WO2005087795A1 - Péptidos como portadores penetrantes de células - Google Patents

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Ernest GIRALT LLEDÓ
Jimena FERNÁNDEZ CARNEADO
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Universitat de Barcelona UB
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    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • This invention is related to the fields of medicine, research, diagnosis, and cosmetics, and specifically with new peptides as penetrating carriers of cells for the administration of compounds to cells.
  • the poor permeability of the cell membrane to external agents is a significant limitation in research and particularly in medicine in the development of many drugs.
  • the efficient cellular internalization of many chemical agents is still a challenge.
  • a first approach involves the use of penetration promoters such as chelating agents, surfactants and non-surfactants, bile salts and fatty acids, which have good penetration effects but also safety problems.
  • a second approach involves the use of technologies based on liposomes, viral vectors and microinjection, but they still have little success.
  • the inventors provide a new family of peptides that have the ability to pass through cell membranes and, therefore, to act as penetrating carriers of drug cells and / or other molecules.
  • these peptides have a high penetration efficiency and have no cytotoxic effects at high concentrations.
  • one aspect of the present invention is related to compounds of formula (I) or their pharmaceutically or biologically acceptable salts, where Val is L-Val or D-Val; Arg is L-Arg, D-Arg or L- (N-methyl) Arg; Pro is L-Pro or D-Pro; Leu is L-Leu or D-Leu; x is an integer from 1 to 20; Li and L 2 are chemical connectors, which are identical or different, present or absent; Mi and M 2 are pharmaceutically and / or biologically active groups, which are identical or different, present or absent; and the link between L
  • N-methylation in (N-methyl) Arg occurs in the amino group of the skeleton of the amino acid Arg, not in the amino group of the side chain.
  • the amino acids that make up the peptide sequence may have an L or D configuration. Synthesis with amino acids of a D configuration is more expensive but is useful for preventing degradation of the peptide by proteases.
  • the inclusion of at least one amino acid the D in the peptide sequence is sufficient to achieve resistance 'to proteases and, consequently, for the peptides used in medical applications.
  • the compounds of the invention can be synthesized using eg solid phase, liquid phase, or combined synthesis techniques, as is known to one skilled in the art.
  • the peptides can be synthesized from a nucleic acid encoding the peptide. This nucleic acid can be introduced into a cellular system and expressed to produce large-scale amounts of the peptide.
  • the compounds according to the present invention represented by the formula (I) can also be obtained by known methods in the form of their pharmaceutically and / or biologically acceptable salts, such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt and salts of addition with acids.
  • salts of inorganic acids eg hydrochloric acid, sulfuric acid and phosphoric acid
  • organic acids eg acetic acid, propionic acid, citric acid, tartaric acid, malic acid and acid methanesulfonic acid
  • the chemical connectors included in formula (I) can be chains aliphatic (eg amino acids and polyethylene glycol) or aromatic chains.
  • the connectors are independently selected from peptide sequences of up to 10 amino acid residues.
  • a wide range of groups having pharmaceutical and / or biological activity can be included in formula (I).
  • the groups can be pharmaceutical active ingredients, nucleic acids (eg oligonucleotides, double stranded DNA, single stranded DNA, circular DNA, RNA and signal interference RNA - "signal interfering", siRNA -), peptide nucleic acids ("PNAs"), nanoparticles, antibodies and markers or probes both radioactive and fluorescent (eg carboxyfluorescein and derivatives, lucifer yellow, rhodamine and texas red).
  • the groups can also be peptides, proteins, carbohydrates, lipids or sterols. Examples of pharmaceutical active ingredients are dopamine, doxorubicin, daunomycin, paclitaxel and therapeutic peptides and proteins.
  • a composition for administration in cells may comprise more than one type of molecule, for example, two different DNA sequences.
  • the link between Li and Mi and the link between L 2 and M 2 can be of any of the known chemical natures, depending on the nature of L
  • the parameter x of the formula (I) is from 1 to 10, more specifically from 1 to 3, and preferably 3.
  • Li, L 2 , Mi and M 2 are all absent and , consequently, the compound of formula (I) is (Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro) x , where x is preferably 3.
  • the compounds have a sequence selected from the group formed by SEQ ID NO : 1-6.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the peptides of the present invention as penetrating cell carriers.
  • the peptides of the present invention have many advantages, including their non-viral origin, their amphipathic character, their water solubility and the absence of an effect. cytotoxic at high concentrations (more than 1000 ⁇ M). Other peptides such as Antp or Tat are cytotoxic at concentrations of 50 ⁇ M.
  • carrier here means any substance used to support or transport another substance.
  • 5 (6) -carboxyfluorescein is used as a group to illustrate the potential of the new peptides to act as penetrating carriers of cells.
  • 5 (6) -carboxyfluorescein is administered to the human HeLa cell line.
  • the peptides of the invention are useful for other types of eukaryotic cells and also for prokaryotic cells.
  • the cell-penetrating carriers of the invention are usable to act as transfection agents.
  • transfection here means the process of inserting foreign DNA into a culture of eukaryotic cells by exposing them to naked DNA (analogous to transformation into prokaryotic cells).
  • compositions comprising a therapeutically effective amount of a compound of the invention, together with appropriate amounts of pharmaceutical excipients.
