WO2005014899A1 - 蛋白質結晶化装置、蛋白質結晶化方法、蛋白質結晶化剤、及びその調製方法 - Google Patents

蛋白質結晶化装置、蛋白質結晶化方法、蛋白質結晶化剤、及びその調製方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an apparatus and a method for crystallization of protein or screening of crystallization conditions, and a method for protein crystallization from a protein-containing sample.
  • the present invention relates to a protein crystallization agent for precipitating crystals and a method for preparing the same.
  • the crystallization conditions of the protein to be analyzed are firstly screened. Then, crystallization is performed under optimal crystallization conditions. The obtained crystals are subjected to X-ray structural analysis to analyze the three-dimensional structure of the protein.
  • X-ray structural analysis to analyze the three-dimensional structure of the protein.
  • Various crystallization methods have been devised, including the vapor diffusion method. However, there are still many problems such as complicated experimental operations.
  • JP-A-6-321700 proposes a method in which a precipitant and a protein are contained in a gel, and the layers are laminated to suppress convection seen in a solution and grow crystals in the gel. . Also, besides this, Attempts have been made to use gels to simplify the crystallization process. Furthermore, in searching for crystallization conditions, various precipitants have been proposed.
  • a microarray In the invention described in WO 03/053998 pamphlet, a microarray is used.
  • a gel-like material is held in each section formed by the through holes.
  • Each gel contains a plurality of types and concentrations of protein crystallization agents.
  • the transfer and mixing (contamination) of the protein-containing sample and / or the crystallization agent occur between the sections of the microarray. For this reason, there is a possibility that the conditions under which the crystals are precipitated may not match the concentration and type of the crystallization agent contained in the gel-like material in the compartment in advance.
  • the present invention has been made to solve the above problems.
  • the present invention provides a protein crystallization agent and a method for preparing the same, and a protein crystallization experiment or screening of crystallization conditions, which promote the gelation reaction without causing gel opacity, in a rapid and economical manner. It is an object of the present invention to provide a protein crystallization apparatus that can be implemented with high reliability.
  • a microarray for protein crystallization having two or more crystallizing agent holding portions holding a protein crystallizing agent, and a plate laminated with the microarray for protein crystallization, wherein the plate comprises: A protein crystallization apparatus, comprising: a crystallization section corresponding to the holding section and capable of being filled with a protein-containing sample; and a recess provided between the crystallization sections;
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a use state of the protein crystallization apparatus of the present invention.
  • FIG. 2 shows an example of a microarray for protein crystallization used in the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of the protein crystallization apparatus of the present invention.
  • FIG. 4 is a sectional view of a part of a plate used in the present invention.
  • FIG. 5 is a plan view of a plate used in the present invention.
  • FIG. 6 shows a use state of the plate and the sample filling and capturing aid in the present invention. It is a top view.
  • FIG. 7 is a plan view of a support used in the present invention.
  • FIG. 8 is a plan view showing the state of use of the protein crystallization apparatus of the present invention. Explanation of symbols
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the protein crystallization apparatus of the present invention.
  • the protein crystallization apparatus of this example includes a support 20, a packing 22 made of silicone rubber, a microarray 18 for protein crystallization, and a plate 24.
  • the packing 22 has a hollow portion 23 having the same shape and area as the microarray 18 for protein crystallization.
  • the support 20 is provided with a microarray support 26 having the same shape and size as the outer periphery of the packing 22.
  • the microarray support 26 is provided with a marking 28 having the same shape as that of the packing 22.
  • Packing 22 is placed on microarray support 26 in alignment with marking 28.
  • the microarray 18 for protein crystallization is placed on the microarray support 26 and stored in the hollow portion 23 of the packing 22.
  • the protein crystallization microarray 1 was used. It is preferable that the upper surface of 8 and the upper surface of support 20 be at the same height.
  • FIG. 3 is an enlarged cross-sectional view of a central portion of the plate 24.
  • Figure 4 shows a part of the assembled state of the support 20, the protein crystallization microarray 18, and the plate 24.
  • the plate 24 includes a crystallization section 32 having a sequence corresponding to each of the crystallization agent holding sections 16 of the protein crystallization microarray 18, and a crystallization section 32. And a concave portion 34 provided therebetween.
  • Each crystallization section 32 is supported by the tip of a crystallization section support section 31 which is a portion of the plate 24 that is convex with respect to the concave section 34.
  • the plate 24 is stacked on the protein crystallization microarray 18 supported on the support 20. That is, as shown in FIG. 4, the crystallization section 32 is sealed by the crystallizing agent holding section 16. Further, between the crystallization section 32 supported by the crystallization section support section 31 and the crystallization section 32 also supported by the crystallization section support section 31, the recesses 3 4 are respectively located. I do.
  • the surface of the support 20 that supports the microarray 18 for protein crystallization is the microarray support surface 100
  • the surface of the plate 24 that is in contact with the microarray 18 for protein crystallization is the reaction surface 102
  • the opposite surface is referred to as the outer surface 104.
  • the outer edge of the region where the crystallization sections 32 are arranged is a concave portion. Therefore, a concave area of a certain area is formed on the plate 24.
  • the concave area where the crystallization sections 32 are arranged is referred to as a seal portion 30.
  • the microarray for protein crystallization 18 is installed on the microarray support 26 of the force support 20. Therefore, the microarray for protein crystallization 18 is only required to be installed so that the crystallization agent holding section 16 can be sealed to the crystallization section 32 in correspondence with the crystallization section 32. ,. That is, the protein crystallization microarray 18 may be bonded to the support 20 or the microarray support 26 may be formed in a concave shape, and may be laminated without bonding to the bottom of the microarray support. Is also good.
  • the material and the shape of the support 20 are not particularly limited as long as the microarray 18 for protein crystallization can be immobilized.
  • Light transmitting materials include, for example, acryl resin, polycarbonate resin, and polystyrene. Resin, polydimethylsiloxane (PDMS), glass and the like.
  • the support 20 is provided with a marking for determining the fixing position of the protein crystallization microarray 18.
  • the marking method is not particularly limited as long as the microarray for protein crystallization 18 can be fixed accurately. For example, a depression having the same shape and area as the protein crystallization microarray 18, a point painted on a position on the support 20 corresponding to a predetermined position of the protein crystallization microarray 18. And the like.
  • the crystallization section 32 and the crystallization agent holding section 16 correspond to the plate position.
  • a positioning hole 4 4 is further provided.
  • the microarray for protein crystallization 18 has two or more crystallizing agent holding sections 16 that hold a protein crystallization agent.
  • a material in which a protein crystallization agent is held in a porous body such as a gel capable of holding the protein crystallization agent (hereinafter, referred to as a holding phase) can be used.
  • a holding phase a material in which a protein crystallization agent is held in a porous body such as a gel capable of holding the protein crystallization agent
  • a gel is used as the holding phase.
  • the movement of the protein crystallization agent from the crystallization agent holding section 16 to the protein-containing sample filled in the crystallization section 32 is controlled to a moderately slow speed. Therefore, stable crystallization can be realized.
  • the material of the gel is not particularly limited.
  • a gel obtained by copolymerizing a polyfunctional monomer with recall di (meth) atarylate in an aqueous medium can be used.
  • Other gels such as agarose, alginic acid, dextra Gels such as polybutane alcohol, polyethylene glycol and polyethylene glycol, or gels obtained by crosslinking these gels can be used.
  • a liquid containing a monomer such as acrylamide, a polyfunctional monomer, and an initiator, which are components of the gel is used. What is necessary is just to inject
  • a method for gelling in addition to a method of copolymerizing in the presence of a polyfunctional monomer, a method of copolymerizing in the absence of a polyfunctional monomer and then using a crosslinking agent is used. There may be. When agarose is used as the gel material, gelling may be performed by lowering the temperature.
  • the method is not particularly limited.
  • a protein crystallization agent and the above polymerizable monomer are mixed in advance and introduced into an appropriate container, and then a polymerization reaction is performed to form a gel.
  • the protein crystallization agent may be impregnated with porous particles or the like, and the particles may be included in the gel.
  • the material, shape, and the like of the protein crystallization microarray 18 are not particularly limited as long as a large number of reaction substances are arranged and do not disturb the observation of crystal precipitation.
  • Examples of the material of the protein crystallization microarray 18 include glass, resin, and metal. Further, a composite prepared by combining these materials may be used. However, in order to easily confirm the presence or absence of the precipitation of the protein crystal, it is preferable to use a material having high light transmittance.
  • the shape of the protein crystallization microarray 18 may be, for example, a circle, a square, a rectangle, or the like.
  • the thickness can be arbitrarily selected in consideration of the improvement of the crystallization efficiency, the easiness of observation of the crystal precipitation, and the rapidity. For example, it can be 0.1 to 5 mm, preferably 0.2 to 2 mm.
  • FIG. 2 shows a microarray formed by arranging a plurality of hollow tubular bodies as a preferred example of a protein crystallization microarray used in the protein crystallization apparatus of the present invention.
  • two or more hollow fibers 12 are partitioned and fixed as a hollow tubular body on a substrate 10.
  • These hollow fibers 12 have hollow portions 14.
  • These hollow parts i 4 are filled with a gel holding a protein crystallization agent,
  • the holding part 16 is formed. That is, two or more crystallizing agent holding units 16 are sectioned and arranged on the substrate 10 to constitute a microarray 18 for protein crystallization.
  • the hollow fiber 12 is, for example, a homopolymer of a methacrylate monomer such as methyl methacrylate, ethyl methacrylate, or butyl methacrylate, an acrylate monomer such as methyl acrylate or ethyl acrylate, or a copolymer thereof. And those formed from coalesced polystyrene, polyethylene, polypropylene, nobornene / ethylene copolymer, polyethylene terephthalate, polycarbonate, glass, and the like.
  • the inner wall surface of the hollow fiber 12 may be used in an untreated state. If necessary, plasma treatment or radiation treatment such as ⁇ -ray or electron beam may be applied. Furthermore, the hollow fiber 12 may have a reactive functional group introduced as necessary.
  • the outer diameter of the hollow fiber 12 is preferably 2 mm or less in order to increase the number of the crystallization agent holding sections 16 per unit area. More preferably, it is 0.7 mm or less.
  • the inner diameter of the hollow fiber 12 is appropriately selected within the range of the outer diameter. The following method can be used as a method for partitioning and fixing two or more hollow fibers 12 to the substrate 10. That is, first, the hollow fibers 12 are arranged in parallel at a predetermined interval. After these hollow fibers 12 are converged, they can be bonded to form a fiber array (three-dimensional array).
  • the obtained three-dimensional array is cut in a direction intersecting with the fiber axis, preferably in a direction perpendicular to the fiber axis, using an apparatus for preparing a section such as a microtome.
  • an apparatus for preparing a section such as a microtome.
  • a microarray composed of thin sections FIG. 2 having a cross section of the hollow fiber array.
  • the thickness of the flake can be usually used as 100 to 500 Aim. Preferably it is 2000 to 2000 ⁇ m.
  • the hollow fiber array in which the hollow fibers 12 are arranged regularly and longitudinally and horizontally. It can.
  • the shape of the hollow fiber array is not particularly limited. Usually, the fibers are regularly arranged to form a square, rectangle, circle, etc.
  • Regularly means that the number of fibers contained in a frame of a certain size is constant Means that they are arranged in order. For example, if fibers of l mm in diameter are bundled and arranged so that the cross section is a square with a length of 1 O mm and a width of 1 O mm, one side of the square frame (1 cm 2 ) The number of fibers contained in is assumed to be 10. Then, the 10 fibers are bundled in one row to form a single-layer sheet. Then, stack the sheets so that they are in 10 layers. As a result, a total of 100 fibers can be arranged, that is, 10 fibers vertically and 10 horizontally. However, the method of regularly arranging the fibers is not limited to the method of stacking the sheets as described above.
  • the microarray 18 for protein crystallization By using a microarray having a plurality of hollow tubular bodies arranged as described above as the microarray 18 for protein crystallization, the thickness of the microphone opening array 18 for protein crystallization, the thickness of the crystallizing agent holding section 16
  • the protein crystallization apparatus can be manufactured efficiently with good control of the volume, the type and concentration of the retained protein crystallization agent, and the like.
  • the microarray for protein crystallization 18 is preferably stored by being sealed with a container or seal having good airtightness for preventing contact with the outside air.
  • a container or seal having good airtightness include a polymer material having low gas and water permeability, glass, metal, and the like.
  • a microarray is preferably stored at a low temperature, and may be stored frozen especially for long-term storage.
  • each of the crystallizing agent holding sections 16 is made of a gel prepared under different protein crystallization conditions. This makes it possible to quickly perform screening on one microarray when screening crystallization conditions.
  • the protein crystallization conditions include the type and concentration of the protein crystallizing agent, the retention phase for retaining the protein crystallizing agent, for example, the pH of the gel after the protein crystallizing agent is retained and solidified, and the gel. , The degree of crosslinking, the temperature, time, cooling profile and the like of the crystallization agent holding section 16 and the crystallization section 32.
  • Examples of the type of the protein crystallization agent include a precipitant, a pH buffer, and any combination thereof.
  • the precipitant examples include sodium salt sodium chloride, polyethylene glycol, 2-methyl-12,4-pentanediol, and ammonium sulfate.
  • pH buffer examples of the agent include sodium acetate trihydrate, potassium phosphate, imidazole, sodium citrate, sodium dihydrocodylate and the like. These may be used alone or in any combination of two or more.
  • a protein crystallization agent commercially available products such as “WIZ ARD II” manufactured by Emerald Biostructures, “Crysta 1 screen”, and “Grid Screen J” manufactured by Hamp to nResearch are available.
  • the concentration of the protein crystallizing agent depends on the type of the protein crystallizing agent to be used. For example, in the case of a precipitant composed of polyethylene glycol, 5 to 50% by volume, preferably 10 to 10% is used. a 35 volume 0/0. on the other hand, in the case of p H buffering agent, from 0.05 to 0.
  • each crystallization agent holding section 16 under different protein crystallization conditions, screening of the crystallization conditions for the target protein can be performed quickly.
  • Microarray for protein crystallization 18 has 10 to 1000 crystallization agent holding units 1
  • the microarray for protein crystallization 18 is preferably made of a material having a high light transmittance in order to easily confirm the precipitation of the protein.
  • the packing 22 is made of silicone rubber. Packing materials are suitable for use in combination with other components of the protein crystallizer (eg, microarrays for protein crystallization 18, plates 24, supports 20). It is not particularly limited as long as it is one.
  • the protein crystallizer eg, microarrays for protein crystallization 18, plates 24, supports 20. It is not particularly limited as long as it is one.
  • the plate 24 has a crystallization section 32 corresponding to the crystallization agent holding section 16 and capable of filling a protein-containing sample, and a concave section 34 provided between these crystallization sections 32. That is, the same number of crystallization sections 32 as the crystallization agent holding sections 16 are provided on the plate 24.
  • a sample filling auxiliary tool positioning hole 50 is formed in the plate 24 as a positioning portion for adjusting the position of the sample filling auxiliary tool described later.
  • a plate positioning member 44 for associating the crystallization section 32 with the crystallization agent holding section 16 when the plate 24 and the support 20 are laminated on the support 20 is further provided. Is provided. A plate positioning hole 46 corresponding to the plate positioning member 44 provided on the support 20 is formed on the plate 24.
  • a sealant inlet 48 penetrating from the outer surface 104 of the plate 24 to the reaction surface 102 is further formed.
  • two sealant injection ports 48 are formed on opposite sides of each other via a seal portion 30.
  • the material and shape of the plate 24 are not particularly limited as long as they can be superimposed on the protein crystallization microarray 18, and may be any given in consideration of the shape of the protein crystallization microarray 18.
  • Examples of the material of the plate include glass, resin, and metal. Any of these can be selected and used alone or in combination of two or more.
  • the portion corresponding to each of the crystallization agent holding sections 16 overlaps with the light transmitting portion. It is preferable to have Therefore, as the material of the plate 24, it is preferable to use a light transmissive material, for example, a transparent resin, glass or the like.
  • Plate 24 provides a crystal recovery mechanism for recovering crystals precipitated in crystallization section 32. It is more preferable to have them. Using such a crystal recovery mechanism, the crystals precipitated in the crystallization section 32 are recovered and used as seed crystals. By subsequently performing the crystal growth process, a crystal that can withstand X-ray structural analysis can be obtained quickly. Of course, if the precipitated crystals can withstand X-ray structure analysis as they are, they are collected and used for analysis.
  • the seal portion 30 is made of a member independent of the plate 24, is connected to the plate 24 by a hinge mechanism, and the seal portion 30 is formed on the outer surface 104 as desired. And a mechanism that can be opened to the side.
