WO2005010208A1 - 改良されたａｔｐの増幅方法およびその利用 - Google Patents

改良されたａｔｐの増幅方法およびその利用 Download PDF

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    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase

Definitions

  • the present invention relates to a method for amplifying ATP, a method for rapidly detecting the presence of a microorganism using the method, and a kit therefor.
  • Methods for rapid and sensitive detection of microorganisms include, for example, control of environmental microorganisms such as detection of microorganisms in food manufacturing plants to prevent food poisoning, and inspection of microorganisms in foods (eg, dairy products such as milk). It is very important in the food and dairy industries. In the conventional method for detecting living cells using a nutrient medium, it takes several days to count viable microorganisms.
  • Atsusi methods conventional ATP is the detection limit (e.g., about 10 4 E. coli colony forming units (CFU) / Atsusi). This sensitivity is not sufficient for industrial or practical applications.
  • CFU E. coli colony forming units
  • ATP amplification using adenylate kinase (ADK) and pyruvate kinase (PVK) has the potential to detect very low levels of ATP without the need for a sensitive photometer.
  • ADK adenylate kinase
  • PVK pyruvate kinase
  • ADK stands for anilate kinase (.adenylate kinase;, po 1 yP for polyphosphate, and PPK for polyphospate kinase).
  • Figure la shows that in the absence of ATP, ATP does not theoretically form ATP from AMP and polyphosphate, as shown in Figure lb.
  • ADK causes a transphosphorylation reaction from ATP to AMP, producing two molecules of ADP (first reaction).
  • PPK receives a phosphate group from polyphosphoric acid and generates two molecules of ATP (second reaction)
  • the two molecules of ATP generated in this second reaction are used again in the first reaction
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-299390 describes that, in the presence of excess AMP and polyphosphoric acid, the equilibrium state between ADK and PKP is changed to ADP generation.
  • the first reaction and the second reaction are treated as one reaction system, and this reaction system is repeated n times. Is amplified to 2 n . Therefore, this method is an excellent ATP amplification method.
  • the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-299390 is an excellent method in that it can detect the presence of cells with higher sensitivity than conventional levels, but this method does not theoretically cause AT.
  • Low levels of ATP amplification in the absence of P have been found to be occasional and lack the certainty of amplifying and detecting only exogenous (externally added) ATP There's a problem.
  • There are also problems such as adjustment of the activity between ADK and PPK. Disclosure of the invention
  • an efficient method for amplifying exogenous ATP is desired.
  • a detection method is desired.
  • the present invention has been made for the purpose of solving the above problems, and the ATP amplification method of the present invention detects a very small amount of ATP, and further detects even the presence of one cell. obtain.
  • the present invention provides a method for amplifying ATP, which comprises a step of allowing a fusion protein of polyphosphate kinase and addate kinase to act on a mixture containing ATP, AMP and a polyphosphate compound.
  • the fusion protein of polyphosphate kinase and adenylate kinase is a fusion protein containing no ADP.
  • the present invention provides a mixed solution containing ATP, AMP and a polyphosphate compound. A fusion protein of polyphosphate kinase and adenylate kinase to amplify the ATP, and a step of detecting the amplified ATP. I do.
  • the fusion protein of polyphosphate kinase and adenylate kinase is a fusion protein containing no ADP.
  • the present invention provides a method for rapidly detecting the presence of a microorganism, comprising the steps of: treating a microorganism-containing sample to prepare an ATP-containing sample; and adding the ATP-containing sample to an ATP amplification system. Amplifying ATP; and detecting the amplified ATP, wherein the ATP amplification system comprises an AMP, a polyphosphate compound, and an ADP-free polyphosphate kinase and addate kinase.
  • a method comprising a fusion protein is provided.
  • the present invention also provides a kit for rapidly detecting the presence of a microorganism, comprising an AMP, a polyphosphate compound, and a fusion protein of ADP-free polyphosphate kinase and adenylate kinase, comprising:
  • a kit comprising a reagent and an ATP detection reagent for detecting ATP is provided.
  • the kit further comprises a cell lysis reagent.
  • the present invention further provides a method for amplifying ATP by reacting a mixture of ATP, AMP, and a polyphosphate compound with adenylate kinase and polyphosphate kinase not containing ADP.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an ATP amplification mechanism using ADK and PPK.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of ATP amplification using PKP-ADK and PKL-ADK treated with avirase.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of performing an ATP amplification reaction on a sample containing a trace amount of ATP.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of performing an ATP amplification reaction on a sample containing a predetermined cell concentration.
  • the fusion protein of polyphosphate kinase and adenylate kinase (hereinafter sometimes referred to as PKK—ADK) used in the present invention is particularly limited in its binding state as long as it has PPK activity and ADK activity. There is no. It is preferably a fusion protein containing PPK on the N-terminal side and ADK on the C-terminal side. In this fusion protein, PPK and ADK may be directly bound, or may be bound via a spacer. Attachment of a tag that does not affect the expression of each enzyme to the C-terminus of the fusion protein is useful for purifying the fusion protein.
  • each gene sequence can be obtained.
  • primers for preparing the ppk gene for example, the following primer combinations are preferable: (1) Suitable upstream of the 5 'end of the PPk gene A primer having a sequence for introducing a unique restriction enzyme recognition sequence; and
  • a fragment containing the ppk gene expressing PPK having a spacer at the C-terminus can be easily recovered.
  • the appropriate primer for preparing the adk gene the following primers are preferable, similar to the ppk gene: (1) A sequence for introducing an appropriate restriction enzyme recognition sequence upstream of the 5, end of the adk gene is preferable.
  • the restriction enzyme of the primer may be determined in consideration of the ppk or adk gene sequence and the cloning site of the vector to be integrated.
  • the chromosomal DNA of Escherichia coli is type III, PCR is carried out using the above primers, and the obtained DNA fragments are cleaved with restriction enzymes to recover a fragment containing the ppk gene and a fragment containing the adk gene.
  • restriction enzymes By incorporating the obtained fragments containing the respective genes into an appropriate vector in the order of ppk-adk, a recombinant vector expressing the PKP-ADK fusion protein can be obtained.
  • the PPK-ADK fusion protein is produced by introducing the obtained vector into an appropriate host (for example, Escherichia coli) and expressing the recombinant vector.
  • An appropriate host for example, Escherichia coli
  • a fusion protein designed to have a histidine tag can be easily purified and recovered by using a Hi trap chelating column.
  • the resulting fusion protein, PK-ADK is Can be used for reaction.
  • ADP bound to the PKP can be used as a substrate for PPK in the presence of the polyphosphate compound, and the ADP can be converted to ATP by the PKP. That is, in the reaction system as shown in FIG. 1, even in the absence of ATP, a reaction from ADP to ATP, which is the second reaction, occurs first, and this ATP is used in the first reaction. It is thought that the ATP amplification reaction starts automatically. Therefore, in order to measure only exogenous ATP, it is necessary to remove ADP bound to PKP in advance.
  • ADP which is an impurity bound to PKP
  • Avilas removes phosphate groups from ATP or ADP to produce AMP.
  • Avirase treatment is preferably performed in the presence of an appropriate amount of pyrophosphate. Pyrophosphate promotes the release of ADP bound to PKP-ADK, making ADP more susceptible to attack by avirase.
  • Avirase-treated PK-ADK is recovered again using a high-trap chelating column. The recovered PKP-ADK retains its activity (ie, ?? activity 01: activity) even after the treatment with avirase.