  • the invention provides cosmetic compositions comprising a cosmetically effective amount of a compound of the invention, together with appropriate amounts of cosmetic excipients.
  • the invention involves the use of a single peptide or a mixture. The person skilled in the art will choose the appropriate administration routes for these compositions, for example oral, parenteral, nasal or topical.
  • FIG. 2. shows the results of the experiment in a fluorescence reader with microplates.
  • F means "fluorescence emission” in fluorescence units.
  • FIG. 2A represents the fluorescence emitted after incubating HeLa cells for 3h with
  • FIG. 2B is a comparative representation of emitted fluorescence obtained after incubating HeLa cells for 1 h at 37 ° C with several carboxyfluoresceinated peptides at different concentrations in a range of 5 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • FIG. 3 shows the results of the HeLa viability and proliferation experiment.
  • CV means "cell viability" in%.
  • cell viability was quantified by MTT treatment, after incubating the 24h HeLa cells with the CF- peptide (Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro) 3 at high concentrations ranging from 50 to 1000 ⁇ M.
  • FIG. 3B the viability of HeLa was quantified by treatment with MTT, after incubating the cells for 24h with CF-Tat-NH 2 and CF-Antp-NH 2 in a series of concentrations of 50 to 1000 ⁇ M.
  • Fmoc-protected amino acids were purchased from Advanced Chem Tech. 2-Chlorotrityl resin was purchased from CBL Pairas.
  • Coupling reagents 7-azabenzotriazol-1-yloxytris (pyrrolidino) phosphonium hexafluorophosphate (PyAOP) was obtained from Applied Biosystems, rink amide MBHA resin and benzotriazol-1-yloxytrisium (pyrrolidine) acquired hexafluorophosphate (pyrrolidine) from Novabiochem, 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) was obtained from GL Biochem, 2- (1 H-benzotriazol-1-yl) -1, 1, 3,3-tetramethyluronium (TBTU) tetrafluoroborate and
  • Hydroxybenzotriazole was purchased from Albatros Chem Inc. Solvents: trifluoroacetic acid (TFA), piperidine, dimethylformamide (DMF), dichloromethane (DCM) and acetonitrile were purchased from SDS. 5 (6) -carboxyfluorescein (CF) was purchased from Acros. Diisopropylcarbodimide (DIC) and N, N-diisopropylethylamine (DIEA) were purchased from Merck. Triisopropylsilane (TIS) was purchased from Fluka.
  • Peptides were synthesized following standard solid phase peptide synthesis protocols using the 9-fluorenylmethoxycarbonyl / tert-butyl (Fmoc / tBu) strategy.
  • the 2-chlorotrityl resin, N-Fmoc-protected amino acids (2 eq) / TBTU (2 eq) or PyBOP (2 eq) and DIEA (6 eq) were used.
  • protective groups for the side chains of Arg and His the
  • the labeled peptides were cleaved from the resin with a 1% TFA treatment in DCM for 5 min and the peptides (Val-X-Leu-Pro-Pro-Pro) n or CF- (Val-X-Leu-Pro -Pro-Pro) n (X is Arg or His) were obtained after treating the peptide-resin with 95% TFA, 2.5% TIS and 2.5% water for 1 h or 2 h depending on the protective group used for the side chains. A similar protocol was followed to obtain CF-Tat-NH 2 or CF-Antp-NH 2 .
  • the final products were characterized by MALDI-TOF mass spectrometry (Vogayer-DE RP MALDI-TOF, PE Biosystems with a N 2 laser of 337 nm).
  • the comparative properties of labeled peptides to cross the cell membrane with the human HeLa cell line were studied. First, the degree of internalization n of the monomers, dimers and trimers at a concentration of 50 ⁇ M in HeLa cells was quantified using an experiment with a fluorescence reader for microplates. A dose-response analysis was then performed, incubating HeLa cells with the peptides at different concentrations. The cellular internalization of the new peptides was also studied by confocal laser scanning microscopy ("confocal laser scanning microscopy", CLS).
  • HeLa cells were purchased from ATCC. They were stored in DMEM culture medium (1000 mg / ml glucose) (Biological Industries) with 10% fetal calf serum ("Fetal Calf Serum", FCS), 2 mM glutamine, 50 u / ml penicillin and 0.05 g / ml streptomycin.
  • DMEM culture medium 1000 mg / ml glucose
  • FCS fetal calf serum
  • FCS fetal calf serum
  • 2 mM glutamine 50 u / ml penicillin
  • 0.05 g / ml streptomycin fetal calf serum
  • the experiments were performed 24 hours later, when the confluence was approximately 60-70%.
  • the carboxyfluoresceinated compounds were dissolved in PBS and sterilized with 0.22 ⁇ m filters (Millex-GV, PVDF, Durapore, Millipore).
  • the initial solutions of peptides and 5 (6) -carboxyfluorescein were diluted in culture medium.
  • the non-adhered cells were removed in the washes and the adhered cells were incubated at 37 ° C in a C0 2 atmosphere in DMEM medium with a known concentration of peptide for 3h.
  • the cells were washed three times with PBS with 1.1 mM CaCI 2 and 1.3 mM MgCl 2 and the images were taken using a 60X / 1.4 NA objective in an Olympus Fluoview confocal microscope for the next 30 min .
