WO2005017154A1

WO2005017154A1 - 改良されたｓｉＲＮＡ分子およびこれを用いた遺伝子発現の抑制法

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Publication number: WO2005017154A1
Application number: PCT/JP2004/011822
Authority: WO
Inventors: Hirohiko Hohjoh
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Priority date: 2003-08-18
Filing date: 2004-08-18
Publication date: 2005-02-24
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Abstract

　本発明は、ｓｉＲＮＡにおいてその遺伝子発現抑制効果を調節するための改良を加えた二本鎖ＲＮＡ分子に関する。本発明による二本鎖ＲＮＡ分子は、細胞内で標的遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端または５’末端から順に１以上のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされたものである。さらに、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子においては、その二本鎖部分におけるセンス鎖中のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数は、前記細胞内における両鎖のハイブリダイゼーションを可能とするものとされる。

Description

明細書

改良された siRNA分子およびこれを用いた遺伝子発現の抑制法発明の背景

[0001] 発明の分野

本発明は、 RNAi現象による遺伝子サイレンシングに関するものであり、より詳細には、改良された siRNA、およびこれを用いた標的遺伝子の発現抑制法に関するものである。

[0002] 昔景按術

RNAi (RNA干渉）は、二本鎖 RNA (dsRNA)によって誘導される配列特異的な遺伝子転写後抑制機構である。この現象は、ハエ、昆虫、原生動物、脊椎動物、高等植物などの様々な種において観察されている。 RNAiの分子レベルでの作用機序に関し、ショヮショウノ、ェ (Drosophila)および！^:虫 (Caenorhabditis elegans)における多くの研究により、 siRNA (短鎖干渉 RNA)と呼ばれる 21— 25ヌクレオチド長の RN A断片が RNAiにとつて必須の配列特異的メディエーターであること（H疆 mond, S.M. et al., Nature 404, 293-296, 2000 ; Parrish, S. et al., Mol. Cell. 6， 1077-1087, 2000 ; Zamore, P.D. et al" Cell 101， 25-33, 2000)、ならびにこの siRNAが長い二本鎖 RNAから、 Dicerと呼ばれる RNァーゼ III様ヌクレアーゼにより生成すること（

Brenstein, E. et al., Nature 409, 363-366， 2001 ; Elbashir, S.M. et al" Genes Dev. 15， 188-200, 2001)がわかっている。

[0003] 哺乳動物においては、当初、 RNAiは卵母細胞および着床前の胚においてのみ見られる現象と考えられていた。一般に、哺乳動物細胞は、配列非特異的 RNァーゼである RNァーゼ Lによる迅速かつ非特異的な RNA分解経路、およびインターフェロンにより誘導される二本鎖 RNA依存的タンパク質キナーゼ（PKR)による迅速な翻訳阻害経路を有しており、これらは共に、 30ヌクレオチド以上の二本鎖 RNAによって活性化される。従って、未分化細胞および PKRを欠く分化細胞などを除く哺乳動物細胞においては、 30ヌクレオチド以上の二本鎖 RNAへの前記応答により、配列特異的な RNAi活性が遮蔽されることがある。最近になって、合成した 21ヌクレオチドの siRNA二重鎖が、哺乳動物細胞培養物にぉレ、て内因性遺伝子の発現を特異的に阻害しうることが報告されている（Elbashir, S.M. et al. , Nature 411 , 494-498， 2001)。

[0004] RNAiによる遺伝子発現抑制の原理は、次のように考えられている。まず、 siRNA が細胞に導入されると、これがマルチタンパク質複合体と結合し、 RISC (RNA誘導型サイレンシング複合体）が形成される。次いで、この RISCは標的遺伝子からの mR NAに結合し、そのヌクレアーゼ活性により mRNA中の siRNAが結合した部分を切断する。これにより、標的遺伝子によるタンパク質の発現が阻害される。

[0005] 最近では、合成 siRNAの細胞への導入による RNAi現象を用いた方法が、遺伝子発現の抑制法として注目され、利用されている。また、 siRNAの構成と遺伝子発現抑制効果との関係も、研究の対象となっている。

[0006] 例えば、 Hohjoh H.の報告（Hohjoh H" FEBS Letters 521 , 195-199, 2002)では、ホタルノレシフェラーゼ遺伝子に対する様々な二本鎖オリゴヌクレオチドについて、哺乳動物細胞における該遺伝子の発現抑制効果が調べられている。この報告には、とりわけ、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれの 3 '末端における 2個のリボヌタレォチドのオーバーハングが好ましいこと、アンチセンス鎖の構造が重要であること、ならびに、対象とする遺伝子における標的配列の違いにより、得られる遺伝子発現抑制効果が異なることが記載されてレ、る。

[0007] Hamada M.らの幸告 (Hamada M. et al. , Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 12，

301-309, 2002)では、センス鎖および/またはアンチセンス鎖においてそれぞれの 3 '末端以外の部分に連続しない 1以上の標的配列とのミスマッチを導入した siRNAを用いて、その標的遺伝子の発現抑制効果が調べられている。この報告には、アンチセンス鎖における標的配列とのミスマッチによって遺伝子発現抑制効果が低減されるが、一方で、センス鎖におけるミスマッチは遺伝子発現抑制効果に影響しないことが記載されている。

発明の概要

[0008] 本発明者は、 siRNAにおいて、センス鎖の二本鎖部分における 3 '末端の幾つかのヌクレオチドにおいてアンチセンス鎖に対するミスマッチを導入することにより、その siRNAの遺伝子発現抑制効果が増強されることを見出した。さらに、本発明者は、 si RNAにおいて、センス鎖の二本鎖部分における 5 '末端の幾つかのヌクレオチドにおいてアンチセンス鎖に対するミスマッチを導入することにより、その siRNAの遺伝子発現抑制効果が低減されることを見出した。本発明は、これら知見に基づくものである。

[0009] 従って、本発明は、 siRNAにおいてその遺伝子発現抑制効果を調節するための改良を加えた二本鎖 RNA分子、およびこれを用いた遺伝子発現抑制法を提供することを目的とする。

