WO2005049816A2 - Oxidoreduktase aus metschnikowia zobellii - Google Patents

Oxidoreduktase aus metschnikowia zobellii Download PDF

Info

Publication number
WO2005049816A2
WO2005049816A2 PCT/EP2004/013156 EP2004013156W WO2005049816A2 WO 2005049816 A2 WO2005049816 A2 WO 2005049816A2 EP 2004013156 W EP2004013156 W EP 2004013156W WO 2005049816 A2 WO2005049816 A2 WO 2005049816A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oxidoreductase
seq
nadph
dna sequence
amino acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2004/013156
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2005049816A3 (de
Inventor
Antje Gupta
Maria Bobkova
Anke Zimmer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cambrex IEP GmbH
Original Assignee
IEP GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IEP GmbH filed Critical IEP GmbH
Priority to AT04818808T priority Critical patent/ATE470715T1/de
Priority to DK04818808.0T priority patent/DK1685248T3/da
Priority to PL04818808T priority patent/PL1685248T3/pl
Priority to DE502004011271T priority patent/DE502004011271D1/de
Priority to EP04818808A priority patent/EP1685248B1/de
Publication of WO2005049816A2 publication Critical patent/WO2005049816A2/de
Publication of WO2005049816A3 publication Critical patent/WO2005049816A3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture

Definitions

  • the present invention relates to a novel NADPH-dependent oxidoreductase from yeasts, for example the genus Metschnikowia, in particular from Metschnikowia zobellii, an enzymatic process for the enantioselective reduction of organic keto compounds to the corresponding hydroxy compounds and an enzymatic process for the enantioselective recovery of hydroxy compounds in the two-phase system Use of the isolated recombinantly overexpressed oxidoreductase from Metschnikowia zobellii.
  • Optically active hydroxy compounds are valuable chiral building blocks with wide application for the synthesis of pharmacologically active compounds, aromatic substances, pheromones, agrochemicals or enzyme inhibitors.
  • the number of suitable for large-scale applications in biocatalysis and sufficiently inexpensive available carbonyl reductases is very limited.
  • the alcohol dehydrogenases which can hitherto be used in the form of isolated enzymes are largely secondary alcohol dehydrogenases whose substrate spectrum is limited to substrates with a large and a small side chain in the vicinity of the carbonyl function, the maximum length of the smaller of the two side chains being three C Atoms may amount to.
  • Such enzymes are for example
  • Aikohoidehydrogenase from Yeast (YADH) (Alcohoi dehydrogenases: The Enzymes, (1963) pages 25-83, New York: Academic Press), Candida parapsilosis carbonyl reductase (CPCR) (US 5,523,223 and US 5,763,236) or Pichia capsulata ADH (DE10327454.4 ).
  • CPCR Candida parapsilosis carbonyl reductase
  • COCR Rhodococcus erythropolis
  • Norcardia fusca Biosci Biotechnol. Biochem., 63 (10) (1999), pages 1721-1729)
  • R-specific secondary alcohol dehydrogenases from organisms of the genus Lactobacillus (Lactobacillus kefir (US5200335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 A1), Lactobacillus minor (DE10119274) or Pseudomonas (US 05385833).
  • the oxidoreductase according to the invention is a novel oxidoreductase which has no relationship or homology to already known carbonyl reductases.
  • the stereoselectivity of the oxidoreductase according to the invention is determined not only by the size of the side chains flanking the carbonyl group but also by their hydrophobicity. As a result, the substrate spectrum and the enantioselectivity of the oxidoreductase according to the invention clearly differ from the known classes of enzyme.
  • the oxidoreductase according to the invention is characterized in that it reduces carbonyl compound to the corresponding chiral hydroxy compounds in the presence of NADPH and water. It can be obtained, for example, from yeasts of the genus Metschnikowia, in particular from Metschnikowia zobellii.
  • oxidoreductase from Metschnikowia zobellii, which has the DNA sequence according to SEQ ID NO: 12 and the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 13, as described in the attached sequence listing.
  • the invention furthermore relates to an oxidoreductase in which more than 70% of the amino acids are identical to the amino acid sequence SEQ ID NO: 13 and has a specific activity of more than 1 ⁇ mol per mg protein, based on the conversion of 2-oxo 4-phenylbutyric acid ethyl ester to give (R) -2-hydroxy-4-phenylbutyric acid ethyl ester.
  • Preference is given to an oxidoreductase in which 80% to 99.5%, in particular 90% to 99.5%, particularly preferably 99% to 99.5% of the amino acids are identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the measurement of specific activity of the oxidoreductase according to SEQ ID NO: 13 or of its derivatives or analogs as defined below is carried out with the test system described in Example 1.
  • oxidoreductases which have 1 to 40 additional amino acids or 1 to 40 amino acids less than the oxidoreductase having the amino acid sequence SEQ ID NO: 13 and which exhibits a specific activity of more than 1 ⁇ mol per mg protein, based on the conversion of 2 Oxo-4-phenylbutyric acid ethyl ester to (R) -2-hydroxy-4-phenylbutyrate.
  • Preferred are the oxidoreductases, in which 1 to 25 amino acids, in particular 2 to 20 amino acids, particularly preferably 3 to 10 amino acids occur more or less in the amino acid sequence SEQ ID NO: 13.
  • an oxidoreductase which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and is derivatized once, twice, three, four or five times by a water-soluble polymer and has a specific activity of more than 1 ⁇ mol per mg protein , based on the reaction of ethyl 2-oxo-4-phenylbutyrate to (R) -2-hydroxy-4-phenylbutyric acid ethyl ester.
  • a water-soluble polymer is, for example, polyethylene glycol.
  • the binding of the polyethylene glycol is preferably carried out at the N-terminal end of the protein according to SEQ ID NO: 13.
  • the oxidoreductase according to SEQ ID NO: 13 can also be bound to a solid, preferably from polyethylene, polystyrene, polysaccharide, cellulose or a cellulose derivative.
  • the invention further relates to protein fragments of the amino acid sequence SEQ ID NO: 13 with 5 to 30 amino acids per fragment.
  • the invention further relates to a fusion protein comprising the oxidoreductase having the amino acid sequence SEQ ID NO: 13 or a fragment thereof having from 5 to 30 amino acids which are peptidisch connected to another polypeptide at the N-terminal or carboxy-terminal end.
  • fusion proteins can be more easily separated from other proteins or are expressed in a greater amount in the cells.
  • the invention further relates to antibodies which bind specifically to the oxidoreductase according to SEQ ID NO: 13.
  • the preparation of these antibodies is carried out by known methods by immunization of suitable mammals and subsequent recovery of the antibodies.
  • the antibodies can be monoclonal or polyclonal.
  • the invention also relates to the (isolated) nucleic acid sequence which codes for the oxidoreductase according to SEQ ID NO: 13.
  • the invention further relates to the (isolated) deoxyribonucleic acid sequence (DNA sequence) of the oxidoreductase, which catalyzes the reduction of carbonyl compound in the presence of NADPH and water to the corresponding hydroxy compounds, the DNA sequence being selected from the group
  • DNA sequence which has the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 or the complementary strand in each case b) DNA sequence which is in contact with one or more of the DNA Hybridizing sequences according to a) or its complementary strands, wherein the hybridization is carried out under stringent conditions as described (Sambrok and Russel, Molecular Cloning a laboratory Manual, Vol 1, Chapter 1 Protocol 30-32), and c) DNA sequence which Reason for the degeneracy of the genetic code, a protein encoded by one or more of the DNA sequences according to a) or b).
  • the invention further relates to a DNA sequence in which more than 70% of the nucleic acid bases are identical to the DNA sequence according to SEQ ID NO: 12 or their complementary strands and which codes for an oxidoreductase having a specific activity of more than 1 ⁇ mol per mg of protein, based on the reaction of 2-oxo-4-phenyl-butyric acid ethyl ester to (R) - 2-hydroxy-4-phenyl-butyrate.
  • nucleic acid bases Preference is given to DNA sequences in which 80% to 99.5%, preferably 90% to 99.5%, particularly preferably 99% to 99.5%, of the nucleic acid bases are identical to the DNA sequence according to SEQ ID NO: 12 .
  • the invention further relates to a nucleic acid sequence with 10 to 50 nucleic acid bases which has a sequence which corresponds to a part or several parts of the DNA sequence according to SEQ ID NO: 12 or their complementary strands.
  • the stated nucleic acid sequences are suitable as molecular samples or as primers for the polymerase chain amplification reaction (PCR).
  • the invention further relates to a cloning vector comprising one or more of the abovementioned nucleic acid or DNA sequences.
  • the invention further relates to an expression vector which is located in a bacterial, insect, plant or animal cell (in particular mammalian cell) and contains one or more of the abovementioned nucleic acid or DNA sequences, which are suitably linked to an expression control sequence.
  • the invention further relates to a host cell which is a bacterial, yeast, insect, plant or (mammalian) animal cell and has been transformed or transfected with one of the above-mentioned expression vectors.
  • the identities of the aforementioned DNA sequences or amino acid sequence are calculated by summing the number of amino acids or nucleic acid bases identical to partial sequences of the respective proteins or DNA sequences, dividing by the total number of amino acids or nucleic acid bases, and multiplying by one hundred.
  • cloning vectors examples include ppCR-Script, pCMV-Script, pBluescript (Stratagene), pDrive cloning Vector (Qiagen, Hilden, Germany), pS Blue, pET Blue, pET LIC vectors (Novagen, Madison, USA) and TA-PCR cloning vectors (Invitrogen, Düsseldorf, Germany).
  • Suitable expression vectors are pKK223-3, pTrc99a, pUC, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM, pQE, pET, PHUB, pPLc, pKC30, pRM1 / pRM9, pTrxFus, pAS1, pGEx, pMAL or pTrx.
  • Suitable expression control sequences are, for example, trp-lac (tac) promoter, trp-lac (trc) promoter, lac promoter, T7 promoter or ⁇ pL promoter.
  • the oxidoreductase from Metschnikowia zobellii is a monomer with a molecular weight determined in the SDS gel of 36 + 2 kDa.
  • the temperature optimum of the oxidoreductase is in the range of 20 ° C to 25 ° C and the pH optimum for the reduction reaction is in the range of 5.5 to 6.5.
  • the oxidoreductase from Metschnikowia zobellii is stable in the pH range of 5.5 to 8.5 and in the temperature range of 15 ° C to 30 ° C for 5 hours and also shows good stability in organic solvents.
  • the enzyme can be isolated in particular from yeasts of the genus Metschnikowia and can be detected in the spectrophotometric test by the decrease of NADPH at 340 nm in the presence of a corresponding substrate, for example ethyl 2-oxo-4-phenylbutyrate.
  • An oxidoreductase according to the invention from Metschnikowia zobellii was cloned and could be overexpressed in Escherichia coli (E. coli) with activities of 1000 to 10,000 U / g E. coli wet weight.
  • the enzyme is thus inexpensive and available in large quantities.
  • the invention also relates to a method for obtaining the oxidoreductase from Metschnikowia zobellii.
  • the DNA coding for the oxidoreductase from Metschnikowia zobellii is expressed, for example, in a suitable prokaryotic or eukaryotic microorganism.
  • the oxidoreductase from Metschnikowia zobellii is preferably transformed into an E. coli strain. and expressed, in particular in E. coli BL21star (DE3) cells (Invitrogen, catalog number C6010-03).
  • the oxidoreductase from Metschnikowia zobellii can be obtained, for example, in such a way that the above-mentioned recombinant E. coli cells are cultivated, the expression of the oxidoreductase is induced and then after about 10 to 18 hours the cells are ultrasonically treated or wet-milled with glass beads in a ball mill ( Retsch, GmbH, Haan Germany 10 min, 24 Hz).
  • the obtained cell extract can either be used directly or further purified.
  • the cell extract is centrifuged, for example, and the resulting supernatant is subjected to hydrophobic interaction chromatography, for example to Octylseparose Fast Flow® (Pharmacia).
  • the invention further relates to a process for the enantioselective reduction of carbonyl compounds to the corresponding chiral hydroxy compounds, which comprises: a) reducing a carbonyl compound in the presence of the oxidoreductase according to the invention, NADPH and water to the corresponding chiral hydroxy compound, and b) the isolated chiral hydroxy compound.
  • the inventive method has a long service life, an enantiomeric purity of more than 90% of the chiral hydroxy compounds prepared and a high yield based on the amount of carbonyl compound.
  • NADPH is understood to mean reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.
  • NADP is understood as meaning nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.
  • carbonyl compound is meant, for example, compounds of the formula IR1-C (O) -R2 (I).
  • R 1 is, for example, 1) (C 1 -C 20 ) alkyl which is straight-chain or branched, 2) (C 2 -C 20 ) alkenyl which is straight-chain or branched and, depending on the chain length, one, two, three or four Contains double bonds, 3) (C 2 -C 2 0) alkynyl which is straight-chain or branched and, depending on the chain length, contains one, two, three or four triple bonds, 4) (C 6 -C 14 ) aryl, 5) ( C 1 -C 8 ) alkyl (C 6 -C 14 ) aryl, 6) a (C 5 -C 4 ) heterocycle which is unsubstituted or monosubstituted to trisubstituted, preferably by halogen, hydroxyl, amino or nitro, or 7) (C 3 -C 7 ) cycloalkyl, where the radicals mentioned above under 1) to 7) are unsubstituted or mono-
  • R2 is, for example 1) (Ci-C ß JAlkyl, which is straight chain or branched, 2) (C 2 -C 6) alkenyl, which is straight-chain or branched and, depending on the chain length, contains one, two or three double bonds, 3 ) (C 2 -C 6 ) alkynyl which is straight-chain or branched and, depending on the chain length, contains one or two triple bonds, or 4) (C 0 -C 10 ) alkyl C (O) -O- (C 1 -C 6 ) alkyl, wherein alkyl is straight or branched and is unsubstituted or mono- to trisubstituted by halogen, hydroxyl, amino or nitro where the radicals mentioned above under 1) to 4) are unsubstituted or mono-, di- or trisubstituted independently of one another by a) -OH, b) halogen, such as fluorine, chlorine, bromine or iod
  • chiral hydroxy compound are, for example, compounds of the formula IIR1-C (OH) -R2 (II)
  • aryl refers to aromatic carbon radicals having 6 to 14 carbon atoms in the ring.
  • Aryl radicals are, for example, phenyl, naphthyl, for example 1-naphthyl, 2-naphthyl, biphenylyl, for example biphenyl-2-yl, biphenyl-3-yl and biphenyl-4-yl, anthracenyl or fluorenyl.
  • Biphenylyl radicals, naphthyl radicals and in particular phenyl radicals are preferred aryl radicals.
  • halogen is understood to mean an element from the series fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • (C 1 -C 20 ) alkyl denotes a hydrocarbon radical whose carbon chain is straight-chain or branched and contains 1 to 20 carbon atoms, examples of which are methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, Heptyl, octyl, nonyl or decyl.
  • C 0 -alkyl in connection with the present invention is to be understood as meaning a covalent bond.
  • (C3-C7) cycloalkyl means cyclic hydrocarbon radicals such as cyclopropyl, cylobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl or cycloheptyl.
  • (Cs-C 1-4 heterocycle” means a monocyclic or bicyclic 5-membered to 14-membered heterocyclic ring which is partially or fully saturated.
  • heteroatoms include N, O and S.
  • Terms (C 5 -C 4 ) heterocycle are radicals derived from pyrrole, furan, thiophene, imidazole, pyrazole, oxazole, isoxazole, thiazole, isothiazole, tetrazole, 1, 2,3,5-oxathiadiazole-2-oxides, triazolones , Oxadiazolones, isoxazolones, oxadiazolidinediones, triazoles which may be substituted by F, -CN, -CF 3 or -CO-O- (C 1 -C 4 ) alkyl, 3-hydroxy-pyrrolidine-2,4-diones, 5-oxo-1, 2,4-thiadiazoles, pyridine
  • Examples of preferred compounds of the formula I are ethyl 2-oxo-4-phenylbutyrate, ethylphenyl glyoxylate, 1-phenyl-2-propanone, 2,3-dichloro-acetophenone, 2-octanone, ethyl 8-chloro-6-oxo-octanoate, 3 Oxo-octane-1,8-diacid dimethyl ester, 2-oxo-cyclohexanecarboxylic acid ethyl ester, 2-methylcyclohexanone or 3-methylcyclohexanone.
  • the correspondingly formed S-alcohols are, for example, ethyl (R) -2-hydroxy-4-phenylbutyrate, ethyl (R) -mandelate, (S) -2-octanol or (R) -ethyl-8-chloro-6-hydroxy octanoic acid, (S) -1-phenyl-2-propanol or (R) -2-chloro-1- (3-chlorophenyl) -ethan-1-ol.
  • Suitable oxidoreductases are derived, for example, from Metschnikowia zobellii.