  • the carboxyfluorescein fluorescence was excited with the 488-nm line of an argon laser and its emission was detected in a range of 515-530 nm.
  • the microscope parameters remained identical for each peptide and dose.
  • the confocal microscopy images revealed an intracellular vesicular distribution of the fluorescent peptides.
  • the carboxyfluoresceinated peptides were located within the cells and were not adhered to the cell membrane.
  • the influence of the fixation stage was examined with a solution of 3% p-formaldehyde, since the pre-observation fixation stage under a microscope could lead to the presence of artifacts at the entrance or could change the location of the molecule carrier A cytoplasmic dotted distribution outside the nucleus was observed in vivo and in fixed cells. Fixation with p-formaldehyde did not influence the entry into HeLa cells and did not modify the location of the carrier peptides.
  • a triplicate of each peptide or carboxyfluorescein concentration was performed and the fluorescence emitted by the targets (cells with culture medium and without peptides) was subtracted. The experiment was reproduced three times.
  • FIG. 2A cells incubated with CF- (Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro) 3 showed a higher fluorescence intensity.
  • the nature of the hydrophilic residues and specifically the length of the peptide was shown to have a pronounced effect on internalization (FIG. 2B).
  • the cells were incubated for 3h or 24h at 37 ° C under 5% CO 2 atmosphere - MTT was added 2h before the final incubation time, that is, after 1h for 3h incubation and after 22h for the incubation time of 24h in a final concentration per well of 0.5 mg / ml.
  • the CF- (Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro) 3 peptide was not cytotoxic after a 24h incubation with HeLa cells at concentrations up to 1000 ⁇ M, which highlights its potential as a carrier (FIG. 3A) .
  • Comparative cytotoxicity studies were performed with other known cell penetrating peptides.
  • CF-Tat-NH 2 and CF-Antp-NH 2 were cytotoxic at relatively low concentrations. At the concentration used in internalization studies, that is to say 50 ⁇ M, CF-Tat-NH 2 reduced cell viability up to 64% and CF-Antp up to 75% (FIG. 3B).
  • the viability of HeLa cells was dramatically reduced in the presence of CF-Tat-NH 2 or CF-Antp-NH 2 at higher concentrations (eg at 40% and 11% respectively at 500 ⁇ M).
  • the degree of internalization of CF- (Val-Arg-Leu-Pro-Pro) 3 was respectively 15 or 20 times lower, however the latter presented absence of cytotoxicity.

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Abstract

Los compuestos de fórmula (I) o sus sales farmacéutica o biológicamente aceptables son útiles como portadores penetrantes de células. Según la fórmula (I), Val es L-Val o D-Val; Arg es L-Arg, D-Arg o L-(N-metil)Arg; Pro es L-Pro o D-Pro; Leu es L-Leu o D-Leu; x es un entero del 1 al 20, preferiblemente 3; L1 y L2 son conectores químicos; M1 y M2 son grupos farmacéutica y/o biológicamente activos; y el enlace entre L1 y M1 y el enlace entre L2 y M2 son de cualquiera de las naturalezas químicas conocidas, incluyendo covalente e iónica. Comparados con otros péptidos portadores descritos previamente, esta nueva familia presenta muchas ventajas, incluyendo su origen no viral, su carácter anfipático, su solubilidad en agua y la absencia de un efecto citotóxico a concentraciones elevadas. M1-L1-(Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro)x-L2-M2 (I)

Description

Péptidos como portadores penetrantes de células
Esta invención está relacionada con los campos de la medicina, la investigación, el diagnóstico, y la cosmética, y específicamente con nuevos péptidos como portadores penetrantes de células para la administración de compuestos a las células.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La pobre permeabilidad de la membrana celular a agentes externos es una limitación significativa en investigación y particularmente en medicina en el desarrollo de muchos fármacos. La eficiente internalización celular de muchos agentes químicos es todavía un reto.
La investigación en este campo ha tomado varias aproximaciones. Una primera aproximación conlleva el uso de promotores de penetración como agentes quelatadores, tensioactivos y no tensioactivos, sales biliares y ácidos grasos, que tienen buenos efectos en la penetración pero también problemas de seguridad. Una segunda aproximación conlleva el uso de tecnologías basadas en los liposomas, los vectores virales y la microinyección, pero todavía tienen poco éxito.