  • ATP amplification using the PKP-ADK of the present invention is carried out by allowing PPK-ADK to act on ATP, excess AMP, and excess polyphosphate compound. That is, the reaction is carried out by adding ATP to a mixture of AMP, polyphosphate compound and PKP-ADP, or by adding PPK-ADK to a mixture of ATP, AMP and polyphosphate compound.
  • the reaction format is the same as in Figure 1, and the first and second reactions shown in Figure 1 Is repeated to amplify ATP.
  • ATP amplification is performed in a suitable buffer at a suitable temperature (eg, 30 to 40 ° C.) for a suitable time (eg, 5 minutes to 2 hours).
  • a suitable temperature eg, 30 to 40 ° C.
  • a suitable time eg, 5 minutes to 2 hours.
  • polyphosphoric acid compound polyphosphoric acid or a salt thereof is used.
  • 10 to 1000, preferably 10 to 100, phosphoric acids are linearly polymerized.
  • the polyphosphoric acid may be derived from bacteria or may be obtained by chemical synthesis. Alternatively, it may be synthesized from ATP using polyphosphate synthase.
  • the measurement is performed by measuring the amount of fluorescence emitted by the reaction between luciferase and ATP.
  • an ATP measurement kit using a commercially available luciferase is used.
  • This method focuses on the fact that cells of all organisms contain ATP, prepares a sample containing ATP from a microorganism-containing sample, amplifies ATP using the ATP amplification method described above, It is a method of detecting.
  • PPK-ADK PPK-ADK with ADP removal treatment
  • only exogenous ATP can be measured.
  • ATP contained in one cell can be amplified to a measurable level, so that the presence of a microorganism can be detected.
  • 1 ⁇ Ssi per the E. coli 10 4 colony forming units (CFU) to consider that it was the detection limit, the detection sensitivity is Noboru Ue the at least 10, 000-fold.
  • Microorganisms include ADP.
  • the method for preparing the ATP-containing sample from the microorganism-containing sample is not particularly limited.
  • Cells may be lysed, but in consideration of the effects of enzymes such as PPK: and ADK contained in the cells, the heat treatment is performed, the ability to elute ATP, and the cells are lysed to elute ATP And a heat treatment for inactivating other enzymes is most preferably used.
  • the heat treatment is, for example, 100 ° C; Done for ⁇ 5 minutes.
  • the cell lysis treatment can be performed, for example, using a lysis buffer such as that included in a commercially available ATP assay kit.
  • An ATP amplification reaction is performed by adding a sample that is considered to contain ATP obtained by performing the ATP elution treatment to a mixture of AMP, a polyphosphate compound and PKP-ADK, and performing an ATP amplification reaction.
  • ATP is detected using an ATP detection method using luciferase. If the sample contains ATP, it reacts with luciferase and fluorescence is observed. Since ATP is amplified, a highly sensitive emission analyzer is not always required.
  • a sample presumed to contain microorganisms is heat-treated, added to the ATP amplification reagent of this kit, subjected to an amplification reaction for an appropriate time, and then treated with an ATP detection reagent.
  • an ATP detection reagent By confirming the presence of ATP, the presence of microorganisms can be quickly confirmed. This method was achieved because it was possible to detect only exogenous ATP by using the PKP-ADK obtained by performing the ADP removal treatment.
  • the ATP detection reagent a reagent using a luciferase-luciferin reaction system is generally used, and the term “ATP detection reagent” is used in a concept that includes a bioluminescence (fluorescence) measurement device.
  • the present invention also provides a method for amplifying ATP by allowing a mixture containing ATP, AMP, and polyphosphate to act on ADK and PKP containing no ADP. Doesn't include 80? ? 1:
  • the gene is prepared, for example, by the same method as in the preparation of the fusion protein. Briefly, a primer having an appropriate restriction enzyme recognition sequence upstream of the 5 'end of the ppk gene and a primer having a His tag sequence and having an appropriate restriction enzyme downstream thereof are used. Then, a DNA fragment containing a ppk gene that expresses a PPK having a His_ tag is recovered. The obtained DNA is introduced into an appropriate vector to obtain a recombinant plasmid, which is then introduced into E.
  • AMP and ATP were purchased and used from Wako Pure Chemical (Osaka) and Sigma, respectively.
  • 0.2M KC 1 and 1% EDTA (H10) were used as solvents using a TSH gel SAX column (Toso-1). And used after further purification.
  • polyphosphoric acid polyphosphoric acid (Sigma) having an average chain length of 65 was used.
  • the bioluminescent assay kit (CLS II) contains luciferin and luciferase and was purchased from Roche and used. Avirase was purchased from Sigma and used.
  • E. coli gene encoding polyphosphate kinase (ppk) (Akiyama, M. et al., I The po ⁇ yphospnate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the proteinj J.
  • the primers for obtaining Biol. Chem. 267, 22556—22561 (1992) are as follows:
  • GGAGGATCCGCCGCCGCCGCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATTT SEQ ID NO: 2.
  • the primer of SEQ ID NO: 1 has a sequence for introducing a restriction enzyme XbaI recognition sequence at the 5, terminal side of the ppk gene.
  • SEQ ID NO: 2 is designed so that four glycines are attached to the C-terminus of PPK, and further has a sequence for introducing a restriction enzyme BamHI recognition sequence at the 3 ′ end.
  • the primer of SEQ ID NO: 3 has a sequence for introducing a restriction enzyme BamHI recognition sequence at the 5, terminal side of the adk gene.
  • the primer of SEQ ID NO: 4 was designed so that the C-terminal tag histidine was attached to the C-terminal of ADK. Furthermore, it has a sequence for introducing a restriction enzyme HindIII recognition sequence at the 3 'end.
  • the chromosomal DNA of Escherichia coli was transformed into type III, and PCR was carried out by the usual method using the above primers to obtain DNA fragments containing the pk gene and the adk gene, respectively!).
  • the obtained DNA fragment containing the ppk gene was introduced into a pGEMT vector (Promega) to obtain pGEMTppk.
  • the resulting DNA fragment containing the adk gene was introduced into a pGEMT vector (Promega) to obtain pGEMTadk.
  • Plasmid p ETp pkadk was constructed by ligating to an XbaI_HindIII digest of the ET vector (Stratagene). This plasmid contains a gene that encodes a fusion protein in which PPK and ADK are linked via four glycines and has a His tag at the C-terminus.
  • This plasmid pETppkadk was introduced into Escherichia coli (E. coli BL21), the resulting transformant was cultured for 2 hours, and then ImM IPTG was added to the growth medium. After 4 hours of culture, transformants were collected by centrifugation and suspended in 2 OmM phosphate buffer (pH 7) containing 0.5 M NaCl. Cells were lysed with B-PER solution (Pierce) and then treated with DNase and RNase in the presence of ImM PMSF. The supernatant was obtained by centrifugation, filtered using a 0.2 / m filter, and then filtered using a Hi trap chelating column (Amersham Bioscience).
  • P PK—ADK fusion protein was 0.1 M pyrophosphate, Elution was performed with 2 OmM phosphoric acid, 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole and 20% glycerol (pH 7.4).
  • the obtained PKP-ADK fusion protein had the activities of ADK (43 mg) and PKP (38 U / mg), and produced ATP from AMP and polyphosphate.