[0010] そして、本発明の第一の態様による二本鎖 RNA分子は、細胞内で標的遺伝子の発現を RNAiにより抑制しうる二本鎖 RNA分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖の 3'末端から順に 1以上のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、かつ、その二本鎖部分におけるセンス鎖中のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数力前記細胞内における両鎖のハイブリダィゼーシヨンを可肯とするものである、二本鎖 RNA分子である。

[0011] さらに、本発明の第二の態様による二本鎖 RNA分子は、細胞内で標的遺伝子の発現を RNAiにより抑制しうる二本鎖 RNA分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖の 5'末端から順に 1以上のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、かつ、その二本鎖部分におけるセンス鎖中のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数力前記細胞内における両鎖のハイブリダィゼーシヨンを可能とするものである、二本鎖 RNA分子である。

[0012] さらに、本発明による遺伝子発現抑制法は、本発明による二本鎖 RNA分子を細胞に導入する工程を含んでなる、細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法である。

[0013] 本発明によれば、 RNAi現象を利用した標的遺伝子の発現抑制法において、その発現抑制効率を調節することが可能となる。

図面の簡単な説明

[0014] [図 1]図 1は、各種 siRNAによる、 HeLa細胞中でのホタルルシフェラーゼ遺伝子発現の抑制効果を示す、二重ルシフェラーゼアツセィの結果を示すグラフである。

[図 2]図 2は、各種 siRNAによる、 HeLa細胞中での内因性遺伝子の発現抑制効果を示すグラフである。 [図 3]図 3は、センス鎖 3 '末端にミスマッチを含む siRNA分子（La21_3'm2)またはこれを含まなレ、 siRNA分子（La21-conv.)による、 2種のプラスミドからのレポーターの発現量を示す棒グラフである。

発明の具体的説明

[0015] 本明細書にぉレ、て「二本鎖 RNA」とは、二本の一本鎖 RNA分子力全体にわたつて、または部分的にハイブリダィズして得られる RNA分子を意味する。それぞれの一本鎖 RNAを構成するヌクレオチドの数は互いに異なっていてもよレ、。また、二本鎖 R NAを構成する一方または両方のヌクレオチド鎖は、一本鎖の部分 (オーバーハング )を含んでいてもよい。

[0016] 本明細書にぉレ、て「二本鎖部分」とは、二本鎖 RNAにおレ、て、両鎖のヌクレオチドが対合している部分、すなわち、二本鎖 RNA中の一本鎖の部分を除いた部分を意味する。

[0017] 本明細書において、「センス鎖」とは、遺伝子のコード鎖と相同な配列を有するヌクレオチド鎖を意味し、「アンチセンス鎖」とは、遺伝子のコード鎖と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖を意味する。

[0018] 本明細書にぉレ、て「相補的」とは、 2つのヌクレオチドがハイブリダィゼーシヨン条件下において対合しうるものであることを意味し、例えば、アデニン (A)とチミン (T)またはゥラシノレ (U)との関係、およびシトシン (C)とグァニン (G)との関係をいう。

[0019] 細胞内で標的遺伝子の発現を RNAiにより抑制しうる二本鎖 RNA分子は、 RNAi に関して得られている知見に基づいて、当業者であれば容易に設計することができる。一般的には、まず、標的遺伝子中においてその遺伝子に特異的な領域を選択し、細胞中においてその領域に特異的にハイブリダィズしうるリボヌクレオチド鎖を前記二本鎖 RNA分子のアンチセンス鎖とする。ここで「特異的な領域」とは、標的遺伝子の発現抑制を行なう細胞内において、他の核酸分子には見られない配列を有する領域を意味する。また、「特異的にハイブリダィズしうる」とは、そのアンチセンス鎖が、標的遺伝子の発現抑制を行なう細胞内において、標的遺伝子およびその転写物以外の核酸分子にはハイブリダィズしないことを意味する。前記アンチセンス鎖は、前記特異的領域に対応する配列を含むものとされるが、前記特異的領域に完全に相補的な配列を有する必要はなぐその特異的領域に特異的にハイブリダィズしうる限り、相補的でなレ、ヌクレオチドを含んでいてもよレ、。し力ながら、前記アンチセンス鎖は、好ましくは完全に相補的な配列を有するものとされる。二本鎖 RNA分子のセンス鎖は、アンチセンス鎖に完全に相補的な配列を含むものとされる。

[0020] 標的遺伝子中において選択される上記の特異的領域は、標的遺伝子におけるエタソンのみから選択することが好ましい。また、前記特異的領域は、一般に、 5 '末端および 3'末端の非翻訳領域 (UTR)ならびに翻訳開始コドンの周辺を除く部分から選択することが好ましいとされており、例えば、ェクソンおよびイントロンの両方を含む配列において、翻訳開始コドンから 3'側に 50ヌクレオチド以上離れた領域が好ましぐより好ましくは翻訳開始コドンから 3 '側に 75ヌクレオチド以上、さらに好ましくは 100 ヌクレオチド以上離れた領域とされる。前記特異的領域の長さは特に制限されないが、好ましくは 15ヌクレオチド以上、より好ましくは 17ヌクレオチド以上、さらに好ましくは 19ヌクレオチド以上、さらに好ましくは 19一 23ヌクレオチド、最も好ましくは 19一 2 1ヌクレオチドとされる。

[0021] 前記二本鎖 RNA分子のアンチセンス鎖は、センス鎖のヌクレオチドと対合した二本鎖部分の 3 '末端側に一本鎖部分 (オーバーハング）を有してレ、てもよレ、。この一本鎖部分のヌクレオチド配列は、標的遺伝子に関連する配列または関連しない配列のどちらであってもよく、その長さも特に制限されなレ、が、好ましくは 2ヌクレオチド長の配歹 IJ、より好ましくは 2つのゥラシノレ残基 (UU)とされる。センス鎖もまた、同様のオーバ一ハングを有するものとしてもよい。

[0022] 本発明の第一の態様による二本鎖 RNA分子は、上述のような二本鎖 RNA分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖の 3'末端から順に 1以上のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でなレ、ヌクレオチドとされたものである。すなわち、本発明の第一の態様による二本鎖 RNA分子のセンス鎖は、その二本鎖部分における 3 '末端から順に、アンチセンス鎖との 1以上のミスマッチを有するものである。これにより、標的遺伝子の発現抑制効果が増強される。ただし、このセンス鎖とアンチセンス鎖は細胞内において二本鎖の状態を保つ必要があるため、ミスマッチのヌクレオチド数は、二本鎖状態を保つのに必要とされるアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数によつて制限される。従って、本発明の第一の態様による二本鎖 RNA分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖中のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数は、細胞内における両鎖のハイブリダィゼーシヨンを可能とするものとされる。

