WO2005022158A1 - Vorrichtungen zum nachweis biochemischer aktivität enthaltend gap junctions - Google Patents

Vorrichtungen zum nachweis biochemischer aktivität enthaltend gap junctions Download PDF

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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the invention relates to devices and methods for the detection of biochemical activity with a detection reaction, the biochemical activity to be detected being spatially separate from the detection reaction.
  • the spatial separation is achieved through lipid membranes and gap junctions.
  • Connexins Biological protein molecules, so-called connexins, which play a special role in the communication between living cells, are known to the person skilled in the art. In the meantime, about fifteen different connexins are differentiated based on their amino acid sequence [1] [2]. Connexins occur in all vertebrates and are usually abbreviated, e.g. Cx26 designated. The number indicates the chromatographic size of the connexins in kD. Connexins with a molecular weight between 26 and 56 kD are known to date. As an alternative to this nomenclature, a second has prevailed, which divides the connexins into at least 3 classes a, b and c on the basis of structural features and then numbers the corresponding connexins in the individual classes.
  • a connexon is a ring-shaped structure that crosses the cell membrane and is basically able to form a very wide, non-specific ion channel or a water-filled pore. However, these pores are usually closed as long as the connexon is in the membrane of a single, healthy cell.
  • a gap junction or electrical synapse is formed between two connexons of the opposite cells, which now bridges the two membranes and the distance between the cell membranes , A gap junction is usually formed in a few minutes on contact.
  • the gap junction channel formed is a structure of generally 12 identical or different connexins, or of two connexons.
  • the channel has a closable central pore with a diameter of about 1.5 to 2 nm.
  • the main difference from other membrane channels is that gap junction channels "pull through two adjacent cell membranes" and thus do not create a connection between the cell interior and the external medium. but create a connection between the intracellular media of the two cells.
  • Gap junction channels enable inorganic ions and small water-soluble molecules up to a molecular mass of approx. 1000 daltons to pass directly from the cytoplasm of one cell into the cytoplasm of the other cell. This connects the two cells mechanically, electrically and metabolically.
  • Gap junction channels belong to the epithelial cell-to-cell connections and can be found in almost all epithelia and many others
  • gap junctions Tissue types. As a rule, many gap junction channels are organized in the form of fields, these structures then being referred to as gap junctions in the true sense.
  • the gap junction channels of connected cells are usually open and the connexins stretched. If a cell experiences a massive influx of calcium from the outside, for example due to an injury, the connection to neighboring cells is interrupted by the connexins twisting allosterically.
  • Connexins can be made available by purifying cell membranes from cells containing connexins, e.g. B. eye lens, heart muscle, smooth muscles, or epithelial cells and by genetic expression of the connexins in bacteria, yeast or other cells. It is also known that connexins can be provided with a marker, such as a fluorescent protein fragment, so that their presence in a cell membrane can be demonstrated using simple optical methods [3].
  • a marker such as a fluorescent protein fragment
  • invertebrates have a functionally similar class of membrane proteins called incnexins [6].
  • the channels formed with this have a larger pore, which allows molecules up to a weight of 2000 daltons to pass through.
  • Innexins also form gap junctions in the sense of the invention.
  • plasmodesmata connections between cells in plants which have similar properties to gap junctions and which are referred to as plasmodesmata. These also span the cell wall of neighboring cells and also allow a limited number of ions and small molecules to pass from cell to cell. In contrast to the channels in animal organisms, the plasmodesmata are of the Plasma membrane limited.
  • Cellular assays are also known in which a certain biochemical activity that takes place inside a living cell is detected by suitable detection reactions that also take place inside the cell.
  • methods are known in which reaction products of the biochemical activity within the cell react with indicator molecules, which then produce an easily detectable signal, e.g. a light signal or a color change.
  • indicator molecules e.g. the aequorin [7].
  • ion channels, receptors and other target molecules are built into artificial lipid membranes and can be functionally examined there by suitable experiments [8].
  • suitable methods which stabilize an artificial lipid membrane with a suitable substrate in such a way that they become mechanically stronger, longer-lasting and more reproducible [9].
  • silica gels are used as substrates, which may have been provided with a polymeric intermediate layer to improve the stability and fluidity of the membrane [10].
  • Bilayer can also be stabilized on the substrate with suitable chain molecules ('tethered bilayers') [11].
  • the prior art includes methods in which target molecules (eg ion channels, receptors, enzymes, etc.) are introduced into a lipid bilayer immobilized on a spherical, solid substrate.
  • the biochemical activity of these target molecules can then be demonstrated by indicator molecules located below the lipid bilayer [10].
  • the mostly solid substrate is, for example, a silica support on which a lipid bilayer made of lecithin is applied.
  • Such an arrangement is commercially available, inter alia, under the trade name Transil ⁇ from Nimbus Biotechnologie (Leipzig, Germany).
  • Transil ⁇ from Nimbus Biotechnologie (Leipzig, Germany).
  • the method described above has the disadvantage that the substrates coated accordingly and enriched with the target molecule have to be produced for the investigation of each target molecule. In addition, it cannot always be guaranteed that the
  • Target molecules display the same biochemical activities in this "artificial” environment as in the “natural” cellular environment.
  • the technical task here is to provide improved methods and devices in which, on the one hand, indicator systems that cannot be used for cellular assays (for example toxic detection reagents) can be used and, on the other hand, the examined target molecules are examined in their natural cellular environment can.
  • indicator systems that cannot be used for cellular assays (for example toxic detection reagents) can be used and, on the other hand, the examined target molecules are examined in their natural cellular environment can.
  • the technical problem is solved according to the invention in that devices and methods are used in which the biochemical activity to be investigated takes place spatially separated from the reaction demonstrating the biochemical activity. This makes it possible for e.g. Toxic detection reagents can be used for the detection of the biochemical activity, while the target molecule still develops the biochemical activity to be detected in its natural cellular environment. Biochemical activity and detection reaction are spatially decoupled.
  • the spatial separation is achieved according to the invention in that locations in which the biochemical activity to be examined or the detection reaction takes place are separated by at least two lipid membranes.
