WO2005075657A1 - Ｄｎａ配列の塩基変換方法 - Google Patents

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the invention of this application relates to a method for base conversion of a DNA sequence. More specifically, the invention of this application relates to a method for converting one or more bases or base sequences of a target DNA sequence in a cell into another base or base sequence.
  • SFHR Small Fragment Homologous Replacement
  • the SFHR method holds great promise as a new form of gene therapy.
  • the efficiency of repairing mutant genes in the SFH method varies greatly depending on the Atssei system and target gene used, but in many cases it is less than 1%, and this value should be dramatically improved.
  • it is essential to make the SFHR method a clinically applicable technology.
  • Reference 5 Colosiio A, Goncz KK, Novel li G, Dallapiccola B and GruenertDC. Targeted correction of a defective selectable marker gene in human epithelial cells by small DNA fragments.Mol Ther. 2001; 3: 178-185.
  • Literature 8 Liu L, Rice MC, Drury M, Cheng S, Gamper H and Kmiec EB. Strand bias in tageted gene repair is influenced by transcriptional activity. Mol Cell Biol. 2002; 22: 3852-3863.
  • Reference 1 O Brachman EE and Kmiec EB.targeted nucleotide repair of cycl mutat ions in Saccharoiyces cerevis iae directed by modified single-stranded nucleot ides.Genetics. 2003; 163: 527-538.
  • Literature 1 2 Alexeev V, Igoucheva 0 and Yoon K. Simul taneous targeted alteration of the tyrosinase and c-kit genes by single-stranded oligonucleotides.Gene Ther. 2002; 9: 1667-1675.
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  • This application is directed to a first invention for solving the above-mentioned problem, which is a method for converting one or more bases of a target DNA sequence in a cell, wherein the method is homologous to the target DNA sequence, and
  • This is a method for base conversion of a DNA sequence, which comprises introducing into a cell a 300-3,000 base single-stranded DM fragment prepared from a single-stranded cyclic DM containing a base to be converted.
  • the single-stranded DM fragment is homologous to the sense strand of the target DNA sequence.
  • the single-stranded circular DNA is a phagemid DNA, and a target D sequence causing a disease by one or more base mutations. Is a base conversion.
  • Yet another embodiment of the first invention is to convert one or more bases of a target DM sequence of a cell in an organism.
  • the second invention of this application is a cell in which one or more bases of a target DNA sequence have been converted by the method of the first invention.
  • the third invention of this application is a living individual having the cells of the second invention in the body.
  • the fourth invention of this application is an agent for treating a disease caused by one or more base mutations in a target DM sequence, the agent being complementary to the target DM sequence and being converted. It is a therapeutic agent having a form in which a single-stranded DNA fragment of 300 to 3,000 bases prepared from single-stranded cyclic DM containing a base to be introduced can be introduced into cells.
  • One embodiment of the fourth invention is that the single-stranded circular DNA is a phagemid DNA.
  • the fifth invention of this application is based on one or more base mutations in the target DNA sequence.
  • a method for treating a disease comprising preparing a single-stranded circular DNA comprising 300 to 3,000 bases, which is complementary to a target DNA sequence and contains bases to be converted.
  • a therapeutic method characterized by introducing a fragment into a cell.
  • the single-stranded cyclic DA is phagemid DNA.
  • the “DNA sequence” means a molecule in which a nucleoside phosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) in which a purine or pyrimidine is linked to a sugar by a] 3- ⁇ -glycoside bond.
  • dATP nucleoside phosphate
  • dGTP nucleoside phosphate
  • dCTP dCTP
  • dTTP nucleoside phosphate
  • “Conversion” means that one or more bases (A, T, G) in the target DNA sequence are replaced with other bases (base substitution), and one or more bases in the target DNA sequence are missing. Loss (base deletion) and the addition of one or more bases to the target DNA sequence (base addition). Furthermore, these base conversions may be performed on one or more bases independently of the target DM sequence, or may be performed by substitution, deletion and addition of a sequence consisting of a plurality of bases in the target sequence. (Sequence replacement, sequence deletion, sequence addition: these may be referred to as “sequence conversion” below).
  • the terms in the present invention are basically based on the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, or are based on the meanings of terms commonly used in the art.
  • a target for gene repair Since the strand DM fragment is prepared from a single-stranded circular DNA having no complementary strand, there is no need to perform the operation of separating the target single-stranded DNA fragment from the complementary strand, and moreover, compared to the conventional SFH method, The base or base sequence of the target DNA sequence can be accurately converted with high efficiency. In particular, by using a single-stranded DNA fragment homologous to the sense strand of the target DNA sequence, the target base of the target gene can be efficiently and accurately converted.
  • FIG. 1A is a configuration diagram of target plasmids pTENHES and pTE HEX into which normal and mutant HygEGFP genes have been respectively incorporated.
  • FIG. 1B is a configuration diagram of phagemid vectors pBSHES / AntiSense and pBSHES / Sense for producing single-stranded antisense DNA fragments and sense DNA fragments.
  • FIG. 2 is a photomicrograph of the fluorescence signal observed when the target plasmid pTENHEX and the single-stranded sense DNA fragment were introduced into mammalian cells (CH0-K1 cells).
  • the mutant HygEGFP gene is repaired by the single-stranded DNA fragment, and the EFGP gene is expressed to generate a fluorescent signal.
  • Figure 3 shows plasmids recovered from mammalian cells (CH0-K1 cells) transfected with target plasmid pTENHEX, single-stranded DNA fragments (iAntiS, fSense), double-stranded DNA fragments (dsHES) and PCR products (pcrHES).
  • iAntiS single-stranded DNA fragments
  • dsHES double-stranded DNA fragments
  • pcrHES PCR products
  • FIG. 4 is a graph showing gene repair efficiencies at the respective cell transduction amounts of dsHES, fAntiS, fSense, and pcrHES.
  • FIG. 5 shows the results of electrophoresis of a restriction enzyme PmaCI fragment of a PCR product amplified from a target plasmid extracted from EGFP-positive cells.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of sequence analysis of a target plasmid extracted from EGFP-positive cells. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a single-stranded DNA fragment of 300 to 3,000 bases, which is homologous to the target DNA sequence and contains a base to be converted, prepared from a single-stranded cyclic DN is introduced into a cell.
  • one or more bases of the target DNA sequence are converted. That is, in this method, the target DNA sequence or a partial region thereof is subjected to “homologous replacement” with a single-stranded DNA fragment, thereby obtaining a base or base sequence to be converted within the target DNA sequence (hereinafter referred to as “target base sequence”). ”) Is converted to another base or base sequence (hereinafter referred to as” converted base ").
  • the conventional SFHR method denatures double-stranded DNA fragments (eg, PCR products) into single-stranded DNA fragments
  • both the sense and antisense strands act on the target DNA sequence.
  • the method of the present invention is characterized in that only a single-stranded DNA fragment (sense strand or antisense strand, preferably sense strand) is allowed to act on a target DM sequence.
  • a “single-stranded DNA fragment” is homologous to a target DNA sequence except that it contains a converted base.
  • “homology” refers to at least 95%, preferably at least 98%, more preferably at least 99%, and ideally, at least one of the sense strand and the antisense strand of the double-stranded target DNA sequence. Although it means that the sequences are 100% identical, it is preferable that they are homologous to the sense strand of the target DNA sequence from the viewpoint of conversion efficiency.
  • this single-stranded DNA fragment is unmodified. That is, it is a DNA fragment that is not modified at both ends with phosphorothioate, 20-Me-NA, or LNA (Locked nucleic acid) as in the above-mentioned modified oligonucleotide.
  • the “size of single-stranded DNA fragment” is selected from the range of 300 to 3,000 bases depending on the length of the target DNA sequence, the number of target bases, and the like. For example, it is a DNA fragment having a length of 300 to 500 bases, 500 to 800 bases, 800 to 1200 bases, 1200 to 1700 bases, 1700 to 2300 bases, or 2300 to 3000 bases.