  • the oxidoreductase can be used either completely purified or partially purified in the process according to the invention or can be carried out with cells containing the oxidoreductase according to the invention.
  • the cells used can be native, permeabilized or lysed.
  • the cloned oxidoreductase according to SEQ ID NO: 13 is used.
  • the volume activity of the oxidoreductase used is from 100 units / ml (U / ml) to 5000 U / ml, preferably about 500 U / ml.
  • the enzyme unit 1 U corresponds to the amount of enzyme required for 1 ⁇ mol of the compound of the formula I per minute (min). implement.
  • the invention further relates to a process for the enantioselective reduction of carbonyl compounds to the corresponding chiral hydroxy compounds, which comprises a) reducing a carbonyl compound in the presence of oxidoreductase, NADPH and water to the corresponding chiral hydroxy compound, b) the NADP formed by the oxidoreductase simultaneously reduced to NADPH with a dehydrogenase and a co-substrate, and c) isolating the resulting chiral hydroxy compound.
  • Suitable dehydrogenases are, for example, secondary alcohol dehydrogenases from Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir or Lactobacillus brevis, which enzymes require NADPH as coenzyme (DE 19 610 984, EP 0 456 107, WO 97/32012).
  • Suitable cosubstrates for the alcohol dehydrogenase used are alcohols such as 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol or 2-octanol.
  • NADP reduction can also be carried out with the known enzymes used for the regeneration of NADPH, for example with glucose dehydrogenase or NADPH-dependent formate dehydrogenase (Tishkov et al., J. Biotechnol., Bioeng., 1999, 64, 187-193) Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase).
  • the suitable cosubstrate for the process according to the invention is glucose when using the glucose dehydrogenase.
  • Suitable cosubstrates of formate dehydrogenase are, for example, salts of formic acid such as ammonium formate, sodium formate or calcium formate.
  • the alcohol dehydrogenases from Lactobacillus minor (DE 101 19274) or Thermoanerobium brockii are preferably used.
  • the alcohol dehydrogenase can be used in the process according to the invention either completely purified or partially purified, or whole cells containing the alcohol dehydrogenase can be used.
  • the cells used can be native, permeabilized or lysed.
  • the enzyme unit 1 U corresponds to the amount of enzyme required for 1 ⁇ mol of the cosubstrate (eg 2 -Propanol) per minute (min) implement.
  • a buffer is preferably added to the water, for example potassium phosphate, tris / HCl or triethanolamine buffer having a pH of 5 to 10, preferably a pH of 6 to 9.
  • the buffer concentration is from 10 mM to 200 mM, preferably from 50 mM to 150 mM, especially 100 mM.
  • the buffer may additionally contain ions for the stabilization or activation of both enzymes, for example magnesium ions for stabilizing the alcohol dehydrogenase from Lactobaillus minor.
  • the buffer may contain detergents, for example, Triton X100, Triton X45, Triton X114, Triton X450 for the reaction mediation.
  • the temperature is in the inventive method, for example, from about 10 ° C to 30 ° C, preferably from 20 ° C to 25 ° C.
  • the invention further relates to a process for the enantioselective reduction of carbonyl compounds to the corresponding chiral hydroxy compounds, which comprises: a) reducing a carbonyl compound in the presence of the oxido reductase, NADPH and water according to the invention to the corresponding chiral hydroxy compound; Oxidoreductase NADP simultaneously reduced to NADPH with a dehydrogenase and a co-substrate, c) carrying out the reactions in the presence of an organic solvent, and d) isolating the chiral hydroxy compound formed.
  • the preferred organic solvents are, for example, tert-butyl methyl ether, diisopropyl ether, heptane, hexane or cyclohexane or mixtures thereof of different composition.
  • the reaction mixture generally consists of an aqueous phase and an organic phase when using additional solvents.
  • the organic phase is formed by a suitable solvent in which the substrate is dissolved or is formed by the water-insoluble substrate itself.
  • the organic phase generally has a proportion of about 5 to 80%, preferably 10 to 40%, based on the total reaction volume.
  • the water forms the one liquid phase in the two-phase system and the organic solvent forms the second liquid phase.
  • a solid or further liquid phase which is formed, for example, by incompletely dissolved oxidoreductase and / or alcohol dehydrogenase or by the compound of the formula I.
  • two liquid phases without solid phase are preferred.
  • the two liquid phases are preferably mechanically mixed so that large surfaces are created between the two liquid phases.
  • the concentration of the cofactor NADPH relative to the aqueous phase is from 0.001 mM to 1 mM, in particular from 0.01 mM to 0.1 mM.
  • a stabilizer of the alcohol dehydrogenase is preferably used in the process according to the invention.
  • Suitable stabilizers are, for example, glycerol, sorbitol or dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • the compounds of the formula I are used in the process according to the invention in an amount of 2% to 30% (w / v) based on the total volume, preferably from 5% to 20% (w / v), in particular 8% to 15% (w / v).
  • the amount of cosubstrate for the regeneration of NADP to NADPH, such as isopropanol, is from about 2% to 30% by total volume, preferably from 5% to 20%, more preferably from 8% to 15%.
  • the process according to the invention is carried out, for example, in a closed reaction vessel made of glass or metal.
  • the components are transferred individually into the reaction vessel and stirring stirred under an atmosphere of, for example, nitrogen or air.
  • the reaction time is 1 hour to 96 hours, in particular from 2 hours to 24 hours.
  • the reaction mixture is worked up.
  • the aqueous phase is separated, the organic phase is filtered. If appropriate, the aqueous phase can be extracted once more and, like the organic phase, worked up further. Thereafter, if necessary, the solvent is evaporated from the clear organic phase.
  • the total yield of the process after distillation of the product is about 50% to 95%, based on the amount of starting material.
  • yeast extract (3) For screening, a number of different yeast strains were cultured in the following medium: The data in the parenthesis refer to g per liter of water: yeast extract (3), malt extract (3), peptones (5) and glucose (10).
  • the medium was sterilized at 121 ° C and the yeasts were cultured without further pH regulation at 25 ° C and on a shaker at 160 revolutions per minute (rpm).
  • the supernatant (lysate) obtained after centrifugation at 12000 rpm for 2 min was used in the following activity screening and determination of the Enantiomeric excess (ee value) used.
  • the substrate used was 2-oxo-4-phenyl-butyric acid ethyl ester.
  • ee (%) ((R-Alcohol -S-Alcohol) / (R-Alcohol + S-Alcohol)) x 100.
  • DSMZ German Collection for Microorganisms and Cell Cultures, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig Definition of the enzyme units: 1 U corresponds to the amount of enzyme required to react 1 ⁇ mol of substrate per minute.
  • the crude extract obtained after centrifugation (7000 rpm) was then further purified by FPLC (fast protein liquid chromatography).
  • the oxidoreductase according to the invention could be purified in three steps by combining hydrophobic interaction chromatography on Octyl Sepharose Fast Flow, Butyl Sepharose HiTrap (Pharmacia) and ion exchange chromatography on Uno Q (Biorad, Kunststoff, Germany).
  • the lysate obtained after centrifugation directly (NH 4) 2 S0 equilibrated with a 100 mM triethanolamine buffer pH 7.0 1 M Octyl Sepharose FF column was applied and eluted with decreasing linear salt gradient.
  • the oxidoreductase was eluted at 0.2 to 0.3 M (NH) 2 S0 4 .
  • the oxidoreductase-containing fractions were combined and concentrated by ultrafiltration (cut-off 10 kDa) to a suitable volume.
  • the concentrated fractions of the oxidoreductase were further purified by means of Uno Q.
  • the enzyme activity of the oxidoreductase was determined in the test system according to Example 1, (activity screening approach, measurement with NADPH) and the determination of the amount of protein was carried out according to Lowry et al. Journal of Biological Chemistry 193 (1951) 265-275 or Peterson et al., Analytical Biochemistry, 100 (1979) 201-220). The quotient of enzyme activity to protein amount gives the specific activity, wherein the conversion of 1 .mu.mol per minute corresponds to 1 unit (U).
  • the molecular weight of the oxidoreductase according to the invention determined by gel permeation was 36 ⁇ 2 kDa in the native state.
  • the SDS-PAGE band of the purified protein was reduced with dithiothreitol, carboxymethylated and digested with endoproteinase Lys-C.
  • the resulting peptides were separated on a 300 ⁇ m x 150 mm capillary HPLC column (Vydac RP18, LC Packings), fractions were collected manually and tested for sequencing using MALDI MS (Voyager-DE STR (PE-Biosystems). Two suitable fractions were sequenced by automatic Edman degradation and provided the following sequences:
  • the eukaryotic microorganism Metschnikowia zobellii belongs to the family Metschnikowiaceae.
  • the genome structure of this organism has an exon-intron arrangement. Therefore, for the identification of the gene sequence encoding the enantioselective oxidoreductase, a cDNA library of the active cells of Metschnikowia zobellii was applied.
  • RNA obtained was precipitated by the addition of 1/10 vol of 5 M LiCl at -20 ° C for 4 hours.
  • RNA 1 mg was used for m-RNA enrichment by means of OligodT cellulose (mRNA RepKit, Qiagen).
  • degenerate primers adapted to Metschnikowia codon usage were derived 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6) and used in the polymerase chain reaction.
  • the plasmid cDNA library isolated from XL-10 gold cells served as template for the first PCR round. Since cDNA library was established as a plasmid library, it was also possible to use stationary primers in combination with derived, degenerate primers in the PCR reaction. Primer T3 and T7 were used, each binding to the 5 'and 3' cDNA inserts flanking sequence in the plasmid backbone.
  • Seq ID 3 Oligo MBme1-for: 5 '- CCNGCHGTDGAAGGWACWAAR - 3'
  • Seq ID 4 oligo MBme1-rev1: 5'-YTTWGTWCCTTCHACDGCMGG - 3 '
  • Seq ID 5 oligo MBme2-for: 5'-GGNCCNAAYGATGARGTNCC - 3 '
  • Seq ID 6 oligo MBme2-rev: 5'-GGNACNTCATCRTTNGGRCC - 3 '
  • Seq ID 14 oligo T3-for: 5 '- AATTAACCCTCACTAAAGGG - 3'
  • Seq ID 15 oligo T7-rev: 5'- TAATACGACTCACTATAGGG - 3 '
  • the PCR reaction was carried out in the following reaction mixture:
  • the amplification signal was amplified by nested PCR using the primers MBme1-rev and T3-for in the polymerase chain reaction, using 2 ⁇ l PCR reaction from the first reaction in a PCR buffer [10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM dNTP mix, 30 pmoles per primer MBme1 -rev and T3-for and 2.5 U AmpliTag Gold (Applied Biosystems).
  • a PCR buffer 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM dNTP mix, 30 pmoles per primer MBme1 -rev and T3-for and 2.5 U AmpliTag Gold (Applied Biosystems).
  • a specific fragment of 500 bp was identified, purified by Qiagen gel extraction kit and ligated into pCR2.1 vector (Invitrogen) for subsequent sequencing. Analysis of the resulting plasmid yielded a cDNA sequence corresponding to the N-terminus of the desired oxidoreductase (SEQ ID 7) and having the N-terminal amino acid sequence Seq ID16.
  • a polymerase chain reaction was carried out with the primers MBme2-for and T7.
  • the template used was the plasmid preparation from the XL-10 gold cDNA plasmid library.
  • the amplification reaction was carried out in the following reaction mixture at 4 different binding temperatures (53 ° C, 55 ° C, 57 ° C, 59 ° C).
  • the PCR reaction was carried out in a PCR buffer [10 mM Tris-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO 4 ; 1 mM dNTP mix; 30 pmol primer and 2.5 U Platinum Pfx DNA polymerase (Invitrogen)] with 300 ng template and the following temperature cycles:
  • the amplificate (about 1000 bp) was digested after purification on a 1% agarose gel using the endonucleases Nde I and Hind III, or with the endonucleases Bam Hl and Hind III, and into the backbone of pET21a treated with the same endonucleases Vectors (Novagen), or pQE30 vectors (Qiagen) ligated. After transformation of 2 ⁇ l of the ligation mixture into E. coli Top 10 F cells (Invitrogen), plasmid DNAs of ampicillin-resistant colonies were restricted to 1000 by restriction endonuclease Nde I and Hind III, or endonucleases Bam Hl and Hind III bp large inserts tested.
  • the expression constructs pET21-MEvl # 1 and pQE-30 -mevl # 9 were sequenced.
  • the Metschnikowia zobellii transcript encoding an oxidoreductase has an open reading frame totaling 1014 bp (SEQ ID NO: 12), corresponding to a protein of 338 amino acids. (Seq.13).
  • Competent Escherichia coli StarBL21 (De3) cells were transformed with the expression construct pET21-MEvl # 1 coding for the oxidoreductase according to the invention.
  • the strain was cultured in LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, ampicillin 50 ⁇ g / ml) and upon reaching an optical density of 0.5, measured at 500 nm, with 1 mM IPTG (isopropyl thiogalactoside ).
  • the achieved activity was 4000 U / g of biofuels.
  • Competent Escherichia coli RB791 cells were transformed with the expression construct pQE30-MEvI # 9 coding for the oxidoreductase according to the invention.
  • the strain was cultured in LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, ampicillin 50 ⁇ g / ml) and upon reaching an optical density of 0.5, measured at 500 nm, with 1 mM IPTG (isopropyl thiogalactoside ).
  • the achieved activity was 320 U / g biobutton.
  • the buffers listed in Table 3 were prepared. The concentration of the respective buffer components was 50 mM each.
  • Measurement batch (25 ° C.): 870 ⁇ l of the buffer systems listed in Table 3, in each case, dilute 20 ⁇ l of NADPH 10 mM (8.6 mg / ml of water) 10 ⁇ l of enzyme
  • the enzyme activity was measured in the temperature range from 15 ° C to 70 ° C in the standard measurement batch. As can be seen from Table 4, the enzyme has its maximum activity at 25 ° C, then the activity decreases rapidly.
  • the temperature stability was determined for the range of 15 ° C to 70 ° C.
  • the enzyme proved to be stable at temperatures below 25 ° C over several days while the enzyme activity rapidly decreases at temperatures above 25 ° C within a few hours.
  • the substrate spectrum of the oxidoreductase according to the invention was determined by measuring the enzyme activity with a series of ketones, oxo acid esters and cyclic ketones. For this purpose, the standard measurement approach according to Example 5.1 was used with different substrates The activity with 2-oxo-4-phenyl-butterklad ylester was set equal to 100% and all other substrates were compared to it.
  • nb means not determined
  • the oxidoreductase according to the invention comprises a broad spectrum of aliphatic and cyclic carbonyl groups. Compounds, in particular 2-oxo acid esters reduced enantioselectively. Short-chain secondary alcohols are not accepted. This means that the substrate-coupled coenzyme regeneration with secondary alcohols as cosubstrate can not be used here.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft eine NADPH-abhängige Oxidoreduktase aus Hefen, beispielsweise der Gattung Metschnikowia, insbesondere aus Metschnikowia zobellii, ein enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion organischer Ketoverbindungen zu den entsprechenden Hydroxyverbindungen und ein enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Gewinnung von Hydroxyverbindungen im Zwei-Phasen-System unter Verwendung der isolierten rekombinant überexprimierten Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii .

Description

Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue NADPH abhängige Oxidoreduktase aus Hefen, beispielsweise der Gattung Metschnikowia, insbesondere aus Metschnikowia zobellii, ein enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion organischer Ketoverbindungen zu den entsprechenden Hydroxyverbindungen und ein enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Gewinnung von Hydroxyverbindungen im Zwei-Phasen-System unter Verwendung der isolierten rekombinant überexprimierten Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii.
Optisch aktive Hydroxyverbindungen sind wertvolle chirale Bausteine mit breiter Anwendung für die Synthese von pharmakologisch wirksamen Verbindungen, aromatischer Substanzen, Pheromonen, Agrochemikalien oder Enzym- inhibitoren.
Die Zahl der für großtechnische Anwendungen in der Biokatalyse geeigneter und in ausreichendem Maße preiswert zur Verfügung stehender Carbonyl- reduktasen ist dabei sehr begrenzt. Bei den bisher in Form von isolierten Enzymen einsetzbaren Alkoholdehydrogenasen handelt es sich weitgehend um sekundäre Alkoholdehydrogenasen, deren Substratspektrum auf Substrate mit einer großen und einer kleinen Seitenkette in Nachbarschaft zur Car- bonylfunktion beschränkt ist, wobei die maximale Länge der kleineren der beiden Seitenketten drei C-Atome betragen darf.
Solche Enzyme sind beispielsweise
Aikohoidehydrogenase aus Pferdeleber (HLADH) (Enzyme Engineering, Vol 6,
1982, Seite 107).
Aikohoidehydrogenase aus Hefe (YADH) (Alcohoi dehydrogenases: The Enzymes, (1963) Seiten 25-83. New York: Academic Press), Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis (CPCR) (US 5,523,223 und US 5,763,236) oder Pichia capsulata ADH (DE10327454.4). Carbonylreduktase aus Rhodococcus erythropolis (RECR) (US 5,523,223) und Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem.,63 (10) (1999), Seiten 1721- 1729),
Alkohodehydrogenase aus Candida boidinii (Biochim,. Biophys. Acta 716, (1982), Seiten 298-307) oder
Aikohoidehydrogenase aus Sulfolobus solfataricus (FEMS Microbiology Letters, 170 (1999), Seiten 31-39).
R-spezifische sekundären Alkoholdehydrogenasen aus Organismen der Gattung Lactobacillus (Lactobacillus kefir (US5200335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 A1), Lactobacillus minor (DE10119274) oder Pseudomonas (US 05385833).
Des weiteren werden noch Enzyme aus den Organismen Candida magnoliae (WO 98/35025), Kluyveromyces lactis (JP-A Hei 11-187869) und Sporo- bolomyces salmonicolor (FEMS Microbiology Letters 70 (1990) 45-48) zur Ketoredukion verwendet. Bei diesen Enzymen handelte es sich um Homologe zur Untereinheit des Fettsäuresynthasekomplexes deren Anwendung bisher auf die Reduktion von 4-Chloracetoacetat beschränkt blieb.
Wenige der genannten Carbonylreduktasen haben bisher großtechnisch Anwendung gefunden. Der Hauptgrund hierfür ist neben den oft zu engen Substratspektren oder der geringen Enantioselektivität der Enzyme vor allem die Verfügbarkeit dieser Enzyme. Die meisten der genannten Enzyme konnten bisher nicht rekombinant in ausreichendem Maße zu günstigen Preisen zur Verfügung gestellt werden.
Es wurde nun gefunden, dass durch eine neue Oxidoreduktase die genannten Nachteile der Verfahren aus dem Stand der Technik behoben werden können. Bei der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase handelt es sich um eine neuartige Oxidoreduktase die keinerlei Verwandtschaft oder Homologie zu bereits bekannten Carbonylreduktasen aufweist. Die Stereoselektivität der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase wird dabei nicht nur durch die Größe der die Carbonylgruppe flankierenden Seitenketten sondern auch durch deren Hydrophobizität bestimmt. Dadurch unterscheiden sich Substratspektrum und Enantioselektivität der erfindungsgemäßen Oxido- reduktase deutlich von der bekannter Enzymklassen.
Die erfindungsgemäße Oxidoreduktase ist dadurch gekennzeichnet, dass sie in Anwesenheit von NADPH und Wasser Carbonylverbindung zu den entsprechenden chiralen Hydroxyverbindungen reduziert. Sie kann beispielsweise aus Hefen der Gattung Metschnikowia, insbesondere aus Metschnikowia zobellii gewonnen werden.
Bevorzugt ist eine Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii, die die DNA- Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 und die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 aufweist, wie im anliegenden Sequenzprotokoll beschrieben.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Oxidoreduktase, in der mehr als 70 % der Aminosäuren identisch sind mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 13 und sie eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein aufweist, bezogen auf die Umsetzung von 2-Oxo-4-phenylbuttersäureethylester zu (R)-2- Hydroxy-4-phenylbuttersäureethylester. Bevorzugt ist eine Oxidoreduktase, in der 80 % bis 99,5 %, insbesondere 90 % bis 99,5 %, insbesondere bevorzugt 99 % bis 99,5 % der Aminosäuren identisch sind mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 13. Die Messung der spezifischen Aktivität der Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 13 oder seiner wie nachfolgend definierten Derivate oder Analogons erfolgt mit dem Testsystem, das in Beispiel 1 beschrieben wird.
Geeignet sind auch Oxidoreduktasen, die 1 bis 40 Aminosäuren zusätzlich oder 1 bis 40 Aminosäuren weniger aufweisen als die Oxidoreduktase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 13 und die eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein zeigt, bezogen auf die Umsetzung von 2-Oxo- 4-phenylbuttersäureethylester zu (R)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersäureethylester. Bevorzugt sind die Oxidoreduktasen, in denen 1 bis 25 Aminosäuren, insbesondere 2 bis 20 Aminosäuren, insbesondere bevorzugt 3 bis 10 Aminosäuren mehr oder weniger in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 13 vorkommen.
Verwendbar ist auch eine Oxidoreduktase, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 13 aufweist und ein-, zwei-, drei-, vier- oder fünffach derivatisiert ist durch ein wasserlösliches Polymer und die eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein aufweist, bezogen auf die Umsetzung von 2-Oxo-4- phenylbuttersäureethylester zu (R)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersäureethylester. Ein wasserlösliches Polymer ist beispielsweise Polyethylenglykol. Die Bindung des Polyethylenglykols erfolgt bevorzugt am N-terminalen Ende des Proteins gemäß SEQ ID NO: 13 . Die Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 13 kann auch an einen Festkörper, bevorzugt aus Polyethylen, Polystyrol, Polysaccharid, Cellulose oder einem Cellulosederivat, gebunden sein.
Die Erfindung betrifft ferner Proteinfragmente der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 13 mit 5 bis 30 Aminosäuren je Fragment. Bevorzugt sind Fragmente von SEQ ID NO: 13 mit einer Kettenlänge von 6 bis 25 Aminosäuren, bevorzugt 8 bis 20 Aminosäuren, besonders bevorzugt 10 bis 18 Aminosäuren. Diese Fragmente können beispielsweise zum Auffinden der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii oder aus beliebig anderen Mikroorganismen eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Fusionsprotein, das die Oxidoreduktase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 13 oder ein Fragment davon mit 5 bis 30 Aminosäuren umfaßt, die mit einem weiteren Polypeptid am N-terminalen oder Carboxy-terminalen Ende peptidisch verbunden sind. Fusionsproteine können beispielsweise leichter von anderen Proteinen abgetrennt werden oder werden in einer größeren Menge in den Zellen exprimiert.
Die Erfindung betrifft ferner Antikörper, die spezifisch an die Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 13 binden. Die Herstellung dieser Antikörper erfolgt nach bekannten Methoden durch Immunisierung von geeigneten Säugetieren und anschließender Gewinnung der Antikörper. Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein.
Die Erfindung betrifft auch die (isolierte) Nukleinsäuresequenz, die für die Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 13 kodiert.
Die Erfindung betrifft ferner die (isolierte) Desoxyribonukleinsäuresequenz (DNA-Sequenz) der Oxidoreduktase, die die Reduktion von Carbonyl- verbindung in Anwesenheit von NADPH und Wasser zu den entsprechenden Hydroxyverbindungen katalysiert, wobei die DNA-Sequenz ausgewählt wird aus der Gruppe
a) DNA-Sequenz, welche die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 aufweist oder der jeweils komplemen- täre Strang, b) DNA-Sequenz, welche mit einer oder mehrerer der DNA-Sequenzen gemäß a) oder seiner komplementären Stränge hybridisiert, wobei die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen wie beschrieben (Sambrok and Rüssel, Molecular Cloning a laboratory Manual , Vol 1 , Chapter 1 Protocol 30-32) erfolgt, und c) DNA-Sequenz, welche auf Grund der Degeneration des genetischen Codes, ein Protein kodiert, das durch eine oder mehrere der DNA- Sequenzen gemäß a) oder b) kodiert wird.
Die Erfindung betrifft ferner eine DNA-Sequenz, in der mehr als 70 % der Nukleinsäurebasen identisch sind mit der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 oder deren komplementären Stränge und die für eine Oxidoreduktase kodiert, die eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein aufweist, bezogen auf die Umsetzung von 2-Oxo-4-phenyl-buttersäureethylester zu (R)- 2-Hydroxy-4-phenyl-buttersäureethylester. Bevorzugt sind DNA-Sequenzen, in denen 80 % bis 99,5 %, bevorzugt 90 % bis 99,5 %, besonders bevorzugt 99 % bis 99,5 %, der Nukleinsäurebasen identisch sind mit der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12. Die Erfindung betrifft ferner eine Nukleinsäuresequenz mit 10 bis 50 Nukleinsäurebasen, die eine Sequenz aufweist, die einen Teile oder mehrere Teile der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 oder deren komplementären Strängen entspricht. Bevorzugt ist eine Nukleinsäuresequenz mit 15 bis 45 Nuklein- säurebasen, insbesondere 20 bis 40 Basen, insbesondere bevorzugt 30 bis 40 Nukleinsäurebasen der genannten DNA-Sequenzen. Die genannten Nuklein- säuresequenzen sind geeignet als molekulare Proben oder als Primer für die Polymerase-Ketten-Vervielfältigungsreaktion (PCR).
Die Erfindung betrifft ferner einen Klonierungsvektor, enthaltend eine oder mehrere der obengenannten Nukleinsäure- oder DNA-Sequenzen. Die Erfindung betrifft ferner einen Expressionsvektor, der sich in einer Bakterien-, Insekten-, Pflanzen- oder Tierzelle (insbesondere Säugetierzelle) befindet und eine oder mehrere der obengenannten Nukleinsäure- oder DNA-Sequenzen enthält, die in geeigneter Weise mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden sind. Die Erfindung betrifft ferner eine Wirtszelle, die eine Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Pflanzen- oder (Säuge-)Tierzelle ist und mit einem der obengenannten Expressionsvektoren transformiert oder transfektiert wurde.
Die Identitäten der vorgenannten DNA-Sequenzen oder Aminosäuresequenz werden dadurch berechnet, dass man die Anzahl der Aminosäuren oder Nukleinsäurebasen summiert, die mit Teilsequenzen der jeweiligen Proteine oder DNA-Sequenzen identisch sind, durch die Gesamtzahl der Aminosäuren oder Nukleinsäurebasen dividiert und mit Hundert multipliziert.
Geeignete Klonierungsvektoren sind beispielsweise ppCR-Script, pCMV-Script , pBluescript (Stratagene), pDrive cloning Vector (Qiagen, Hilden, Deutschland), pS Blue, pET Blue, pET LIC-Vektoren (Novagen, Madison, USA) sowie TA- PCR Klonierungsvektoren (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland).
Geeignete Expressionsvektoren sind beispielsweise pKK223-3, pTrc99a, pUC, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM, pQE, pET, PHUB, pPLc, pKC30, pRM1/pRM9, pTrxFus,pAS1 , pGEx, pMAL oder pTrx. Geeignete Expressionskontrollsequenzen sind beispielsweise trp-lac (tac)- Promotor, trp-lac (trc) promotor, lac-Promotor, T7-Promotor oder λpL-Promotor.
Die Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii ist ein Monomer mit einem Molekulargewicht bestimmt im SDS-Gel von 36 + 2 kDa. Das Temperaturoptimum der Oxidoreduktase liegt im Bereich von 20 °C bis 25 °C und das pH- Optimum für die Reduktionsreaktion liegt im Bereich von 5,5 bis 6,5. Die Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii ist im pH-Bereich von 5,5 bis 8,5 und im Temperaturbereich von 15 °C bis zu 30 °C für 5 Stunden stabil und zeigt ferner eine gute Stabilität in organischen Lösungsmitteln.