  • the lipid membranes are each occupied with connexins or innexins, so that gap junctions are formed between the membranes, which allow molecules or other signals to pass between the location of the biochemical activity and the location of the
  • Biochemical activity in the sense of the invention, is any biochemical activity that takes place in or on or on the surface of biological systems (eg cells) that can take place or can be catalyzed by the biological system.
  • Biochemical activities are, for example, chemical reactions catalyzed by proteins, signal transduction processes or changes in the physical or chemical state variables (such as pH value, ion concentration, metabolite concentrations, etc.).
  • the proteins, which are target molecules can be dissolved, for example freely in cytoplasm, or also membrane-bound, for example on the cytoplasmic membrane or on organelles.
  • Detection reactions in the sense of the invention, are chemical or biochemical reactions which can detect or make detectable the biochemical activity or its effects. Preferred detection reactions are color reactions, fluorescence or luminescence phenomena or even complex biochemical reactions which allow the detection of the biochemical activity.
  • Lipid membranes in the sense of the invention are lipid membranes as are known to the person skilled in the art from biological or non-biological systems. Lipid membranes preferably contain a lipid bilayer, which prevents the free passage of hydrophilic substances.
  • Lipid membranes in the sense of the invention can contain molecules, e.g. Proteins.
  • Lipid membranes can be spherical or planar. In particular, they can also be provided on a solid or gel-like surface.
  • a special embodiment of the lipid membrane is a lipid membrane made of lecithin.
  • Gap junctions in the sense of the invention, are connections between two spatial regions which are separated from one another by lipid membranes. Gap junctions are formed by proteins that span the lipid membranes and the space between the membranes and thus allow passage for substances and for charge exchange.
  • Membrane bodies in the sense of the invention are volume elements enclosed by a membrane and filled with a liquid. Membrane bodies according to the invention are preferably biological
  • Membrane bodies such as living cells. This includes cells that have been isolated from living tissue by dissociation (primary cultures). This also includes cells that are kept in culture as established cell lines, such as CHO cells, HEK cells, NIH3T3 cells, HeLa cells, but also transiently transfected cells or primary cells.
  • Biological membrane bodies in the sense of the invention, are also artificially produced membrane bodies in which, for example, a lipid bilayer encloses a limited volume of an aqueous medium (vesicles). These membrane bodies then preferably contain at least one biological component, for example a polypeptide embedded in the lipid bilayer, a membrane-bound enzyme, an ion channel or a G protein-coupled receptor.
  • Biological membrane bodies in the sense of the invention, can also be bacterial cells, fungal cells or cells of other unicellular or multicellular organisms.
  • Biological membrane bodies within the meaning of the invention are, for example, protoplasts of fungal cells and plant cells, which are achieved by removing external cell walls or similar structures.
  • Biological membrane bodies, in the sense of the invention are also membrane bodies which, such as synaptosomes, are split off or Union created from the membranes of living organisms or which have been obtained by combining such preparations with synthetic lipid vesicles.
  • “Dyes” in the sense of the invention are substances that can be detected optically by detection of the electromagnetic radiation emitted by them or that they have not absorbed.
  • Voltage-sensitive indicators in the sense of the invention, are substances which, depending on an applied electrical potential difference or the existing electrical potential, change their physical, optical or catalytic properties in such a way that they produce a detectable signal.
  • Voltage-sensitive indicators such as e.g. DIBAC [14].
  • pH-value-sensitive indicators in the sense of the invention are substances which, depending on the pH value, change their physical, optical or catalytic properties such that they produce a detectable signal.
  • Indicator dyes such as phenol red, bromothymol blue, bromophenol blue and many others. are well known to the expert.
  • Calcium-sensitive indicators in the sense of the invention, are substances that are present in the presence of
  • Calcium-sensitive indicators known to the person skilled in the art are e.g. the aequorin and other calcium-sensitive dyes such as FURA-2.
  • “Supported bilayer” are membranes that are on the one hand in contact with or in the immediate vicinity of a suitable solid, porous or gel-like material. This makes them mechanically more stable and resilient than self-supporting membranes.
  • Active ingredients in the sense of the invention are substances that can influence the activity of biological molecules.
  • Preferred active substances in the sense of the invention are those which specifically influence the activity of individual biological molecules or of groups of biological molecules.
  • Particularly preferred active ingredients are those which have the activity of
  • Affect receptors and / or ion channels can heal, alleviate or prevent certain clinical pictures of humans or animals.
  • Active substance screening in the sense of the invention, is the targeted search for chemical or biological substances which trigger a certain physiological effect in a certain biological system. This effect is preferably the modulation of the activity of a Target molecule or the healing, relief, or prevention of a certain disease state of an organism. Drug screening is preferably carried out in high-throughput screening (HTS) format. A large number of chemical substances are brought into contact with a target during the screening process and the effects of the chemical substances on the target are evaluated.
  • HTS high-throughput screening
  • the invention relates in particular to:
  • a measuring arrangement for the detection of a biochemical activity with a detection reaction for said biochemical activity characterized in that said biochemical activity takes place spatially separated from said detection reaction in the measuring arrangement, and the spatial separation is carried out by at least two lipid membranes which are with gap junctions are connected.
  • the change caused by the biochemical activity (e.g. a change in the concentration of a chemical substance or a change in voltage) continues through said gap junctions from the location of the biochemical activity to the location of the detection reaction. There, the change is amplified or made detectable by the detection reaction, if necessary, and finally detected.
  • the detection itself can be done anywhere.
  • the living cells used can e.g. Cells isolated from living tissues by dissociation (primary cultures). Cells which are kept in culture as established cell lines, such as CHO cells, HEK cells, NIH3T3 cells, HeLa cells, but also transiently transfected cells or primary cells, can also be used.
  • a measuring arrangement according to one of items 1 to 3, the detection reaction being a reaction with a dye.
  • a measuring arrangement according to one of items 1 to 3, the detection reaction being a reaction with a pH-sensitive indicator.
  • a measuring arrangement according to one of items 1 to 1, one of the lipid membranes being designed as a supported bilayer.