  • Target DNA sequence is not particularly limited as long as it is a DNA sequence existing in a cell. Instead, it can target DNA sequences that have some function in cells, such as DNA sequences of genomic genes, DNA sequences of mitochondria, and DNA sequences of plasmids.
  • the number of “converted bases” in a single-stranded DNA fragment depends on the number of target bases in the target DNA sequence. For example, in the case of individual base conversion (base substitution, base deletion, base addition), depending on the target DNA sequence and the size of the single-stranded DM fragment, one or more (about 2 to 30) are required. However, for efficient substitution, about 1 to 10 is preferable. In the case of sequence conversion, a sequence consisting of about 2 to 30 bases, preferably about 2 to 10 bases, is used as the converted base.
  • the position of the conversion base in the single-stranded DNA fragment is not particularly limited, but is preferably not at the end of the DM fragment.
  • the single-stranded DNA fragment can be prepared, for example, as follows.
  • the single-stranded DNA fragment may be, for example, a normal genomic gene DNA sequence or its cDM. It is preferable that the DNA is amplified by a single-stranded DNA vector (for example, phagemid DM or the like), fragmented with an enzyme or the like, and separated and purified into a desired portion and an unnecessary portion. By such preparation, it is not necessary to separate from the complementary strand, and a single-stranded DNA fragment can be obtained regardless of whether the strand is short or long.
  • a single-stranded DNA vector for example, phagemid DM or the like
  • a method for preparing the DM fragment a method of amplifying type I DNA in a test tube (for example, a PCR (Polymerase Chain Reaction) method, a SBN (Nucleic acid sequence based amplification if ication) method, a TMA (Transcript ion -mediated amplif ication) methods] are known, but in these methods, it is difficult to amplify a single-stranded DNA fragment that is highly consistent with type I DNA.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • SBN Nucleic acid sequence based amplification if ication
  • TMA Transcript ion -mediated amplif ication
  • the method of the present invention can be used for producing a compound screening system or a disease model cell or a disease model animal.
  • a single-stranded DNA fragment for converting one or more bases of a normal target DNA sequence is obtained by a method using a commercially available mutagenesis kit or the like.
  • it can be prepared from single-stranded circular DNA (for example, phagemid DNA, etc.) prepared by a known method such as a mutagenesis type PCR method.
  • the single-stranded DNA fragment can be introduced into cells existing in an organism.
  • a method in which the single-stranded DNA fragment is administered to an organism in a state of being mixed with an appropriate solvent can be adopted.
  • a single-stranded DNA fragment may be embedded in a hollow nanoparticle or ribosome presenting a biorecognition molecule and then introduced into an organism.
  • the elect opening method can be adopted.
  • the method of introducing a single-stranded DNA fragment into cells existing in this organism is that the target DNA sequence of interest has one or more base conversion mutations to cause disease.
  • a “causal disease gene” that is the cause it is possible to correct the transversion mutation of the causative gene (fifth invention).
  • it can be used as a therapeutic drug for diseases caused by base conversion mutations in genes (the fourth invention). ).
  • Mutations known to be the causes of genetic diseases include not only single nucleotide changes but also long insertion mutations caused by CAG repeats such as those found in Huntington's disease (McMurray CT.Huntington's disease: new Hops for therapeutics. Trends Nerosci. 2001; 24: S32-S38) and a long deletion mutation in the muscular dystrophy dystrophin gene (Forrest SM, Cross GS, Speer A, Gardner-Medwin D, Bums J and Davies KE.Preferential delet ion of exons in Duchenne aid Becker muscular dystrophines.Nature. 1987; 329: 638-640.
  • the second invention of this application is a “cell” in which one or more bases or a base sequence of the target DNA sequence has been converted to another base or base sequence by the method of the first invention.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis
  • eukaryotic cells such as yeast, insect cells, and animal and plant cells
  • Cells created in this way are, for example, cells in which one or more base changes have been introduced into the functional gene sequence, and cells having a specific function deficiency or enhancement, such as drugs or bioactive substances. It can be used as a material for in vitro screening of cytotoxic substances and the like.
  • the cells used in bioreactors, fermentation engineering, etc. can be used to delete specific cell functions that are “inconvenient” in their use.
  • the third invention of this application is a biological individual having the cells of the second invention in the body, particularly a multicellular organism such as animal and plant cells.
  • the individual organism is It may be a living individual transplanted with clear cells (cells converted in vitro) into the body, or as a result of the introduction of a single-stranded DNA fragment into the body, one or more of the target DNA sequences
  • a biological individual in which a plurality of bases have been converted to other bases or base sequences may be used.
  • Such an individual is useful as a “disease model animal”, for example, when the base substitution of the target DNA sequence causes a disease. It can also be used for applications such as base conversion of various genes and in vivo screening of drug components and toxic substances.
  • pTE HEX which is the target plasmid, cannot express a normal HygEGFP gene in mammalian cells and E. coli because a termination mutation (Stop: TGA) is introduced into codon 34 of the HygEGFP gene.
  • HygEGFP gene a single-stranded DNA fragment (HygEGFP gene) in which codon 34 is normal Ser (TCA) into cells, codon 34 of this mutant HygEGFP gene is restored to normal Ser (TCA). This was confirmed by two phenotypes: hygromycin resistance and EGFP fluorescence.
  • the double-stranded DNA fragment used for comparison was obtained using restriction enzymes from a plasmid replicated in E. coli (Drake JW. Nature. 1969: 221: 11329), which is twice as accurate as the PCR method.
  • a double-stranded DNA fragment was prepared and heat-denatured (dsHES) was used.
  • the Kpnl-Sall fragment of pHygEGFP (CLONTECH Laboratories Inc., CA) was introduced into pALTER-1 (Promega Corp., WI) at the same restriction enzyme site, while pALHE was introduced into the Altered Sites II in vitro Mutagenesis System (Promega Corp., WI) to perform a site-directed mutagenesis reaction.
  • pALTER-1 Promega Corp., WI
  • pALHE was introduced into the Altered Sites II in vitro Mutagenesis System (Promega Corp., WI) to perform a site-directed mutagenesis reaction.
  • an Xhol site was introduced using the oligonucleotide Xho (5′-cggcacctcgagcacgcggat-3 ′: SEQ ID No. 1) (pALHEX).
  • codon 195 changed from Val to Glu, but did not affect the quantification of the gene repair reaction.
  • a PMCI site serving as a gene marker was introduced at codon 34 of the normal HygEGFP gene using the oligonucleotide Silent (5'-gcgaagaatcacgtgctttca-3 *: SEQ ID No. 2) (pALHEXP).
  • pALHEXP oligonucleotide Silent
  • the oligonucleotide Opal 5'-ggcgaagaatgacgtgcttttc-3 ': SEQ ID No. 3 was used (pALHEXB).
  • Phagemid was obtained by introducing the Xhol fragment of pTENHES into the Xhol site of pBluescript II SK + (FIG. 1B).
  • the resulting pBSHESZ Antisense and pBSHES / Sense were inserted in the opposite direction to the orientation of the Xhol fragment, pBluescript II SK + (Stratagene, CA), in the opposite direction, and the single-stranded circular form obtained from this phagemid.
  • the DNA contains the antisense or sense sequence of the hHygEGFP gene, respectively. Each insertion direction was confirmed by restriction enzymes Nael and PmaCI.
  • the phage was suspended in 20 ml of 0.3 M AcONa / lmM EDTA, and cyclized with phenol, phenol / chloroform (1Z1) and chloroform. The single-stranded DNA was recovered. The 25 ml EtOH was added to D solution was allowed to stand at room temperature for 15 minutes, precipitated by centrifugation, and dissolved in H 2 0 in 500 l.