Das Enzym ist insbesondere aus Hefen der Gattung Metschnikowia isolierbar und kann im spektrophotometrischen Test über die Abnahme von NADPH bei 340 nm in Gegenwart eines entsprechenden Substrates, beispielsweise 2-Oxo- 4-phenyl-buttersäureethylester, nachgewiesen werden.
Eine erfindungsgemäße Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii wurde kloniert und konnte in Escherichia coli (E. coli) mit Aktivitäten von 1000 bis 10 000 U/g E. coli Feuchtgewicht überexprimiert werden. Das Enzym ist somit preiswert und in großen Mengen verfügbar.
Sequenzvergleiche in Datenbanken ergaben, dass die Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii keine direkte Homologie zu bekannten Enzymen aufweist, eine entfernte Verwandschaft konnte zur Gruppe der Hydroxysteroid- dehydrogenasen festgestellt werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung der Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii. Dazu wird die DNA, die für die Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii kodiert, beispielsweise in einem geeigneten pro- karyotischen oder eukaryotischen Mikroorganismus exprimiert. Bevorzugt wird die Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii in einen E. coli Stamm transfor- miert und exprimiert, insbesondere in E. coli BL21star (DE3) Zellen (Invitrogen, Katalognummer C6010-03).
Die Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii lässt sich beispielsweise so gewinnen, dass die oben genannten rekombinanten E. coli Zellen kultiviert werden, die Expression der Oxidoreduktase induziert wird und anschließend nach etwa 10 bis 18 Stunden die Zellen durch Ultraschallbehandlung oder durch Naßvermahlung mit Glasperlen in einer Kugelmühle (Retsch, GmbH, Haan Deutschland 10 min, 24 Hz) aufgeschlossen werden. Der erhaltene Zellextrakt kann entweder direkt verwendet oder weiter gereinigt werden. Dazu wird der Zellextrakt beispielsweise zentrifugiert und der erhaltene Überstand wird einer hydrophoben Interaktionschromatographie unterworfen, beispielsweise an Octylseparose Fast Flow® (Pharmacia).
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen zu den entsprechenden chiralen Hydroxyverbindungen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase, NADPH und Wasser zur entsprechenden chiralen Hydroxy-verbindung reduziert, und b) die gebildete chirale Hydroxyverbindung isoliert.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist eine hohe Standzeit auf, eine enantiomeren Reinheit von mehr als 90 % der hergestellten chiralen Hydroxyverbindungen und eine hohe Ausbeute bezogen auf die eingesetzte Menge der Carbonylverbindung.
Unter dem Begriff „NADPH" wird reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid- phosphat verstanden. Unter dem Begriff „NADP" wird Nicotinamid-adenin- dinucleotid-phosphat verstanden. Unter dem Begriff „Carbonylverbindung" werden beispielsweise Verbindungen der Formel I R1-C(0)-R2 (I) verstanden.
R1 steht beispielsweise für 1 ) (Cι-C20)Alkyl, das gerad kettig oder verzweigt ist, 2) (C2-C20)Alkenyl, das geradkettig oder verzweigt ist und, je nach Kettenlänge, ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen enthält, 3) (C2-C2o)Alkinyl, das geradkettig oder verzweigt ist und, je nach Kettenlänge, ein, zwei, drei oder vier Dreifachbindungen enthält, 4) (C6-C14)Aryl, 5) (C1-C8)Alkyl-(C6-C14)Aryl, 6) einen (C5-Cι4)Heterocyclus, der unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist, bevorzugt durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro, oder 7) (C3-C7)Cycloalkyl, wobei die oben unter 1) bis 7) genannten Reste unsubstituiert sind oder ein-, zwei- oder dreifach substituiert sind unabhängig voneinander durch a) -OH, b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, c) -N02 oder d) -NH2.
R2 steht beispielsweise für 1) (Ci-CßJAlkyl, das geradkettig oder verzweigt ist, 2) (C2-C6)Alkenyl, das geradkettig oder verzweigt ist und, je nach Kettenlänge, ein, zwei oder drei Doppelbindungen enthält, 3) (C2-C6)Alkinyl, das geradkettig oder verzweigt ist und, je nach Kettenlänge, ein oder zwei Dreifachbindungen enthält, oder 4) (C0-C10)Alkyl-C(O)-O-(C1-C6)Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro, wobei die oben unter 1) bis 4) genannten Reste unsubstituiert sind oder ein-, zwei- oder dreifach substituiert sind unabhängig voneinander durch a) -OH, b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, c) -N02 oder d) -NH2.
Unter dem Begriff chirale Hydroxyverbindung werden beispielsweise Verbindungen der Formel II R1-C(OH)-R2 (II)
verstanden, wobei die -OH Gruppe in Abhängigkeit der Reste R1 und R2 in R- oder in S-Konfiguration zum Kohlenstoffatom steht an das sie gebunden ist und R1 und R2 dieselbe Bedeutung wie in Formel I haben.
Unter dem Begriff Aryl werden aromatische Kohlenstoffreste verstanden mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen im Ring. (C6-C14)Arylreste sind beispielsweise Phenyl, Naphthyl, zum Beispiel 1-Naphthyl, 2-Naphthyl, Biphenylyl, zum Beispiel Biphenyl-2-yl, Biphenyl-3-yl und Biphenyl-4-yl, Anthracenyl oder Fluorenyl. Biphenylylreste, Naphthylreste und insbesondere Phenylreste sind bevorzugte Arylreste. Unter dem Begriff "Halogen" wird ein Element aus der Reihe Fluor, Chlor, Brom oder Jod verstanden. Unter dem Begriff "(Cι-C20)Alkyl wird ein Kohlenwasserstoffrest verstanden, dessen Kohlenstoffkette geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele sind Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl oder Decyl. Unter "C0-Alkyl" soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine kovalente Bindung verstanden werden. Unter dem Begriff ,,(C3-C7)Cycloalkyl" werden cyclische Kohlenwasserstoffreste verstanden wie Cyclopropyl, Cylobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl.
Der Begriff "(Cs-C-^Heterocyclus" steht für einen monocyclischen oder bicycli- schen, 5-gliedrigen bis 14-gliedrigen heterocyclischen Ring, der teilweise oder vollständig gesättigt ist. Beispiele für Heteroatome sind N, O und S. Beispiele für die Begriffe (C5-Cι4)Heterocyclus sind Reste, die sich von Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Pyrazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, Tetrazol, 1 ,2,3,5-Oxathiadiazol-2-Oxide, Triazolone, Oxadiazolone, Isoxazolone, Oxa- diazolidindione, Triazole, die durch F, -CN, -CF3 oder -CO-0-(Cι-C4)Alkyl substituert sein können, 3-Hydroxy-pyrrolidin-2,4-dione, 5-Oxo-1 ,2,4-thia- diazole, Pyridin, Pyrazin, Pyrimidin, Indol, Isoindol, Indazol, Phthalazin, Chinolin, Isochinolin, Chinoxalin, Chinazolin, Cinnolin, Carbolin und benz- anellierte, cyclopenta-, cyclohexa- oder cyclohepta-anellierte Derivate dieser Heterocyclen ableiten. Insbesondere bevorzugt sind die Reste 2- oder 3- Pyrrolyl, Phenylpyrrolyl wie 4- oder 5-Phenyl-2-pyrrolyl, 2-Furyl, 2-Thienyl, 4- Imidazolyl, Methyl-imidazolyl, zum Beispiel 1-Methyl-2-, -4- oder -5-imidazolyl, 1 ,3-Thiazol-2-yl, 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, 2-, 3- oder 4-Pyridyl-N-oxid, 2- Pyrazinyl, 2-, 4- oder 5-Pyrimidinyl, 2-, 3- oder 5-lndolyl, substituiertes 2-lndolyl, zum Beispiel 1 -Methyl-, 5-Methyl-, 5-Methoxy-, 5-Benzyloxy-, 5-Chlor- oder 4,5- Dimethyl-2-indolyl, 1-Benzyl-2- oder -3-indolyl, 4,5,6,7-Tetrahydro-2-indolyl, Cyclohepta[b]pyrrol-5-yl, 2-, 3- oder 4-Chinolyl, 1-, 3- oder 4-lsochinolyl, 1-Oxo- 1 ,2-dihydro-3-isochinolyl, 2-Chinoxalinyl, 2-Benzofuranyl, 2-Benzo-thienyl, 2- Benzoxazolyl oder Benzothiazolyl oder Dihydropyridinyl, Pyrrolidinyl, zum Beispiel 2- oder 3-(N-Methyl-pyrrolidinyl), Piperazinyl, Morpholinyl, Thiomorpho- linyl, Tetrahydrothienyl oder Benzodioxolanyl.
Bevorzugte Verbindungen der Formel l sind beispielsweise 2-Oxo-4-phenyl- buttersäureethylester, Ethylphenylglyoxylat, 1-Phenyl-2-propanon, 2,3-Dichlor- acetophenon, 2-Octanon, 8-Chlor-6-oxo-octansäureethylester, 3-Oxo-octan-1 ,8- disäuredimethylester, 2-Oxo-cyclohexancarbonsäureethylester, 2-Methyl-cyclo- hexanon oder 3-Methyl-cyclohexanon . Die entsprechend gebildeten S-Alkohole sind beispielsweise (R)-2-Hydroxy-4- phenylbuttersäureethylester, Ethyl-(R)-mandelat, (S)-2-Octanol oder (R)-Ethyl- 8-chlor-6-hydroxy-octansäure, (S)-1-Phenyl-2-propanol oder (R)-2-Chlor-1-(3- chlorphenyl)-ethan-1 -ol.
Geeignete Oxidoreduktasen stammen beispielsweise aus Metschnikowia zobellii. Die Oxidoreduktase kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder vollständig gereinigt oder teilweise gereinigt eingesetzt werden oder mit Zellen, enthaltend die erfindungsgemäße Oxidoreduktase, durchgeführt wer- den. Die eingesetzten Zellen können dabei nativ, permeabilisiert oder lysiert vorliegen. Bevorzugt wird die Monierte Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 13 eingesetzt.
Die Volumenaktivität der eingesetzten Oxidoreduktase beträgt von 100 Units/ml (U/ml) bis 5000 U/ml, bevorzugt etwa 500 U/ml.
Je kg umzusetzender Verbindung der Formel I werden 5000 bis 2 000 000 U Oxidoreduktase eingesetzt, bevorzugt etwa 10 000 bis 500 000 U. Der Enzymeinheit 1 U entspricht dabei der Enzymmenge die benötigt wird um 1 μmol der Verbindung der Formel I je Minute (min) umzusetzen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen zu den entsprechenden chiralen Hydroxyverbindungen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit von Oxidoreduktase, NADPH und Wasser zum entsprechenden chiralen Hydroxyverbindung reduziert, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NADP mit einer Dehydrogenase und einem Cosubstrat gleichzeitig zu NADPH reduziert, und c) die gebildete chirale Hydroxyverbindung isoliert.
Geeignete Dehydrogenasen sind beispielsweise sekundäre Alkohol-Dehydro- genasen aus Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir oder Lactobacillus brevis, wobei diese Enzyme als Coenzym NADPH benötigen (DE 19 610 984, EP 0 456 107, WO 97/32012).
Geeignete Cosubstrate für die eingesetzte Alkohol-Dehydrogenase sind Alkohole wie 2-Propanol (Isopropanol), 2-Butanol, 2-Pentanol oder 2-Octanol.
Ferner kann die NADP-Reduktion auch mit den bekannten zur Regenerierung von NADPH verwendeten Enzymen durchgeführt werden, beispielsweise mit Glucose-Dehydrogenase oder NADPH abhängiger Formiat-Dehydrogenase (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase).
Das geeignte Cosubstrat für das erfindungsgemäße Verfahren ist bei Einsatz der Glucose-Dehydrogenase Glucose. Geeignete Cosubstrate der Formiat- Dehydrogenase sind beispielsweise Salze der Ameisensäure wie Ammonium- formiat, Natriumformiat oder Calciumformiat.
Bevorzugt werden die Alkoholdehydrogenasen aus Lactobacillus minor (DE 101 19274) oder Thermoanerobium brockii eingesetzt.
Die Alkohol-Dehydrogenase kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder vollständig gereinigt oder teilweise gereinigt eingesetzt werden oder es können ganze Zellen, die die Alkohol-Dehydrogenase enthalten, verwendet werden. Die eingesetzten Zellen können dabei nativ, permeabilisiert oder lysiert vorliegen.
Je kg umzusetzender Verbindung der Formel I werden 10 000 U bis 2 000 000 U Alkohol-Dehydrogenase eingesetzt, bevorzugt etwa 20 000 U bis 500 000 U. Der Enzymeinheit 1 U entspricht dabei der Enzymmenge die benötigt wird um 1 μmol des Cosubstrates (z.B. 2-Propanol) je Minute (min) umzusetzen.
Dem Wasser wird bevorzugt ein Puffer zugesetzt, beispielsweise Kaliumphosphat-, Tris/HCI- oder Triethanolamin-Puffer mit einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise ein pH-Wert von 6 bis 9. Die Pufferkonzentration beträgt von 10 mM bis 200 mM, bevorzugt von 50 mM bis 150 mM, insbesondere 100 mM.
Der Puffer kann zusätzlich noch Ionen zur Stabilisierung oder Aktivierung beider Enzyme enthalten, beispielsweise Magnesiumionen zur Stabilisierung der Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobaillus minor.
Weiterhin kann der Puffer Detergenzien enthalten, beispielsweise ©Triton X100, Triton X45, Triton X114, Triton X450 zur Reaktionsvermittlung.
Die Temperatur beträgt bei den erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise von etwa 10 °C bis 30 °C, bevorzugt von 20°C bis 25 °C.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen zu den entsprechenden chiralen Hydroxyverbindungen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Oxido- reduktase, NADPH und Wasser zur entsprechenden chiralen Hydroxyverbindung reduziert, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NADP mit einer Dehydrogenase und einem Cosubstrat gleichzeitig zu NADPH reduziert, c) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel durchführt und d) die gebildete chirale Hydroxyverbindung isoliert.