  • a measuring arrangement according to item 8 the supported bilayer being designed as a planar supported bilayer.
  • a measuring arrangement according to point 8 the supported bilayer being designed as a spherical supported bilayer.
  • a measuring arrangement according to point 8 the supported bilayer being applied to a spherical silica support.
  • a measuring arrangement according to point 8 the supported bilayer being located on a Transil ⁇ particle.
  • a measuring arrangement according to one of items 1 to 7, wherein at least one lipid membrane spans the end of a capillary. With such an arrangement, a detection reaction can take place in a glass capillary, as currently e.g. is used for so-called "patch-clamp” applications [12].
  • a device for the determination of biochemical activities comprising a multiplicity of measuring arrangements according to one of the items 1 to 13.
  • a method for detecting a biochemical activity with a detection reaction characterized in that said biochemical activity is spatially separated from said detection reaction, and that the spatial separation is carried out by at least two lipid membranes, and the lipid membranes are connected with gap junctions.
  • FIG. 1 shows an arrangement according to the invention for determining biological activity with a target molecule (simultaneously the location of the biochemical activity) (1), the location of the detection reaction (2) spatially separated therefrom, a first (3) and a second (4) lipid membrane,
  • the location of the biochemical reaction (1) is spatially separated from the location of the detection reaction (2) and yet functionally connected via gap junctions (6).
  • the first lipid membrane (3) is planar.
  • Target molecule (simultaneously the location of the biochemical activity) (1), the spatially separate location of the detection reaction (2), a first (3) and a second (4) lipid membrane, connexins (5) and gap junctions (6).
  • the detection reaction takes place below the lipid membrane (3) on a particle (eg on a transit particle) which has a core (7) and a lipid membrane (3). Two membrane bodies coupled to the particle via gap junctions are shown.
  • Example 1 Supported bilayer membranes with built-in connexins
  • Connexins are purified from the liver and renatured as described in the literature [4]. The connexins are inserted onto transit particles using the NIMBUS method in supported bilayer membrane. The procedure can of course not only be performed with Connexin Cx32 from the liver, but also with other Connexins such as e.g. Connexin Cx43 from cardiac muscle, and practically all other connexins can be carried out as well as with proteins of comparable structure from other organisms, e.g. Innexins from invertebrates or plasmodesmata from plants.
  • Connexon potassium channel particles described above are brought into contact with dissociated hepatocytes.
  • Methods for obtaining dissociated hepatocytes are known to the person skilled in the art. Since hepatocytes also contain Connexin Cx32, they attach to the particles and form gap junctions with them. The gap junctions open and form a conductive connection between the hepatocytes and the particles. This is demonstrated by a
  • Dye e.g. Lucifer Yellow [13] diffuses into the cells if the particles have previously been loaded with this dye.
  • Example 3 Activity determination of a nicotinic acetylcholine receptor
  • HEK cells are transfected with cDNA for the expression of connexin 32 and at the same time or subsequently with cDNA for the expression of a ligand-controlled ion channel, a nicotinic gene
  • Acetylcholine receptor transfected.
  • the methods for producing such cells and for the functional expression of the ion channel are generally known and belong to the specialist knowledge of the person skilled in the art.
  • Particles as well as the cells have Connexin 32.
  • the particles are previously loaded with a voltage-sensitive, membrane-soluble dye (eg DIBAC [14]).
  • Cells that have a second messenger-coupled receptor are additionally transfected with a connexin, so that they form this connexin in addition to the native membrane proteins in their membrane. They are brought into contact with particles from example 1 which have been produced using a compatible connexin. The cells attach themselves to the particles. The gap junctions create a connection between the cells and the interior of the particles. If the second messenger-coupled receptors are activated in the cells, the intracellular reaction products also diffuse into the particles and can be detected there by a corresponding chemical reaction. For example, this could be the detection of an increased calcium concentration by FURA-2, as is documented in many places in the literature as a detection method.
  • Dissociated heart cells have the connexin Cx43 [15]. Therefore, they can attach to particles from Example 1 that have been produced using the Connexin Cx43. If these cells are now treated with active substances which activate receptors present in the heart cells, the effects can be demonstrated, for example, using the methods given in Examples 3 and 4.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis von biochemischer Aktivität mit einer Nachweisreaktion, wobei die nachzuweisende biochemische Aktivität räumlich getrennt von der Nachweisreaktion verläuft. Die räumliche Trennung wird durch Lipidmembranen und Gap Junctions erreicht.

Description

Vorrichtungen zum Nachweis biochemischer Aktivität enthaltend Gap Junctions
Die Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis von biochemischer Aktivität mit einer Nachweisreaktion, wobei die nachzuweisende biochemische Aktivität räumlich getrennt von der Nachweisreaktion verläuft. Die räumliche Trennung wird durch Lipidmembranen und Gap Junctions erreicht.
Stand der Technik
Connexine. Connexone und Gap Junctions
Dem Fachmann bekannt sind biologische Protein-Moleküle, sogenannte Connexine, welche bei der Kommunikation zwischen lebenden Zellen eine besondere Rolle spielen. Mittlerweile werden etwa fünfzehn verschiedene Connexine aufgrund ihrer Aminosäuresequenz unterschieden [1][2]. Connexine kommen in allen Vertebraten vor und werden in der Regel mit Abkürzung wie z.B. Cx26 bezeichnet. Hierbei gibt die Zahl die chromatographische Größe der Connexine in kD an. Bekannt sind bislang Connexine mit einem Molekulargewicht zwischen 26 und 56 kD. Alternativ zu dieser Nomenklatur hat sich eine zweite durchgesetzt, die die Connexine anhand von Struktur- merkmalen in wenigstens 3 Klassen a, b und c einteilt und dann die entsprechenden Connexine in den einzelnen Klassen durchnummeriert.