  • One unit of PKP synthesizes ATP and 1.0 zmo of ATP from ADP and polyphosphoric acid at 37 ° C.
  • One unit of ADK synthesizes 1.0 zmo1 / min ATP from 80 gin at 37 ° C.
  • ATP amplification occurred in the reaction system containing no ATP, and fluorescence was observed.
  • ADP was bound to the PKP, and this ADP was used for the PKP, and the second reaction shown in Fig. 1 first occurred to generate ATP, and this ATP was amplified. It was suggested that this could have been done.
  • pyrophosphate is added to the washing buffer and the elution buffer when PPK-ADK is adsorbed to and eluted from the High Trap Chelate column.
  • 0.1M pyrophosphate has an effect of releasing ADP from PKP-ADK, and can remove ADP more effectively.
  • the concentration of ATP was detectable.
  • the use of the ATP amplification method of the present invention shows that the sensitivity of bioluminescence was improved by at least 10,000 times.
  • Example 4 Application of ultrasensitive bioluminescent assay for detection of single microorganism
  • a culture solution of Escherichia coli (2 ⁇ 10 9 CFU / m 1) was diluted to an appropriate concentration with pure water.
  • lysis buffer Bioluminescence Assay Kit, Roche
  • E. coli single dry weight is about 2.
  • E. coli contains about 2 attomoles of ATP per cell. This level of ATP is almost the same as the detection limit of this ultra-sensitive bioluminescent assay.
  • the scan Wa blanking monitoring has enabled measurement at approximately 12 E. coli C FUZc m 2 level. It has been found that the method of the present invention can be applied to sub monitoring of E. coli.
  • CFU The number of colonies (CFU) was determined by adding a 1 ml water sample to a nutrient agar medium (1.6 g tryptone, lg yeast extract, 0.5 g NaC1, 15 g agar, 1 L water). After incubation for 3 days at 28 ° C, The colonies formed were counted and determined. Table 4
  • the application in dairy was discussed. Bacterial contamination can cause significant damage to the milk industry, and fast and reliable tests have been developed to detect bacteria in milk.
  • the present inventors have further developed a highly sensitive assay for detecting Staphylococcus aureus in milk. I considered Sey.
  • the Staphylococcus aureus culture was diluted to the appropriate concentration and added to the milk.
  • To remove non-bacterial ATP from mammary glands and somatic cells contained in milk 0.5 ml of milk was filtered using a 0.45 ⁇ membrane. The membrane was treated with a solution of 1% Oml containing 0.2% Trit ⁇ ⁇ ⁇ —100, 10 OmM Tris—HCl (pH 7.8) and 2 mM EDTA (Olsson, T.
  • the PKP-ADK fusion protein of the present invention acts on a mixture of ATP, AMP and a polyphosphate compound to amplify ATP.
  • PKP-ADK that does not contain the impurity ADP makes it possible to amplify only exogenous ATP, and to amplify the ATP of a microorganism at the level of one cell.
  • the amplified ATP can be detected by luciferase Atsusei or the like. Therefore, microorganisms that could only be detected in a few days in the past can be detected very quickly and even with a single cell.

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Abstract

本発明のＡＴＰの増幅方法は、ＡＴＰ、ＡＭＰおよびポリリン酸化合物を含有する混合物にＡＤＰを含まないポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質（ＰＫＫ−ＡＤＫ）を作用させることによって、外因性の極微量のＡＴＰを増幅、検出する。本発明はまた、細胞１個のレベルのＡＴＰを増幅し、検出できる超高感度のＡＴＰ増幅法およびこのＡＴＰ増幅法に基づく超高感度微生物アッセイ法を提供する。

Description

明 細 書 改良された A T Pの増幅方法およびその利用 技術分野
本発明は、 A T Pの増幅方法および該方法を用いて微生物の存在を迅速に 検出する方法、 並びのそのためのキットに関する。 背景技術
迅速かつ高感度で微生物を検出する方法は、 例えば、 食中毒予防のための 食品製造工場における微生物の検出などの環境微生物の制御、 食品 （例えば、 ミルクなどの乳製品） における微生物の混入の検査など、 食品業界、 酪農業 界などにおいて非常に重要である。 従来の栄養培地を用いて生細胞を検出す る方法においては、 生存微生物をカウントするまでに数日を要する。