[0023] 二本のリボヌクレオチド鎖が細胞内においてハイブリダィズするか否かは、当業者であれば容易に調べることができる。例えば、目的とする細胞内におけるハイブリダィゼーシヨン条件を in vitroにおいて再現し、そこに二本のリボヌクレオチド鎖を添加して、これらがハイブリダィズするか否かを調べればょレ、。

[0024] 本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第一の態様による二本鎖 RNA分子において、二本鎖部分におけるセンス鎖の 3'末端力順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数は 1一 4個とされ、より好ましくは 2個とされる。

[0025] 細胞内で標的遺伝子の発現を効率よく抑制するためには、上記のセンス鎖の 3'末端におけるミスマッチに加え、その 3 '末端から 11一 13番目に位置する 1つのヌクレォチドにおいてミスマッチを導入することが有利である。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第一の態様による二本鎖 RNA分子はさらに、二本鎖部分におけるセンス鎖の 3 '末端から 11一 13番目、より好ましくは 12番目、に位置する 1つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされたものである。

[0026] 二本鎖部分におけるセンス鎖の 3'末端から 11一 13番目に位置する 1つのヌクレオチドにミスマッチを有する二本鎖 RNA分子が遺伝子発現抑制効果を増強する上で有利であることは、 19一 20ヌクレオチド長のセンス鎖において、その 3，末端の 2つのヌクレオチドおよびその 3 '末端から 12番目のヌクレオチドにミスマッチを導入した二本鎖 RNA分子についての実験データにより確認されている。そして、このミスマッチの位置は、 RISCによる標的遺伝子転写産物の切断位置に近接している。従って、本発明の第一の態様による二本鎖 RNA分子において、センス鎖の二本鎖部分の 3' 末端におけるミスマッチの他に導入されるミスマッチは、 RISCによる標的遺伝子転写産物の切断位置に相当するセンス鎖上の位置から 5'側または 3'側に 1一 3ヌクレオチドの位置にある 1つのヌクレオチドに導入されるものとされてもよい。 RISCによる標的遺伝子転写産物の切断位置は、二本鎖 RNA分子中に含まれる標的遺伝子の特異的領域の配列に応じて、当業者であれば容易に決定することができるが、典型的には前記特異的領域の配列の中心部分である。

[0027] 本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第一の態様による二本鎖 RNA分子において、センス鎖の二本鎖部分の 3 '末端におけるミスマッチの他に導入されるミスマッチは、センス鎖の二本鎖部分が奇数のヌクレオチドで構成される場合には、中心に位置するヌクレオチドから 5，側に 1一 3ヌクレオチドの位置、好ましくは 2ヌクレオチドの位置にある 1つのヌクレオチドに導入されるものとされ、センス鎖の二本鎖部分が偶数のヌクレオチドで構成される場合には、中心の 3 '側のヌクレオチドから 5'側に 1一 3ヌクレオチドの位置、好ましくは 2ヌクレオチドの位置にある 1つのヌクレオチドに導入されるものとされる。

[0028] 本発明の第二の態様による二本鎖 RNA分子は、細胞内で標的遺伝子の発現を R NAiにより抑制しうる二本鎖 RNA分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖の 5 '末端から順に 1以上のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でなレ、ヌクレオチドとされたものである。すなわち、本発明の第二の態様による二本鎖 RNA分子のセンス鎖は、その二本鎖部分における 5'末端から順に、アンチセンス鎖との 1以上のミスマッチを有するものである。これにより、標的遺伝子の発現抑制効果が低減される。ただし、このセンス鎖とアンチセンス鎖は細胞内において二本鎖の状態を保つ必要があるため、ミスマッチのヌクレオチド数は、二本鎖状態を保つのに必要とされるアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数によって制限される。従って、本発明の第二の態様による二本鎖 RNA分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖中のァンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数は、細胞内における両鎖のハイブリダィゼーシヨンを可能とするものとされる。

[0029] 本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第二の態様による二本鎖 RNA分子において、二本鎖部分におけるセンス鎖の 5'末端力順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数は 1一 4個とされ、より好ましくは 2個とされる。

[0030] 本発明の第二の態様による二本鎖 RNA分子は、さらに、第一の態様による二本鎖 RNA分子について上述したセンス鎖上のミスマッチの一部または全部を含むものとすることもできる。これにより、標的遺伝子の発現抑制効果をより微細に調節することが可能となる。

[0031] 哺乳動物の細胞に長い二本鎖 RNA分子を導入すると、二本鎖 RNA依存的タンパク質キナーゼゃ 2 ' -5 '一オリゴァデュル酸合成酵素が誘導され、ひレ、ては細胞死につながることが知られている。従って、本発明による二本鎖 RNA分子は、哺乳動物の細胞内において、二本鎖 RNA依存的タンパク質キナーゼまたは 2' _5，_オリゴァデュル酸合成酵素を誘導しなレ、ものであることが好ましい。この条件を満たす二本鎖

RNA分子の鎖長は、当業者には容易に理解される。一般的には、 30ヌクレオチド以上の二本鎖 RNA分子によって上記の細胞死が起こることが知られており、従って、本発明による二本鎖 RNA分子は、好ましくは 29ヌクレオチド以下、より好ましくは 25 ヌクレオチド以下の鎖長を有するものとされる。ここで用いられる「鎖長」は、二本鎖 R NA分子の二本鎖部分だけでなぐ一本鎖部分をも含めた場合のヌクレオチド長を意味する。