In der Zellmembran lagern sich jeweils sechs Connexine zu einem Connexon zusammen. Ein Connexon ist eine ringförmige Struktur, die die Zellmembran durchquert und grundsätzlich in der Lage ist, einen sehr weiten, unspezifϊschen Ionenkanal oder eine wassergefüllte Pore zu bilden. Dabei sind diese Poren aber in der Regel geschlossen, solange sich das Connexon in der Membran einer einzelnen, gesunden Zelle befindet. Berühren sich jedoch zwei Zellen, die in ihrer Membran jeweils miteinander kompatible Connexone aufweisen, dann kommt es zwischen zwei Connexonen der gegenüberliegenden Zellen zur Bildung einer Gap Junction (oder auch elektrische Synapse bezeichnet), der nunmehr die beiden Membranen und den Abstand zwischen den Zellmembranen überbrückt. Die Bildung einer Gap Junction erfolgt bei Kontakt in der Regel in wenigen Minuten.
Der ausgebildete Gap Junction Kanal ist eine Struktur aus in der Regel 12 identischen oder verschiedenen Connexinen, bzw. aus zwei Connexonen. Der Kanal besitzt eine ggf. verschließbare zentrale Pore mit einem Durchmesser von etwa 1,5 bis 2 nm. Der wesentliche Unterschied zu anderen Membrankanälen ist, das Gap Junction Kanäle zwei aneinanderliegende Zellmembranen " durchziehen und damit nicht eine Verbindung zwischen dem Zellinneren mit dem Außenmedium, sondern eine Verbindung zwischen den intrazellulären Medien der beiden Zellen herstellen. Dabei ermöglichen Gap Junction Kanäle anorganischen Ionen und kleinen wasserlöslichen Molekülen bis zu einer molekularen Masse von ca. 1000 Dalton den direkten Durchgang von dem Cytoplasma der einen Zelle ins Cytoplasma der anderen Zelle. Damit sind die zwei Zellen sowohl mechanisch, elektrisch als auch metabolisch verbunden. Gap Junction Kanäle gehören zu den epi- thelialen Zeil-Zeil- Verbindungen und finden sich in nahezu allen Epithelien und vielen anderen
Gewebetypen. In der Regel sind viele Gap Junction Kanäle in Form von Feldern organisiert, wobei diese Strukturen dann als Gap Junction im eigentlichen Sinne bezeichnet werden.
Die Gap Junction Kanäle verbundener Zellen sind in der Regel geöffnet und die Connexine gestreckt. Erleidet eine Zelle einen massiven Calciumeinstrom von außen, etwa durch eine Verlet- zung, so wird die Verbindung zu benachbarten Zellen unterbrochen indem sich die Connexine allosterisch miteinander verwinden.
Connexine können verfügbar gemacht werden durch Aufreinigen von Zellmembranen aus Zellen, die Connexine enthalten, z. B. Augenlinse, Herzmuskel, glatte Muskulatur, oder Epithelzellen sowie durch gentechnische Expression der Connexine in Bakterien, Hefen oder anderen Zellen. Es ist weiter bekannt, dass Connexine durch Verbindung mit einem Marker, wie zum Beispiel einem fluoreszierenden Proteinfragment, versehen werden können so dass ihr Vorhandensein in einer Zellmembran mit einfachen optischen Verfahren nachweisbar wird [3].
Es sind dem Fachmann Verfahren bekannt, mit denen Connexone in künstliche Membranen oder andere zellfreie Systeme eingebaut werden können [4]. Diese Connexone und Gap Junctions wei- sen häufig noch die gleichen Eigenschaften - wie z.B. Porengröße, Ionenselektivität, elektrisches
Verhalten - auf, wie in ihrer natürlichen Umgebung. Es ist bekannt, dass es auch zwischen zwei Connexonen, die in künstliche Membranen eingelagert sind, bei Kontakt der Membranflächen zur Ausbildung eines funktionsfähigen Gap Junction Kanals kommt [5].
Weiterhin ist bekannt, dass Invertebraten eine funktionell ähnliche Klasse von Membranproteinen aufweisen, die Innexine genannt werden [6]. Die hiermit gebildeten Kanäle besitzen allerdings eine größere Pore, die Molekülen bis zu einem Gewicht von 2000 Dalton den Durchgang ermöglicht. Innexine bilden auch Gap Junctions im Sinne der Erfindung.
Es ist weiterhin bekannt, dass auch in Pflanzen Verbindungen zwischen den Zellen vorkommen, die ähnliche Eigenschaften aufweisen wie Gap Junctions und die als Plasmodesmata bezeichnet werden. Diese überspannen ebenfalls die Zellzwischenwand benachbarter Zellen und ermöglichen ebenfalls einer begrenzten Anzahl von Ionen und kleiner Moleküle die Passage von Zelle zu Zelle. Im Gegensatz zu den Kanälen bei tierischen Lebewesen sind die Plasmodesmata jedoch von der Plasmamembran begrenzt. Auch diese Strukturen werden im Sinne der Erfindung unter dem Oberbegriff Gap Junction zusammengefasst.
Zelluläre Assays
Bekannt sind weiterhin zelluläre Assays, bei welchen eine bestimmte biochemische Aktivität, die innerhalb einer lebenden Zelle stattfinden, durch geeignete Nachweisreaktionen, welche ebenfalls innerhalb der Zelle stattfinden, nachgewiesen werden. Bekannt sind insbesondere Verfahren, in denen Reaktionsprodukte der biochemischen Aktivität innerhalb der Zelle mit Indikatormolekülen reagieren, welche dann ein leicht detektierbares Signal, z.B. ein Lichtsignal oder eine Farbänderung, hervorrufen. Ein häufig verwendetes Indikatormolekül ist z.B. das Aequorin [7].
Diesen zellulären Assays ist gemeinsam, dass sie auf die Verwendung von Indikatormolekülen beschränkt sind, die nicht toxisch auf die Zellen wirken und die innerhalb der lebenden Zelle ihre Aufgabe erfüllen können. Anderenfalls würden die Zellen durch die toxischen Indikatormoleküle bereits vor oder auch während des Assays so geschädigt, dass der eigentliche Test gar nicht mehr durchgeführt werden könnte.