  • 606 bp fragment was separated by 3.5% low melting point agarose gel and recovered by phenol / chloroform extraction.
  • a new piece of 606 nt was recovered by the same operation as for the double-stranded, using 5 X Xhol for single-stranded pBSHES / AntiSense and pBSHES / Sense lpiol (l.lig).
  • oligonucleotides that are located at the 5 'and 3' Xhol sites of pBSHES / AntiSense are Reotide AS5 '(5'-ccccctcgagatcccc-3': SEQ ID No. 6) and AS3 '(5'-cggcacctcgaggtcgac-3': SEQ ID No.
  • the recovered fragments were each purified by gel filtration (NAP5 columns, Amersham Biosciences Ltd., Buckinghamshire, England), and the degree of purification was confirmed by A 2M / A 2M being 1.8 or more.
  • the concentration was calculated as 1.00D26 () , 50 £ g for double-stranded DNA and 40 xg for single-stranded DNA.
  • DH-5Q! Cultured in 1.4 ml of LB medium was transferred to 12.5 ml of fresh LB medium at 125 / zl per sample and cultured for another 4 hours.
  • This was transferred to a 0.1-cm gap cuvette together with the pDNA of 41, and 4,8 kV, 25 / zF, 200 ⁇ was applied using Gene Pulse rII (Bio-Rad laboratories inc.CA). The election opening was performed under the following conditions.
  • the plasmid-introduced DH-5Q was cultured in lml S0C medium for 1 hour, diluted in LB medium containing 50 / g / ml Amp, and cultured overnight. At this time, a part of DH-5 ⁇ was taken, inoculated on LB agar medium, and the electroporation efficiency was measured by the number of colonies, but no significant difference was observed. The DH-5 ⁇ obtained the next day was collected by centrifugation and resuspended in mnl of TEG. After adding 0.23 of 1 (1% SDS) and gently stirring, 150 l Sol III (3M potassium acetate, 11.5% acetic acid) was further added, and the mixture was left on ice for 5 minutes.
  • the separated supernatant was treated with phenol / chloroform (1/1), and the plasmid DNA was recovered by ethanol precipitation, and dissolved in 20 d 3 ⁇ 40.
  • BL21 (DE3) was transformed by the same operation as DH-50 !.
  • the digested solution was inoculated on an LB agar medium (HygO: 50 ⁇ g / ml Amp, 10 zM IPTG) without hygromycin B, and incubated at 37 ° C. After 12-24 hours, colonies that grew on HygO were counted, and colonies that grew on Hyg75 after 26-48 hours were analyzed using FLA2000G (FUJI PHOTO FILM Co., Ltd., Kanagawa, Japan), and EGFP was analyzed. Colonies emitting fluorescence (Ex. 473 ⁇ , El. 520 dishes) were counted. Gene repair efficiency was calculated using the number of colonies obtained with HygO as the denominator and the number of EGFP fluorescence-positive colonies obtained with Hyg75 as the numerator.
  • T7pro (5'-taatacgactcactataggg-3 ': SEQ ID No. 10) and HET7
  • pTENHES and pTENHEX incorporate the normal and mutant HygEGFP genes, respectively, and their codons 34 are Ser (TCA '. PiaCI) and Stop (TGA: BigBI).
  • the phagemid vectors pBSHES-No AntiSense and pBSHEXZSense (Fig. IB) for creating single strands incorporate a part of the normal HygEGFP gene obtained by Qiol treatment of pTE thigh S. When they become strands, they encode an antisense sequence and a sense sequence, respectively.
  • DNA fragments obtained by Xhol treatment of pTENHES and the main chain cyclic pBSHES / AntiSense and pBSHES / Sense will be referred to as dsHES, fiS and fSense, respectively.
  • Target plasmid PTE secret X is introduced into CH0-K1 cells together with dsHES, fAnt iS, and fSense did.
  • This plasmid has the mutant HygEGFP gene under the control of the CMV promoter for expression in mammalian cells and the T7 promoter for expression in E. coli, so that a successful repair The fluorescence of EGFP is observed from Fig. 2 (Fig. 2).
  • the repaired gene can be easily isolated (Fig. 3).
  • the target pTENHEX was introduced into CH0-K1 cells along with the DNA fragment obtained by Xol treatment.
  • dsHES was double-stranded, it was heat denatured immediately before introduction into cells, as in the conventional SFH method.
  • f AntiS and f Sense are single-stranded DNAs, they were subjected to heat denaturation and introduced into cells in the same manner as dsHES in order to solve intramolecular higher-order structures and compare them with dsHES. 48 hours after the start of transfection, the cells were observed with a fluorescence microscope, and it was observed that the repaired HygEGFP gene was expressed in CH0-K1 cells (Fig. 2).
  • Plasmids were recovered from these cells, and hygromycin B-resistant and EGFP-positive colonies (FIG. 3) obtained by transforming BL21 (DE3) were confirmed, and the gene repair efficiency was calculated.
  • dsHES a double-stranded DNA fragment
  • Figure 4 equivalent to the conventional SFHR method
  • f AntiS a single-chain DM fragment
  • Figure 4 did not show a gene repair efficiency exceeding dsHES (0.15%). It showed about 5 times higher gene repair efficiency ( Figure 4).
  • PCR product (pcrHES) was amplified using the following primer 1 and TaQ polymerase (Toyobo), the 3′-end was blunt-ended with Blunting High Kit (Toyobo), and the dsHES and Similarly, 3.5% low melting point agarose electrophoresis was used.
  • the results are as shown in FIGS.
  • the PCR product (pcrHES) was less effective in obtaining the hygromycin BiHfe trait of the cell than the single-stranded sense DNA fragment (fSense) (FIG. 3), and the conversion efficiency was 0.16%. This value was less than half of the conversion efficiency of dsHES (0.43%), and was one-tenth or less of the conversion efficiency of single-stranded sense DNA fragment (fSense) (2.0%).
  • the invention of the present application provides a method for converting a specific base or base sequence of an intracellular DNA sequence to another base or base sequence with high efficiency. This makes it possible to efficiently repair a mutated site in a disease gene or the like.