このような微生物の検出に、 全ての生物に存在する A T Pを利用する方法 が検討されている。 A T Pを検出する方法として、 ホタルルシフェラーゼを 用いる生物発光アツセィが知られている。 この方法は、 A T Pを測定する確 立された方法であり （DeLuca, M. and W. D. McElroy. 「Kinetics of the f iref ly luciferase catalyzed： reactionsj Biochemistry 2 6卷、 9 2 1 — 9 2 5頁 （1 9 7 4年） 参照） 、 迅速な衛生学的なモニタリングとして用 レヽられ" t レヽる (Bautista, D. A.ら、 「Adenosine tripnosphate biolumines cence as a method to determine microbial levels in scald and chili t anks at a poultry abattoirj Poult. Sci. 7 3卷、 1 6 7 3— 1 6 7 8 頁 （1 9 9 4年） ） 。 さらに、 最近ではバイオテロに対する対抗技術として、 A T Pアツセィが提案されている （Spencer, R. C. and N. F. Lightfoot
「Preparedness and response to bioterrori smj J. Infect. 4 3卷、 1 04— 1 10頁 （2001年） ） 。
しかし、 従来の ATPのアツセィ法には検出限界 （例えば、 約 104大腸 菌コロニー形成単位 （CFU) /アツセィ） がある。 この感度では、 工業的 あるいは実用的な応用には充分な感度とはいえない。
コンピューターシミュレーションでは、 アデ二レートキナーゼ （ADK) およびピルビン酸キナーゼ （PVK) を用いる A TP増幅は、 高感度の光度 計を用いなくとも、 非常に低いレベルの ATPを検出し得る可能性があるこ とカ示唆されてレヽる (Chittock, R. S.ら、 「Kinetic aspects of ATP arapl if ication reactionsj Anal. Biochem 255卷、 120— 126頁 (1 998) ) 。 し力 し、 この方法は、 実際に行われていない。
微量の AT Pをアツセィするために、 AT Pを増幅させる方法が提案され ている （特開 2001 -299390号公報） 。 この特開 2001— 299 390号公報に示される方法を図 1で説明する。 図 1において、 ADKはァ ァニレートキナーセ (.adenylate kinase; 、 p o 1 yPはポリリン酸 (poly phosphate) 、 P P Kはポリリン酸キナーゼ （polyphospate kinase) を意味 する。 以下、 本明細書においても、 この略号を使用するときがある。 図 l a は、 ATPの非存在下では、 理論的には、 AMPとポリリン酸とからは AT Pが生成しないことを示している。 図 l bに示すように、 ATPが存在する と、 ADKによって、 AT Pから AMPへのリン酸基転移反応が起こり、 2 分子の ADPが生成する （第 1反応） 。 この第 1反応で生じた 2分子の AD Pは、 PPKの作用により、 ポリリン酸からリン酸基を受け取り、 2分子の AT Pを生じる （第 2反応） 。 この第 2反応で生じた 2分子の AT Pは、 再 度、 第 1反応に使用され、 4分子の ADPを生成し、 この 4分子の ADPは P PKによって 4分子の AT Pに変換される。
このように、 特開 2001— 299390号公報では、 過剰の AMPとポ リリン酸を存在させて、 ADKと P PKの平衡状態をそれぞれ、 ADP生成 方向 （第 1反応） および ATP生成方向 （第 2反応） に向かわせるようにし、 第 1反応と第 2反応を 1つの反応系として、 n回この反応系を繰り返すこと により、 1個の AT Pが 2 n個に増幅される。 従って、 この方法は、 優れた AT Pの増幅方法である。
この特開 2001 -299390号公報の方法は、 従来のレベルよりも高 い感度で、 細胞の存在を検出し得る点では優れた方法であるが、 この方法で は、 理論的には起こらない AT P非存在下での AT Pの増幅が、 低いレベル であるが、 時折見られることが判明し、 外因性の （外部から添加した） AT Pのみを増幅し、 検出するという確実性に欠けるという問題がある。 すなわ ち、 細胞 1個のレベルの AT Pを増幅し、 検出し得るまでの感度を確実に提 供できないという問題がある。 さらに、 ADKと PPKとの活性の調整など の問題もある。 発明の開示
そこで、 外因性の AT Pの効率的な増幅方法が望まれており、 特に、 外因 性の AT Pのみを増幅させる方法およびこの方法を用いて 1個の細胞の存在 を検出し得る高感度の検出方法が望まれている。
本発明は、 上記課題を解決することを目的として行われたものであり、 本 発明の AT P増幅方法により、 極微量の AT Pが検出され、 さらに、 1個の 細胞の存在さえも検出し得る。
本発明は、 ATP、 AMPおよびポリリン酸化合物を含有する混合物に、 ポリリン酸キナーゼとアデ-レートキナーゼとの融合タンパク質を作用させ る工程を含む、 AT Pの増幅方法を提供する。
好ましい実施態様においては、 前記ポリリン酸キナーゼとアデ二レートキ ナーゼとの融合タンパク質が、 ADPを含まない融合タンパク質である。 また、 本発明は、 ATP、 AMPおよびポリリン酸化合物を含有する混合 物に、 ポリリン酸キナーゼとアデ二レートキナーゼとの融合タンパク質を作 用させて、 AT Pを増幅する工程；および、 該増幅した ATPを検出するェ 程；を包含する AT Pの検出方法を提供する。
好ましい実施態様においては、 前記ポリリン酸キナーゼとアデ二レートキ ナーゼとの融合タンパク質が、 ADPを含まない融合タンパク質である。 さらに、 本発明は、 微生物の存在を迅速に検出する方法であって、 微生物 含有試料を処理して、 AT P含有試料を調製する工程；該 AT P含有試料を AT P増幅系に添加して AT Pを増幅する工程；および、 該増幅した AT P を検出する工程；を包含し、 該 ATP増幅系が AMP、 ポリリン酸化合物、 および A DPを含まないポリリン酸キナーゼとアデ-レートキナーゼとの融 合タンパク質を含む方法を提供する。
また、 本発明は、 微生物の存在を迅速に検出するためのキットであって、 AMP, ポリリン酸化合物、 および ADPを含まないポリリン酸キナーゼと アデ二レートキナーゼとの融合タンパク質、 を含有する ATP増幅試薬と、 AT Pを検出する AT P検出試薬を包含するキットを提供する。
好ましい実施態様においては、 さらに細胞溶解用試薬を備えるキットであ る。
本発明は、 さらに、 ATP、 AMP、 およびポリリン酸化合物の混合物に、 アデ二レートキナーゼ、 および ADPを含まないポリリン酸キナーゼを作用 させて AT Pを増幅する方法を提供する。
また、 本発明は、 ポリリン酸キナーゼとアデ二レートキナーゼとの融合タ ンパク質、 並びに、 ADPを含まないポリリン酸キナーゼとアデ二レートキ ナーゼとの融合タンパク質を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ADKおよび PPKを用いる AT P増幅機構を示す模式図である。 図 2は、 P PK— ADKおよびアビラーゼ処理した P PK— ADKを用い る AT P増幅の結果を示す図である。
図 3は、 極微量の AT Pを含有するサンプルについて、 AT P増幅反応を 行つた結果を示す図である。
図 4は、 所定の細胞濃度を含有するサンプルについて、 AT P増幅反応を 行つた結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
(融合タンパク質）
本発明に用いられるポリリン酸キナーゼとアデェレートキナーゼとの融合 タンパク質 （以下、 P PK— ADKということがある） は、 PPK活性およ び ADK活性を有していれば、 結合状態に特に制限はない。 N末端側に PP Kを、 C末端側に ADKを含む融合タンパク質であることが好ましい。 この 融合蛋白質は、 PPKと ADKとが直接結合されていてもよいが、 スぺーサ 一を介して結合されていてもよい。 また、 融合タンパク質の C末端には、 そ れぞれの酵素の発現に影響を与えないタグを付着させることが、 融合タンパ ク質の精製に有用である。