  • the shape of the crystallization section 32 is not particularly limited as long as it can be filled with a protein-containing sample and is sealed when it comes into contact with the crystallization agent holding section 16.
  • the volume of the crystallization section 32 should be less than 0.5 ⁇ l to reduce the amount of protein required for screening the crystallization conditions. It is preferable that On the other hand, when the crystal precipitated here is intended to be subsequently subjected to X-ray structural analysis or used as a seed crystal for producing a crystal to be subjected to structural analysis, the capacity of the crystallization section 32 is 0.5 ⁇ 1 or more is preferred! / ,. In this case, a large crystal of 0.1 mm or more that can be subjected to X-ray structural analysis is obtained.
  • the relationship between the areas of the crystallization agent holding section 16 and the crystallization section 32 is as follows.
  • the area of the surface where the holding section 16 and the crystallization section 32 come into contact with each other is such that the crystallization agent held in the crystallization agent holding section 16 moves to the crystallization section 32 and the crystallization section 3 It is only required that the condition “C” that can react with the protein-containing sample filled in 2 is sufficient.
  • the crystallization section 3 2 may be larger than the crystallization agent holding section 16. Preferably, 2 does not contact the substrate 12 that constitutes the protein crystallization microarray 18.
  • the sealant 35 may be any as long as it does not dissolve in the protein-containing sample and each other and does not erode the members such as the plate 24, the packing 22, and the substrate 12 constituting the protein crystallization microarray 18.
  • paraffin oil, silicone oil and the like can be used.
  • the concave portion 34 can prevent the protein-containing sample from entering the adjacent compartment.
  • the sealant 35 when the sealant 35 is used, mixing of the protein-containing samples and intrusion into the adjacent crystallization section 32 can be more reliably prevented, and evaporation of the protein-containing sample can be prevented.
  • a mechanism for pressing the protein crystallization microarray 18 supported on the support 20 and the plate 24 is further shown. Specifically, as shown in FIG. 1, a first screw hole 40 penetrating the support 20 and a second screw hole 4 penetrating the plate 24 corresponding to the first screw hole 40. 2 is provided. The screw 41 is screwed into the first screw hole 40 and the second screw hole 42 as shown in FIG. By using such a mechanism, the crystallization section 32 can be more stably maintained in a closed state.
  • a detection mechanism for monitoring crystallization of the protein in the crystallization section 32 can be further provided.
  • the detection mechanism examples include a detection mechanism including a microscope mounted on the outer surface 104 of the plate 24 and a CCD camera mounted on the microscope.
  • a detection mechanism including a microscope mounted on the outer surface 104 of the plate 24 and a CCD camera mounted on the microscope.
  • the state of crystallization can be photographed and recorded by a CCD camera mounted on a microscope, and the recorded image data can be processed to quickly determine the success or failure of crystallization. Therefore, protein crystallization conditions can be determined quickly.
  • the crystallization section 32 can be filled with the protein-containing sample using the sample filling aid.
  • the volume of the crystallization section 32 is preferably 0.5 ⁇ 1 or more.
  • the volume of the crystallization section 32 is preferably set to less than 0.5 ⁇ l.
  • the protein-containing sample is a sample containing a protein to be crystallized or to specify crystallization conditions (hereinafter, referred to as a target protein).
  • Proteins include natural or synthetic peptides, polypeptides, proteins and protein complexes. These substances are extracted from natural or synthetic materials, isolated, or produced by genetic engineering or chemical synthesis techniques, and then combined with ordinary purification methods such as solvent extraction, column chromatography, and liquid chromatography. It is preferable to purify the target protein by using it.
  • the protein concentration and purity in the protein-containing sample also contribute to the protein crystallization conditions. Therefore, a protein-containing sample having several levels of concentration and purity may be prepared and reacted with the protein crystallization agent.
  • the protein concentration is preferably changed in several steps within the range of 1 to 5 Omg / m1.
  • the amount of the protein-containing sample to be reacted with the protein crystallization agent can be appropriately changed according to the volume and number of the crystallization sections 32 to be used.
  • the viscosity of the protein-containing sample is particularly limited unless the protein-containing sample leaks from the crystallization section 32 when the plate 24 is held with the crystallization section 32 holding the protein-containing sample facing downward. Not done.
  • the protein-containing sample may contain, in addition to the target protein, a protein solubilizing agent that helps dissolve the protein, a stabilizing agent such as a reducing agent, and the like.
  • a protein solubilizing agent include a surfactant that dissolves a membrane protein.
  • a surfactant When a surfactant is used, a protein having low water solubility such as a membrane protein can be favorably dispersed in a protein-containing sample. Therefore, protein crystallization can be performed efficiently by applying the protein crystallization apparatus of this example.
  • a plate 24 as shown in FIG. 1 is allowed to stand with the reaction surface 102 facing upward as shown in FIG.
  • a cylindrical guide bin of the same diameter as the sample filling aid positioning hole 50 and the plate positioning hole 46 is provided in the sample filling aid positioning hole 50 and the plate positioning hole 46 drilled in the plate 24. 5 Insert 2 one by one and fix.
  • the crystallization section 32 corresponding to the perforation 56 is filled with the protein-containing sample.
  • the guide bin 52 is pushed from the reaction surface 102 side of the plate 24 to the outer surface 104 side, and the sample filling aid 54 is removed from the plate 24. As a result, all the crystallization sections 32 are filled with the protein-containing sample.
  • the sample-filling aid 54 is placed on the reaction surface 102 of the plate 24, and the protein-containing sample is added thereto, whereby the protein-containing sample is accurately crystallized. 2 can be filled.
  • the sample filling aid 54 is preferably made of stainless steel from the viewpoint of ease of molding, strength, salt resistance, and the like.
  • the sample filling auxiliary tool 54 is provided with a portion to be handled by tweezers or the like so that the sample filling auxiliary tool 54 can be easily removed after the protein-containing sample is filled in the crystallization section 32.
  • a bent portion 59 is provided with one end bent upward.
  • the guide bin 52 was fixed to the sample filling auxiliary tool positioning hole 50 and the plate positioning hole 46, respectively.
  • a plurality of sample filling auxiliary tool positioning holes 50 may be formed in the plate 24 independently of the plate positioning holes 46.
  • the protein-containing sample can be filled in the same amount in all the crystallization sections 32, and the sample to the components other than the crystallization section 32 can be loaded. Any method that can suppress adhesion.
  • each of the crystallization sections 32 can be filled with a protein-containing sample using a pipeter or the like without using the sample filling and capturing tool 54. It is also better to use an automatic device for sample addition.
  • a pipetter When a pipetter is used to fill the protein-containing sample, a small amount of liquid adhering to the tip of the pipetter is used without using a mechanism for discharging the protein-containing sample sucked and held by the pipetter.
  • the droplet is brought into contact near the crystallization section 32.
  • the packing 22 is set in accordance with the marking 28 on the support 20. Then, the protein crystallization microarray 18 is placed on the support 20 so as to be stored in the hollow portion 23 of the packing 22.
  • the plate 24 filled with the protein-containing sample in the crystallization section 32 is held with the reaction surface 102 down and on the protein crystallization microarray 18 supported on the support 20. Laminate.
  • the plate positioning member 44 provided on the support 20 passes through the plate positioning hole 46 formed in the plate 24.
  • the plate 24 is stacked on the protein crystallization microarray 18 supported on the support 20 with the reaction surface 102 facing down.
  • the plate 24 filled with the protein-containing sample in the crystallization zone 32 is allowed to stand with the reaction surface 102 facing upward, and the microarray 1 for protein crystallization is placed on the plate 24.
  • the support 20 supporting 8 may be laminated with the microarray support surface 100 down. If the plate 24 is installed with the outer surface 104 facing upward, it is easy to inject the sealant from the sealant inlet 48 or to observe crystals precipitated in the crystallization section 32. Preferred.
  • Screw 41 is screwed into second screw hole 42, and plate 24 is pressed against protein crystallization microarray 18 supported on support 20.
  • a pipette or the like is inserted from the sealant injection port 48 drilled in the plate 24 as shown in Figs. Is used to fill the seal portion 30 and the concave portion 34 with the sealant.
  • the protein-containing sample that has leaked out of the protein crystallization microarray 18 to a position other than the crystallization agent holding section 16 can be replaced with a sealant.
  • the contamination and the change in conditions due to the movement of the protein-containing sample between the adjacent crystallization sections 32 are more reliably prevented. Further, evaporation of the protein-containing sample can be prevented.
  • the amount of the sealant to be injected is such that the sealant spreads over the concave portion 34 over the entire area of the seal portion 30 and the sealant is injected from one sealant inlet 48 as shown in FIGS. It is preferable that the maximum amount is such that the sealing agent does not leak from the other sealing agent injection port 48 upon injection.
  • crystallizer Using the assembled protein crystallizer, screening of protein crystallization conditions can be performed, and the optimal crystallization conditions for the target protein can be determined. In addition, crystals suitable for structural analysis can be produced using the precipitated crystals.
  • the protein crystallizer After reacting the protein crystallizing agent with the protein-containing sample in the protein crystallizer, the protein crystallizer is sealed in the air or in air under a certain temperature condition for a time sufficient for the protein to precipitate. Leave to rest.
  • the time sufficient for protein precipitation depends on the specific protein, concentration, crystallization conditions, etc., but is about 1 hour to 10 days, and when crystals do not precipitate after about 30 days or more , The crystallization conditions are considered to be inappropriate. Further, the temperature condition is a factor of the protein crystallization condition, so that the crystallization may be performed by changing the temperature condition. Temperature conditions are preferably set in multiple stages, for example, 4 ° C, 15 ° C, 18 ° C, 22 ° C, and the like.
  • the volume of the crystallization section 32 is set to 0.5 ⁇ 1 or more for the purpose of protein crystallization, of all the crystallization sections 32, the crystallization section 32 in which crystals have precipitated continues to be used. Crystals are grown or precipitated crystals are collected from crystallization section 32 and used as seed crystals under a similar crystallization condition as crystallization section 32 from which seed crystals were recovered by a known protein crystallization method. Crystals for structural analysis can be produced.
  • Known protein crystallization methods include, for example, a hanging drop method, a sitting drop method, a dialysis method, and a batch method.
  • the volume of the crystallization section 32 is set to less than 0.5 ⁇ l for the purpose of more rapid screening of protein crystallization conditions, the target protein is crystallized under the obtained optimal crystallization conditions, A crystal for analysis can be obtained.
  • a known method for example, a vapor diffusion method, a hanging hole method, or the like can be used.
  • the three-dimensional structure of the target protein can be determined.
  • the plate 24 and the protein crystallization microarray 18 are laminated, whereby the crystallization agent holding section 1 is formed. 6 and the crystallization sections 32 filled with the protein-containing sample overlap correspondingly.
  • the crystallization agent held in the crystallization agent holding section 16 moves into the crystallization section 32 and reacts with the protein. If each crystallization agent holding section 16 is set to different crystallization conditions, crystals precipitate in the crystallization section 32 set to appropriate crystallization conditions in order to crystallize the target protein. I do.
  • the protein-containing sample is held in the crystallization section 32 and sealed by the crystallization agent holding section 16.
  • Each crystallization section 32 is isolated by a recess 34. Therefore, the movement of the protein-containing sample between the crystallization sections 32 and between the Z or protein crystal reagent holding section 16 Mixing can be prevented. Further, evaporation of the solution from the protein-containing sample can be suppressed, and a minute amount of protein-containing sample of n1 level can be stably retained. Therefore, protein crystallization can be performed with high reliability. In addition, it is possible to reliably determine whether the crystallization conditions are good or bad.
  • the protein-containing samples can be more efficiently prevented from entering the crystallization compartment 32 adjacent to each other.
  • evaporation of the protein-containing sample can be prevented. Therefore, even if the amount of the protein-containing sample is very small, the crystallization conditions can be controlled well.
  • the crystallization section 32 can be stably sealed. Therefore, crystallization can be performed with higher reliability and reliability.
  • the protein crystallization apparatus of the present invention can be suitably used, for example, in research and development in the field of medicine and the like, for both screening of protein crystallization conditions and preparation of crystals for protein structure analysis.
  • the gel for protein crystallization according to the present invention is characterized in that the protein crystallization agent is uniformly dispersed and dissolved in the gel by gelling a solution containing the protein crystallization agent and the unsaturated monomer. To do.
  • the protein crystallization agent is not particularly limited as long as it can reduce the solubility of the protein in the protein solution.
  • salts include ammonium sulfate, sodium salt, sodium phosphate, potassium phosphate, lithium chloride, sodium malonate, sodium citrate, magnesium sulfate, lithium sulfate, sodium nitrate, cadmium sulfate, sodium sulfate, and the like.
  • Organic solvents include 2-methyl-1,2,4-pentanediol (hereinafter referred to as MPD), ethanol, isopropanol, dioxane, methanol, tert-butanol, n-propano And the like.
  • water-soluble polymer compound include polyethylene dalicol (hereinafter, referred to as PEG), polyethylene glycol monoalkyl ether, polyethyleneimine, and the like.
  • precipitants can be used alone or in combination of two or more.
  • ammonium sulfate, sodium chloride, sodium phosphate phosphate, lithium chloride, sodium malonate, MPD and PEG are particularly preferred.
  • concentration of the precipitant used is preferably 0.1 to 5.0 Omol / L for salts, 1 to 80% by volume for organic solvents, and 1 to 50% by weight for water-soluble polymer compounds.
  • the crystallization of the protein is preferably performed in a specific pH region, and a buffer may be used to maintain the pH.
  • the buffer to be used is not particularly limited.
  • citric acid, 21- (N-morpholino) ethanesulfonic acid, N-2-hydroxyhexylpyrazine-N-ethanesulfonic acid, tris (hydroxymethyl ) Aminomethane, N, N-bis (hydroxyxethyl) glycine, etc. may be used.
  • a single or a mixture of two or more types may be neutralized with an acid or alkaline as necessary to adjust to a predetermined pH. I do.
  • the pH is preferably in the range of 3.0 to 10.0, more preferably in the range of 4.0 to 9.0.
  • an unsaturated monomer is used as a gelling agent.
  • the unsaturated monomer is not particularly limited as long as it can form a gel by polymerization in an aqueous medium, but is preferably a (meth) acrylamide-based monomer or a (meth) acryl-based monomer.
  • Examples of (meth) acrylamide monomers include (meth) acrylamide, N, N-dialkylacrylamide, N, N-dialkylacrylamide, and other N, N-dialkylacrylamide (meth) acrylic monomers.
  • Dialkylamino (meth) acrylamide quaternary ammonium salts such as oral salt and dimethylaminoethyl (meth) acrylamide dimethyl oral salt are preferably used.
  • the (meth) acrylic monomers include 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl (meth) acrylate, 6-hydroxyhexyl (meth) acrylate, and diethylene glycol mono (meth) acrylate.
  • Hydroxyl-containing (meth) acrylate such as triethylene glycolone mono (meth) acrylate, polyethylene glycol mono (meth) acrylate, dimethylaminoethyl (meth) acrylate, getylaminoethyl (meth) acrylate, etc.
  • Dialkylaminoalkyl (meth) acrylates such as dialkylaminoalkyl (meth) acrylates, dimethylaminoethyl (meth) atalylate methyl chloride salts, and ethylaminoethyl (meth) atelylate, etc.
  • Grade ammonium salts are preferably used.
  • the monomer concentration is preferably 0.1 to 50% by mass relative to 100% by mass of the protein crystallization agent solution. ⁇ 10 mass% is more preferable.
  • the crosslinkable monomer copolymerizable with the above-mentioned monomer used as required in the present invention is not particularly limited as long as it is a monomer having a bifunctional or higher functional radical polymerizable group.
  • N -methylenebis (meth) acrylamide, ethylene dalichol di (meth) atalylate, diethylene glycol di (meth) atalylate, triethylene glycol di (meth) atalylate, polyethylene glycol di (meth) atalylate, trimethylol propane
  • Examples include tri (meth) acrylate, trimethylolpropaneethylene oxide-modified tri (meth) atalylate, and the like.
  • N, N'-methylenebis (meth) acrylamide, ethylene dalicol di (meth) acrylate, polyethylene dalicol di ( Meta) Door is preferred.
  • the amount of the crosslinkable monomer to be added is 0.01 to 10 parts by mass based on the monomers in the group (A) or the group (B). Preferably 0.1 to 5 parts by mass.
  • the protein crystallization agent of the present invention can obtain a transparent gel by combining a specific precipitant with a specific unsaturated monomer. If the gel is transparent, it will be very easy to observe the protein crystals formed. Therefore, automation by an optical detection system becomes easier.