[0032] 本発明による二本鎖 RNA分子は、 RNAiによる遺伝子発現抑制の効力を調節しうるものであり、これは、本明細書に記載の実験データによって裏付けられている。これらの実験データによれば、 siRNAにおいて、センス鎖 3'末端にミスマッチを導入した場合には RNAiによる遺伝子発現抑制効果が増強され、逆に 5'末端にミスマッチを導入した場合にはその効果が低減されることが実証されている。そして、このような遺伝子発現抑制の効力の調節は、 siRNA力 ¾NA誘導型サイレンシング複合体 (RIS C)に取り込まれる際の方向性を調節することによりもたらされる。すなわち、 siRNA のいずれかの末端に導入されたミスマッチによってその端部におけるハイブリダィゼーシヨンが解除されると、 siRNAはその端部力 RISCに取り込まれ、そのときに、 siR NAを構成する 2本の鎖のうち、 5 '末端から取り込まれた鎖が RNAiのメディエーター (真のアンチセンス鎖）として機能する。従って、発現を抑制しょうとする標的遺伝子について設計された siRNAにおいて、そのアンチセンス鎖の 5 '末端から RISCに取り込まれるように該 siRNAを改変することにより標的遺伝子の発現抑制効果を増強することができ、一方で、そのセンス鎖の 5 '末端から RISCに取り込まれるように該 si RNAを改変することにより標的遺伝子の発現抑制効果を低減させることができる。 [0033] 従って、本発明によれば、細胞内で標的遺伝子の発現を RNAiにより抑制しうる二本鎖 RNA分子において、前記二本鎖 RNA分子がそのアンチセンス鎖の 5 '末端側力 RNA誘導型サイレンシング複合体に組み込まれるように改変されてなる二本鎖 RNA分子が提供される。このような改変の具体例は、本発明の第一の態様による二本鎖 RNA分子について上述したとおりである。このような改変により、標的遺伝子の発現抑制効果が増強される。

[0034] さらに、本発明によれば、細胞内で標的遺伝子の発現を RNAiにより抑制しうる二本鎖 RN A分子において、前記二本鎖 RN A分子がそのセンス鎖の 5 '末端側から R NA誘導型サイレンシング複合体に組み込まれるように改変されてなる二本鎖 RNA 分子が提供される。このような改変の具体例は、本発明の第二の態様による二本鎖 R NA分子について上述したとおりである。このような改変により、標的遺伝子の発現抑制効果が低減される。

[0035] 本発明による二本鎖 RNA分子は、細胞内において、標的遺伝子の発現を抑制すること力 Sできる。従って、本発明によれば、本発明による二本鎖 RNA分子を細胞に導入する工程を含んでなる、細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。

[0036] 細胞は、 siRNAによる RNAi現象を起こすことが可能な細胞であればいかなるものであってもよぐ例えば、昆虫、線虫、植物、哺乳動物などに由来する細胞が挙げられ、好ましくは哺乳動物細胞とされる。植物に由来する細胞としては、例えば、トマト、タバコ、シロイヌナズナ、イネなどに由来するものが挙げられる。哺乳動物に由来する細胞としては、例えば、マウス、ハムスター、ヒトなどに由来するものが挙げられる。また、好適な培養細胞としては、例えば、 HeLa細胞、 NIHZ3T3細胞、 C〇S_7細胞、 293細胞などが挙げられる。

[0037] 本発明による二本鎖 RNA分子を細胞に導入する方法は、二本鎖核酸分子を細胞中に導入しうるものであればレ、かなる方法であってもよぐ特に制限されない。本発明による方法において、特に好適な二本鎖 RNA分子の細胞中への導入法は、リポソーム、好ましくはカチオン性リボソームを用いたトランスフエクシヨン法であり、これは、 Lipofectamine2000トランスフエクシヨン試薬（Invitrogen社製）、 Oligofectaminトランスフ工クシヨン試薬（Invitrogen社製）、 jetSIトランスフヱクシヨン試薬（Polyplus-transfection 社製）、 TransMessenger (Qiagen社製）などの市販のトランスフエクシヨン試薬を用いて容易に行なうことができる。

[0038] あるいは、本発明による二本鎖 RNA分子を利用した標的遺伝子の発現抑制は、本発明による二本鎖 RNA分子を細胞中におレ、て発現するベクターを目的とする細胞に導入することによって行なうこともできる。この方法においては、本発明による二本鎖 RNA分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれを発現する 2種のベクターを用いてもよいし、または本発明による二本鎖 RNA分子のセンス鎖をコードする DN Aおよびアンチセンス鎖をコードする DNAの両方を含んでなるベクターを用いてもよレ、。従って、本発明の他の態様によれば、本発明による二本鎖 RNA分子のセンス鎖をコードする DNAを含んでなるベクターと、該ニ本鎖 RNA分子のアンチセンス鎖をコードする DNAを含んでなるベクターとの組み合わせ、または本発明による二本鎖 R NA分子のセンス鎖をコードする DNAおよびアンチセンス鎖をコードする DNAの両方を含んでなるベクター、を細胞に導入する工程を含んでなる、細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。

[0039] 上記のベクターは、本発明による二本鎖 RNA分子の一方の鎖または両方の鎖を細胞内において発現しうるものであればよレ、。従って、上記のベクターは、二本鎖 R NA分子の鎖をコードする DNAを、細胞内でのその転写を可能とする形で含んでなる。このようなベクターは、当業者であれば容易に構築することができ、例えば、必要に応じて、プロモーター、ターミネータ一などの要素を機能しうる形で連結することができる。プロモーターとしては、目的とする細胞内において機能しうるものであればよく、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーターなどのいずれのものを用いてもよレ、。また、標的遺伝子の発現を制御しているものと同じプロモーターを用いることもでき、これにより、標的遺伝子の転写産物が生成すると同時に、該転写産物を分解するための本発明による二本鎖 RNA分子を生成させることができる。構築されたべクターの目的とする細胞中への導入は、当技術分野において知られている方法により、当業者であれば適切に行なうことができる。

[0040] 特に、本発明による二本鎖 RNA分子の両方の鎖を発現しうる単一のベクターを用レ、ることが好ましい。このようなベクターは、二本鎖 RNA分子の 2本の鎖を独立して発現するものであっても、 2本の鎖がリンカ一配列によって連結されたヘアピン型二本鎖 RNAとして発現するものであってもよレ、。本発明による二本鎖 RNA分子をへアビン型ニ本 RNAとして発現するベクターは、当業者であれば適宜構築することができ、例えば、文献の記載（Bass, Β·し， Cell 101， 235-238, 2000 ; Tavernarakis, Ν· et al., Nat. Genet. 24, 180 - 183， 2000 ; Malagon, F. et al, Mol. Gen. Genet. 259,

