WO2005094783A2 - Serumstabile amphotere liposomen - Google Patents

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WO2005094783A2
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liposomal
formulation according
chol
molar composition
membrane
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Novosom AG
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    • Y10T428/2984—Microcapsule with fluid core [includes liposome]

Definitions

  • the invention relates to amphoteric liposomal formulations which show particular serum stability and are suitable for the intracellular delivery of oligonucleotides.
  • RNA short interfering ribonucleic acids
  • Another approach is to use a carrier that protects the siRNA from attack by enzymes and can transport it to the site of action.
  • Liposomes have been used as pharmaceutical carriers for drugs for some time.
  • Vdrformed liposomes and nucleic acids are also produced for the above-mentioned applications.
  • the complex formation or the mostly not stable in serum Liposomal formulations mean that the stability of the oligonucleotides is not guaranteed over a long period of time.
  • Amphoteric liposomes are a new class of liposomes that offer advantageous properties over conventional liposomes and purely cationic systems for intracellular delivery. Negatively charged active ingredients, such as the Nucleic acids can be effectively packed inside these liposomes, although the total charge of the liposomes remains negative at physiological pH. By changing the ambient pH, as occurs in the endosomal uptake of liposomes in cells, from neutral to slightly acidic, the charge of the amphoteric liposomes also changes from anionic to slightly cationic and the advantages of a cationic transfection reagent are exploited. These liposomes are described for the first time in WO 02/66012 A2. WO 02/66490 and WO 02/66489 (WO 03/070220 and WO 03/070735) present pH-sensitive lipids which are suitable for the construction of amphoteric liposomes.
  • amphoteric liposomes which enclose small oligonucleotides, such as siRNA and / or antisense molecules, in their interior and do not or only release a small part under serum conditions and are therefore suitable for parenteral administration ,
  • the invention solves the problem comprehensively by providing liposomal formulations with an aqueous interior
  • amphoteric lipids with a proportion of 5-30 mol%, or mixtures of cationic and anionic lipids with a total proportion of at most 50 mol%, the formulation as an active ingredient in the aqueous interior comprising at least one oligonucleotide.
  • the oligonucleotides relevant for this embodiment of the invention are composed of 5-100, preferably 5-40 and particularly preferably 10-25 nucleotides or base pairs.
  • the oligonucleotides can be present as a single strand (e.g. antisense oligonucleotides), as a double strand (e.g. small-interfering RNA, decoy-oligonucleotides) or in complex folds (e.g. aptamers, Spiegelmers, ribozymes).
  • oligonucleotides relevant to this invention are made up of deoxyribonucleotides or ribonucleotides and their chemically modified derivatives, such as phosphorothioate DNA (PS), 2'-O-methyl RNA (OMe), 2'-O-methoxy-ethyl RNA (MOE) , Peptide nucleic acid (PNA), N3'-P5 'Phosphoroamidate (NP), 2'-fluoro-arabino nucleic acid (FANA), Locked nucleic acid (LNA), Morpholino phosphoroamidate (MF), Cyclohexene nucleic acid (CeNA), Tricyclo-DNA (tcDNA)).
  • PS phosphorothioate DNA
  • OMe 2'-O-methyl RNA
  • MOE 2'-O-methoxy-ethyl RNA
  • PNA Peptide nucleic acid
  • NP N3'-P5 'Phosphor
  • aptamers or Spiegelmers are included in the liposomes.
  • Aptamers are DNA or RNA-based oligonucleotides with a complex three-dimensional structure. Due to this structure, aptamers can bind to protein targets in a very specific and highly affine manner and thus have a therapeutic, usually extracellular, effect. Their functionality is almost identical to that of monoclonal antibodies.
  • Spiegelmers are made up of L-ribose and L-2'-deoxyribose units. Just like aptamers, these mirror-image nucleic acids bind specifically to protein targets. Due to the chiral inversion, Spiegelmers, in contrast to conventional D-oligonucleotides, have increased stability against enzymatic degradation.