  • Examples of the combination of the unsaturated monomer and the protein crystallizing agent from which a transparent gel can be obtained include (1) a group of acrylamide, 2-acrylamide-12-methylpropanesulfonic acid, and methacryldimethylaminoethyl methyl chloride salt. At least one monomer selected from the group consisting of sodium chloride, (2) dimethylacrylamide and MPD,
  • the protein crystallization agent of the present invention is prepared by thermally polymerizing an aqueous solution containing at least a precipitant, a buffer, and an unsaturated monomer.
  • it can be prepared by polymerizing in the presence of a thermal and / or photo-radical polymerization initiator to cause gelling, and keeping the precipitating agent uniformly in the gel. It is preferable to carry out the polymerization in the presence of a radical polymerization initiator.
  • a redox polymerization initiator obtained by combining the above peroxide with a reducing agent such as a tertiary amine, a sulfite, and a ferrous salt. Further, a redox polymerization initiator and a azo polymerization initiator are combined. A combined polymerization initiator may be used.
  • polymerization can be performed using a photoradical polymerization initiator under a light source that provides light of a specific wavelength.
  • the photo-radical polymerization initiator used is in a range of a specific wavelength.
  • Suitable initiators include, for example, initiators commonly used for photopolymerization such as acylphosphinoxide, benzoin, benzoin alkyl ether, benzyl, benzophenone, and anthraquinone.
  • the above-mentioned specific wavelength has a wavelength of 200-650 when considering two points of light absorption by the monomer itself contained in the reaction solution and photon energy used for radical generation. It is desirable to use light in the nm range.
  • Representative examples of light sources that can be used for light irradiation in the wavelength region of 200 to 65 nm include high-pressure mercury lamps, low-pressure mercury lamps, metal halide lamps, fluorescent chemical lamps, and fluorescent blue lamps.
  • a hollow fiber array was produced as a component supporting the crystallization agent holding section.
  • Two perforated plates are stacked, and in each hole of these perforated plates, polyethylene hollow fiber (Mitsubishi Rayon Co., Ltd., outer diameter about 500 ⁇ , inner diameter about 300 ⁇ , length about 10 ⁇ m) (0 cm) 100 pieces were passed. Then, with the hollow fiber stretched, two positions of 10 cm and 40 cm from one end of the hollow fiber were fixed, and the distance between the two perforated plates was set to 30 cm. .
  • a mixed solution having the following composition was prepared.
  • the mixed solution and the hollow fiber array obtained above were placed in a desiccator, and the long end of the free ends of each hollow fiber was immersed in the mixed solution, and the desiccator was used.
  • the mixture was introduced into the hollow portion of the hollow fiber by reducing the pressure in the inside.
  • the hollow fiber array was transferred to a closed glass container whose inside was saturated with steam, and a polymerization reaction was carried out at 80 ° C. for 4 hours.
  • a hollow fiber array in which the acrylamide gel was fixed to the hollow portion of the hollow fiber was obtained.
  • the acrylamide gel-containing hollow fiber array obtained above is cut into a thickness of about 2 mm using a microtome in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the hollow fibers, so that the hollow portions of the hollow fibers are filled with the gel.
  • a total of 100 hollow fibers in each of the vertical and horizontal directions, that is, a total of 100 hollow fibers were regularly arranged in a square to obtain an arrayed body slice.
  • FIG. 2 shows a gel-containing hollow fiber array slice obtained by the above-described process. As shown in FIG. 2, the hollow portion 14 of the hollow fiber 12 is filled with the acrylamide gel prepared above.
  • the acrylamide gel filled in the hollow portion 14 of the hollow fiber 12 was mixed with the following A, B, C, D, E, F, G, H, I,
  • the protein crystallizing agent 11 composed of the aqueous solution of J was added to the gel held in each hollow portion, whereby the protein crystallizing agent was held in the acrylamide gel, and a microarray 18 for protein crystallization was produced.
  • spots A to J the crystallization agent holding sections 16 holding the protein crystallization agents of A to J are referred to as spots A to J, respectively.
  • the crystallization conditions of lysozyme (manufactured by Sigma-Aldrich) were screened using the protein crystallizer shown in FIG.
  • the microarray for protein crystallization 18 prepared above was used as the microarray for protein crystallization, and acryl resin was used as the material for the support 20 and the plate 24.
  • the crystallization section 32 was filled with the protein-containing sample.
  • the sample filling aid 54 one having perforations 56 of an arrangement corresponding to the crystallization agent holding part 16 of the microarray for protein crystallization 18 obtained above was used.
  • the crystallization section 32 was in the form of a cylinder having a diameter of 0.7 mm and a height of 0.15 mm and closed at one end, and the capacity of the crystallization section 32 was 105 n1.
  • a lysozyme-containing aqueous solution (8 O mg / m 1) was used as the protein-containing sample.
  • the sample filling aid 54 is placed on the plate 24 as shown in FIG. 6, and a protein-containing sample 1.5 to 2 / ⁇ 1 is pierced with a 20 ⁇ 1 autopipette 56 Was added over all of the Next, the protein-containing sample was pressed onto the plate 24 with a spatula from above the sample filling aid 54, whereby the protein-containing sample was filled in all the crystallization sections 32 on the plate 24.
  • the plate 24 filled with the protein-containing sample was held in the crystallization section 32 with the reaction surface 102 down, and the support 2 was removed. It was laminated on the microarray 18 for protein crystallization supported on 0.
  • the sealant injection port 48 drilled on the plate 24 was inserted from the outer surface 104 side of the plate 24. Using a pipette, paraffin filler (hereinafter referred to as oil) was injected as a sealant. The amount of oil to be injected is The area was filled with oil and immediately before oil overflowed from the other sealant inlet 48.
  • the protein crystallizer was allowed to stand at 20 ° C for 3 hours. Subsequently, as a result of observing the inside of the crystallization section 32 with an optical microscope, no lysozyme crystals were observed in the spot B holding an aqueous solution of polyethylene daricol as a protein crystallization agent, and 2.Omo1 / L aqueous sodium chloride solution was added. In the retained spot A, columnar crystals most suitable for X-ray structural analysis were observed.
  • lysozyme crystals were prepared from the lysozyme-containing sample solution by the hanging drop method using an Omo 1 / L sodium chloride aqueous solution as a protein crystallization agent. At this time, the size of the obtained lysozyme crystal was 0.3 X 0.3 X 0.5 mm.
  • screening of protein crystallization conditions could be carried out quickly, economically, and with high reliability on a small amount of a protein-containing sample.
  • the buffer used in the protein crystallization gel of the present invention was prepared according to a conventional method using the following buffer.
  • 0.1 M-citrate buffer pH 4.0
  • 0.1 M-citrate buffer pH 5.0
  • 0.1 M-MES pH 6.0
  • 0.1 M-HEPES pH 7.
  • 0.1 M-Tris pH 8.0
  • 0.1 M-Bicine pH 9.0
  • solution b 90 g of a 50% aqueous acrylamide solution (manufactured by Mitsubishi Rayon) is dissolved by adding 5 g of N, N'-methylenebisacrylamide (hereinafter abbreviated as MBAAm) and 5 g of deionized water, and dissolving it in a 50% monomer solution.
  • MBAAm N, N'-methylenebisacrylamide
  • solution c A 10% aqueous solution of zobis [2- (2-imidazoline-1-yl) propane] dihydrochloride (VA-044, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was prepared (referred to as solution c).
  • Example 2 A crystallization agent aqueous solution (2.0 M NaCl, pH 4.0, monomer concentration 8%) was prepared in the same procedure as in Example 1 except that the concentration of solution a was changed to 2.4 M. Further, a transparent hide mouth gel was obtained by the same procedure. In addition, the formation of lysozyme crystals was confirmed by the same method. Table 1 shows the results.
  • Examples 9 to 12 A crystallization agent aqueous solution was prepared in the same manner as in Examples 1 to 4, except that the buffer was changed to 0.1 M—MES buffer (pH 6.0). By the same procedure, a transparent hide mouth gel was obtained. Also, the lysozyme crystal Generation was confirmed. Table 1 shows the results.
  • Examples 21 to 24 A crystallization agent aqueous solution was prepared in the same procedure as in Examples 1 to 4, except that the buffer was changed to 0.1 M Bicine buffer (pH 9.0). Further, a transparent hide mouth gel was obtained in the same procedure. In addition, the formation of lysozyme crystals was confirmed by the same method. Table 1 shows the results.
  • Example 25 0.5 g of polyethylene glycol as a precipitant (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, PEG 6 000, weight average molecular weight: 6000) was weighed in a 10 ml measuring flask, and 0.1 M citrate buffer was used. (pH 4.0) to prepare a 5.5% -PEG aqueous solution (this is referred to as solution d). Also, a monomer solution of polyethylene glycol monoacrylate (NKESTERA-200, manufactured by Shin-Nakamura Chemical) dissolved in 95 g of polyethylene glycol monoacrylate (Plenma-AE 90, manufactured by NOF CORPORATION) is referred to as e-solution. Prepared.
  • solution c a 10% aqueous solution of 2,2′-azobis [2- (2-imidazoline_2-2-yl) propane] dihydrochloride (VA-044, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is a water-soluble polymerization initiator, is used. Is referred to as solution c). Inject 920 ⁇ l of Solution a and 80 ⁇ l of Solution b into a 2 ml sample tube and mix to prepare a protein crystallization reagent aqueous solution (5% PEG, pH 4.0, monomer concentration 8%) The solution c was further added to 10 ⁇ l of kneaded kneaded rice cake and mixed well, and then polymerized in a 55 ° C. warm bath for 3 hours to obtain a transparent hide mouth gel. Thereafter, the formation of lysozyme crystals was confirmed in the same manner as in Example 1. Table 1 shows the results.
  • Example 26 A crystallization agent aqueous solution (10% -PEG, pH 4.0, monomer concentration 8%) was prepared in the same manner as in Example 25 except that the concentration of solution d was changed to 11%. Was prepared, and a transparent hide mouth gel was obtained by the same procedure. In addition, the formation of lysozyme crystals was confirmed by the same method. Table 1 shows the results.
  • Example 27 A crystallization agent aqueous solution (20% -PEG, pH 4.0, monomer concentration 8%) was prepared in the same procedure as in Example 25 except that the concentration of solution d was changed to 22%. Further, a transparent hide mouth gel was obtained by the same procedure. In addition, the formation of lysozyme crystals was confirmed by the same method. Table 1 shows the results.
  • Example 28 A crystallization agent aqueous solution (30%-PEG, pH 4.0, monomer concentration 8%) was prepared in the same procedure as in Example 25 except that the concentration of Solution d was changed to 33%. Further, a transparent hide mouth gel was obtained by the same procedure. In addition, the formation of lysozyme crystals was confirmed by the same method. Table 1 shows the results.
  • Examples 29-32> A crystallization agent aqueous solution was prepared in the same procedure as in Examples 25-28, except that the buffer was changed to 0.1 M-citrate buffer (pH 5.0). A transparent hide mouth gel was obtained in the same manner as described above. In addition, the formation of lysozyme crystals was confirmed by the same method. Table 1 shows the results.
  • Examples 37-40> A crystallization agent aqueous solution was prepared in the same procedure as in Examples 25-28, except that the buffer was changed to 0.1 M-HEPES buffer (pH 7.0). By the same procedure, a transparent hide mouth gel was obtained. In addition, the formation of lysozyme crystals was confirmed by the same method. Table 1 shows the results.
  • Examples 41-44> A crystallization agent aqueous solution was prepared in the same procedure as in Examples 25-28, except that the buffer was changed to 0.1 M-Tris buffer (pH 8.0). A transparent hide mouth gel was obtained in the same manner as described above. In addition, the formation of lysozyme crystals was confirmed by the same method. Table 1 shows the results.
  • Examples 45 to 48> A crystallization agent aqueous solution was prepared in the same procedure as in Examples 25 to 28 except that the buffer was changed to 0.1 M Bicine buffer (pH 9.0). By the same procedure, a transparent hide mouth gel was obtained. Also, in the same way The formation of team crystals was confirmed. Table 1 shows the results.
  • Example 49 0.48 g of a precipitant, sodium salt, was weighed into a 10 ml container, and the volume was adjusted to 0.1 M-citrate buffer (pH 4.0) to prepare 1.2 M-NaC. An aqueous solution (referred to as solution a) was prepared.
  • N-acrylamide 2-methylpropanesulfonic acid 47.5 g 2.5 g of N'-methylenebisacrylamide (hereinafter abbreviated as MBAAm) and 50 g of deionized water were added and dissolved to prepare a 50% monomer solution (referred to as solution b).
  • solution b a 50% monomer solution
  • VA-044 2,2′-azobis [2- (2-imidazoline-1-yl) propane] dihydrochloride
  • VA-044 2,2′-azobis [2- (2-imidazoline-1-yl) propane] dihydrochloride
  • solution c 2.5 g of N, N'-methylenebisacrylamide (hereinafter abbreviated as MBAAm) and 35 g of deionized water are dissolved in 62.5 g of an 80% aqueous solution of methacryl dimethylaminoethyl methyl chloride salt, and dissolved. Then, a 50% monomer solution (referred to as solution b) was prepared. Furthermore, a 10% aqueous solution of 2,2,2-azobis [2- (2-imidazoline-l- 2-yl) propane] dihydrochloride (VA-044, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Is referred to as solution c).
  • VA-044 2,2,2-azobis [2- (2-imidazoline-l- 2-yl) propane] dihydrochloride
  • Example 51 2 g of 2-methyl-2,4-pentanediol with a precipitant was weighed into a 10 ml volumetric flask, and the volume was adjusted to 20% with 0.1 M citrate buffer ( ⁇ 4.0). An aqueous solution of 2-methyl-2,4-pentanediol (hereinafter referred to as a solution a) was prepared. Also, 2.5 g of N, N'-methylenebisacrylyl-amide (hereinafter abbreviated as MBAAm) and 4 g of deionized water were added to 47.5 g of dimethylacrylamide, and dissolved. A solution (this is referred to as solution b) was prepared.
  • MBAAm N, N'-methylenebisacrylyl-amide
  • solution b A solution (this is referred to as solution b) was prepared.
  • a 10% aqueous solution of 2,2, -azobis [2- (2-imidazoline-1-yl) propane] dihydrochloride (VA-044, manufactured by Wako Pure Chemical Industries), which is a water-soluble polymerization initiator, is used.
  • Is c liquid Prepared. Inject 840 ⁇ l of solution a and 160 ⁇ l of solution b into a 2 ml sample tube, mix and mix, protein crystallization reagent aqueous solution (1.0 ⁇ —NaCl, pH 4.0, monomer concentration 8%) was prepared, and 10 ⁇ l of Solution c was added thereto, mixed well, and polymerized in a warm bath at 55 ° C. for 3 hours to obtain a transparent hide mouth gel.
  • VA-044 2,2, -azobis [2- (2-imidazoline-1-yl) propane] dihydrochloride
  • Example 52 1.176 g of sodium phosphate, a precipitant, and 0.035 g of potassium phosphate were weighed into a 1 Om 1 volumetric flask, and were weighed with a 0.1 M citrate buffer (pH 4.0). The volume was adjusted to a 1.0 M aqueous solution of sodium / potassium phosphate (this is referred to as a night).
  • solution c a 50% monomer solution (this was referred to as solution b) was prepared. Furthermore, a 10% aqueous solution of 2,2′-azobis [2- (2-imidazoline-1-yl) propane] dihydrochloride (VA-044, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is a water-soluble polymerization initiator, is used. This was designated as solution c).
  • Example 54> 1.04 g of a precipitant, malonic acid, was weighed into a 1 Om 1 volumetric flask, neutralized by adding 4 g of a 20% aqueous sodium hydroxide solution, and then 0.1 M A 1.0 M aqueous solution of sodium malonate (hereinafter referred to as “solution a”) was prepared by making the volume constant with an acid buffer (pH 4.0).
  • solution b a 50% aqueous acrylamide solution (manufactured by Mitsubishi Rayon), 5 g of N, N'-methylenebisacrylamide (hereinafter abbreviated as MBAAm) and 5 g of deionized water are added and dissolved. Is referred to as solution b).
  • the gelation reaction in the protein crystallization, the gelation reaction can be completed, and a gel-like substance that does not cause cloudiness can be formed, and the protein crystallization agent is retained.
  • a transparent gel material can be provided.