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Abstract

細胞内の標的DNA配列の1または複数個の塩基を変換する方法であって、標的DNA配列と相同であり、かつ、変換すべぎ塩基を含む、一本鎖環状DNAから調製される300～3,000塩基の一本鎖DNA断片を細胞内に導入する。

Description

明細書
DNA配列の塩基変換方法 技術分野
この出願の発明は、 DNA配列の塩基変換方法に関するものである。 さらに詳し くは、 この出願の発明は、 細胞内の標的 DNA配列の 1または複数個の塩基または 塩基配列を他の塩基または塩基配列に変換する方法に関するものである。 背景技術
近年のヒトゲノム計画の進展や大量遺伝子サンプルのスクリーニング方法の 開発によって、個人の遺伝子情報がより詳細かつ簡便に調べることが可能になつ た （文献 1、 2 )。 このような技術の進歩と共に、 個々の患者の遺伝子情報に合 わせて、 変異の入った配列を直接正常な配列に戻す遺伝子修復法は、 遺伝子治療 におけるテーラ一メード医療として、 非常に期待できる技術である。 この遺伝子 修復法の一つである Smal l Fragment Homologous Replacement (SFHR) 法は、 正 常遺伝子配列を含む、 熱変性させた PCR産物 （二本鎖 DNA断片） を細胞へ導入す ることによって、 変異遺伝子を正常型へ変換することを目的としている （文献 3 〜5 )。 これまでこの方法によって、 嚢胞性線維症や筋ジストロフィーなどの原 因遺伝子を修復できることが報告されてきた （文献 6、 7 )。 このように修復さ れた遺伝子は、 正常遺伝子と同様に本来のプロモーターの制御下で、 細胞内で適 切に発現されることが期待できる。 また、 これまでの遺伝子治療では難しいとさ れてきた癌遺伝子に代表されるような機能獲得性変異も、 原理的に治療 ·修復す ることが可能である。
また、 一本鎖 DNA断片を用いる遺伝子修復方法としては、 化学合成により得ら れた末端修飾オリゴヌクレオチドを用いた方法が知られている。 これは、 両末端 をホスホロチォエート （文献 8〜： L 0 )や 2' - 0- Me- RNA (文献 1 1〜： L 3 )、 さら には LNA (Locked nucleic acid) (文献 1 4) で修飾した 25〜100塩基の一本鎖 DNAを用いて、哺乳動物細胞と酵母においてそれぞれ 10— 2、 10— 5の修復効率を示す ことが報告されている。 またこの末端修飾オリゴヌクレオチドを用いた方法では、 標的 DNA配列のアンチセンス鎖と相同の一本鎖 DNA断片を用いたときに、 より高 い遺伝子修復効率を示すことが知られている （文献 8、 1 1 )。
前記のとおり、 SFHR法は新しい遺伝子治療の形態として極めて有望である。 し かしながら、 現在のところ SFH 法における変異遺伝子の修復効率は、 用いてい るアツセィ系や標的遺伝子により大きくばらついているものの、多くは 1 %未満 にとどまり、 この値を飛躍的に向上させることが、 SFHR法を臨床応用可能な技術 とするためには不可欠である。
そこで、 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであつ て、 相補鎖から分離することなく、 遺伝子修復用の一本鎖 DNA断片を調製でき、 また、 この一本鎖 DNA断片を利用して、 細胞内 DNA配列の塩基をより効率良く変 換することのできる方法を提供することを課題としている。 文献
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この出願は、 前記の課題を解決するための第 1の発明は、 細胞内の標的 DNA配 列の 1または複数個の塩基を変換する方法であって、標的 DNA配列と相同であり、 かつ、 変換すべき塩基を含む、 一本鎖環状 DMから調製される 300〜3, 000塩基 の一本鎖 DM断片を細胞内に導入することを特徴とする DNA配列の塩基変換方法 である。
この第 1発明においては、 一本鎖 DM断片が、 標的 DNA配列のセンス鎖と相同 であることを好ましい態様としている。
また、 この第 1発明における一つの実施態様は、 一本鎖環状 DNAが、 ファージ ミド DNAであることであり、 また、 その 1または複数個の塩基変異によって疾患 の原因となつている標的 D 配列を塩基変換することである。
さらに第 1発明における別の実施態様は、生物体内細胞の標的 DM配列の 1ま たは複数個の塩基を変換することである。
この出願の第 2の発明は、 前記発明第 1発明の方法によって、 標的 DNA配列の 1または複数個の塩基が変換された細胞である。
この出願の第 3の発明は、 前記第 2発明の細胞を体内に保有する生物個体であ る。
この出願の第 4の発明は、 標的 DM配列の 1または複数個の塩基変異が原因と なっている疾患を治療するための薬剤であって、 標的 DM配列に相補的であり、 かつ、 変換すべき塩基を含む、 一本鎖環状 DMから調製される 300〜3, 000塩基 の一本鎖 DNA断片が細胞内に導入可能な形態を有する治療薬剤である。
この第 4発明における一つの実施態様は、一本鎖環状 DNAが、ファージミド DNA であることであることである。
この出願の第 5の発明は、 標的 DNA配列の 1または複数個の塩基変異が原因と なっている疾患を治療する方法であって、 標的 DNA配列に相補的であり、 かつ、 変換すべき塩基を含む、 一本鎖環状 DNAから調製される 300〜3， 000塩基の一本 鎖 DNA断片を細胞内に導入することを特徴とする治療方法である。 また、 第 5発 明における一つの実施態様は、 一本鎖環状 D Aが、 ファージミド DNAであること であることである。
なお、 この発明において「DNA配列」 とはプリンまたはピリミジンが糖に ]3 -Ν- グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル （dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP) が結合した分子を意味する。
また、 「変換」 とは、 標的 DNA配列の 1または複数個の塩基 （A、 T、 G) が それぞれ他の塩基に置き換わること （塩基置換)、 標的 DNA配列の 1または複数 個の塩基が欠失すること （塩基欠失)、 標的 DNA配列に 1または複数個の塩基が 付加されること（塩基付加）を意味する。さらに、 これらの塩基変換は、標的 DM 配列の個々に独立した 1または複数個の塩基が対象であってもよく、 あるいは標 的配列中の複数個の塩基からなる配列の置換、 欠失および付加 （それぞれ配列置 換、 配列欠失、 配列付加：以下これらを 「配列変換」 と記載することがある） で あってもよい。
この発明におけるその他の用語や概念は、突明の実施形態の説明や実施例にお いて詳しく規定する。 またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、 特 にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば 容易かつ確実に実施可能である。 例えば、 薬剤の調製は Remington' s Pharmaceut ical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publ ishing Co. , Eastern, PA, 1990、 Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 ; Ausubel, F. M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y， 1995等に記載されている。 さらに、 この発明における用語は基本的 には IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、 あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。 上記のとおりのこの出願の前記発明によれば、 目的とする遺伝子修復用の一本 鎖 DM断片は、相補鎖を持たない一本鎖環状 DNAから調製されるため、 目的の一 本鎖 DNA断片を相補鎖から分離操作する必要がなく、 しかも従来の SFH 法に比 較して、高い効率で標的 DNA配列の塩基または塩基配列を正確に変換することが 可能となる。特に標的 DNA配列のセンス鎖に相同の一本鎖 DNA断片を使用するこ とによって、効率よく標的遺伝子の目的塩基を正確に変換することが可能となる。 図面の簡単な説明
図 1 Aは、正常型および変異型の HygEGFP遺伝子をそれぞれ組み込んだ標的プ ラスミド pTENHESおよび pTE HEXの構成図である。 図 1 Bは、 一本鎖のアンチセ ンス DNA断片おょぴセンス DNA断片を作成するためのファージミドベクター pBSHES/AntiSenseおよび pBSHES/Senseの構成図である。
