WO2005045007A1 - 幹細胞の凍結保存法およびシステム - Google Patents

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WO2005045007A1
WO2005045007A1 PCT/JP2004/016167 JP2004016167W WO2005045007A1 WO 2005045007 A1 WO2005045007 A1 WO 2005045007A1 JP 2004016167 W JP2004016167 W JP 2004016167W WO 2005045007 A1 WO2005045007 A1 WO 2005045007A1
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stem cells
dmso
present
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PCT/JP2004/016167
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French (fr)
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Norio Nakatsuji
Hirofumi Suemori
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Kyoto University NUC
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Kyoto University NUC
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
    • A01N1/122—Preservation or perfusion media
    • A01N1/125—Freeze protecting agents, e.g. cryoprotectants or osmolarity regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]

Definitions

  • the present invention is in the field of stem cells. More particularly, the present invention relates to a method for the preservation of stem cells (especially primate embryonic stem cells (hereinafter also referred to as ES cells)).
  • stem cells especially primate embryonic stem cells (hereinafter also referred to as ES cells)).
  • ES cells Stem cells, particularly ES cells, which are at the center of regenerative medicine, have become increasingly important in recent years because of their potential for medical applications. Human ES cells are particularly important among them, but their establishment or stable passage maintenance is difficult and their efficient use is inhibited. Primate ES cells, including humans, need to establish ES cell lines efficiently from a small number of blastocysts that require very little blastocyst supply. In the conventional method, the efficiency of erection from a blastocyst is about 10 to 30%!
  • ES cells are cultivated by culturing inner cell mass (ICM) cells, which are undifferentiated groups of cells that will be present in the developmental stage of embryos, usually called blastocysts. The obtained cell line.
  • ICM inner cell mass
  • ES cells were established by M. J. Evans and M. H. Kaufman (Non-patent Document 1 in 1981), followed by G. R. Martin (Non-patent Document 2) as a cell line that is possibly capable of functioning in mice.
  • Non-patent Document 4 A method have been developed (Non-patent Document 4). This method has attracted attention because it is more efficient than the slow cooling method and is simple. However, the straw-shaped container used in this method has the disadvantage that the risk of contamination has increased significantly.
  • Non-Patent Document 1 M.J.Evans & M.H.Kauftnan: Nature, 292, 154, 1981
  • Non-Patent Document 2 G.R.Martin: Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78,7634,1981
  • Non-Patent Document 3 Freshney R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic
  • Non-Patent Document 4 Reubinoff BE, Para MF, Vajta G, Trounson AO., Hum Reprod. 2001 Oct; 16 (10): 2187-94
  • Non-Patent Document 5 Stem cell 'clone research protocol
  • An object of the present invention is to provide a simple technique capable of cryopreserving stem cells (particularly primate ES cells) with an efficiency that cannot be achieved by conventional techniques.
  • the above-described problem can be achieved by freezing and preserving stem cells easily and with good storage efficiency by rapid freezing by using a medium containing propylene glycol. It was completed by the present inventors' finding that it was solved by finding this unexpectedly.
  • the present invention provides a medium for storing stem cells, A) Dimethyl sulfoxide (DMSO);
  • a medium including:
  • the DMSO accounts for 15-40% of the medium.
  • the propylene glycol and DMSO together comprise more than about 30% of the medium and less than about 50% of the medium.
  • the DMSO and the propylene glycol are present in a molar ratio of about 1: 2 to about 2: 1.
  • the DMSO and the propylene glycol are present in a molar ratio of about 3: 2.
  • the medium of the present invention further comprises a component selected from the group consisting of acetamide and a sugar.
  • the DMSO is present at about 1M-4M and the propylene glycol is present at about 1.5M-6M.
  • the DMSO is present at about 2M.
  • the propylene glycol is present at about 3M.
  • the DMSO is present at about 2M and the propylene glycol is present at about 3M.
  • the DMSO is present at about 1M-4M
  • the propylene glycol is present at about 1.5M-6M
  • the DMSO is present at about 2M.
  • the propylene glycol is present at about 3M.
  • the acetamide is included at about 1M.
  • the DMSO is present at about 2M
  • the propylene glycol is present at about 3M
  • the media of the present invention comprises about 1M cetamide.
  • the medium includes a medium selected from the group consisting of DMEM medium and F12, or a mixture thereof. [0028] In one embodiment:
  • the stem cell is selected from the group consisting of tissue stem cell and ES cell force.
  • the stem cells include ES cells.
  • the stem cells include primate ES cells.
  • the stem cells include human ES cells.
  • the above storage is cryopreservation.
  • the above storage is rapid freezing storage.
  • the rapid freezing storage is frozen at a rate of about 30 ° CZ min or more.
  • the medium of the present invention is rapidly thawed after the above storage.
  • the rapid thawing is performed at a rate of about 50 ° CZ min or more.
  • the present invention provides a medium for storing stem cells
  • At least one of the DMSO and the ethylene glycol provides a medium that is less than 20% by weight.
  • the DMSO and ethylene glycol are included by about 15% each.
  • the medium of the present invention further comprises a sugar.
  • the sugar includes sucrose.
  • the DMSO comprises about 7.5% -30% of the medium
  • the ethylene glycol comprises about 7.5% -30% of the medium
  • the sucrose comprises about 0 1875M—Includes 0.775M.
  • the DMSO comprises about 15% of the medium
  • the ethylene glycol comprises about 15% of the medium
  • the sucrose comprises about 0.375M.
  • the medium is for cryopreserving the stem cells.
  • the present invention is a method for storing stem cells, comprising:
  • Rapidly freezing stem cells in a medium comprising:
  • a method comprising:
  • the rapid freezing is performed using an enclosed tube.
  • the stem cells are detached from large colonies.
  • the above stem cells, and the medium is present from about 1 X 10 4/100 ⁇ 1- about 5 X IOVIOO ⁇ 1 ratio.
  • the rapid freezing is performed in liquid nitrogen.
  • the method further includes a step of rapidly thawing after the storage.
  • the rapid thawing is by pipetting.
  • the stem cells include tissue stem cells and ES cells.
  • the stem cells include ES cells.
  • the stem cells include primate ES cells.
  • the stem cells include human ES cells.
  • the medium may take the form of any of the embodiments described herein.
  • the present invention is a method for storing stem cells comprising:
  • At least one of the DMSO and the ethylene glycol is 2
  • a method comprising:
  • the medium may take the form of any of the embodiments described herein.
  • the present invention provides a system for storing stem cells
  • a system is provided.
  • the system of the present invention comprises a smoother, enclosed tube.
  • the stem cells include tissue stem cells and ES cells.
  • the stem cells include ES cells.
  • the stem cells include primate ES cells.
  • the stem cells include human ES cells.
  • the medium may take the form of any of the embodiments described herein.
  • the present invention provides a system for storing stem cells
  • At least one of the DMSO and the ethylene glycol is less than 20% by weight
  • a system is provided.
  • the medium may take the form of any of the embodiments described herein.
  • the present invention provides:
  • the medium may take the form of any of the embodiments described herein.
  • the present invention provides:
  • At least one of the DMSO and the ethylene glycol is less than 20% by weight
  • the medium may take the form of any of the embodiments described herein.
  • the present invention provides a technique for particularly efficiently storing stem cells.
  • the present invention achieves an effect that could not be achieved in the past, that is, simple and efficient preservation of stem cells.
  • various stem cells including ES cells can be efficiently stored according to the present invention.
  • FIG. 1 shows the storage efficiency (middle) when stem cells (ES cells) are cryopreserved and thawed (ie, simplified vitrification method) using the DAP medium of the present invention. Compared to the results of using the normal vitrification method (right) with the slow cooling method (left) using DMSO media.
  • Figure 1 shows data from three independent experiments, with bars indicating standard error. Significantly different from DAP (t test, p ⁇ 0.05).
  • FIG. 2 shows an improvement of the vitrification freezing method using DES as described in Example 6.
  • Fig. 3 shows the refrigeration efficiency when various ratios of DMSO and propylene glycol (PG) are changed. The relative ratio is shown as the efficiency when 100 is performed using DAP (see Example 5).
  • FIG. 4 shows the cryopreservation effect when the simple vitrification method of the present invention is used using a medium containing only DMSO.
  • FIG. 5 shows the cryopreservation effect when the simplified vitrification method of the present invention is used using a medium containing only propylene glycol.
  • FIG. 6 shows an example of an ES cell establishment scheme.
  • FIG. 7 shows cell viability after freezing and thawing of human ES cells by the described method.
  • the cell viability after thawing was close to 0%, but by using the simple freezing method, a cell viability of 10% or more was obtained. A significant improvement in rate was shown.
  • cell is defined in the same way as the broadest meaning used in the art, and is a structural unit of a tissue of a multicellular organism and is enclosed in a membrane structure that isolates the outside world. Rarely, an organism that has self-regenerative ability and has genetic information and its expression mechanism. Any cell can be targeted in the present invention.
  • the number of “cells” used in the present invention can be counted through an optical microscope. When counting through an optical microscope, count by counting the number of nuclei. Cells stain the extracellular matrix (eg, elastin or collagen) and cell-derived nuclei with a dye by performing hematoxylin eosin (HE) staining.
  • HE hematoxylin eosin
  • the cells can be examined with an optical microscope, and the number of nuclei per specific area (for example, 200 m ⁇ 200 ⁇ m) can be estimated and counted.
  • the cells used herein may be naturally occurring cells or artificially modified cells (for example, fusion cells, genetically modified cells).
  • the source of cells can be, for example, a single cell culture or cells from a normally grown transgenic animal embryo, blood, or body tissue, or a successfully grown cell line. Cell mixtures such as, but not limited to.
  • stem cell refers to a self-replicating ability and pluripotency (ie, pluripotency).
  • Stem cells are usually able to regenerate the tissue when it is damaged.
  • the stem cells may be ES cells or tissue stem cells (including tissue stem cells, tissue-specific stem cells or somatic stem cells), but are not limited thereto.
  • an artificially produced cell for example, a reprogrammed cell
  • ES cell is used interchangeably and refers to any pluripotent stem cell derived from an early embryo. ES cells are usually considered to be totipotent or almost totipotent.
  • a chimera was produced by introducing this ES cell into a normal host blastocyst and returning it to the foster parent uterus.
  • a germline chimera (a chimeric mouse with functional germ cells derived from ES cells) that has high chimera-forming ability.
  • ES cell lines can be applied with various gene transfer methods (for example, calcium phosphate method, retroviral vector method, ribosome method, electoporation method, etc.) in culture.
  • the method of selecting cells with integrated genes is selected, and clones of cells that have been modified (substitution, deletion, insertion) to target specific genes using homologous recombination are used. It can also be obtained.
  • ES cell lines treated in vitro in this way retain their ability to differentiate into the germ line, there is an active study to investigate the function of certain genes at the individual level (MR Capecchi). : Science, 244, 1288, 1989).
  • Transgeneic mouse production methods using ES cells are not available in many transgenic animal production methods by microinjection in that it enables individuals to be obtained by arbitrarily modifying only certain genes. Benefits can be considered.
  • a knockout animal in which a specific gene is inactivated can be produced, and the function of the gene can be elucidated or only a foreign gene can be expressed. Therefore, if ES cells can be easily established, the effect cannot be expected.
  • tissue stem cell refers to a cell in which the direction of differentiation is limited unlike an ES cell.
  • tissue stem cells are present at specific positions in the tissue and have an undifferentiated intracellular structure. Therefore, tissue stem cells have a low level of pluripotency.
  • Tissue stem cells are poor in organelles with a high nuclear Z cytoplasm ratio. Tissue stem cells generally have the ability to function and maintain the ability to proliferate over the life of an individual with a slow cell cycle.
  • ES cells can be preferably used as stem cells.
  • the cells used as stem cells used in the present invention may be any cell derived from any organism (for example, mammals (for example, single pores, marsupials, rodents, etc.) as long as there are stem cells or their counterparts. Skin wings, wings, carnivores, carnivores, long noses, odd hoofs, even hoofs, rodents, scales, sea cattle, cetaceans, primates, rodents, maggots, etc. ) Derived cells) may be used . More preferably, stem cells are cells derived from primates (eg, chimpanzee, dihonosa, human). Most preferably, human-derived cells are used as stem cells.
  • ES cell lines are very important in the production of chimeric mice, knockout mice, and the like, and the analysis of gene functions has greatly advanced by these techniques. Development of a system that induces specific yarns and weaves from ES cells is progressing, and it has a real applicability to transplantation medicine. In addition, when considering clinical application using human ES cells, pre-clinical research using ES cells from appropriate model animals such as monkeys is considered to be almost essential, and its Standing is also important.
  • the ES cell line is established using a feeder cell.
  • ES cells are established by culturing an inner cell mass (ICM) separated from blastocyst force on a feeder cell.
  • ICM inner cell mass
  • STO mouse fetal fibroblasts or a cell line derived therefrom, STO, is used as one feeder cell.
  • mice the embryo develops into a blastocyst 3.5 days after fertilization.
  • the inner cell mass which is an undifferentiated stem cell that forms the embryo body, is separated from the blastocyst by immunosurgery.
  • This ICM has the ability to differentiate into trophectoderm, a cell made by the placenta. For this reason, separating ICM directly from day 3.5 embryos often causes undifferentiated cells to be lost because ICM differentiates into trophectoderm. 3.
  • 5 day embryos are further cultured for 1 day. 4. 0-4. When 5 day embryos are used, blastocysts escape from the zona pellucida.
  • ICM is no longer distributed to trophectoderm. From such a state, when ICM is separated and culture is started, the proportion of undifferentiated cells can be increased. Therefore, even when stem cells are established in the present invention, such undivided cells can be used for such days.
  • the blastocyst can be directly cultured on the feeder cell, but in the case of direct, the blastocyst adheres and the trophectoderm extends.
  • the power to expose ICM is also not very desirable.
  • immunosurgery is preferably used.
  • a schematic ES cell line establishment scheme is shown in FIG. Briefly, when ICM isolated by immunosurgery is cultured on a feeder cell, and passage continues, colonies of undifferentiated stem cells appear mixed with the separated cells. By separating this and subculture, An ES cell line that can be stably maintained can be established. When the present invention is used, since the establishment rate exceeds 80%, the efficiency of obtaining ES cells that can be stably maintained is remarkably increased.
  • the feeder cell used in the examples, PBS (Ca--Mg free), 0.25% trypsin 'lmM EDTA in PBS, ES Cell culture medium (Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) (high glucose) 400 ml, urine fetal serum 100 ml, non-essential amino acid solution (Gibco) 4 ml, nucleoside solution (nucleoside, guanosine, cytidine, uridine 3 mM each, thymidine lmM aqueous solution 4ml, 2 mercaptoethanol 41 (0.lmM), LI F 100 l (2000UZml)), ⁇ 2 medium (Sigma etc.) M16 medium (available from Sigma, etc.), acidic Tyrode's solution (available from Sigma, etc.), anti-mouse serum (mouse spleen cells or lymphocytes 5 x 10 8 cells in a rabbit every two weeks)
  • DMEM Dulbecco's
  • multiwell plates eg available from 4well, 12well, NUNC, etc. are recommended.
  • the inner cell mass is separated by methods such as immunosurgery with anti-human serum and then cultured on the feeder cell layer.
  • the feeder cell As the feeder cell, the feeder cell exemplified in this example can be used. Treat the remainder of the inner cell mass after sampling with courtesy.
  • the cells grown on the feeder cells are dissociated at appropriate times, divided and passaged, and the cell line that appears to be an ES cell is established while the cell colony that appears to be a stem cell is selectively cultured. During this time, research aimed at improving culture maintenance methods and cell cryopreservation methods will be conducted.
  • stem cell markers alkaline phosphatase activity and specific antigen
  • karyotype analysis is performed to test whether the number and morphology of chromosomes are normal.
  • cell differentiation is induced by changing the culture conditions and creating cell aggregates, and the ability to differentiate into various functional cells is analyzed.
  • transplantation to immunodeficient mice will be performed to analyze the ability of tissue differentiation due to teratoma formation.
  • Temporary storage of human frozen embryos uses a dedicated liquid nitrogen tank to prevent contamination by viruses and microorganisms derived from cells and animal embryos other than those used for the establishment plan.
  • a special carbon dioxide incubator is used to prevent mixing with other types of cells and to reduce the possibility of contamination by viruses and microorganisms.
  • Culture media and equipment used for cell culture should be discarded after autoclaving in the laboratory. Strictly manage the resident of the laboratory that stores human fertilized embryos and establishes cell lines.
  • pluripotency or "probably pluripotency” is used interchangeably and refers to the nature of a cell, and is divided into one or more, preferably two or more various tissues or organs. The ability to be ashamed. Therefore, “pluripotency” and “pluripotency” are not specifically mentioned herein. As long as it is used interchangeably with “undifferentiated”. Normally, the pluripotency of a cell is limited as it develops, and in adults, the cells of one tissue or organ rarely change to another. Therefore, pluripotency is usually lost. In particular, epithelial cells are unlikely to change into other epithelial cells. When this happens, it is usually a pathological condition and is called metaplasia.
  • mesenchymal cells have a high degree of pluripotency because they tend to undergo metaplasia instead of other mesenchymal cells with a relatively simple stimulus.
  • ES cells are pluripotent.
  • Tissue Stem cells are pluripotent.
  • pluripotency the ability to distribute to all types of cells constituting a living body, such as a fertilized egg, is called totipotency, and pluripotency can encompass the concept of totipotency.
  • pluripotency includes, but is not limited to, formation of an embryoid body in an in vitro culture system, culture under differentiation induction conditions, and the like.
  • assesi methods for the presence or absence of pluripotency using living organisms include the formation of malformed species (teratomas) by transplantation into immunodeficient mice, the formation of chimeric embryos by injection into blastocysts, and transplantation into living tissues Examples include, but are not limited to, proliferation by injection into ascites.
  • pluripotency the ability to divide into all types of cells that constitute a living body like fertilized eggs is called “totipotency”, and pluripotency is the concept of totipotency. Can be included. However, when clearly distinguishing, totipotency and pluripotency can be distinguished, the former being the ability to be divided into any cell, the latter having multiple directions, but the biological It has the ability that cannot be divided in all possible directions. The ability to divide only in one direction is also called monopotency.
  • totipotency and pluripotency can be determined by, for example, the number of days after fertilization.
  • they can be distinguished on the basis of about 8 days after fertilization.
  • it is normal for mice to follow the following course after fertilization.
  • the primitive streak also referred to as the original streak
  • the primitive streak represents the future posterior end of the embryo and reaches the distal end of the cylinder across the ectoderm.
  • the original stripe is an area where cell movement occurs, and as a result, the future endoderm and mesoderm are formed.
  • E7.5 a head projection appeared in front of the nodule.
  • a neural plate is formed in the endoderm and upper layer.
  • the nodules appear around E6.5 and move backwards, forming the shaft structure from front to back.
  • E8 By the 5th day, the embryo is somewhat longer, and a large head fold is formed at the front end, mostly with anterior neural plate strength.
  • the body segment is E8 daily force 1.
  • the forward force begins to form backward at a rate of 1 per 5 hours. Cells that have passed this period will no longer exhibit totipotency and will not form individuals, even if they are returned to the placenta, unless they are departed.
  • this is a branch point of totipotency because it can show totipotency without special treatment. This is because it is difficult for ES cells to establish later embryonic power, and the embryonic power after this is usually established as cells called EG (germ cell-derived) cells. It can be said that it is a turning point.
  • the term "divided cell” refers to a cell (eg, muscle cell, nerve cell, etc.) that is specialized in function and morphology. There is little or no ability.
  • differentiated cells include epidermal cells, splenic parenchymal cells, splenic duct cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal myoblasts, nerve cells, vascular endothelial cells, dyes Examples thereof include cells, smooth muscle cells, fat cells, bone cells, and chondrocytes.
  • the dividing cells are in the form of a population or tissue.
  • somatic cells refers to all cells that are cells other than germ cells such as eggs and sperm and do not directly transfer the DNA to the next generation. Somatic cells usually have power or loss of limited pluripotency. As used herein, somatic cells may be naturally occurring or genetically modified.
  • fibroblast refers to a cell that supplies the fiber component of the supporting tissue and forms an important component of the fibrous connective tissue.
  • Tissue sections have a flat, long outline and often show irregular protrusions.
  • the cytoplasm contains mitochondria, Golgi apparatus, centrosome, small fat sphere, etc., but does not show any other special features.
  • the nucleus has an elliptical shape, often close to the collagen fibers.
  • feeder layer or “feeder layer” is used interchangeably and is a cell that is provided in a culture substrate and cannot be maintained alone. To allow species growth and Z or phenotypic expression It refers to a feeder cell layer of other cell types. Tissue cells are said to have many cell types that cannot be propagated as well as expressed under normal cell culture conditions. Examples of such cells include stem cells (especially ES cells, nerve cells). Stem cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, and the like), but are not limited thereto. These cell types generally require auxotrophic and specific growth factors and differentiation inducing factors.
  • corresponding for example, when used for a cell, refers to a cell of another species having similar properties and Z or function with respect to the cell in a certain organism.
  • the term "fetus” or “fetus” is used interchangeably and refers to the period until the birth of a mammal when a mammal pup has completed differentiation of each organ primordium and enters the growth phase. A certain organism.
  • established or established cells maintain certain properties (eg, pluripotency) and allow cells to grow stably under culture conditions. It means a state in which people continue to do so. Thus, the established stem cells maintain pluripotency.
  • Established differentiated cells have certain defined functions. Established differentiated cells are often cancerous, but are not limited thereto.
  • differentiation generally means that one system is separated into two or more qualitatively different systems.
  • cells yarns and tissues or organs
  • it refers to the specialization of function and Z or form.
  • pluripotency usually decreases or disappears.
  • any medium or culture solution can be used as long as the preservation of the cells is supported.
  • Such media or cultures include, for example, Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM), M2, M16, P199, Modified Eagle Medium (MEM), Hank's Buffer Salt Solution (HBSS), Ham's F12, Eagle Basic Medium (BME), RPMI 1640, MCDB104, MCDB153 (KGM), DMEMZF12 ( 1: 1) and the like, but are not limited thereto.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle Medium
  • M2 M16
  • P199 Modified Eagle Medium
  • HBSS Hank's Buffer Salt Solution
  • BME Eagle Basic Medium
  • RPMI 1640 RPMI 1640
  • MCDB104 MCDB153
  • KGM DMEMZF12
  • the culture medium for storage and the culture medium for thawing can be the same or different.
  • Such media or culture media include corticosteroids such as dexamethasone, insulin, glucose, indomethacin, isobutyl-methylxanthine (IBMX), ascorbate-2-phosphate, ascorbic acid and its derivatives, Glycetophosphate, estrogen and its derivatives, progesterone and its derivatives, androgen and its derivatives, acidic fibroblast growth factor (aFGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF), insulin -Like growth factor (IGF), transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ ), endothelial growth factor (ECGF), bone morphogenetic protein (BMP), platelet-derived growth factor (PDGF), and other pituitary extracts , Pineal extract, retinoic acid, vitamin D, thyroid hormone, serum (eg, fetus, horse, human) , Heno ⁇ phosphorus, sodium bicarbonate, HEPES, albumin, transferrin, s
  • the "minute factor” is also referred to as a "minute factor” and is a factor known to promote differentiation into differentiated cells (for example, chemical substances, temperature, etc.) Any factor is acceptable. Examples of such factors include various environmental factors. Examples of such factors include temperature, humidity, pH, salt concentration, nutrition, metal, gas, organic solvent, pressure, and chemical substance. (Eg, steroids, antibiotics, etc.) or any combination thereof.
  • DNA demethylating agents such as 5-azacitidine
  • histone deacetylating agents such as trichostatin
  • nuclear receptor ligands eg, retinoic acid (ATR A), vitamin D, T3 etc.
  • cell growth factor activin, IGF-1, FGF, PDGF, TG
  • site force in LIF ⁇ IL 2, IL-6, etc.