Die bevorzugten organischen Lösungsmittel sind beispielsweise tertiär- Butylmethylether, Diisopropylether, Heptan, Hexan oder Cyclohexan oder deren Gemische unterschiedlicher Zusammensetzung.
Der Reaktionsansatz besteht beim Einsatz zusätzlicher Lösungsmittel allgemein aus einer wäßrigen Phase und einer organischen Phase. Die organische Phase wird durch ein geeignetes Lösungsmittel in dem das Substrat gelöst vorliegt oder wird durch das wasserunlösliche Substrat selbst gebildet. Die organische Phase hat dabei allgemein einen Anteil von etwa 5 bis 80 %, bevorzugt 10 bis 40 %, bezogen auf das gesamte Reaktionsvolumen.
Das Wasser bildet im Zwei-Phasen-System die eine flüssige Phase und das organische Lösungsmittel bildet die zweite flüssige Phase. Gegebenenfalls kann auch noch eine feste oder weitere flüssige Phase vorliegen, die beispielsweise durch nicht vollständig gelöste Oxidoreduktase und/oder Alkohol-Dehydrogenase oder durch die Verbindung der Formel I entsteht. Bevorzugt sind jedoch zwei flüssige Phasen ohne feste Phase. Die zwei flüssigen Phasen werden bevorzugt mechanisch gemischt, so dass große Oberflächen zwischen den beiden flüssigen Phasen erzeugt werden.
Die Konzentration des Cofaktors NADPH bezogen auf die wässrige Phase beträgt von 0,001 mM bis 1 mM, insbesondere von 0,01 mM bis 0,1 mM.
Bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren noch ein Stabilisator der Alkohol-Dehydrogenase eingesetzt. Geeignete Stabilisatoren sind beispiels- weise Glycerin, Sorbit oder Dimethylsulfoxid (DMSO).
Die Verbindungen der Formel I werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einer Menge von 2 % bis 30 % (w/v) bezogen auf das Gesamtvolumen eingesetzt, bevorzugt von 5% bis 20 % (w/v), insbesondere 8 % bis 15 % (w/v).
Die Menge des Cosubstrats für die Regenerierung von NADP zu NADPH wie Isopropanol beträgt von etwa 2 % bis 30 % bezogen auf das Gesamtvolumen, bevorzugt von 5 % bis 20 % , insbesondere von 8 % bis 15 % .
Das erfindungsgemäße Verfahren wird beispielsweise in einem geschlossen Reaktionsgefäß aus Glas oder Metall durchgeführt. Dazu werden die Komponenten einzeln in das Reaktionsgefäß überführt und Rühren unter einer Atmosphäre von beispielsweise Stickstoff oder Luft gerührt. Je nach Substrat und eingesetzter Verbindung der Formel I beträgt die Reaktionszeit von 1 Stunde bis 96 Stunden, insbesondere von 2 Stunden bis 24 Stunden.
Anschließend wird das Reaktionsgemisch aufgearbeitet. Dazu wird die wässrige Phase abgetrennt, die organische Phase wird gefiltert. Die wässrige Phase kann gegebenenfalls noch einmal extrahiert werden und wie die organische Phase weiter aufgearbeitet werden. Danach wird gegebenenfalls das Lösungsmittel aus der klaren organischen Phase verdampft. Man erhält so beispielsweise das Produkt (R)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersäureethylester mit einer Enantiomerenreinheit von mehr als 90 %. Die Gesamtausbeute der Prozesses beträgt nach Destillation des Produktes etwa 50 % bis 95 %, bezogen auf die Menge Ausgangsmaterials.
Die Erfindung soll mit folgenden Beispielen erläutert werden:
Beispiel 1
Screening von Hefen nach Carbonylreduktasen zur Darstellung von (R)-2-
Hydroxy-4-phenylbuttersäureethylester
Zum Screening wurden eine Reihe verschiedene Hefestämme in folgendem Medium kultiviert: Die Angaben in der Klammer beziehen sich jeweils auf g pro Liter Wasser: Hefeextrakt (3), Malzextrakt (3), Peptone (5) und Glucose (10).
Das Medium wurde bei 121 °C sterilisiert und die Hefen wurden ohne weitere pH-Regulierung bei 25 °C und auf einem Schüttler bei 160 Umdrehungen pro Minute (rpm) kultiviert.
Anschließend wurden 125 mg Zellen mit 800 μl Aufschlusspuffer (100 mM Triethanolamin (TEA), pH = 7,0) resuspendiert, mit 1 g Glasperlen versetzt und 10 Minuten (min) bei 4 °C und 24 Hz in der Kugelmühle aufgeschlossen (Retsch). Der nach 2 min Zentrifugation bei 12000 rpm erhaltene Überstand (Lysat) wurde im folgenden Aktivitätsscreening und zur Bestimmung des Enantiomerenüberschusses (ee-Wert) eingesetzt. Als Substrat wurde 2-Oxo-4- phenyl-buttersäureethylester eingesetzt.
Ansatz für das Aktivitätsscreening: 860 μl 0,1 M TEA pH = 7,0 20 μl NADPH oder NADH (10 mM) 20 μl Lysat
10O μl 2-Oxo-4-phenyl-buttersäureethylester (10 mM)
Die Reaktion wurde 1 min bei 340 nm verfolgt.
Ansatz für die ee-Wert-Bestimmung: 20 μl Lysat
10O μl NADPH (50 mM) 2 μl 2-Oxo-4-phenyl-buttersäureethylester
Die Ansätze zur ee-Bestimmung wurden nach 24 Stunden (h) mit Chloroform extrahiert und mittels Gaschromatographie (GC) wurde der Enantiomeren- überschuss bestimmt.
Der Enantiomerenüberschuss wurde wie folgt berechnet: ee(%) = ((R-Alkohol -S-Alkohol)/(R-Alkohoi+ S-Alkohol)) x 100.
Tabelle 1
Figure imgf000019_0001
DSMZ steht für Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig Definition der Enzymeinheiten: 1 U entspricht der Enzymmenge die benötigt wird um 1 μmol Substrat pro min umzusetzen.
Beispiel 2 Isolierung einer NADPH-abhängigen Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii
Zur Isolierung der NADPH abhängigen Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii wurde der Mikrorganismus wie unter Beispiel 1 beschrieben kultiviert. Nach Erreichen der stationären Phase wurden die Zellen geerntet und durch Zentrifugation vom Medium getrennt. Die Enzymfreisetzung erfolgte durch Nassvermahlung mittels Glasperlen, kann aber auch durch andere Aufschlussmethoden erreicht werden. Dazu wurden 66 g Metschnikowia zobellii mit 264 ml Aufschlusspuffer (100 mM Triethanolamin, pH =7,0) suspendiert und mittels einer French press homogenisiert.
Der nach Zentrifugation (7000 rpm) erhaltene Rohextrakt wurde dann mittels FPLC (fast protein liquid chromatography) weiter aufgereinigt.
Die erfindungsgemäße Oxidoreduktase konnte durch Kombination von hydrophober Interaktionschromatographie an Octylsepharose Fast Flow, Butylsepharose HiTrap (Pharmacia) und lonenaustauschchromatographie an Uno Q (Biorad, München, Deutschland) in drei Schritten aufgereinigt werden.
Dazu wurde das nach Zentrifugation erhaltene Lysat direkt auf eine mit 100 mM Triethanolaminpuffer pH = 7,0 1 M (NH4)2S0 äquilibrierte Octylsepharose FF- Säule aufgetragen und mit fallendem linearen Salzgradienten eluiert. Die Oxidoreduktase wurde dabei bei 0,2 bis 0,3 M (NH )2S04 eluiert. Die oxidoreduktase-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mittels Ultrafiltration (Ausschlussgrenze 10 kDa) auf ein geeignetes Volumen eingeengt.
Anschließend wurde die eingeengten Fraktionen der Oxidoreduktase mittels Uno Q weiter aufgereinigt. Dazu wurde die Oxidoreduktase direkt auf eine mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH = 7,0 äquilibrierte UnoQ-Säule (Biorad) aufgetragen und mit steigendem linearen Salzgradienten eluiert, wobei die Oxidoreduktase ohne Bindung bei 0 M NaCI eluierte, während ein Großteil der Verunreinigungen gebunden wurde und bei höheren Salzkonzentrationen eluiert werden konnte.
Der dritte Reinigungsschritt wurde an einer Butylsepharose HiTrap Säule (Pharmacia) durchgeführt, wobei dieselben Puffer wie beim ersten Reinigungsschritt eingesetzt wurden und die Oxidoreduktase bei einer Konzentration von 0,6 bis 0,5M (NH4)2S0 eluierte. Danach wurde das Molekulargewicht der erhaltenen aufgereinigten Oxidoreduktase mit Hilfe von Gelpermeation (Superdex 200 HR; Pharmacia, 10O mM Triethanolamin, pH = 7, 0,15 M NaCI ) bestimmt. Als Molekulargewichtsstandards wurden Catalase (232 kDa), Aldolase (158 kDa), Albumin (69,8kDa) und Ovalbumin (49,4 kDa) verwendet.
Die folgende Tabelle 2 fasst die erhaltenen Ergebnisse zusammen:
Tabelle 2:
Figure imgf000021_0001
Die Enzymaktivität der Oxidoreduktase wurde im Testsystem gemäß Beispiel 1 , (Ansatz Aktivitätsscreening, Messung mit NADPH) bestimmt und die Bestimmung der Proteinmenge erfolgte gemäß Lowry et al. Journal of Biological Chemistry 193 (1951) 265-275 oder Peterson et al., Analytical Biochemistry, 100 (1979) 201-220). Der Quotient von Enzymaktivität zu Proteinmenge ergibt die spezifische Aktivität, wobei der Umsatz von 1 μmol pro min 1 Unit (U) entspricht.
Das mittels Gelpermation bestimmte Molekulargewicht der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase betrug im nativen Zustand 36 ± 2 kDa. Beispiel 3
Bestimmung zweier interner Peptide nach In-Gelverdau
Die SDS-PAGE- Bande des gereinigten Proteins wurde mit Dithiothreitol reduziert, carboxymethyliert und mit Endoproteinase Lys-C verdaut. Die erhaltenen Peptide wurden über eine 300 μm x 150 mm Kapillar-HPLC-Säule (Vydac RP18, LC Packings getrennt. Fraktionen wurden manuell gesammelt und mittels MALDI MS (Voyager-DE STR (PE-Biosystems) auf für die Sequenzierung geeignete Peptide geprüft. Zwei geeignete Fraktionen wurden mittels automatischem Edman-Abbau sequenziert und lieferte folgende Sequenzen:
SEQ ID 1 :
ELLLPAVEGTK
SEQ ID 2:
LGPNDEVPSQ(SHW)(GSC)(G)FVDV
Beispiel 4
Klonierung der Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii
Der eukaryotische Mikrorganismus Metschnikowia zobellii gehört zu der Familie Metschnikowiaceae. Die Genomstruktur dieses Organismus weist eine Exon- Intron Anordnung auf. Daher wurde für die Identifizierung der Gensequenz, die für die enantioselektive Oxidoreduktase kodiert, eine cDNA Bibliothek aus den aktiven Zellen der Metschnikowia zobellii angelegt.
4.1 Präparation der gesamten RNA aus den Zellen von Metschnikowia zobellii
600 mg frische Zellen von Metschnikowia zobellii wurden in 2,5 ml eiskalten LETS Puffer (10 mM Tris-HCI, pH = 7,4, 10 mM EDTA, 100 mM LiCI, 0,2 % SDS) resuspendiert. Zu der Zellsuspension wurden 5 ml (etwa 20 g) in Salpetersäure gewaschener und mit 3 ml Phenol (pH 7.0) equilibrierte Glasperlen zugegeben. Der gesamte Ansatz wurde dann abwechselnd jeweils 30 Sekunden (sec) geschüttelt (Vortex Genie 2, Scientific Industries Inc., New York, USA) und 30 sec auf Eis gekühlt und insgesamt 10 min behandelt. Anschließend wurden weitere 5 ml eiskalter LETS Puffer dazugegeben. Diese Zellsuspension wurde für 5 min bei 11000 g bei 4 °C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde abgenommen und mit dem gleichen Volumen an Phenol: Chloroform: 3-Methyl-1-butanol (24:24:1) zweimal extrahiert. Anschließend erfolgte eine Extraktion mit Chloroform. Nach der letzten Extraktion wurde die gesamte erhaltene RNA durch die Zugabe von 1/10 Vol von 5 M LiCI bei -20 °C für 4 Stunden präzipitiert.
1 mg der oben isolierten RNA wurde für die m-RNA Anreicherung mittels Oligo- dT Cellulose (mRNA PräpKit, Qiagen) eingesetzt.
4.2 Herstellung einer cDNA Bibliothek ausgehend von der mRNA aus Metschnikowia zobellii
Nach der anschließenden Präzipitation wurden 5 μg mRNA für die cDNA Synthese (pBluescript IIXR cDNA Library Construction kit, Stratagene) verwendet. Die nach den Angaben des Herstellers konstruierte Bibliothek wurde in XL-10 Gold E. coli transformiert und mit einem Titer von 4 x 106 colony forming units (cfu) nach der blau-weiß Selektion etabliert.
4.3 Identifizierung der für eine NADPH-abhängige Oxidoreduktase kodierenden cDNA
4.3.1 Identifizierung des N-Terminus.
Ausgehend von den Peptidsequenzen Seq ID 1 und Seq ID 2 wurden an Metschnikowia Codon Nutzung angepasste degenerierte Primer abgeleitet (Seq. 3; Seq. 4; Seq. 5; Seq. 6) und in die Polymerase-Ketten Reaktion eingesetzt. Dabei diente aus XL-10 Gold Zellen isolierte Plasmid cDNA Bibliothek als Matrize für die erste PCR Runde. Da cDNA Bibliothek als eine Plasmid Bibliothek etabliert wurde, war es möglich auch stationären Primer in Kombination mit abgeleiteten, degenerierten Primern in die PCR Reaktion einzusetzen. Dabei wurden Primer T3 und T7 verwendet, die jeweils an die 5'- bzw. 3'- cDNA-lnserts flankierende Sequenz im Plasmid Rückgrad binden.
Seq ID 3 = Oligo MBme1-for: 5 '- CCNGCHGTDGAAGGWACWAAR - 3'
Seq ID 4 = Oligo MBme1-rev1 : 5'- YTTWGTWCCTTCHACDGCMGG - 3'
Seq ID 5 = Oligo MBme2-for: 5'- GGNCCNAAYGATGARGTNCC - 3'
Seq lD 6 = Oligo MBme2-rev: 5' - GGNACNTCATCRTTNGGRCC - 3'
Seq ID 14 = Oligo T3-for: 5' - AATTAACCCTCACTAAAGGG - 3'
Seq ID 15 = Oligo T7-rev: 5'- TAATACGACTCACTATAGGG - 3'