図 2は、 標的プラスミド pTENHEX と一本鎖センス DNA断片を哺乳動物細胞 (CH0-K1細胞） に導入した場合の蛍光シグナルを観察した顕微鏡写真像である。 変異型 HygEGFP遺伝子が一本鎖 DNA断片によって修復され、 EFGP遺伝子が発現し て蛍光シグナルが生じる。
図 3は、 標的プラスミド pTENHEXと一本鎖 DNA断片 （iAntiS、 f Sense), 二本 鎖 DNA断片（dsHES)および PCR産物（pcrHES) を導入した哺乳動物細胞（CH0 - K1 細胞） から回収したプラスミド DNAを大腸菌に導入し、 ハイグロマイシン B添加 寒天培地で培養した状態をィメ一ジアナライザで解析した像である。特に一本鎖 センス DNA断片（f Sense)を導入した場合に、変異型 HygEGFP遺伝子が修復され、 細胞は八ィグロマイシン B耐性および蛍光シグナル陽性形質を獲得する。
図 4は、 dsHES、 fAntiS、 f Senseおよび pcrHESのそれぞれの細胞導入量にお ける遺伝子修復効率を示したグラフ図である。
図 5は、 EGFP陽性細胞から抽出した標的プラスミドより増幅した PCR産物の制 限酵素 PmaCI断片の電気泳動の結果を示した。
図 6は、 EGFP陽性細胞から抽出した標的プラスミドの配列分析の結果を示した 図である。 発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の 形態について詳しく説明する。
第 1発明の方法は、標的 DNA配列と相同であり、かつ、変換すべき塩基を含む、 一本鎖環状 DN から調製される 300〜3， 000塩基の一本鎖 DNA断片を細胞内に導 入することによって、標的 DNA配列の 1または複数個の塩基を変換することを特 徵としている。すなわちこの方法は、 標的 DNA配列またはその一部領域を一本鎖 DNA断片により 「相同置換 (homologous replacement)] することによって、 標的 DNA配列内の変換しょうとする塩基または塩基配列 （以下 「標的塩基」 と記載す る） を、 別の塩基または塩基配列 （以下 「変換塩基」 と記載する） に変換するこ とを原理としている。 そして、 従来の SFHR法が二本鎖 DNA断片 （例えば PCR産 物） を熱変性してそれぞれ一本鎖 DNA断片とし、 センス鎖とアンチセンス鎖の両 方を標的 DNA配列に作用させるのに対し、 この発明の方法は、 一本鎖 DNA断片の み（センス鎖またはアンチセンス鎖、 好ましくはセンス鎖） を標的 DM配列に作 用させることを特徴としている。
「一本鎖 DNA断片」 は、 変換塩基を含むことを除き、 標的 DNA配列と相同であ る。 この場合の 「相同」 とは、 二本鎖の標的 DNA配列のセンス鎖およびアンチセ ンス鎖のいずれか一方と 95%以上、好ましくは 98%以上、さらに好ましくは 99% 以上、 そして理想的には 100%同一の配列であることを意味するが、 標的 DNA配 列のセンス鎖と相同であることが、 変換効率の点から好ましい。
またこの一本鎖 DNA断片は、 その端部が非修飾である。 すなわち、 前記の修飾 オリゴヌクレオチドのように、 両末端がホスホロチォェ一ト、 2 0-Me- NA、 LNA (Locked nucleic acid) で修飾されていない DNA斬片である。
「一本鎖 DNA断片のサイズ」 は、 標的 DNA配列の長さや標的塩基の数等に応じ て、 300~3, 000塩基の範囲から選択される。例えば、 300〜500塩基長、 500〜800 塩基長、 800〜1200塩基長、 1200〜1700塩基長、 1700〜2300塩基長、 2300〜3000 塩基長といった DNA断片である。
「標的 DNA配列」 は、 細胞内に存在する DNA配列であれば特に限定されるもの ではなく、 ゲノム遺伝子の DNA配列、 ミトコンドリアの DNA配列、 プラスミドの DNA配列など、 細胞内において何らかの機能を担う DNA配列を対象とすることが できる。
一本鎖 DNA断片における 「変換塩基」 の数は、標的 DNA配列における標的塩基 の数に依存する。 例えば個々の塩基変換 （塩基置換、 塩基欠失、 塩基付加） の場 合には、 標的 DNA配列や一本鎖 DM断片のサイズに応じて、 1または複数個 ( 2 〜3 0個程度） とすることができるが、 効率良く置換するためには、 1〜1 0程 度が好ましい。 また、 配列変換の場合には、 2 ~ 3 0程度、 好ましくは 2〜 1 0 程度の塩基からなる配列を変換塩基とする。 また一本鎖 DNA断片における変換塩 基の位置には特段の制限はないが、 DM断片の末端部ではないことが好ましい。 一本鎖 DNA断片は、 例えば以下のように作成することができる。 例えば、 標的 DNA配列が、 塩基変異を有する配列 （例えば疾患原因となっているゲノム遺伝子 DNA配列） である場合、 1本鎖 DNA断片は、 例えば正常なゲノム遺伝子 DNA配列 やその cDMを適当な一本鎖 DNAベクター （例えば、 ファージミド DM等） で増 幅し、 酵素等により断片化して、 目的の部分と不要の部分とに分離 ·精製して作 成することが好ましい。このような調製によって、相補鎖と分離する必要もなく、 また、 短鎖および長鎖にかかわらず一本鎖 DNA断片を得ることができる。
なお、 DM断片を調製する方法としては、 試験管内で铸型 DNAを増幅する方法 [例えば、 PCR (Polymerase Chain React ion) 法、 SBN (Nucleic acid sequence based ampl if icat ion)法、 TMA (Transcript ion-mediated ampl if icat ion) 法等] が知られているが、 これらの方法の場合には、 铸型 DNAと高度に一致する一本鎖 DNA断片を増幅することが困難である。 例えば PCR法の場合には、 数百塩基に一 回の確率で変異が導入されることが知られている （Takagi Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue E Kawakami H， Oka M and Imanaka T. Characterizat ion of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain聽 1 and its appl ication to PCR, Appl Environ Microbiol. 1997 ; 63 :4504-4510) . このよう な一本鎖 DNA断片における 「予想外の変異」 は、 例えば疾患遺伝子の修復に使用 した場合、 正常な塩基に新たな変異を導入する危険性があり、 好ましくない。 ま た、 大腸菌プラスミドの場合には、 PCR法よりも約 108倍の正確さでそのインサ ート （二本鎖 DNA断片） を増幅することができる （Drake JW. Comparative rates of spontaneous mutation. Nature. 1969: 221 : 1132 参照） が、 増幅した二本鎖 DNA断片を変性させて一本鎖 DN 断片とした場合、 センス鎖とアンチセンス鎖を 分離することが困難である。従って、 特にセンス一本鎖 DNA断片を標的 DNA配列 に作用させる場合には、 プラスミド DNAによる一本鎖]) NA断片の作成は好ましく ない （このような不都合は、 PCR産物 （二本鎖 DM断片） から一本鎖 DNA断片を 作成する場合も同様である）。
一方、 細胞内の正常ゲノム遺伝子配列に変異を導入することによって、 非天然 型の細胞や動物個体（これらの細胞や動物個体は、 例えば特定の化合物等に対す る感受性が正常型とは異なることによつて化合物スクリーニング系として有用 であり、 あるいは疾患モデル細胞または疾患モデル動物等として有用である） を 作出するためにも、 この発明の方法を使用することができる。 このような正常な 標的 DNA配列の 1または複数個の塩基を変換するための （すなわち、 人為的な変 異導入のための） 1本鎖 DNA断片は、 市販の変異導入キット等を用いた方法や、 変異導入型の PCR法等の公知の方法により作成した、一本鎖環状 DNA (たとえば、 ファージミド DNA等） から調製することができる。
上記のような、一本鎖環状 DNAから調製される一本鎖 DNA断片を細胞内に導入 するには、 リン酸カルシウム法、 リボソームや赤血球ゴーストを使用する方法、 エレクトロボレ一シヨン法、 ガラスピぺットを用いた微量注入法等の公知の手法 を用いることができる。
また、一本鎖 DNA断片は、生物体内に存在する細胞内に導入することができる。 その場合には、適当な溶媒と混合した状態で一本鎖 DNA断片を生物体内に投与す る方法を採用することができる。 あるいは生体認識分子を提示した中空ナノ粒子 やリボソーム等に一本鎖 DNA断片を包埋して生物体内に導入するようにしてもよ い。 また、 エレクト口ポレーシヨン法を採用することもできる。
