生株）は、コハク酸 8 ImM (9. 6g/ L)、乳酸 200mM (18. OgZUが生成しており、コリネバタテリゥム グノレタミカム（C orynebacterium glutamicum) R/pCRBl_PCは、コハク酸 82mM (9. 7g/L) 、乳酸 202mM (18. lgZUが生成していた。なお、いずれの株を用いた場合もリン ゴ酸は検出されなかった。
すなわち、これらの実験結果は、野生株（コリネバクテリゥム グノレタミカム（Coryne bacterium glutamicum) R株）において PC遺伝子を高発現させてもコハク酸生成 量の増加は認められないこと、また、いずれも実施例 3におけるコリネバタテリゥム グ ノレタミカム (コリネバクテリゥム グノレタミカム (Corynebacterium glutamicum) R 1 dh_/pCRBl_PC株と比べて 1Z2程度のコハク酸生産性であることから、 ldh破壊 力 Sコハク酸生産性の向上に対して非常に有効であることを示している。
[0086] 〔比較例 2〕 ldh遺伝子の破壊効果その 2
使用する菌体株を実施例 1 (C)記載の方法で作製したコリネバタテリゥム ダルタミ カム（Corynebacterium glutamicum) R ldh—株に替えること以外は、実施例 3と 同様の方法、条件にて有機化合物生成反応を行った。
3時間反応後、反応培地溶液の液体クロマトグラフィーによる分析をしたところ、コハ ク酸 80mM (9. 4g/L)が生成していた。尚、乳酸、リンゴ酸は検出されなかった。こ の結果より、 ldh遺伝子の破壊のみではコハク酸生産性の向上効果はないこと、コリ ネバクテリゥム グノレタミカム (Corynebacterium glutamicum) R ldh—株にぉレヽ て PC遺伝子を高発現させることにより始めてコハク酸の生産性が 2倍程度増加し、本 発明の効果が現れることが判る。
[0087] 〔比較例 3〕 ldh遺伝子破壊株への PEPC遺伝子高発現効果
実施例 3で使用したコリネ型細菌をコリネバタテリゥム ダルタミカム（Corynebacter ium glutamicum) R ldh— /pCRBl_PEPC株に変えた以外は、実施例 3と同様 の方法、条件にて有機化合物生成反応を行った。
尚、プラスミド pCRBl— PEPCの創製は、文献（Appl. Environ. Microbiol. , 57 : 1746— 1752 (1991)、 Mol. Gen. Genet. , 218 : 330— 33 (1989)および Gene ， 77 : 237-251 (1989) )で公知の PEPC遺伝子を特異的に増幅するプライマーを 利用する以外は、実施例 2の方法に従った。
即ち 2種のプライマー
PEPC-N； 5 ' -CTCTGTCGACAGCACAGCCTTAAAGCA-3 ' (配列番号 9)
PEPC-C； 5， -CTCTGTCGACTTGTGCAGCAAGACGAAA-3， (配列番 号 10)
(いずれのプライマーも（下線部分に示すように Sailサイトが末端に付加されている） および鎳型 DNAとしてコリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacterium gluta micum) R株の染色体 DNAを用いた PCRにより増幅し、コリネ型細菌一大腸菌シャト ルベクター pCRBlの Sailサイトに導入する方法によりプラスミド pCRBl—PEPCを創 製した。
[0088] また、コリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum) R ldh_ 株への形質転換は、実施例 2の方法に従った。尚、コリネバタテリゥム ダルタミカム（ Corynebacterium glutamicum) R ldh— ZpCRBl— PEPC株は、コリネバタテリ ゥム グノレタミカム（Corynebacterium glutamicum) R Wh—株に比べて、文献 (J . Bacteriol.， 179 : 4942—4945 (1997) )の方法により PEPC活性を比較したとこ ろ、 PEPC活性が 4倍上昇していた。
3時間反応後、反応培地溶液の液体クロマトグラフィーによる分析をしたところ、コハ ク酸 83mM (9. 8g/L)が生成していた。尚、乳酸は検出されなかった。コリネバクテ リウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum) R ldh—株において PEPC 遺伝子高発現させてもコハク酸の生産性は向上しないことが判る。
[0089] 〔実施例 4〕付加的に FRD遺伝子を導入した効果
実施例 3で使用したコリネ型細菌をコリネバタテリゥム ダルタミカム（Corynebacter ium glutamicum) R ldh— /pCRBl_PC_FRD株に替えた以外は、実施例 3と同 様の方法、条件にて有機化合物生成反応を行った。
プラスミド pCRBl_PEPC_FRDとは、実施例 2 (B)項で構築したプラスミド pCRBl 一 PCに大腸菌由来のフマール酸レダクターゼ遺伝子（酵素名は FRD、遺伝子名は f rdと略）を連結したものである。フマール酸レダクターゼは、トリカルボン酸回路に於 けるフマール酸からコハク酸への変換を触媒する酵素である。
プラスミド pCRBl—PEPC—FRDの創製方法は下記の方法で行なった。
[0090] 大腸菌由来の frd遺伝子のクローニングは、 PCRにより増幅した力 PCRに際して は、 frd遺伝子をクローン化するベぐェシエリチア コリ（Escherichia coli) K- 12 株の全ケノム角军析結果 (Tne complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science, 277 (5331)， 1453— 1474 (1997)参照）を基に、下記の 1 対のプライマーを、アプライド 'バイオシステムズ（Applied Biosystems)社製「394
DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer)」を用いて合成し、使用した。 frd遺伝子増幅用プライマー frd-N； 5， -CTCTGCATGCGGATGCCGTTTCGCTCATAG-3， (酉己 列番号 11)