P PKをコードする遺伝子 p p kおよび ADKをコードする遺伝子 a d k は、 これらの遺伝子配列が特定されていれば、 その由来に特に制限はない。 大腸菌の配列が好ましく用いられる。
これらの遺伝子配列に基づいて適切なプライマーを調製し、 PCRを行うこ とにより、 それぞれの遺伝子配列を得ることができる。
p p k遺伝子を調製するための適切なプライマーとして、 例えば、 以下の プライマーの組合せが好ましい： （1) P P k遺伝子の 5 ' 末端の上流に適 切な制限酵素認識配列を導入するための配列を有するプライマー ；および
(2) スぺーサー （例えば、 グリシン） 配列、 およびスぺーサ一部位または その下流に適切な制限酵素認識配列を導入するための配列を有するプライマ 一。 この 2つのプライマーをセットにして PC Rを行うと、 C末端にスぺー サーを有する PPKを発現する p p k遺伝子を含む断片が容易に回収される。 a d k遺伝子を調製するための適切なプライマーとしては、 p p k遺伝子 と同様、 以下のプライマーが好ましい： （1) a d k遺伝子の 5， 末端の上 流に適切な制限酵素認識配列を導入するための配列を有するプライマー ；お よび （2) C末端タグ （例えば、 ヒスチジン） 配列を有し、 かつ C末端タグ の下流に適切な制限酵素認識配列を導入するための配列を有するプライマー。 この 2つのプライマーをセットにして PCRを行うと、 C末端にタグを有す る ADKを発現する a d k遺伝子を含む断片が容易に回収される。
上記プライマーの制限酵素は、 p p kあるいは a d kの遺伝子配列、 組込 むベクターのクローニング部位を考慮して、 決定すればよい。 大腸菌の染色体 DNAを铸型とし、 上記プライマーを用いて PCRを行い、 得られた DNA断片を、 それぞれ、 制限酵素で切断し、 p p k遺伝子を含む 断片、 および a d k遺伝子を含む断片を回収する。 得られたそれぞれの遺伝 子を含む断片を、 p p k— a d kの順となるように適切なベクターに組み込 むことにより、 P PK— ADKの融合タンパク質を発現する組換えベクター が得られる。
得られたベクターを適切な宿主 （例えば、 大腸菌） に導入し、 組換えべク ターを発現させることにより、 PPK—ADK融合タンパク質が生産される。 ヒスチジンタグ （H i sタグ） を有するように設計された融合タンパク質は、 ノヽィ トラップキレートカラム (Hi trap chelating column) を用レヽることに より、 容易に精製、 回収される。
得られた融合タンパク質である P PK— ADKは、 このまま、 ATP増幅 反応に用いることができる。 しかし、 後述のように、 外因性の ATPのみを 測定する場合、 不都合があることが判明した。 この原因として、 ADPが P PKと結合した状態で存在することが考えられる。 この P PKに結合してい る ADPは、 ポリリン酸化合物の存在下、 PPKの基質とされ得、 この AD Pが P PKにより ATPに変換され得る。 すなわち、 図 1に示すような反応 系において、 ATP非存在下であっても、 まず第 2反応である ADPから A TPへの反応が生じ、 この ATPが第 1反応で使用されることにより、 自動 的に AT P増幅反応が開始すると考えられる。 従って、 外因性の AT Pのみ を測定するためには、 P PKに結合した ADPを予め除去しておくことが必 要である。
P PKに結合している不純物である ADPの除去は、 例えば、 アビラーゼ 処理により行われる。 アビラーゼは、 ATPまたは ADPからリン酸基を除 去し、 AMPを生成する。 アビラーゼ処理は、 適切な量のピロリン酸存在下 で行うことが好ましい。 ピロリン酸により、 P PK— ADKに結合した AD Pの遊離が促進され、 ADPがアビラーゼによるアタックを受けやすくなる。 アビラーゼ処理した P PK— ADKは、 再び、 ハイトラップキレートカラム を用いて、 回収される。 回収された P PK— ADKは、 アビラーゼ処理によ つても、 それぞれの活性 （すなわち、 ？？ 活性ぉょぴ八01：活性） を維持 している。
(P PK— ADKを用いる ATPの増幅）
本発明の P PK— ADKを用いる ATPの増幅は、 ATP、 過剰の AMP、 および過剰のポリリン酸化合物に PPK— ADKを作用させることによって 行なわれる。 すなわち、 AMP、 ポリリン酸化合物および P PK— ADPの 混合物に AT Pを添加することにより、 あるいは、 ATP、 AMP、 および ポリリン酸化合物の混合物に PPK— ADKを添加することにより、 行なわ れる。 反応形式は、 図 1と同じであり、 図 1に示す第 1反応および第 2反応 が繰り返されて、 ATPが増幅される。
ATPの増幅は、 適切な緩衝液中で、 適切な温度 （例えば、 30〜4 0°C) で、 適切な時間 （例えば、 5分〜 2時間） 行われる。 AT Pの存在が 微量と思われる場合は、 1時間ほど増幅反応を行うことが好ましい。
なお、 ポリリン酸化合物としては、 ポリリン酸あるいはその塩が用いられ る。 好ましくは、 10〜1000個、 好ましくは 10〜100個のリン酸が 直鎖状に重合したものが好ましく用いられる。 ポリリン酸は、 バクテリア由 来でもよく、 化学合成で得られたものでもよい。 あるいは、 ポリリン酸合成 酵素を用いて AT Pから合成してもよい。
(ATPの検出）
増幅された AT Pの検出方法には、 当業者が通常用いる方法が使用される 、 特に制限がない。 一般には、 ルシフェラーゼと ATPとの反応による蛍 光発光量を測定することにより行われる。 例えば、 市販のルシフェラーゼを 用いる AT P測定キットが用いられる。
(微生物の存在を迅速に検出する方法）
この方法は、 すべての生物の細胞には AT Pが含まれることに着目して、 微生物含有試料から A T Pを含む試料を調製し、 上記 A T P増幅方法を用レ、 て、 AT Pを増幅し、 検出する方法である。 ADP除去処理を行った PPK — ADKを用いることにより、 外因性 AT Pのみを測定することが可能とな る。 例えば、 1個の細胞に含まれる AT Pを測定可能なレベルまで増幅でき ることから、 微生物の存在を検出することができる。 従来の方法では、 1ァ ッセィあたり、 104個のコロニー形成ユニット （CFU) の大腸菌が検出 限界であったことを考慮すると、 検出感度が少なくとも 10， 000倍に上 昇する。
なお、 微生物には、 ADPも含まれる。 ADP除去処理を行った P PK—
ADKを用いる場合、 本発明の増幅系に ADPを加えると、 ADPが ATP に変換され、 ATP増幅反応が開始される。 従って、 微生物を検出するため の前処理中に AT Pが ADPに分解されても、 本発明の感度に影響しない点 で、 本発明の増幅方法は優れている。 以下、 微生物の検出において、 測定す る AT Pの試料について言及するときは、 試料中に ADPが含まれる場合も 意図する。
微生物含有試料からの AT P含有試料の調製方法には、 特に制限はない。 細胞を溶解してもよいが、 その細胞に含まれる PPK：、 ADKなどの酵素の 影響を考慮すると、 加熱処理を行って、 AT Pを溶出させる力、 細胞を溶解 して、 AT Pを溶出させ、 そして他の酵素を失活させる加熱処理を行う方法 が最も好ましく用いられる。 加熱処理は、 例えば、 100°C、 ；！〜 5分行わ れる。 細胞溶解処理は、 例えば、 市販の ATPアツセィキットに附属してい るような、 溶解緩衝液を用いて、 行うことができる。
このような、 AT P溶出処理を行って得られる AT Pを含むと思われる試 料を、 AMP、 ポリリン酸化合物および P PK— ADKの混合物に添カ卩して、 AT P増幅反応を行い、 例えばルシフェラーゼを用いる AT P検出方法を用 いて、 AT Pの存在を検出する。 試料中に AT Pが含まれていれば、 ルシフ エラーゼと反応して蛍光が観察される。 なお、 AT Pが増幅されているので、 高感度の発光分析器は必ずしも要求されなレ、。