そして、 この生物体内に存在する細胞内に一本鎖 DNA断片を導入する方法は、 対象となる標的 DNA配列が、その 1または複数個の塩基変換変異によって疾患の 原因となっているような 「疾患原因遺伝子」 の場合には、 その原因遺伝子の塩基 変換変異を修正することが可能となる （第 5発明)。 また、 そのような一本鎖 DNA 断片を、 前記のとおりに 「細胞内に導入可能な形態」 とすることによって、 遺伝 子の塩基変換変異を原因とする疾患の治療薬剤となる （第 4発明)。
なお、 遺伝子疾患の原因として知られている変異には、 一塩基の変換だけでは なく、 ハンチントン舞踏病に見られるような CAG リピー卜による長鎖挿入変異 (McMurray CT. Hunt ington' s disease: new hope for therapeut ics. Trends Nerosci. 2001 ;24:S32-S38) や、 筋ジストロフィーのジス卜口フィン遺伝子にお ける長鎖欠失変異 (Forrest SM, Cross GS, Speer A, Gardner-Medwin D， Bums J and Davies KE. Preferential delet ion of exons in Duchenne aid Becker muscular dystrophines. Nature. 1987; 329:638-640. 19. Den Dunnen JT, Bakker E, Breteler EG, Pearson PL and van-Ommen GJ. Direct detect ion of more than 50¾ of the Duchenne muscular dystrophy mutat ions by f ield invasion gels. Nature. 1987 ;329: 640-642) のように、 修復用一本鎖 DNAに正確かつ長い塩基配 列を必要とするような原因遺伝子も存在する。 このような変異遺伝子に対しても、 この発明の治療方法および治療薬剤は有効である。
この出願の第 2の発明は、 前記第 1発明の方法によって、 標的 DNA配列の 1ま たは複数個の塩基若しくは塩基配列が他の塩基または塩基配列に変換された「細 胞」 である。 細胞の種類には特段の制限はなく、 大腸菌、 枯草菌等の原核細胞、 酵母、 昆虫細胞、 動植物細胞等の真核細胞等を対象とすることができる。 このよ うに作成された細胞は、 例えば、 その機能遺伝子配列に 1または複数個の塩基変 換が導入された細胞であり、 特定の機能が欠損または亢進した細胞として、 例え ば薬剤や生理活性物質、 細胞毒性物質等の in vitroスクリーニングの材料とし て使用することができる。 また、 バイオリアクターや発酵工学等において使用す る細胞について、 その用途において 「不都合」 な特定の細胞機能を欠損させるた めにも使用することができる。
この出願の第 3の発明は、前記第 2発明の細胞を体内に保有する生物個体であ り、 特に動植物細胞等の多細胞生物である。 また、 この生物個体は、 前記第 2発 明の細胞 （in vitroで塩基変換された細胞） を体内に移植された生物個体であつ てもよく、あるいは一本鎖 DNA断片を体内に導入された結果、体内細胞の標的 DNA 配列の 1または複数個の塩基が他の塩基または塩基配列に変換された生物個体 であってもよい。 このような生物個体は、 例えば、 その標的 DNA配列の塩基置換 が疾患の原因となる場合には、 「疾患モデル動物」 として有用である。 また、様々 な遺伝子を塩基変換し、 薬剤成分や毒性物質を in vivoスクリーニングする等の 用途にも使用することができる。
以下、 実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細、 かつ、 具体的に説 明するが、 この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。 実施例
この実施例では、 哺乳動物細胞および大腸菌のプロモーター下流に、 ハイグロ マイシン耐性遺伝子 (Hyg) と緑色蛍光タンパク質 (EGFP) 遺伝子の融合遺伝子 (HygEGFP) を導入したプラスミドを構築し、 一本鎖 DM断片による塩基置換を 検討した。 すなわち、 標的プラスミドである pTE HEXは、 HygEGFP遺伝子のコド ン 34に終止変異 （Stop: TGA) が導入されているため、 哺乳動物細胞および大腸 菌内で正常な HygEGFP遺伝子を発現することができない。 そこで、 コドン 34が 正常型の Ser (TCA) である一本鎖 DNA断片 （HygEGFP遺伝子） を細胞に導入する ことによって、 この変異 HygEGFP遺伝子のコドン 34を正常型の Ser (TCA) に修 復するか否かを、 ハイグロマイシン耐性および EGFPの蛍光発色という 2種類の 表現型によって確認した。
これまでの研究において、 相同な配列を持つ二組の DNAが相互作用する際、一 方の二本鎖が一本鎖になることによって、他方の二本鎖へ進入することが知られ ている ( Kowalczykowski SC. Init iation of genet ic recombinat ion and recombinat ion-dependent replication Trend Biochem Sci. 2000; 25 : 156-165； Baumann P, Bensen FE and West SC. Human Rad51 protein promotes ATP - dependent homologous pairing and strand transfer react ions in vitro. Cel l. 1996 ;87:757-766. ) o そこで、 SFHR法の機構にこれと類似した仕組みが存在する ならば、 二本鎖 DNAを使うよりも、 あらかじめ一本鎖 DNAを調製して遺伝子修復 を行えば、 より高い遺伝子修復効率が得られることが想定される。 そこで、 ファ ージミド DMを用いて環状一本鎖 DNAを調製し、 これを制限酵素で切り出して一 本鎖 DNA断片としたもの （fSense、 fAntiS) を使用した。
なお、 比較に用いる二本鎖 DNA断片は、 PCR法よりも 倍の正確さを持つ大 腸菌内 （Drake JW. Nature. 1969: 221 : 11329 ) で複製されたプラスミドより、 制限酵素を用いて二本鎖 DNA断片を調製し、 これを熱変性させたもの （dsHES) を使用した。
(1) 方法
(1-1) プラスミドおよびファージミド
pHygEGFP (CLONTECH Laboratories Inc. , CA) の Kpnl-Sall 断片を、 pALTER-1 (Promega Corp. , WI)の同じ制限酵素部位へ導入した pALHEに対し、 Altered Sites II in vitro Mutagenesis System (Promega Corp. , WI) を用いて部位特異的変異 導入反応を行った。 一回目の反応ではオリ ゴヌク レオチ ド Xho (5' - cggcacctcgagcacgcggat-3' ： SEQ ID No. 1) を用いて Xhol部位を導入した (pALHEX)。 このときコドン 195は Valから Gluへ変化するが、 遺伝子修復反応 の定量には影響しなかった。二回目の反応では、正常 HygEGFP遺伝子のコドン 34 に遺伝子マ一カーとなる PMCI 部位を、 オリゴヌクレオチド Si lent (5' -gcgaagaatcacgtgctttca-3* ： SEQ ID No. 2) を用いて導入した （pALHEXP)。 さらに pALHEXPに対し、 コドン 34に opal変異を導入するために、 オリゴヌクレ ォチド Opal (5' -ggcgaagaatgacgtgct t tc-3'： SEQ ID No. 3)を用いた (pALHEXB)o 最後の反応は opal変異と同時に、 先ほど導入された PmaCI部位が除去され、 代 わりに変異型 HygEGFP遺伝子のマーカーとして BmgBI部位が導入される。それぞ れの HygEGFP遺伝子の配列はシークェンス反応によって確認した。 pALHEXPおよ び pALHEXB よ り BamHI- Sail 断 片 を 精 製 し 、 NXB リ ン カ 一 (Upper: 5' -catggcgatcctcga-3'： SEQ ID No. 4、 Lower: 5' -gatctcgaggatcgc-3' ： SEQ ID No. 5) を用いて、 pTriEx-3Neo (Novagen, WI) の CMV プロモーターおよ ぴ T7 プロモーターの下流に存在する Ncol-Xhol 部位へ導人した （pTENHES、 pTENHEL 図 1 A)。 ここで得られたプラスミドは、 大腸菌おょぴ哺乳動物の両細 胞内で、それぞれ正常型または変異型 HygEGFP遺伝子を発現することができるこ とが確認された。これらのプラスミドを大腸菌 DH-5 Q!株に導入し、 Endofree Mega Kit (QIAGEN, CA) を用いて調製した。