  • hexamethylene bisacetamide dimethylacetamide
  • dibutyl cAMP dimethyl sulfoxide
  • iodine deoxyuridine hydroxylurea
  • Examples include, but are not limited to, cytosine arabinoside, mitomycin C, sodium butyrate, affidicholine, fluorodeoxyuridine, polyprene, and selenium.
  • in vivo or “in vivo” refers to the inside of a living body.
  • in vivo refers to the location where the target tissue or organ is to be placed.
  • in vitro refers to a state in which a portion of a living organism has been removed or released “in vitro” (eg, in a test tube) for various research purposes. Say. A term that contrasts with in vivo.
  • ex vivo means that a target cell for gene transfer is extracted from a subject, a therapeutic gene is introduced in vitro, and then the same subject is returned to the same subject. When returning, a series of operations is called ex vivo.
  • the term “self” or “self” refers to an individual or a part thereof (eg, a cell, tissue, organ, etc.) derived from that individual.
  • the term “self” may broadly include a graft from another genetically identical individual (eg, an identical twin).
  • the same species refers to an individual or a part thereof (for example, a cell, a tissue, an organ, etc.) to be transplanted by another individual that is the same species but genetically different.
  • allogeneic ones can elicit an immune response in the transplanted individual (recipient).
  • examples of such cells include, but are not limited to, parent-derived cells.
  • xenogeneic refers to an xenogeneic individual transplanted.
  • a transplant from a pig is referred to as a xenograft.
  • a "recipient" is an individual that receives cells to be transplanted, and is also referred to as a "host”.
  • a donor an individual that provides cells to be transplanted.
  • the recipient and donor can be the same or different
  • the cells used in the present invention may be derived from the same strain (derived from the self (autologous)), derived from the same species (derived from other individuals (other families)), or derived from different species. Self-derived cells are preferred because of possible rejection, but if rejection is a problem, it can be from allogeneic.
  • transplantation means that the cells, compositions, medicaments, etc. of the present invention are transferred into the body alone or in combination with other therapeutic agents.
  • introduction method, introduction form, and introduction amount to the treatment site can be used: direct injection into the lesion site such as the pharmaceutical of the present invention, and suturing after application And then insert it.
  • the combination of adipose stem cells of the present invention and sorting cells can be administered, for example, either simultaneously as a mixture, separately but simultaneously or concurrently; or sequentially. This includes presentation administered together as a combined pharmacodynamic therapy mixture, and also includes procedures where the combined drugs are administered separately but simultaneously (eg, differentiation promoting factors).
  • “Combination” administration or transplantation further includes the separate administration of one of the cells, medicaments, compounds or agents given first, followed by the second.
  • preservation means to substantially retain its function and Z or form when used on a cell, tissue or organ.
  • preservation of stem cells preferably includes substantially maintaining the pluripotency of stem cells, in addition to viability as a cell.
  • the "storage efficiency" of the present invention can be calculated by evaluating the proliferation ability of cells after thawing and the multipotency of stem cells. Such an assessment can be made relative or absolute.
  • Such evaluation can be performed, for example, with regard to the efficiency of the cryopreservation method by an ESSAy that counts the number of ES cell colonies and the number of ES cells 4 days after thawing.
  • the proliferative capacity of cells after thawing is determined by the number of ES cell colonies and Obtained as the cell number of the cell, and maybe the ability after thawing is determined by the unidentified marker (for example,
  • Oct3Z4 etc. expression and undifferentiated ES cell colony specific morphology can be determined as indices.
  • a general method for determining the cryopreservation efficiency of cells a method for distinguishing cell viability by trypan blue staining may be used, but this indicator does not necessarily guarantee cell growth after thawing. In this specification, it is adopted to measure the efficiency of the cryopreservation method by directly measuring the amount of cell growth after thawing.
  • regeneration refers to a phenomenon in which when a tissue or part of an organ of an individual is lost, the missing tissue is supplemented and restored. Depending on the tissue species between species or in the same individual, the degree and mode of regeneration varies. Many human tissues have limited regenerative capacity, and complete regeneration cannot be expected if they are largely lost. In large injuries, tissue with strong proliferative potential that is different from the lost tissue proliferates, and incomplete regeneration can occur where the tissue is regenerated incompletely and functions cannot be restored. In this case, a structure that also has a bioabsorbable material strength is used to increase the ability of the tissue to grow and prevent the invasion of the tissue to secure a space where the original tissue can grow, and further to the cell.
  • Regenerative medicine is being carried out to replenish growth factors to enhance the regenerative capacity of the original tissue.
  • examples of this include regenerative medicine of cartilage, bone and peripheral nerves.
  • stem cells established using the cryopreservation method of the present invention any tissue can be regenerated in principle, and the organ of the present invention thus prepared, Tissue and cells are provided as an implant for regeneration.
  • Cells can be classified according to origin into stem cells derived from ectoderm, mesoderm and endoderm. Cells derived from ectoderm are mainly present in the brain, and include neural stem cells and their cells.
  • Cells derived from mesoderm are mainly present in the bone marrow, and include hemangioblasts and their differentiated cells, hematopoietic stem cells and their differentiated cells, mesenchymal stem cells and their differentiation cells, and the like.
  • Endoderm-derived cells are mainly present in organs, and include liver stem cells and their differentiated cells, spleen stem cells and their differentiated cells.
  • somatic cells may be derived from any germ layer.
  • stem cells can be genetically modified. Since stem cells are cultured cells, various gene transfer methods (for example, calcium phosphate method, ribosome method, microinjection method, electoral position method, etc.) can be used just like other cultured cells. .
  • genes that can be introduced include, but are not limited to, genes derived from bacteria, animals, or human chromosomes. Similarly, modification of an endogenous gene by homologous gene recombination using a targeting vector used as a gene targeting method using an ES cell line is also possible.
  • Stem cells preserved by the method of the present invention include diseases, disorders, and conditions that can be targeted, and include any disease, disorder, or condition in which regeneration of organs or tissues is desired.
  • the present invention is particularly advantageous for diseases, disorders, and conditions where stem cells are required for treatment in situations where long-term storage is required.
  • the diseases and disorders that can be targeted by the present invention may be the circulatory system (such as blood cells).
  • diseases or disorders include, for example, anemia (eg, aplastic anemia (particularly severe aplastic anemia), renal anemia, cancerous anemia, secondary anemia, refractory anemia, etc.), cancer or tumor (Eg, leukemia) and hematopoietic failure, thrombocytopenia, acute myeloid leukemia (especially the first remission phase (high-risk group), the remission phase after the second remission phase), acute lymphatic disease Leukemia (especially the first remission phase, remission phase after the second remission phase), chronic myelogenous leukemia (especially the chronic phase, transition phase), malignant lymphoma (especially the first remission phase (High-risk group)), Remission period after the second remission period), multiple myeloma (especially early after onset); heart failure, angina pectoris, myocardial infarction,
  • anemia e
  • diseases and disorders to which the present invention may be directed may be those of the nervous system.
  • diseases or disorders include, but are not limited to, for example, dementia, stroke and its sequelae, brain tumors, spinal cord injury.
  • diseases and disorders to which the present invention can be directed can be those of the immune system.
  • diseases or disorders include, but are not limited to, T cell deficiency and leukemia.
  • diseases and disorders that can be targeted by the present invention may be those of musculoskeletal, skeletal system.
  • diseases or disorders include, for example, fractures, osteoporosis, Examples include, but are not limited to, joint dislocation, subluxation, sprains, ligament injury, osteoarthritis, osteosarcoma, Ewing sarcoma, osteogenesis imperfecta, muscular dystrophy, and osteochondral dysplasia.
  • the diseases and disorders targeted by the present invention may be of the skin system.
  • diseases or disorders include, but are not limited to, alopecia, melanoma, cutaneous malignant lymphoma, angiosarcoma, histiocytosis, blistering, pustulosis, dermatitis, eczema.
  • diseases and disorders that can be targeted by the present invention may be of the endocrine system.
  • diseases or disorders include, for example, hypothalamus' pituitary disease, thyroid disease, parathyroid (parathyroid) disease, adrenal cortex, medullary disease, abnormal glucose metabolism, abnormal lipid metabolism, abnormal protein metabolism, nucleic acid metabolism Abnormalities, inborn errors of metabolism (phenylketonuria, galactosemia, homocystinuria, maple syrupuria), albuminemia, lack of ascorbic acid synthesis, hyperpyrurubinemia, hyperbilirubinuria, kallikrein deficiency , Mast cell deficiency, diabetes insipidus, vasopressin secretion abnormality, gonorrhea, Wolman's disease (acid lipase deficiency), mucopolysaccharidosis type VI and the like, but are not limited thereto.
  • diseases and disorders targeted by the present invention may be those of the respiratory system.
  • diseases or disorders include, but are not limited to, lung diseases (eg, pneumonia, lung cancer, etc.) and bronchial diseases.
  • diseases and disorders to which the present invention can be directed can be of the extinguisher system.
  • diseases or disorders include, for example, esophageal disease (for example, esophageal cancer), stomach / duodenal disease (for example, stomach cancer, duodenal cancer), small intestine disease / colon disease (for example, colon polyps, colon cancer, rectum). Cancer), biliary tract disease, liver disease (e.g.
  • cirrhosis hepatitis (A, B, C, D, E, etc.), fulminant hepatitis, chronic hepatitis, primary liver cancer, alcoholic liver disorder, Drug-induced liver injury), spleen disease (acute splenitis, chronic splenitis, spleen cancer, cystic spleen disease), peritoneal 'abdominal wall' diaphragmatic disease (eg hernia), and Hirschsprung's disease.
  • spleen disease acute splenitis, chronic splenitis, spleen cancer, cystic spleen disease
  • peritoneal 'abdominal wall' diaphragmatic disease eg hernia
  • Hirschsprung's disease eg hernia
  • diseases and disorders that can be targeted by the present invention are those of the urinary system. It can be.
  • diseases or disorders include, for example, renal diseases (renal failure, primary glomerular disease, renal vascular disorders, tubular dysfunction, interstitial renal disease, renal disorders due to systemic diseases, renal cancer, etc.), Examples include but are not limited to bladder diseases (cystitis, bladder cancer, etc.).
  • the diseases and disorders that can be targeted by the present invention can be of the reproductive system.
  • diseases or disorders include, for example, male genital diseases (male infertility, prostatic hypertrophy, prostate cancer, testicular cancer, etc.), female genital diseases (female infertility, ovarian dysfunction, uterine fibroids, uterine adenomyosis) , Uterine cancer, endometriosis, ovarian cancer, chorionic disease, etc.).
  • such medicament may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier and the like.
  • pharmaceutically acceptable carrier contained in the medicament of the present invention include any substance known in the art.
  • when used for medicinal purposes it is understood that in addition to being used as a medicine as it is, it also includes the use of the strength and the medicine after being thawed.
  • Such suitable formulation materials or pharmaceutically acceptable carriers include antioxidants, preservatives, colorants, flavoring agents, diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents. , Buffering agents, delivery vehicles, diluents, excipients and / or pharmaceutical adjuvants.
  • the medicament of the present invention is a medium containing dimethyl sulfoxide (DMSO); propylene glycol; and C) medium, or a stem cell maintained using the medium.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a suitable vehicle can be water for injection, physiological solution, or artificial cerebrospinal fluid, which can be supplemented with other materials common to compositions for parenteral delivery. is there.
  • Acceptable carriers, excipients or stabilizers used herein are non-toxic to the recipient and are preferably inert at the dosages and concentrations used.
  • phosphate, citrate, or other organic acids e.g, phosphate, citrate, or other organic acids; ascorbic acid, a-tocopherol; low molecular weight polypeptide; protein (eg, serum albumin, gelatin Or immunoglobulin); hydrophilic polymers (eg, polybulurpyrrolidone); amino acids (eg, glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including glucose, mannose, or dextrin) Chelating agents (eg, EDTA); sugar alcohols (eg, mantol or sorbitol); salt-forming counterions (eg, sodium); and Z or non-ionic surfactants (eg, Tween, pull mouth) Such as, but not limited to, pluronic or poly
  • Suitable carriers include neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin.
  • the product is formulated as a lyophilizer using a suitable excipient (eg, sucrose).
  • suitable excipient eg, sucrose
  • Other standard carriers, diluents and excipients may be included as desired.
  • the medicament of the present invention may contain a coloring agent, a preservative, a fragrance, a flavoring agent, a sweetener and the like, as well as other agents as necessary.
  • the amount of the medicine used in the treatment method of the present invention takes into consideration the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, sex, medical history, cell morphology or type, etc. Thus, it can be easily determined by those skilled in the art.
  • the frequency with which the treatment method of the present invention is applied to a subject (or patient) also depends on the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, gender, medical history, and treatment course. This can be easily determined by those skilled in the art. Examples of the frequency include administration once a month every day (for example, once a week once a month). It is preferable to administer once a week once a month while monitoring the course.
  • the amount to be administered can be ascertained by estimating the amount required by the site to be treated.
  • the "instruction” refers to a person who administers or diagnoses a method of administering or diagnosing the pharmaceutical of the present invention, etc. It is described.
  • This instruction manual includes a word indicating a procedure for administering the diagnostic agent or medicine of the present invention.
  • This instruction is prepared in accordance with the format prescribed by the national supervisory authority (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan and the Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc. in the United States). It will be clearly stated that it has been approved.
  • finger Indications are so-called package inserts, usually provided in paper form, but not limited to, eg, electronic media (eg, home pages (websites), emails provided on the Internet) It can also be provided in such a form.
  • the end of treatment by the method of the present invention can be determined based on the results of standard clinical tests using commercially available accessories or equipment, or the above diseases (eg, hematopoietic diseases, neurological diseases, heart diseases, etc.). Can be supported by the disappearance of clinical symptoms characteristic of Treatment can be resumed by recurrence of the above diseases (eg, hematopoietic disease, neurological disease, heart disease, etc.).
  • the present invention also includes a pharmaceutical pack or kit comprising one or more components of a medicament of the present invention (eg, stem cells such as ES cells) and one or more containers filled with a storage medium of the present invention.
  • a pharmaceutical pack or kit comprising one or more components of a medicament of the present invention (eg, stem cells such as ES cells) and one or more containers filled with a storage medium of the present invention.
  • the stem cells of the present invention are distributed using the storage medium of the present invention in accordance with the ethical rules established by the authorities.
  • Examples of such provisions include, but are not limited to, those established by the Japanese government. The example of the regulation is described below.
  • the cell line subjected to post-mortem characterization is distributed using the storage medium of the present invention.
  • the time of distribution begins when cell lines that have been tested and confirmed for pluripotency and normal karyotype are grown and the number of frozen cell samples required to preserve the cell line is obtained. It is contemplated to begin dispensing.
  • the distribution agency is responsible for distribution. Distributors should have clean rooms and equipment necessary for cell culture and liquid nitrogen tanks for cell cryopreservation. It is used by the human ES cell line establishment team, and its personnel composition is, for example, 5 researchers (2 of whom are preferably medical license holders). At the start of cell distribution, about two additional experimental assistants and one administrative assistant will share the work. You may be responsible. It is preferable to increase the number of personnel and facilities in response to the increasing demand for cell distribution and training.
  • Examples of distribution methods and conditions include the following: Securing cell stocks in an established institution required to maintain and continue the growth of ES cell lines should be given priority.
  • the stem cell donor is a human, it is necessary to obtain informed consent.
  • the candidate responds to the head of the provider, whether he or she agrees to the offer. Consent requires the signing of informed consent documents, which are kept strictly by the provider. Do not communicate the results of consent or disagreement with specific candidates to the establishment parties.
  • kit is usually divided into two or more compartments, and the parts to be provided (eg, reagents, cells, storage medium of the present invention, etc.) are provided.
  • This kit form is preferred when it is intended to provide a composition that should preferably be mixed and used immediately prior to use.
  • each component for example, DMSO, propylene glycol, ethylene glycol, acetamide, etc.
  • Such a kit will preferably include instructions describing how the provided parts (e.g., reagents, cells, components of the storage medium of the present invention, etc.) should be processed. It is advantageous.
  • Such a manual may be any medium.
  • Examples of such a medium include, but are not limited to, a paper medium, a transmission medium, and a recording medium.
  • Examples of the transmission medium include, but are not limited to, the Internet, an intranet, an extranet, a WAN, and a LAN.
  • Recording media include, but are not limited to, CD-ROM, CD-R, flexible disk, DVD-ROM, DVD-R, MD, mini-disc, MO, and memory stick.
  • Short Protocols in Molecular Biology A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley— Interscience; Innis, MA (1990) .PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, FM (1992 Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates; Ausubel, FM (1995) .Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub Associates; Innis, MA et al. (1995).
  • the invention provides a medium for storing stem cells, comprising A) DMSO; B) propylene glycol; and C) culture medium.
  • DA medium also referred to as “DA medium”.
  • DMSO can be used of any grade or origin as long as it is suitable for cell culture and Z or storage.
  • Propylene glycol can also be used of any grade or origin that is suitable for cell culture and Z or storage. Such a thing can use what each component was marketed independently.
  • the medium can be of any grade or origin as long as it is suitable for cell culture and Z or storage.
  • a medium containing DMEM medium, F12 medium, CMK medium (described in Example 1), DMEM / F12 (1: 1) medium, or a mixture thereof can be used.
  • CMK medium is used as such a medium, but the medium is not limited thereto, and the medium can be changed and used according to the stem cells to be preserved.
  • a medium may be supplemented with supplements such as urchin fetal serum (FBS) and KSR.
  • FBS urchin fetal serum
  • KSR urchin fetal serum
  • DMEMZF12 (1: 1) medium + KSR is used, and more preferably DMEMZF12 (1: 1) medium + 20% KSR is used.
  • the present invention has been completed by the first discovery that it is particularly suitable for the preservation of stem cells (especially frozen storage), because of the ability of a mixture of propylene glycol and DMSO. It must be present in an appropriate medium and at an appropriate concentration. Such concentrations can be appropriately determined by those skilled in the art based on the disclosure herein.
  • DMSO and propylene glycol are usually mixed in a ratio of about 1: 5 to about 5: 1.
  • a molar ratio of about 1: 2 to about 2: 1 Preferably in a molar ratio of about 1: 2 to about 2: 1, more preferably DMSO and propylene glycol have a slightly higher DMSO molar ratio (eg, about 3: 2) than about 1: 1. In a molar ratio).
  • stem cells especially ES Cells
  • the DMSO used in the present invention preferably accounts for 15-40% of the medium of the present invention, but is not limited thereto, and a medium containing DMSO less than 15% or 40% or more It can also be understood that can be used according to the purpose of the present invention.
  • the propylene glycol used in the present invention preferably comprises, but is not limited to, about 5% to about 35% in the medium of the present invention. It can be appreciated that media containing less than 5% or more than 35% propylene glycol can also be used depending on the purpose of the invention.
  • DMSO and propylene glycol preferably comprise a total of greater than about 30% of the media of the present invention and less than about 50% of the media of the present invention.
  • this range there is also a force that has achieved a storage efficiency of at least 3 times, more preferably 5 times, and even more preferably 10 times that of the prior art. Therefore, this range is only a preferable range, and those skilled in the art will understand that stem cells (especially as long as DMSO and propylene glycol are mixed in a recognizable amount with a storage efficiency higher than that achieved conventionally). Understand that ES cells can be stored.
  • the medium of the present invention further comprises a component selected from the group consisting of acetamide and a sugar. More preferably, it is still advantageous that the medium of the present invention comprises acetamide. By including acetamide, a higher storage efficiency is also achieved.
  • the acetamide can be included in the media of the present invention in any proportion, but preferably in a proportion between 10% -100%, more preferably between 25% -75% of DMSO or propylene glycol. be able to. Alternatively, it is preferably present between 0.5 M and 1.5 M in the medium of the present invention. In one embodiment, it is preferable that sugar is contained in the present invention because it is generally known that inclusion of sugar increases the cryopreservation efficiency.
  • DMSO is present between about 1 and 4M, more usually between about 1 and 3M, as well as propylene glycol is about 1.
  • each of the DMSO is advantageously present at about 2M and the propylene glycol is advantageously present at about 3M. This is because the presence of this concentration increases the cryopreservation efficiency by at least 3 times, usually at least about 5 times compared to the conventional vitrification freezing method.
  • the upper limit of the total concentration of these components is usually about 10M, but it varies depending on the ratio of each component. Such an upper limit can be easily determined by those skilled in the art with reference to the present specification.
  • the maximum concentration may vary depending on the protein concentration of the medium used as the base material.
  • the combinations that do not cause precipitation or the like within the range of the examples include, for example, a total of 9M, but are not limited thereto.
  • the most preferred combination is around 2M, about 1M and around 3M forces of DMSO, acetoamide and propylene glycol, respectively.
  • acetoamide there is an effect of about 70% if the concentration of the other two components is optimized even if it is removed, so the concentration range of 0-2M can be appropriate, preferably 0.5M-2M .
  • DMSO is present between about 1 and 4M, more usually between about 1 and 3M, as well as propylene glycol is about 1. between 5-6M, more usually between about 2-4M, and further comprising acetamide, which is typically about 0-2M, more usually About 0.5M—2M exists. More preferably, in the media of the present invention, DMSO is present at about 2M, propylene glycol is present at about 3M, and acetoamide is present at about 1M. This is because the presence of this concentration increases the cryopreservation efficiency by at least 5 times, usually about 10 times compared to the conventional vitrification method.
  • Stem cells to be stored in the present invention may be any stem cells, and therefore, stem cell power including tissue stem cells and ES cells is arbitrarily selected.
  • tissue stem cells include hematopoietic stem cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells, myocardial stem cells, and bone marrow cells.
  • stem cells to be preserved by the present invention include ES cells. ES cells are thought to be difficult to preserve while retaining pluripotency, and for the first time, the present invention has been able to achieve powerful preservation efficiency that could not be achieved conventionally. .
  • the stem cells targeted by the present invention are primate ES cells, particularly human ES cells.
  • these primates, especially human ES cells can be preserved makes general distribution possible, and research using primates and human ES cells has made great progress. If you deserve special mention, you can!
  • the preservation of the stem cells of the present invention is usually cryopreservation, but is not limited thereto. This is because the medium containing DMSO, propylene glycol and the like of the present invention is considered to exhibit its efficacy normally by cryopreservation.
  • the preservation of the stem cells of the present invention is performed by cryopreservation.
  • Cryopreservation may be in any form as long as it is performed while the medium is frozen, but usually 0 ° C or lower, -20 ° C or lower, preferably -80 ° C or lower More preferably, it is carried out at a temperature of ⁇ 150 ° C. or lower, more preferably under liquid nitrogen or lower.
  • the storage of the present invention is performed by rapid freezing storage.
  • “rapid freezing storage” refers to freezing at a rate of usually 30 ° CZ or more, more usually 50 ° CZ or more.
  • the quick freezing is advantageously at least 100 ° C / min, more preferably at least 500 ° CZ.
  • the freezing speed it is preferable not to consider the initial speed and the final speed.
  • the freezing rate can be an average rate. This is because there is a high possibility that the freezing rate will be moderated immediately after the start of freezing and immediately before reaching the target temperature.
  • the time required from the normal culture temperature (eg, 37 ° C) to the target cryopreservation temperature (eg, -196 ° C) is usually within 5 minutes, more preferably within 3 minutes, and even more preferably It is also within the definition of quick freezing that is within 1 minute, most preferably within 15 seconds.
  • the stem cells of the invention are rapidly thawed.
  • “rapid thawing” means that thawing is usually performed at a rate of 30 ° CZ or more, more usually at a rate of 50 ° CZ or more.
  • the rapid thawing is advantageously at least 100 ° CZ, more preferably at least 500 ° CZ.
  • the degree of thawing does not consider the initial speed and the final speed.
  • the freezing rate can be an average rate.