  • the basic structure of the amphoteric liposomes according to the invention is formed by neutral framework lipids which have a membrane share of 5 to 65 mol%, preferably 10 to 60 mol%.
  • Suitable lipids are phosphatidylcholines, such as DMPC, DPPC, DSPC, DOPC and POPC, which can be of synthetic as well as natural or semi-synthetic origin.
  • the liposomes according to the invention preferably have a content of 30 to 50 mol%, preferably 35 to 45 mol%, of cholesterol in the membrane.
  • lipids that can be used as charge carriers for amphoteric liposomes are derived from the basic chemical structure of cholesterol (for example the compounds disclosed in WO 02/66490 and WO 02/6648). Surprisingly, it was found that these cholesterol derivatives in general, especially MoChol, HisChol, Chems, HistChol, do not have the stabilizing effect of native cholesterol, so it is advantageous if the sum of all sterol-based lipids does not exceed 60 mol%.
  • amphoteric charge behavior can be formed in two ways: by using amphoteric lipids or by suitable mixtures of pH-sensitive cationic and anionic lipids, as are disclosed in WO 02/066012. If amphoteric lipids are used, the membrane part is between 5 and 30 mol%, more preferably between 5 and 20 mol%, in the case of mixtures the total charge carrier fraction is preferably not more than 50 mol%, more preferably between 15 and 45 mol%. In a preferred embodiment of the invention, amphoteric formulations are composed as follows:
  • - Cholesterol with 35 - 45 mo_% - amphoteric lipid, selected from the group HistChol, HistDG, isoHistSuccDG, Acylcamosin, HCChol with 5 - 20 mol%.
  • formulations are composed as follows: base lipid selected from the group DMPC, DPPC, DSPC with 10 to 50 mol%
  • cationic and anionic lipids of which at least one is pH-sensitive, selected from groups a) cationic: DMTAP, DPTAP, DOTAP, DC-Chol, MoChol, HisChol, DPIM, CHIM, DORIE, DDAB, DAC-Chol, TC- Chol, DOTMA, DOGS, C (18) 2Gly + N, N-dioctadecylamidoglycin, CTAP, CpyC, DODAP, and DOEPC with 5 to 40 mol%.
  • the formulation and its composition are selected from Table 3.
  • formulations according to the invention for use of the formulations according to the invention as a pharmaceutical carrier, it may be expedient to add substances which increase the shelf life and which serve to regulate the osmotic pressure.
  • the liposomes according to the invention can be produced by methods according to the prior art, such as, for example, extrusion through membranes of defined pore size, ethanol injection or high-pressure homogenization. Exemplary designs are given in the examples.
  • Active substance not included is separated off. Suitable separation processes are used for this, so that at least 90% of the active substance is enclosed in the liposome and less than 10% of the active substance is outside the liposome. Chromatographic methods, centrifugation, dialysis or ultrafiltration can be used for this.
  • the liposomal formulations according to the invention can be used for the therapeutic treatment of a mammal. They can also be used for the therapeutic treatment of people.
  • the liposomal formulations according to the invention are particularly suitable for parenteral administration, preferably for intravenous administration.
  • the invention accordingly also relates to a kit which optionally comprises the liposomal formulation according to the invention together with a suitable carrier, and to the use of the kit in diagnosis and therapy.
  • DOTMA 1-dioIeyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride
  • DOTAP (1,2-dioleoyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium salt
  • HistChol N-histidinyl cholesterol hemisuccinate HistChol N-histidinyl cholesterol hemisuccinate.
  • IsoHistSuccDG 1, 2 Dipalmitoylglycerol-O ⁇ -histidinyl-N ⁇ -hemisuccinate, & Distearoyl-, Dimyristoyl, Dioleoyl or palmitoyl-oleoyl derivatives
  • Figure 2 Assignment of a 96-well microtiter plate for the serum stability test, the release of the fluorescent marker CF is measured
  • Figure 3 Fluorescence microscope image next to a phase contrast image for cell localization.