ファ一ジミドは、 pTENHESの Xhol断片を pBluescript II SK+の Xhol部位に導 入することによって得られた （図 1 B )。 これによつて得られる pBSHESZ Ant iSenseおよび pBSHES/Senseは、それぞれ Xhol断片の向き力 pBluescript II SK+ (Stratagene, CA) の f l oriに対し逆の向きに挿入され、 このファージミド から得られる一本鎖環状 DNAは、 それぞれ hHygEGFP遺伝子のァンチセンス配列 またはセンス配列を含んでいる。 それぞれの挿入方向は制限酵素 Nael および PmaCIによって確認した。 これらのファージミドを JM105株に導入し、 50 t g/ml のアンピシリンを含む 2XYT培地で一晩培養した後、 5mlを 500mlの 2XYT培地 (50 xg/ml Amp) に移し、 激しく攪拌しながら 3TCで培養した。 1時間後に 25 z g/ml となるようカナマイシンを加え、 再び培養を続け、 23 時間後、 遠心分 離 （2. 15 X K)3g、 15分） によってファージを大腸菌と分離した。 上清に含まれる ファージに、 75mlの 20%PEG6000Z2. 5 MNaCl溶液を加え、一晩 4でに静置した。 遠心分離 （18. 8X l03g、 20分） により、 ファージを沈殿させた後、 20mlの 0. 3 M AcONa/lmM EDTAに懸濁し、 フエノール、 フエノール/クロロフオルム （1Z1)、 クロロフオルムによって、 環状一本鎖 DNAを回収した。 D 溶液に 25ml EtOHを 加え、 室温に 15分間静置した後、 遠心分離によって沈殿させ、 500 lの H20に 溶解した。
(1-2) 断片の調製
pTENHES l iig当たり 2. 5 IIの制限酵素 Xholで消化し、 606bpの断片を 3. 5%低 融点ァガロースゲルによって分離した後、 フエノール.クロロフオルム抽出によ つて回収した。 また一本鎖状の pBSHES/AntiSenseおよび pBSHES/Sense lpiol (l. l i g) に対し 5 ϋの Xholを用い、 二本鎖と同様の操作によって、 606ntの新 片を回収した。環状一本鎖 DMの制限酵素処理では、 Xhol部位周辺を二本鎖とす るため、 pBSHES/AntiSenseの 5 ' および 3 '側の Xhol部位に栢同なオリゴヌク レオチド AS5' (5'-cccccctcgagatcccc-3' ： SEQ ID No. 6) および AS3' (5'-cggcacctcgaggtcgac-3' ： SEQ ID No. 7)、 また pBSHESZSenseの 5'および 3'側に対し S5' (5'-cccccctcgaggtgccg-3' ： SEQ ID No. 8) および S3' (5'-ggggctctcgaggtcgac-3'： SEQ ID No. 9) を、環状一本鎖に対し 5モル当量、 制限反応溶液に加えた。
回収された断片は、 それぞれゲルろ過 （NAP5 columns, Amersham Biosciences Ltd., Buckinghamshire, England)により精製を行い、精製度を A2M/A2Mが 1· 8 以上であることにより確認した。 濃度は 1.00D26()を、 二本鎖 DNAでは 50 £g、 一 本鎖では 40 xgとして算出した。
(1-3) 遺伝子導入
遺伝子導入反応の前日に、 4mlの 10%FBSを含む D' MEM/F12 (Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)中に懸濁した 3X105の CH0- Kl細胞を 6-cniディッシュに播き、 37で、 5%C02雰囲気下において培養した。 あらかじめ熱変性処理 （98で、 5分間" TC、 5分間） させた 2.5、 5、 10望 ol (それぞれ 0.47、 0.94、 1.9 g) の一本鎖 DM または 10皿 ol (3.8/Ag)の二本鎖 DNAに、 72/ gの PLUS試薬（Invitrogen Corp.， Carlsbad, CA) を含む 149 z 1の D'MEMZF12、 および 25imol (125ng) の pTE腿 X を加えた。さらに、 NZP比の違いが遺伝子修復効率に大きな影響を及ぼすことが 報告されている （Sangiuolo F, Bruscia E, Seraf ino A, Nardone AM, Bonifazi E, Lais M, Gruenert DC and Novel li G. In vitro correction of cystic fibrosis epitherial cell lines by small fragment homologous replacement (SFHR) tec niQue. BMC Med Genet. 2002;3:8) ため、 すべてのサンプルにおいて DNA量 が一定 （計 4 g) となるよう、 Amp耐性遺伝子を含まない pALTER - Ex2 (Promega Corp.,WI) を適量加えた。 これを 20 分間室温に放置した後、 32 g の LipoiectAMINE試薬 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) を含む 141 zlの D'MEM /F12を加え、さらに 20分間室温に放置し、細胞に処理する直前に 250/ 1の D' MEM /F12を加えた。 細胞は 4mlの D'MEM/F12で洗った後、 2mlの D'MEMZF12に置 換し、 そこへ先に調製した DNA溶液を全量加え、 37で、 5%C02雰囲気下において インキュベートした。 6時間後、 反応溶液を 4mlの 10%FBSを含む D'MEMZF12 に置換し、 導入反応を終了した。 さらに 42時間培養した細胞をトリプシン処理 し、 lml PBSで洗った後、遠心分離により細胞を集めた。これを 100 1の TEG(25niM Tris-HCK 10mM EDTA、 50mM Glc、 pH8. 0) に懸濁し、 200 z lの 0. 2N NaOHZ l% SDSを加え穏やかに攪拌した後、室温に 5分間放置した。さらに 150 1の 8M AcONH4 を加え、 4 で 15分間冷やした。 遠心分離後、 isoPrOH沈殿によって、 上清;^ら プラスミド DNAを回収した。 プラスミド DNAは の ¾0に溶解し、 - 20^に 保存した。
(1-4) 遺伝子修復効率の定量
前日から 1. 4mlの LB培地で培養した DH-5 Q!を、 1サンプル当たり 125 /z lと り 12. 5mlの新鮮な LB培地へ移し、さらに 4時間培養した。大腸菌は 7. 5、 1、 0. 2ml の冷 H20で洗浄し、 最後に約 100 1となるよう冷 ¾0を加え、 再度懸濁させた。 これを 4 1の pDNAと共に 0. 1-cmギャップのキュべットへ移し、 Gene Pulse r II (Bio-Rad laboratories inc. CA) を用いて、 4 、 1. 8kV、 25 /zF、 200 Ωの条件 でエレクト口ポレーシヨンを行った。 プラスミドを導入した DH-5 Q:は、 lml S0C 培地で 1時間培養した後、 50/ g/ml Amp添加 LB培地に希釈し、 一晩培養した。 このとき DH- 5 αの一部をとり、 LB寒天培地に播き、 コロニー数によってエレク トロポレーシヨン効率を測定したが、 大きな違いは観察されなかった。 翌日得ら れた DH- 5 α を遠心分離によって回収し、 mn l の TEGに再懸濁した。 これに 200 1の0. 2 3( 1 % SDSを加え穩やかに攪拌した後、さらに 150 l Sol III (3M酢酸カリウム、 11. 5%酢酸） を加え、 氷上に 5分間放置した。遠心分離した 上清をフエノール/クロロフオルム （1/1) で処理し、 エタノール沈殿によりプ ラスミド DNAを回収した。 これを 20 dの ¾0に溶解し、 このうち l— 2 i lを大 腸菌 BL21 (DE3)株へエレクトロボレ一シヨンにより導入した。 このとき、 DH— 50! と同様の操作によって、 BL21 (DE3) への形質転換を行った。