La capacidad de ciertos péptidos para atravesar membranas celulares es de interés en este campo. Recientemente, este interés ha conducido a un rápido desarrollo de péptidos portadores para la administración de fármacos antitumorales, antivirales o antibióticos, que de otra manera serían incapaces de atravesar la membrana celular y alcanzar su diana terapéutica. El uso de péptidos portadores tiene la ventaja de permitir una síntesis accesible y una elevada flexibilidad para la modificación cuando se unen péptidos o moléculas pequeñas de fármaco como cargas. Se ha demostrado la capacidad de una gran variedad de péptidos cortos para actuar como portadores para la administración de otros péptidos, proteínas u oligonucleótidos dentro de la célula. Los ejemplos más destacados son la calcitonina humana (hCT), los fragmentos de dominios de transducción de proteínas como el VP22 (cfr. S.R. Schwarze et al., "Protein transduction: unrestricted delivery into all cells?", Trend in Cell Biol. 2000. vol. 10, pp. 290-5), el transactivador VIH de transcripción, también conocido como "Tat" (cfr. M. Silhol et al., "Different mechanisms for cellular internalization of the HIV-1 Tat-derived cell penetrating peptide and recombinant proteins fused to Tat", Eur. J. Biochem. 2002, vol. 269, pp. 494-501) o la Antennapedia, también conocida como "Antp" (cfr. D.J. Dunican et. al., "Designing cell-permeant phosphopeptides to modulate intracellular signaling pathways", Biopolvmers Pept. Sci. 2001 , vol. 60, pp. 45-60), péptidos ricos en arginina (cfr. J.B. Rothbard et al., "Arginine-rich molecular transporters for drug delivery: role of backbone spacing in cellular uotake". J. Med. Chem. 2002. vol. 45, pp. 3612-18; N. Emi et al., "Gene transfer mediated by polyarginine requires a formation of big carrier-complex of DNA aggregate", Biochem. and Biophvs. Res. Commun. 1997, vol 231 , pp. 421-4), β-péptidos, peptoides y loligómeros (péptidos ramificados ricos en Lys). Se ha demostrado que todos estos péptidos penetrantes de células son valiosos en la administración de cargas biológicamente activas al citoplasma y al núcleo. Sin embargo, el principal incoveniente de estos péptidos es que son citotóxicos a concentraciones moderadas y elevadas. Además, el manejo en el laboratorio asociado al uso de estos péptidos es difícil.
Hace varios años se sintetizaron péptidos de fórmula general (Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro)χ , (utilizando códigos de aminoácido de tres letras) con x = 2-8 utilizando una aproximación convergente en fase sólida (cfr. I.
Dalcol et al., "Convergent solid phase peptide synthesis: an efficient approach to the synthesis of highly repetitive domains", J. Oro. Chem. 1995, vol. 60, pp.
7575-81). Pero no se ha descrito la capacidad de estos péptidos para formar complejos con fármacos u otros compuestos y para actuar como portadores capaces de translocar estos compuestos.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores proporcionan una nueva familia de péptidos que tienen la capacidad de atravesar las membranas celulares y, por lo tanto, de actuar como portadores penetrantes de células de fármacos y/o otras moléculas. En particular, estos péptidos tienen una elevada eficiencia de penetración y no tienen efectos citotóxicos a concentraciones elevadas.
Así, un aspecto de la presente invención está relacionado con compuestos de fórmula (I) o sus sales farmacéutica o biológicamente aceptables, donde Val es L-Val o D-Val; Arg es L-Arg, D-Arg o L-(N-metil)Arg; Pro es L-Pro o D-Pro; Leu es L-Leu o D-Leu; x es un entero del 1 al 20; Li y L2 son conectores químicos, que son idénticos o diferentes, presentes o ausentes; Mi y M2 son grupos farmacéutica y/o biológicamente activos, que son idénticos o diferentes, presentes o ausentes; y el enlace entre L| y Mi y el enlace entre L2 y M2 son de cualquiera de las naturalezas químicas conocidas, incluyendo covalente e iónica.
MrL1-(Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro)χ-L2-M2 (I)
La N-metilación en (N-metil)Arg ocurre en el grupo amino del esqueleto del aminoácido Arg, no en el grupo amino de la cadena lateral. Los aminoácidos que componen la secuencia peptídica pueden tener configuración L o D. La síntesis con aminoácidos de configuración D es más cara pero es útil para evitar la degradación del péptido por proteasas. La inclusión de al menos un aminoácido D en la secuencia peptídica es suficiente para conseguir la resistencia'a las proteasas y, consiguientemente, para hacer a los péptidos utilizables en aplicaciones médicas.
Los compuestos de la invención pueden sintetizarse utilizando p.ej. las técnicas de síntesis en fase sólida, en fase líquida, o combinadas, como es conocido para un experto en la materia. Alternativamente, los péptidos pueden sintetizarse a partir de un ácido nucleico que codifique para el péptido. Este ácido nucleico puede introducirse en un sistema celular y expresarse para producir cantidades a gran escala del péptido.
Los compuestos según la presente invención representados por la fórmula (I) también pueden obtenerse por métodos conocidos en forma de sus sales farmacéutica y/o biológicamente aceptables, como la sal sódica, la sal potásica, la sal calcica, la sal magnésica y sales de adición con ácidos.
Ejemplos de las últimas sales incluyen las sales de ácidos inorgánicos (p.ej. ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico) y de ácidos orgánicos (p.ej. ácido acético, ácido propiónico, ácido cítrico, ácido tartárico, acidó málico y ácido metanosulfónico).