f rd-C； 5 ' -CTCTGCATGCTAATAAGGCGCAGAGCGTCG-3 ' (配 列番号 12)
尚、いずれのプライマーも Sphl サイト末端に付加されている。
実施例 1 (A)項と同様の方法により Escherichia coliK-12 MG1665株より全 D NAを調整し、铸型 DNAとして用いた。
PCRは、〔実施例 1〕（B)項と同様の条件で行った。
上記で生成した反応液 10 μ ΐを 0. 8%ァガロースゲルにより電気泳動を行い、 frd 遺伝子の場合、約 3. 8kbの DNA断片が検出できた。
[0091] 次に、上記 frd遺伝子を含む 3. 8kb PCR産物 10 μ 1を制限酵素 Sphlで切断した もの、および上記実施例 2 (B)項で構築したプラスミド pCRBl-PC 2 μ 1を制限酵素 Sphlで切断したものをそれぞれ、 70°Cで 10分処理することにより制限酵素を失活さ せた後、両者を混合し、これに T4DNAリガーゼ 10 X緩衝液 1 μ 1、 T4DNAリガ一 ゼ limitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で 10 μ ΐにして、 15°Cで 3時間反応させた 。このライゲーシヨン液を用レ、、塩化カルシウム法 Joumal of Molecular Biolog y, 53, 159 (1970)〕によりェシエリヒア 'コリ JM109 (宝酒造株式会社製）を形質転 換し、クロラムフエニコーノレ 50mgを含む培地〔トリプトン 10g、イーストエキストラタト 5 g、 NaC15gおよび寒天 16gを蒸留水 1Lに溶解〕に塗抹した。
上記培地上で生育する株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミド DNAを抽 出し、制限酵素で切断し、揷入断片を確認した。この結果、プラスミド pCRBl-PC約 6. Okbの DNA断片に加え、 frd遺伝子を含有する長さ約 3. 8kbの揷入 DNA断片 が言忍められた。
該 PC遺伝子を含むプラスミドを pCRBl—PC—FRD命名とした。
[0092] 次に、プラスミド pCRBl— PC— FRDを電気パルス法（Y. Kurusu, et al. , Agric . Biol. Chem. 54 : 443—447. 1990.および A. A. Vertes, et al. , Res. Micr obiol. 144 : 181-185. 1993)の方法 (こ従って、コリネノ クテリゥム グノレタミカム（C orvnebactenum g丄 utamicum) R ldh株へ専入した。 この株をコリネバタテリゥム グノレタミカム（Corynebacterium glutamicum) R Id h_ZpCRBl_PC_FRD株とした。 （本組換え菌株は、菌体名； Corynebacterium glutamicum) R ldh— ZpCRBl_PC_FRDのもとに、独立行政法人産業技術総合 研究所 特許生物寄託センターに受託番号： FERM BP—10061で寄託されてい る)。
本菌株内におけるフマール酸からコハク酸に至る経路の酵素活性を、 (ELENA MAKLASHINA, et al. , J. Bacteriology, 180 : 5989-5996. 1998)記載の 方法により測定したところ、形質転換前の親株に比して本経路の酵素活性は 3倍に 上昇していた。
[0093] 本コリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum) R ldh"/p CRB1— PC— FRD株に用いて 3時間反応後、反応培地溶液を液体クロマトグラフィ 一により分析したところ、コハク酸 168mM (19. 8g/L)が生成していた。乳酸、リン ゴ酸は検出されなかった。
[0094] このことから、コリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum) R ldh / pCRBl_PC株とコリネバタテリゥム グルタミカム（Corynebacterium gl utamicum) R ldh— /pCRBl_PC_FRD株を比較すると、 ldh遺伝子破壊株内で PC遺伝子を高発現した株に、さらに、大腸菌由来の frd遺伝子を高発現させることに より、コハク酸の生成量が増大すると共に、高純度のジカルボン酸が採取でき、ジカ ルボン酸の分離、精製の上からも有用な技術であることが明らかである。
産業上の利用可能性
[0095] 本発明によって製造されるジカルボン酸は高分子合成原料、医薬原料、化粧品用 途そして食品添加剤用途など広い分野で使用される。例えば、コハク酸およびその 誘導体は生分解性プラスチック原料や環境汚染をもたらさないクリーンな洗浄溶剤用 途に使用される。
Figure imgf000034_0001
1 下記の表示は発明の詳細な説明中に記載
された微生物又は生物材料に関連している
1-1 段落番号 36， 80
1 3 寄託の表示
1-3-1 寄託機関の名称 I P0D 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄 託センタ一（I P0D)
1-3 2 寄託機関のあて名 〒305- 8566 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1
中央第 6
1-3-3 寄託の日付 2003年 07月 24日 （24. 07. 2003)
1-3-4 受託番号 I POD FERM BP- 10060
1-5 この表示を行うための指定国
すべての指定国
2 下記の表示は発明の詳細な説明中に記載
された微生物又は生物材料に関連している
2-1 段落番号 37， 92
2-3 寄託の表示
2-3-1 寄託機関の名称 I P0D 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄 託センター（I P0D)
2-3-2 寄託機関のあて名 〒305- 8566 曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1
中央第 6
2-3-3 寄託の日付 2003年 07月 24日 (24. 07. 2003)
2-3 - 4 受託番号 I POD FERM BP- 10061
2-5 この表示を行うための指定国
すべての指定国 受理官庁記入欄
0-4 この用紙は囯際出願とともに受理した
(はい/いいえ)