形質転換後、 lmlの S0C培地を加え、 37でで 1時間培養した後、 その 50 1を とり 50 _tg/ml Ampおよび IO M IPTGを含む lmlの LB培地で 37で、 3時間培養 した。 培養後、 培地の一部を 1—10倍希釈したものを 75 xg/mlハイグロマイシ ン B添加 LB寒天培地 （Hyg75： 50^g/ml Amp 10 IPTG) へ、 100— 1000倍希 釈したものを、ハイグロマイシン Bを含まない LB寒天培地 (HygO： 50 Λ g/ml Amp、 10 zM IPTG) へ、 それぞれ等量ずっ播き、 37Όでインキュベートした。 12—24 時間後、 HygOに生えたコロニーを数え、 また、 26— 48時間後に Hyg75に生えた コロニーは、 FLA2000G (FUJI PHOTO FILM Co. , Ltd. , Kanagawa, Japan) を用い て解析し、 EGFPの蛍光 (Ex. 473歷、 El. 520皿）を発するコロニーを数えた。 HygO で得られたコロニー数を分母に、 Hyg75で得られた EGFPの蛍光陽性コロニー数を 分子とすることで遺伝子修復効率を算出した。
(1-5) 遺伝子型の確認
Hyg75プレート上に得られた EGFP陽性コロニーをいくつか選び、 その一部を 20 x lの ¾0に懸濁した後、 98 で 5分間、 熱処理を行った。 細菌の不溶性成分 を遠心分離によりペレットとし、 上清 2 lを铸型として、 rTad DM polymerase
(T0Y0B0 Co. , Ltd. , Osaka, Japan) を用いて PCRを行った。 このときプライマ 一として、 T7pro (5' -taatacgactcactataggg-3' ： SEQ ID No. 10) および HET7
(5' -atcgcctcgctccagtcaat-3' ： SEQ ID No. 11) を用いた。 ここで得られた PCR 産物は、さらに正常型 HygEGFP遺伝子マーカーである PmaCI処理および ABI PRI SM BigDye Terminator v3. 1 Cycle SeQuencingKi t (Appl ied Biosystems, Foster Ci ty, CA) を用いたシークェンシング反応に用いた。
(2) 結果
(2-1) 遺伝子修復反応の評価系
pTENHESおよび pTENHEX (図 1 A) は、 それぞれ正常型、 変異型 HygEGFP遺伝 子が組み込まれており、 それぞれのコドン 34は Ser (TCA '. PiaCI) , Stop (TGA： BigBI) である。 また、 一本鎖を作成するためのファージミドベクター pBSHESノ AntiSenseおよび pBSHEXZSense (図 I B) は、 pTE腿 Sを] Qiol処理して得られ た正常 HygEGFP遺伝子の一部が組み込まれており、環状一本鎖となったとき、 そ れぞれアンチセンス配列およびセンス配列をコードする。
pTENHESおよぴー本鎖環状 pBSHES/Ant iSense、 pBSHES/Senseを Xhol処理 して得られた DNA断片を、 今後それぞれ dsHES、 f iS, f Senseと記載する。 標的プラスミド PTE匿 Xは、 dsHES、 f Ant iS、 f Senseと共に CH0 - K1細胞へ導入 した。 このプラスミドには、 哺乳動物細胞での発現のための CMVプロモーターお よび大腸菌内での発現のための T7プロモーターによって、 変異型 HygEGFP遺伝 子が支配されているため、 修復反応が成功したとき両細胞から EGFPの蛍光が観 察される （図 2 )。 さらに、 ハイグロマイシン Bに耐性となるため、 修復された 遺伝子を容易に単離することができる （図 3 )。
(2-2) 遺伝子修復反応
CH0-K1細胞に、 X ol処理して得られた DNA断片と共に、 標的である pTENHEX を導入した。 このとき、 dsHESは二本鎖であるため、 これまでの SFH 法と同様、 細胞へ導入する直前に熱変性した。 また f AntiSおよび f Senseは一本鎖 DNAで はあるが、 分子内高次構造を解き、 また dsHESと比較を行うために、 dsHESと同 様に熱変性処理を行い細胞内へ導入した。導入開始から 4 8時間後に細胞を蛍光 顕微鏡で観察したところ、 CH0-K1細胞内で修復された HygEGFP遺伝子が発現して いるのが観察された（図 2 )。 これらの細胞よりプラスミドを回収し、 BL21 (DE3) へ形質転換することにより得られるハイグロマイシン B耐性かつ EGFP陽性のコ ロニー （図 3 ) を確認し、 遺伝子修復効率を算出した。 pTENHEXに対し 400倍の モル比に相当する 10皿 ol の DNA断片を処理したとき、 二本鎖 DNA断片である dsHESでは、 0. 43%といった従来の SFHR法と同等の修復効率であった （図 4)。 これに対し、 一本鎖 DM断片である f AntiSは、 dsHESを越える遺伝子修復効率 は示さなかったものの（0. 15%)、 f Senseを処理した場合、 2. 0%という、 dsHES に対して約 5倍高い遺伝子修復効率を示した （図 4)。
この解析によって得られた EGFP陽性コロニーをいくつか選ぴ、 その遺伝子配 列を制限酵素 PmaCI (図 5 ) およびシークェンシング反応 （図 6 ) によって確認 した。 その結果、 コドン 34における Stopから Ser (TGA—TCA) への配列変換が 確認された。 また、 その他の配列変換は観察されなかったことより、 この方法に おける配列特異性が確認された。 比較例
実施例で使用した PTENHEX (コドン 34 に終止変異 （Stop: TGA) を導入した HygEGFP遺伝子を保有するプラスミド DNA) に対して、 PCR産物を用いた従来の SFHR法を行い、 変異 HygEGFP遺伝子の修復効率を実施例と同様に検討した。
PCR産物 (pcrHES)は、以下のプライマ一 1と TaQポリメラーゼ（Toyobo社製） を用いて増幅し、 3' -末端を Blunt ing High Kit (Toyobo社製） により平滑末端 化し、 実施例の dsHESと同様にして 3. 5%低融点ァガロース電気泳動により生成 した。
•プライマ一 1： 5' -gagatccccggagccg-3' (SEQ ID No. 10)
•プライマー 2： 5' - gaggtgccggacUcgg-3' (SEQ ID No. 11)
結果は、 図 3および図 4に示したとおりである。 PCR産物 （pcrHES) は、 一本 鎖センス DNA断片（fSense) と比較して細胞のハイグロマイシン B iHfe形質の獲 得効果が低く （図 3 )、 変換効率は 0. 16%であった。 この値は dsHESの変換効率 (0. 43%) の半分以下であり、 また、 一本鎖センス DNA断片 （fSense) の変換効 率 （2. 0%) の 10分の 1以下であった。 産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 細胞内 DNA配列の特定 塩基または塩基配列を高効率で他の塩基、 または、 塩基配列に変換する方法が提 供される。 これによつて、 疾患遺伝子等の変異箇所を効率よく修復することが可 能となる。

Claims

請求の範囲
1 . 細胞内の標的 DNA配列の 1または複数個の塩基を変換する方法であって、 標的 DM配列と相同であり、 かつ、 変換すべき塩基を含む、 一本鎖環状 MAから 調製される 300~3， 000塩基の一本鎖 DNA断片を細胞内に導入することを特徴と する DM配列の塩基変換方法。
2 . 一本鎖環状 DNAが、 ファージミド DNAである請求項 1の方法。
3. 一本鎖 DM断片が、標的 DNA配列のセンス鎖と相同である請求項 1または 2の方法。
4. 細胞内の標的 DM配列が、 その 1または複数個の塩基によって疾患の原因 となっている DNA配列である請求項 1から 3のいずれかの方法。
5. 生物体内細胞の標的 DNA配列の 1または複数個の塩基を変換する請求項 1 から 4のいずれかの方法。
6. 請求項 1から 5のいずれかの方法によって、 標的 DNA配列の 1または複数 個の塩基が変換された細胞。
7 . 請求項 6の細胞を体内に保有する生物個体。
8. 標的 DNA配列の 1または複数個の塩基の変換が原因となっている疾患を治 療するための薬剤であって、 標的 DNA配列に相補的であり、 かつ、 変換すべき塩 基を含む、 一本鎖環状 DMから調製される 300~3，000塩基の一本鎖 DNA断片が 細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする治療薬剤。
9. 一本鎖環状 DNAが、 ファージミド DNAである請求項 8の治療薬剤。
1 0. 標的 DNA配列の 1または複数個の塩基の変換が原因となっている疾患を 治療する方法であって、 標的 DNA配列に相補的であり、 かつ、 変換すべき塩基を 含む、 一本鎖環状 DNAから調製される 300〜3, 000塩基の一本鎖 DNA断片を細胞 内に導入することを特徴とする治療方法。
1 1 . 一本鎖環状 DNAが、 ファージミド DMである請求項 1 0の治療方法。
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