Die PCR-Reaktion wurde in folgendem Reaktionsgemisch durchgeführt:
10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 50 mM KCI, 2 mM MgCI2, 1mM dNTP Mix, 30 pMol je
Primer MBme2-rev und T3-for und 2.5 U AmpliTag Gold (Applied Biosystems)
Nach einer Aktivierung der AmpliTag Gold Polymerase (5 min, 95 CC) und folgenden 25 Zyklen PCR (95° C, 45 sec; 55 °C, 45 sec; 70 ° C, 45 sec) wurde die Reaktion auf 4° C abgekühlt und teils auf ein 1 % Agarose Gel zur Analyse aufgetragen.
In einer darauffolgenden PCR Reaktion wurde das Amplifizierungssignal durch „nested" PCR verstärkt. Dabei wurden in die Polymerase-Ketten-Reaktion die Primer MBme1-rev und T3-for eingesetzt. Als Matrize dienten 2 μl PCR Reaktion aus der ersten Reaktion. Die Reaktion wurde in einem PCR Puffer [10 mM Tris-HCI (pH 8.3), 50 mM KCI, 2 mM MgCI2, 1 mM dNTP Mix, 30 pMol je Primer MBme1 -rev und T3-for und 2,5 U AmpliTag Gold (Applied Biosystems) durchgeführt.
Ein spezifisches Fragment von 500 bp wurde identifiziert, mittels Qiagen Gel Extraktionskit aufgereinigt und in pCR2.1 Vektor (Invitrogen) zwecks nachfolgender Sequenzierung ligiert. Die Analyse des somit entstandenen Plasmids lieferte eine cDNA Sequenz, die dem N-Terminus der gesuchten Oxidoreduktase entsprach (Seq. ID 7) und die N-terminale Aminosäuresequenz Seq ID 16 aufwies.
4.3.1 Identifizierung des C-Terminus.
Für die Identifizierung des C-Terminus des gesuchten Oxidoreduktase-Gens wurde eine Polymerase-Ketten-Reaktion mit den Primern MBme2-for und T7 durchgeführt. Als Matrize diente die Plasmid Präparation aus der XL-10 Gold cDNA Plasmid Bibliothek. Die Amplifizierungsreaktion wurde in folgendem Reaktionsgemisch bei 4 verschiedenen Bindungstemperaturen (53 °C; 55 °C; 57 °C; 59 °C) durchgeführt.
Reaktionsgemisch:
10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 50 mM KCI, 2 mM MgCI2, 1mM dNTP Mix, 30 pMol je
Primer MBme2-for und T7-rev und 2.5 U AmpliTag Gold (Applied Biosystems)
Nach einer Aktivierung der AmpliTag Gold Polymerase (5 min, 95 °C) und folgenden 25 Zyklen PCR (95° C, 45 sec; 55 °C, 45 sec; 70 ° C, 45 sec) wurde die Reaktion auf 4 °C abgekühlt und teils auf ein 1 % Agarose Gel zur Analyse aufgetragen.
Eine spezifische Bande einer Größe von 500 Basenpaaren (bp) wurde in allen Ansätzen der Gradienten PCR identifiziert. Nach einer Aufreinigung aus dem Gel mittels Qiagen Gel Extraktionskit wurde das identifizierte PCR Fragment für eine nachfolgende Sequenzierung in den Vektor pCR2.1 (Invitragen) ligiert. Die Analyse der Nukleotidfolge dieses Fragmentes lieferte die Sequenz, die dem C- Terminus der gesuchten Oxidoreduktase entsprach (Seq. ID 8) und die C- terminale Aminosäuresequenz Seq ID 17 aufwies. 4.4 Herstellung des Expressionskonstruktes für die rekombinante Produktion der Oxidoreduktase von Metschnikowia zobellii
Basierend auf Sequenzen No: 7 und No: 8 wurden spezifische Primer für eine Klonierung des Vollänge-Gens in ein passendes Expressionssystem kon- struiert. Dabei wurden 5'-Primer mit einer Erkennungssequenz für Nde I und 3'- Primer mit einer Erkennungssequenz für Hind III für die Klonierung in den pET21 a Expressionsvektor modifiziert (Seq. 9, Seq. 10). Für die Klonierung in Vektoren der pQE Serie wurde der 5' Primer mit einer Erkennungssequenz für die Bam Hl Restriktions-endonuclease versehen (Seq. 11).
Die im Plasmid pBluescript (Stratagene) etablierte cDNA Bibliothek von Metschnikowia zobellii diente als Matrize für die Polymerase Ketten-Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde in einem PCR-Puffer [10 mM Tris-HCI, (pH 8,0); 50 mM KCI; 1 0 mM MgS04; 1 mM dNTP Mix; je 30 pMol Primer und 2.5 U Platinum Pfx DNA-Polymerase (Invitrogen)] mit 300 ng Template und folgenden Temperatur- Zyklen durchgeführt:
Zyklus 1 : 94 ° C, 2 min
Zyklus 2 x 30: 94 ° C, 15 sec 58 ° C, 30 sec 68 ° C, 75 sec Zyklus 3: 68 ° C, 7 min 4 ° C, oo
Das Amplifikat (etwa 1000 bp) wurde nach der Reinigung über ein 1 % Agarose Gel mit Hilfe der Endonukleasen Nde I und Hind III, oder mit den Endo- nucleasen Bam Hl und Hind III verdaut, und in das mit gleichen Endonukleasen behandelten Rückrad des pET21a Vectors (Novagen), oder pQE30 Vectors (Qiagen) ligiert. Nach der Transformation von 2 μl des Ligationsansatzes in E. coli Top 10 F Zellen (Invitrogen) wurden Plasmid-DNA's Ampicillin-resistenter Kolonien mittels einer Restriktionsanalyse mit Endonukleasen Nde I und Hind III, oder Endonucleasen Bam Hl und Hind III auf das Vorhandensein eines 1000 bp großen Inserts getestet. Der Expressionskonstrukt pET21-MEvl#1 und pQE-30 -Mevl #9 wurden sequenziert. Das für eine Oxidoreduktase kodierende Transkript aus Metschnikowia zobellii besitzt einen offenen Leserrahmen von insgesamt 1014 bp (Seq. 12) was einem Protein von 338 Aminosäuren entspricht. (Seq. 13).
4.5 Produktion der rekombinanten Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii in Escherichia coli
4.5.1 BL 21 (De3) Zellen
Kompetente Escherichia coli StarBL21 (De3) Zellen (Invitrogen) wurden mit dem für die erfindungsgemäße Oxidoreduktase kodierendem Expressionskonstrukt pET21-MEvl#1 transformiert.
Der Stamm wurde in LB Medium kultiviert (1% Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCI, Ampicillin 50 μg/ml) und bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,5, gemessen bei 500 nm, mit 1 mM IPTG (Isopropylthiogalaktosid) induziert. Die erreichte Aktivität betrug 4000 U / g Biofeuchtgewicht.
4.5.2 E.coli RB791
Kompetente Escherichia coli RB791 Zellen wurden mit dem für die erfindüngs- gemäße Oxidoreduktase kodierendem Expressionskonstrukt pQE30-MEvl#9 transformiert.
Der Stamm wurde in LB Medium kultiviert (1% Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCI, Ampicillin 50 μg/ml) und bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,5, gemessen bei 500 nm, mit 1 mM IPTG (Isopropylthiogalaktosid) induziert. Die erreichte Aktivität betrug 320 U / g Biofeuchtgewicht.
Beispiel 5 Charakterisierung der rekombinanten Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii
5.1 pH-Optimum
Es wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Puffer hergestellt. Die Konzentration der jeweiligen Pufferkomponenten betrug jeweils 50 mM.
Tabelle 3
Figure imgf000028_0001
Messansatz (25 °C): 870 μl der jeweils in Tabelle 3 genannten Puffersysteme 20 μl NADPH 10 mM (8,6 mg/ml Wasser) 10 μl Enzym verdünnt
Es wurde etwa 2 bis 3 min inkubiert, danach erfolgte die Zugabe von 100 μl Substratlösung (100mM 2-Oxo-4-phenyl-buttersäureethylester). Zur Bestimmung des pH-Optimums wurde die enzymatische Reaktion in dem jeweiligen in Tabelle 3 aufgeführten Puffer bestimmt. Zur Bestimmung des pH- Optimums für die Reduktion wurde als Cofaktor NADPH und als Substrat 2- Oxo-4-phenylbuttersäureethylester eingesetzt. Dabei konnte für das erfindungsgemäße Enzym ein pH-Optimum von 5,5 bis 6,5 für die Reduktionsreaktion ermittelt werden.
5.2.1 Temperatur-Optimum Zur Bestimmung der optimalen Testtemperatur wurde die Enzymaktivität im Temperaturbereich von 15 °C bis 70 °C im Standardmessansatz gemessen. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich hat das Enzym seine maximale Aktivität bei 25 °C, anschließend sinkt die Aktivität rapide ab.
Tabelle 4
Figure imgf000029_0001
5.3 Temperatur-Stabilität
In analoger Weise wie unter Beispiel 5.2 beschrieben wurde die Temperatur- Stabilität für den Bereich von 15 °C bis 70 °C bestimmt. Dazu wurde jeweils eine 1 :20 Verdünnung der gereinigten Oxidoreduktase für 60 min und 180 min bei der jeweiligen Temperatur inkubiert und anschließend bei 30 °C mit dem obigen Testansatz gemessen. Auch hier wurde als Ausgangswert der Messwert herangezogen, den man unmittelbar nach Verdünnung der gereinigten Oxidoreduktase in Kaliumphosphatpuffer 50 mM bei pH = 7,0 erhält. Dieser Wert wurde auch in diesem Beispiel als 100%-Wert gesetzt.
Das Enzym erwies sich dabei bei Temperaturen unter 25 °C als stabil über mehrere Tage während die Enzymaktivität bei Temperaturen über 25 °C innerhalb von wenigen Stunden rapide abnimmt.
5.4 Substratspektrurn/Enantiomerenüberschuss
Das Substratspektrum der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase wurde durch Messung der Enzymaktivität mit einer Reihe von Ketonen, Oxosäureestern und cyclischen Ketonen bestimmt. Dazu wurde der Standard Messansatz gemäß Beispiel 5.1 mit unterschiedlichen Substraten verwendet Die Aktivität mit 2-Oxo- 4-phenyl-buttersäureet ylester wurde gleich 100% gesetzt und alle anderen Substrate wurden dazu ins Verhältnis gesetzt.
Für die ee-Wert-Bestirnmung wurden für ausgewählte Substrate folgender Reaktionsansatz verwendet:
100 μl TEA 100 rnM pH = 7
100 μl NADPH (50 mM) 60 μl Substrat (100 mM)
+ 1 bis 2 U der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase
Die Ansätze zur ee- Bestimmung wurden nach 24 h mit Chloroform extrahiert und mittels GC wurde der Enantiomerenüberschuss des resultierenden Alkohols bestimmt. Tabelle 5
Figure imgf000031_0001
n.b. bedeutet nicht bestimmt Wie aus Tabelle 5 ersichtlich, werden von der erfindungsgemäßen Oxidoreduktase ein breites Spektrum an aliphatischen und zyklischen Carbonyl- Verbindungen, insbesondere 2-Oxosäureestern enantioselektiv reduziert. Kurz- kettige sekundäre Alkohole werden nicht akzeptiert. Das bedeutet, dass hier die substratgekoppelte Coenzymregenerierung mit sekundären Alkoholen als Cosubstrat nicht angewendet werden kann.
5.5 Umsetzungsbeispiele
5.5.1 Reduktion von 2-Oxo-4-phenylbuttersäureethylester zu (R)-2-Hydroxy- 4-phenyl-buttersäureethylester
Zur Reduktion von 2-Oxo-4-phenylbuttersäureethylester wurde ein Gemisch aus 800 μl Puffer (100 mM TEA, pH = 8, 10 % ©Triton X 100), 100 μl Isopropanol (1 ,3, mmol), 0,1 mg NADP (0,1 μmol) 10 U rekombinante Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii und 5 Units Aikohoidehydrogenase aus Thermoanerobium brockii mit 50 μl 2-Oxo-4-phenyl-buttersäureethylester (0,25 mmol) gelöst in 600 μl n-Heptan überschichtet und für 24 h bei 25 °C unter ständiger Durchmischung inkubiert.
Nach 24 h waren 92% des eingesetzten 2-Oxo-4-phenyl-buttersäureethylester reduziert. Der Enantiomerenüberschuss des erhaltenen (R)-2-Hydroxy-4- phenyl-buttersäureethylester betrug mehr als 90 %.
5.5.2. Reduktion von 8-Chlor-6-oxo-octansäureethylester zu (R)-8-Chlor-6- hydroxy-octansäureethylester
Zur Reduktion von 8-Chloro-6-oxo-octansäureethylester wurde ein Gemisch aus 800 μl Puffer (100mM TEA, pH = 8, 5 % Triton X 100), 80 μl Isopropanol (1 ,04 mmol), 0,1 mg NADP (0,1 μmol) 25 U rekombinante Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii und 5 Units Aikohoidehydrogenase aus Thermoanerobium brockii mit 50 μl 8-Chlor-6-oxo-octansäureethylester (0,23 mmol) gelöst in 600 μl Cyclohexan überschichtet und für 24 h bei 25 °C unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 55% des eingesetzten 8-Chlor-6-oxo-octansäureethylesters reduziert. Der Enantiomerenüberschuss des erhaltenen (R)-8-Chlor-6-hydroxy- octansäureethylesters betrug mehr als 97 % .
5.5.3. Reduktion von 2-Chlor-1-phenyl-ethan-1-on zu (1 R)-2-Chlor-1-phenyl- ethan-1-ol
Zur Reduktion von 2-Chlor-1-phenyl-ethan-1-on wurde ein Gemisch aus 800 μl Puffer (100mM TEA, pH = 8, 5 % Triton X 100), 100 μl Isopropanol (1 ,3 mmol), 0,1 mg NADP (0,1 μmol) 20 U rekombinante Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii und 10 Units Aikohoidehydrogenase aus Thermoanerobium brockii mit 50 rng 2-Chlor-1-phenyl-ethan-1-on (0,33 mmol) gelöst in 400 μl Cyclohexan/tert.-Butyl-methylether (50:50) überschichtet und für 24 h bei 25 °C unter ständiger Durchmischung inkubiert.
Nach 48 h waren 75% des eingesetzten 2-Chlor-1-phenyl-ethan-1-ons reduziert. Der Enantiomerenüberschuss des erhaltenen (1 R)-2-Chlor-1-phenyl- ethan-1-ols betrug mehr als 94 %.
5.5.4. Reduktion von Ethylphenylglyoxylat zu (1 R)-Ethylmandelat
Zur Reduktion von Ethylphenylglyoxylat wurde ein Gemisch aus 800 μl Puffer (100mM TEA, pH = 8, 5 % Triton X 100), 100 μl Isopropanol (1 ,3 mmol), 0,1 mg NADP (0,1 μmol) 20 ü rekombinante Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii und 10 Units Aikohoidehydrogenase aus Thermoanerobium brockii mit 50 μl Ethylphenylglyoxylat (0,31 mmol) gelöst in 600 μl Cyclohexan überschichtet und für 24 h bei 25 °C unter ständiger Durchmischung inkubiert.
Nach 48 h waren 50% des eingesetzten Ethylphenylglyoxylat reduziert. Der Enantiomerenüberschuss des erhaltenen (I R)-Ethylmandelat betrug mehr als 99%.