-4-1 権限のある職員 国際事務局記入欄 -5 この用紙が国際事務局に受理された日
0-5-1 権限のある職員
差替え甩紙（規則 26)

Claims

請求の範囲
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊され、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝 子が高発現すべく組換えられた好気性コリネ型細菌形質転換体であつて、 好気性コリネ型細菌がコリネバタテリゥム属菌、ブレビバタテリゥム属菌、アースロバク ター属菌、マイコバクテリウム属菌およびマイクロコッカス属菌の群から選択されるレヽ ずれか 1種であることを特徴とする好気性コリネ型細菌形質転換体。
コリネノヽクテリゥム 菌力、、 Corynebacterium glutamicum R、し orynebacteri um glutamicum ATCC13032、 Corynebacterium glutamicum ATCC13 058、 Corynebacterium glutamicum ATCCl3059、 Corynebacterium glu tamicum ATCC13060, Corynebacterium glutamicum ATCC13232, Co rynebacterium glutamicum ATCC13286、 Corynebacterium glutamicu m ATCC13287、 Corynebacterium glutamicum ATCC13655、 Coryneba cterium glutamicum ATCC13745、 Corynebacterium glutamicum ATC C13746、 Corynebacterium glutamicum ATCC13761、 Corynebacterium glutamicum ATCC14020および Corynebacterium glutamicum ATCC3 1831から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載 の好気性コリネ型細菌形質転換体。
ブレビバクテリウム属菌力 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、 Brevibacterium flavura J— 233、 Brevibacterium flavum MJ— 233AB 一 41および Brevibacterium flavum Brevibacterium ammoniagenes ATC C6872から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記 載の好気性コリネ型細菌形質転換体。
アースロバクター属菌力 Arthrobacter globiformis ATCC8010, Arthroba cter globiformis ATCC4336, Arthrobacter globiformis ATCC21056、 Arthrobacter globiformis ATCC31250、 Arthrobacter globiformis ATC C31738および Arthrobacter globiformis ATCC35698から選択されるいずれ かの菌であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の好気性コリネ型細菌形質 転換体。
差替え甩紙（規則 26) [5] マイコバクテリウム属菌力 Mycobacterium bovis ATCC19210または Myco bacterium bovis ATCC27289であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載 - の好気性コリネ型細菌形質転換体。
[6] マイクロコッカス属菌カ、 Micrococcus freudenreichii No. 239、 Micrococc us luteus No. 240、 Micrococcus ureae IAM1010および Micrococcus r oseus IF03764力 選択されるレヽずれかの菌であることを特徴とする請求の範囲 第 1項に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体。
[7] コリネバクテリウム属菌が Corynebacterium glutamicum Rであることを特徴と する請求の範囲第 2項に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体。
[8] 乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の破壌が、相同性組換え法、トランスポゾン揷入法お よび変異原導入法から選ばれる方法により該遺伝子が分断もしくは該遺伝子の一部 または全域が除去され、該酵素活性発現機能が喪失して！/、ることを特徴とする請求 の範囲第 1項〜第 7項のいずれかに記載の好気性コリネ型細菌形質転換体。
[9」 Corynebacterium glutamicum R ldh ZpCRBl— PCまたは Corynebacte rium glutamicum R ldh— ZpCRBl— PC— FRDであることを特徴とする請求 の範囲第 1項、第 2項、第 7項および第 8項のいずれかに記載の好気性コリネ型細菌 形質転換体。
[10] 炭酸イオン若しくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する還元状態下の 反応液中で細菌と糖類とを反応させ反応液中に生成するジカルボン酸を採取する方 法において、細菌が請求の範囲第 1項に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体で あることを特徵とするジカルボン酸の製造方法。
[11] 還元状態下の反応液の酸化還元電位が— 200ミリボルト乃至一 500ミリボルトであ ることを特徴とする請求の範囲第 10項に記載のジカルボン酸の製造方法。
[12] ジカルボン酸がコハク酸、フマール酸およびリンゴ酸カも選ばれることを特徴とする 請求の範囲第 10項または第 11項に記載のジカルボン酸の製造方法。
差替え甩紙（規則 26)
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