  • a mixture of the lipids named in Table 1 is dissolved in the molar ratios given in chloroform and then completely dried in a rotary evaporator in vacuo.
  • the lipid film is mixed with 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 that a 100 mM
  • the liposomes are repeatedly passed through a membrane with a
  • Pore width of 400 nm extruded is 400 nm extruded.
  • Lipid film uses a solution of the dye, after: 500 mg CF in 130 ul 5
  • the CF which is not included, is separated off by gel filtration.
  • a lipid mixture of the following composition DMPC / MoChol / DG-Succ / Chol 40: 10: 10: 40 (mol%) is dissolved in chloroform at 50 ° C. and then completely dried in a rotary evaporator in vacuo.
  • the liposomes are extruded several times through a membrane with a pore size of 200 nm or 400 nm (Avestin LiposoFast, polycarbonate membrane with a pore size of 200 or 400 nm).
  • a pH of 7.5 is adjusted by adding a 1 mol / L HEPES stock solution.
  • the fraction of the enclosed Cy5.5-anti-CD40-ODN (antisense oligonucleotide) is determined after separation of the freely available active ingredient by sedimentation three times in the ultracentrifuge at 60,000 x g for 45 min using fluorescence spectroscopy.
  • the inclusion efficiency of the oligonucleotide is seen by determining the lipid content and the fluorimetric Cy5.5 determination in relation to the material use of lipid and ODN and is 53% for the formulation.
  • Carboxyflourescein (CF) is used as a model drug, which like oligonucleotides is negatively charged at physiological pH.
  • the serum stability of the CF-filled liposomes is observed over a period of 24 h at 37 ° C.
  • the release of the CF from the liposomes is observed over time by fluorescence measurement.
  • Liposome formulations can be tested per 96-well plate. To determine the percentage of CF released, the sample incubated in buffer is measured both directly (base value) and after opening the liposomes by adding Triton (Triton value or 100% value).
  • Sterile-filtered serum and 1 mM liposomes are combined in a total volume of 500 ⁇ l.
  • the same approach is prepared as a control with buffer instead of serum.
  • a 96-well plate is prepared as follows before the respective sampling: In the wells of a row, columns 1, 3, 5, 7, 9 and 11, 5 ⁇ l buffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 ) submitted. In columns 2, 4, 6, 8, 10 and 12 each 5 ⁇ l 10% Triton X-100.
  • the 96-well plate is loaded as shown in Figure 2.
  • Columns 1-6 each contain 5 ⁇ l of the liposomes incubated in buffer, columns 7-12 each in serum incubated.
  • 290 ⁇ l buffer are added to the 5 ⁇ l sample plus 5 ⁇ l buffer or Triton.
  • a base and a triton value are used again.
  • the times are as follows: zero, zero, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 3 hours, 5 hours, 24 hours.
  • a plate reader with 485/530 nm filters is used to measure the fluorescence.
  • the relative release values are calculated from the measured fluorescence data, in that the triton value corresponds to 100% release.
  • Table 1 shows a number of formulations tested. It can be seen that only compositions according to the invention have a high serum stability.
  • the antisense oligonucleotide (ODN) used is an 18-th phosphorothioate with a FITC label at the 5 'end (fluorescein isothiocyanate).
  • ODN antisense oligonucleotide
  • Liposomes with FITC-ODN were prepared: 0.5 ml of a 1 mM lipid solution with 9 ⁇ g ODN.
  • the liposomes were floated in a discontinuous sucrose gradient with 0, 0.8 and 1, 2 M sucrose in Hep 10 , NaCI 150 (10mM Hepes, 150mM NaCI).
  • siRNA anti GFP
  • amphoteric liposomes 5: 1 to 10: 1 is chosen as the charge ratio of cationic lipid to anionic siRNA.