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Abstract

本発明は、蛋白質の結晶化実験あるいは結晶化条件のスクリーニングを、迅速かつ経済的に、高い信頼性をもって実施することができる蛋白質結晶化装置、及びより簡便な方法で蛋白質の結晶化操作を行うことが可能である蛋白質結晶化剤を提供する。本発明の蛋白質結晶化装置は、蛋白質結晶化剤を保持した2以上の結晶化剤保持部16を有する蛋白質結晶化用マイクロアレイ18と、前記蛋白質結晶化用マイクロアレイ18と積層されるプレート24とを有し、前記プレート24は、前記結晶化剤保持部16に対応し蛋白質含有試料を充填可能な結晶化区画32と、該結晶化区画32の間に設けられた凹部34とを有することを特徴とする。本発明の蛋白質結晶化剤は、蛋白質沈殿剤、不飽和単量体を含有してなる溶液をゲル化させることにより、該結晶化剤がゲル中に均一に保持されたことを特徴とする。

Description

蛋白質結晶化装置、 蛋白質結晶化方法、 蛋白質結晶化剤、 及びその調製方法 技術分野 本発明は、 蛋白質の結晶化あるいは結晶化条件のスクリーニングを行うための 装置および方法、 並びに蛋白質含有試料から蛋白質の結晶を析出させるための蛋 白質結晶化剤及びその調製方法に関する。 背景技術 近年、 蛋白質の立体構造と蛋白質の機能との関係を明らかにすることにより、 それをコードする遺伝子の機能を解明しようとする、 構造ゲノム科学と呼ばれる 研究が行われている。
蛋白質の立体構造の解析は、 通常、 解析しょうとする蛋白質の結晶化条件をま ずスクリーニングする。 その後、 最適な結晶化条件における結晶化を実施する。 そして得られた結晶を X線構造解析に供することにより、 蛋白質の立体構造の解 析が行われている。 ここで、 蛋白質の結晶化条件をスクリーニングする過程にお いては、立体構造解析を行うのに十分に良好な結晶を得る条件を決定するまでに、 多くの時間と多量の蛋白質試料を費やしている。 そのため、 これが立体構造解析 におけるボトルネックとなっている。 また、 蒸気拡散法を始めとしてとする様々 な結晶化方法が考案されている。 し力 し、 実験操作が煩雑である等依然として課 題は多い。 これら既存の方法に代わる新しい結晶化方法や装置の開発が行われ、 蛋白質の結晶化条件のスクリーニング、 あるいは結晶化を迅速に、 より微量のサ ンプルで行うための、 種々の蛋白質結晶化装置や結晶化方法、 結晶化スクリー二 ング方法が提案されている。例えば特開平 6-321700号公報では、沈殿剤や蛋白質 をゲル中に含有させ、 これらを積層することにより、 溶液中で見られる対流を抑 えてゲル中で結晶を成長させる方法が提案されている。 また、 これ以外にも、 結 晶化方法を簡略化するため、 ゲル状物を利用しょうとする試みがなされている。 さらには、 結晶化条件の探索に際して、 様々な沈殿化剤が提案されている。
しかし、ゲル状物を利用する場合、ゲル状物と沈殿剤の組み合わせによっては、 ゲルが白濁したり、 ゲルィ匕反応が進行しなかったりとレ、う問題があった。 ゲルが 白濁すれば、結晶化状態の有無を顕微鏡により観察することができず問題となる。 また、 本発明者らの一部は、 蛋白質の結晶化条件のスクリーニングを迅速に、 かつ微量のサンプルで経済的に行うことを目的として、 結晶化実験を、 マイクロ アレイ型のチップ上で行うような結晶化装置を提案している （例えば、 WO O 3 , 0 5 3 9 9 8号パンフレツト）。
WO O 3 / 0 5 3 9 9 8号パンフレツトに記載の発明では、 マイクロアレイを 使用している。 そのマイクロアレイは、 貫通孔により形成された各区画内にゲル 状物が保持されている。 そして各ゲル状物には、 複数の種類および濃度の蛋白質 結晶化剤が含まれている。 このマイクロアレイを蛋白質含有試料と接触させるこ とにより、一度に複数の結晶化条件をスクリーニングすることができる。さらに、 微量の蛋白質試料で実施することができ、 非常に効率的である。
しかしながら、 上記の蛋白質結晶化装置では、 マイクロアレイの区画間で、 蛋 白質含有試料及び/又は結晶化剤の移動、 混合 （汚染） が起こる。 そのため、 結 晶が析出した条件が予め区画内のゲル状物に含まれる結晶化剤の濃度や種類と一 致しない虞があった。
また、 このような装置では、 蛋白質含有試料を手作業で結晶化剤保持部分に供 する必要があり、 操作が煩雑となる。 また、 自動的に蛋白質含有試料を供する自 動装置は高価である。
本発明は前記課題を解決するためになされたものである。 本発明は、 ゲルの白 濁化を起こさずに、 ゲル化反応を進行させる、 蛋白質結晶化剤とその調製方法、 並びに蛋白質の結晶化実験あるいは結晶化条件のスクリーニングを、 迅速かつ経 済的に、 高い信頼性をもって実施することができる蛋白質結晶化装置を提供する ことを目的とする。
発明の開示 本発明は、 以下のものを提供する。
-蛋白質結晶化剤を保持した 2以上の結晶化剤保持部を有する蛋白質結晶化用マ イクロアレイと、 前記蛋白質結晶化用マイクロアレイと積層されるプレートとを 有し、 前記プレートは、 前記結晶化剤保持部に対応し蛋白質含有試料を充填可能 な結晶化区画と、 該結晶化区画の間に設けられた凹部とを有することを特徴とす る蛋白質結晶化装置；
•アクリルアミ ド、 2—アクリルアミ ドー 2—メチルプロパンスルホン酸、 メタ クリルジメチルァミノェチルメチルク口ライド塩の群から選択される少なくとも
1種のモノマーを含むゲル状物に塩化ナトリゥムが保持されている蛋白質結晶化 用ゲル；
-ジメチルアクリルアミドを含むゲル状物に MP Dが保持されている蛋白質結晶 化用ゲル；
• 2—ァクリルアミ - 2—メチルプロパンスルホン酸を含むゲル状物にリン酸 Na/Kが保持されている蛋白質結晶化剤；
•メタタリルジメチルァミノェチルメチルク口ライド塩を含むゲル状物に、 硫酸 アンモニゥムが保持されている蛋白質結晶化用ゲル；
•ァクリルアミドを含むゲル状物に、 マロン酸ナトリゥムが保持されている蛋白 質結晶化用ゲル；
•ポリオキシエチレンモノアクリレートを含むゲル状物に PEG6kが保持されてい る蛋白質結晶化用ゲル。 図面の簡単な説明 図 1は、 本発明の蛋白質結晶化装置の使用状態を示す模式図である。
図 2は、 本発明に用いられる蛋白質結晶化用マイクロアレイの例を示す。 図 3は、 本発明の蛋白質結晶化装置の一例を示す模式図である。
図 4は、 本発明に用いられるプレートの一部の断面図である。
図 5は、 本発明に用いられるプレートの平面図である。
図 6は、 本発明におけるプレートおよびサンプル充填捕助具の使用状態を示す 平面図である。
図 7は、 本発明に用いられる支持体の平面図である。
図 8は、 本発明の蛋白質結晶化装置の使用状態を示す平面図である。 符号の説明
1 2 中空繊維； 1 6 結晶化剤保持部； 1 8 蛋白質結晶化用マイクロアレ ィ ； 2 0 支持体； 2 4 プレート； 3 2 結晶化区画； 3 4 凹部 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明の実施の形態について、 図面を参照して説明する。
図 1は、 本発明の蛋白質結晶化装置の一例を示す模式図である。
この例の蛋白質結晶化装置は、 図 1に示すように、 支持体 2 0、 シリコンゴム 製のパッキング 2 2、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8、 プレート 2 4を備え ている。
パッキング 2 2は蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8と同じ形状おょぴ面積の 中空部 2 3を有している。 支持体 2 0には、 該パッキング 2 2の外周と同じ形状 および大きさのマイクロアレイ支持部 2 6が設けられている。 マイクロアレイ支 持部 2 6には、 パッキング 2 2と同一の形状のマーキング 2 8が施されている。 パッキング 2 2は、 マーキング 2 8に位置を合わせてマイクロアレイ支持部 2 6上に設置されている。 そして蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8が、 マイクロ アレイ支持部 2 6上に、 パッキング 2 2の中空部 2 3に格納されて設置されてい る。 ここで、 プレート 2 4に設けられた結晶化区画 3 2と、 蛋白質結晶化用マイ クロアレイ 1 8上の結晶化剤保持部 1 6とを正確に接触させるために、 蛋白質結 晶化用マイクロアレイ 1 8の上面と、 支持体 2 0の上面とは、 同じ高さになって いることが好ましい。
図 3は、プレート 2 4の中央部を拡大した断面図である。図 4に、支持体 2 0、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8、 プレート 2 4が組み立てられた状態の一部 の断面図を示す。
プレート 2 4は、 図 3、 4に示すように、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8 の結晶化剤保持部 1 6の各々と対応した配列の結晶化区画 3 2と、 該結晶化区画 3 2の間に設けられた凹部 3 4とを有する。 なお、 各々の結晶化区画 3 2は、 プ レート 2 4において凹部 3 4に対し凸な部位である結晶化区画支持部 3 1の先端 にそれぞれ支持されている。
このプレート 2 4は、 支持体 2 0に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8の上に積層される。 すなわち、 図 4に示すように、 結晶化区画 3 2は、 結晶 ィ匕剤保持部 1 6によって密封されている。 更に、 結晶化区画支持部 3 1に支持さ れた結晶化区画 3 2と、 同様に結晶化区画支持部 3 1に支持された結晶化区画 3 2との間に、 各々凹部 3 4が位置する。
以下、 支持体 2 0のうち蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8を支持する面をマ イクロアレイ支持面 1 0 0、 プレート 2 4のうち蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8に接する面を反応面 1 0 2、 それと反対側の面を外側面 1 0 4と称する。 なお、 プレート 2 4において、 結晶化区画 3 2の配列された領域の外縁は凹部 となる。 従って、 プレート 2 4において凹状となった一定面積の領域が形成され る。 以下、 プレート 2 4の反応面のうち、 結晶化区画 3 2が配列された凹状の領 域を、 シール部 3 0と称する。
この例においては、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8力 支持体 2 0のマイ クロアレイ支持部 2 6上に設置されている。 し力 し、 蛋白質結晶化用マイクロア レイ 1 8は、 結晶化剤保持部 1 6が結晶化区画 3 2に対応して該結晶化区画 3 2 を密封できるように設置されていればよレ、。 即ち蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8は、 支持体 2 0に接着されていてもよいし、 マイクロアレイ支持部 2 6を凹 状に形成し、該マイクロアレイ支持部の底部に接着せずに積層されていてもよい。 支持体 2 0の材料おょぴ形状は、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8を固定可 能なものであれば、 特に限定されない。 支持体 2 0の材料としては、 光透過性の 材料を用いることにより、 生成した結晶を結晶化装置のまま迅速'簡便に顕微鏡 にて確認でき、 結晶の成長過程を経時的に観察できることから好ましい。 光透過 性の材料としては、 例えばァクリル樹脂、 ポリカーボネート榭脂、 ポリスチレン 樹脂、 ボリジメチルシロキサン ( P DM S )、 ガラス等が挙げられる。
支持体 2 0には、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8の固定位置を決めるため のマーキングが施されている。 マーキング方法は、 蛋白質結晶化用マイクロアレ ィ 1 8を正確な固定を可能とするものであれば特に限定されない。 例えば、 蛋白 質結晶化用マイクロアレイ 1 8と同様の形状おょぴ面積を有する窪み、 蛋白質結 晶化用マイクロアレイ 1 8の所定の位置に対応する支持体 2 0上の位置に塗装さ れた点などが挙げられる。
この例では、 図 7に示すように、 支持体 2 0に、 プレート 2 4と支持体 2 0と を積層する際に結晶化区画 3 2と結晶化剤保持部 1 6とを対応させるプレート位 置決め孔 4 4がさらに設けられている。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8は、 蛋白質結晶化剤を保持した 2以上の結 晶化剤保持部 1 6を有する。
結晶化剤保持部 1 6としては、 ゲル等の蛋白質結晶化剤を保持できる多孔質体 (以下、 保持相とする） に蛋白質結晶化剤を保持させたものを用いることができ る。 保持相は、 図 4に示すように結晶化区画 3 2に充填された蛋白質含有試料が 結晶化剤保持部 1 6に接触した際に、 該保持相から結晶化区画 3 2へ蛋白質結晶 ィ匕剤が移動するものであればよい。
前記保持相としては、ゲルを用いることが好ましレ、。ゲルを用いることにより、 結晶化剤保持部 1 6力 ら、 結晶化区画 3 2に充填された蛋白質含有試料への蛋白 質結晶化剤の移動が、 適度に緩やかな速度に制御される。 そのため、 安定した結 晶化を実現できる。
ゲルの材料は特に制限されないが、 例えば、 アクリルアミ ド、 N, N—ジメチ ルアクリルアミ ド、 N—イソプロピルアクリルアミ ド、 N—アタリロイルァミノ エトキシエタノール、 N—ァクリロイルァミノプロパノール、 N—メチロールァ クリルアミ ド、 N—ビニルピロリ ドン、 ヒ ドロキシェチルメタクリ レート、 （メタ） アクリル酸、 ァリルデキストリン等の単量体の一種類または 2種類以上と、 メチ レンビス （メタ） アクリルアミ ド、 ポリエチレンダリコールジ (メタ) アタリレ 一ト等との多官能性単量体を、 例えば水性媒体中で共重合したゲルを用いること ができる。 その他に、 ゲルとして、 例えばァガロース、 アルギン酸、 デキストラ ン、 ポリビュルアルコール、 ポリエチレングリコール等のゲル、 またはこれらを 架橋したゲルを用いることができる。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8に、 上記のようなゲルを保持させるには、 例えば、 ゲルの構成成分であるアクリルアミド等の単量体、 多官能性単量体およ ぴ開始剤を含む液を該容器に注入し、 重合させてゲル化させればよい。 ゲル化さ せる方法としては、 多官能性単量体の存在下に共重合させる方法の他、 多官能性 単量体の非存在下に共重合させたのち架橋剤を用レ、る方法であってもよい。また、 ゲル材料としてァガロースを用いる場合は、 温度降下によってゲルィ匕を行っても よい。
蛋白質結晶化剤をゲルに保持させる場合、 その方法は、 特に制限されるもので はない。 例えば、 予め蛋白質結晶化剤と上記の重合性モノマーとを混合して、 適 当な容器に導入しておき、 その後、 重合反応を行ってゲルを形成させる。 これに より、 蛋白質結晶化剤をゲルに保持させることができる。 ここで、 蛋白質結晶化 剤を多孔性粒子等を含浸させ、 その粒子をゲルに包括させることもできる。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8の材料、 形状等は、 反応用物質が多数個整 列配置されており、結晶析出の観察を妨げないものであれば、特に限定されない。 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8の材料としては、 例えば、 ガラス、 樹脂、 金属等が挙げられる。 また、 これらの材料を組み合わせて作製した複合体を用い てもよい。 ただし、 蛋白質結晶の析出の有無を容易に確認するために、 光透過性 の高い材料を用いることが好ましい。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8の形状としては、 例えば、 円形、 正方形、 長方形などの形状が挙げられる。 また、 その厚みについては、 結晶化の効率の向 上や、 結晶析出の観察の容易化および迅速ィヒを考慮して任意に選択できる。 例え ば 0 . l〜5 mm、 好ましくは 0 . 2〜 2 mmとすることができる。