Assays an künstlichen Lipidmembranen
Weiterhin ist bekannt, dass Ionenkanälen, Rezeptoren und andere Targetmoleküle in künstliche Lipidmembranen eingebaut werden, und dort durch geeignete Experimente funktionell untersucht werden können [8]. Interessant sind besonders jene Verfahren, die eine künstliche Lipidmembran durch ein geeignetes Substrat in der Weise zu stabilisieren, dass sie mechanisch fester, länger halt- bar, und reproduzierbarer werden [9]. Als Substrate finden hier zum Beispiel Silicagele Verwendung, die ggf. zur Verbesserung der Stabilität und Fluidität der Membran mit einer polymeren Zwischenschicht versehen worden sind [10]. Auch können Bilayer auf dem Substrat mit geeigneten Kettenmolekülen stabilisiert werden ('tethered bilayers') [11].
Im Stand der Technik sind Verfahren enthalten, bei denen Targetmoleküle (z.B. Ionenkanäle, Re- zeptoren, Enzyme, etc.) in eine auf einem sphärischen, festen Substrat immobilisierte Lipiddoppel- schicht eingebracht werden. Die biochemische Aktivität dieser Targetmoleküle kann dann durch unterhalb der Lipiddoppelschicht befindliche Indikatormoleküle nachgewiesen werden [10]. Das zumeist feste Substrat ist beispielsweise ein Silica-Träger auf welchem eine Lipiddoppelschicht aus Lecitin aufgebracht ist. Eine solche Anordnung ist u.A. kommerziell erhältlich unter dem Handelsnamen Transil^ der Firma Nimbus Biotechnologie (Leipzig, Germany). Zum Nachweis der biochemischen Aktivität von Targetmolekülen (welche direkt in die Lipiddoppelschicht ein- gelagert sind) werden hierbei unterhalb der Lipiddoppelschicht immobilisierte Calcium-sensitive oder Phosphat-sensitive Farbstoffe verwendet.
Das vorstehend beschriebene Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass für die Untersuchung eines jeden Targetmoleküls die entsprechend beschichteten und mit dem Targetmolekül angereicherten Substrate hergestellt werden müssen. Außerdem kann nicht immer gewährleistet werden, dass die
Targetmoleküle in dieser "künstlichen" Umgebung die gleichen biochemischen Aktivitäten entfaltet, wie in der "natürlichen" zellulären Umgebung.
Beschreibung der Erfindung
Ausgehend von dem oben beschriebenen Stand der Technik stellt sich hier die technische Aufgabe, verbesserte Verfahren und Vorrichtungen bereitzustellen, bei denen einerseits für zelluläre Assays nicht einsetzbare Indikatorsysteme (z.B. toxische Nachweisreagentien) angewendet werden können und andererseits die untersuchten Targetmoleküle in ihrer natürlichen zellulären Umgebung untersucht werden können.
Die technische Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass Vorrichtungen und Verfahren zur Anwendung kommen, bei denen die zu untersuchende biochemische Aktivität räumlich getrennt stattfindet von der die biochemische Aktivität nachweisenden Reaktion. Dadurch ist es möglich, dass z.B. toxische Nachweisreagentien für den Nachweis der biochemischen Aktivität verwendet werden können, während das Targetmolekül immer noch in seiner natürlichen zellulären Umgebung die nachzuweisende biochemische Aktivität entfaltet. Biochemische Aktivität und Nachweisreaktion sind räumlich entkoppelt.
Die räumliche Trennung wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, dass Orte, in denen die zu untersuchende biochemische Aktivität bzw. die Nachweisreaktion stattfindet, durch mindestens zwei Lipidmembranen getrennt sind. Die Lipidmembranen sind jeweils mit Connexinen oder Innexinen besetzt, sodass sich zwischen den Membranen Gap Junctions ausbilden, die einen Durchtritt von Molekülen oder anderen Signalen zwischen dem Ort der biochemischen Aktivität und dem Ort der
Nachweisreaktion ermöglichen.
"Biochemische Aktivität", im Sinne der Erfindung, ist jedwede biochemische Aktivität, die in oder an oder an der Oberfläche von biologischen Systemen (z.B. Zellen) stattfindet, stattfinden kann oder durch das biologische System katalysiert werden kann. Biochemische Aktivitäten sind z.B. durch Proteine katalysierte chemische Reaktionen, Signaltransduktionsvorgänge oder Änderungen der physikalischen oder chemischen Zustandsgrößen (wie z.B. pH Wert, Ionenkonzentration, Me- tabolitkonzentrationen, etc.). Die Proteine, welche Targetmoleküle darstellen, können gelöst, z.B. frei in Cytoplasma, oder auch membrangebunden, z.B. an der Cytoplasmamembran oder an Organellen, vorliegen.
"Nachweisreaktionen", im Sinne der Erfindung, sind chemische oder biochemische Reaktionen, welche die biochemische Aktivität oder deren Auswirkungen nachweisen können bzw. detektierbar machen. Bevorzugte Nachweisreaktionen sind Farbreaktionen, Fluoreszenz- oder Lumineszenzerscheinungen oder auch komplexe biochemische Reaktionen, die den Nachweis der biochemischen Aktivität erlauben.
"Lipidmembranen", im Sinne der Erfindung, sind Lipidmembranen, wie sie dem Fachmann aus biologischen oder nicht-biologischen Systemen bekannt sind. Lipidmembranen enthalten bevor- zugt eine Lipiddoppelschicht, welche den freien Durchtritt von hydrophilen Substanzen verhindert.
Lipidmembranen im Sinne der Erfindung können Moleküle, z.B. Proteine, eingelagert haben. Lipidmembranen können sphärisch oder auch planar ausgeführt sein. Sie können insbesondere auch auf einer festen oder Gel-artigen Unterlage vorgesehen sein. Eine besondere Ausführungsform der Lipidmembran ist eine Lipidmembran aus Lecitin.
"Gap Junctions", im Sinne der Erfindung, sind Verbindungen zwischen zwei räumlichen Bereichen, die durch Lipidmembranen voneinander getrennt sind. Gap Junctions werden von Proteinen ausgebildet, welche die Lipidmembranen und den Zwischenraum zwischen den Membranen überspannen und so einen Durchgang für Stoffe und für Ladungsaustausch ermöglichen.