  • the time required from the normal storage temperature (for example, -196 ° C) to the target temperature (for example, 37 ° C) is, for example, usually within 5 minutes, more preferably within 3 minutes, and even more preferably 1 It is also within the definition of rapid thawing within minutes, most preferably within 15 seconds.
  • the term “vitrification preservation method” or “vitrification method” is used interchangeably throughout the present specification, and is a conventional technique as described in Non-Patent Document 4.
  • the conventional vitrification method is usually characterized by freezing using a straw-shaped opening tube, and there is a risk of contamination in such a method.
  • the conventional vitrification method has been used for freezing eggs, sperm, or embryos.
  • a glass tube is used, there is a drawback in that the operation of storing a relatively small amount is complicated. .
  • the present invention also has the advantage of overcoming these drawbacks.
  • concise vitrification storage method or “simple vitrification method” is used interchangeably in the present specification, and cells to be frozen such as stem cells are used in the medium of the present invention.
  • the conventional vitrification method is characterized in that it uses a non-contaminating tube, such as an enclosed tube, rather than using a straw-shaped opening tube. Compared to the vitrification method, it has the advantage of being easy and easy to operate, and has the advantage of not requiring the use of special equipment (eg, glass tubes). .
  • special equipment eg, glass tubes.
  • the present invention is a medium for storing stem cells, comprising: A) DMSO; B) ethylene glycol; and C) culture medium, wherein the DMSO and At least one of the ethylene glycol provides a medium (also referred to herein as “DE medium”) that is less than 20% by weight.
  • This medium also called DES medium when it contains sucrose, is frequently used in the vitrification freezing method, but in the present invention, by using DMSO and Z or ethylene glycol thinner than before, it is unexpectedly used. It was first discovered that stem cells could be stored with high efficiency.
  • the storage efficiency (eg, 0.75X) is significantly higher than conventional DES media (DMSO 20%, ethylene glycol 15%, sucrose 0.5M). It was a surprising discovery that we were able to achieve about 5 times the case of DES.
  • the preferred medium of the present invention advantageously includes sugar. It is generally known that the inclusion of sugar increases the efficiency of cryopreservation. As this sugar, for example, sucrose can be included.
  • DMSO comprises about 7.5% -30% of the medium of the present invention
  • ethylene glycol comprises about 7.5% -30% of the medium of the present invention.
  • sucrose is advantageously included at about 0.1875M—0.75M.
  • DMSO comprises about 15% of the media of the invention
  • ethylene glycol comprises about 15% of the media of the invention
  • sucrose is about 0.
  • 375M is included. In this ratio, it is the power that achieved storage efficiency more than about 5 times compared with the case of using the conventional D ES X 1 medium.
  • the preservation of the stem cells of the present invention using the DE medium is performed by cryopreservation.
  • Cryopreservation may be in any form as long as the medium is frozen, but usually 0 ° C or lower, 20 ° C or lower, preferably 80 ° C or lower, more preferably It is preferably carried out at a temperature of 150 ° C. or lower, more preferably under liquid nitrogen or lower.
  • the present invention is a method for preserving stem cells, comprising: A) a) DMSO; b) propylene glycol; and c) medium, wherein the stem cells are rapidly frozen in a medium.
  • a method is provided.
  • DMS 0, propylene glycol, medium and other components contained in this medium is described in detail in the section of DA medium described above, and also in the cell preservation method of the present invention. It will be understood that any form described in can be employed.
  • rapid freezing is also described in the DA medium section above, and it will be understood that any form described therein can also be employed in the cell storage method of the present invention.
  • the quick freezing in the present invention is performed using an enclosed tube.
  • stem cells are frozen using a straw-like tube having an open tip. This is a force that was thought to have an impact on storage efficiency.
  • the achievement of a high cell storage efficiency without using such a straw-shaped material can be said to be a force that cannot be achieved by conventional storage techniques.
  • the stem cells collected during the preservation method of the present invention have been detached as large colonies. Although not wishing to be bound by theory, it is because the efficiency of cryopreservation of cells increases when exfoliated as a large colony.
  • the stem cells and the medium are usually present in a ratio of 1 X 10 3 ⁇ 00 / ⁇ 1-5 X 1 oVioo ⁇ 1, and preferably 1 X IOVIOO 1 1 X IOVIOO It is advantageous to exist in the ⁇ 1 range. Although not wishing to be bound by theory, mixing cells at a ratio within the above range often results in loss during operation if it is too small, and it becomes difficult to suspend cells if it is too large. This is because it is predicted.
  • the rapid freezing of the present invention is performed using any freezing means, preferably in liquid nitrogen. This is because it is relatively inexpensive and can be quickly frozen. When freezing with liquid nitrogen, it is necessary to pay attention to the fact that the entire tube is immersed in liquid nitrogen, and that the preservation solution is added to the cells and then immediately immersed in liquid nitrogen. . This is because it is thought to affect cell storage efficiency. Ma This is because the effect of being able to freeze more rapidly than using a low-temperature freezer or dry ice is expected.
  • the quick freezing and quick thawing can be performed in any form described in the explanation given in the section of the DA medium.
  • rapid thawing in the preservation of the stem cells of the present invention, rapid thawing can be thawed by shaking in a water bath, and it is preferable to pipette warmed medium. U ,. It is also the power that can quickly thaw cells.
  • Stem cells to be stored in the present invention may be any stem cells, and therefore, stem cell power including tissue stem cells and ES cells is arbitrarily selected.
  • tissue stem cells include, but are not limited to, hematopoietic stem cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells, myocardial stem cells, and bone marrow cells.
  • stem cells to be preserved by the present invention include ES cells. ES cells are thought to be difficult to preserve while retaining pluripotency, and for the first time, the present invention has achieved a powerful preservation efficiency that could not be achieved in the past. .
  • the stem cells targeted by the present invention are primate ES cells, particularly human ES cells.
  • these primates, especially human ES cells can be preserved makes general distribution possible, and research using primates and human ES cells has made great progress. If you deserve special mention, you can!
  • the present invention is a method for preserving stem cells comprising: A) a) DMSO; b) ethylene glycol; and c) culture medium, wherein the DMSO and At least one of the ethylene glycol is less than 20% by weight Freezing the stem cells in a medium is provided.
  • any form described in the section of the DE medium can be used! /.
  • the preservation of the stem cells of the present invention is performed by cryopreservation.
  • Cryopreservation may be in any form as long as the medium is frozen, but is preferably 0 ° C or lower, ⁇ 20 ° C or lower, ⁇ 80 ° C or lower, and more.
  • it is carried out at a temperature of 150 ° C or lower, more preferably under liquid nitrogen or lower. If DE medium is used, it is advantageous to perform quick freezing storage.
  • the present invention provides a system for storing stem cells, comprising: A) a) DMSO; b) propylene glycol; and c) medium, B) means for quick freezing.
  • a system is provided.
  • DMSO, propylene glycol, medium and other components contained in this medium are described in detail in the section of DA medium described above, and also in the cell preservation method of the present invention. It will be understood that any form described therein may be employed.
  • rapid freezing is also described in the DA medium section above, and it will be understood that any of the forms described therein can also be employed in the cell storage method of the present invention. Therefore, any freezing means (for example, liquid nitrogen) can be used as the means for rapid freezing.
  • any freezing means of the present invention any of those exemplified in the above section “Cell preservation method using DA medium” can be used.
  • the system of the present invention further includes an enclosed tube.
  • the present invention also has a force that allows the stem cells to be efficiently stored aseptically.
  • Such a sterile and highly efficient storage method has not been disclosed so far, and its usefulness and significance are high.
  • Stem cells to be stored by the system of the present invention may be any stem cells, and therefore are arbitrarily selected from stem cells including tissue stem cells and ES cells.
  • tissue stem cells include, but are not limited to, hematopoietic stem cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells, myocardial stem cells, and bone marrow cells.
  • the present invention is an object of storage Stem cells include ES cells. ES cells are thought to be difficult to preserve while retaining pluripotency, and with the present invention, for the first time, it was possible to achieve the storage efficiency that could not be achieved previously. is there.
  • the system of the present invention also has industrial utility and significance. Is expensive.
  • the stem cells targeted by the present invention are primate ES cells, particularly human ES cells. The fact that these primates, especially human ES cells, can be preserved makes general distribution possible, and research using primates and human ES cells has made significant progress. Is worth mentioning.
  • the present invention provides a system for storing stem cells comprising: A) a) DMSO; b) ethylene glycol; and c) culture medium,
  • DMSO, ethylene glycol, and the like in the DE medium used can be in any form described in the above-mentioned section of the DE medium.
  • freezing means any means used in this field can be used. Examples of such means include, but are not limited to, liquid nitrogen, a low-temperature freezer, a freezer, ice with salt, and dry ice.
  • the present invention provides the use of a medium for rapid cryopreservation of stem cells, comprising: a) DMSO; b) propylene glycol; and c) medium.
  • a medium for rapid cryopreservation of stem cells comprising: a) DMSO; b) propylene glycol; and c) medium.
  • DMSO DMSO
  • propylene glycol propylene glycol
  • medium and additional components any form described in the section of the DA medium can be used.
  • cryopreservation any form described in the above-mentioned DA medium section can be used, and those skilled in the art should implement it in any appropriate form from the above disclosure and the description of the following examples. It is understood that they can
  • the present invention provides a) DMSO; b) ethylene glycol; and c) medium (c ulture medium), wherein at least one of the DMSO and the ethylene glycol is less than 20% by weight of the medium for use in cryopreserving stem cells.
  • DMSO DMSO
  • ethylene glycol ethylene glycol
  • medium c ulture medium
  • the general procedure is as follows. Obtain embryos that are the source of ES cells and freeze them. Thereafter, the frozen embryo is thawed and cultured to the blastocyst stage. Next, the inner cell mass is separated and the cell line is established. By the presence or absence of stem cell marker expression and chromosome test, Confirm that they are stem cells, especially ES cells. To confirm ES cells, detect stem cell markers (alkaline phosphatase activity, specific antigen, Oct3 / 4, etc.). In addition, karyotype analysis is performed to determine whether the chromosome number and morphology are normal. Thereafter, differentiation potential is tested.
  • stem cell markers alkaline phosphatase activity, specific antigen, Oct3 / 4, etc.
  • cell differentiation is induced by changing the culture conditions and creating cell aggregates, and the ability to differentiate into various functional cells is analyzed.
  • transplantation to immunodeficient mice will be carried out to analyze the ability of the organization to form teratomas.
  • Non-essential amino acids (Gibco) 0.8 ml
  • huLIF Human leukemia inhibitory factor
  • bFGF Basic fibroblast growth factor
  • the culture dish for making the feeder is pre-gelatin coated. 0.1. Cover with 1% gelatin solution (swine skin, Type A: Sigma) and incubate at 37 ° C for at least 1 hour. Remove the gelatin solution from the culture dish and add the cell suspension. It can be used as a feeder cell after several hours.
  • gelatin solution swine skin, Type A: Sigma
  • ES cells were established using a feeder cell as follows.
  • Feeder cell culture medium was replaced with ES cell culture medium.
  • the inner cell mass was isolated from blastocysts by immunosurgery or mechanical manipulation. The brief description of the immunosurgery method is as follows.
  • the zona pellucida was removed by enzyme treatment or the like, and incubated in an antibody solution that reacts with mouse surface antigens. Next, incubation in complement solution removed the outermost cell vegetative ectoderm and separated the inner cell mass.
  • the cells established in this example are confirmed to be stem cells.
  • ES cells were fixed with 4% PFA, and standard immunostaining of cultured cells (Willingham, MC et. Al., 1985. An Atlas of Immunofluorescence m Cultured Cell, Academic Press, Orlando, FL, pp. 1-13 .) Immunostaining was performed according to. For blocking, 0.1% Triton XZPBSZ 2% skim milk was used for one hour at room temperature, and for washing, 0.1% Triton XZPBS was used for 4 minutes at room temperature for 5 minutes.
  • the primary antibodies are SS EA-4 and TRA-1-60 monoclonal antibodies diluted 1Z100 with 200 ⁇ g / ml (CLONTECH), and the secondary antibodies are FITC-labeled goat anti-mouse IgG (H + L) ( ZYMED LABORATORIES, INC) diluted 1Z200 was used. After the reaction of the secondary antibody, staining was performed in the order of rhodamine phalloidin (Molecular Probe) and DAPI (SIGMA) to detect the signal.
  • Molecular Probe rhodamine phalloidin
  • SIGMA DAPI
  • ALP alkaline phosphatase
  • the histological staining of ALP was performed as follows. The culture dish was washed twice with Dulbecco's PBS (—), fixed with 95% cold ethanol at 4 ° C for 30 minutes or more, and then dehydrated with absolute ethanol at 4 ° C for 30 minutes or less. After removing the fixative and washing the dish with 0.1 M Tris-HCl (pH 9.0-9.5) at room temperature 3 times for 5 minutes, 1.5 ml of 1 ml of staining solution (naphthol AS-BI phosphate ( Sigma, Catalog No.
  • the volume was made up to 10 ml with ES cell culture medium. Stored at 30 ° C. Used at 4 ° C.
  • acetoamide 0.65 g was weighed, 1. 42 ml of DMSO and 2.24 ml of propylene glycol were added, and the volume was made up to 10 ml with ES cell culture medium. Stored at 30 ° C. Used at 4 ° C.
  • the force-quizal ES cells prepared in Example 2 were cultured in a 10 cm dish and cryopreserved by 1/3 each of the three methods of slow cooling, vitrification, and simplified vitrification. After storing at 150 ° C. for several days, ES cells were thawed by each method, and thawed in a 3.5 cm dish coated with one-tenth and one-half of that amount with feeder cells. The efficiency of each cryopreservation method was determined by counting the number of ES cell colonies and the number of ES cells on the fourth day after thawing.
  • the slow cooling method known as the prior art is based on a kit sold by Geron, It carried out as follows. The outline is as described in Non-Patent Document 3.
  • a 10 ml medium was prepared in a 15 ml centrifuge tube in advance.
  • the vitrification method was also performed based on the prior art, but the tube used was not a straw shape but a sealed shape with a closed tip. Others were performed based on Non-Patent Document 4.
  • ES cells were treated with 0.25% trypsin and then pipetted to separate the cells one by one.
  • Fig. 1 shows the experimental results.
  • Figure 1 shows the case of using methods A, B and C.
  • Example 5 Effect of DE medium
  • concentration of DES medium DMSO 20%, ethylene glycol 20%, sucrose 0.5M as X 1 solution
  • DES medium DMSO 20%, ethylene glycol 20%, sucrose 0.5M as X 1 solution
  • 0.5 X DES, 0.775 X DES, 1. OX DES, 1.25 X DES and 1.5 X DES as described in Example 4.
  • Vitrification freezing method was performed. The result is shown in Fig.2.
  • Fig. 2 it was found that the freezing efficiency of 0.75 X DES was significantly higher than that of 1 X DES. This demonstrates that it is better to use a thinner DES in the vitrification freezing method.
  • Such an effect has not been known so far, and therefore, the effect found for the first time in the present invention is shown.
  • DA media was prepared by mixing 15%, 20%, 25%, 30% DMSO and 15%, 20%, 25%, 30% propylene glycol and is described in Example 4.
  • the cryopreservation experiment was conducted by the simple vitrification method. The results are shown in Fig. 3.
  • DMS O and propylene glycol are preferably present in a total amount of about 30% to about 50%, and the ratio thereof is about 1: 2-2: 1.
  • the efficiency of the DAP medium did not reach, but the efficiency was far superior to the cryopreservation efficiency achieved by the prior art.
  • cryopreservation efficiency was confirmed using a storage medium containing DMSO and propylene glycol alone in 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, and 60%, respectively.
  • a simple vitrification method was performed. The results are shown in Figs. As is apparent from the results, it was found that DMSO is preferably present alone at 20-40% and propylene glycol at 40-60%. However, the efficiency of the DAP media was insignificant at any ratio.
  • Example 7 The experiment described in Example 7 is performed every 0.5M within the range of DMSO concentration (0.5M-5M), propylene glycol (0.5M-8M), and acetoamide (0.5M-3M). .
  • concentration of DMSO has a remarkable effect of improving cryopreservation in the range of 1M-4M starting from 2M
  • propylene glycol has a remarkable effect of improving cryopreservation in the range of 1.5M-6M.
  • the effect of improving cryopreservation is remarkable in the range of 0.5M-2M.
  • acetamide is not essential even in the case of OM, because the effect of improving freezing preservation can be seen with the other two components.
  • the DMSO concentration was 2.5% between 2.5% and 40% every 2.5%, and ethylene glycol was 2.5% between 2.5% and 40%.
  • DMSO has a remarkable effect of improving cryopreservation in a concentration range of 7.5% -30%
  • ethylene glycol has a remarkable effect of improving cryopreservation in a concentration range of 7.5% -30%. It is confirmed that the effect of improving the cryopreservation is remarkable in the sucrose concentration range of 0.1875M—0.75M.
  • ES cells stored and thawed in Example 4 of the present invention are washed 3 times with serum-free medium to completely remove the serum.
  • Undifferentiated cells are cultured on PA6 feeder cells for 8-11 days using ES cell medium containing KSR (Knockout Serum Replacement; GIBCO / Invitrogen Cat. No. 10828-028) (Kawasaki et al., 2000, Neu ron 28; 31-40, Tada et al., 2003; Dev. Dyn., 227; 504-510 .;). This allows them to differentiate into neurons.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • Example 4 of the present invention the teratoma-forming ability of ES cells stored and thawed in Example 4 of the present invention was confirmed. Approximately 10 7 ES cells of the present invention are transplanted subcutaneously and intraperitoneally into SCID mice (CLEA, Tokyo, Japan), and the state is observed for 1 to 3 months.
  • ES cells preserved by the method of the present invention various tissues derived from ectoderm, endoderm, mesoderm and the like are observed. Therefore, it is demonstrated that ES cells preserved by the method of the present invention probably retain the ability to function.
  • Example 4 of the present invention the differentiation of ES cells stored and thawed into hematopoietic cells is observed.
  • a MEM Gibco BRL, Cat # 11900— 0
  • ES cells were differentiated into mesoderm cells. Undifferentiated ES cells are suspended in the above-mentioned differentiation-inducing medium and seeded at a density of 1 ⁇ 10 4 Zwell on type IV collagen-coated 6 plates. Incubate it at 37 ° C, 5% CO for 4 days.
  • the cells were suspended in 10 ml of HBSSZBSA and centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes to remove the supernatant.
  • the cells were suspended in 0.1 ml of normal mouse serum per 1 ⁇ 10 7 cells and allowed to stand for 10 minutes. Appropriate amounts of E-forced doherin antibody and anti-FLK1 antibody were placed on ice water for 20 minutes. After washing the cells twice with HBSSZBSA, the FLK1 + E—forced doherin-mesoderm cells are sorted by FACS.
  • the mesoderm cells selected here are suspended in a culture medium for differentiation induction, and seeded on a type IV collagen-coated plate at a density of 3 x 10 5 .
  • the culture solution is 3 ml per well, 37 ° C, 5%
  • VE-forced doherin + vascular endothelial cells are sorted by FACS to prepare vascular endothelial cells.
  • ES cells stored by the method of the present invention also differentiate into hematopoietic cells.
  • ES cells thawed after being cryopreserved in the above-described examples are cultured in suspension in a basic medium containing KSR (eg, DMEM) to form embryoid bodies. After embryoid body formation
  • KSR eg, DMEM
  • the embryoid bodies are collected and seeded in a gelatin-coated culture dish.
  • Cardiomyocytes are separated by culturing for 1 to 3 weeks in a basic medium containing KSR.
  • ES cells can be prepared as described in Non-Patent Document 5. Specifically, the procedure is carried out according to the procedure described in Example 1.
  • mice ES cells thus obtained are stored according to Example 5. The following points should be noted when using mouse cells. In the case of mice, it is important to use a marker specific to the mouse.
  • tissue stem cells tissue stem cells
  • tissue stem cells neural stem cells, mesenchymal stem cells, etc.
  • ES cells are collected from the force-quix monkey, stored in the same manner as in Example 5, and then differentiated into neural cells.
  • Differentiation into nerves involves appropriate differentiation factors (nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), neurology) Trophime (neuro trophin), IL- 6, TGF- j8, TNF) carried by the culturing in a medium containing. It can be seen that transplantation of this nerve cell implant can function when it is transplanted into a force quizal subject having a neurological disorder.
  • NGF nerve growth factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • GDNF glial cell-derived neurotrophic factor
  • Trophime neurotrophin
  • IL- 6, TGF- j8, TNF TNF
  • Example 4 The method described in Example 4 was modified to demonstrate that the storage efficiency of human ES cells was increased. The detailed protocol is shown below.
  • DAP is highly cytotoxic and should be done as quickly as possible. As a guide, within 15 seconds.
  • the DAP to be added may be 200 1 regardless of the number of cells to be frozen.
  • human ES cells are prepared, stored as described in Example 15, and then differentiated into skin cells. Differentiation into the skin is necessary in a medium containing an appropriate differentiation factor (in the case of skin (keratinocytes), TGF—j8, FGF—7 (KGF: keratinocyte growth fact or), EGF). It is achieved by culturing using appropriate feeder cells accordingly. It can be seen that when this skin cell transplant is transplanted into a human subject having a skin disease, the transplant functions and the skin function is restored.
  • an appropriate differentiation factor in the case of skin (keratinocytes), TGF—j8, FGF—7 (KGF: keratinocyte growth fact or), EGF.
  • the present invention has great utility in regenerative medicine.
  • the preferred embodiment is highly useful because stem cells can be easily stored with high storage efficiency, which could not be achieved in the past. Therefore, the present invention has applicability in the industry of manufacturing regenerative medicine and its therapeutic medicine.