図 2に、 本発明の蛋白質結晶化装置に用いられる蛋白質結晶化用マイクロアレ ィの好適な例として、 複数の中空管状体を配列してなるマイクロアレイを示す。 図 2に示すように、 基板 1 0に、 中空管状体として 2本以上の中空繊維 1 2が区 画配列されて固定されている。これらの中空繊維 1 2は中空部 1 4を有している。 これらの中空部 i 4に、 蛋白質結晶化剤を保持したゲルが充填されて、 結晶化剤 保持部 1 6を成している。 すなわち、 基板 1 0に、 2つ以上の結晶化剤保持部 1 6が区画配列されて、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8を構成している。 中空繊維 1 2は、 例えば、 メチルメタクリレート、 ェチルメタクリレー卜、 ブ チルメタタリレート等のメタタリレート系モノマー、 メチルァクリレート、 ェチ ルァクリレート等のァクリレート系モノマーの単独重合体もしくはこれらの共重 合体、 ポリスチレン、 ポリエチレン、 ポリプロピレン、 ノボルネン /エチレン共 重合体、 ポリエチレンテレフタレート、 ポリカーボネート、 ガラス等から形成さ れるものが挙げられる。
中空繊維 1 2の内壁表面は、無処理の状態で用いてもよい。また必要に応じて、 プラズマ処理や γ線、電子線などの放射線処理を施したものであってもよレ、。 さ らに、 中空繊維 1 2は、 必要に応じて反応性官能基を導入したものであってもよ い。
中空繊維 1 2の外径は、 単位面積あたりの結晶化剤保持部 1 6の数を多くする ために、 2 mm以下であることが好ましい。、 0 . 7 mm以下であることがより好 ましい。 また、 中空繊維 1 2の内径は、 前記外径の範囲内で適宜選択される。 基板 1 0に、 2つ以上の中空繊維 1 2を区画配列して固定する方法としては、 以下の方法を用いることができる。 すなわち、 まず、 中空繊維 1 2を、 所定の間 隔をもって平行に配列させる。 これらの中空繊維 1 2を収束した後に接着して、 繊維配列体 （三次元配列体） となすことができる。 得られた三次元配列体を、 ミ クロトームなどの切片作成用の装置を用いて、 繊維軸と交差する方向、 好ましく は繊維軸に対して垂直方向に切断する。 これににより、 中空繊維配列体断面を有 する薄片 （図 2 ) からなるマイクロアレイを得ることができる。 薄片の厚みは、 通常 1 0 0〜5 0 0 0 Ai mとして用いることができる。 好ましくは 2 0 0〜2 0 0 0 μ mである。
このとき、 中空繊維 1 2を規則的に配列し、 樹脂接着剤等で接着することによ り、 例えば、 縦横に中空繊維 1 2が整然と規則的に配列した中空繊維配列体を得 ることができる。中空繊維配列体の形状は特に限定されるものではなレ、。通常は、 繊維を規則的に配列させることにより、 正方形、 長方形、 円形等に形成される。
「規則的に」 とは、 一定の大きさの枠の中に含まれる繊維の本数が一定となる ように順序良く配列させることをいう。 例えば、 直径 l mmの繊維を束にして断 面が縦 1 O mm、 横 1 O mmの正方形となるように配列させようとする場合は、 その正方形の枠内（1 c m2)における 1辺に含まれる繊維の数を 1 0本とする。 そしてこの 1 0本の繊維を 1列に束ねて 1層のシートとする。 その後、 このシー トが 1 0層になるように重ねる。 その結果、 縦に 1 0本、 横に 1 0本、 合計 1 0 0本の繊維を配列させることができる。 ただし、 繊維を規則的に配列させる手法 は、 上記のようにシートを重層するものに限定されるものではない。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8として、 上記のような、 複数の中空管状体 を配列してなるマイクロアレイを用いることによって、 蛋白質結晶化用マイク口 アレイ 1 8の厚み、 結晶化剤保持部 1 6の体積、 保持される蛋白質結晶化剤の種 類および濃度等を、 良好に制御して、 かつ効率よく、 蛋白質結晶化装置を製造す ることができる。
なお、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8は、 外気との接触を防ぐ密閉性のよ い容器やシール等で密閉することにより保存されることが好ましい。 密閉性のよ い容器としては、 例えば、 気体や水の透過率の小さい高分子材料や、 ガラス、 金 属等が挙げられる。 また、 このようなマイクロアレイは、 低温で保存されること が好ましく、 特に長期にわたる保存の場合は凍結保存してもよい。
さらに、 各々の結晶化剤保持部 1 6が、 異なる蛋白質結晶化条件に調製された ゲルからなることが好ましい。 このことにより、 結晶化条件のスクリ一二ングを 行う場合に、 スクリーニングを一枚のマイクロアレイ上で迅速に行うことができ る。
ここで、 蛋白質結晶化条件とは、 蛋白質結晶化剤の種類および濃度、 蛋白質結 晶化剤を保持させる保持相、 例えば蛋白質結晶化剤を保持させて固化させた後の ゲルの p H、 ゲルの組成、 架橋度、 結晶化剤保持部 1 6および結晶化区画 3 2の 温度、 時間、 冷却プロファイル等である。
蛋白質結晶化剤の種類としては、 例えば、 沈殿剤、 p H緩衝剤、 これらの任意 の組み合わせ等が挙げられる。
沈殿剤としては、 例えば、 塩ィ匕ナトリウム、 ポリエチレングリコール、 2—メ チル一 2 , 4—ペンタンジオール、 硫酸アンモニゥム等が挙げられる。 p H緩衝 剤としては、例えば、酢酸ナトリゥム三水和物、 リン酸カリウム、イミダゾール、 クェン酸ナトリウム、 力コジル酸ナトリウム等が挙げられる。 これらを単独で使 用してもよいし、 任意の組み合わせの 2種以上で使用してもよい。 さらに、 蛋白 質結晶化剤としては、市販品として、 Eme r a l d B i o S t r u c t u r e s社製「WI Z ARD I I」、 Hamp t o nRe s e a r c h社製「C r y s t a 1 s c r e e n」、 「G r i d S c r e e n J 等を用いることができる。 蛋白質結晶化剤の濃度としては、 用いる蛋白質結晶化剤の種類にもよるが、 例 えば、 ポリエチレングリコールからなる沈殿剤の場合は、 5〜50体積％、 好ま しくは 10〜 35体積0 /0である。 一方、 p H緩衝剤の場合には、 0. 05〜 0.
5mo 1 ZL、 好ましくは 0. ；!〜 0. 2mo l/Lである。
上述のように、 各々の結晶化剤保持部 16を、 それぞれ異なる蛋白質結晶化条 件に調製することにより、 対象の蛋白質についての結晶化条件のスクリーニング を迅速に行うことができる。 ここで、 例えば、 蛋白質結晶化剤の濃度を多段階に 設定することが好ましい。 具体的には、 塩化ナトリウムからなる沈殿剤を用いる 場合は、 0. 5〜4. Omo l/Lの範囲で、 5段階、 10段階、 20段階のよ うに希釈列を作製する。 そして、 それぞれの濃度の蛋白質結晶化剤を、 結晶化剤 保持部 16に充填することができる。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ 18は、 10〜 1000個の結晶化剤保持部 1
6を有することが、 より多数の結晶化条件における結晶化を一括して行うために 好ましい。 例えば、 通常の蛋白質結晶化条件スクリーユングにおいては、 800 程度の結晶化条件を検討することが必要である。 従って、 結晶化剤保持部の数が
10以上であることが好ましい。 一方、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 18が 1
000を超える結晶化剤保持部 16を有すると、 結晶化剤保持部 16間の間隔が 非常に狭くなり、 取り扱いの効率に劣る。
蛋白質 晶化用マイクロアレイ 18は、蛋白質析出の確認を容易に行うために、 光透過性の高い材料からなることが好ましい。
この例において、 パッキング 22はシリコンゴム製である。 パッキングの材料 は、 蛋白質結晶化装置におけるその他の構成要素 （例えば、 蛋白質結晶化用マイ クロアレイ 18、 プレート 24、 支持体 20) と組み合わせて用いるのに適当な ものであれば特に限定されない。
プレート 2 4は、 結晶化剤保持部 1 6に対応し蛋白質含有試料を充填可能な結 晶化区画 3 2と、これらの結晶化区画 3 2の間に設けられた凹部 3 4とを有する。 すなわち、 結晶化剤保持部 1 6と同数の結晶化区画 3 2が、 プレート 2 4上に設 けられている。
プレート 2 4には、 後述のサンプル充填捕助具との位置を合わせる位置決め部 として、 例えば、 サンプル充填補助具位置決め孔 5 0が形成されていることが好 ましい。
この例では、 支持体 2 0上に、 プレート 2 4と支持体 2 0とを積層する際に結 晶化区画 3 2と結晶化剤保持部 1 6とを対応させるプレート位置決め部材 4 4が さらに設けられている。 プレート 2 4上に、 支持体 2 0上に設けられたプレート 位置決め部材 4 4と対応するプレート位置決め孔 4 6が形成されている。
この例では、 図 1、 5に示すように、 さらに、 プレート 2 4の外側面 1 0 4か ら反応面 1 0 2へ貫通するシール剤注入口 4 8が穿たれている。 図 5に示すよう に、 この例では、 2つのシール剤注入口 4 8がシール部 3 0を介して互いに反対 側に穿たれている。 このことにより、 一方のシール剤注入口 4 8力、らシール部 3 0にシール剤を注入した場合に、 初めにシール部 3 0内に存在した空気が他方の シール剤注入口 4 8から排出されるため、 シール部 3 0において凹部 3 4の間に 位置する結晶化区画 3 2がより確実に密封される。
プレート 2 4の材料および形状は、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8と重ね 合わせることができるものであれば特に限定されず、 蛋白質結晶化用マイクロア レイ 1 8の形状を考慮して任意のものを用いることができる。 プレートの材料と しては、 ガラス、 樹脂、 金属などを例示することができる。 これらの中から任意 のものを選択し、単独で、または 2種類以上を組み合わせて用いることもできる。 なお、 結晶化区画 3 2における蛋白質の結晶化状態を観察するために、 蛋白質結 晶化用マイクロアレイ 1 8と重ねた際に各結晶化剤保持部 1 6と対応して重なる 部分が光透過性をもつことが好ましい。そのため、プレート 2 4の材料としては、 光透過性の材料、 例えば透明な樹脂、 ガラス等を用いることが好ましい。
プレート 2 4は、 結晶化区画 3 2に析出した結晶を回収する結晶回収機構をさ らに有することが好ましい。 このような結晶回収機構を用いて、 結晶化区画 3 2 に析出した結晶を回収して種結晶として用いる。 そして引き続いて結晶成長過程 を行うことによって X線構造解析に耐える結晶を迅速に得ることができる。 もち ろん、 析出した結晶がそのまま X線構造解析に耐える結晶であれば、 それを回収 して解析に使用する。
このような結晶回収機構としては、 えば、 シール部 3 0がプレート 2 4と独 立した部材からなり、 プレート 2 4とヒンジ機構で接続され、 所望に応じシール 部 3 0を外側面 1 0 4側へ開くことができる機構等が挙げられる。
結晶化区画 3 2の形状は、 蛋白質含有試料を充填可能であり、 結晶化剤保持部 1 6と接触した際に密閉されるものであれば、 特に限定されない。
結晶化区画 3 2の容量は、 対象の蛋白質について結晶化条件のスクリーニング を行うことを目的とする場合には、 結晶化条件のスクリーニングに要する蛋白質 量を低減するために、 0 . 5 μ 1未満であることが好ましい。 一方、 ここで析出 した結晶を引き続いて X線構造解析に供する、 または構造解析に供する結晶を作 製するための種結晶として用いることを目的とする場合には、 結晶化区画 3 2の 容量は 0 . 5 μ 1以上であることが好まし!/、。 この場合、 X線構造解析を行うこ とのできる 0 . 1 mm以上の大きな結晶が得られるためである 結晶化剤保持部 1 6と結晶化区画 3 2との面積の関係は、 結晶化剤保持部 1 6と結晶化区画 3 2 とが接触する面の面積が、 結晶化剤保持部 1 6に保持された結晶化剤が結晶化区 画 3 2に移動して、 該結晶化区画 3 2に充填された蛋白質含有試料と反応するこ とができる条件" Cあればよい。 結晶化剤保持部 1 6よりも結晶化区画 3 2の方が 大きくてもよい。 ただし、 結晶化区画 3 2は、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8を構成する基板 1 2に接触しないことが好ましい。
この例では、 さらに、 図 4に示すように、 結晶化区画 3 2の間に設けられた凹 部 3 4の全てにシール剤 3 5が充填される。
シール剤 3 5としては、 蛋白質含有試料と互いに溶解せず、 プレート 2 4、 パ ッキング 2 2、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8を構成する基板 1 2等の部材 を侵食しないものであればよい。 例えば、 パラフィンオイル、 シリコンオイル等 を用いることができる。 シール剤 3 5を用いなくても、 凹部 3 4を有することにより、 隣接する区画へ の蛋白質含有試料の侵入を防止することができる。 しかしシール剤 3 5を用いる と、 さらに確実に蛋白質含有試料どうしの混合および近接する結晶化区画 3 2へ の侵入を防止することができるとともに、 蛋白質含有試料の蒸発を防止すること ができる。
この例では、 さらに、 支持体 2 0に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8とプレート 2 4とを圧接する機構が示されている。 具体的には図 1に示すよ うに、 支持体 2 0を貫通する第一のネジ孔 4 0と、 第一のネジ孔 4 0に対応して プレート 2 4を貫通する第二のネジ孔 4 2とが設けられている。 これらの第一の ネジ孔 4 0、 第二のネジ孔 4 2に、 図 1に示すようにネジ 4 1が螺揷される。 こ のような機構を用いることにより、 結晶化区画 3 2を、 より安定して密閉状態に 保持することができる。
この例の蛋白質結晶化装置において、 結晶化区画 3 2における蛋白質の結晶化 をモニタリングする検出機構をさらに設けることができる。
前記検出機構としては、 例えば、 プレート 2 4の外側面 1 0 4に設置された顕 微鏡と、 顕微鏡に搭載された C C Dカメラからなる検出機構が挙げられる。 この ような検出機構において、 顕微鏡に搭載した C C Dカメラにより結晶の析出の様 子を撮影記録し、 記録された画像データを処理することによって、 結晶化の成否 を迅速に判断することができる。 したがって、 迅速に蛋白質結晶化条件を決定す ることができる。
ここで、 この例の蛋白質結晶化装置の好適な使用方法を例示する。
[蛋白質含有試料の充填]
この例では、 サンプル充填補助具を用いて、 結晶化区画 3 2に蛋白質含有試料 を充填することができる。
(結晶化区画）
本発明を使用する際に、 蛋白質の結晶化を目的とする場合は、 結晶化区画 3 2 の容量を 0 . 5 μ 1以上とすることが好ましい。 蛋白質結晶化条件のより迅速な スクリーニングを目的とする場合は、 結晶化区画 3 2の容量を 0 . 5 μ 1未満と することが好ましい。 (蛋白質含有試料）
本発明において、 蛋白質含有試料とは、 結晶化を行おうとする、 または結晶化 条件を特定しょうとする蛋白質 （以下、 対象の蛋白質と称する） を含む試料であ る。 蛋白質としては、 天然又は合成のペプチド、 ポリペプチド、 蛋白質および蛋 白質複合体が挙げられる。 これらの物質は、 天然もしくは合成材料から抽出 -単 離、 または遺伝子工学的手法もしくは化学合成手法等により生成した後、 通常の 精製法、 例えば溶媒抽出、 カラムクロマトグラフィー、 液体クロマトグラフィー などを組み合わせて用いることにより、 対象の蛋白質を精製しておくことが好ま しい。
蛋白質含有試料中の蛋白質濃度およぴ純度も蛋白質結晶化条件の一要因となる。 そのため、 数段階の濃度および純度の蛋白質含有試料を調製して蛋白質結晶化剤 と反応させてもよい。 例えば、 蛋白質濃度は、 1〜5 O m g /m 1の範囲内で数 段階に変更することが好ましい。 また、 蛋白質結晶化剤と反応させる蛋白質含有 試料の量は、 用いる結晶化区画 3 2の容量および数等に応じて適宜変更しうる。 なお、 蛋白質含有試料の粘度は、 該蛋白質含有試料を保持した結晶化区画 3 2を 下に向けてプレート 2 4を保持した際に結晶化区画 3 2から蛋白質含有試料が漏 出しなければ特に限定されない。
蛋白質含有試料は、 対象の蛋白質のほか、 さらに、 蛋白質の溶解を助ける蛋白 質可溶化剤、還元剤等の安定化剤等を含有してもよい。蛋白質可溶化剤としては、 例えば膜蛋白質を溶解させる界面活性剤などが挙げられる。 界面活性剤を用いる と、 蛋白質含有試料において、 例えば膜蛋白質などの水溶解性の低い蛋白質を良 好に分散させることができる。 従って、 この例の蛋白質結晶化装置を適用して効 率よく蛋白質の結晶化を行うことができる。