639-644, 1998 ; Parrish, S. et al., Mol. Cell 6, 1077-1087， 2000)に従って構築することちできる。

[0041] 本発明による二本鎖 RNA分子、およびこれを利用した遺伝子発現抑制法は、様々な遺伝子を標的とすることができ、例えば、細胞における機能を解析することが望まれる遺伝子を標的とすることができる。また、癌遺伝子、ウィルス遺伝子などを標的としてその発現を抑制することにより、これら遺伝子の機能を解明することができ、さらには、生体中に存在する細胞においてこれら遺伝子の発現を抑制することにより、疾患または障害の治療を行なうことも可能となる。

実施例

[0042] 例 1：各種 siRNAによる HeLa細朐中でのホタルルシフェラーゼ遺伝子発現の抑制

ホタルルシフヱラーゼ遺伝子に対する従来の siRNA、およびセンス鎖の様々な箇所にアンチセンス鎖とのミスマッチを導入した siRNAを設計し、これらによるホタルノレシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果を調べた。

[0043] 設計した各種 siRNAのヌクレオチド配列を下記の表 1に示す。表 1では、各 siRNA のセンス鎖を上側とし、アンチセンス鎖を下側として整列させ、互いに相補的なヌクレォチドには、両鎖の間にアステリスク「*」が付されている。また、各 siRNAの名称において、「La2」および「La21」はホタルルシフェラーゼ遺伝子中の標的配列を表し、該遺伝子の細胞への導入に用いた発現プラスミド pGL3_control (Promega社製）における番号体系によれば、「La2」は第 282— 300ヌクレオチドを標的とするものであり、「La21」は第 340— 358ヌクレオチドを標的とするものである。また、「conv.」は、従来の設計基準に基づいて設計された siRNAを表し、従って、これはミスマッチを含んでいない。さらに、「3'BL」は、その siRNAが、センス鎖における 3'末端に突出部分（ォ一バーハング）を含まなレ、ことを表す。

[表 1]

表 1 ：ホタルルシフェラーゼ遣伝子に対して設計した s 1 RNA 名称配歹 IJ 配列番号

5 GGAAGACGCCAAAAACAUAUU3' 1

3 UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5' 2

5 GGAAGACGCCAAAAACAUU3' 3

******************

3 UUCCUUCUGCGGUUUOUGUAU5» 2

5 GGAAGACGCCAAAAACAAU3¹ 4

La2-3 ' m2

3 UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5' 2

5 GGAAGACGCCAAAAACUAU3' 5

La2-3 'm3

3 UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5- 2

5 GGAAGACGCCAAAAAUUAU3' 6

La2-3 'm4 ***************

3 UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5'

5 UUAAGACGCCAAAAACAUAUU3' 7

La2-5 ^fm2

3 UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5' 2 s GGAAGACUCCAAAAACAAO3* 8

La2-3 'm2ml2 * * * ** * * A ** ** * * ¹**

3 UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5' 2

5 GGAAGACGCCAAAAACAUA 3 ' 28

La2-3 ' BL

3 UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5- 2

5 ACCGCUGGAGAGCAACUGCUU3* 9

La21-conv.

3 UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5' 10

5 i¾CCGCUGGAGAGCAACUGU3' 11

La21-3 'ml ******************

3 UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5' 10

5 ACCGCUGGAGAGCAACUUU3' 12

La21-3 ^fm2

3 UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5- 10

5 ACCGCUGGAGAGCAACAUU3' 13

La21-3 'm3 ****************

3 UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5' 10

5 ACCGCUGGAGAGCAAUAUU3' 14

La21-3 'm4

3 UUOGGCGACCUCUCGUUGACG5' 10

5 UACGCUGGAGAGCAACUGCUU3' 29

La21-5'm2 *****************

3 UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5' 10

5 ACCGCUGUAGAGCAACUUU3' 15

La21-3 'm2ml2 ******* *********

3 UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5' 10

5ACCGCUGGAGAGCAACUGC3' 30

La21-3^!BL *******************

3 UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5' 10 [0045] 上記の各オリゴリボヌクレオチドのペアを合成し、それぞれの 20 μ Μをアニーリング緩衝液（30mM HEPES pH7. 0、 lOOmM酢酸カリウム、および 10mM酢酸マグネシゥム）中に添加し、 90°Cで 3分間の熱変性を行なった後、 37°Cで一昼夜のァニ一リングを行なった。これにより、各 siRNAを得た。

[0046] HeLa細胞は、 10%ゥシ胎児血清（Life Technologies社製）、 100U/mlペニシリン

(Life Technologies社製)および 100 μ g/ mlストレフトマイシン (Life Technologies子土製）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Sigma社製）中において、 5%C〇雰囲

2 気下、 37°Cで増殖させた。

[0047] トランスフヱクシヨンの前日、増殖させた HeLa細胞をトリプシン処理し、抗生物質を含まない新鮮な培地で希釈し、 24ゥエル培養プレートに播種した (培養培地 0. 5ml 中における約 0. 5 X 10⁵細胞/ゥエル）。次いで、培養培地を 0. 5mlの OPTI—ME M I (Life Technologies社製）で置換し、各ゥエルに、ホタルルシフェラーゼを発現する pGL3— controlプラスミド（Promega社製） 0· 25 g、対照としてのゥミシィタケルシフェラーゼを発現する phRL— TKプラスミド（Promega社製） 0· 05 /i g、および 0· 24 μ gの各 siRNAを添加した。 2種のレポータープラスミドおよび各 siRNAでの同時トランスフエクシヨンは、 Lipofectamine2000トランスフエクシヨン試薬（Invitrogen社製）を用いて行なった。

[0048] その後、細胞を 37°Cで 4時間インキュベートし、抗生物質を含まない新鮮な培養培地 0. 5mlを添加した後、さらに 37°Cでインキュベートした。トランスフエクシヨンの 24 時間後に細胞溶解物を調製し、 Dud-Luciferaseレポーターアツセィシステム（