本発明では、 また、 このような微生物の存在を迅速に検出するためのキッ トを提供する。 すなわち、 AMP、 ポリリン酸、 および ADPを含まない P PK— ADKを含有する ATP増幅試薬と、 AT Pを検出する A TP検出試 薬を包含するキットが提供される。 このキットには、 さらに、 細胞溶解用試 薬が含まれる。 細胞溶解用試薬は、 対象となる細胞 （例えば、 微生物、 体細 胞など） に応じて、 その組成を変化させ得る。
微生物を含有すると思われる試料を加熱処理し、 このキットの ATP増幅 試薬に添カ卩して、 適切な時間、 増幅反応を行い、 ついで、 AT P検出試薬で、 ATPの存在を確認することによって、 微生物の存在が迅速に確認できる。 この方法は、 ADP除去処理を行って得られた P PK— ADKを用いること によって、 外因性の AT Pのみを検出できることが可能になったことにより、 達成された。 なお、 AT P検出試薬としては、 ルシフェラーゼ一ルシフェリ ン反応系を用いる試薬が一般的であり、 用語 「ATP検出試薬」 は生物発光 (蛍光） 測定器をも含む概念で使用する。
(ADKおよび ADPを含まない P PK用いる ATP増幅）
また、 本発明は、 ATP、 AMP, およびポリリン酸を含む混合物に、 A DKおよび、 ADPを含まない P PKを作用させて ATPを増幅する方法を も提供する。 八0 を含まなぃ？？1：遺伝子は、 例えば、 上記融合タンパク 質の調製と同様の方法で調製される。 簡潔に述べると、 p p k遺伝子の 5' 末端の上流に適切な制限酵素認識配列を有するプライマーと、 H i sタグ配 列を有し、 かつその下流に適切な制限酵素認識配列を有するプライマーとを 用いて、 H i s _タグを有する PPKを発現する p p k遺伝子を含む DNA 断片を回収する。 得られた DNAを適切なベクターに導入して組換えプラス ミ ドを得、 これを大腸菌に導入して、 PPKを発現させる。 PPKを、 ハイ トラップキレートカラムを用いて生成し、 ピロリン酸存在下、 アビラーゼ処 理を行い、 再びハイトラップキレートカラムにかけて、 ADPを除去した P PKを回収する。 この PPKを、 図 1に示す反応系に用いることにより、 外 因性 AT Pのみを増幅し、 検出する方法が提供される。
実施例
以下、 実施例を挙げて本発明を説明するが、 本発明はこれらの実施例に制 限されることはなレ、。
この実施例において、 AMPおよび A TPは和光純薬 （大阪） およぴシグ マから、 それぞれ購入して用いた。 AMPは、 TSHゲル SAXカラム （ト ーソ一） を用いて 0. 2M KC 1および 1%EDTA ( H 10) を溶媒 として用いて、 さらに精製して用いた。 ポリリン酸は、 平均鎖長 65のポリ リン酸 （シグマ） を用いた。 生物発光アツセィキット （CLS I I) はル.シ フェリンとルシフェラーゼを含み、 ロシュから購入して用いた。 アビラーゼ はシグマから購入して用いた。
(実施例 1 ： PPK— ADKの調製）
大腸菌 （E. c o l i) のポリリン酸キナーゼをコードする遺伝子 （p p k ) (Akiyama, M.ら、 I The po丄 yphospnate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location o f the proteinj J. Biol. Chem. 267巻、 22556— 22561頁 (1992年） 参照） を取得するためのプライマーは、 以下の通りである ：
GGATCTAGATGAATAAAACGGAGTAAAAGT (配列番号 1 ) 、 および
GGAGGATCCGCCGCCGCCGCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATTT (配列番号 2 ) 。
配列番号 1のプライマーは p p k遺伝子の 5， 末端側に制限酵素 X b a I 認識配列を導入するための配列を有する。 配列番号 2は、 4つのグリシンが PPKの C末端に付着するように設計され、 さらに 3' 末端側に制限酵素 B amH I認識配列を導入するための配列を有している。
大腸菌のアデニル酸キナーゼ遺伝子をコードする遺伝子 （a d k) (ブル ーン (Brune, M. ) ら、 「Cloning and sequencing of the adenylate kinas e gene (adk) of Escherichia coli」 Nucleic Acias Res. 1 3卷、 713 9— 71 51頁 （1985年） ） を取得するためのプライマーは、 以下の通 りである ：
GGAGGATCCATGCGTATCATTCTGCTTGGC (配列番号 3 ) および
GGAAAGCTTGCCGAGGATTTTTTCCAG (配列番号 4) 。
配列番号 3のプライマーは a d k遺伝子の 5， 末端側に制限酵素 B amH I認識配列を導入するための配列を有する。 配列番号 4のプライマーは、 C 末端タグであるヒスチジンが ADKの C末端に付着するように設計され、 さ らに 3' 末端側に制限酵素 H i n d III認識配列を導入するための配列を有 する。
大腸菌の染色体 DNAを錶型とし、 上記プライマーを用いて、 常法により PCRを行い、 それぞれ!） p k遺伝子および a d k遺伝子を含む DNA断片 を取得した。 得られた p p k遺伝子を含む DN A断片を、 pGEMTベクタ 一（プロメガ）に導入し、 pGEMTp p kを得た。 得られた a d k遺伝子を 含む DNA断片を、 p GEMTベクター（プロメガ）に導入し、 pGEMTa d kを得た。
p GEMT p p kを X b a I— B a mH I処理して得られた 2. 1 k bの 断片、 および p GEMT a d kを B amH I _H i n dill処理して得られ た 0. 6 k b断片を、 p ETベクター （ストラタジーン） の X b a I _H i n d III消化物に連結させることによって、 プラスミ ド p ETp p k a d k を構築した。 このプラスミ ドは、 PPKと ADKとが 4つのグリシンを介し て結合され、 C末端に H i sタグを有するような融合タンパク質をコードす る遺伝子を含有している。
このプラスミ ド p ETp p k a d kを大腸菌 （E. c o l i B L 21) に導入し、 得られた形質転換体を 2時間培養し、 ついで、 ImMの I PTG を生育培地に添加した。 4時間培養後に、 形質転換体を遠心分離して集め、 0. 5M Na C 1を含有する 2 OmMリン酸緩衝液 （pH7) に懸濁した。 細胞を B— PER溶液 （ピアース）を用いて溶解し、 ついで ImM PMS F存在下、 DNa s eおよび RNa s eで処理した。 遠心分離により上清を 得、 0. 2 / mのフィルターを用いて濾過し、 ついで、 ハイ トラップキレー トス フム (Hi trap chelating column (Amersham Bioscienceノ ίこ口—卜し た。 カラムを 0. 1M ピロリン酸、 2 OmM リン酸、 0. 5M Na C 1、 5 OmM イミダゾール、 および 20%グリセロール （pH7. 4) を 用いて洗浄した。 P PK— ADK融合タンパク質は、 0. 1M ピロリン酸、 2 OmM リン酸、 0. 5M N a C l、 0. 5M イミダゾールおよび 2 0%グリセロール （pH 7. 4) で溶出した。
得られた P PK— ADK融合タンパク質は、 ADK (4 3 mg) およ ぴ P PK (3 8U/mg) の活性を有しており、 AMPとポリリン酸から A TPを生成した。 なお、 1ユニットの P PKは、 3 7°Cで、 ADPおよびポ リリン酸から 1. 0 zmo 1 Z分の ATPを合成する。 1ユニットの ADK は、 3 7°Cで、 八0卩から 1. 0 z mo 1 /分の ATPを合成する。
0. 1 6 gの P PK— ADK：、 Ι Ο Μ AMP、 400 μΜ ポリリ ン酸、 8mM Mg C l 2および 6 0mM T r i s— HC 1 (p H 7.