まず、 図 1に示すようなプレート 2 4を、 図 5に示すように反応面 1 0 2を上 にして静置する。 プレート 2 4に穿たれたサンプル充填捕助具位置決め孔 5 0お よびプレート位置決め孔 4 6に、 このサンプル充填捕助具位置決め孔 5 0および プレート位置決め孔 4 6と同一径の円柱形のガイドビン 5 2を 1本ずつ挿入して 固定する。
ついで、 この反応面 1 0 2の上に、 図 6に示すような、 プレート 2 4上の結晶 化区画 3 2に対応した配列の穿孔 5 6と、 該穿孔 5 6をプレート 2 4上で結晶ィ匕 区画 3 2に対応させる位置合わせ機構として 2つの位置合わせ孔 5 8とを有する 薄板状のサンプル充填捕助具 5 4を設置する。 このとき、 プレート 2 4のサンプ ル充填補助具位置決め孔 5 0およびプレート位置決め孔 4 6にそれぞれ固定され たガイドビン 5 2に、 サンプル充填補助具 5 4に穿たれた位置合わせ孔 5 8を合 わせて差し込む。そして、サンプル充填補助具 5 4をプレート 2 4上に設置する。 このことにより、 プレート 2 4の結晶化区画 3 2とサンプル充填補助具 5 4の穿 孔 5 6が対応するようにサンプル充填補助具 5 4が設置される。
その後、 プレート 2 4上に設置されたサンプル充填補助具 5 4の上に、 サンプ ル充填補助具 5 4のうち穿孔 5 6の配置された領域全体に行き渡る分量の蛋白質 含有試料を載せる。
さらに、 スパチュラ等を用いてサンプル充填補助具 5 4の表面を擦ることによ り、 穿孔 5 6に対応した結晶化区画 3 2に蛋白質含有試料を充填する。
その後、 ガイドビン 5 2をプレート 2 4の反応面 1 0 2側から外側面 1 0 4側 へ押し出し、 サンプル充填補助具 5 4をプレート 2 4上から取り除く。 このこと により、 全ての結晶化区画 3 2に蛋白質含有試料が充填される。
上記説明したように、 サンプル充填補助具 5 4をプレート 2 4の反応面 1 0 2 上に設置し、 その上から蛋白質含有試料を添加することによって、 蛋白質含有試 料を正確に結晶化区画 3 2に充填することができる。
なお、 サンプル充填補助具 5 4は、 成形の容易さ、 強度、 耐塩性などの観点か ら、 ステンレス製であることが好ましい。 また、 サンプル充填補助具 5 4には、 蛋白質含有試料を結晶化区画 3 2に充填した後にサンプル充填補助具 5 4を容易 に取り外せるように、 ピンセット等により取り扱う部位が設けられていることが 好ましい。 例えば一端が上側に折り曲げられて折曲部 5 9が設けられていること が好ましい。
ここでは、 ガイドビン 5 2をサンプル充填補助具位置決め孔 5 0およぴプレー ト位置決め孔 4 6にそれぞれ固定した。 しかしプレート 2 4において、 サンプル 充填補助具位置決め孔 5 0が、 プレート位置決め孔 4 6と独立して複数形成され ていてもよい。 蛋白質含有試料を結晶化区画 3 2に充填する方法としては、 蛋白質含有試科を 全ての結晶化区画 3 2に同一の分量で充填することができ、 結晶化区画 3 2以外 の構成要素への付着を抑えられる方法であればよレ、。 例えば、 サンプル充填捕助 具 5 4を用いずに、 ピぺッター等を用いて結晶化区画 3 2の各々に蛋白質含有試 料を充填することができる。 また、 サンプル添加用の自動機器を用いることもで さる。
ただし、 蛋白質含有試料の充填を迅速かつ経済的に行うためには、 上記のサン プル充填補助具 5 4を用いる方法が好ましい。
なお、 蛋白質含有試料の充填においてピぺッターを用いる場合、 ピぺッターに 吸引して保持させた蛋白質含有試料を吐出する機構を用いずに、 ピぺッターの先 端部に付着した微量の液滴を結晶化区画 3 2付近に接触させることが好ましい。
[蛋白質結晶化装置の組み立て]
図 1に示すように、 支持体 2 0上のマーキング 2 8に合わせて、 パッキング 2 2を設置する。 そして蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8を、 該パッキング 2 2 の中空部 2 3に格納されるように支持体 2 0上に設置する。
蛋白質含有試料が結晶化区画 3 2に充填されたプレート 2 4を、 反応面 1 0 2 を下にして保持するそして支持体 2 0に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレ ィ 1 8の上に積層する。
このとき、 支持体 2 0上に設けられたプレート位置決め部材 4 4が、 プレート 2 4に穿たれたプレート位置決め孔 4 6を貫通するようにする。
なお、 この例では支持体 2 0に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8 の上に、 プレート 2 4が反応面 1 0 2を下にして積層される。 し力 し、 結晶化区 画 3 2に蛋白質含有試料が充填されたプレート 2 4を、 反応面 1 0 2を上にして 静置し、 該プレート 2 4の上に、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8を支持した 支持体 2 0を、 マイクロアレイ支持面 1 0 0を下にして積層してもよい。 プレー ト 2 4の外側面 1 0 4を上にして設置されて 、ると、 シール剤注入口 4 8からの シール剤の注入、 あるいは結晶化区画 3 2に析出した結晶の観察を行いやすいた め好ましい。
プレート 2 4を支持体 2 0に押し付けて保持し、 保持したまま第一のネジ孔 4 0、 第二のネジ孔 4 2にネジ 4 1を螺揷して、 プレート 2 4と、 支持体 2 0に支 持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8とを圧接する。
その後、 顕微鏡を用いて、 蛋白質含有試料の充填状態を確認する。
蛋白質含有試料が各々の結晶化区画 3 2に充填されていることを確認した後、 図 5、 8に示すようにプレート 2 4に穿たれたシール剤注入口 4 8から、 ピぺッ ト等を用いてシール剤をシール部 3 0および凹部 3 4に充填する。 このことによ り、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8のうち結晶化剤保持部 1 6以外の位置に 漏出した蛋白質含有試料を、 シール剤で置き換えることができる。 そして、 蛋白 質含有試料が隣接する結晶化区画 3 2間で移動することによるコンタミネーショ ンおよび条件変化をさらに確実に防止する。 更には蛋白質含有試料が蒸発するこ とを防止することができる。 なお、 シール剤の注入量は、 シール部 3 0の全域に おいて凹部 3 4にシール剤が行き渡り、 かつ、 図 5、 8に示すような一方のシー ル剤注入口 4 8からシール剤を注入した際に、 他方のシール剤注入口 4 8からシ ール剤が漏出しない最大量であることが好ましい。
[蛋白質の結晶化条件のスクリーニング]
組み立てられた蛋白質結晶化装置を用いて、 蛋白質の結晶化条件のスクリー二 ングを行レ、、目的蛋白質における最適な結晶化条件を求めることができる。また、 析出した結晶を用いて構造解析に適した結晶を作製することもできる。
蛋白質結晶化装置において蛋白質結晶化剤と蛋白質含有試料とを反応させた後、 蛋白質結晶化装置を、 蛋白質が析出するのに十分な時間にわたって、 ある温度条 件下にて、 密閉状態または大気中に静置する。
蛋白質が析出するのに十分な時間とは、 特定の蛋白質、 濃度、 結晶化条件など により異なるが、 約 1時間〜 1 0日であり、 およそ 3 0日以上経過しても結晶が 析出しない場合には、 その結晶化条件は適切ではないものとみなす。 また、 温度 条件は、 蛋白質結晶化条件の一要因であるため、 温度条件を変更して結晶化を行 つてもよい。 温度条件は、 例えば、 4 °C、 1 5 °C、 1 8 °C、 2 2 °C等のように、 複数の段階に設定することが好ましレ、。
蛋白質が析出するのに十分な時間が経過した後、 蛋白質の結晶析出の状況を観 察する。 このとき、 プレート 2 4の外側面 1 0 4側から、 例えば光学顕微鏡等に て観察することが好ましい。
このようにして、 対象の蛋白質について最適な結晶化条件を決定することがで さる。
[構造解析用の結晶の作製]
蛋白質の結晶化を目的として、 結晶化区画 3 2の容量を 0 . 5 μ 1以上とした 場合は、全ての結晶化区画 3 2のうち、結晶の析出した結晶化区画 3 2において、 引き続いて結晶を成長させる、 あるいは析出した結晶を結晶化区画 3 2から回収 して種結晶として用い、 公知の蛋白質結晶化方法により、 種結晶を回収した結晶 化区画 3 2と同様の結晶化条件において、 構造解析用の結晶を作製することがで きる。 公知の蛋白質結晶化方法としては、 例えば、 ハンギングドロップ法、 シッ ティングドロップ法、 透析法、 バッチ法などが挙げられる。
蛋白質結晶化条件のより迅速なスクリーニングを目的として、 結晶化区画 3 2 の容量を 0 . 5 μ 1未満とした場合は、 求めた最適の結晶化条件において目的蛋 白質の結晶化を行い、 構造解析用の結晶を得ることができる。 このとき、 構造解 析用の結晶を得る方法としては、 公知の方法、 例えば蒸気拡散法、 ハンギングド 口ップ法などを用いることができる。
得られた構造解析用の結晶を回収し、 回収した結晶を公知の方法で X線構造解 析に供することにより、 対象の蛋白質の立体構造を決定することができる。 この例の蛋白質結晶化装置においては、 蛋白質含有試料を結晶化区画 3 2に充 填した後に、 プレート 2 4と蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8が積層されるこ とによって、 結晶化剤保持部 1 6と蛋白質含有試料を充填した結晶化区画 3 2と が対応して重なり合う。 このことによって、 結晶化剤保持部 1 6に保持された結 晶化剤が、 結晶化区画 3 2内へ移動して蛋白質と反応する。 各々の結晶化剤保持 部 1 6が異なる結晶化条件に設定されている場合、 対象の蛋白質が結晶化するた めに適当な結晶化条件に設定された結晶化区画 3 2内に結晶が析出する。
以上説明したように、 この例の蛋白質結晶化装置において、 蛋白質含有試料は 結晶化区画 3 2内に保持されて結晶化剤保持部 1 6により密閉される。 また各々 の結晶化区画 3 2が凹部 3 4によって隔離されている。 従って、 蛋白質含有試料 の結晶化区画 3 2間での移動及び Z又は蛋白質結晶ィヒ剤の結晶ィヒ剤保持部 1 6間 での混合を防止することができる。 更には、 蛋白質含有試料からの溶液の蒸発を 抑制し、 n 1レベルの微少量の蛋白質含有試料をも安定して保持することができ る。 したがって、高い信頼性をもって蛋白質の結晶化を行うことができる。また、 結晶化条件の好不適を信頼性よく判定することができる。
さらに、 凹部 3 4にシール剤が充填されると、 さらに効率よく蛋白質含有試料 どうしの混合おょぴ近接する結晶化区画 3 2への侵入を防止することができる。 また、 蛋白質含有試料の蒸発を防止することができる。 従って、 蛋白質含有試料 が微量であっても結晶化条件を良好に制御することができる。
また、 蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8を支持した支持体 2 0と、 プレート 2 4とを圧接すると、 結晶化区画 3 2を安定して密閉することができる。 そのた め、 さらに高レ、信頼性をもつて結晶化を行うことができる。
結晶化区画 3 2の容量を適宜選択することにより、 蛋白質結晶化条件のスクリ 一ユングおよび構造解析用の結晶の作製のいずれをも、 迅速かつ正確に行うこと ができる。
さらにサンプル充填補助具を用いると、 簡便かつ迅速に、 蛋白質の結晶化条件 のスクリーニングを行うことができる。
本発明の蛋白質結晶化装置は、 例えば、 医薬分野等における研究、 開発におい て、 蛋白質の結晶化条件のスクリーニングおよび蛋白質の構造解析用結晶の作製 のいずれにも、 好適に用いることができる。
本発明の蛋白質結晶化用ゲルは、 蛋白質結晶化剤、 不飽和単量体を含む溶液を ゲル化することにより、 該蛋白質結晶化剤がゲル中に均一に分散、 溶解されたこ とを特徴とするものである。
蛋白質結晶化剤としては、 蛋白質溶液の蛋白質の溶解度を下げることができる ものであれば特に限定はない。 例えば、 塩類として、 硫酸アンモニゥム、 塩ィ匕ナ トリウム、 リン酸ナトリウム、 リン酸カリウム、 リチウムクロライド、 マロン酸 ナトリウム、 クェン酸ナトリウム、 硫酸マグネシウム、 硫酸リチウム、 硝酸ナト リウム、 硫酸カドミウム、 硫酸ナトリウム等が挙げられる。 有機溶媒としては 2 一メチル一2 , 4 _ペンタンジオール (以下、 M P Dとする）、 エタノール、 イソ プロパノール、 ジォキサン、 メタノール、 t e r t—ブタノ一ノレ、 n—プロパノ ール等が挙げられる。水溶性高分子化合物としては、ポリエチレンダリコール (以 下、 P E Gとする）、 ポリエチレングリコールモノアルキルエーテル、 ポリエチレ ンィミン等が挙げられる。
これらの沈殿剤は、 単独もしくは 2種類以上の組み合わせで使用することがで きる。 これらの中で、 特に、 硫酸アンモニゥム、 塩化ナトリウム、 リン酸力リウ ムナトリウム、 リチウムクロライド、 マロン酸ナトリウム、 MP D、 P E Gが好 適である。
市販品として、 Emerald BioStructures 社製 「WIZARD II」、 Hampton Research 社製 「Crystal screen」、 「Grid Screen」 等を用いることができる。 沈殿剤の使用 濃度は、 塩類では 0. 1〜5. Omol/Lが好ましく、 有機溶媒では 1〜80体積％が好ま しく、 水溶性高分子化合物では 1〜 5 0重量％が好ましい。
蛋白質の結晶化は特定の p H領域で行うことが好ましく、 p Hを維持するため に緩衝液を使用しても良い。 使用する緩衝液には特に限定はないが、 例えば、 ク ェン酸、 2一 (N—モリホリノ） エタンスルホン酸、 N— 2—ヒ ドロキシェチル ピぺラジン一N—エタンスルホン酸、 トリス（ヒ ドロキシメチル）ァミノメタン、 N, N—ビス (ヒ ドロキシェチル) グリシン等を含有するものが挙げられ、 単独 もしくは 2種類以上の混合物を、 必要に応じて酸あるいはアル力リなどで中和し 所定の pHに調整する。 pHは、 3. 0〜10. 0の範囲が好ましく、 4. 0〜9. 0の範囲が より好ましい。
本発明において、ゲル化剤として不飽和単量体が使用される。不飽和単量体は、 水性媒体中で重合することによりゲル形成が可能なものであれば特に限定はない が、 (メタ） アクリルアミド系モノマーや （メタ） ァクリル系モノマーであること が好ましい。
(メタ) アクリルアミ ド系モノマーとしては、 (メタ） アクリルアミ ド、 N, N 一ジメチルァクリルアミ ド、 N, N—ジェチルアクリルアミ ド等の N， N—ジァ ルキルァミノ (メタ)アクリルアミ ド、（メタ）アクリルアミ ドメタンスルホン酸、
(メタ) アクリルアミ ドエタンスルホン酸、 2— (メタ） アクリルアミ ド一 2— メチルプロパンスルホン酸等の (メタ） ァクリルアミ ドアルキルスルホン酸、 ジ メチルァミノプロピル (メタ） アクリルアミ ド、 ジェチルァミノプロピル (メタ） アクリルアミ ド、 ジメチルアミノエチル （メタ） アクリルアミ ド等のジアルキル アミノアルキル （メタ） アクリルアミ ド、 ジメチルァミノプロピル (メタ） ァク リルアミ ドメチルクロライド塩、 ジェチルァミノプロピル (メタ) ァクリルアミ ドメチルェチルク口ライド塩、 ジメチルアミノエチル （メタ） ァクリルアミ ドメ チルク口ライド塩等のジアルキルァミノ (メタ） アクリルアミ ド 4級アンモニゥ ム塩が好適に用いられる。
また、 （メタ） ァクリル系モノマーとしては、 2—ヒドロキシェチル （メタ) ァ タリレート、 4—ヒ ドロキシブチル （メタ) アタリレート、 6—ヒドロキシへキ シル （メタ） アタリレート、 ジエチレングリコールモノ （メタ） アタリレート、 トリエチレングリコーノレモノ （メタ） アタリレート、 ポリエチレングリコールモ ノ (メタ) アタリレート等の水酸基含有 (メタ) アタリレート、 ジメチルァミノ ェチル （メタ） アタリレート、 ジェチルアミノエチル （メタ） アタリレート等の ジアルキルァミノアルキル (メタ） アタリレート、 ジメチルアミノエチル （メタ） アタリレートメチルクロライド塩、 ジェチルアミノエチル （メタ） アタリレート のェチルク口ライド塩等のジアルキルァミノアルキル (メタ） アタリレートの 4 級アンモニゥム塩が好適に用いられる。
モノマー濃度は、蛋白質結晶化剤溶液 1 0 0質量％に対し、 0 . 1〜 5 0質量％ が好ましく、 ：！〜 1 0質量％がより好ましい。