Los conectores químicos incluidos en la fórmula (I) pueden ser cadenas alifáticas (p.ej. aminoácidos y polietilenglicol) o cadenas aromáticas. En una realización particular de la invención los conectores se seleccionan independientemente de secuencias de péptidos de hasta 10 residuos de aminoácidos. Se puede incluir en la fórmula (I) una gran gama de grupos que tienen acitividad farmacéutica y/o biológica. Los grupos pueden ser principios activos farmacéuticos, ácidos nucleicos (p.ej. oligonucleótidos, ADN de cadena doble, ADN de cadena simple, ADN circular, ARN y ARN de interferencia de señal - "signal interfering", siRNA -), ácidos nucleicos peptídicos ("PNAs"), nanopartículas, anticuerpos y marcadores o sondas ambos radioactivos y fluorescentes (p.ej. carboxifluoresceína y derivados, amarillo lucifer, rodamina y rojo texas). Los grupos también pueden ser péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos o esteróles. Ejemplos de principios activos farmacéuticos son la dopamina, la doxorubicina, la daunomicina, el paclitaxel y péptidos y proteínas terapéuticas. Una composición para la administración en células puede comprender más de un tipo de molécula, por ejemplo, dos secuencias de ADN diferentes.
Es bien conocido para aquellos expertos en la materia el cómo unir químicamente un péptido a un grupo y/o a un conector. Así, el enlace entre Li y Mi y el enlace entre L2 y M2 puede ser de cualquiera de las naturalezas químicas conocidas, dependiendo de la naturaleza de L|, L2, Mi, M2 y de la naturaleza del péptido, incluyendo los enlaces covalente e iónico. Es importante que el enlace químico seleccionado mantenga la actividad del correspondiente grupo.
En una realización de la invención, el parámetro x de la fórmula (I) es del 1 al 10, más específicamente del 1 al 3, y preferiblemente 3. En otra realización, L-i, L2, Mi y M2 están todos ausentes y, consecuentemente, el compuesto de fórmula (I) es (Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro)x , donde x es preferiblemente 3. En una realización particular, los compuestos tienen una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 1-6.
Otro aspecto de la invención se relaciona con el uso de los péptidos de la presente invención como portadores penetrantes de células. Comparados con otros péptidos portadores descritos previamente, los péptidos de la presente invención tienen muchas ventajas, incluyendo su origen no viral, su carácter anfipático, su solubilidad en agua y la absencia de un efecto citotóxico a concentraciones elevadas (más de 1000 μM). Otros péptidos como Antp o Tat son citotóxicos a concentraciones de 50 μM.
El término "portador" ("carrier") significa aquí cualquier sustancia utilizada para soportar o transportar otra sustancia. En esta invención, la
5(6)-carboxifluoresceína se utiliza como grupo para ilustrar el potencial de los nuevos péptidos para actuar como portadores penetrantes de células. En «I ejemplo específico incluido, la 5(6)-carboxifluoresceína se administra a la línea celular humana HeLa. Sin embargo, los péptidos de la invención son útiles para otros tipos de células eucariotas y también para células procariotas. En una aplicación particular, los portadores penetrantes de células de la invención son utilizables para actuar como agentes de transfección. El término "transfección" significa aquí el proceso de insertar ADN extraño en un cultivo de células eucariotas exponiéndolas a ADN desnudo (análogo a la transformación en células procariotas).
Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención, junto con cantidades apropiadas de excipientes farmacéuticos. Y de la misma manera, la invención proporciona composiciones cosméticas que comprenden una cantidad cosméticamente efectiva de un compuesto de la invención, junto con cantidades apropiadas de excipientes cosméticos. La invención conlleva el uso de un solo péptido o una mezcla. El experto en la materia escogerá las vías de administración apropiadas para estas composiciones, por ejemplo oral, parenteral, nasal o tópica.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes realizaciones particulares, los dibujos y la lista de secuencias se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1. muestra un esquema de la síntesis y la reacción de carboxifluoresceinación en soporte sólido (resina = resina 2-clorotritilo); a) 5(6)-carboxifluoresceína (5 eq), PyAOP (5 eq), HOAt (5 eq), DIEA (10 eq), DMF, 1 h 30 min, t.a., b) 95% TFA, 2.5% TIS, 2.5% agua (15 min-1 h 30 min). R significa "resina".
La FIG. 2. muestra los resultados del experimento en un lector de fluorescencia con microplacas. F significa "emisión de fluorescencia" en unidades de fluorescencia. La FIG. 2A representa la fluorescencia emitida después de incubar células HeLa durante 3h con
CF-(Val-X-Leu-Pro-Pro-Pro)n con X = Arg e His y n = 1 -3 a una concentración
50 μM. La FIG. 2B es una representación comparativa de fluorescencia emitida obtenida después de incubar células HeLa durante 1 h a 37 °C con varios péptidos carboxifluoresceinados a diferentes concentraciones en un rango de 5 μM a 50 μM.
La FIG. 3 muestra los resultados del experimento de viabilidad y proliferación de HeLa. CV significa "viabilidad celular" en %. En la FIG. 3A la viabilidad celular fue cuantificada por tratamiento con MTT, después de incubar las células HeLa curante 24h con el péptido CF-(Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro)3 a altas concentraciones que variaban de 50 a 1000 μM. En la FIG. 3B la viabilidad de HeLa fue cuantificada por tratamiento con MTT, después de incubar las células durante 24h con CF-Tat-NH2 y CF-Antp-NH2 en una serie de concentraciones de 50 a 1000 μM.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
Síntesis peptídica
Los péptidos basados en (Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro) se sintetizaron para ser comparados con los péptidos basados en (Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro). Se realizó la síntesis de (Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro)n y (Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro)n, donde n = 1-3, mediante síntesis peptídica en fase sólida en una resina 2-clorotritilo. Este soporte evita la reacción secundaria de formación de dicetopiperacina PP. El compuesto 5(6)-carboxifluoresceína (CF) se utilizó para la síntesis de los péptidos marcados fluorescentemente necesarios en estudios de internalización en células.