Promega社製）を用いてルシフェラーゼ発現アツセィを行なった。

[0049] 図 1は、二重ルシフェラーゼアツセィの結果を示す。図 1では、各 siRNAを用いた場合における、対照（ゥミシィタケ)ルシフェラーゼ活性に対する標的（ホタル)ルシフヱラーゼ活性の比が示されている。この 2種のルシフェラーゼ活性の比は、遺伝子発現の抑制を起こさない二本鎖 RNA (Mock) (Qiagen社製）を用いた対照サンプルについて得られたものを 1. 0として標準化されている。各データは少なくとも 4回の独立した実験からの平均値であり、また、各データに付されたエラーバーは標準偏差を表す。 [0050] 図 laによれば、 La2_conv.は約 98%という強い遺伝子発現抑制を示したのに対し、 La21_conv.は約 50%という中程度の遺伝子発現抑制を示すことがわかる。この La2_conv.と La21_conv.との遺伝子発現抑制効果における違いは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子中の標的配列の違いによるものと考えられる。

[0051] 図 lbは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子中の La2を標的とする各種 siRNAを用いた場合の遺伝子発現抑制効果を示す。 La2-conv.と La2_3'ml、 La2_3'm2、 La2_3'm3、および La2-3'm4とを比較すると、 siRNAのセンス鎖における 3 '末端への 1一 4ヌクレォチドのミスマッチの導入により、その標的遺伝子の発現抑制効果が 2 3倍となることがわかる。そのうち、センス鎖の 3，末端に 2ヌクレオチドのミスマッチを有する siRN Aが最も強い遺伝子発現抑制効果を示している。さらに、センス鎖の 3 '末端における 2ヌクレオチドのミスマッチに加え、センス鎖の 3 '末端から 12番目のヌクレオチドにおけるミスマッチを有する siRNA (La2_3'm2ml2)は、さらに強い遺伝子発現抑制効果を示している。これに対し、センス鎖の 5 '末端に 2ヌクレオチドのミスマッチを有する si RNA (La2-5'm2)は、従来の siRNA (La2_conv.)よりも低い遺伝子発現抑制効果を示しており、このことは、 siRNAのセンス鎖における 5 '末端へのミスマッチの導入がその siRNAによる遺伝子発現抑制効果を低減することを示している。

[0052] 図 lcは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子中の La21を標的とする各種 siRNAを用いた場合の遺伝子発現抑制効果を示す。 La21_conv.と La21_3'ml、 La21_3'm2、

La21_3'm3、および La21_3'm4とを比較すると、 siRNAのセンス鎖における 3 '末端への 1一 4ヌクレオチドのミスマッチの導入により、その標的遺伝子の発現抑制効果が 2 一 3倍となることがわかる。そのうち、センス鎖の 3 '末端に 2ヌクレオチドのミスマッチを有する siRNAが最も強い遺伝子発現抑制効果を示している。さらに、センス鎖の 3 ' 末端における 2ヌクレオチドのミスマッチに加え、センス鎖の 3 '末端から 12番目のヌクレオチドにおけるミスマッチを有する siRNA (La21-3'm2ml2)は、さらに強い遺伝子発現抑制効果を示している。これに対し、センス鎖の 5 '末端に 2ヌクレオチドのミスマツチを有する siRNA (La21_5'm2)は、従来の siRNA (La21_conv.)よりも低い遺伝子発現抑制効果を示しており、このことは、 siRNAのセンス鎖における 5 '末端へのミスマッチの導入がその siRNAによる遺伝子発現抑制効果を低減することを示している。これらの結果は、上述の La2を標的とする各種 siRNAを用いた場合に一致しており、従って、 siRNAのセンス鎖における 3，末端へのミスマッチの導入、さらには 3，末端から 12番目のヌクレオチドにおけるミスマッチの導入による遺伝子発現抑制の増強効果は、標的遺伝子中の標的配列の部位、標的配列のヌクレオチド配歹 1J、その標的配列に対して設計されたミスマッチの無い従来の siRNAによる遺伝子発現抑制効率等に依存しなレ、ことがわかる。

[0053] 例 2：各種 siRNAによる HeLa細朐中での LaminA/C遣伝子および Dnmtl遺伝子のの港 II

HeLa細胞において発現する内因性の LaminA/C遺伝子および Dnmtl遺伝子のそれぞれについて、これら遺伝子対する従来の siRNA、およびセンス鎖の様々な箇所にアンチセンス鎖とのミスマッチを導入した siRNAを設計し、これら siRNAによる前記遺伝子の発現抑制効果を調べた。

[0054] 設計した各種 siRNAのヌクレオチド配列を下記の表 2に示す。表 2では、各 siRNA のセンス鎖を上側とし、アンチセンス鎖を下側として整列させ、互いに相補的なヌクレォチドには、両鎖の間にアステリスク「*」が付されている。また、各 siRNAの名称において、「Lam」および「Dnl」はそれぞれが標的とする遺伝子、すなわち LaminA/C遺伝子および Dnmtl遺伝子を表す。各遺伝子の mRNA配列において翻訳開始コドンの「 A」を 1とする番号体系によれば、「Lam」は LaminA/C遺伝子からの mRNA中の第 82 9一 851ヌクレオチドを標的とするものであり、「Dnl(#l)」は Dnmtl遺伝子からの mRN A中の第 70— 89ヌクレオチドを標的とするものであり、「Dnl(#2)」は Dnmtl遺伝子からの mRNA中の第 185— 203ヌクレオチドを標的とするものである。さらに、「

Nat. Lam jは LaminA/C遺伝子を標的とする siRNAを表し、その標的配列は文献に記載されている（Elbrashir, S.M. et al.， Nature 411: 494-498, 2001)。また、「conv.」は、従来の設計基準に基づいて設計された siRNAを表し、従って、これはミスマッチを含んでいない。

[0055] [表 2] 表 2 ： LaminA/C遺伝子および DnniU遺伝子に対して設計した s i R NA

上記の各オリゴリボヌクレオチドのペアを合成し、それぞれの 20 μ Μをアニーリング緩衝液（30mM HEPES pH7. 0、 lOOmM酢酸カリウム、および lOmM酢酸マグネシゥム）中に添加し、 90°Cで 3分間の熱変性を行なった後、 37°Cで一昼夜のァニ一リングを行なった。これにより、各 siRNAを得た。 [0057] HeLa細胞は、 10%ゥシ胎児血清（Life Technologies社製）、 100U/mlペニシリン (Life Technologies社製)および 100 μ g mlストレプトマイシン (Life Technologies社製）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Sigma社製）中において、 5%C〇雰囲