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Abstract

　本発明は、従来技術では達成し得ない程度の効率で幹細胞（特に、ヒトを含む霊長類のＥＳ細胞）を凍結保存することができる簡便な技術を提供することを課題とする。本発明は、幹細胞を保存するための方法であって、Ａ）ａ）ＤＭＳＯ；ｂ）プロピレングリコール；およびｃ）培地、を含む、媒体中で、幹細胞を急速凍結させる工程、を包含する、方法を提供する。本発明は、幹細胞を保存するための媒体および幹細胞を保存するためのシステムも提供する。

Description

明 細 書
幹細胞の凍結保存法およびシステム
技術分野
[0001] 本発明は、幹細胞の分野にある。より詳細には、本発明は、幹細胞 (特に、霊長類 の胚性幹細胞 (本明細書にぉ 、て以下 ES細胞とも 、う） )の効率よ 、保存のための 方法に関する。
背景技術
[0002] 再生医療による疾患治療が最近注目を浴びている。再生医療は、臓器移植のほか 、医療機器での補助システムの利用などに代わる治療法としての役割が期待されて いる。しかし、これを臓器または組織機能不全を呈する多くの患者に対して日常的に 適応するまでには至って ヽな 、。
[0003] 再生医療の中心にある幹細胞、特に ES細胞は、その医療応用面での可能性から 近年その重要性を増して 、る。ヒト ES細胞はその中でも特に重要であるがその榭立 または安定した継代維持が難しく効率的な利用を阻害している。ヒトを含めた霊長類 ES細胞は、その榭立必要とされる胚盤胞の供給がきわめて少なぐ少数の胚盤胞か ら効率よく ES細胞株の榭立を行う必要がある。従来の方法では胚盤胞からの榭立の 効率は 10から 30%程度であると!/、われて!/、る。
[0004] トランスジエニック動物の作出力 ES細胞を使用することで可能となっている。 ES 細胞とは、通常胚盤胞と呼ばれる発生段階の胚に存在する将来動物個体となる未分 化な細胞群である内部細胞塊 (Inner cell mass, ICM)の細胞を培養することによ つて得られた細胞株である。 ES細胞は、 M. J. Evans と M. H. Kaufman (1981 年に非特許文献 1)に続いて、 G. R. Martin (非特許文献 2)によりマウスで多分ィ匕 能を有する細胞株として樹立された。
[0005] ES細胞が、霊長類で榭立され、その応用に対する期待がますます高まる中、これ らの問題を克服するために幹細胞治療とその応用を中心とした再生医学に対する期 待がますます高まっている。
[0006] ES細胞などの幹細胞は、凍結保存されることが頻繁に行われている力 従来行わ れている緩慢冷却法 (例えば、 Geron社が提供する方法 (非特許文献 3) )では、手 順が煩雑であり、し力も、保存効率がそれほど高くないことが知られている。
[0007] より最近になってガラス化法と!/、う方法が開発された (非特許文献 4)。この方法は、 効率が緩慢冷却法よりも高ぐしかも、簡便であるということで注目を浴びた。しかし、 この方法で用いられるストロー状の容器のために、汚染の危険性が格段に上昇したと いう欠点がある。
[0008] 幹細胞は、非特許文献 5に記載されるように種々の応用が期待されている力 その 保存方法の開発はそれほど進んで 、な 、。
[0009] このように、種々の観点力 簡便で確実な幹細胞の凍結保存方法、ならびにそのた めの媒体およびシステムが待ち望まれて 、る。
非特許文献 1： M.J.Evans & M.H.Kauftnan:Nature,292, 154, 1981
非特許文献 2 : G.R.Martin:Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78,7634,1981
非特許文献 3 : Freshney R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic
Technique'WIley— Liss,Inc.,pp.255— 265、 1994
非特許文献 4: Reubinoff BE, Para MF, Vajta G, Trounson AO., Hum Reprod. 2001 Oct;16(10):2187-94
非特許文献 5 :幹細胞'クローン 研究プロトコール 中辻編、羊土社 (2001) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明は、従来技術では達成し得ない程度の効率で幹細胞 (特に、霊長類の ES 細胞)を凍結保存することができる簡便な技術を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明は、一部、上記課題が、プロピレングリコールを含む媒体を用いることによつ て、急速凍結をすると、簡便に、かつ、保存効率よぐ幹細胞を凍結保存することがで きることを予想外に見出したことによって解決されることを本発明者らが見出したこと によって完成された。
[0012] 一つの局面において、本発明は、幹細胞を保存するための媒体（medium)であつ て、 A)ジメチルスルホキシド（DMSO)；
B)プロピレングリコール；および
C)培地 (culture medium)、
を含む、媒体を提供する。
[0013] 一つの実施形態において、上記 DMSOは、上記媒体の 15— 40%を占める。
[0014] 一つの実施形態において、上記プロピレングリコールと上記 DMSOとは、合計で、 上記媒体の約 30%より多ぐかつ、上記媒体の約 50%未満を占める。
[0015] 一つの実施形態において、上記 DMSOと上記プロピレングリコールとは、約 1： 2— 約 2 : 1のモル比率で存在する。
[0016] 一つの実施形態において、上記 DMSOと上記プロピレングリコールとは、約 3 : 2の モル比率で存在する。
[0017] 一つの実施形態において、本発明の媒体は、ァセトアミドおよび糖からなる群より選 択される成分をさらに含む。
[0018] 一つの実施形態において、上記 DMSOは約 1M— 4M存在し、上記プロピレングリ コールは約 1. 5M— 6M存在する。
[0019] 一つの実施形態において、上記 DMSOは、約 2M存在する。
[0020] 一つの実施形態において、上記プロピレングリコールは、約 3M存在する。
[0021] 一つの実施形態において、上記 DMSOは約 2M存在し、上記プロピレングリコー ルは約 3M存在する。
[0022] 一つの実施形態において、上記 DMSOは約 1M— 4M存在し、上記プロピレングリ コールは約 1. 5M— 6M存在し、さらに約 0M— 2Mのァセトアミドを含む。
[0023] 一つの実施形態において、上記 DMSOは、約 2M存在する。
[0024] 一つの実施形態において、上記プロピレングリコールは、約 3M存在する。
[0025] 一つの実施形態において、上記ァセトアミドは、約 1Mで含まれる。
[0026] 一つの実施形態において、上記 DMSOは、約 2M存在し、上記プロピレングリコー ルは、約 3M存在し、本発明の媒体は約 1Mァセトアミドを含む。
[0027] 一つの実施形態において、上記培地は、 DMEM培地および F12からなる群より選 択される培地またはそれらの混合物を含む。 [0028] 一つの実施形態に： 、て
[0029] 一つの実施形態に ： 、て 上記幹細胞は、組織幹細胞および ES細胞力 なる群 より選択される。
[0030] 一つの実施形態に ： 、て 上記幹細胞は、 ES細胞を含む。
[0031] 一つの実施形態に ： 、て 上記幹細胞は、霊長類 ES細胞を含む。
[0032] 一つの実施形態に ： 、て 上記幹細胞は、ヒト ES細胞を含む。
[0033] 一つの実施形態に ： 、て 上記保存は、凍結保存である。
[0034] 一つの実施形態に ： 、て 上記保存は、急速凍結保存である。
[0035] 一つの実施形態に ： 、て 上記急速凍結保存は、約 30°CZ分以上の速度で凍結 される。
[0036] 一つの実施形態に ： 、て 本発明の媒体は、上記保存の後、急速解凍される。
[0037] 一つの実施形態に ： 、て 上記急速解凍は、約 50°CZ分以上の速度で解凍され
5
[0038] 一つの局面において、本発明は、幹細胞を保存するための媒体 (medium)であつ て、
A) DMSO ;
B)エチレングリコール；および
C)培地 (culture medium)、
を含み、
ここで、上記 DMSOおよび上記エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、 2 0重量％未満である、媒体を提供する。
[0039] 一つの実施形態において、上記 DMSOおよびエチレングリコールは、約 15%ずつ 含まれる。
[0040] 一つの実施形態において、本発明の媒体は、さらに、糖を含む。
[0041] 一つの実施形態において、上記糖は、スクロースを含む。
[0042] 一つの実施形態において、上記 DMSOは上記媒体の約 7. 5%— 30%含まれ、上 記エチレングリコールは上記媒体の約 7. 5%— 30%含まれ、上記スクロースは、約 0 . 1875M— 0. 75M含まれる。
[0043] 一つの実施形態において、上記 DMSOは上記媒体の約 15%含まれ、上記ェチレ ングリコールは上記媒体の約 15%含まれ、上記スクロースは、約 0. 375M含まれる
[0044] 一つの実施形態において、上記媒体は、上記幹細胞を凍結保存するためのもので ある。
[0045] 一つの局面において、本発明は、幹細胞を保存するための方法であって、
A) a) DMSO；
b)プロピレングリコール；および
c)培地、
を含む、媒体中で、幹細胞を急速凍結させる工程、
を包含する、方法を提供する。
[0046] 一つの実施形態にお!、て、上記急速凍結は、封入管を用いて行われる。
[0047] 一つの実施形態において、上記幹細胞は、大きなコロニーのまま剥離されたもので ある。
[0048] 一つの実施形態において、上記幹細胞と、上記媒体とは、約 1 X 104/100^ 1- 約 5 X IOVIOO μ 1の比率で存在する。
[0049] 一つの実施形態に ：おいて、上記急速凍結は、液体窒素中で行われる。
[0050] 一つの実施形態に ：おいて、上記保存後、急速に解凍する工程をさらに包含する。
[0051] 一つの実施形態に ：おいて、上記急速解凍は、ピペッティングによる。
[0052] 一つの実施形態に ：おいて、上記幹細胞は、組織幹細胞および ES細胞を含む。
[0053] 一つの実施形態に ：おいて、上記幹細胞は、 ES細胞を含む。
[0054] 一つの実施形態に ：おいて、上記幹細胞は、霊長類 ES細胞を含む。
[0055] 一つの実施形態に ：おいて、上記幹細胞は、ヒト ES細胞を含む。
[0056] 一つの実施形態に ：おいて、上記媒体は、本明細書に記載される任意の実施形態 の形態を採ることができる。
一つの局面において、本発明は、幹細胞を保存するための方法であって、
A) a) DMSO； b)エチレングリコール；および
c)培地 (culture medium)、
を含み、
ここで、上記 DMSOおよび上記エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、 2
0重量％未満である、
媒体中で、幹細胞を凍結させる工程、
を包含する、方法を提供する。
[0058] 一つの実施形態にお!、て、上記媒体は、本明細書に記載される任意の実施形態 の形態を採ることができる。
[0059] 一つの局面において、本発明は、幹細胞を保存するためのシステムであって、
A) a) DMSO；
b)プロピレングリコール；および
c)培地、
を含む、媒体；
B)急速凍結する手段、
を備える、システムを提供する。
[0060] 一つの実施形態において、本発明のシステムは、さら〖こ、封入管を備える。
[0061] 一つの実施形態にお!、て、上記幹細胞は、組織幹細胞および ES細胞を含む。
[0062] 一つの実施形態において、上記幹細胞は、 ES細胞を含む。
[0063] 一つの実施形態において、上記幹細胞は、霊長類 ES細胞を含む。
[0064] 一つの実施形態において、上記幹細胞は、ヒト ES細胞を含む。
[0065] 一つの実施形態にお!、て、上記媒体は、本明細書に記載される任意の実施形態 の形態を採ることができる。
[0066] 一つの局面において、本発明は、幹細胞を保存するためのシステムであって、
A) a) DMSO；
b)エチレングリコール；および
c)培地 (culture medium)、
を含み、 ここで、上記 DMSOおよび上記エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、 2 0重量％未満である、
媒体；
B)凍結する手段、
を備える、システムを提供する。
[0067] 一つの実施形態にお!、て、上記媒体は、本明細書に記載される任意の実施形態 の形態を採ることができる。
[0068] 一つの局面において、本発明は、
a) DMSO ;
b)プロピレングリコール；および
c)培地、
を含む、媒体の、幹細胞を急速凍結保存するための、使用を提供する。
[0069] 一つの実施形態にお!、て、上記媒体は、本明細書に記載される任意の実施形態 の形態を採ることができる。
[0070] 一つの局面において、本発明は、
a) DMSO ;
b)エチレングリコール；および
c)培地 (.culture mediumノ、
を含み、
ここで、上記 DMSOおよび上記エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、 2 0重量％未満である、
媒体の、幹細胞を凍結保存するための、使用を提供する。
[0071] 一つの実施形態において、上記媒体は、本明細書に記載される任意の実施形態 の形態を採ることができる。
[0072] 従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な 説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白〖こなることが理解される。
発明の効果
[0073] 本発明によって、特に幹細胞を効率よく保存するための技術が提供される。特に、 簡便で、かつ、効率よく幹細胞を保存するという従来達成不可能であった効果を本 発明が達成する。このようにして、本発明によって ES細胞を含む種々の幹細胞を効 率よく保存することができるようになった。
図面の簡単な説明
[0074] [図 1]図 1は、本発明の DAP媒体を用いて幹細胞 (ES細胞）を凍結保存し、解凍した とき (すなわち、簡易ガラス化法)の保存効率 (真ん中）を、 DES媒体を用いて通常の ガラス化法を用いて行った結果 (右）と、 DMSO媒体を用いて行った緩慢冷却法 (左 )と比較して示す。図 1では、独立した 3回の実験データを示し、バーは標準誤差を示 す。 DAPに対して有意差あり（t検定， p< 0. 05)。
[図 2]図 2は、実施例 6に記載されるように、 DESを用いたガラス化凍結法の改良を示 す。
[図 3]図 3は、 DMSOとプロピレングリコール（PG)との比率を種々変更したときの凍 結保存効率を示す。 100を DAP (実施例 5参照）を用いて行った場合の効率として相 対比率を示す。
[図 4]図 4は、 DMSOのみを含む媒体を用いて本発明の簡易ガラス化法を用いた場 合の凍結保存効果を示す。
[図 5]図 5は、プロピレングリコールのみを含む媒体を用いて本発明の簡易ガラス化法 を用いた場合の凍結保存効果を示す。
[図 6]図 6は、 ES細胞榭立スキーム例を示す。
[図 7]図 7は、ヒト ES細胞を記載の方法で凍結し、解凍した後の細胞生存率を示す。 10%DMSOを使用した緩慢凍結法では解凍後の細胞生存率がほぼ 0%に近かつ たのに対し、簡易凍結法を用いることで 10%以上の細胞生存率を得ることができ、生 存率の著しい向上が示された。
発明を実施するための最良の形態
[0075] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及 しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形 の冠詞 (例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など）は、特に言及しない限り、そ の複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用 される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられるこ とが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用さ れる全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によつ て一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書 (定義を含め て）が優先する。
[0076] 以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙し、必要な技術の説 明を行い、本発明を説明する。
[0077] 本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の 意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜 構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する 生命体をいう。本発明においては、どのような細胞でも対象とされ得る。本発明で使 用される「細胞」の数は、光学顕微鏡を通じて計数することができる。光学顕微鏡を通 じて計数する場合は、核の数を数えることにより計数を行う。細胞は、へマトキシリン ェォシン (HE)染色を行うことにより細胞外マトリクス (例えば、エラスチンまたはコラー ゲン)および細胞に由来する核を色素によって染め分ける。この細胞を光学顕微鏡 にて検鏡し、特定の面積 (例えば、 200 m X 200 μ m)あたりの核の数を細胞数と 見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存在 する細胞であっても、人工的に改変された細胞 (例えば、融合細胞、遺伝子改変細 胞)であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あ るいは、正常に成長したトランスジエニック動物の胚、血液、または体組織、または正 常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定さ れない。
[0078] 本明細書にぉ 、て「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能 (すなわち多能性）
(「pluripotency」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときに その組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、 ES細胞または組織幹細 胞 (組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞とも 、う）であり得るがそれ らに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞 (たと えば、再プログラム化された細胞など)もまた、幹細胞であり得る。 [0079] 本明細書において「胚性幹細胞」または「ES細胞」とは、交換可能に用いられ、初 期胚に由来する任意の多能性幹細胞をいう。通常 ES細胞は、全能性またはほぼ全 能性を有するとされる。この ES細胞を正常な宿主胚盤胞へ導入し仮親子宮へ戻すこ とによってキメラ作製を行ったところ、高いキメラ形成能を持つ、生殖系列キメラ (ES 細胞由来の機能的生殖細胞を持つキメラマウス）が得られた (A. Bradley et al. ： Nature, 309, 255, 1984)。 ES細胞株は、培養下で、種々の遺伝子導入法（例え ばリン酸カルシウム法、レトロウイルスベクター法、リボゾーム法、エレクト口ポレーショ ン法等)の適用が可能である。また、遺伝子が組込まれた細胞を選別する方法をェ 夫し、相同遺伝子組換え（homologous recombination)を利用し、特定の遺伝子 を狙って改変（置換、欠失、挿入)させた細胞のクローンを得ることもできる。インビトロ でこのような処理をした ES細胞株は生殖系列への分ィ匕能を保持することから、ある特 定の遺伝子の機能を個体レベルで調べる研究が現在盛んに行われている（M. R. Capecchi: Science, 244, 1288, 1989)。 ES細胞を利用したトランスジエニックマ ウス作出法は、ある特定の遺伝子のみを任意に改変させた個体を得ることを可能に した点でマイクロインジェクション法によるトランスジエニック動物作出法にはない多く の利点が考えられる。特に、特定の遺伝子を不活ィ匕させたノックアウト動物を作出で きるようになり、遺伝子の機能を解明したり、外来性の遺伝子のみを発現させることが できる。従って、 ES細胞の榭立が容易になれば、その効果は図り知れない。
[0080] 本明細書において「組織幹細胞」とは、 ES細胞とは異なり、分化の方向が限定され ている細胞をいう。通常、組織幹細胞は、組織中の特定の位置に存在し、未分化な 細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞 は、核 Z細胞質比が高ぐ細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分ィ匕 能を有し、細胞周期が遅ぐ個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書におい て使用される場合は、幹細胞としては、好ましくは ES細胞が使用され得る。
[0081] 本発明で用いられる幹細胞として使用される細胞は、幹細胞またはその対応物が ある限り、どの生物由来の細胞 (例えば、哺乳動物 (例えば、単孔類、有袋類、貧歯 類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、 海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ゥサギ目など）由来の細胞）が用いられてもよい 。さらに好ましくは、幹細胞としては、霊長類 (たとえば、チンパンジー、二ホンザル、ヒ ト）由来の細胞が用いられる。最も好ましくは、幹細胞としてはヒト由来の細胞が用い られる。
[0082] ES細胞株は、キメラマウス、ノックアウトマウスなどの作製において非常に重要であ り、これらの技術により遺伝子機能の解析が飛躍的に進歩した。 ES細胞から特定の 糸且織を分ィヒ誘導する系の開発が進んでおり、移植医療への応用の現実味を帯びて いる。また、ヒト ES細胞を利用した臨床応用を考えた場合、サルなどの適切なモデル 動物の ES細胞を利用して前臨床研究をすることは必須に近い程度に重要であると 考えられ、その榭立もまた重要である。
[0083] ES細胞株の榭立は、フィーダ一細胞を用いて行われる。通常、 ES細胞は、胚盤胞 力 分離した内部細胞塊 (ICM)をフィーダ一細胞上で培養することによって榭立さ れる。通常フィーダ一細胞としては、マウス胎仔繊維芽細胞あるいはそれ由来の細胞 株 STOが用いられている。
[0084] 次に ES細胞の一般的な榭立法を解説する。マウスで説明すると、受精後 3. 5日で 胚は胚盤胞に発生する。胚盤胞から胚本体を形成する未分化幹細胞である内部細 胞塊を免疫手術により分離する。この ICMは、胎盤などが作る細胞である栄養外胚 葉への分化能を有する。このため、 3. 5日胚から直接 ICMを分離すると ICMが栄養 外胚葉へと分化することから未分化細胞が喪失することがよくあるとされる。 3. 5日胚 をさら〖こ 1日培養し、 4. 0-4. 5日胚とすると、胚盤胞は透明帯を脱出する。このステ ージでは ICMはもはや栄養外胚葉には分ィ匕しない。このような状態から、 ICMを分 離し、培養を開始すると、未分ィ匕細胞の割合を高めることができる。従って、本発明 における幹細胞の榭立の際も、このような日数の未分ィ匕細胞を用いることができる。
[0085] ES細胞を榭立する際には、胚盤胞は、フィーダ一細胞上に直接培養することもで きるが、直接の場合は、胚盤胞が接着し栄養外胚葉が伸展して ICMが露出すること 力もあまり好ましくない。これを分離し培養したものを用いてもよいが、好ましくは免疫 手術が用いられる。模式的な ES細胞株榭立スキームを図 6に示す。簡単に言うと、 免疫手術で分離した ICMをフィーダ一細胞上で培養し、継代を続けると分ィ匕した細 胞に混じって、未分化幹細胞のコロニーが現れる。これを分離し、継代を行うことで、 安定して維持することができる ES細胞株を榭立することができる。本発明を用いると 、榭立率が 80%を超えることから、安定して維持することができる ES細胞を得る効率 も格段に上がる。
[0086] ES細胞を榭立するためには、実施例において例示的に使用されるフィーダ一細胞 のほ力、 PBS (Caゝ Mg不含）、 0. 25%トリプシン ' lmM EDTA in PBS、 ES細 胞用培地（ダルベッコ改変 Eagle培地（DMEM) (ハイグルコース） 400ml、ゥシ胎仔 血清 100ml、非必須アミノ酸溶液（Gibco) 4ml、ヌクレオシド溶液 (ヌクレオシド、グ ァノシン、シチジン、ゥリジン各 3mM、チミジン lmM水溶液、 40°Cに加熱して溶解し 、濾過滅菌し、—20°Cで保存する） 4ml、 2 メルカプトエタノール 4 1 (0. lmM)、 LI F 100 l (2000UZml) )、 Μ2培地（Sigmaなどから入手可能）、 M16培地（Sig maなど力 入手可能）、酸性タイロード液 (Sigmaなど力 入手可能）、抗マウス血清 (マウス脾臓細胞またはリンパ球 5 X 108細胞をゥサギに 2週間おきに 3回静脈免疫し 、最終免疫から 2週間後に採血する。これを抗血清として非働化し 80°Cで保存する )、モルモット補体、流動パラフィン (軽質;ナカライテスタなど力 入手可能)を用意す ることが必要である。実験器具としては、 COインキュベーター、実体顕微鏡、キヤピ
2
ラリー、マルチウエルプレート（例えば、 4ゥエル、 12ゥエル、 NUNCなどから入手可 能)を用意するとよい。
[0087] 以下に ES細胞の榭立の例示的なプロトコール記載する。このプロトコールは、京都 大学再生医科学研究所においてまとめられたヒト ES細胞株榭立計画書に準じて記 載される力 本明細書では、この特定のプロトコールに限定されず、いずれのプロトコ ールであっても用いることができる。
[0088] (1)凍結胚の解凍と胚盤胞期までの培養
凍結保存されたヒト受精卵または胚盤胞期までの初期胚を順次解凍して培養を行 う。個々の凍結胚容器からは提供者を同定できるものは除去されているため、各回の 解凍 ·培養実験に使用されたヒト受精胚の出自は同定され得ない。し力 ながら、各 々のヒト受精胚の取扱がおろそかにならないように、凍結胚として受け入れた時点か らひとつの凍結容器内に納められたヒト受精胚を榭立研究の過程で個々の存在とし て尊重し、どのような経過をたどつたかを記録する。 [0089] (2)内部細胞塊の分離と細胞株の榭立
胚盤胞期まで到達した胚 (受精後の発生期間が 14日以内のもの）について、抗ヒト 血清による免疫手術などの方法によって内部細胞塊を分離したのち、フィーダ一細 胞層の上で培養する。フィーダ一細胞としては、本実施例において例示されるフィー ダー細胞を用いることができる。内部細胞塊を採取した後の残部についても、礼節を もって取扱う。フィーダ一細胞の上で増殖した細胞を適時に解離して分割継代し、幹 細胞と思われる細胞コロニーの選別培養などを行ないながら、 ES細胞と思われる細 胞株を榭立する。この間に、培養維持方法や細胞凍結保存方法などの改良を目指し た研究を行う。
[0090] (3)幹細胞マーカー発現の有無および染色体検定
ES細胞であることを確認するために、幹細胞マーカー（アルカリ性フォスファターゼ 活性や特異的抗原)の検出を行なう。また核型解析を行なって染色体数や形態が正 常かどうかを検定する。
[0091] (4)分化能の検定
培養下での分ィ匕能を検定するために、培養条件の変更や細胞凝集塊作成による細 胞分化の誘導と各種機能細胞への分化能の解析を行なう。また免疫不全マウスなど への移植を行なってテラトーマ形成による組織分ィ匕能の解析を行なう。
[0092] (5)安全性確保と事故防止
ヒト凍結胚の一時的保存は専用の液体窒素タンクを用いることによって、榭立計画に 用いる以外の細胞や動物胚などに由来するウィルスと微生物による汚染を防ぐ。また 細胞培養実験には専用の炭酸ガスインキュベーターを用いることによって、他種類の 細胞との混合を防ぎ、ウィルスや微生物による汚染の可能性を小さくする。細胞培養 に用いた培養液や培養器具は、実験室内で加圧高温滅菌処理を行なったのちに廃 棄する。ヒト受精胚の保存および細胞株榭立を行なう実験室への入室者の管理を厳 重に行う。
[0093] 本明細書において「多能性」または「多分ィ匕能」とは、互換可能に用いられ、細胞の 性質をいい、 1以上、好ましくは 2以上の種々の組織または臓器に分ィ匕し得る能力を いう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない 限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて 制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化す ることは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮 性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生 (metaplasia )と呼ばれる。し力し間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり 化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。 ES細胞は、多能性を有する。組織 幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体 を構成する全ての種類の細胞に分ィ匕する能力は全能性といい、多能性は全能性の 概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系に おける、胚様体 (Embryoid Body)の形成、分ィ匕誘導条件下での培養等が挙げら れるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアツセィ 法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形種 (テラトーマ）の形成、胚盤胞への 注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げ られるがそれらに限定されない。
[0094] 本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の 細胞に分ィ匕する能力は「全能性」といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ただ し、明確に区別する場合は、全能性と多能性とは区別され得、前者はどのような細胞 へも分ィ匕し得る能力をいい、後者は、複数の方向を有するが、生物が可能なすべて の方向には分ィ匕できない能力を有することをいう。また、 1つの方向にのみ分ィ匕する 能力は、単能性ともいう。
[0095] 本明細書において全能性と多能性とは、例えば、受精後の日数により判定すること ができ、例えば、マウスであれば、受精後約 8日を基準として区別され得る。理論に束 縛されないが、マウスでは、受精後、以下のような経過をたどることが通常である。受 精後 6. 5日（E6. 5とも表記する）では、原始線条 (原条ともいう）がェピブラストの片 側に出現し、胚の将来の前後軸が明らかになる。原条は、胚の将来の後方端を示し 、外胚葉を横切って円筒の遠位端まで達する。原条は、細胞運動が行われる領域で あり、その結果、将来の内胚葉と中胚葉とが形成されることになる。 E7. 5までに結節 の前方に頭部突起が出現し、この部分には脊索と、それを取り囲んで下層には将来 の内胚葉、上層には神経板が形成されることになる。結節は、 E6. 5日ごろカゝら現れ 、後方へと移動し、軸構造が前から後ろへと形成される。 E8. 5日までに胚は幾分丈 が長くなり、その前端には大部分前方神経板力もなる大きな頭部ヒダが形成される。 体節は E8日力 1. 5時間に 1個の割合で前方力も後方へと形成され始める。この時 期を越えた細胞は、仮に胎盤に戻したとしても、脱分ィ匕をしない限りもはや全能性を 示さず、個体を形成しない。これより前では特別の処理をしなくても全能性を示し得る ことから、この点が全能性の分岐点であるといえる。このことは、 ES細胞がこれ以降の 胚力 樹立することが困難であり、これ以降の胚力 は通常 EG (生殖細胞由来)細胞 と呼ばれる細胞が榭立されることから、そのような意味でも分岐点であるといえる。
[0096] 本明細書にぉ 、て「分ィ匕 (した)細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞 (例 えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほ とんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、脾実質細胞、脾管細胞、肝 細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血 管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられ る。本発明において用いられる場合、分ィ匕細胞は、集団または組織の形態であって ちょい。
[0097] 本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、 その DNAを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性 が限定されている力または消失している。本明細書において使用される体細胞は、 天然に存在するものであってもよぐ遺伝子改変されたものであってもよい。
[0098] 本明細書にぉ ヽて「繊維芽細胞」とは、支持組織の繊維成分を供給し，繊維性結 合組織の重要な成分をなす細胞をいう。組織切片図では、扁平で長目の外形をもち 、不規則な突起を示すことが多い。細胞質は、ミトコンドリア、ゴルジ体、中心体、小脂 肪球などを含むが、そのほかに特殊な分ィ匕は示さない。核は楕円形をしており、しば しば膠原繊維に密接して存在する。