Figure imgf000008_0001
5(6)-carboxifluoresceína (CF)
Materiales: Los aminoácidos Fmoc-protegidos se adquirieron de Advanced Chem Tech. La resina 2-clorotritilo se compró a CBL Pairas. Reactivos de acoplamiento: el hexafluorofosfato de 7-azabenzotriazol-1-iloxitris(pirrolidino)fosfonio (PyAOP) se obtuvo de Applied Biosystems, la resina rink amide MBHA y el hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(pirrolidino)fosfonio (PyBOP) se adquirieron de Novabiochem, el 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) se obtuvo de GL Biochem, el tetrafluoroborato de 2-(1 H-benzotriazol-1-yl)-1 ,1 ,3,3-tetrametiluronio (TBTU) y el
1 -hidroxibenzotriazol (HOBt) se adquirieron de Albatros Chem Inc. Disolventes: el ácido trifluoroacético (TFA), la piperidina, la dimetilformamida (DMF), el diclorometano (DCM) y el acetonitrilo se compraron a SDS. La 5(6)-carboxifluoresceína (CF) se adquirió de Acros. La diisopropilcarbodimida (DIC) y la N,N-diisopropiletilamina (DIEA) se adquirieron de Merck. El triisopropilsilano (TIS) se adquirió de Fluka.
Los péptidos fueron sintetizados siguiendo protocolos estándares de síntesis peptídica en fase sólida utilizando la estrategia 9-fluorenilmetoxicarbonil/tert-butil (Fmoc/tBu). Se utilizaron la resina 2- clorotritilo, los aminoácidos N -Fmoc-protegidos (2 eq)/TBTU (2 eq) o el PyBOP (2 eq) y la DIEA (6 eq). Las síntesis de (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)-NH2 (Tat) y (Arg-Gln-lle-Lys-lle-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys)-NH2 (Antp) se realizaron automáticamente en un sintetizador peptídico Applied Biosystems 433A. Se utilizaron la resina rink amide MBHA (0.1 mmol, 128 mg, funcionalización inicial de la resina = 0.78 mmol/g), los aminoácidos Nα-Fmoc-protegidos (10 eq), TBTU/HOBt 0.45 M y la DIEA 2 M en NMP en las reacciones de condensación. Como grupos protectores para las cadenas laterales de Arg e His, se eligieron el
2,2,4,6, 7-pentametildihidrobenzofuran-5'Sulfonil (Pbf) y el tert-butiloxicarbonil (Boc). La escisión del grupo protector Fmoc se llevó a cabo por tratamiento con una solución de 20% de piperidina en DMF (2 x 10 min).
Se disolvieron en DMF/DCM 9/1 , la 5(6)-carboxyfluoresceína (CF) (5 eq), el PyAOP (5 eq), el HOAt (5 eq) y la DIEA (10 eq) en DMF, preactivados durante 10 min y después añadidos a la péptido-resina y agitados durante 1 h 30 min. Los péptidos marcados fueron escindidos de la resina con un tratamiento con un 1 % de TFA en DCM durante 5 min y los péptidos (Val-X-Leu-Pro-Pro-Pro)n o CF-(Val-X-Leu-Pro-Pro-Pro)n (X es Arg o His) fueron obtenidos después de tratar la péptido-resina con un 95% de TFA, un 2.5% de TIS y un 2.5% de agua durante 1 h o 2h dependiendo del grupo protector utilizado para las cadenas laterales. Se siguió un protocolo similar para obtener CF-Tat-NH2 o CF-Antp-NH2.
Caracterización de los péptidos: Los péptidos marcados fueron identificados a una λ = 443 nm en un RP-HPLC analítico [aparato detector fotodiode Waters 996 equipado con un módulo de separación Waters 2695, una columna Symmetry® (C18, 5 μm, 4.6 x 150 mm) y el programa de cromatografía Millenium manager; flujo = 1 ml/min; gradiente = 5-100% B en 15 min (B = 0.036% TFA en acetonitrilo)]. Los péptidos carboxifluoresceinados fueron purificados en un RP-HPLC semipreparativo [detector de absorbancia dual λ Waters 2487 equipado con un Waters 2700, un controlador Waters 600, un colector de fracciones Waters, una columna Symmetry® (C18, 5 μm, 30 x 100 mm) y el programa de cromatografía Millenium manager; flujo = 10 ml/min; gradiente = 5-20% D en 5 min; 20-70% D en 30 min; 70-100% D en 5 min (D = 0.1% TFA en acetonitrilo)]. Los productos finales fueron caracterizados por espectrometría de masas MALDI-TOF (Vogayer-DE RP MALDI-TOF, PE Biosystems con un láser de N2 de 337 nm). La combinación de los valores experimentales de absorción de los diferentes péptidos carboxifluoresceinados obtenidos por UV a 490 y 443 nm y el análisis de los aminoácidos permitió obtener la concentración exacta para cada muestra (cf. TABLE 1).