4) を含む混合液 5 0 μ 1を調製し、 5 μ 1の反応混液をサンプリングして、 40 μ 1の ATP生物発光アツセィ試薬 （ロシュ） と混合し、 直ちに、 マル チプレート蛍光測定計 （アルボ、 ワラス） を用いて、 発光を測定した。
図 2の P PK— ADKに示すように、 この ATPを含まない反応系で、 A TPの増幅が起こり、 蛍光が観察された。 この原因を検討したところ、 AD Pが P PKに結合しており、 この AD Pが P PKに利用されて、 最初に図 1 に示す第 2反応が起こって A T Pが生成し、 この A T Pが増幅された可能性 が示唆された。
(実施例 2 ： P PK— ADKに結合した AD Pの除去）
実施例 1で取得した P PK— ADKに結合している不純物の AD Pを除く ために、 6 OmM T r i s— HC 1 (p H8) および 8mM Mg C l 2、 および 1 OmM ポリリン酸の存在下、 1 8 0 gの P PK— ADKとアビ ラーゼ （a p y r a s e) (20 OU) とを 1時間反応させた。 反応終了後、 再度、 ハイトラップキレートカラムを用いて、 AD Pが除去された P PK— ADKを回収した。 以下、 この P PK— ADKを、 アビラーゼ処理した P P K一 ADKという。 なお、 1ユニットのアビラーゼは、 ATPまたは AD P から、 3 0°Cで、 1 μ mo 1のリン酸を遊離する。 0. 16 / gのアビラーゼ処理した PPK— ADK：、 10 AMP、 400 ポリリン酸、 8mM MgC l 2ぉょび60mM Tr i s—
HC 1 (pH7. 4) を含む混合液 50 μ 1を調製し、 5 μ 1の反応混液を サンプリングして、 40μ 1の ATP生物発光アツセィ試薬 （ロシュ） と混 合し、 直ちに、 マルチプレート蛍光測定計 （アルボ、 ワラス） を用いて、 発 光を測定した。
図 2に示すように、 アビラーゼ処理した P PK— ADKを用いた反応では、 60分間反応させた後でも、 蛍光が観察されなかった。 なお、 図示していな いが、 この混合液に ATPを添カ卩したところ、 蛍光が観察された。 このこと から、 アビラーゼ処理は、 P PK— ADKの ADK活性および P PK活性に 影響を与えないこと、 およびアビラーゼ処理により不純物の ADPが除去さ れた結果、 内因性の AT P増加が認められなかったことが判明した。 従って、 AT P添加による蛍光の観察は、 純粋に外因性の AT Pによると考えられる。 従って、 アビラーゼ処理した （ADKを含まない） PPK— ADKは、 外因 性 AT Pのアツセィに極めて有用である。
なお、 アビラーゼ処理に際して、 ハイ トラップキレートカラムへの PPK — ADKの吸着および同カラムからの溶出に際し、 洗浄緩衝液および溶出緩 衝液にピロリン酸を添加することが好ましい。 0. 1Mのピロリン酸は、 P PK— ADKから ADPを遊離させる効果があり、 ADPの除去をより効果 的に行うことができる。
(実施例 3 ：超高感度生物発光アツセィ）
0. 16 gのアビラーゼ処理した P PK— ADK：、 10 μΜ ΑΜΡ、 400 juM ポリリン酸、 8mM Mg C 12および 60 mM Tr i s— HC 1 (pH7. 4) を含む混合液 48 1を調製し、 ついで、 2 μ 1の A TPサンプルをこの混合液に添カ卩し、 ATPを増幅した。 5 μ ΐの反応混液 を経時的にサンプリングして、 40 / 1の AT P生物発光アツセィ試薬と混 合し、 直ちに、 マルチプレート蛍光測定計を用いて、 蛍光を測定した。 なお、 AT Pの増幅を行わず （P PK— ADKを添加せず） 、 そのまま、 蛍光を測 定したものを比較とした。 蛍光値は、 それぞれ異なった 3回の測定の平均値 士標準偏差を表す。 蛍光の経時的増加を図 3に、 60分後の ATP増幅の結 果を表 1に示す。
Figure imgf000016_0001
図 3に示すように、 アビラーゼ処理した P PK— ADKは、 外因性の AT Pがないときは、 60分の増幅処理にもかかわらず、 全く ATPの増幅がな いことがわかった。 さらに、 図 3およぴ表 1に示すように、 AT Pの初期濃 度が低いにもかかわらず、 蛍光測定可能な程度まで増幅できることがわかつ た。 この結果は、 この AT P増幅反応が、 超高感度生物発光アツセィに応用 可能であることを示している。 すなわち、 0. 0033フェムトモル （f m o l : 10— 15mo l =3. 3アトモル： 10— 18mo 1 ) 濃度の ATPを 含む試料を、 60分間 AT P増幅処理を行うことにより、 検出可能なレベル まで、 AT Pを増幅できることが示された。 すなわち、 数アトモル （a mo 1 ： 10-18mo 1 ) 濃度の ATPが検出可能となった。 これに対して、 従 来の生物発光は、 数十フヱムトモル （ f mo 1 ： 10— 15mo 1 ) の ATP が、 その発光を測定するために必要である （表 1) 。 このように、 本発明の AT P増幅法を用いることにより、 生物発光の感度が、 少なくとも 10， 0 00倍向上したことを示している。
(実施例 4 ：単一微生物の検出における超高感度生物発光アツセィの応用） 大腸菌の培養液 （2 X 109CFU/m 1 ) を、 純水を用いて適切な濃度 に希釈した。 細胞懸濁液 （500 1 ) を溶解緩衝液 500 μ 1 (生物発光 アツセィキット、 ロシュ） に加えて、 100°C、 2分間加熱して、 細胞から
AT Pを放出させた。 加熱サンプル 2 /1 1を AT P増幅アツセィにかけ、 生 物発光を測定した。 なお、 AT P増幅を行わず （P PK— ADKを添加せず） 、 そのまま、 蛍 光を測定したものを比較とした。 蛍光値は、 それぞれ異なった 3回の測定の 平均値士標準偏差を表す。 蛍光の経時的増加を図 4に、 60分後の ATP増 幅の結果を表 2に示す。
表 2
Figure imgf000017_0001
表 2およぴ図 4に示すように、 アツセィに用いた大腸菌の数に依存して、 蛍光量が変化した （図 4) 。 表 2に示すように、 AT P増幅を行わなかった 場合に比べ、 AT P増幅を行った場合の蛍光発色は著しく増強された。 AT P増幅がない場合、 表 2の 1 0， 000 CFUの場合でも蛍光発光の程度は 極めて低く、 有意な生物発光のレベルに達するには、 数万 CFUの大腸菌が 必要であった。 これに対して、 本発明の AT P増幅技術を用いた場合、 単一 の大腸菌 （1 CFUの大腸菌のレベル） という、 最も低レベルでも、 明確な 蛍光が観察された。 このことは、 AT P増幅をしなかった場合に比べて、 1 0， 0 00倍以上の感度があることを示している。
大腸菌生細胞の細胞内 AT Pレベルは、 約 7 μ τηο lZg乾燥菌体と報告 れてレヽる (Neuhard, j. , and Y. Nygaard 「P rines and pyrimiainesj 4 4 5— 4 7 3頁、 F. C. Neidhardtら編、 Escherichia coli and Salmonell a typhi murium: cellular and molecular biology, ASM press, Washingto n, D. C. (1 9 8 7年） ） 。 大腸菌 1個の乾燥重量は約 2. 8 X 1 0 13 g で ¾)る (F. C. Neidhardt 「Chemical composition of Escherichia coli」 3 - D F. C. Neidhardtら編、 Escherichia coli and Salmonella typh imuriura: cellular and molecular biologyj ASM press, Washington, D.