Claims

Patentansprüche
1. Oxidoreduktase, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Anwesenheit von NADPH und Wasser eine Carbonylverbindung zur entsprechenden chiralen Hydroxyverbindung reduziert.
2. Oxidoreduktase gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Hefen der Gattungen aus Metschnikowia, insbesondere aus Metschnikowia zobellii, erhältlich ist.
3. Oxidoreduktase gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch die DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 kodiert wird und die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 aufweist.
4. Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als 70 % der Aminosäuren identisch sind mit der Aminosäuresequenz SEQ l'D NO: 13 und sie eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein aufweist, bezogen auf die Umsetzung von 2-Oxo-4-phenyl-buttersäureethylester zu (R)-2-Hydroxy-4-phenyl-buttersäureethylester.
5. Oxidoreduktase gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass 80 bis 99,5 %, bevorzugt 90 bis 99,5 %, besonders bevorzugt 99 bis 99,5 %, der Aminosäuren identisch sind mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 13.
6. Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie 1 bis 40 Aminosäuren zusätzlich oder 1 bis 40 Aminosäuren weniger aufweist als die Oxidoreduktase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 13 und daß sie eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein aufweist, bezogen auf die Umsetzung von 2-Oxo-4-phenylbuttersäureethylester zu (R)-2-Hydroxy- 4-phenylbuttersäure-ethylester.
7. Oxidoreduktase gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass 1 bis 25 Aminosäuren, insbesondere 2 bis 20 Aminosäuren, insbesondere bevorzugt 3 bis 10 Aminosäuren mehr oder weniger als in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 13 vorkommen.
8. Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 13 aufweist und ein-, zwei-, drei-, vier- oder fünffach durch ein wasserlösliches Polymer modifiziert ist und eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein zeigt, bezogen auf die Umsetzung von 2- Oxo-4-phenyl-buttersäureethylester zu (R)-2-Hydroxy-4-phenyl-butter- säure-ethylester.
9. Oxidoreduktase gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche Polymer Polyethylenglykol ist.
10. Fragment einer Oxidoreduktase, dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Fragment der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 13 darstellt und 5 bis 30, bevorzugt 6 bis 25, Aminosäuren umfaßt.
11. Fragment einer Oxidoreduktase gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es 8 bis 20, bevorzugt 10 bis 18, Aminosäuren umfaßt.
12. Oxidoreduktase oder ein Fragment davon, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 13 oder ein Fragment davon mit 5 bis 30 Aminosäuren aufweist und daß die Oxidoreduktase oder das Fragment davon am N-terminalen oder C-terminalen Ende über eine Peptidbindung mit einem weiteren Polypeptid zu einem Fusionsprotein verbunden ist.
13. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, das er spezifisch an die Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 13 bindet.
14. DNA-Sequenz, die für die Oxidoreduktase gemäß SEQ ID NO: 13 kodiert.
15. DNA-Sequenz, die für eine Oxidoreduktase kodiert, die in Anwesenheit von NADPH und Wasser die Reduktion einer Carbonylverbindung zur entsprechenden chiralen Hydroxyverbindung katalysiert, wobei die DNA- Sequenz a) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 oder dem jeweils komplementären Strang entspricht oder b) einer DNA-Sequenz ist, die mit einer oder mehreren der DNA- Sequenzen gemäß a) oder einem von deren komplementären Strängen hybridisiert, wobei die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen erfolgt, oder c) eine DNA-Sequenz ist, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ein Protein kodiert, wie es auch durch eine oder mehrere der DNA-Sequenzen gemäß a) oder b) kodiert wird.
16. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass darin mehr als 70 % der Nukleinsäurebasen identisch sind mit der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 oder deren komplementärem Strang und daß sie eine Oxido- reduktase kodiert, die eine spezifische Aktivität von mehr als 1 μmol pro mg Protein aufweist, bezogen auf die Umsetzung von 2-Oxo-4-phenyl- buttersäureethylester zu (R)-2-Hydroxy-4-phenyl-buttersäureethylester.
17. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass 80 % bis 99,5 %, bevorzugt 90 % bis 99,5 %, besonders bevorzugt 99 % bis 99,5 %, der Nukleinsäurebasen identisch sind mit der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12.
18. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie 10 bis 50 Nukleinsäurebasen aufweist, die einem Teil oder mehreren Teilen der DNA- Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 oder deren komplementärem Strang entspricht.
19. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie 15 bis 45, bevorzugt 20 bis 40, besonders bevorzugt 30 bis 40, Nukleinsäurebasen umfaßt.
20. Klonierungsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine oder mehrere der DNA-Sequenzen gemäß der Ansprüche 14 bis 19 umfaßt.
21. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine oder mehrere der DNA-Sequenzen gemäß der Ansprüche 14 bis 19 umfaßt und mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist.
22. Wirtszelle, die eine Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Pflanzen- oder Tierzelle, insbesondere eine Säugetierzelle, ist und mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 21 transformiert oder transferiert wurde.
23. Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen zu den entsprechenden chiralen Hydroxyverbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit einer Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADPH und Wasser zur entsprechenden chiralen Hydroxyverbindung reduziert, und b) die gebildete chirale Hydroxyverbindung isoliert wird.
24. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß als Carbonylverbindung eine Verbindung der Formel I einsetzt wird, R1-C(0)-R2 (I) worin R1 für
1 ) (Cι-C20)Alkyl, das geradkettig oder verzweigt ist,
2) (C2-C20)Alkenyl, das geradkettig oder verzweigt ist und je nach Kettenlänge ein, zwei, drei oder vier Doppelbindungen enthält,
3) (C2-C20)Alkinyl, das geradkettig oder verzweigt ist und je nach Kettenlänge ein, zwei, drei oder vier Dreifachbindungen enthält,
Figure imgf000038_0001
5) (Cι-C8)Alkyl-(C6-C14)Aryl, 6) (Cδ-Cι4)Heterocyclus, der unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist, bevorzugt durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro, oder 7) (C3-C7)Cycloalkyl, wobei die oben unter 1) bis 7) genannten Reste unsubstituiert sind oder ein-, zwei- oder dreifach substituiert sind unabhängig voneinander durch a) -OH, b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, c) -N02 oder d) -NH2 steht und
R2 für
1) (CrC6)Alkyl, das geradkettig oder verzweigt ist,
2) (C2-Ce)Alkenyl, das geradkettig oder verzweigt ist und, je nach Kettenlänge, ein, zwei oder drei Doppelbindungen enthält,
3) (C2-C6)Alkinyl, das geradkettig oder verzweigt ist und, je nach Kettenlänge, ein oder zwei Dreifachbindungen enthält, oder
4) (C0-C10)Alkyl-C(O)-O-(Cι-C6)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein- bis dreifach substituiert ist, bevorzugt durch Halogen, Hydroxyl, Amino oder Nitro, wobei die oben unter 1) bis 4) genannten Reste unsubstituiert sind oder ein-, zwei- oder dreifach substituiert sind unabhängig voneinander durch a) -OH, b) Halogen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, c) -N02 oder d) -NH2 steht.
25. Verfahren gemäß der Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADPH und Wasser zur entsprechenden chiralen Hydroxyverbindung reduziert, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NADP mit einem Cosubstrat zu NADPH reduziert, und c) die gebildete chirale Hydroxyverbindung isoliert wird.
26. Verfahren gemäß der Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADPH und Wasser zur entsprechenden chiralen Hydroxyverbindung reduziert, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NADP mit einer Dehydro- genäse und einem Cosubstrat zu NADPH reduziert, und c) die gebildete chirale Hydroxyverbindung isoliert wird.
27. Verfahren gemäß der Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADPH und Wasser zur entsprechenden chiralen Hydroxyverbindung reduziert, b) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel durchführt und c) die gebildete chirale Hydroxyverbindung isoliert wird.
28. Verfahren gemäß der Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADPH und Wasser zur entsprechenden chiralen Hydroxyverbindung reduziert, b) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel durchführt, c) das durch die Oxidoreduktase gebildete NADP mit einem Cosubstrat zu NADPH reduziert, und d) die gebildete chirale Hydroxyverbindung isoliert wird.
29. Verfahren gemäß der Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Carbonylverbindung in Anwesenheit der Oxidoreduktase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, NADPH und Wasser zur entsprechenden chiralen Hydroxyverbindung reduziert, b) das durch die Oxidoreduktase gebildete NADP mit einer Dehydrogenase und einem Cosubstrat gleichzeitig zu NADPH reduziert, c) die Reaktionen in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittel durchgeführt und d) die gebildete chirale Hydroxyverbindung isoliert wird.
30. Verfahren gemäß der Ansprüche 25, 26, 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß als Cosubstrat 2-Propanol, 2-Butanol, 2-Pentanol oder 2-Octanol verwendet wird.
31. Verfahren gemäß der Ansprüche 23 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass man 2-Oxo-4-phenyl-buttersäureethylester zu (R)-2-Hydroxy-4- phenylbuttersäureethylester, 8-Chlor-6-oxo-octansäureethylester zu (R)- 8-Chlor-6-hydroxy-octansäureethylester, 2-Chlor-1-phenyl-ethan-1-on zu (1 R)-2-Chlor-1 -phenyl-ethan-1-ol oder Ethylphenylglyoxylat zu (1 R)- Ethylmandelat umsetzt.
32. Verfahren gemäß der Ansprüche 26 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Dehydrogenase aus Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir oder Lactobacillus brevis einsetzt.
33. Verfahren gemäß der Ansprüche 26 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass man als Dehydrogenase NADPH abhängige Formiat- Dehydrogenase und als Cosubstrat ein Salz der Ameisensäure wie Ammoniumformiat, Natriumformiat oder Calciumformiat einsetzt.
34. Verfahren gemäß der Ansprüche 27 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass man als organische Lösungsmittel tert.-Butylmethylether, Diisopropylether, Heptan, Hexan oder Cyclohexan oder deren Gemische einsetzt.
35. Verfahren gemäß der Ansprüche 27 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösemittel eine Phase bildet, deren Anteil 5 bis 80 %, bevorzugt 10 bis 40 %, bezogen auf das gesamte Reaktionsvolumen, beträgt.
PCT/EP2004/013156 2003-11-21 2004-11-19 Oxidoreduktase aus metschnikowia zobellii Ceased WO2005049816A2 (de)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT04818808T ATE470715T1 (de) 2003-11-21 2004-11-19 Oxidoreduktase aus metschnikowia zobellii
DK04818808.0T DK1685248T3 (da) 2003-11-21 2004-11-19 Oxidoreduktase fra Metschnikowia zobellii
PL04818808T PL1685248T3 (pl) 2003-11-21 2004-11-19 Oksydoreduktaza z Metschnikowia Zobellii
DE502004011271T DE502004011271D1 (de) 2003-11-21 2004-11-19 Oxidoreduktase aus metschnikowia zobellii
EP04818808A EP1685248B1 (de) 2003-11-21 2004-11-19 Oxidoreduktase aus metschnikowia zobellii

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10354779.7 2003-11-21
DE10354779A DE10354779A1 (de) 2003-11-21 2003-11-21 Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2005049816A2 true WO2005049816A2 (de) 2005-06-02
WO2005049816A3 WO2005049816A3 (de) 2005-11-17

Family

ID=34609243

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2004/013156 Ceased WO2005049816A2 (de) 2003-11-21 2004-11-19 Oxidoreduktase aus metschnikowia zobellii

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP1685248B1 (de)
AT (1) ATE470715T1 (de)
DE (2) DE10354779A1 (de)
DK (1) DK1685248T3 (de)
ES (1) ES2349466T3 (de)
PL (1) PL1685248T3 (de)
PT (1) PT1685248E (de)
WO (1) WO2005049816A2 (de)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005108593A1 (de) * 2004-05-10 2005-11-17 Iep Gmbh Verfahren zur herstellung von 2-butanol
WO2008018520A1 (en) 2006-08-09 2008-02-14 Kaneka Corporation Method for producing optically active hydroxycarboxylic acid derivative or salt thereof
WO2011009849A2 (en) 2009-07-21 2011-01-27 Basf Se Method for preparing optically active hydroxy acid esters
EP2004838B1 (de) * 2006-04-11 2012-06-13 IEP GmbH Verfahren zur herstellung von steroidderivaten durch reduktion von oxosteroidverbindungen oder durch oxidation von hydroxysteroidverbindungen unter verwendung einer hydroxysteroiddehydrogenase
US8404461B2 (en) 2009-10-15 2013-03-26 SK Biopharmaceutical Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
US8501436B2 (en) 2009-06-22 2013-08-06 Sk Biopharmaceuticals Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
US10294479B2 (en) 2015-03-04 2019-05-21 East China University Of Science And Technology Candida carbonyl reductase and method for preparing (R)-lipoic acid precursor
CN109929885A (zh) * 2019-03-06 2019-06-25 泰州市惠利生物科技有限公司 一种利用酶膜反应器耦合萃取制备r-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2874055A1 (en) 2012-06-18 2013-12-27 Laboratorio Chimico Internazionale S.P.A. Enzymatic reduction

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1302999A (en) * 1997-11-04 1999-05-24 Eli Lilly And Company Ketoreductase gene and protein from yeast
US6818752B2 (en) * 2000-01-31 2004-11-16 Biocatalytics, Inc. Synthetic genes for enhanced expression

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VON COSTELLO C.A. ET AL., EUR. J. BIOCHEM., vol. 267, 2000, pages 5493 - 5501

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005240857B2 (en) * 2004-05-10 2009-12-03 Iep Gmbh 2-butanol production method
WO2005108593A1 (de) * 2004-05-10 2005-11-17 Iep Gmbh Verfahren zur herstellung von 2-butanol
US7371903B2 (en) 2004-05-10 2008-05-13 Iep Gmbh 2-butanol production method
EP2004838B1 (de) * 2006-04-11 2012-06-13 IEP GmbH Verfahren zur herstellung von steroidderivaten durch reduktion von oxosteroidverbindungen oder durch oxidation von hydroxysteroidverbindungen unter verwendung einer hydroxysteroiddehydrogenase
US8058471B2 (en) 2006-08-09 2011-11-15 Kaneka Corporation Method for producing optically active hydroxycarboxylic acid derivatives or salts thereof
WO2008018520A1 (en) 2006-08-09 2008-02-14 Kaneka Corporation Method for producing optically active hydroxycarboxylic acid derivative or salt thereof
US8501436B2 (en) 2009-06-22 2013-08-06 Sk Biopharmaceuticals Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
WO2011009849A2 (en) 2009-07-21 2011-01-27 Basf Se Method for preparing optically active hydroxy acid esters
US8404461B2 (en) 2009-10-15 2013-03-26 SK Biopharmaceutical Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
US9068207B2 (en) 2009-10-15 2015-06-30 Sk Biopharmaceuticals Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
US9434970B2 (en) 2009-10-15 2016-09-06 Sk Biopharmaceuticals Co., Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
US10294479B2 (en) 2015-03-04 2019-05-21 East China University Of Science And Technology Candida carbonyl reductase and method for preparing (R)-lipoic acid precursor
CN109929885A (zh) * 2019-03-06 2019-06-25 泰州市惠利生物科技有限公司 一种利用酶膜反应器耦合萃取制备r-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法
CN109929885B (zh) * 2019-03-06 2022-07-15 江苏惠利生物科技有限公司 一种利用酶膜反应器耦合萃取制备r-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法

Also Published As

Publication number Publication date
PL1685248T3 (pl) 2011-02-28
DE502004011271D1 (de) 2010-07-22
DK1685248T3 (da) 2010-10-11
EP1685248B1 (de) 2010-06-09
WO2005049816A3 (de) 2005-11-17
EP1685248A2 (de) 2006-08-02
ES2349466T3 (es) 2011-01-03
ATE470715T1 (de) 2010-06-15
DE10354779A1 (de) 2005-06-23
PT1685248E (pt) 2010-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1633779B1 (de) Oxidoreduktase aus pichia capsulata
KR101341392B1 (ko) 케토 화합물의 입체구조 선택적인 환원을 위한산화환원효소
EP1383899B1 (de) Enzymatisches verfahren zur enantioselektiven reduktion von ketoverbindungen
JP2007523617A6 (ja) ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素
EP1685248B1 (de) Oxidoreduktase aus metschnikowia zobellii
EP1437401B1 (de) Oxidoreduktase
EP2403953B1 (de) Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen reduktion von ketoverbindungen

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004818808

Country of ref document: EP

DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004818808

Country of ref document: EP