[0099] 本明細書において「フィーダ一層」または「フィーダ一細胞」 (feeder layerまたは f eeder cell)とは、互換可能に用いられ、培養基質に設けられる、単独では培養維 持することのできない細胞種の増殖および Zまたは分ィ匕形質発現を可能にするよう な、他の細胞種による支持細胞層をいう。組織細胞には、通常の細胞培養条件下で は，分ィ匕形質発現はもとより増殖すらできない細胞種も多いといわれており、そのよう な細胞としては、例えば、幹細胞 (特に、 ES細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造 血幹細胞など)などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの細胞種は一般に 、栄養要求性が高く特異的な増殖因子、分化誘導因子を必要とする。このような細胞 種でも生体内でのその細胞種の支持細胞あるいはそれと類似の細胞が形成する特 定の細胞の層を培養基質に活用することで、培養される細胞種が要求する因子およ び Zまたは栄養源が供給されることによって、増殖および分ィ匕をするようになる。フィ ーダー細胞として用いる細胞種は、対象となる細胞種によって選択される力 UV照 射、マイトマイシン Cなどの抗生物質処理などの方法で細胞増殖を抑制して用いるこ とが多い。
[0100] 本明細書において「対応物」とは、例えば、細胞について用いられる場合、ある種の 生物中の細胞に関し、同様の性質および Zまたは機能を有する別の種の細胞をいう
[0101] 本明細書において「胎児」または「胎仔」とは、交換可能に用いられ、哺乳動物の子 が各器官原基の分化を完了し，成長期に入ったとき力 出産までの期間にある生物 体をいう。
[0102] 本明細書において、「榭立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質 (例え ば、多分化能)を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになつ た状態をいう。したがって、榭立された幹細胞は、多分化能を維持する。榭立された 分化細胞は、特定の確定した機能を有する。榭立された分化細胞は癌化しているこ とが多いが、それに限定されない。
[0103] 本明細書において本明細書において「分化」とは、一般的には、 1つの系が 2つ 以上の質的に異なる系に分離することをいい、細胞、糸且織または臓器について用い られるとき、機能および Zまたは形態が特殊ィ匕することをいう。分化に伴い、通常、多 能性は減少または消失する。
[0104] 本発明の細胞は、細胞の保存を支持する限り、任意の培地または培養液を用いる ことができる。そのような培地または培養液としては、例えば、ダルベッコ改変 Eagle 培地（DMEM)、 M2、 M16、 P199、改変 Eagle培地（MEM)、ハンクス緩衝塩類 溶液（HBSS)、 Ham' s F12、 Eagle基本培地（BME)、 RPMI 1640、 MCDB104 、 MCDB153 (KGM)、 DMEMZF12 (1 : 1)などが挙げられるがそれらに限定され ない。保存用の培養液と解凍用の培養液は、同一または異なるものが使用され得る
[0105] このような培地または培養液には、デキサメタゾンなどの副腎皮質ステロイド、インス リン、グルコース、インドメタシン、イソブチルーメチルキサンチン（IBMX)、ァスコルべ ート— 2—ホスフェート、ァスコルビン酸およびその誘導体、グリセ口ホスフェート、ェスト ロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその 誘導体、酸性線維芽細胞増殖因子 (aFGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF) 、上皮細胞増殖因子 (EGF)、インスリン様増殖因子 (IGF)、トランスフォーミング増 殖因子 β (TGF β )、内皮細胞増殖因子 (ECGF)、骨形成タンパク質 (BMP)、血小 板由来増殖因子 (PDGF)などの増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノィ ン酸、ビタミン D、甲状腺ホルモン、血清 (ゥシ胎仔、ゥマ、ヒトなど）、へノ《リン、炭酸 水素ナトリウム、 HEPES、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（亜セレン酸ナトリウ ムなど）、リノレン酸、 3—イソブチルー 1ーメチルキサンチン、 5—ァザンシチジンなどの 脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱ァセチル化剤、ァクチビン、 LIF-IL-2- IL— 6などのサイト力イン、へキサメチレンビスァセトアミド（HMBA)、ジメチノレアセトァ ミド（DMA)、ジブチル cAMP (dbcAMP)、ジメチルスルホキシド（DMSO)、ョード デォキシゥリジン（IdU)、ヒドロキシゥレア（HU)、シトシンァラビノシド (AraC)、マイト マイシン C (MMC)、酪酸ナトリウム（NaBu)、ポリブレン、セレニウムなどを 1つまたは その組み合わせとして含ませてぉ 、てもよ 、。
[0106] 本明細書において「分ィ匕因子」とは、「分ィ匕促進因子」ともいい、分化細胞への分化 を促進することが知られている因子 (例えば、化学物質、温度など)であれば、どのよ うな因子であってもよい。そのような因子としては、例えば、種々の環境要因を挙げる ことができ、そのような因子としては、例えば、温度、湿度、 pH、塩濃度、栄養、金属 、ガス、有機溶媒、圧力、化学物質 (例えば、ステロイド、抗生物質など)などまたはそ れらの任意の組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。そのような因子のう ち代表的なものとしては、 DNA脱メチル化剤（5—ァザシチジンなど）、ヒストン脱ァセ チル化剤（トリコスタチンなど）、核内レセプターリガンド (例えば、レチノイン酸 (ATR A)、ビタミン D、 T3など）、細胞増殖因子（ァクチビン、 IGF— 1、 FGF, PDGF、 TG
3
F- β、 BMP2/4など）、サイト力イン（LIFゝ IL 2、 IL— 6など）、へキサメチレンビス ァセトアミド、ジメチルァセトアミド、ジブチル cAMP、ジメチォルスルホキシド、ョード デォキシゥリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンァラビノシド、マイトマイシン C、酪酸ナト リウム、ァフイディコリン、フルォロデオキシゥリジン、ポリプレン、セレンなどが挙げられ るがそれらに限定されない。
[0107] 本明細書において「生体内」または「インビボ」（in vivo)とは、生体の内部をいう。
特定の文脈において、「生体内」は、目的とする組織または器官が配置されるべき位 置をいう。
[0108] 本明細書にぉ 、て「インビトロ」 (in vitro)とは、種々の研究目的のために生体の 一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に)摘出または遊離されている状態をいう。 インビボと対照をなす用語である。
[0109] 本明細書にぉ 、て「ェキソビボ」（ex vivo)とは、遺伝子導入を行うための標的細 胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子を導入した後に、再び同一被験体に 戻す場合、一連の動作をェキソビボという。
[0110] 本明細書において自己または自家とは、ある個体についていうとき、その個体に由 来する個体またはその一部（例えば、細胞、組織、臓器など）をいう。本明細書にお いて自己というときは、広義には遺伝的に同じ他個体 (例えば一卵性双生児）からの 移植片をも含み得る。
[0111] 本明細書において同種（同種異系）とは、同種であっても遺伝的には異なる他個体 カゝら移植される個体またはその一部 (例えば、細胞、組織、臓器など)をいう。遺伝的 に異なることから、同種異系のものは、移植された個体 (レシピエント）において免疫 反応を惹起し得る。そのような細胞などの例としては、親由来の細胞などが挙げられ るがそれらに限定されない。
[0112] 本明細書において異種とは、異種個体力 移植されるものをいう。従って、例えば、 ヒトがレシピエントである場合、ブタからの移植物は異種移植物という。 [0113] 本明細書において「レシピエント」（受容者）とは、移植される細胞などを受け取る個 体といい、「宿主」とも呼ばれる。これに対し、移植される細胞などを提供する個体は、 「ドナー」（供与者）という。レシピエントとドナーとは同じであっても異なっていてもよい
[0114] 本発明で使用される細胞は、同系由来（自己（自家）由来)でも、同種異系由来 (他 個体 (他家）由来)でも、異種由来でもよい。拒絶反応が考えられることから、自己由 来の細胞が好ま U、が、拒絶反応が問題でな 、場合同種異系由来であってもよ 、。
[0115] 本明細書において「移植」とは、本発明の細胞、組成物、医薬などを、単独で、また は他の治療剤と組み合わせて体内に移入することを意味する。本発明は、以下のよ うな治療部位 (例えば、骨などなど)への導入方法，導入形態および導入量が使用さ れ得る:本発明の医薬などの障害部位への直接注入し、貼付後に縫合し、挿入する 等の方法があげられる。本発明の脂肪幹細胞と、分ィ匕細胞との組み合わせは、例え ば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して;または逐次的にか のいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤力 治療混合物としてとも に投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例え ば、分化促進因子)投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与または移植は、 第 1に与えられ、続いて第 2に与えられる細胞、医薬、化合物または薬剤のうちの 1つ を別々に投与することをさらに含む。
[0116] 本明細書において「保存」とは、細胞、組織または臓器について用いられるとき、そ の機能および Zまたは形態を実質的に保持させることをいう。特に、幹細胞の保存と は、細胞としての生存能のほか、好ましくは、幹細胞が有する多分化能を実質的に保 持することをも含む。
[0117] 本発明の「保存効率」は、解凍後の細胞の増殖能力、および幹細胞が有する多分 化能を評価することによって算出することができる。そのような評価は、相対的または 絶対的に行うことができる。
[0118] そのような評価は、例えば、凍結保存法の効率については、解凍後 4日目の ES細 胞のコロニー数および、 ES細胞数をカウントするというアツセィによって行うことができ る。この方法において、解凍後の細胞の増殖能力は ES細胞のコロニー数および ES 細胞の細胞数として求め、解凍後の多分ィ匕能は、未分ィ匕特異的マーカー（例えば、
Oct3Z4など)の発現および未分化 ES細胞コロニー特異的な形態)を指標として求 めることができる。一般の細胞の凍結保存効率を求める方法として、トリパンブルー染 色による細胞の生死の判別法が用いられることもあるが、この指標は必ずしも解凍後 の細胞の増殖を保証するものではないことから、本明細書では、解凍後の細胞増殖 量を直接計測することによって、凍結保存法の効率を測定することを採用する。
[0119] 本明細書において使用される「再生」（regeneration)とは，個体の組織または臓 器の一部が失われた際に、欠如した組織が補填されて復元される現象をいう。動物 種間または同一個体における組織種に応じて、再生のその程度および様式は変動 する。ヒト組織の多くはその再生能が限られており、大きく失われると完全再生は望め ない。大きな傷害では、失われた組織とは異なる増殖力の強い組織が増殖し，不完 全に組織が再生され機能が回復できない状態で終わる不完全再生が起こり得る。こ の場合には，生体内吸収性材料力もなる構造物を用いて、組織欠損部への増殖力 の強 、組織の侵入を阻止することで本来の組織が増殖できる空間を確保し，さらに 細胞増殖因子を補充することで本来の組織の再生能力を高める再生医療が行われ ている。この例として、軟骨、骨および末梢神経の再生医療がある。あるいは、本発 明の凍結保存方法を利用して榭立された幹細胞を用いれば、どのような組織の再生 も原理的には行うことができ、そのようにして調製された本発明の臓器、組織および 細胞が再生のための移植物として提供される。細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉 および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に 存在し、神経幹細胞およびその分ィ匕細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主 に骨髄に存在し、血管幹細胞およびその分化細胞、造血幹細胞およびその分化細 胞ならびに間葉系幹細胞およびその分ィ匕細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞 は主に臓器に存在し、肝幹細胞およびその分化細胞、脾幹細胞およびその分化細 胞などが含まれる。本明細書では、体細胞はどのような胚葉由来でもよい。
[0120] 本発明にお 、て、幹細胞は遺伝子改変することができる。幹細胞は培養細胞であ るので、他の培養細胞と全く同様に種々の遺伝子導入法 (例えばリン酸カルシウム法 、リボゾーム法、マイクロインジェクション法、エレクト口ポレーシヨン法等）が利用できる 。また、導入できる遺伝子も何ら制限されるものではなぐ細菌、動物またはヒトの染 色体に由来する遺伝子などを挙げることができるがそれに限定されない。同様に、 E S細胞株を利用するジーンターゲッティングの方法として使用されるターゲッティング ベクターを用いた内在遺伝子の相同遺伝子組換えによる改変も可能である。
[0121] 本発明の方法によって保存された幹細胞は、対象とし得る疾患、障害、状態は、臓 器または組織の再生が所望される任意の疾患、障害、状態を含む。本発明は特に、 長期保存が要求される状況において幹細胞が処置に必要である疾患、障害、状態 が対象として特に有利である。
[0122] 1つの実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、循環器系（血 液細胞など)であり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、貧血 (例えば、 再生不良性貧血 (特に重症再生不良性貧血)、腎性貧血、癌性貧血、二次性貧血、 不応性貧血など）、癌または腫瘍 (例えば、白血病）およびその化学療法処置後の造 血不全、血小板減少症、急性骨髄性白血病 (特に、第 1寛解期 (High - risk群）、第 2寛解期以降の寛解期）、急性リンパ性白血病 (特に、第 1寛解期、第 2寛解期以降 の寛解期）、慢性骨髄性白血病 (特に、慢性期、移行期）、悪性リンパ腫 (特に、第 1 寛解期 (High - risk群)、第 2寛解期以降の寛解期）、多発性骨髄腫 (特に、発症後 早期）；心不全、狭心症、心筋梗塞、不整脈、弁膜症、心筋，心膜疾患、先天性心疾 患 (たとえば、心房中隔欠損、心室中隔欠損、動脈管開存、ファロー四徴)、動脈疾 患 (たとえば、動脈硬化、動脈瘤)、静脈疾患 (たとえば、静脈瘤)、リンパ管疾患 (たと えば、リンパ浮腫)が挙げられるがそれらに限定されない。
[0123] 別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、神経系のもの であり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、痴呆症、脳卒中およびその 後遺症、脳腫瘍、脊髄損傷が挙げられるがそれらに限定されない。
[0124] 別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、免疫系のもの であり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、 T細胞欠損症、白血病が挙 げられるがそれらに限定されない。
[0125] 別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、運動器，骨格 系のものであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、骨折、骨粗鬆症、 関節の脱臼、亜脱臼、捻挫、靱帯損傷、変形性関節症、骨肉腫、ユーイング肉腫、 骨形成不全症、筋ジストロフィー、骨軟骨異形成症が挙げられるがそれらに限定され ない。
[0126] 別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、皮膚系のもの であり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、無毛症、黒色腫、皮膚悪性 リンパ腫、血管肉腫、組織球症、水疱症、膿疱症、皮膚炎、湿疹が挙げられるがそれ らに限定されない。
[0127] 別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、内分泌系のも のであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、視床下部'下垂体疾患、 甲状腺疾患、副甲状腺 (上皮小体)疾患、副腎皮質，髄質疾患、糖代謝異常、脂質 代謝異常、タンパク質代謝異常、核酸代謝異常、先天性代謝異常 (フェニールケトン 尿症、ガラクトース血症、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症）、無アルブミン血 症、ァスコルビン酸合成能欠如、高ピリルビン血症、高ビリルビン尿症、カリクレイン欠 損、肥満細胞欠損、尿崩症、バソプレツシン分泌異常、侏儒症、ウォルマン病 (酸リバ ーゼ (Acid lipase)欠損症）、ムコ多糖症 VI型等が挙げられるがそれらに限定され ない。
[0128] 別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、呼吸器系のも のであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、肺疾患 (例えば、肺炎、 肺癌など)、気管支疾患が挙げられるがそれらに限定されない。
[0129] 別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、消ィ匕器系のも のであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、食道疾患 (たとえば、食 道癌)、胃 ·十二指腸疾患 (たとえば、胃癌、十二指腸癌)、小腸疾患 ·大腸疾患 (たと えば、大腸ポリープ、結腸癌、直腸癌など)、胆道疾患、肝臓疾患 (たとえば、肝硬変 、肝炎 (A型、 B型、 C型、 D型、 E型など)、劇症肝炎、慢性肝炎、原発性肝癌、アル コール性肝障害、薬物性肝障害)、脾臓疾患 (急性脾炎、慢性脾炎、脾臓癌、嚢胞 性脾疾患)、腹膜 '腹壁'横隔膜疾患 (ヘルニアなど)、ヒルシュスプラング病が挙げら れるがそれらに限定されない。
[0130] 別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、泌尿器系のも のであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、腎疾患（腎不全、原発性 糸球体疾患、腎血管障害、尿細管機能異常、間質性腎疾患、全身性疾患による腎 障害、腎癌など)、膀胱疾患 (膀胱炎、膀胱癌など)が挙げられるがそれらに限定され ない。
[0131] 別の実施形態において、本発明が対象とし得る疾患および障害は、生殖器系のも のであり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、男性生殖器疾患 (男性不 妊、前立腺肥大症、前立腺癌、精巣癌など)、女性生殖器疾患 (女性不妊、卵巣機 能障害、子宮筋腫、子宮腺筋症、子宮癌、子宮内膜症、卵巣癌、絨毛性疾患など） が挙げられるがそれらに限定されな 、。
[0132] 本発明が医薬目的で使用される場合、そのような医薬は、薬学的に受容可能なキ ャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリア としては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。医薬目的で使用され る場合は、そのまま医薬として使用することのほか、解凍してもとに戻して力も医薬と して使用することも含まれることが理解される。
[0133] そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤 、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩 衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または薬学的アジュバントが挙げられ るがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、ジメチルスルホキシド (D MSO)；プロピレングリコール；および C)培地を含む媒体、あるいはその媒体を用い て維持された幹細胞ある 、はその幹細胞力も調製された分ィ匕細胞などを、 1つ以上 の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で 投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄 液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充す ることが可能である。
[0134] 本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエン トに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不 活性であり、例えば、リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸;ァスコルビン酸、 a— トコフエロール;低分子量ポリペプチド；タンパク質 (例えば、血清アルブミン、ゼラチン または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビュルピロリドン）；アミノ酸 (例 えば、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジ サッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）； キレート剤（例えば、 EDTA)；糖アルコール（例えば、マン-トールまたはソルビトー ル）；塩形成対イオン (例えば、ナトリウム）；ならびに Zあるいは非イオン性表面活性 化剤（例えば、 Tween、プル口ニック（pluronic)またはポリエチレングリコール（PEG ) )などが挙げられるがそれらに限定されな 、。
[0135] 例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと 混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤 (例 えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希 釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。
[0136] 必要に応じて本発明の医薬は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、 ならびに他の薬剤を含んで 、てもよ 、。
[0137] 本発明の処置方法において使用される医薬の量は、使用目的、対象疾患 (種類、 重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮 して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体 (または患 者)に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など)、患者の年 齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定す ることができる。頻度としては、例えば、毎日一数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1回一 1ヶ月に 1回）の投与が挙げられる。 1週間一 1ヶ月に 1回の投与を、経過を見ながら 施すことが好ましい。投与する量は、処置されるべき部位が必要とする量を見積もる こと〖こよって確定することができる。
[0138] 本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する 方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人 (患者本人であり得る）に対して 記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指 示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（ 例えば、 日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局 (FDA)など）が規 定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指 示書は、いわゆる添付文書 (package insert)であり、通常は紙媒体で提供される 力 それに限定されず、例えば、電子媒体 (例えば、インターネットで提供されるホー ムページ (ウェブサイト）、電子メール)のような形態でも提供され得る。
[0139] 本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用できるアツセィもしくは機 器使用による標準的な臨床検査の結果または上記疾患 (例えば、造血疾患、神経疾 患、心臓疾患など）に特徴的な臨床症状の消滅によって支持され得る。治療は、上 記疾患 (例えば、造血疾患、神経疾患、心臓疾患など)の再発により再開することが できる。
[0140] 本発明はまた、本発明の医薬の 1つ以上の成分 (例えば、 ES細胞のような幹細胞） および本発明の保存媒体を満たした 1つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキ ットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政 府機関が定めた形式の通知力 このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒト への投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。
[0141] 本発明が研究用試薬として使用される場合、本発明の幹細胞は、当局の定める倫 理規定に従って、本発明の保存媒体を用いて分配されることが望ましい。そのような 規定としては、例えば、日本政府が定めるものが挙げられるがそれに限定されない。 以下にその規定の例を記載する。
[0142] 榭立機関の業務および義務として政府指針などに定められているもの従い、ヒト ES 細胞の榭立および使用に関する指針に従って承認された研究計画をもつ使用機関 からの要請を受けて、榭立後特性解析を行った細胞株を本発明の保存媒体を用い て分配する。分配の開始の時期としては、多分化能と正常核型の検定と確認を行つ た細胞株を増殖させて、細胞株保存のために必要な数の凍結細胞サンプルが得ら れた時点力 分配を始めることが企図される。
[0143] 榭立と分配を開始する時点では、分配機関が分配に責任を持って担当する。分配 機関には細胞培養に必要なクリーンルームと機器および細胞凍結保存用液体窒素 タンクが整備されるべきである。ヒト ES細胞株の榭立チームが使用し、その人員構成 は、例えば、研究者 5名（内 2名は医師免許保持者が好ましい）力もなる。細胞の分配 を開始する時点では、さらに実験補佐員 2名程度と事務補佐員 1名程度が実務を分 担してもよい。細胞分配および研修の要請の増加に応じて、あらたに人員および施 設を増加させることが好まし 、。
[0144] 分配の方法および条件は例えば以下のようなものを挙げることができる： ES細胞株 の維持および増殖の継続に必要な榭立機関における細胞ストックの確保が優先され るべさである。
[0145] 幹細胞の提供者がヒトである場合、インフォームド 'コンセントを得る必要がある。
[0146] ヒト受精胚の提供候補者については、 ES細胞研究に (好ましくは、本発明の保存 媒体を用いた)凍結胚を提供依頼にあたってのインフォームド 'コンセントによる同意 が与えられるかどうかを、次のような手順に従って確認する。不妊治療の開始から凍 結胚の廃棄決定に至る手続き、および関連文書、その後に始まる ES細胞研究への 提供に関するプロセスの例示的概要を示す。
[0147] (1) 不妊治療の結果作られて凍結保存されているヒト受精胚が、子宮へ移植され ることなく廃棄させることが決定するまでは、 ES細胞研究とは全く無関係な不妊治療 プロセスとして患者と不妊治療担当医師による臨床的問題である。
[0148] (2) 廃棄させることが決定した凍結胚について、不妊治療担当医師が中立的立場 を保ちながら、 ES細胞の研究について説明を受けるかどうか提供候補者に質問する
[0149] (3) 説明を受けたいとの意思を示した提供候補者に対して、榭立機関の説明者（ 榭立責任者以外)が ES細胞とはなにか、将来の医療への応用の可能性、研究内容 の概要、 ES細胞株榭立によって提供者は利益も不利益も受けないこと、提供者のプ ライパシーは保護されること、などについて十分に説明する。これらの説明は、全く中 立の立場で行われる。
[0150] (4) 提供候補者は説明を受けた後に、提供医療機関の長に対して提供に同意す るかどうかを回答する。同意はインフォームド 'コンセントの書類への署名を必要とし、 その書類は提供医療機関が厳重に保管する。特定の提供候補者による同意あるい は不同意に関する結果は榭立関係者には伝えない。
[0151] (5) 提供候補者による同意の署名カゝら一ヶ月間以上の猶予期間をおいて、提供候 補者の意思に変更がない場合は、凍結胚を榭立機関に移送する。その際、複数の 提供者からの凍結胚を同時に引渡すとともに、凍結胚容器力ゝらは提供者を同定でき るラベルなどを完全に除去しておく。従って、榭立機関の説明担当者が複数の提供 候補者と面会はするが、その氏名などの個人情報は知ることがなぐまたそれらの候 補のうち誰が同意して提供者となった力も知ることがないので、提供者の匿名性は保 証され得る。さらに、複数の提供者からの凍結胚を使ってその一部のみ力 細胞株 が榭立されるので、どの提供者の胚から実際に ES細胞株が樹立されたかは榭立機 関と提供医療機関の両者ともに知ることができな ヽようにする。
[0152] 本明細書において「キット」とは、通常 2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部 分 (例えば、試薬、細胞、本発明の保存媒体など)が提供されるュ-ットをいう。混合 されて提供されるべきでなぐ使用直前に混合して使用することが好ましいような組成 物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。例えば、本発明の保存 媒体を用いて保存をする場合、各成分 (例えば、 DMSO、プロピレングリコール、ェ チレングリコール、ァセトアミドなど）が各々配置されている。そのようなキットは、好ま しくは、提供される部分 (例えば、試薬、細胞、本発明の保存媒体の各成分など)をど のように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。このような説 明書は、どのような媒体であってもよぐ例えば、そのような媒体としては、紙媒体、伝 送媒体、記録媒体などが挙げられるがそれらに限定されない。伝送媒体としては、例 えば、インターネット、イントラネット、ェクストラネット、 WAN, LANなどが挙げられる がそれらに限定されない。記録媒体としては、 CD— ROM、 CD-R,フレキシブルデ イスク、 DVD— ROM、 DVD-R, MD、ミニディスク、 MO、メモリースティックなどが挙 げられるがそれらに限定されない。
[0153] (一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手 法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual,し old Spring Harborおよびその 3rd Ed. (2001); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. AssociatES and Wiley— Interscience; Ausubel, F. M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley— Interscience; Innis, M. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F. M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J. J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press ¾'J 冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載されており、 これらは本明細書において関連する部分 (全部であり得る）が参考として援用される。
[0154] 人工的に合成した遺伝子を作製するための DNA合成技術および核酸化学につい て ίま、 f列 J¾、 Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Syntnesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; ^habarova, Z. et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. et al. (1996). Nucleic Acids in
Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G. T. (I99b .