また、 本発明で必要に応じて使用される上記のモノマーと共重合可能な架橋性 モノマーとしては、 2官能以上のラジカル重合性基を有する単量体ならば特に限 定はないが、 例えば N, N， ーメチレンビス （メタ） アクリルアミ ド、 エチレン ダリコールジ (メタ） アタリレート、 ジエチレングリコールジ （メタ） アタリレ ート、 トリエチレングリコールジ （メタ） アタリレート、 ポリエチレングリコー ルジ（メタ） アタリレート、 トリメチロールプロパントリ (メタ） ァクリレート、 トリメチロールプロパンエチレンオキサイド変性トリ （メタ） アタリレート等が 挙げられるが、 特に N, N ' —メチレンビス （メタ） アクリルアミ ド、 エチレン ダリコールジ (メタ） ァクリレート、 ポリエチレンダリコールジ (メタ） ァクリ レートが好適である。 架橋性モノマーの添加量は、 （A) 群あるいは （B ) 群のモ ノマーに対し、 0 . 0 1 〜 1 0質量部である。 好ましくは 0 . 1〜 5質量部であ る。
本発明の蛋白質結晶化剤は、 特定の沈殿剤と特定の不飽和単量体とを組み合わ せることにより、 透明ゲルを得ることができる。 ゲルが透明であると、 生成した 蛋白質結晶の観察が極めて容易となる。 そのため、 光学的検出系による自動化も より容易となる。
透明ゲルが得られる不飽和単量体及び蛋白質結晶ィ匕剤の組み合わせとしては、 ( 1 ) アクリルアミ ド、 2—アクリルアミ ド一 2—メチルプロパンスルホン酸、 メタクリルジメチルアミノエチルメチルクロライド塩の群から選択される少なく とも 1種のモノマーと塩化ナトリウム、 （2 ) ジメチルアクリルアミ ドと M P D、
( 3 ) 2—ァクリルアミ ドー 2—メチルプロパンスルホン酸リ とリン酸 Na/K、
( 4 )メタクリルジメチルアミノエチルメチルクロライド塩と硫酸アンモニゥム、
( 5 ) アクリルアミ ドとマロン酸ナトリゥム、 ( 6 ) ポリオキシエチレンモノアク リレートと PEG6k、 である。
本発明の蛋白質結晶化剤は、 少なくとも沈殿剤、 緩衝液、 不飽和単量体を含有 してなる水溶液を熱重合させて調製する。 あるいは熱および/または光ラジカル 重合開始剤存在下に重合させることによりゲルィヒさせ、 沈殿剤をゲル中に均一に 保持させることにより調製することができる。 ラジカル重合開始剤存在下に重合 を行うのが好適である。 水溶液中において好適に使用されるラジカル重合開始剤 としては、 例えば、 t e r t—プチルハイドロパーォキサイド、 過酸化水素、 過 硫酸アンモ-ゥム、 過硫酸カリウム等の過酸化物、 2， 2 ' —ァゾビス （2—ァ ミジノプロパン） 2塩酸塩、 2 , 2， ーァゾビス （2—アミジノブタン） 2塩酸 塩、 2 , 2， 一ァゾビス [ 2 - ( 2—イミダゾリン— 2—ィル) プロパン] 2塩 酸塩等のァゾ系重合開始剤が挙げられる。 これらのラジカル重合開始剤は、 単独 もしくは 2種類以上の混合物として使用することができる。 また、 前記の過酸化 物に第三級ァミン、 亜硫酸塩、 第 1鉄塩等の還元剤を組み合わせたレドックス系 重合開始剤、 さらには、 レドックス系重合開始剤とァゾ系重合開始剤を組み合わ せた併用重合開始剤を使用してもよい。
また、 特定波長の光を与える光源下で、 光ラジカル重合開始剤を用いて重合を 行うこともできる。 その際、 使用される光ラジカル重合開始剤は、 特定波長の範 囲内の光照射により分解し、 ラジカルを発生するものであれば特に限定はない。 好適に利用できるものとしては、 例えば、 ァシルホスフィンォキサイド、 ベンゾ イン、 ベンゾィンアルキルエーテル、 ベンジル、 ベンゾフエノン、 アントラキノ ン等の通常光重合に使用される開始剤、 その他に、 2， 2， ーァゾビス （2—メ チルプロピオンアミジン） 塩酸塩、 4 , 4 ' —ァゾビス （4ーシァノ吉草酸） ナ トリ ゥム塩、 2， 2， —ァゾビス [ 2—メチル一N— ( 2—ヒ ドロキシェチル) プロピオンアミ ド] 等のァゾ系重合開始剤が挙げられる。 これらのうちから、 利 用する光波長に応じて、任意のものを 1種類以上を選択し使用することができる。 また、 前記の特定波長とは、 反応液中に含有される単量体自身による光吸収、 ラ ジカル生成に利用される光量子エネルギーの二つの点を考慮すると、 波長が 2 0 0〜6 5 0 n mの領域の光を用いることが望ましい。 波長が 2 0 0〜6 5 0 n m の領域の光照射に利用可能な光源の代表例としては、 高圧水銀ランプ、 低圧水銀 ランプ、 メタルハライドランプ、 蛍光ケミカルランプ、 蛍光青色ランプ等が挙げ られる。
実施例
(中空繊維配列体の作製）
結晶化剤保持部を支持する構成要素として、 中空繊維配列体を作製した。
直径 0 . 3 2 mmの孔を有し、孔の中心間距離が 0 . 4 2 mm多孔版であって、 縦横各 1 0列に合計 1 0 0個配列された厚さ 0 . 1 mmの多孔板 2枚を重ね、 こ れらの多孔版の各孔に、 ポリエチレン製中空繊維 （三菱レイヨン社製、 外径約 5 0 0 μ πι、 内径約 3 0 0 μ πι、 長さ約 1 0 0 c m) 1 0 0本を通過させた。 つい で、 中空繊維を張った状態で、 中空繊維の一方の端部から 1 0 c mの位置と 4 0 c mの位置の 2箇所を固定し、 2枚の多孔板の間隔を 3 0 c mとした。
次に 2枚の多孔板間の空間の 3方を、 シリコン製の板状物で囲んだ。 開放され た一方から、 樹脂原料として、 ポリウレタン樹脂接着剤からなる樹脂と、 樹脂原 料の総質量に対し 2 . 5質量％のカーボンブラックとの混合物を、 2枚の多孔板 の間に流し込んだ。引き続き、室温で 1週間静置し、樹脂を硬化させた。その後、 多孔板及び多孔板間に設置した板状物を取り除き、 中空繊維配列体を得た。 (中空繊維配列体への高分子ゲルの導入固定化）
以下の組成からなる混合溶液を調製した。
アクリルアミド： 3 . 7質量部メチレンビスアクリルアミド： 0 . 3質量部 2， 2， ーァゾビス （2—アミジノプロパン） 二塩酸塩： 0 . 1質量部
上記の混合溶液と、 上記で得られた中空繊維配列体とをデシケータ中に入れ、 各中空繊維の自由端部の内、 長い方の端部をこの混合液中に浸漬した状態で、 デ シケータ内を減圧状態にすることにより、 中空繊維の中空部に前記混合液を導入 した。 ついで、 この中空繊維配列体を、 内部が水蒸気で飽和された密閉ガラス容 器に移し、 8 0 °Cで 4時間かけて重合反応を行った。 このことにより、 アクリル ァミドゲルが中空繊維の中空部に固定された中空繊維配列体を得た。
(ゲル充填中空繊維配列体薄片の作製）
上記で得られたアクリルアミドゲル含有中空繊維配列体を、 中空繊維の長手方 向に直交する方向でミクロトームを用いて約 2 mmの厚さに切り出すことにより、 中空繊維の中空部にゲルが充填された縦横各々 1 0個、 計 1 0 0個の中空繊維が 規則的に正方に配列された配列体薄片を得た。 図 2は、 上記工程によって得られ たゲル含有中空繊維配列体薄片を示す。 図 2に示すように、 中空繊維 1 2の中空 部 1 4には上記で作製したアクリルアミドゲルが充填されている。
(蛋白質結晶化用マイクロアレイの作製）
上記で作製したゲル含有中空繊維配列体薄片において、 中空繊維 1 2の中空部 1 4に充填されたアクリルアミドゲルに、 下記の A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 Jの水溶液からなる蛋白質結晶ィ匕剤 1 1を各中空部に保持されたゲル に添加することにより、 アクリルアミドゲルに蛋白質結晶化剤を保持させ、 蛋白 質結晶化用マイクロアレイ 1 8を作製した。
A ： 2 . O m o l / L 塩ィ匕ナトリウム水溶液 B ： 0 . 5 m o 1 / L 塩化ナト リゥム水溶液 C ： 1 0体積％ ポリエチレンダリコール （分子量 4 0 0 ) 水溶液 D： 2 0体積0 /0 ポリエチレングリコール（分子量 4 0 0 )水溶液 E： 1 0体積0 /0 ポリエチレンダリコール （分子量 6 0 0 0 ) 水溶液 F ： 2 0体積0 /0 ポリエチレ ングリコール （分子量 6 0 0 0 ) 水溶液 G ： 2 0体積0 /0 2—メチル— 2， 4一 ペンタンジオール水溶液 H ： 2 0体積0 /0 2ーメチルー 2 , 4一ペンタンジォ一 ル水溶液 I ： 0 . 5 m o 1 / L 硫酸アンモニゥム水溶液 J ： 1 . 5 m o 1 / L 硫酸アンモニゥム水溶液
以下、 上記 A〜 Jの蛋白質結晶化剤を保持した結晶化剤保持部 1 6を、 それぞ れスポット A〜 Jと称する。
蛋白質結晶化条件のスクリーニング
図 1に示す蛋白質結晶化装置を用い、 リゾチーム （シグマアルドリッチ社製） の結晶化条件のスクリーニングを行った。 蛋白質結晶化用マイクロアレイとして 上記で作製した蛋白質結晶化用マイクロアレイ 1 8を用い、 支持体 2 0、 プレー ト 2 4の材料としてァクリル樹脂を用いた。
(蛋白質含有試料の添加）
図 6に示すサンプル充填補助具 5 4を用いて、 結晶化区画 3 2に蛋白質含有試 料を充填した。 サンプル充填補助具 5 4は、 上記で得た蛋白質結晶化用マイクロ アレイ 1 8の結晶化剤保持部 1 6に対応した配列の穿孔 5 6を有するものを用い た。
結晶化区画 3 2は、 直径： 0 . 7 mm、 高さ ： 0 . 1 5 mmの一端が閉じた円 筒状であり、 結晶化区画 3 2の容量は 1 0 5 n 1であった。
蛋白質含有試料として、リゾチーム含有水溶液（8 O m g /m 1 )を使用した。 まず、サンプル充填補助具 5 4を、図 6に示すようにプレート 2 4上に設置し、 その上に、 2 0 ^ 1オートピペットで蛋白質含有試料 1 . 5〜2 /^ 1を穿孔5 6 の全ての上に行き渡るように添加した。 ついで、 サンプル充填補助具 5 4の上か らスパチュラにて、 蛋白質含有試料をプレート 2 4上に押し付けることにより、 蛋白質含有試料をプレート 2 4上の全ての結晶化区画 3 2に充填した。
(蛋白質結晶化装置の組み立て、 蛋白質結晶化条件のスクリーニング） ついで、 結晶化区画 3 2に蛋白質含有試料の充填されたプレート 2 4を、 反応 面 1 0 2を下にして保持し、 支持体 2 0に支持された蛋白質結晶化用マイクロア レイ 1 8の上に積層した。 結晶化区画 3 2に蛋白質含有試料が充填されているこ とを確認した後、 プレート 2 4に穿たれた一方のシール剤注入口 4 8に、 プレー ト 2 4の外側面 1 0 4側から、 ピペットを用いて、 シール剤としてパラフィンォ ィル （以下、 オイルという） を注入した。 オイルの注入量は、 シール部 3 0の全 域にオイルがいきわたり、 他方のシール剤注入口 48からオイルがあふれる直前 までとした。
その後、 蛋白質結晶化装置を 20°Cで 3時間静置した。 引き続き、 光学顕微鏡 にて結晶化区画 32内を観察した結果、 蛋白質結晶化剤としてポリエチレンダリ コール水溶液を保持させたスポット Bではリゾチームの結晶は認められず、 2. Omo 1 /L塩化ナトリゥム水溶液を保持させたスポット Aでは、 X線構造解析 に最も適した柱状結晶が認められた。
(構造解析用の結晶の作製）
さらに、 上記の結果を踏まえて、 2. Omo 1/L塩化ナトリウム水溶液を蛋 白質結晶化剤として用い、 リゾチーム含有試料溶液から、 ハンギングドロップ法 によってリゾチーム結晶を作製した。 このとき、 得られたリゾチーム結晶の大き さは 0. 3 X 0. 3 X 0. 5 mmであった。
以上の結果より、 リゾチームの結晶化条件のうち、 蛋白質結晶化剤の種類およ ぴ濃度を検討した結果、 2. Omo 1 /L塩化ナトリゥム水溶液が最適の結晶化 条件であることが明らかになり、 かつ、 明らかになった最適の結晶化条件を用い て、 X線構造解析に適した結晶を得ることができた。
すなわち、 迅速かつ経済的に、 高い信頼性をもって、 微量の蛋白質含有試料に て蛋白質結晶化条件のスクリーニングを実施することができた。
本発明の蛋白質結晶化用ゲルにおける緩衝液は、 以下のものを使用し、 常法に 従って調製した。
0. 1M—クェン酸緩衝液（pH4. 0)、 0. 1M_クェン酸緩衝液（pH5. 0)、 0. 1M-ME S (pH6. 0)、 0. 1M—HEPES (p H 7. 0) 0. 1M-T r i s (pH8. 0)、 0. 1M— B i c i n e (pH9. 0) く実施例 1〉 沈殿剤である塩化ナトリウム 0. 48 gを 1 Om 1メスフラスコ に秤量し、 0. 1M—クェン酸緩衝液 (pH4. 0) で定容して 1. 2M— Na C l水溶液 （これを a液とする） を調製した。 また、 50%アクリルアミド 水溶液 (三菱レイョン製) 90 gに N, N 'ーメチレンビスアクリルアミ ド (以 下、 MBAAm と略す） 5 g、 脱イオン水 5 gを加えて溶解し、 50%モノマー溶液 (これを b液とする） を調製した。 更に、 水溶性重合開始剤である 2, 2' ーァ ゾビス [2— （2—イミダゾリン一 2 _ィル） プロパン] 二塩酸塩 （和光純薬ェ 業製、 VA—044) の 10%水溶液 （これを c液とする） を調製した。 2ml のサンプルチューブに、 a液を 840 μ 1、 b液を 160 μ 1注入して混合し、 蛋白質結晶化剤水溶液 （1. 0Μ— Na C l、 pH4. 0、 モノマー濃度 8 %) を調製し、 更に c液を 10 μ 1添加してよく混合した後、 55 °Cの温浴で 3時間 重合し、 透明なハイドロゲルを得た。
前記の手順でハイドロゲルを形成したサンプルチューブに、 40 m g /m 1の リゾチーム水溶液 1 m 1を加え、 20 で 24時間ィンキュベートしたところ、 リゾチーム水溶液中にリゾチーム結晶が析出していた。 尚、 結晶生成は肉眼およ ぴ実体顕微鏡で確認した。
く実施例 2 > 実施例 1において、 a液の濃度 2. 4Mに変更した以外は同様の 手順で、 結晶化剤水溶液 （2. 0M_Na C l、 pH4. 0、 モノマー濃度 8 %) を調製し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリ ゾチーム結晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
く実施例 3 > 実施例 1において、 a液の濃度 3. 6 Mに変更した以外は同様の 手順で、 結晶化剤水溶液 （3. 0M— Na C l、 pH4. 0、 モノマー濃度 8 %) を調製し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリ ゾチーム結晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
く実施例 4> 実施例 1において、 a液の濃度 4. 8Mに変更した以外は同様の 手順で、 結晶化剤水溶液 （4. 0M— Na C l、 pH4. 0、 モノマー漉度 8%) を調製し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリ ゾチーム結晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
く実施例 5〜8> 実施例:！〜 4において、 緩衝液を 0. 1M—クェン酸緩衝液 (pH5. 0) に変更した以外は同様の手順で、 結晶化剤水溶液を調製し、 更に 同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリゾチーム結晶の 生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
<実施例 9〜 12 > 実施例 1〜 4において、 緩衝液を 0. 1 M— ME S緩衝液 (pH6. 0) に変更した以外は同様の手順で、 結晶化剤水溶液を調製し、 更に 同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリゾチーム結晶の 生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
く実施例 1 3〜 1 6〉 実施例：！〜 4において、 緩衝液を 0. 1 M—HE P E S 緩衝液（pH7. 0)に変更した以外は同様の手順で、結晶化剤水溶液を調製し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリゾチーム結 晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
く実施例 1 7〜 20 > 実施例 1〜 4において、 緩衝液を 0. 1 M— T r i s緩 衝液 （pH8. 0) に変更した以外は同様の手順で、 結晶化剤水溶液を調製し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリゾチーム結 晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