Cultivo de células v tratamientos peptídicos
Se estudiaron las propiedades comparativas de los péptidos marcados para atravesar la membrana celular con la línea celular humana HeLa. En primer lugar, se cuantificó el grado de internalizado n de los monómeros, dímeros y trímeros a una concentración de 50 μM en células HeLa utilizando un experimento con un lector de fluorescencia para microplacas. Después se realizó un análisis dosis-respuesta, incubando células HeLa con los péptidos a diferentes concentraciones. La internalización celular de los nuevos péptidos fue también estudiada por microscopía de barrido láser confocal ("confocal láser scanning microscopy", CLS ).
Las células HeLa se adquirieron de ATCC. Se conservaron en medio de cultivo DMEM (1000 mg/ml glucosa) (Biological Industries) con un 10% de suero fetal de ternero ("Fetal Calf Serum", FCS), 2 mM de glutamina, 50 u/ml de penicilina y 0.05 g/ml de estreptomicina. Para los experimentos de microscopía confocal, se despegaron células HeLa exponencialmente crecientes de las botellas de cultivo utilizando una solución de tripsina-0.25% EDTA y la suspensión de células fue sembrada en una concentración de 21.4 x 103 células/cm2 sobre cubres de vidrio, o en portas de vidrio divididos en 8- pozos Lab-Teck™ o en placas de 96-pocilIos (Nalge Nunc International). Los experimentos fueron realizados 24h después, cuando la confluencia era de aproximadamente 60-70%. Se disolvieron los compuestos carboxifluoresceinados en PBS y esterilizados con filtros de 0.22 μm (Millex-GV, PVDF, Durapore, Millipore). La disoluciones iniciales de péptidos y de 5(6)-carboxifluoresceína se diluyeron en medio de cultivo. Las células no adheridas fueron eliminadas en los lavados y las células adheridas fueron incubadas a 37 °C en una atmósfera de C02 en medio DMEM con una concentración conocida de péptido durante 3h.
Microscopía confocal de barrido láser confocal (CLSM)
Después de 3h de incubación a 37 °C de las células HeLa con 5(6)-carboxifluoresceína (como control negativo) o con los péptidos carboxifluoresceinados a una concentración de 50 μM, las células fueron lavadas tres veces con PBS y fijadas en una solución de 3% p-formaldehído durante 15 min. Las células se lavaron con PBS durante 5 min y montadas con medio de montaje Mowiol. La CLSM se realizó con un microscopio confocal Leica SP2. Las imágenes se tomaron utilizando un objetivo de inmersión de aceite 63X/1.3 NA. Como control de fijación, se realizaron experimentos similares con células sembradas en cámaras con el fondo de vidrio Lab-Tek™ para observaciones de células vivas. Después de una incubación de 3h, se lavaron las células tres veces con PBS con 1.1 mM de CaCI2 y 1.3 mM de MgCI2 y se tomaron las imágenes utilizando un objetivo 60X/1.4 NA en una microscopio confocal Olympus Fluoview durante los siguientes 30 min. En ambos microscopios confocales, la fluorescencia de la carboxifluoresceína fue excitada con la línea a 488-nm de un láser de argón y su emisión fue detectada en un rango de 515-530 nm. Los parámetros del microscopio se mantuvieron idénticos para cada péptido y dosis.
Las imágenes de microscopía confocal (imágenes no mostradas en esta descripción por la ausencia de color), revelaron una distribución vesicular intracelular de los péptidos fluorescentes. Los péptidos carboxifluoresceinados fueron localizados dentro de las células y no estaban adheridos a la membrana celular. Se examinó la influencia de la etapa de fijación con una solución de 3% de p-formaldehído, pues la etapa de fijación previa a la observación en un microscopio podría llevar a la presencia de artefactos en la entrada o podría cambiar la localización de la molécula portadora. Se observó in vivo y en células fijadas, una distribución punteada citoplásmica fuera del núcleo. La fijación con p-formaldehído no influenció en la entrada en células HeLa y no modificó la localización de los péptidos portadores.
Experimento con un lector de fluorescencia de microplacas
Para cada experimento, se sembraron y cultivaron 21.4 x 103 células/cm2 durante 24h. Después de una completa adhesión a la placa, se cambió el medio de cultivo. Las células fueron incubadas durante 1 h o 3h a 37 °C en atmósfera de CO2 con medio fresco con péptidos marcados con carboxifluoresceína o con carboxifluoresceína. Se lavaron las células con PBS. Las células se trataron con un tampón de lisis (0.1% de Tritón X-100 en 50 mM Tris, pH 8.5) durante 30 min. Las medidas de fluorescencia emitida se realizaron después de 30 min de incubación con el tampón de lisis en un lector de fluorescencia con microplacas FL600 (Bio-Tek). La fluorescencia se midió a una λeXc¡tac¡ón = 485/20 nm y una λem¡s¡ón = 530/25 nm. Se realizó un triplicado de cada concentración de péptido o carboxifluoresceína y se restó la fluorescencia emitida por los blancos (células con medio de cultivo y sin péptidos). El experimento se reprodució tres veces.