Bioconjugate Techniques, Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書 において関連する部分が参考として援用される。
[0155] (好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本 発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に 限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参 酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。なお、本 発明の好ましい実施形態において使用される場合、特に言及しない限り、％は重量 %を示す。
[0156] (幹細胞保存 DA媒体）
1つの局面において、本発明は、幹細胞を保存するための媒体 (medium)であつ て、 A) DMSO； B)プロピレングリコール；および C)培地（culture medium)、を含 む、媒体 (本明細書において「DA媒体」とも称する）を提供する。ここで、 DMSOは、 細胞培養および Zまたは保存に適したものであれば、どのような等級または由来のも のであっても使用することができる。プロピレングリコールもまた、細胞培養および Z または保存に適したものであれば、どのような等級または由来のものであっても使用 することができる。このようなものは、各々の成分が単独で市販されたものを使用する ことができる。培地としては、細胞培養および Zまたは保存に適したものであれば、ど のような等級または由来のものであっても使用することができる。そのような培地として は、例えば、 DMEM培地、 F12培地、 CMK培地（実施例 1において説明される）、 DMEM/F12 (1： 1)培地などまたはそれらの混合物を含むものを使用することがで きるがそれらに限定されない。好ましくは、このような培地としては、 CMK培地が使用 されるがそれらに限定されず、保存が企図される幹細胞に応じてその培地は変更し て使用することができる。このような培地には、ゥシ胎仔血清 (FBS)、 KSRなどの補 充物が補充されていてもよい。好ましくは、 DMEMZF12 (1 : 1)培地 +KSRが使用 され、より好ましくは、 DMEMZF12 (1 : 1)培地 + 20%KSRが使用される。
[0157] 本発明は、プロピレングリコールと DMSOとの混合物力 幹細胞の保存（特に、凍 結保存）に特に適切であることを初めて見出したことによって完成されたものであり、 それゆえ、この混合物が適切な培地中に適切な濃度で存在していることが必要であ る。そのような濃度は、本明細書の開示をもとに当業者が適宜決定することができる 力 好ましくは、例えば、 DMSOとプロピレングリコールとは、通常、約 1 : 5—約 5 : 1 で混合され、好ましくは約 1 : 2—約 2 : 1のモル比率で混合され、より好ましくは、 DM SOとプロピレングリコールとは、約 1： 1より DMSOが若干多いモル比率（例えば、約 3： 2のモル比率)で混合されることが有利である。このような比率でこれらの成分を混 合した媒体を用いることによって、従来達成不可能であった程度で幹細胞 (特に、 ES 細胞)を凍結保存することが可能になった。
[0158] 1つの実施形態において、本発明において使用される DMSOは、本発明の媒体中 15— 40%を占めることが好ましいがそれに限定されず、 15%未満または 40%以上 DMSOが含まれる媒体もまた、本発明の目的に応じて使用することができることが理 解され得る。
[0159] 別の実施形態において、本発明において使用されるプロピレングリコールは、本発 明の媒体中約 5%—約 35%を占めることが好ましいがそれに限定されない。 5%未 満または 35%以上プロピレングリコールが含まれる媒体もまた、本発明の目的に応じ て使用することができることが理解され得る。
[0160] 好ましい実施形態において、 DMSOとプロピレングリコールとは、合計で、本発明 の媒体の約 30%より多ぐかつ、本発明の媒体の約 50%未満を占めることが好まし い。この範囲において、従来に比べて少なくとも 3倍の、より好ましくは 5倍の、さらに 好ましくは 10倍の保存効率が達成された力もである。従って、この範囲はあくまでも 好ましい範囲であり、当業者は、 DMSOとプロピレングリコールとが、認識可能な程 度の量で混合される限り、従来達成されていた効率より高い保存効率で幹細胞 (特 に、 ES細胞)を保存することができることを理解する。
[0161] 好ましい実施形態において、本発明の媒体は、ァセトアミドおよび糖からなる群より 選択される成分をさらに含む。より好ましくは、本発明の媒体は、ァセトアミドを含むこ とがなお有利である。ァセトアミドを含むことによって、より高い保存効率が達成された 力もである。ァセトアミドは、任意の割合で本発明の媒体に含ませることができるが、 好ましくは、 DMSOまたはプロピレングリコールの 10%— 100%の間、より好ましくは 25%— 75%の間の割合で含ませることができる。あるいは、本発明の媒体中に 0. 5 M— 1. 5Mの間で存在することが好ましい。また、ある実施形態において、本発明に おいて糖を含むことが好ましいのは、糖を含むことによって、凍結保存効率が上昇す ることが一般的に知られているからである。この糖としては、例えば、スクロースを含ま せることができるが、それに限定されず、例えば、グルコース、ラフイノース、トレハロー ス、フイコール (Ficoll)、ラタトース、ソルビトールなどを挙げることができるがそれらに 限定されない。 [0162] 別の好ましい実施形態において、本発明の媒体において、 DMSOは、約 1一 4M の間で存在し、より通常には約 1一 3Mの間で存在し、同様にプロピレングリコールは 、約 1. 5— 6Mの間で存在し、より通常には約 2— 4Mの間で存在する。より好ましく は、それぞれ、 DMSOは約 2Mで存在し、プロピレングリコールは約 3Mで存在する ことが有利である。この濃度で存在することによって、凍結保存効率が従来のガラス 化凍結法に比べて少なくとも 3倍、通常少なくとも約 5倍になるからである。
[0163] ここで、 2倍濃度で作製するとタンパク質、塩などが析出して液が濁ることがあるが、 そのような場合、析出した後の液状の媒体を使用することができる。従って、これらの 成分の合計濃度の上限は、通常およそ 10Mであるが、各々の成分の比率によっても 変化する。このような上限は、当業者が本明細書を参酌して容易に決定することがで きる。また、この上限濃度は、基材にする培地のタンパク質濃度によっても最高濃度 が変わり得る。好ましくは、例示の範囲で、沈殿等を生じない組み合わせとしては、例 えば、合計 9Mを挙げることができるがそれに限定されない。最も好ましい組み合わ せは、 DMSO、ァセトアミドおよびプロピレングリコール力 それぞれ約 2M、約 1Mお よび約 3M付近である。ァセトアミドについては、除去しても他の 2成分の濃度を最適 にすると 7割程度の効果はあることから、 0— 2Mの濃度範囲が適切であり得、好ましく は 0. 5M— 2Mであり得る。
[0164] 別の好ましい実施形態において、本発明の媒体において、 DMSOは、約 1一 4M の間で存在し、より通常には約 1一 3Mの間で存在し、同様にプロピレングリコールは 、約 1. 5— 6Mの間で存在し、より通常には約 2— 4Mの間で存在し、かつ、ァセトアミ ドをさらに含み、このァセトアミドは、通常は、約 0— 2M、より通常には、約 0. 5M— 2 M存在する。より好ましくは、本発明の媒体において、 DMSOは、約 2Mで存在し、 プロピレングリコールは約 3Mで存在し、かつ、ァセトアミドは、約 1Mで存在すること が有利である。この濃度で存在することによって、凍結保存効率が従来のガラス化凍 結法に比べて少なくとも 5倍、通常約 10倍程度になるからである。
[0165] 本発明が保存の対象とする幹細胞は、どのような幹細胞であってもよぐしたがって 、組織幹細胞および ES細胞を含む幹細胞力 任意に選択される。組織幹細胞として は、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、心筋幹細胞、骨髄細胞など が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、本発明が保存の対象とする幹細 胞は、 ES細胞を含む。 ES細胞は、多能性を保持しつつ保存することが困難であると 考えられており、本発明によって、初めて、従来では達成できな力つた保存効率を達 成することができた力 である。本発明によって達成することができた保存効率によつ て、 ES細胞の一般配布という行為が実質的に可能になったという事実にかんがみる と、本発明の産業上における有用性および意義は高い。特に、本発明が対象とする 幹細胞は、霊長類 ES細胞であり、特にヒト ES細胞である。このような霊長類、特にヒト の ES細胞が保存可能になったことによって、一般配布が可能になり、霊長類および ヒト ES細胞を用いた研究を行うことが格段に進歩したと 、うことは特筆に価すると!/、う ことができる。
[0166] 本発明の幹細胞の保存は、通常凍結保存であるがそれに限定されない。本発明の DMSO、プロピレングリコールなどを含む媒体は、凍結保存によってその効力を通 常発揮すると考えられるからである。
[0167] 好ましくは、本発明の幹細胞の保存は、凍結保存によって行われる。凍結保存は、 媒体が凍結するような状態で、行われるのあれば、どのような形態であってもよいが、 通常 0°C以下、— 20°C以下、好ましくは、— 80°C以下、より好ましくは、— 150°C以下、 さらに好ましくは液体窒素下またはそれよりも低い温度で行われることが好ましい。
[0168] 好ましい実施形態において、本発明の保存は、急速凍結保存によって行われる。
本発明において「急速凍結保存」とは、通常 30°CZ分以上の速度で、より通常には 5 0°CZ分以上の速度で凍結されることをいう。好ましくは、急速凍結保存は、 100°C/ 分以上、より好ましくは、 500°CZ分以上であることが有利である。ここで、凍結速度 は、初速および終速については、考慮しないことが好ましい。あるいは、この凍結速 度は、平均速度であり得る。凍結開始直後、および目的とする温度に達する直前は、 通常凍結速度が緩和される可能性が高いからである。あるいは、通常の培養温度（ 例えば、 37°C)から、目的とする凍結保存温度 (例えば、— 196°C)までに要する時間 が例えば、通常 5分以内、より好ましくは 3分以内、さらに好ましくは 1分以内、もっとも 好ましくは 15秒以内であることもまた、急速凍結保存の定義内に入る。
[0169] 別の好ましい実施形態において、本発明の保存の後、実際に使用する際には、本 発明の幹細胞は、急速解凍されることが有利である。本発明において「急速解凍」と は、通常 30°CZ分以上の速度で、より通常には 50°CZ分以上の速度で解凍される ことをいう。好ましくは、急速解凍は、 100°CZ分以上、より好ましくは、 500°CZ分以 上であることが有利である。ここで、解凍度は、初速および終速については、考慮しな いことが好ましい。あるいは、この凍結速度は、平均速度であり得る。解凍開始直後、 および目的とする温度 (例えば、 37°C)に達する直前は、通常解凍速度が緩和される 可能性が高いからである。あるいは、通常の保存温度 (例えば、— 196°C)から、目的 とする温度 (例えば、 37°C)までに要する時間が例えば、通常 5分以内、より好ましく は 3分以内、さらに好ましくは 1分以内、もっとも好ましくは 15秒以内であることもまた 、急速解凍の定義内に入る。
[0170] 本発明では、急速凍結および急速解凍は、速ければ速!、ほどよ 、ことが理解され る。
[0171] 本明細書にぉ 、て「ガラス化保存法」または「ガラス化法」とは、本明細書にぉ ヽて 交換可能に用いられ、非特許文献 4に記載されるような従来技術に記載される方法 をいい、特に、幹細胞などの凍結すべき細胞を、液体窒素などでの極低温での凍結 および解凍により、保存および再利用する方法をいう。従来のガラス化法では、通常 ストロー状の開口管を用いて凍結することが特徴であり、このような方法では、汚染の 危険性がある。また、従来のガラス化法は、卵、精子または胚の凍結に用いられてき た方法であるが、ガラス管を用いるため、保存できる量が比較的少なぐ操作も煩雑 であるという欠点もあった。本発明は、これらの欠点を克服するという利点も有する。
[0172] 本明細書において「簡易ガラス化保存法」または「簡易ガラス化法」は、本明細書に おいて交換可能に用いられ、幹細胞などの凍結すべき細胞を、本発明の媒体を用い て液体窒素などを用いて急速冷凍し、その後、急速解凍する方法をいい、本発明に おいて初めて提供されるものであり、本発明の範囲内にある。従来のガラス化法とは 、ストロー状の開口管を用いるのではなぐ好ましくは封入管のような汚染しにくいも のを用いる点に特徴があり、このほか、簡易ガラス化法では、凍結細胞数のスケール アップが容易であり、ガラス化法に比べて操作が楽で簡易であるという利点があり、さ らに、特別な器具 (例えば、ガラス管）を用いる必要がないという点も特徴である。 [0173] (DE媒体）
別の局面において、本発明は、幹細胞を保存するための媒体 (medium)であって 、 A) DMSO； B)エチレングリコール；および C)培地（culture medium)、を含み、 ここで、該 DMSOおよび該エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、 20重量 %未満である、媒体 (本明細書において「DE媒体」ともいう）を提供する。この媒体は 、スクロースを含む場合に DES媒体とも呼ばれ、ガラス化凍結法で頻繁に用いられ ているが、本発明では、従来よりも薄い DMSOおよび Zまたはエチレングリコールを 用いることによって、予想外に高 、効率で幹細胞を保存することができたと 、うことが 初めて見出された。特に、 DMSOおよびエチレングリコールは、約 15%ずつ含まれ る場合に、従来の DES媒体（DMSO20%、エチレングリコール 15%、スクロース 0. 5M)よりも顕著に高い保存効率 (例えば、 0. 75 X DESの場合約 5倍)を達成するこ とができたことは驚くべき発見である。このように、本発明の好ましい媒体では、糖を 含むことが有利である。糖を含むことによって、凍結保存効率が上昇することが一般 的に知られている力もである。この糖としては、例えば、スクロースを含ませることがで きる。
[0174] 依り好ましい実施形態では、本発明の媒体において、 DMSOは本発明の媒体の 約 7. 5%— 30%含まれ、エチレングリコールは本発明の媒体の約 7. 5%— 30%含 まれ、スクロースは、約 0. 1875M— 0. 75M含まれることが有利である。
[0175] 従って、さらに好ましい実施形態において、本発明の媒体において、 DMSOは本 発明の媒体の約 15%含まれ、エチレングリコールは本発明の媒体の約 15%含まれ 、スクロースは、約 0. 375M含まれることが有利である。この比率において、従来の D ES X 1媒体を用いた場合に比べて約 5倍以上の保存効率を達成した力 である。
[0176] 好ましくは、本発明の幹細胞の DE媒体を用いた保存は、凍結保存によって行われ る。凍結保存は、媒体が凍結するような状態で、行われる限り、どのような形態であつ てもよいが、通常 0°C以下、 20°C以下、好ましくは、 80°C以下、より好ましくは、 1 50°C以下、さらに好ましくは液体窒素下またはそれよりも低い温度で行われることが 好ましい。 DE媒体を用いた場合もまた、急速凍結保存を行うことが好ましい。
[0177] (DA媒体を用いた細胞保存法） 別の局面において、本発明は、幹細胞を保存するための方法であって、 A) a) DM SO ;b)プロピレングリコール;および c)培地、を含む、媒体中で、幹細胞を急速凍結 させる工程、を包含する、方法を提供する。ここで、この媒体において含まれる DMS 0、プロピレングリコール、培地およびその他の成分についての詳細な説明は、上述 の DA媒体の節において詳述されており、本発明の細胞保存法においてもまた、そこ で説明される任意の形態を採用することができることが理解される。ここで、急速凍結 もまた、上述の DA媒体の節において説明されており、本発明の細胞保存法におい てもまた、そこで説明される任意の形態を採用することができることが理解される。
[0178] 好ましくは、本発明における急速凍結は、封入管を用いて行われる。従来のガラス 化凍結保存法では、先が開いたストロー状の管を用いて、幹細胞を凍結していた。保 存効率に影響があるとされていた力 である。しかし、そのような開放的な構造では、 細胞汚染の問題が生じることから、本発明では、そのような構造のものを使用しないこ とが好ましい。し力も、本発明では、そのようなストロー状のものを使用しなくても、高 度の細胞保存効率を達成したことは従来の保存技術からは達成できな力つたことと いえる。
[0179] 好ましい実施形態において、本発明の保存方法の際に採取される幹細胞は、大き なコロニーのまま剥離されたものである。理論に束縛されることを望まないが、大きな コロニーのまま剥離されたほうが、細胞の凍結保存効率が上昇するからである。
[0180] 本発明の保存方法において、幹細胞と、媒体とは、通常 1 X 103Ζΐ00 /ζ 1— 5 X 1 oVioo μ 1の比率で存在し、好ましくは、 1 X IOVIOO 1一 1 X IOVIOO μ 1の 範囲で存在することが有利である。理論に束縛されることを望まないが、上記範囲内 の比率で細胞を混ぜることによって、少なすぎると操作の際にロスすることが多くなり 、多すぎると細胞を懸濁することが難しくなることが予測されるからである。
[0181] 1つの実施形態において、本発明の急速凍結は、任意の凍結手段を用いて行われ る力 好ましくは、液体窒素中で行われる。比較的安価でかつ急速凍結を容易に行う ことができるからである。液体窒素を用いた凍結を行う場合には、管の全体が液体窒 素に浸されていること、細胞に保存液を加えた後、速やかに液体窒素中に浸すという 点に注意する必要がある。細胞保存効率に影響することが考えられるからである。ま た、低温フリーザーまたはドライアイスを用いるよりも急速に凍結することができるとい う効果が期待されるからである。
[0182] 好ましい実施形態において、本発明の急速凍結の後、保存し、その後、使用時に は、急速に解凍する工程をさらに包含することが有利である。理論に束縛されることを 望まないが、急速に解凍することによって、細胞の保存時の生存効率を上げることが 可能となった力 である。
[0183] 上記急速凍結および急速解凍は、上記 DA媒体の節にお ヽて行った説明に記載さ れて 、る任意の形態を用いることができる。
[0184] 1つの実施形態において、本発明の幹細胞の保存において、急速解凍は、ウォー ターバス中で振とうして解凍することも可能であり、温めた培地を力卩ぇピペッティング することが好ま U、。速やかに細胞を解凍することができる力もである。
[0185] 本発明が保存の対象とする幹細胞は、どのような幹細胞であってもよぐしたがって 、組織幹細胞および ES細胞を含む幹細胞力 任意に選択される。組織幹細胞として は、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、心筋幹細胞、骨髄細胞など が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、本発明が保存の対象とする幹細 胞は、 ES細胞を含む。 ES細胞は、多能性を保持しつつ保存することが困難であると 考えられており、本発明によって、初めて、従来では達成できな力つた保存効率を達 成することができた力 である。本発明によって達成することができた保存効率によつ て、 ES細胞の一般配布という行為が実質的に可能になったという事実にかんがみる と、本発明の産業上における有用性および意義は高い。特に、本発明が対象とする 幹細胞は、霊長類 ES細胞であり、特にヒト ES細胞である。このような霊長類、特にヒト の ES細胞が保存可能になったことによって、一般配布が可能になり、霊長類および ヒト ES細胞を用いた研究を行うことが格段に進歩したと 、うことは特筆に価すると!/、う ことができる。
[0186] (DE媒体を用いた保存方法）
別の局面において、本発明は、幹細胞を保存するための方法であって、 A) a) DM SO ;b)エチレングリコール；および c)培地（culture medium)、を含み、ここで、該 DMSOおよび該エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、 20重量％未満で ある、媒体中で、幹細胞を凍結させる工程、を包含する、方法を提供する。
[0187] ここで、 DE媒体としては、上記 DE媒体の節にぉ 、て説明されて 、る任意の形態を 用!/、ることができる。
[0188] 好ましくは、本発明の幹細胞の保存は、凍結保存によって行われる。凍結保存は、 媒体が凍結するような状態で行われる限り、どのような形態であってもよいが、好まし くは、 0°C以下、— 20°C以下、— 80°C以下、より好ましくは、— 150°C以下、さらに好ま しくは液体窒素下またはそれよりも低 、温度で行われることが好ま 、。 DE媒体を用 V、た場合、好ましくは急速凍結保存を行うことが有利である。
[0189] (DA媒体を用いた幹細胞保存システム）
別の局面において、本発明は、幹細胞を保存するためのシステムであって、 A) a) DMSO ;b)プロピレングリコール；および c)培地、を含む、媒体; B)急速凍結する手 段、を備える、システムを提供する。ここで、この媒体において含まれる DMSO、プロ ピレンダリコール、培地およびその他の成分についての詳細な説明は、上述の DA媒 体の節において詳述されており、本発明の細胞保存法においてもまた、そこで説明 される任意の形態を採用することができることが理解される。ここで、急速凍結もまた、 上述の DA媒体の節において説明されており、本発明の細胞保存法においてもまた 、そこで説明される任意の形態を採用することができることが理解される。従って、急 速凍結する手段としては、任意の凍結手段 (例えば、液体窒素）を用いることができる 。本発明の急速凍結手段は、上記「DA媒体を用いた細胞保存法」の節において例 示されている任意のものを使用することができる。
[0190] 好ましくは、本発明のシステムは、さらに、封入管を備えることが好ましい。封入管を 使用することによって、本発明は、無菌的に幹細胞を効率よく保存することができるよ うになつた力もである。このような無菌的な高効率の保存方法は、従来開示されてお らず、その有用性および意義は高い。
[0191] 本発明のシステムが保存の対象とする幹細胞は、どのような幹細胞であってもよぐ したがって、組織幹細胞および ES細胞を含む幹細胞から任意に選択される。組織幹 細胞としては、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、心筋幹細胞、骨 髄細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、本発明が保存の対象 とする幹細胞は、 ES細胞を含む。 ES細胞は、多能性を保持しつつ保存することが困 難であると考えられており、本発明によって、初めて、従来では達成できな力 た保 存効率を達成することができた力もである。本発明によって達成することができた保 存効率によって、 ES細胞の一般配布という行為が実質的に可能になったという事実 にかんがみると、本発明のシステムもまた、産業上における有用性および意義は高い 。特に、本発明が対象とする幹細胞は、霊長類 ES細胞であり、特にヒト ES細胞であ る。このような霊長類、特にヒトの ES細胞が保存可能になったことによって、一般配布 が可能になり、霊長類およびヒト ES細胞を用いた研究を行うことが格段に進歩したと V、うことは特筆に価すると 、うことができる。