2 気下、 37°Cで増殖させた。

[0058] HeLa細胞の各 siRNA (lOOnM)でのトランスフエクシヨンは、 jetSIトランスフエクション試薬（Polyplus-transfection社製）を用いて行なった。

[0059] トランスフエクシヨンの 48時間後に全 RNAを単離し、逆転写酵素による cDNA合成を行なった。この cDNAを铸型とするリアルタイム PCRにより、標的遺伝子の発現レベルを測定した。これら一連の発現レベル測定は、 SYBR green PCRキット（Molecular Probe社製）を用いて行なった。

[0060] 図 2は、各種 siRNAによる、 HeLa細胞中での内因性遺伝子の発現抑制効果を示す。図 2では、各 siRNAを用いた場合における、対照遺伝子（G3PDH遺伝子）の発現レベルに対する標的遺伝子（LaminA/C遺伝子または Dnmtl遺伝子）の発現レべルの比が示されている。この発現レベルの比は、遺伝子発現の抑制を起こさない二本鎖 RNA (Mock) (Qiagen社製）を用いた対照サンプルについて得られたものを 1 · 0 として標準化されている。各データは少なくとも 4回の独立した実験からの平均値であり、また、各データに付されたエラーバーは標準偏差を表す。

[0061] 図 2aおよび図 2bによれば、センス鎖の 3，末端に 2ヌクレオチドのミスマッチを有し、さらにセンス鎖の 3 '末端から 12番目のヌクレオチドにおいてミスマッチを有する siRN A力従来の siRNAに比べて強い遺伝子発現抑制効果を示すことがわかる。

[0062] 例 3： siRNA分子を構成するセンス鎖の 3 '末端におけるミスマッチによる RISC形成 siRNAが細胞内に導入されると、そのセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方が RISC内に取り込まれる。こうして形成された RISCは、その中に取り込まれた鎖がハイブリダィズした mRNAを切断すると考えられている。従って、 siRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれが RISC内に取り込まれやすいかによつて、標的となる遺伝子の発現抑制の効率は異なると考えられる。

[0063] 本例では、 siRNA分子においてセンス鎖の 3'末端にミスマッチを導入することにより、 RISC内に取り込まれる鎖の選択性が変化するか否力を調べることを目的として、以下の実験を行った。

[0064] まず、ゥミシィタケ'ノレシフェラーゼ遺伝子の 3，非翻訳領域に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子におけるターゲット配列「La21」のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれに対応する配列を揷入した 2種のレポータープラスミドを作製した。コントロールプラスミドとしては、 j3—ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するプラスミドを用いた。 siRNA 分子（二量体）としては、上記の表 1に示される La21-conv. (センス鎖 3 '末端にミスマツチを含まなレ、）および La21_3'm2 (センス鎖 3 '末端に 2塩基のミスマッチを含む）を用いた。

[0065] HeLa細胞は、 10%ゥシ胎児血清（Life Technologies社製）、 100U/mlペニシリン

2 気下、 37°Cで増殖させた。

[0066] 上記レポータープラスミドのいずれか一つ、上記 siRNA分子のいずれか一つ、およびコントロールプラスミドを、 HeLa細胞に共トランスフエクシヨンした。 24時間後に、ルシフェラーゼ活性および β ガラクトシダーゼ活性を測定し、ルシフェラーゼ活性の測定値を β ガラクトシダーゼ活性の測定値で除した値を、標準化されたレポーターの発現量として評価した。

[0067] 図 3は、センス鎖 3 '末端にミスマッチを含む siRNA分子（La21-3'm2)またはこれを含まなレ、 siRNA分子（La21-conv.)による、 2種のプラスミドからのレポーターの発現量を示す棒グラフである。図 3において、「アンチセンス— siRNA」のグラフは、ターゲット配列のセンス鎖が 3 '非翻訳領域に組み込まれたレポータープラスミドからの発現量を示し、従って、この発現量は、各 siRNA分子のアンチセンス鎖をメディエーターとする RNAiによって抑制されたものである。一方で、「センス _siRNA」のグラフは、ターゲット配列のアンチセンス鎖が 3 '非翻訳領域に組み込まれたレポータープラスミドからの発現量を示し、従って、この発現量は、各 siRNA分子のセンス鎖をメデイエ一ターとする RNAiによって抑制されたものである。

[0068] 図 3によれば、センス鎖 3'末端にミスマッチを含まない従来型の siRNA分子（ La21_conv.)を用いた場合では、そのセンス鎖とアンチセンス鎖がほぼ同程度の割合で RNAiメディエーターとして働くことがわかる。一方、センス鎖 3'末端にミスマッチを含む siRNA分子（La21_3'm2)を用いた場合では、そのセンス鎖をメディエーターとする RNAi活性がほとんど誘導されないのに対し、アンチセンス鎖をメディエーターとする RNAi活性が著しく強いことがわかる。この結果によれば、 siRNA分子においてセンス鎖の 3'末端にミスマッチを導入することにより、そのアンチセンス鎖が優先的に RNAiメディエーターとして RISC内に取り込まれることが明ら力、となる。このことは、センス鎖 3'末端におけるミスマッチにより、 siRNA分子がそのアンチセンス鎖の 5 '末端側から RISC内に取り込まれ、その結果として、該アンチセンス鎖；

ターとして働くことを示唆している。

Claims

請求の範囲

[1] 細胞内で標的遺伝子の発現を RNAiにより抑制しうる二本鎖 RNA分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖の 3 '末端から順に 1以上のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、かつ、

その二本鎖部分におけるセンス鎖中のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数が、前記細胞内における両鎖のハイブリダィゼーシヨンを可能とするものである、二本鎖 RNA分子。

[2] 二本鎖部分におけるセンス鎖の 3'末端力順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数が 1一 4個である、請求項 1に記載の二本鎖 RNA 分子。

[3] 二本鎖部分におけるセンス鎖の 3'末端力順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数が 2個である、請求項 1に記載の二本鎖 RNA分子。

[4] さらに、二本鎖部分におけるセンス鎖の 3 '末端から 11一 13番目に位置する 1つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でなレ、ヌクレオチドとされる、請求項 1に記載の二本鎖 RN A分子。