Como muestra la FIG. 2A, las células incubadas con CF-(Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro)3 presentaron un mayor intensidad de fluorescencia. La naturaleza de los residuos hidrofílicos y específicamente la longitud del péptido mostraron tener un pronunciado efecto en la internalización (FIG. 2B).
Ensayo de toxicidad peptídica (ensayo MTT)
La viabilidad y proliferación de las HeLa en presencia de los péptidos se estudiaron utilizando una prueba con bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (cfr. "MTT-cell proliferation assay" Cell Biology: A Laboratory Handbook, Academic Press, 1998, Second Ed. vol. 1 ; Y. Liu et al., "Mechanism of cellular
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction", J. Neurochem. 1997 vol. 69 pp. 581-93).
Para cada experimento se sembraron 7 x 103 células/cm2 en una placa de
96-pocillos (Nange Nunc) (100 μl/pocillo) e incubadas durante 24h. Para evitar saturación con el crecimiento celular, después de 24h de la incubación con el péptido, se utilizaron 7 x 103 células/cm2 en el experimento de proliferación (en vez de 21.4 x 103 células/cm2 sembradas en los experimentos previamente descritos). Después de una completa adhesión de las células a la placa, se aspiró el medio de cultivo. Los péptidos fueron añadidos en concentraciones crecientes de 50, 100, 500, y 1000 μM. Las células se incubaron durante 3h o 24h a 37 °C en atmósfera del 5% de CO2- El MTT fue añadido 2h antes del tiempo de incubación final, es decir, después de 1 h para las 3h de incubación y después de 22h para el tiempo de incubación de 24h en una concentración final por pocilio de 0.5 mg/ml. Las células con péptidos y el MTT se incubaron durante 2h más y entonces se eliminó el medio aspirando. Se añadió ¡sopropanol para disolver el formazan, unos cristales azul oscuro observados en los pocilios. La absorbancia fue medida a una λ = 570 nm, 30 min después de la adición de isopropanol. La viabilidad celular se expresó como porcentaje de la fracción de células tratadas con péptido respecto a las no tratadas utilizadas como control.
El péptido CF-(Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro)3 no fue citotóxico después de una incubación de 24h con las células HeLa a concentraciones de hasta 1000 μM, lo cual destaca su potencial como portador (FIG. 3A). Se realizaron estudios de citotoxicidad comparativos con otros péptidos penetrantes de células ya conocidos. CF-Tat-NH2 y CF-Antp-NH2 fueron citotóxicos a concentraciones relativamente bajas. A la concentración utilizada en los estudios de internalización, es decir a 50 μM, CF-Tat-NH2 redució la viabilidad celular hasta un 64% y CF-Antp hasta un 75% (FIG. 3B). La viabilidad de las células HeLa se redujo dramáticamente en presencia de CF-Tat-NH2 o CF-Antp-NH2 a concentraciones mayores (p.ej. a 40% y 11% respectivamente a 500 μM). En comparación con CF-Tat-NH2 o CF-Antp-NH2, el grado de internalización de CF-(Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro)3 fue respectivamente 15 o 20 veces menor, sin embargo este último presentó ausencia de citotoxicidad.
TABLA 1. Características de los péptidos sintetizados. Todos los péptidos tienen aminoácidos con configuración L.
Figure imgf000014_0001

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula (I)
MrLr(Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro)x-L2-M2 (
o su sal farmacéutica o biológicamente aceptable, donde
Val es L-Val o D-Val; Arg es L-Arg, D-Arg o L-(N-metil)Arg;
Pro es L-Pro o D-Pro;
Leu es L-Leu o D-Leu; x es un entero del 1 al 20;
Li y L2 son conectores químicos, que son idénticos o diferentes, presentes o ausentes;
Mi y M2 son grupos farmacéutica y/o biológicamente activos, que son idénticos o diferentes, presentes o ausentes; y el enlace entre L| y Mi y el enlace entre L2 y M2 son de cualquiera de las naturalezas químicas conocidas, incluyendo covalente e iónica.
2. Compuesto según la reivindicación 1 , donde los conectores químicos se seleccionan independientemente de secuencias de péptidos de hasta 10 residuos de aminoácidos.
3. Compuesto según la reivindicación 1 , donde los grupos farmacéutica y/o biológicamente activos son principios activos farmacéuticos, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptídicos, péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, esteróles, nanopartículas, anticuerpos, marcadores o sondas.
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde x es del 1 al 10.
5. Compuesto según la reivindicación 4, donde x es del 1 al 3.
6. Compuesto según la reivindicación 5, donde x es 3.
7. Compuesto según la reivindicación 1 , donde L-i, L2, Mi y M2 están todos ausentes y, consecuentemente, el compuesto de fórmula (I) es (Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro )x .
8. Compuesto según la reivindicación 7, donde x es 3.
9. Compuesto según la reivindicación 7, que tiene una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 1-6.
10. Uso del compuesto definido en cualquiera de la reivindicaciones 7-9 como portador penetrante de células.
11. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, junto con cantidades apropiadas de excipientes farmacéuticos.
12. Composición cosmética que comprende una cantidad cosméticamente efectiva del compuesto definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, junto con cantidades apropiadas de excipientes cosméticos.
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