[0192] (DE媒体を用いたシステム）
別の局面において、本発明は、幹細胞を保存するためのシステムであって、 A) a) DMSO ;b)エチレングリコール；および c)培地（culture medium)、
を含み、ここで、該 DMSOおよび該エチレングリコールの少なくともいずれか一方は 、 20重量％未満である、媒体; B)凍結する手段、を備える、システムを提供する。ここ で、使用される DE媒体中の DMSO、エチレングリコールなどは、上述の DE媒体の 節において説明される任意の形態を用いることができる。凍結手段は、当該分野に おいて使用される任意の手段を用いることができる。そのような手段としては、例えば 、液体窒素、低温フリーザー、冷凍庫、塩を付加した氷、ドライアイスなどが挙げられ るがそれらに限定されない。
[0193] (保存媒体の凍結保存のための使用）
別の局面において、本発明は、 a) DMSO ;b)プロピレングリコール；および c)培地 、を含む、媒体の、幹細胞を急速凍結保存するための、使用を提供する。ここで、 D MSO、プロピレングリコール、培地および追加の成分としては、上述の DA媒体の節 において説明される任意の形態を用いることができる。凍結保存についてもまた、上 述の DA媒体の節において説明される任意の形態を用いることができ、当業者は上 述の開示および下記実施例の記載から適宜任意の適切な形態で実施することがで きることが理解される。
[0194] 他の局面において、本発明は、 a) DMSO ;b)エチレングリコール；および c)培地（c ulture medium)、含み、ここで、該 DMSOおよび該エチレングリコールの少なくと もいずれか一方は、 20重量％未満である、媒体の、幹細胞を凍結保存するための、 使用を提供する。ここで、 DMSO、エチレングリコール、培地および追加の成分とし ては、上述の DE媒体の節において説明される任意の形態を用いることができる。凍 結保存についてもまた、上述の DE媒体の節において説明される任意の形態を用い ることができ、当業者は上述の開示および下記実施例の記載力 適宜任意の適切な 形態で実施することができることが理解される。
[0195] 以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的の みに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例 にも限定されるものではなぐ請求の範囲によってのみ限定される。
実施例
[0196] 以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬、
Sigmaから、細胞関連の試薬は Gibcoから得た。動物の飼育は、 National Society for Medical Researchg作成し 7こ「Principles of Laboratory Animal じ ar e」およひnstitute of Laboratory Animal Resource力 S作成、 National Inst itute of Health力 S公表した「Guide for the じ are and Use of Laborator y AnimalsJ (NIH Publication, No. 86— 23, 1985,改訂）に遵つて、京都大学 および日本政府が規定する基準に遵ぃ、動物愛護精神に則って行った。ヒトを対象 とする場合は、厚生労働省の基準に従い、事前に同意を得た上で実験を行う。その 同意方法は、本明細書において記載されるとおりである。
[0197] (実施例 1 :ヒト ES細胞の調製）
ヒト ES細胞の調製は、提供者の合意を得た上で、情報が完全に守られる形で行う。 具体的には、本明細書において別の場所において記載されるように、慎重に、かつ、 認証された機関で行う。以下に示す実験は京都大学再生医科学研究所において、 行われる。
[0198] まず、その一般的手順は以下のとおりである。 ES細胞のソースとなる胚を取得し、 凍結する。その後、凍結胚を解凍し、胚盤胞期まで培養する。次に、内部細胞塊を 分離し、細胞株を榭立する。幹細胞マーカー発現の有無および染色体検定により、 幹細胞であること、特に ES細胞であることを確認する。 ES細胞であることを確認する ために、幹細胞マーカー（アルカリ性フォスファターゼ活性、特異的抗原、 Oct3/4 など)の検出を行なう。また核型解析を行なって染色体数や形態が正常かどうかを検 定する。その後、分化能を検定する。培養下での分ィ匕能を検定するために、培養条 件の変更や細胞凝集塊作成による細胞分化の誘導と各種機能細胞への分化能の 解析を行なう。また免疫不全マウスなどへの移植を行なってテラトーマ形成による組 織分ィ匕能の解析を行なう。
[0199] 具体的には以下のように行う。
[0200] (ES細胞用培養液）
培地組成： (本明細書にぉ 、て CMK培地とも!、う）
DMEM/F12 (Sigma D— 6421) 80ml
非必須アミノ酸 (Gibco) 0. 8ml
200mM L グルタミン lml
KSR (Gibco) 20ml
2—メルカプトエタノール 0. 8 ^ 1
ヒト白血病阻害因子 (huLIF) (lO ^ g/ml) lOO ^ KlOng/ml) 塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF) (lmg/ml) 0. 4 1 (4ngZml)。
[0201] (細胞解離液）
0. 25% トリプシン (リン酸緩衝ィ匕生理食塩水（PBS) )
ImM CaCl
2
20%KSR。
[0202] (ディッシュ）
フィーダ一をつくる培養ディッシュは予めゼラチンコートしておく。 0. 1%ゼラチン溶 液（swine skin, Type A: Sigma社製）で覆い、 37°Cで 1 時間以上インキュベー トする。培養ディッシュのゼラチン溶液を除き、細胞の懸濁液を加える。数時間経て ばフィーダ一細胞として使用可能である。
[0203] フィーダ一細胞を用いた ES細胞の榭立は、以下のように行った。
[0204] 1.フィーダ一細胞の培養液を ES細胞用の培養液に交換した。 [0205] 2.免疫手術法もしくは機械的操作により胚盤胞カゝら内部細胞塊を分離した。免疫 手術法は、簡単に述べると、以下のとおりである。
[0206] 酵素処理などにより透明帯を取り除き、マウス表面抗原に反応する抗体溶液内でィ ンキュペートした。次に補体溶液内でインキュベートすることによって最外層の細胞で ある栄養外胚葉が取り除かれ、内部細胞塊が分離された。
[0207] ヒト ES細胞の場合は、ヒトの細胞表面抗原に反応する抗体溶液を用いることに留意 して上記手順を行った。力-クイサル（(株)ケアリー力も入手)の場合は、サルの細胞 表面抗原に反応する抗体溶液を用いることに留意して上記手順を行った。
[0208] 3.分離した内部細胞塊をフィーダ一細胞上で培養した。
[0209] 4.翌日内部細胞塊がフィーダ一細胞に接着して 、ることを確認して、培養液を交 換した。以後毎日培地交換した。
[0210] 5. 5— 10日後に内部細胞塊力も増殖してくる ES細胞様の細胞が認められるように なった。細胞塊が 100から 200 mになったら継代を行った。
[0211] 6.培養液をのぞき細胞解離液を入れた。
[0212] 7. 5から 10分間処理すると ES細胞様細胞が培養ディッシュよりはがれてくるので、 これを細く弓 I V、たガラス管で拾 、上げ数回出し入れすることで細胞塊を数個に分け た。
[0213] 8.培養液中で細胞解離液を洗浄して除き、新しいフィーダ一上に細胞塊を移した [0214] 9.翌日、培養液を交換した。以後毎日培地交換した。
[0215] 10.フィーダ一上で個々の細胞塊が 100— 200 m程度に増殖するのを確認した 後、同様の操作で継代を行った。
[0216] 11.細胞が十分増殖するようになれば（35mm培養ディッシュ 1枚に増えるぐらい） サル ES細胞の通常の継代操作と同様に継代ができるようになった。この段階に達す れば以後安定した培養が可能であることが確認される。
[0217] この実施例で榭立された細胞は、幹細胞であることが確認される。
[0218] 本実施例では、基本培地に DMEM/F12を使用した力 DMEMまたは他の基本培地 でも問題なく使用できることが示される。 [0219] (マーカーによる染色）
次に、榭立した細胞の未分化状態を、特異的マーカーによる染色により調べた。 E S細胞を、 4% PFAで固定し標準的な培養細胞の免疫染色法 (Willingham, M. C. et. al. , 1985. An Atlas of Immunofluorescence m Cultured Cell , Academic Press, Orlando, FL, pp. 1—13. ) に従い免疫染色を行つ た。ブロッキングは 0. 1% Triton XZPBSZ2%スキムミルクを用い室温で一時 間、洗いは 0. 1% TritonXZPBSを用い室温で 5分を 4回行った。一次抗体は SS EA— 4、 TRA— 1—60のモノクローナル抗体をそれぞれ 200 μ g/ml (CLONTECH )を 1Z100希釈したものを、二次抗体は FITC標識 goat 抗ー mouse IgG (H + L) (ZYMED LABORATORIES, INC)を 1Z200希釈したものを使用した。二次抗 体の反応後はローダミンファロイデイン (rhodamine phalloidin) (Molecular Pro be)、 DAPI (SIGMA)の順に染色を行 、シグナルを検出した。
[0220] ALP (アルカリホスファターゼ)の組織ィ匕学的染色は、以下のように行った。培養デ イツシュをダルベッコの PBS (—)で 2回洗浄した後、 4°Cの 95%冷エタノールで 30分 以上固定し、次いで 4°Cの無水エタノールで 30分以脱水した。固定液を除き、デイツ シュを室温で 0. 1M Tris— HCl(pH9. 0—9. 5)にて 5分間 3回洗浄した後、 1. 5 一 2mlの染色液（ナフトール AS— BIホスフェート（シグマ社、カタログ番号 N— 2125) 2. 5mgと、ファースト赤 TR塩（Sigma) 15mg [またはファースト紫 B塩 6mg (Sigma) 、ファースト青 BB塩 12. 5mg (Sigma) ]とを 0. 1M Tris— HC1緩衝液 25mlに加え 、遮光下で 3— 5分間撹拌して溶解し、次いで濾過する）を各ディッシュに加え、遮光 下で室温にて ALPを 15— 30分間染色した。 PBS (—)で 2回洗浄した後グリセロール を加え位相差立体顕微鏡で赤褐色に染まった ES細胞コロニーを検鏡した。
[0221] 結果力も明らかなように、榭立した幹細胞は通常どおり多分ィ匕能を保持していること が確認された。
[0222] このようにして得た ES細胞を、以下の保存実験において用いる。
[0223] 本実施例では、補填成分として KSRを使用した力 KSRのかわりに通常使用され ているゥシ胎仔血清でもよいようである。ただし、 KSRのほうがゥシ胎仔血清よりも良 い結果が出るようであった。 [0224] さらに必要に応じて 1一 2mg/mlのコラゲナーゼを添カ卩した。コラゲナーゼの添加に より、若干榭立しゃすくなるようである。
[0225] (実施例 2 :サル ES細胞の調製）
力-クイサルカ の ES細胞の調製は、実施例 1において記載されるヒトの ES細胞 の調製に準じて行った。力-クイサルは、（株)ケアリー力も入手し、施設内では、京 都大学において規定される基準に従って動物愛護精神にのっとって維持した。
[0226] このようにして得た ES細胞を、以下の保存実験において用いた。
[0227] (実施例 3：凍結保存の凍結保存のための媒体）
(1) 10% DMSOZCMK培地
9 ml の ES細胞培養培地に、 1mlの DMSOをカ卩え、 30°Cで保存。 4°Cで使用 した。
(2) DES (20%DMSO, 20%エチレングリコール， 0. 5Mスクロース ZCMK培地） スクロースを 1. 026g量り取り、 DMSOとエチレングリコールとをそれぞれ 2mlカロえ
、 ES細胞培養培地で 10mlにメスアップした。 30°Cで保存した。 4°Cで使用した。
(3) DAP (2M DMSO, 1Mァセトアミド， 3Mプロピレングリコール ZCMK mediu m)
ァセトアミドを 0. 65g量り取り、 1. 42mlの DMSOと 2. 24mlのプロピレングリコー ルを加え、 ES細胞培養培地で 10mlにメスアップした。 30°Cで保存した。 4°Cで使 用した。
[0228] (実施例 4：凍結保存法の比較）
実施例 2で調製した力-クイザル ES細胞を 10 cmディッシュで培養し、それぞれ 3 分の 1量ずつ、緩慢冷却法、ガラス化法、および簡易ガラス化法の 3法で凍結保存を 行った。 150°Cで数日間保存した後、それぞれの方法により、 ES細胞を解凍し、そ の 10分の 1量および、 2分の 1量をフィーダ一細胞でコートした 3. 5cmディッシュに 解凍した。各凍結保存法の効率については、解凍後 4日目の ES細胞のコロニー数 および、 ES細胞数をカウントして求めた。
[0229] (A1.緩慢冷却法）
従来技術として知られる緩慢冷却法は、 Geron社から販売されるキットに従って、 以下のようにして行った。その概略は非特許文献 3に記載されるとおりである。
[0230] 1) ES細胞をトリプシン処理し、出来るだけ大きなコロニーのままはがした。
[0231] 2)細胞を回収し、遠心分離した。
[0232] 3)上澄みを取り除き、ペレットに lmlの凍結保存液（10% DMSOZCMK培地） を加え、軽くピペッティングした。
[0233] 4)細胞懸濁液をクライオチューブ（ナルゲン、 systemlOO クライオジェニックバイ アル）に移した。
[0234] 5)クライオチューブを凍結保存容器 (ナルゲン、 Mr. frosty)に入れ、 80°Cのフリ 一ザ一中でー晚放置した。
[0235] 6)翌日、 150°Cのフリーザーに移し、保存した。
[0236] (A2.緩慢冷却法の解凍手順）
1)あらかじめ、 15 ml遠心チューブに培地を 10 mlカ卩えたものを準備しておいた。
[0237] 2)クライオチューブを 37°Cのウォーターバス中で振りながら、すばやく溶かした。
[0238] 3)氷が半分ほど溶けたら、遠心チューブに細胞懸濁液を移し、残った氷も培地を 加え、完全に溶力した後、チューブに移した。
[0239] 4) 1000 rpm (クボタ ユニバーサル冷却遠心分離機 5800)で 3分間遠心分離した。
[0240] 5)上澄みを取り除き、培地にサスペンドした。
[0241] 6)フィーダ一細胞でコートした 3. 5cmディッシュ 2枚に、それぞれ 10分の 1量およ び 2分の 1量まいた。
[0242] 7) 37°C、 5% COの条件下で、 4日間培養した。
2
[0243] (B1. ガラス化法）
ガラス化法もまた、従来技術に基づいて行ったが、使用した管はストロー状ではなく 、先が閉じた封入形状のものを用いた。そのほかは、非特許文献 4に基づいて行った
[0244] 1) ES細胞をトリプシン処理し、出来るだけ大きなコロニーのままはがした。
細胞を回収し、遠心分離した。
[0245] 2)上澄みを取り除き、ペレットに 200 1の凍結保存液（DES)で細胞をサスペンド した後、すぐにクライオチューブに移し、液体窒素中で急速凍結した。 [0246] 3)— 150°Cのフリーザーに移し、保存した。
[0247] (B2 ガラス化法の解凍手順）
1)あらかじめ、 15ml遠心チューブに培地を 10mlカ卩えたものと、 37°Cに温めた培 地を準備しておいた。
[0248] 2)クライオチューブに温めた培地 800 μ 1を加え、すばやくピペッティングして、急 速に氷を溶力した。
[0249] 3)完全に溶けたら、遠心チューブに細胞懸濁液を移し、 lOOOrpmで 3分間遠心分 離し 7こ。
[0250] 4)上澄みを取り除き、培地にサスペンドした。
[0251] 5)フィーダ一細胞でコートした 3. 5cmディッシュ 2枚に、それぞれ 10分の 1量およ び 2分の 1量まいた。
[0252] 6) 37°C、 5% COの条件下で、 4日間培養した。
2
[0253] (B1 ' 従来のガラス化法）
プラスチック製ストロー（250 μ 1、 IMV,フランス）をホットプレート上でやわらかくし て直径がほぼ半分になるまで引き伸ばす。細くした部分でストローを切断する。加工 したストローを放射線照射により滅菌する。
[0254] 4一 6個の ES細胞の塊を、 10%DMSO、 10%エチレングリコール ZDMEM + 20 %FBS中で、 37°Cで 1分間インキュベートし、次いで 20%DMSO、 20%エチレング リコール、 0. 5Mスクロース ZDMEM + 20%FBS中で 20秒間インキュベートした後 、同溶液 1一 2 1とともにストローの細いほうに吸い上げ、直ちに液体窒素を投入し、 急速凍結する。
[0255] (B2 '従来のガラス化法の解凍法）
解凍は、ストローを液体窒素力 取り出した 3秒後にストローの細いほうの先端を 0. 2Mスクロース ZDMEM + 20%FBSに浸し、ストロー内の液が解けたら反対の端を 封じる。これにより、ストロー内の気体部分の温度上昇に伴いストロー内の液は、培地 中に移動する。 1分間インキュベートし、 0. 1Mスクロース ZDMEM + 20%FBSに 細胞塊を移し、 5分間インキュベートする。 DMEM + 20%FBSで細胞塊を 5分間洗 浄し、これを 2回行い、フィーダ一細胞の上に移し培養する。 [0256] (CI 簡易ガラス化法）
本発明の簡易ガラス化法を説明する。
[0257] 1) ES細胞をトリプシン処理し、出来るだけ大きなコロニーのままはがした。
細胞を回収し、遠心した。
[0258] 2)上澄みを取り除き、ペレットに 200 1の凍結保存液（DAP)で細胞をサスペン ドした後、すぐにクライオチューブに移し、液体窒素中で急速凍結した。
[0259] 3)— 150°Cのフリーザーに移し、保存した。
[0260] (C2 簡易ガラス化法の解凍手順）
簡易ガラス化法で凍結して保存したものを利用する場合、ガラス化法 (B1)と同様 の方法で解凍することができる。
[0261] (D 幹細胞のコロニー数の計測）
1)解凍後 4日目に、 10分の 1量まいたディッシュの ES細胞のコロニー数を、倒立顕 微鏡下でカウントした。
[0262] (E 幹細胞の細胞数の計測）
1) ES細胞を 0. 25%トリプシンで処理した後、ピペッティングし、細胞を一つ一つバ ラバラにした。
[0263] 2)培地を lmlカ卩え、トリプシンの活性を止めた後、血球計算盤を用いて、 ES細胞の 数をカウントした。（細胞内小器官が多ぐ細胞の大きさも適当なものを ES細胞として カウントした。 GFPを導入した ES細胞を用いて確認した。
[0264] 図 1に上記実験結果を示す。図 1には、 A、 Bおよび Cの方法を用いた場合を示す。
図 1からも明らかなように、本発明の方法によって、従来方法よりも、顕著に優れた効 率で ES細胞などの幹細胞を保存することができることが実証された。また、従来の非 特許文献 4にお ヽて記載されるガラス化法で用いた場合は、本発明の DAPを用いて 行ったものを 100とした場合、凍結保存効率は 5— 10程度であった。従って、本発明 は、従来最高と言われて 、た Reubinoffのガラス化法に比べて 10倍以上の効果を 示すことができる。また、 B'で示される方法を用いた場合、手順が非常に煩雑であり 、効率も、 Bまたは Cの方法には及ばない。
[0265] (実施例 5 : DE媒体の効果） 次に、 DES媒体（DMSO20%、エチレングリコール 20%、スクロース 0. 5Mを X 1 溶液とする）の濃度を振って、その効果を確認した。ここでは、 0. 5 X DES, 0. 75 X DES、 1. O X DES, 1. 25 X DESおよび 1. 5 X DESの 5種類の媒体を調製して、 実施例 4に記載されるようにガラス化凍結法を行った。その結果を図 2に示す。図 2に 示すように、 1 X DESに比べて、 0. 75 X DESでの凍結効率が格段に上がっていた ことが分力ゝつた。これは、従来使用されている DESが、ガラス化凍結法においてもより 薄めの物を用いることが良いことを実証する。このような効果は従来知られておらず、 従って、本発明において初めて見出された効果を示す。
[0266] (実施例 6： DA媒体における DMSOとプロピレングリコールとの混合）
次に、 DA媒体において、 DMSOとプロピレングリコールの混合比が凍結保存効率 に与える影響を考慮した。
[0267] 15%、 20%、 25%、 30%の DMSOと、 15%、 20%、 25%、 30%のプロピレングリ コールとを混合した DA媒体を調製し、実施例 4に記載されるように簡易ガラス化法に よって凍結保存実験を行った。その結果を図 3に示す。図から明らかなように、 DMS Oとプロピレングリコールとは、合計で約 30%—約 50%、その比率は、約 1： 2— 2 : 1 で存在することが好ましいことが明らかになった。しかし、どの混合比でも、 DAP媒体 には効率は及ばなかつたが、従来技術で達成された凍結保存効率よりも格段に優れ た効率であることには変わりはな力つた。
[0268] (実施例 7：媒体の説明 プロピレングリコールおよび DMSOの単独の効果）
DMSOおよびプロピレングリコールがそれぞれ、 5%、 10%、 15%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%単独で存在する保存媒体を用いて、その凍結保存効率における 効果を確認した。実施例 4に記載の通り、簡易ガラス化法を行った。その結果を図 4 および図 5に示す。結果から明らかなように、 DMSOは単独では 20— 40%、プロピレ ングリコールは 40— 60%で存在することが好ましいことが明らかになった。しかし、ど の存在比でも、 DAP媒体には効率は及ばな力つた。
[0269] また、エチレングリコールのみを含むものについても、凍結保存効果を見た。すると 、 40%の点において DAPの 40%程度の効率を示すことが明らかになった。この効 果は、 DES単独よりも高い。従って、本発明の簡易ガラス化法は、優れた効果を示す ことが明らかになった。
[0270] さらに、グリセロール、ァセトアミド単独のものについても効果を見た力 これらにつ いては、ほとんど効果は見出されな力つた。
[0271] (実施例 8 :濃度についてのさらなる検証）
実施例 7に記載される実験を、 DMSOの濃度（0. 5M— 5M)、プロピレングリコー ル（0. 5M— 8M)、ァセトアミド（0. 5M— 3M)の範囲内で 0. 5Mごとに行う。その結 果、 DMSOの濃度は、 2Mを頂点に 1M— 4Mの範囲で凍結保存改善効果が顕著 であり、プロピレングリコールは、 1. 5M— 6Mの範囲で凍結保存改善効果が顕著で あり、ァセトアミドは、 0. 5M— 2Mの範囲で凍結保存改善効果が顕著であることが確 認される。なお、ァセトアミドについては、 OMであっても、他の二成分によって凍結保 存改善効果が見られることから、必須ではな 、ことが分かる。