[5] 二本鎖部分におけるセンス鎖の 3'末端から 12番目に位置するヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でなレ、ヌクレオチドとされる、請求項 4に記載の二本鎖 RNA分子。

[6] さらに、二本鎖部分におけるセンス鎖の、 RISCによる標的遺伝子転写産物の切断位置に相当するセンス鎖上の位置から 5 '側または 3 '側に 1一 3ヌクレオチドの位置にある 1つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項 1に記載の二本鎖 RNA分子。

[7] さらに、センス鎖の二本鎖部分が奇数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心に位置するヌクレオチドから 5'側に 1一 3ヌクレオチドの位置にある 1つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、センス鎖の二本鎖部分が偶数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心の 3，側のヌクレオチドから 5，側に 1一 3ヌクレオチドの位置にある 1つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項 1に記載の二本鎖 RNA分子。

[8] さらに、センス鎖の二本鎖部分が奇数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心に位置するヌクレオチドから 5'側に 2ヌクレオチドの位置にある 1つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、センス鎖の二本鎖部分が偶数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心の 3 '側のヌクレオチドから 5 '側に 2ヌクレオチドの位置にある 1 つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でなレ、ヌクレオチドとされる、請求項 1に記載の二本鎖 RN A分子。

[9] 哺乳動物の細胞内において、二本鎖 RNA依存的タンパク質キナーゼまたは 2' _5 '一オリゴアデニル酸合成酵素を誘導しないものである、請求項 1に記載の二本鎖 RN A分子。

[10] 29ヌクレオチド以下の鎖長を有するものである、請求項 9に記載の二本鎖 RNA分子。

[11] 細胞内で標的遺伝子の発現を RNAiにより抑制しうる二本鎖 RNA分子において、その二本鎖部分におけるセンス鎖の 5 '末端から順に 1以上のヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、かつ、

その二本鎖部分におけるセンス鎖中のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数

1S 前記細胞内における両鎖のハイブリダィゼーシヨンを可能とするものである、二本鎖 RNA分子。

[12] 二本鎖部分におけるセンス鎖の 5'末端力順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数が 1一 4個である、請求項 11に記載の二本鎖 RN A分子。

[13] 二本鎖部分におけるセンス鎖の 5'末端力順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数が 2個である、請求項 11に記載の二本鎖 RNA分子。

[14] さらに、二本鎖部分におけるセンス鎖の 3 '末端から順に 1以上のヌクレオチドがァンチセンス鎖に相補的でなレ、ヌクレオチドとされる、請求項 11に記載の二本鎖 RNA 分子。

[15] 二本鎖部分におけるセンス鎖の 3'末端力順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数が 1一 4個である、請求項 14に記載の二本鎖 RN A分子。

[16] 二本鎖部分におけるセンス鎖の 3'末端力順にアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされるヌクレオチドの数が 2個である、請求項 14に記載の二本鎖 RNA分子。

[17] さらに、二本鎖部分におけるセンス鎖の 3 '末端から 11一 13番目に位置する 1つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でなレ、ヌクレオチドとされる、請求項 11に記載の二本鎖 RN A分子。

[18] 二本鎖部分におけるセンス鎖の 3'末端から 12番目に位置するヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でなレ、ヌクレオチドとされる、請求項 17に記載の二本鎖 RNA分子。

[19] さらに、二本鎖部分におけるセンス鎖の、 RISCによる標的遺伝子転写産物の切断位置に相当するセンス鎖上の位置から 5 '側または 3 '側に 1一 3ヌクレオチドの位置にある 1つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項 11に記載の二本鎖 RNA分子。

[20] さらに、センス鎖の二本鎖部分が奇数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心に位置するヌクレオチドから 5'側に 1一 3ヌクレオチドの位置にある 1つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、センス鎖の二本鎖部分が偶数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心の 3，側のヌクレオチドから 5，側に 1一 3ヌクレオチドの位置にある 1つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされる、請求項 11に記載の二本鎖 RNA分子。

[21] さらに、センス鎖の二本鎖部分が奇数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心に位置するヌクレオチドから 5'側に 2ヌクレオチドの位置にある 1つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でないヌクレオチドとされ、センス鎖の二本鎖部分が偶数のヌクレオチドで構成される場合には、二本鎖部分におけるセンス鎖の中心の 3 '側のヌクレオチドから 5 '側に 2ヌクレオチドの位置にある 1 つのヌクレオチドがアンチセンス鎖に相補的でなレ、ヌクレオチドとされる、請求項 11 に記載の二本鎖 RNA分子。

[22] 哺乳動物の細胞内において、二本鎖 RNA依存的タンパク質キナーゼまたは 2' _5 '一オリゴアデニル酸合成酵素を誘導しなレ、ものである、請求項 11に記載の二本鎖 R NA分子。

[23] 29ヌクレオチド以下の鎖長を有するものである、請求項 22に記載の二本鎖 RNA 分子。

[24] 請求項 1一 23のいずれか一項に記載の二本鎖 RNA分子を細胞に導入する工程を含んでなる、細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法。

[25] 細胞が哺乳動物細胞である、請求項 24に記載の方法。

[26] 請求項 1一 23のいずれか一項に記載の二本鎖 RNA分子のセンス鎖をコードする DNAおよびアンチセンス鎖をコードする DNAの両方を含んでなる、ベクター。

[27] 請求項 1一 23のいずれか一項に記載の二本鎖 RNA分子のセンス鎖をコードする DNAを含んでなるベクターと、該ニ本鎖 RNA分子のアンチセンス鎖をコードする D NAを含んでなるベクターとの組み合わせ、または請求項 26に記載のベクターを細胞に導入する工程を含んでなる、細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法。

[28] 細胞が哺乳動物細胞である、請求項 27に記載の方法。

[29] 細胞内で標的遺伝子の発現を RNAiにより抑制しうる二本鎖 RNA分子において、前記二本鎖 RNA分子がそのアンチセンス鎖の 5'末端側から RNA誘導型サイレンシング複合体に組み込まれるように改変されてなる、二本鎖 RNA分子。

[30] 細胞内で標的遺伝子の発現を RNAiにより抑制しうる二本鎖 RNA分子において、前記二本鎖 RNA分子がそのセンス鎖の 5 '末端側から RNA誘導型サ

複合体に組み込まれるように改変されてなる、二本鎖 RNA分子。