"Membrankörper", im Sinne der Erfindung, sind von einer Membran umschossene, mit einer Flüs- sigkeit gefüllte Volumenelemente. Erfindungsgemäße Membrankörper sind bevorzugt biologische
Membrankörper, wie z.B. lebende Zellen. Dazu gehören Zellen, die aus lebendem Gewebe durch Dissoziation isoliert wurden (Primärkulturen). Dazu gehören ebenso Zellen, die als etablierte Zelllinien in Kultur gehalten werden, wie CHO-Zellen, HEK-Zellen, NIH3T3-Zellen, HeLa-Zellen aber auch transient transfizierte Zellen oder Primärzellen. Biologische Membrankörper, im Sinne der Erfindung sind außerdem künstlich erzeugte Membrankörper, bei welchen z.B. eine Lipiddoppelschicht ein begrenztes Volumen eines wässrigen Mediums einschließt (Vesikel). Diese Membrankörper enthalten dann vorzugsweise mindestens eine biologische Komponente, z.B. ein in der Lipiddoppelschicht eingelagertes Polypeptid, ein membranständiges Enzym, einen Ionenkanal oder einen G-Protein gekoppelten Rezeptor. Biologische Membrankörper, im Sinne der Erfindung können auch bakterielle Zellen, Pilzzellen oder Zellen anderer einzelliger oder mehrzelliger Organismen sein. Biologische Membrankörper, im Sinne der Erfindung sind, z.B. auch Protoplasten von Pilzzellen und Pflanzenzellen, die durch Entfernen außenliegender Zellwände oder ähnlicher Strukturen erzielt werden. Biologische Membrankörper, im Sinne der Erfindung sind weiterhin auch Membrankörper, die - wie z.B. Synaptosomen - durch Abspaltung oder Vereinigung aus den Membranen von lebenden Organismen erzeugt oder die durch die Vereinigung solcher Präparate mit synthetischen Lipidvesikeln erhalten worden sind.
"Farbstoffe", im Sinne der Erfindung, sind Stoffe, die optisch durch Detektion der von ihnen ausgesandten oder der durch sie nicht absorbierten elektromagnetischen Strahlung nachgewiesen wer- den können.
"Spannungs-sensitive Indikatoren", im Sinne der Erfindung, sind Stoffe, die in Abhängigkeit einer anliegenden elektrischen Potentialdifferenz oder des vorliegenden elektrischen Potentials derart ihre physikalischen, optischen oder katalytischen Eigenschaften ändern, dass diese ein detektierbares Signal hervorrufen.
Dem Fachmann bekannt sind spannungs-sensitive Indikatoren wie z.B. DIBAC [14].
"pH- Wert-sensitive Indikatoren", im Sinne der Erfindung, sind Stoffe, die in Abhängigkeit des pH- Wertes derart ihre physikalischen, optischen oder katalytischen Eigenschaften ändern, dass diese ein detektierbares Signal hervorrufen. Solche Indikatorfarbstoffe, wie zB Phenolrot, Bromthymolblau, Bromphenolblau u.v.a. sind dem Fachmann zahlreich bekannt.
"Calcium-sensitive Indikatoren", im Sinne der Erfindung, sind Stoffe, die in Anwesenheit von
Calcium derart ihre physikalischen, optischen oder katalytischen Eigenschaften ändern, dass diese ein detektierbares Signal hervorrufen. Dem Fachmann bekannte Calcium-sensitive Indikatoren sind z.B. das Aequorin und andere Calcium-sensitive Farbstoffe wie z.B FURA-2.
"Supported Bilayer" sind Membranen, die sich auf der einen Seite in Kontakt mit oder in unmittel- barer Nähe von einem geeigneten festen, porösen oder gel-artigen Material befinden. Dadurch werden sie gegenüber frei tragenden Membranen mechanisch stabiler und belastbarer.
"Wirkstoffe", im Sinne der Erfindung, sind Stoffe, welche die Aktivität von biologischen Molekülen beeinflussen können. Bevorzugte Wirkstoffe, im Sinne der Erfindung, sind solche, die spezifisch die Aktivität von einzelnen biologischen Molekülen oder von Gruppen von biologischen Molekülen beeinflussen. Besonders bevorzugte Wirkstoffe sind solche, welche die Aktivität von
Rezeptoren und/oder Ionenkanälen beeinflussen. Ganz besonders bevorzugte Wirkstoffe vermögen bestimmte Krankheitsbilder des Menschen oder von Tieren zu heilen, zu lindem oder zu verhindern.
"Wirkstoff-Screening", in Sinne der Erfindung, ist die zielgerichtete Suche nach chemischen oder biologischen Substanzen, die bei einem bestimmten biologischen System einen bestimmten physiologischen Effekt auslösen. Dieser Effekt ist bevorzugt die Modulation der Aktivität eines Targetmoleküls oder die Heilung, Linderung, oder Verhinderung eines bestimmten Krankheitszustands eines Organismus. Wirkstoff-Screening wird bevorzugt im High-Throughput-Screening (HTS) Format durchgeführt. Hierbei wird eine große Anzahl von chemischen Substanzen während des Screening- Verfahrens mit einem Target in Kontakt gebracht und die Auswirkungen der chemi- sehen Substanzen auf das Target wird ausgewertet.
Die Erfindung betrifft insbesondere:
1. Eine Messanordnung zum Nachweis einer biochemischen Aktivität mit einer Nachweisreaktion für besagte biochemische Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass in der Messanordnung die besagte biochemische Aktivität räumlich getrennt von besagter Nach- weisreaktion erfolgt, und die räumliche Trennung durch mindestens zwei Lipidmembranen erfolgt welche mit Gap Junctions verbunden sind.