<実施例 2 1〜 24 > 実施例 1〜 4において、 緩衝液を 0. 1 M— B i c i n e緩衝液 (pH9. 0) に変更した以外は同様の手順で、 結晶化剤水溶液を調製 し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリゾチ一 ム結晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
<実施例 25 > 沈殿剤であるポリエチレングリコール （和光純薬工業製、 P E G 6 000、 重量平均分子量： 6000) 0. 55 gを 1 0m lメスフラスコに 秤量し、 0. 1M—クェン酸緩衝液 (pH4. 0) で定容して 5. 5%— PEG 水溶液 （これを d液とする） を調製した。 また、 ポリエチレングリコールモノア クリレート （日本油脂製プレンマ一 AE 90) 9 5 gに、 ポリエチレングリコー ルジアタリレート （新中村化学製 NKESTERA— 200) を溶解したモノマ 一溶液（これを e液とする） を調製した。更に、水溶性重合開始剤である 2， 2' ーァゾビス [2— (2—イミダゾリン _ 2—ィル） プロパン] 二塩酸塩 （和光純 薬工業製、 VA-044) の 1 0%水溶液 （これを c液とする） を調製した。 2 m 1のサンプルチューブに、 a液を 920 μ 1、 b液を 80 μ 1を注入して混合 し、 蛋白質結晶化剤水溶液 （5%—PEG、 pH4. 0、 モノマー濃度 8%) を 調製し、 更に c液を 1 0 μ 1添カ卩してよく混合した後、 55 °Cの温浴で 3時間重 合し、 透明なハイド口ゲルを得た。 以下、 実施例 1と同様の方法でリゾチーム結 晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
く実施例 26 > 実施例 25において、 d液の濃度を 1 1 %に変更した以外は同 様の手順で、 結晶化剤水溶液 （1 0%—PEG、 pH4. 0、 モノマー濃度 8%) を調製し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリ ゾチーム結晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
く実施例 27 > 実施例 25において、 d液の濃度を 22 %に変更した以外は同 様の手順で、結晶化剤水溶液 （20%— PEG、 pH4. 0、 モノマー濃度 8%) を調製し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリ ゾチーム結晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
<実施例 28 > 実施例 25において、 d液の濃度を 33 %に変更した以外は同 様の手順で、結晶化剤水溶液 （30%— PEG、 pH4. 0、 モノマー濃度 8 %) を調製し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリ ゾチーム結晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
<実施例 29〜32> 実施例 25〜28において、 緩衝液を 0. 1M—クェン 酸緩衝液 （pH5. 0) に変更した以外は同様の手順で、 結晶化剤水溶液を調製 し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリ'ゾチー ム結晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
く実施例 33〜 36 > 実施例 25〜 28において、 緩衝液を 0. 1 M—ME S 緩衝液（ p H 6. 0 )に変更した以外は同様の手順で、結晶化剤水溶液を調製し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリゾチーム結 晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
く実施例 37〜40> 実施例 25〜28において、 緩衝液を 0. 1M—HEP ES緩衝液 (pH7. 0) に変更した以外は同様の手順で、 結晶化剤水溶液を調 製し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリゾチ ーム結晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
く実施例 41〜44> 実施例 25〜 28において、 緩衝液を 0. 1M— Tr i s緩衝液 (pH8. 0) に変更した以外は同様の手順で、 結晶化剤水溶液を調製 し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリゾチ一 ム結晶の生成を確認した。 結果を表一 1に示す。
く実施例 45〜 48 > 実施例 25〜 28において、 緩衝液を 0. 1 M— B i c i n e緩衝液 (pH9. 0) に変更した以外は同様の手順で、 結晶化剤水溶液を 調製し、 更に同様の手順で透明なハイド口ゲルを得た。 また、 同様の方法でリゾ チーム結晶の生成を確認した。 結果を表 1に示す。
Figure imgf000032_0001
く実施例 49 > 沈殿剤である塩ィ匕ナトリウム 0. 48 gを 1 0m l コに秤量し、 0. 1M—クェン酸緩衝液 （pH4. 0) で定容して 1. 2M- Na C l水溶液 （これを a液とする） を調製した。
また、 2 _アクリルアミ ドー 2—メチルプロパンスルホン酸 47. 5 gに N N '—メチレンビスアクリルアミド （以下、 MBAAm と略す） 2. 5 g、 脱イオン 水 50 gを加えて溶解し、 50%モノマー溶液（これを b液とする）を調製した。 更に、 水溶性重合開始剤である 2， 2' —ァゾビス [2— （2—イミダゾリン一 2—ィル） プロパン] 二塩酸塩 （和光純薬工業製、 V A— 044) の 10%水溶 液 （これを c液とする） を調製した。 2 m 1のサンプルチューブに、 a液を 84 0 μ 1、 b液を 160 μ 1注入して混合し、 蛋白質結晶化剤水溶液 （ 1. 0Μ_ Na C l、 pH4. 0、 モノマー濃度 8%) を調製し、 更に c液を Ι Ομ Ι添加 してよく混合した後、 55 °Cの温浴で 3時間重合し、透明なハイドロゲルを得た。 く実施例 50〉 沈殿剤である塩ィ匕ナトリウム 0. 48 gを 1 Om 1メスフラス コに秤量し、 0. 1M—クェン酸緩衝液 (pH4. 0) で定容して 1. 2M— NaC l水溶液 （これを a液とする） を調製した。
また、 80%メタクリルジメチルァミノェチルメチルク口ライド塩水溶液 62. 5 gにN, N '—メチレンビスアクリルアミド（以下、 MBAAmと略す） 2. 5 g、 脱イオン水 35 gを加えて溶解し、 50%モノマー溶液 （これを b液とする） を 調製した。 更に、 水溶性重合開始剤である 2， 2， ーァゾビス [2— （2—イミ ダゾリン一 2 _ィル） プロパン] 二塩酸塩 （和光純薬工業製、 VA—044) の 10%水溶液 （これを c液とする） を調製した。 2m 1のサンプルチューブに、 a液を 840 μ し b液を 160 1注入して混合し、蛋白質結晶化剤水溶液（ 1. OM— Na C l、 pH4. 0、 モノマー濃度 8%) を調製し、 更に c液を 10 1添加してよく混合した後、 55 °Cの温浴で 3時間重合し、 透明なハイド口ゲル を得た。
く実施例 51 > 沈殿剤で 2-メチル- 2， 4-ペンタンジオール 2 gを 10m lメス フラスコに秤量し、 0. 1M—クェン酸緩衝液（ρΗ4· 0)で定容して 20% 一 2-メチル- 2, 4-ペンタンジオール水溶液 (これを a液とする） を調製した。 また、 ジメチルアクリルアミ ド 47. 5 gに N, N 'ーメチレンビスァクリル- アミド （以下、 MBAAm と略す） 2. 5 g、 脱イオン水 5◦ gを加えて溶解し、 5 0%モノマー溶液 （これを b液とする） を調製した。 更に、 水溶性重合開始剤で ある 2, 2， ーァゾビス [2- (2—イミダゾリン一2—ィル） プロパン] 二塩 酸塩 （和光純薬工業製、 VA—044) の 10%水溶液 （これを c液とする） を 調製した。 2 m 1のサンプルチューブに、 a液を 840 μ 1、 b液を 160μ 1 注入して混合し、 蛋白質結晶化剤水溶液 （1. 0Μ— Na C l、 pH4. 0、 モ ノマー濃度 8 %)を調製し、更に c液を 10 μ 1添加してよく混合した後、 55 °C の温浴で 3時間重合し、 透明なハイド口ゲルを得た。
く実施例 52 >沈殿剤であるリン酸ナトリウム塩 1. 176 g、 リン酸カリウム 塩 0. 035 gを 1 Om 1メスフラスコに秤量し、 0. 1M—クェン酸緩衝液 (pH4. 0) で定容して 1. 0M—リン酸ナトリウム/カリウム塩水溶液 （これ を a ί夜とする） を調製した。
また、 2 _アクリルアミ ドー 2—メチルプロパンスルホン酸 47. 5 §に1^, Ν '—メチレンビスアクリルアミ ド （以下、 MBMm と略す） 2. 5 g、 脱イオン 水 50 gを加えて溶解し、 50%モノマー溶液（これを b液とする）を調製した。 更に、 水溶性重合開始剤である 2, 2' —ァゾビス [2— (2—イミダゾリン一 2—ィル） プロパン] 二塩酸塩 （和光純薬工業製、 V A— 044) の 10%水溶 液 （これを c液とする） を調製した。 2m 1のサンプルチューブに、 a液を 84 0 μ 1、 b液を 160 μ 1注入して混合し、 蛋白質結晶化剤水溶液 （ 1. 0Μ— Na C l、 pH4. 0、 モノマー濃度 8%) を調製し、 更に c液を 10 /z 1添カロ してよく混合した後、 55 °Cの温浴で 3時間重合し、透明なハイド口ゲルを得た。 く実施例 53 > 沈殿剤である硫酸アンモニゥム 3. 17 gを 1 Om 1メスフラ スコに秤量し、 0. 1M—クェン酸緩衝液 （pH4. 0) で定容して 2. 4M- 硫酸アンモニゥム水溶液 （これを a液とする） を調製した。
また、 80 %メタタリルジメチルァミノェチルメチルク口ライド塩水溶液 62. 5 gに N， N '—メチレンビスアクリルアミ ド （以下、 MBAAmと略す） 2. 5 g、 脱イオン水 35 gを加えて溶解し、 50%モノマー溶液 （これを b液とする） を 調製した。 更に、 水溶性重合開始剤である 2, 2， ーァゾビス [2— （2—イミ ダゾリン一 2—ィル） プロパン] 二塩酸塩 （和光純薬工業製、 VA— 044) の 10%水溶液 （これを c液とする） を調製した。 2m 1のサンプルチューブに、 a液を 840 μ し b液を 160 μ 1注入して混合し、蛋白質結晶化剤水溶液（ 1. 0Μ— Na C l、 pH4. 0、 モノマー濃度 8%) を調製し、 更に c液を 10 μ 1添加してよく混合した後、 55 °Cの温浴で 3時間重合し、 透明なハイド口ゲル を得た。
く実施例 54 > 沈殿剤であるマロン酸 1. 04 gを 1 Om 1メスフラスコに秤 量し、 20%—水酸ィ匕ナトリウム水溶液 4 gを加えて中和したのち、 0. 1M— クェン酸緩衝液 （pH4. 0) で定容して 1. 0M—マロン酸ナトリウム水溶液 (これを a液とする） を調製した。
また、 50%アクリルアミド水溶液 （三菱レイヨン製） 90 gに N， N 'ーメ チレンビスアクリルアミド （以下、 MBAAm と略す） 5 g、 脱イオン水 5 gを加え て溶解し、 50%モノマー溶液 （これを b液とする） を調製した。 更に、 水溶性 重合開始剤である 2, 2， 一ァゾビス [2— （2—イミダゾリン一 2—ィル） プ 口パン] 二塩酸塩 （和光純薬工業製、 V A— 044) の 10%水溶液 （これを c 液とする） を調製した。 2m 1のサンプルチューブに、 3液を840 1、 b液 を 160 μ 1注入して混合し、 蛋白質結晶化剤水溶液 （ 1. ΟΜ—Ν a C 1、 p H4. 0、 モノマー濃度 8%) を調製し、 更に c液を 10 μ 1添加してよく混合 した後、 55 °Cの温浴で 3時間重合し、 透明なハイド口ゲルを得た。 産業上の利用性 本発明の蛋白質結晶化装置によれば、 蛋白質の結晶化実験あるいは結晶化条件 のスクリーニングを、 迅速かつ経済的に、 高い信頼性をもって実施することがで きる。 また、 本発明の蛋白質結晶化用ゲルによれば、 蛋白質結晶化において、 ゲ ル化反応が完結し、 さらには白濁等を生じないゲル状物を形成することができ、 蛋白質結晶化剤を保持した透明なゲル状物を提供することができる。

Claims

請求の範囲
1 . 蛋白質結晶化剤を保持した 2以上の結晶化剤保持部を有する蛋白質結晶化 用マイクロアレイと、 前記蛋白質結晶化用マイクロアレイと積層されるプレート とを有し、 前記プレートは、 前記結晶化剤保持部に対応し蛋白質含有試料を充填 可能な結晶化区画と、 該結晶化区画の間に設けられた凹部とを有することを特徴 とする蛋白質結晶化装置。
2. 前記結晶化剤保持部は、各々異なる蛋白質結晶化条件に調製されたゲルから なることを特徴とする請求項 1に記載の蛋白質結晶化装置。
3 . 前記蛋白質結晶化用マイクロアレイは、複数の中空管状体を配列してなるマ イクロアレイであることを特徴とする請求項 1に記載の蛋白質結晶化装置。
4 . 前記蛋白質結晶化用マイクロアレイと前記プレートとを圧接する機構をさ らに有することを特徴とする請求項 1に記載の蛋白質結晶化装置。
5 . 前記凹部にシール剤が充填されることを特徴とする請求項 1に記載の蛋白
6. 前記結晶化区画は、容量が 0 . 5 μ 1未満であることを特徴とする請求項 1 に記載の蛋白質結晶化装置。
7. 前記結晶化区画は、容量が 0 . 5 μ 1以上であることを特徴とする請求項 1 に記載の蛋白質結晶化装置。
8 . 前記蛋白質結晶化用マイクロアレイは、 1 0〜 1 0 0 0個の結晶化剤保持部 を有することを特徴とする請求項 1に記載の蛋白質結晶化装置。
9.前記プレートは、前記結晶化区画に析出した結晶を回収する結晶回収機構をさ らに有することを特徴とする請求項 1に記載の蛋白質結晶化装置。
1 0 . 前記結晶化区画における蛋白質の結晶化をモニタリングする検出機構を さらに有することを特徴とする請求項 1に記載の蛋白質結晶化装置。
1 1 . 請求項 1ないし 1 0のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置の前記結晶化 区画に蛋白質含有試料を充填するためのサンプル充填補助具であって、
前記結晶化区画に対応した配列の穿孔と、 該穿孔を前記プレート上で前記結晶 化区画に対応させる位置合わせ機構とを有することを特徴とするサンプル充填捕 助具。
1 2 . 請求項 1 1に記載のサンプル充填補助具との位置を合わせる位置決め部 が前記プレートに形成されていることを特徴とする請求項 1ないし 1 0のいずれ かに記載の蛋白質結晶化装置。
1 3 . 請求項 1 2に記載の蛋白質結晶化装置と、請求項 1 1に記載のサンプル充 填補助具とを用いる蛋白質結晶化条件スクリーニング法であつて、
請求項 1 1に記載のサンプル充填補助具を、 該サンプル充填補助具の前記穿孔 が前記結晶化区画に対応するように前記プレート上に設置し、 蛋白質含有試料を 該サンプル充填補助具の上から前記穿孔に添カ卩して前記結晶化区画に充填した後、 前記サンプル充填補助具を取り外し、 前記結晶化区画と、 前記結晶化剤保持部と を対応させて接触させるように、 前記プレートと前記蛋白質結晶化用マイクロア レイとを積層することを特徴とする蛋白質結晶化条件スクリ一ユング法。
1 4 . アクリルアミ ド、 2—アクリルアミ ドー 2—メチルプロパンスルホン酸、 メタクリルジメチルァミノェチルメチルク口ライド塩の群から選択される少なく とも 1種のモノマーを含むゲル状物に塩化ナトリウムが保持されている蛋白質結 晶化用ゲル。
1 5 . ジメチルァクリルァミ ドを含むゲル状物に 2 -メチル- 2, 4_ペンタンジォ ールが保持されている蛋白質結晶化用ゲル。
1 6 . 2—アクリルアミ ドー 2—メチルプロパンスルホン酸を含むゲル状物に リン酸ナトリゥム /力リゥム塩が保持されている蛋白質結晶化剤。
1 7 . メタクリルジメチルァミノェチルメチルク口ライ ド塩を含むゲル状物に、 硫酸アンモニゥムが保持されている蛋白質結晶化用ゲル。
1 8 . アクリルアミ ドを含むゲル状物に、マロン酸ナトリウムが保持されている 蛋白質結晶化用ゲル。
1 9 . ポリオキシエチレンモノアクリレートを含むゲル状物にポリエチレング リコール 6000が保持されている蛋白質結晶化用ゲル。
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