[0272] エチレングリコールを含む媒体について確認したところ、 DMSOの濃度を 2. 5%— 40%の間で 2. 5%ごと、エチレングリコールを 2. 5%— 40%の間で 2. 5%ごと、およ びスクロースの濃度を、 1. 5Mから 1Z2の系列希釈により 0. 09375Mまでの濃度（ 0. 75M、 0. 375Mおよび 0. 1875M)でアツセィを行う。その結果、 DMSOは、 7. 5%— 30%の濃度範囲で凍結保存改善効果が顕著であり、エチレングリコールは、 7 . 5%— 30%の濃度範囲で凍結保存改善効果が顕著であり、スクロースの濃度は、 0 . 1875M— 0. 75Mの濃度範囲で凍結保存改善効果が顕著であることが確認され る。
[0273] (実施例 9 :神経細胞への分化）
本発明の上記実施例 4において保存し解凍した ES細胞を、 3回無血清培地にて洗 浄し、血清を完全に取り除く。 KSR (Knockout Serum Replacement； GIBCO /Invitrogen Cat. No. 10828— 028)を含む ES細胞培地を用いて、 PA6フィー ダー細胞上で未分化細胞を 8— 11日間培養する（Kawasaki et al. , 2000, Neu ron 28 ; 31-40, Tada et al. , 2003 ; Dev. Dyn. , 227 ; 504-510.参照;)。こ れにより、神経細胞に分化させる。
[0274] その結果、本発明の方法で保存した ES細胞は、神経への分ィ匕能を保持することが 明らかになる。 [0275] (実施例 10 :テラトーマ形成）
次に、本発明の上記実施例 4にお ヽて保存し解凍した ES細胞のテラトーマ形成能 を確認した。 SCIDマウス（日本クレア、東京）の皮下および腹腔内に本発明の ES細 胞を約 107個移植し、 1一 3ヶ月様子を見る。
[0276] 1一 3力月後に得られるテラトーマを回収し、組織学的解析を行う。その一例を図 5 に示す。本発明の方法で保存した ES細胞は、外胚葉、内胚葉、中胚葉などに由来 する種々の組織が観察される。したがって、本発明の方法で保存された ES細胞は、 多分ィ匕能を保持して 、ることが実証される。
[0277] (実施例 11 :造血系細胞への分化）
次に、本発明の上記実施例 4にお 、て保存し解凍した ES細胞の造血系細胞への 分化を観察する。分化誘導培養液として、 a MEM (Gibco BRL、 Cat # 11900— 0
16)に 10%ゥシ胎仔血清をカ卩え、 5 X 10— 5Mメルカプトエタノールを加えた培養液を 使用した。
[0278] まず、 ES細胞は、中胚葉細胞へと分化させた。未分化 ES細胞を、上述の分化誘 導培養液で懸濁し、 IV型コラーゲンコート 6プレートに 1 X 104Zゥエルの密度で播種 する。これを 37°C、 5% COで 4日間培養する。
2
[0279] 培養上清を回収し、ゥエルを PBS (—)で一回洗う。次に細胞剥離液 (Cell Dissoci ation Buffer (Gibco BRL, # 13150— 016)を入れて 10分間静置（37°C、 5%C O )し、細胞を剥離して回収する。細胞塊をほぐし、ほぐれないものはメッシュで除き、
2
細胞数を計数する。 1, 200rpmで 5分間遠心分離し、上清を除いた。
[0280] 次に、 10mlの HBSSZBSAで細胞を懸濁し、 1, 200rpmで 5分間遠心分離して 上清を除いた。 1 X 107細胞あたり 0. 1mlの正常マウス血清に懸濁し、 10分間静置 した。適切な量の E—力ドヘリン抗体および抗 FLK1抗体をカ卩ぇ 20分間氷水上に配 置した。 HBSSZBSAで 2回細胞を洗浄した後、 FLK1 +E—力ドヘリン一中胚葉細 胞を F ACSによりソートする。
[0281] ここで選択した中胚葉細胞を、分化誘導用培養液で懸濁し、 IV型コラーゲンコート プレートに 3 X 105の密度で播種する。培養液は 1ゥエルあたり 3mlカ卩え、 37°C、 5%
COで 3日間培養する。 [0282] 細胞の回収およびブロッキングを行う。回収およびブロッキングは、上述のように行 う。適切な量の VE—力ドヘリン抗体をカ卩え、 20分間氷温に静置する。細胞を HBSS ZBSAで洗浄した後、 VE—力ドヘリン +血管内皮細胞を FACSによりソートして血管 内皮細胞を調製する。
[0283] このようにして、本発明の方法で保存した ES細胞が造血系細胞へも分化することが 実証される。
[0284] (実施例 12 :心筋への分化誘導）
上述の実施例で凍結保存した後に解凍した ES細胞を、 KSRを含む基本培地 (例 えば、 DMEM)中で浮遊培養することによって胚様体を形成させる。胚様体形成後
、 4一 7日経過後に胚様体を集めゼラチンコート下培養ディッシュに播種する。 KSR を含む基本培地中で 1一 3週間培養することによって心筋細胞が分ィ匕する。
[0285] (実施例 13：他の動物由来の幹細胞での実験）
次に、マウス ES細胞を用いて、本発明の保存媒体がもたらす凍結保存効果を実証 する。 ES細胞は、非特許文献 5に記載されるように調製することができる。具体的に は、実施例 1に記載される手順に準じて行う。
[0286] このようにして得たマウス ES細胞を、実施例 5に準じて保存する。マウス細胞を使用 する場合の留意点は以下のとおりである。マウスの場合は、マウスに特異的なマーカ 一を用いることが重要である。
[0287] このようにして、マウス ES細胞を用いた場合でも、本発明の媒体が優れた保存効果 を有することが示される。
[0288] (実施例 14 :他の幹細胞 (例えば糸且織幹細胞)での実験）
組織幹細胞 (神経幹細胞、間葉系幹細胞など)を含む組織を取り出して単離して、 上記実施例のように凍結保存および解凍することによって、組織幹細胞でも安定して 凍結保存することができる細胞株が樹立される。
[0289] (実施例 15：サルでの再生治療）
次に、力-クイサルから、 ES細胞を採取し、実施例 5と同様の保存を行った後、神 経細胞に分化させる。神経への分化は、適切な分化因子 (神経成長因子 (NGF)、 脳由来神経栄養因子 (BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子 (GDNF)、ニューロ トロフィン（neurotrophin)、 IL— 6、 TGF— j8、 TNF)を含む培地中で培養することに よって行う。この神経細胞の移植物を神経疾患を有する力二クイサル被検体に移植 すると、移植物が機能できることがわかる。
[0290] (実施例 16 :ヒトの ES細胞の調製）
実施例 4に記載の方法を改変して、ヒトの ES細胞の保存効率が上がることを実証し た。以下に詳細なプロトコールを示す。
[0291] (ヒト ES細胞の継代培養法）
方法
1)前日までに、 4日以内に作成したフィーダ一細胞を準備する。
[0292] 通常の継代は、 60mmディッシュ 1枚分の ES細胞を 60mmディッシュ 2枚に継代す る。
[0293] 継代当日、ヒト ES細胞のコロニーの状態を観察し、コンフルェントであることを確認 する。
2) (以下の試薬容量は、 60mm細胞培養ディッシュ 1枚の場合）
ヒト ES細胞用培地を室温にもどす。ヒト ES細胞用解離液を解凍し、室温にもどす。
3)細胞解離液 0. 5mlをディッシュにカ卩え、細胞表面全体に液が行き渡るようにした 後、 37°C、 COインキュベーターで 5分間加温する。
2
4)細胞の状態を顕微鏡で観察する。半分以上のコロニーが周囲力 小さくまとまり、 フィーダ一細胞からはがれかけている状態が望ましい。ここで、 5分以上放置してもコ 口-一がこのような状態にならない場合は、原因として解離溶液が充分に室温にもど つて 、な 、、ある 、は失活して 、ることが考えられる。
5)ヒト ES細胞用培地を 2ml加え、細胞をディッシュからはがす。数回ピペッティング を行い、コロニーを適切なサイズに砕く。ギルソン P— 1000を使用するとよい。 ES細 胞コロニー 1つあたり約 100細胞程度になるようにする。ここで、コロニーが小さくなり すぎると再接着 ·増殖の効率が極端に低下する原因になるため、顕微鏡で確認しな がら、コロニーを解離する。
6)約 170 X g (l, OOOrpm)、 5分間遠心。
7)上澄みをできるだけ除く。 8)フィーダ一細胞のディッシュ力も培地を除き、ヒト ES細胞用培地を 4 mlずつ加え る。
9)コ-カルチューブに 2mlの培地をカ卩え、軽く懸濁する。ここで、既に ES細胞は 100 細胞前後の適切なサイズのコロニーなって 、るため、激し 、ピペッティングを避ける。 もし大きなコロニーがみえるようなら、細胞懸濁液を吸い上げたピペットの先端をコ- カルチューブの底に軽く押しつけ、穏やかに細胞懸濁液を排出して細胞をほぐす。
10)フィーダ一細胞ディッシュ 1枚あたり 1mlの ES細胞懸濁液をカ卩える。最終濃度 5n g/mlで繊維芽増殖因子 (bFGF；科研製薬)を加える
11)細胞の状態を顕微鏡で観察する。
12) ES細胞のコロニーがディッシュ全体に行き渡るように、ディッシュを充分に揺する 。 37°C、 COインキュベーターでー晚培養する。
2
13)翌日、顕微鏡で細胞の状態を観察する。培地交換。
14)以後毎日培地交換する。 3— 4日でコンフルェントになる。
[0294] (ヒト ES細胞の凍結保存法）
材料
凍結保存溶液 DAP213
2 M DMSO, 1Mァセトアミド， 3Mプロピレングリコール Zヒト ES細胞用培地 •0. 59gァセトアミドを 6ml程度の ES培地に溶解。 0. 22 mフィルターで濾過滅菌 。 15mlの遠心分離チューブへ入れる。
•DMSO 1. 42ml、プロピレングリコール 2. 2mlを添カ卩する。
• 10mlに培地でメスアップ（チューブの目盛りでよ 、）。
'よく混ぜて、 1mlずつクライオチューブに分注し、 80°Cで保存する。数回の融解' 凍結は可能である。
[0295] 方法
1)コンフルェントの状態のヒト ES細胞を 60mm細胞培養ディッシュ 1枚準備する。
2)ヒト ES細胞用培地を室温にもどす。ヒト ES細胞用解離液を解凍し、室温にもどす
3)液体窒素と氷を準備する。凍結保存用チューブ (Nulgene # 5000-1012)に「 細胞名」「日付」「継代数」等を記入し、氷上で冷やしておく。
4)凍結保存液 DAP213を解凍、氷上で冷やしておく。
5)ヒト ES細胞ディッシュの培地を除き、適量の PBS (-)をカ卩え、細胞を洗う。
6)ヒト ES細胞用トリプシン溶液 lmlをディッシュにカ卩え、細胞表面全体に液が行き渡 るようにする。
7)細胞の状態を顕微鏡で観察する。半分以上のコロニーが周囲力 小さくまとまり、 フィーダ一細胞からはがれかけて 、る状態が望まし 、。
8)ヒト ES細胞用培地を 5ml加え、細胞全体をディッシュからはがす。凍結、融解時に 自然にコロニーがほぐれるため、この時点でほぐす必要はない。
9)細胞懸濁液を 15 mlコ-カルチューブに回収する。新しいヒト ES細胞用培地 5ml をディッシュに加え、残りの細胞も回収する。
10) 170 X g (l, OOOrpm)、 4°Cで 5分間遠心分離する。ここで、サンプル数が多い 場合、遠心後、氷上においておく。
11)上澄みをできるだけ除く。
12) DAPを 200 1カ卩え、穏やかに懸濁する。予め準備した凍結保存用チューブに 移す。ピンセットで凍結チューブをつかみ、液体窒素につける。ここで、 DAPは細胞 毒性が強いため出来る限りすばやく作業すること。目安として 15秒以内。また、加え る DAPは、凍結する細胞数に関係なく 200 1で良い。
13)液体窒素中で、 30秒から 1分間凍結する。ここで、内部まで完全に凍らせる。
14)液体窒素保存容器に移す。
(ヒト ES細胞の解凍法）
方法
1)前日までに、ヒト ES細胞の凍結チューブ 1本あたり 60mm細胞培養ディッシュ 1枚 分のフィーダ一細胞を用意する。
2)ヒト ES細胞用培地 10mlを 15mlコ-カルチューブに移し、 37°Cウォーターバスで 温めておく。
3)凍結保存していたヒト ES細胞凍結チューブに、あらかじめ 37°Cに温めたヒト ES細 胞用培地を lml加え、ピペッティングを行い、急速解凍する。ここで、解凍および希釈 はすばやく行う。また、ウォーターバスでの解凍は、融解後の細胞生存率が極端に低 下する原因になる。
4)細胞懸濁液を 15mlコ-カルチューブへ移す。
5)約 170 X g (l, OOOrpm)、 5分間遠心。
6)上清を吸引し、ヒト ES細胞用培地を 10ml加える。ピペッティングを穏やかに行い、 ES細胞のコロニーが小さくなりすぎない程度に懸濁する。大きなコロニーは、細胞懸 濁液を吸い上げたピペットの先端をコ-カルチューブの底に軽く押しつけ、穏やかに 細胞懸濁液を排出してほぐす。
7)フィーダ一細胞の培地を除く。
8) ES細胞懸濁液全量を 60mmフィーダ一細胞ディッシュに移す。
9)顕微鏡で細胞の状態を確認する。
10) 37°C、 COインキュベーターでー晚培養する。
2
11)翌日、顕微鏡で細胞の状態を確認する。通常解凍した翌日は、多数の細胞が死 んでいるのが確認される。毎日 1回培地交換を継続する。通常、 3日程度で継代可能 になる。
[0297] 結果を、図 7に示す。ヒト ES細胞を記載の方法で凍結し、解凍後の細胞生存率が 示されて!/、る。 10%DMSOを使用した緩慢凍結法では解凍後の細胞生存率がほぼ 0%に近力つたのに対し、簡易凍結法を用いることで 10%以上の細胞生存率を得る ことができ、ヒト ES細胞を用いても生存率の著しい向上が示された。
[0298] (実施例 17 :ヒトでの再生治療）
次に、ヒトの ES細胞を調製し、実施例 15に記載されるように保存した後、皮膚細胞 に分化させる。皮膚への分化は、適切な分ィ匕因子 (皮膚 (ケラチノサイト)の場合は、 TGF— j8、FGF— 7 (KGF:ケラチノサイト増殖因子 =keratinocyte growth fact or)、 EGF)を含む培地中で必要に応じて適切なフィーダ一細胞を用いて培養するこ とによって達成される。この皮膚細胞の移植物を、皮膚疾患を有するヒト被検体に移 植すると、移植物が機能し、皮膚の機能が回復することがわかる。
[0299] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力 本発 明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求 の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、 本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に 基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引 用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載さ れているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであるこ とが理解される。
産業上の利用可能性
本発明は、再生医療において、多大な有用性を有する。好ましい実施形態では特 に、従来達成不可能であった高い保存効率でかつ簡便に幹細胞を保存することが できたことから、その有用性は高い。したがって、本発明は、再生医療およびその治 療用医薬などを製造する業にぉ 、て利用可能性がある。

Claims

請求の範囲
[I] 幹細胞を保存するための媒体 (medium)であって、
A)ジメチルスルホキシド（DMSO)；
B)プロピレングリコール；および
C)培地 (culture medium)、
を含む、媒体。
[2] 前記 DMSOは、前記媒体の 15— 40%を占める、請求項 1に記載の媒体。
[3] 前記プロピレングリコールと前記 DMSOとは、合計で、前記媒体の約 30%より多ぐ かつ、該媒体の約 50%未満を占める、請求項 1に記載の媒体。
[4] 前記 DMSOと前記プロピレングリコールとは、約 1： 2—約 2 : 1のモル比率で存在す る、請求項 1に記載の媒体。
[5] 前記 DMSOと前記プロピレングリコールとは、約 3： 2のモル比率で存在する、請求項
1に記載の媒体。
[6] ァセトアミドおよび糖からなる群より選択される成分をさらに含む、請求項 1に記載の 媒体。
[7] 前記 DMSOは約 1M— 4M存在し、前記プロピレングリコールは約 1. 5M— 6M存 在する、請求項 1に記載の媒体。
[8] 前記 DMSOは、約 2M存在する、請求項 7に記載の媒体。
[9] 前記プロピレングリコールは、約 3M存在する、請求項 7に記載の媒体。
[10] 前記 DMSOは約 2M存在し、前記プロピレングリコールは約 3M存在する、請求項 7 に記載の媒体。
[II] 前記 DMSOは約 1M— 4M存在し、前記プロピレングリコールは約 1. 5M— 6M存 在し、さらに約 0M— 2Mのァセトアミドを含む、請求項 1に記載の媒体。
[12] 前記 DMSOは、約 2M存在する、請求項 10に記載の媒体。
[13] 前記プロピレングリコールは、約 3M存在する、請求項 10に記載の媒体。
[14] 前記ァセトアミドは、約 1Mで含まれる、請求項 10に記載の媒体。
[15] 前記 DMSOは、約 2M存在し、前記プロピレングリコールは、約 3M存在し、前記ァ セトアミドは、約 1Mで含まれる、請求項 10に記載の媒体。
[16] 前記培地は、ダルベッコ改変 Eagle培地（DMEM培地）および F12培地力 なる群 より選択される培地またはそれらの混合物を含む、請求項 1に記載の媒体。
[17] 前記培地は、 DMEM/F12 (1： 1)培地 +KSRである、請求項 1に記載の媒体。
[18] 前記幹細胞が組織幹細胞および胚性幹 (ES)細胞からなる群より選択される幹細胞 である、請求項 1に記載の媒体。
[19] 前記幹細胞が ES細胞を含む幹細胞である、請求項 1に記載の媒体。
[20] 前記幹細胞が霊長類 ES細胞を含む幹細胞である、請求項 1に記載の媒体。
[21] 前記幹細胞がヒト ES細胞を含む幹細胞である、請求項 1に記載の媒体。
[22] 前記保存が凍結保存である、請求項 1に記載の媒体。
[23] 前記保存が急速凍結保存である、請求項 1に記載の媒体。
[24] 前記急速凍結保存が約 30°CZ分以上の速度で凍結される、請求項 23に記載の媒 体。
[25] 前記保存の後、急速解凍される、請求項 1に記載の媒体。
[26] 前記急速解凍は、約 50°CZ分以上の速度で解凍される、請求項 25に記載の媒体。
[27] 幹細胞を保存するための媒体 (medium)であって、
A) DMSO ;
B)エチレングリコール；および
C)培地 (culture medium)、
を含み、
ここで、該 DMSOおよび該エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、 20重 量％未満である、
媒体。
[28] 前記 DMSOおよびエチレングリコールは、約 15%ずつ含まれる、請求項 27に記載 の媒体。
[29] さらに、糖を含む、請求項 27に記載の媒体。
[30] 前記糖は、スクロースを含む、請求項 29に記載の媒体。
[31] 前記 DMSOは前記媒体の約 7. 5%— 30%含まれ、前記エチレングリコールは前記 媒体の約 7. 5%— 30%含まれ、前記スクロースは、約 0. 1875M— 0. 75M含まれ る、請求項 27に記載の媒体。
[32] 前記 DMSOは前記媒体の約 15%含まれ、前記エチレングリコールは前記媒体の約
15%含まれ、前記スクロースは、約 0. 375M含まれる、請求項 27に記載の媒体。
[33] 前記媒体は、前記幹細胞を凍結保存するためのものである、請求項 27に記載の媒 体。
[34] 幹細胞を保存するための方法であって、
A) a) DMSO；
b)プロピレングリコール；および
c)培地、
を含む、媒体中で、幹細胞を急速凍結させる工程、
を包含する、方法。
[35] 前記急速凍結は、封入管を用いて行われる、請求項 34に記載の方法。
[36] 前記幹細胞は、コロニーのまま剥離されたものである、請求項 34に記載の方法。
[37] 前記幹細胞と、前記媒体とは、約 1 X 104/100 1一約 5 X 107/100 /ζ 1の比率で 存在する、請求項 34に記載の方法。
[38] 前記急速凍結は、液体窒素中で行われる、請求項 34に記載の方法。
[39] 前記保存後、急速解凍する工程をさらに包含する、請求項 34に記載の方法。
[40] 前記急速解凍は、ピペッティングによる、請求項 39に記載の方法。
[41] 前記幹細胞は、組織幹細胞および ES細胞を含む、請求項 34に記載の方法。
[42] 前記幹細胞は、 ES細胞を含む、請求項 34に記載の方法。
[43] 前記幹細胞は、霊長類 ES細胞を含む、請求項 34に記載の方法。
[44] 前記幹細胞は、ヒト ES細胞を含む、請求項 34に記載の方法。
[45] 前記媒体は、請求項 2— 26のいずれか 1項に記載される媒体である、請求項 34に記 載の方法。
[46] 幹細胞を保存するための方法であって、
A) a) DMSO；
b)エチレングリコール；および
c)培地 (culture medium)、 を含み、
ここで、該 DMSOおよび該エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、 20重 量％未満である、
媒体中で、幹細胞を凍結させる工程、
を包含する、方法
[47] 前記媒体は、請求項 28— 33のいずれ力 1項に記載される媒体である、請求項 46に 記載の方法。
[48] 幹細胞を保存するためのシステムであって、
A) a) DMSO；
b)プロピレングリコール；および
c)培地、
を含む、媒体；
B)急速凍結する手段、
を備える、システム。
[49] さらに、封入管を備える、請求項 48に記載のシステム。
[50] 前記幹細胞は、組織幹細胞および ES細胞を含む、請求項 48に記載のシステム。
[51] 前記幹細胞は、 ES細胞を含む、請求項 48に記載のシステム。
[52] 前記幹細胞は、霊長類 ES細胞を含む、請求項 48に記載のシステム。
[53] 前記幹細胞は、ヒト ES細胞を含む、請求項 48に記載のシステム。
[54] 前記媒体は、請求項 2— 26のいずれ力 1項に記載される媒体である、請求項 48に記 載のシステム。
[55] 幹細胞を保存するためのシステムであって、
A) a) DMSO；
b)エチレングリコール；および
c)培地 (culture medium)、
を含み、
ここで、該 DMSOおよび該エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、 20重 量％未満である、 媒体；
B)凍結する手段、
を備える、システム。
[56] 前記媒体は、請求項 28— 33のいずれ力 1項に記載される媒体である、請求項 55に 記載のシステム。
[57] a) DMSO；
b)プロピレングリコール；および
c)培地、
を含む、媒体の、幹細胞を急速凍結保存するための、使用。
[58] a) DMSO；
b)エチレングリコール；および
c)培地 (.culture mediumノ、
を含み、
ここで、該 DMSOおよび該エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、 20重 量％未満である、
媒体の、幹細胞を凍結保存するための、使用。
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