C. ( 1 9 8 7年） ） から、 大腸菌は、 細胞 1個あたり、 約 2アトモルの AT Pを含有している。 このレベルの AT Pは、 この超高感度生物発光アツセィ の検出限界の値とほとんど同じである。
(実施例 5 ：衛生学上のモニタリングへの超高感度生物発光ァッセィの応 用）
本発明の方法が、 大腸菌のスヮブモニタリングに応用できるか否かについ て検討した。 大腸菌の細胞懸濁液をポリスチレン製ペトリ皿にひろげ、 空気 乾燥して市販の綿棒で拭き取った。 市販の綿棒は有意な量の AT Pを含有し ているので、 予め 1 2 1°C、 7 5分のオートクレーブ処理を行い、 AT Pを AMPとリン酸に分解した。 4 c m2の表面積から拭き取ったサンプルを 4 0 0 μ \の溶解緩衝液に浸漬し、 ついで 1 0 0°C、 2分間加熱した。 加熱サ ンプル （10 1 ) を ATP増幅反応溶液 (40^ 1 ) に添加し、 60分間、 AT P増幅反応を行った。 そのうちの 25 / 1を生物発光アツセィに用いた c 結果を表 3に示す。 表 3
Figure imgf000019_0001
このスヮブモニタリングにより、 約 12大腸菌 C FUZc m2のレベルで の測定が可能となった。 本発明の方法が大腸菌のスヮブモニタリングに応用 できることが判った。
(実施例 6 ：飲料水中のバクテリアの検出）
本発明の方法が、 飲料水中のバクテリアの検出に有効か否かを検討した。 加熱した水サンプル （2 μ 1) を、 ΑΤΡ増幅反応溶液 （50μ 1) に添カロ し、 60分間、 ΑΤΡ増幅反応を行った。 表 4に結果を示す。 表 4において、 水道水 （1) は、 広島巿の上水道から得られたものである。 水道水 （2) は、 広島大学内で再生された水である。 ボトル詰めの水は、 市販品を購入した。 滅菌水は、 蒸留水をオートクレーブして、 調製した。 池水は、 広島大学の池 の水である。 コロニー数 （CFU) は、 1 m 1の水のサンプルをニュートリ ェント寒天培地 （1· 6 gのトリプトン、 l gのイーストエキス、 0. 5 g の Na C 1、 15 gの寒天、 水 1 L) に塗布し、 28°C、 3日間培養後、 形 成されたコロニーをカウントして、 求めた。 表 4
Figure imgf000020_0001
この結果は、 従来の生物発光アツセィでは検出できないレベルでも、 バタ テリアが検出できたことを示している。 表 4の結果が示すように、 本発明の 方法を用いて、 水サンプルについて 6 0分間の A T P増幅処理を行うことに より、 1 C F UZm 1のバクテリアが検出可能であることがわかる。 従来の 栄養培地を用いる方法は、 バクテリアの混入を検出するのに、 典型的には数 日を要した （表 4 ) 。 病原菌である緑膿菌 （Pseudomonas aeruginosa) が水 道水で検出されたとの報告がある （Bert, F.ら、 「Multi- resistant Pseudo monas aeruginosa outbreaK associated with contaminated tap water in a neurosurgery intensive care unitj J. Hosp. Infect. 3 9卷、 5 3— 6 2頁 （1 9 9 8年） ） 力 S、 本発明により、 このような微生物の存在が容易 にかつ迅速に、 検出される。
(実施例 7 ： ミルク中のバクテリアの検出）
酪農業における応用について検討した。 バクテリアの混入は、 ミルク業界 に大きなダメージを与えるため、 ミルク中のバクテリアを検出するための、 迅速で信頼のおけるテストが開発されている。 本発明者は、 さらに、 ミルク 中の黄色ブドウ球菌 （Staphylococcus aureus) を検出する感度の高いアツ セィを検討した。 黄色ブドウ球菌の培養液を適切な濃度に希釈し、 ミルク中 に加えた。 ミルク中に含まれる乳腺および体細胞からの非バクテリア性 AT Pを除去するために、 0. 5m lのミルクを、 0· 45 μπιのメンブランを 用いて濾過した。 このメンブランを 0· 2%T r i t ο ηΧ— 1 00、 1 0 OmM T r i s—HC l (pH7. 8) および 2mM EDTAを含む 1 Om lの溶液 (Olsson, T.ら、 「Extraction and determination of adenos ine 5' -triphosphate in bovine milk by the firefly luciferase assay. BiotechJ Appl. Biochem 8卷、 3 6 1— 3 6 9頁 （1 98 6) ) で洗浄 した。 洗浄後、 このメンブランを 20 0 i 1の溶解緩衝液に浸漬し、 1 0 0°C、 5分加熱した。 加熱サンプル （20 / 1 ) を 60分間の AT P増幅に かけた。 次いで、 生物発光アツセィに供した。 結果を表 5に示す。 表 5
Figure imgf000021_0001
アツセィの結果、 7 5 CFU (黄色ブドウ球菌） 0. 5m l ミルクが検 出できた。 黄色ブドウ球菌の検出感度は大腸菌の検出感度より低いが、 ミル ク中の黄色ブドウ球菌を検出する感度は、 従来の生物発光アツセィを用いた 場合の感度の約 1 0, 000倍に増大した。 本発明の微生物の存在を迅速に 決定する方法は、 環境中の微生物のみならず、 幅広い範囲の衛生学上のモニ タリングに応用可能である。 産業上の利用可能性
本発明の P PK— ADK融合タンパク質は、 ATP、 AMPおよびポリリ ン酸化合物の混合物に作用して、 AT Pを増幅する。 特に、 不純物である A DPを含まない P PK— ADKを用いることによって、 外因性 AT Pのみを 増幅することが可能となり、 細胞 1個のレベルの微生物の AT Pを増幅でき る。 増幅した AT Pは、 ルシフェラーゼアツセィなどで、 検出できる。 従つ て、 従来、 数日間かかってやっと検出できた微生物を、 極めて迅速に検出で き、 しかも、 たった 1個の細胞でも検出可能である。

Claims

請求の範囲
1. ATP、 AMPおよびポリリン酸化合物を含有する混合物に、 ポリリン 酸キナーゼとアデ-レートキナーゼとの融合タンパク質を作用させる工程を 含む、 AT Pの増幅方法。
2. 前記ポリリン酸キナーゼとアデ二レートキナーゼとの融合タンパク質が、 ADPを含まない融合タンパク質である、 請求項 1に記載の方法。
3. ATP、 AMPおよびポリリン酸化合物を含有する混合物に、 ポリリン 酸キナーゼとアデ二レートキナーゼとの融合タンパク質を作用させて、 AT Pを増幅する工程；および、 該増幅した AT Pを検出する工程； を包含する AT Pの検出方法。
4. 前記ポリリン酸キナーゼとアデ二レートキナーゼとの融合タンパク質力 A D Pを含まなレ、融合タンパク質である、 請求項 3に記載の検出方法。
5. 微生物の存在を迅速に検出する方法であって、
微生物含有試料を処理して、 AT P含有試料を調製する工程；
該 AT P含有試料を AT P増幅系に添カ卩して AT Pを増幅する工程；およ び
該増幅した AT Pを検出する工程；を包含し、
該 ATP増幅系が AMP、 ポリリン酸化合物、 および ADPを含まないポ リリン酸キナーゼとアデ二レートキナーゼとの融合タンパク質を含む、 方法。
6. 微生物の存在を迅速に検出するためのキットであって、 AMP、 ポリリ ン酸化合物、 および AD Pを含まないポリリン酸キナーゼとアデ二レートキ ナーゼとの融合タンパク質、 を含有する AT P増幅試薬と、 AT Pを検出す る AT P検出試薬を包含する、 キット。
7. さらに細胞溶解用試薬を備える、 請求項 6に記載のキット。
8. ATP、 AMP、 およびポリリン酸化合物の混合物に、 アデ二レートキ ナーゼ、 および ADPを含まないポリリン酸キナーゼを作用させて AT Pを 増幅する方法。
9. ポリリン酸キナーゼとアデ-レートキナーゼとの融合タンパク質。
10. ADPを含まない、 ポリリン酸キナーゼとアデ二レートキナーゼとの 融合タンパク質。
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