Die durch die biochemische Aktivität hervorgerufene Änderung (z.B. eine Änderung der Konzentration einer chemischen Substanz oder eine Spannungsänderung) setzt sich durch besagte Gap Junctions vom Ort der biochemischen Aktivität zum Ort der Nachweisreaktion fort. Dort wird die Änderung durch die Nachweisreaktion ggf. verstärkt bzw. detektierbar gemacht und schließlich detektiert. Die Detektion selbst kann irgendwo erfolgen.
2. Eine Messanordnung nach Punkt 1, wobei besagte biochemische Aktivität in einem Membrankörper erfolgt.
3. Eine Messanordnung nach Punkt 1, wobei besagte biochemische Aktivität in einer lebenden Zelle erfolgt.
Die verwendeten lebenden Zellen können z.B. Zellen, die aus lebenden Geweben durch Dissoziation isoliert wurden (Primärkulturen) sein. Weiterhin können Zellen, die als etablierte Zelllinien in Kultur gehalten werden, wie CHO-Zellen, HEK-Zellen, NIH3T3- Zellen, HeLa-Zellen aber auch transient transfizierte Zellen oder Primärzellen verwendet werden.
4. Eine Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nachweisreaktion eine Reaktion mit einem Farbstoff ist.
5. Eine Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nachweisreaktion eine Reaktion mit einem Calcium-sensitiven Indikator ist. 6. Eine Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nachweisreaktion eine Reaktion mit einem Spannungs-sensitiven Indikator ist.
7. Eine Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nachweisreaktion eine Reaktion mit einem pH- Wert-sensitiver Indikator ist.
8. Eine Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 1, wobei eine der Lipidmembranen als supported bilayer ausgeführt ist.
9. Eine Messanordnung nach Punkt 8, wobei die supported bilayer als planare supported bilayer ausgeführt ist.
10. Eine Messanordnung nach Punkt 8, wobei die supported bilayer als sphärische supported bilayer ausgeführt ist.
11. Eine Messanordnung nach Punkt 8, wobei die supported bilayer auf einem sphärischen Silica-Träger aufgebracht ist.
12. Eine Messanordnung nach Punkt 8, wobei sich die supported bilayer auf einem Transil^- Partikel befindet.
13. Eine Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 7, wobei mindestens eine Lipidmembran das Ende einer Kapillare überspannt. Mit einer solchen Anordnung kann eine Nachweisreaktion in einer Glaskapillare stattfinden, wie sie derzeit z.B. für sogenannte "patch-clamp" Anwendungen verwendet wird [12].
14. Eine Vorrichtung zur Bestimmung von biochemischen Aktivitäten enthaltend eine Vielzahl von Messanordnungen gemäß einem der Punkte 1 bis 13.
15. Ein Verfahren zum Nachweis einer biochemischen Aktivität mit einer Nachweisreaktion, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte biochemische Aktivität räumlich getrennt von besagter Nachweisreaktion erfolgt, und dass die räumliche Trennung durch mindestens zwei Lipidmembranen erfolgt, und die Lipidmembranen mit Gap Junctions verbunden sind.
16. Verfahren nach Punkt 15, wobei besagte biochemische Aktivität eine Reaktion auf das Vorhandensein eines Wirkstoffs darstellt.
17. Verwendung einer Messanordnung nach einem der Punkte 1 bis 13 oder einer Vorrichtung nach Punkt 14 zum W kstoff-Screening Kurze Beschreibung der Abbildungen
Figur 1
zeigt eine erfindungsgemäße Anordnung zur Bestimmung von biologischer Aktivität mit einem Targetmolekül (gleichzeitig der Ort der biochemischen Aktivität) (1), dem davon räumlich ge- trennten Ort der Nachweisreaktion (2), einer ersten (3) und einer zweiten (4) Lipidmembran,
Connexinen (5) und Gap Junctions (6). Der Ort der biochemischen Reaktion (1) ist räumlich getrennt vom Ort der Nachweisreaktion (2) und dennoch funktioneil über Gap Junctions (6) verbunden. Die erste Lipidmembran (3) istplanar ausgeführt.
Figur 2
zeigt eine erfindungsgemäße Anordnung zur Bestimmung von biologischer Aktivität mit einem
Targetmolekül (gleichzeitig der Ort der biochemischen Aktivität) (1), dem davon räumlich getrennten Ort der Nachweisreaktion (2), einer ersten (3) und einer zweiten (4) Lipidmembran, Connexinen (5) und Gap Junctions (6). Die Nachweisreaktion findet unterhalb der Lipidmembran (3) auf einem Partikel (z.B. auf einem Transit Partikel) statt, der einen Kern (7) und eine Lipid- membran (3) aufweist. Es sind zwei über Gap Junctions an das Partikel gekoppelte Membrankörper dargestellt.
Beispiele
Beispiel 1: Supported Bilayer Membranen mit eingebauten Connexinen
Es werden Connexine aus der Leber aufgereinigt und renaturiert, wie es in der Literatur beschrieben ist [4]. Die Connexine werden nach dem Verfahren von NIMBUS in supported bilayer Mem- brau auf Transit Partikel eingefügt. Das Verfahren kann natürlich nicht nur mit Connexin Cx32 aus der Leber, sondern sinngemäß auch mit anderen Connexinen wie z.B. Connexin Cx43 aus Herzmuskel, und praktisch allen anderen Connexinen durchgeführt werden sowie mit Proteinen vergleichbarer Struktur aus anderen Organismen, wie z.B. Innexinen aus Invertebraten oder Plasmodesmata aus Pflanzen.
In vielen Fällen ist es wichtig, das Membranpotential einstellen zu können. Deshalb ist es zweckmäßig, nach demselben Verfahren in die Membran zusätzlich einen Kalium-selektiven Ionenkanal einzufügen, der es erlaubt, mit Hilfe der externen Kaliumkonzentration das Membranpotential des Transil^ Partikeln grob einzustellen. In dieser Weise modifizierte Transit Partikel werden im weiteren als "Connexon-Kaliumkanal Partikel" bezeichnet.
Beispiel 2: Kopplung von Transil^ Partikeln an Hepatocyten
Die oben beschriebenen Connexon-Kaliumkanal Partikel werden mit dissoziierten Hepatocyten in Kontakt gebracht. Verfahren zur Gewinnung von dissoziierten Hepatocyten sind dem Fachmann bekannt. Da Hepatocyten ebenfalls das Connexin Cx32 enthalten, lagern sie sich an die Partikel an und bilden mit ihnen Gap Junctions aus. Die Gap Junctions öffnen sich und bilden eine leitende Verbindung zwischen den Hepatocyten und den Partikel. Dies wird nachgewiesen, indem ein
Farbstoff, z.B. Lucifer Yellow [13] in die Zellen hinein diffundiert, wenn die Partikel zuvor mit diesem Farbstoff beladen worden sind.
Beispiel 3: Aktivitätsbestimmung eines nikotinergen Acetylcholinrezeptors
Es werden HEK Zellen mit cDNA zur Expression des Connexin 32 transfiziert und zugleich oder anschließend mit cDNA zur Expression eines ligandengesteuteren Ionenkanals, eines nikotinergen
Acetylcholinrezeptors, transfiziert. Die Verfahren zur Herstellung derartiger Zellen und zur funk- tionellen Expression des Ionenkanals, sind allgemein bekannt und gehören zum Fachwissen des Durchschnittsfachmanns.
Zellen, welche beide Proteine exprimieren, werden nun mit den Partikeln aus Beispiel 1 in Kontakt gebracht. Sie lagern sich an die Partikel an und bilden mit diesen Gap Junctions aus, da sowohl die
Partikel als auch die Zellen das Connexin 32 besitzen. Die Aktivierung des nikotinergen Acetylcholinrezeptors mit einem geeigneten Agonisten, wie z.B. Nikotin, führt zu einer Änderung des Membranpotentials. Diese wird über die Gap Junctions auf die Membran des Partikels übertragen und wird optisch nachgewiesen werden. Hierfür werden die Partikel zuvor mit einem spannungssensitiven membranlöslichen Farbstoff (z.B. DIBAC [14]) beladen.
Beispiel 4: Second messenger gekoppelte Rezeptoren
Zellen, die einen second messenger gekoppelten Rezeptor besitzen, werden zusätzlich mit einem Connexin transfiziert, so dass sie dieses Connexin zusätzlich zu den nativ vorhandenen Membranproteinen in ihrer Membran ausbilden. Sie werden mit Partikeln aus Beispiel 1 in Kontakt ge- bracht, die mit einem dazu kompatiblen Connexin hergestellt worden sind. Die Zellen lagern sich an die Partikel an. Durch die Gap Junctions wird eine Verbindung zwischen den Zellen und dem Innern der Partikel hergestellt. Werden nun die second messenger gekoppelten Rezeptoren in den Zellen aktiviert, so diffundieren die intrazellulären Reaktionsprodukte auch in die Partikel hinein und können dort durch eine entsprechende chemische Reaktion nachgewiesen werden. Zum Bei- spiel könnte dies der Nachweis einer erhöhten Calciumkonzentration durch FURA-2 sein, wie es in der Literatur an vielen Stellen als Nachweisverfahren ausführlich dokumentiert ist.
Beispiel 5; Experimente an dissoziierten Herzzellen
Dissoziierte Herzzellen besitzen nativ das Connexin Cx43 [15]. Deshalb können sie sich an Partikel aus Beispiel 1 anlagern, die unter Verwendung des Connexin Cx43 hergestellt worden sind. Werden diese Zellen nun mit Wirkstoffen behandelt, die in den Herzzellen vorhandene Rezeptoren aktivieren, dann können die Effekte beispielsweise mit den in Beispiel 3 und 4 angegebenen Verfahren nachgewiesen werden.
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Claims

Patentansprtiche
1. Messanordnung zum Nachweis einer biochemischen Aktivität mit einer Nachweisreaktion für besagte biochemische Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass in der Messanordnung die besagte biochemische Aktivität räumlich getrennt von besagter Nachweisreaktion erfolgt, und die räumliche Trennung durch mindestens zwei Lipidmembranen erfolgt welche mit Gap Junctions verbunden sind.
2. Messanordnung nach Anspruch 1, wobei besagte biochemische Aktivität in einem Membrankörper erfolgt.
3. Messanordnung nach Anspruch 1, wobei besagte biochemische Aktivität in einer lebenden Zelle erfolgt.
4. Messanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nachweisreaktion eine Reaktion mit einem Farbstoff ist.
5. Messanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nachweisreaktion eine Reaktion mit einem Calcium-sensitiven Indikator ist.
6. Messanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nachweisreaktion eine Reaktion mit einem Spannungs-sensitiven Indikator ist.
7. Messanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nachweisreaktion eine Reaktion mit einem pH- Wert-sensitiver Indikator ist.
8. Messanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei eine der Lipidmembranen als supported-bilayer ausgeführt ist.
9. Messanordnung nach Anspruch 8, wobei die supported bilayer als planare supported bilayer ausgeführt ist.
10. Messanordnung nach Anspruch 8, wobei die supported bilayer als sphärische supported bilayer ausgeführt ist.
11. Messanordnung nach Anspruch 8, wobei die supported bilayer auf einem sphärischen Silica-Träger aufgebracht ist.
12. Messanordnung nach Anspruch 8, wobei sich die supported bilayer auf einem Transil^- Partikel befindet.
13. Messanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei mindestens eine Lipidmembran das Ende einer Kapillare überspannt.
14. Vorrichtung zur Bestimmung von biochemischen Aktivitäten enthaltend eine Vielzahl von Messanordnungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13.
15. Verfahren zum Nachweis einer biochemischen Aktivität mit einer Nachweisreaktion, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte biochemische Aktivität räumlich getrennt von besagter Nachweisreaktion erfolgt, und dass die räumliche Trennung durch mindestens zwei Lipidmembranen erfolgt, und die Lipidmembranen mit Gap Junctions verbunden sind.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei besagte biochemische Aktivität eine Reaktion auf das Vorhandensein eines Wirkstoffs darstellt.
17. Verwendung einer Messanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder einer Vorrichtung nach Anspruch 14 zum Wirkstoff- Screening.
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