  • the siRNA in 10mM Hepes, 10mM NaCl pH 7.2
  • the hydration buffer (10mM NaAcetate, 10mM NaCl, 280mM sucrose, pH 4.5) and applied to the lipid film so that a 5-10 mM lipid suspension is formed.
  • the lipids are detached from the piston wall by ultrasound treatment (max. 10 min). It is hydrated for 15 min at room temperature (PO PC as carrier lipid) or at 50 ° C (with DMPC, DPPC as carrier lipid).
  • the liposome fractions are mixed with the same volume of 2.4 M sucrose in H 2 O (ie a 1.2 M solution is formed).
  • the gradient is layered with buffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5), including 0.8 M sucrose in buffer and below the liposomes in 1.2 M sucrose in H 2 O.
  • the volume of the gradient is maximal 4.5 ml.
  • the flotation is carried out at room temperature for 45 min at 50,000 rpm in an ultracentrifuge.
  • the liposomes, which are located between the 0.8 M sucrose and the buffer layer, are removed.
  • the assay is carried out in a final volume of 200 ⁇ l.
  • a calibration series of the siRNA is made between 1 ng and 10 ng (10-100 ⁇ l 100 ng / ml siRNA).
  • the Ribo Green is diluted 1: 2000 in TE buffer. 100 ⁇ l of Ribo Green are added to each batch, then incubated for 5 min at room temperature and the fluorescence is measured at 485/520 nm.
  • the batches are mixed with 4 ⁇ l of 10% Triton (final concentration 0.2 mM). This calibration curve will later be used to determine the amount of siRNA enclosed in liposomes. After about 15 minutes, the fluorescence is measured again.
  • the results are entered graphically in a diagram (one curve each with and without Triton) and calibration lines with the corresponding equations are generated from the values.
  • the liposomes are diluted in two different concentrations (e.g. 1:50 and 1: 100) and 2-3 different volumes of the dilutions are measured (e.g. 5, 10 and 15 ⁇ l of the dilutions to 100 ⁇ l TE plus 100 ⁇ l Ribo Green reagent ) without and with Triton.
  • concentration of the siRNA of a formulation must roughly match in the different measurements. If this is not the case, the siRNA amount was outside the calibration curves and these values should not be included in the calculation of the concentration.
  • the efficiency with which the siRNA could be included in various formulations is shown in Table 2.
  • Unmodified siRNA is broken down very quickly in the serum.
  • the concentration of the included siRNA is determined before the serum test. Liposomes with 4 ⁇ g siRNA per time are used for each time to be tested. Tested times: zero, 1 h, 2 h and 4 h.
  • the liposomes with 4 ⁇ g siRNA inside are diluted to a volume of 60 ⁇ l with the buffer in which the liposomes are located (usually 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5). 60 ⁇ l of serum are added to the batches and up to the incubated at 37 ° C at appropriate times. The zero time is determined separately.
  • a phenol / chloroform extraction is carried out with PLG-Eppis (phase lock gel Eppendor tubes) for a good separation of the serum components and the lipids from the siRNA.
  • the PLG-Eppis are centrifuged for 1 min at 13,000 rpm and placed on ice (in the following, work is carried out at max. 4 ° C). 280 ⁇ l of buffer (as above) and 45 ⁇ l of 5 M NaCI are added to the PLG-Eppis.
  • the liposomes in the serum (120 ⁇ l) are added to this solution. Immediately afterwards, 300 ⁇ l phenol / chloroform mixture is added. For the zero value, 60 ⁇ l serum is also added to the buffer with NaCI in the PLG-Eppi. Everything is mixed immediately. Centrifugation for 10 min at 13,000 rpm and 4 ° C follows. the aqueous phase contains the free siRNA. A further 300 ⁇ l of chloroform are added to the gradient and mixed briefly. After a further centrifugation as above, the aqueous phase is clear and can be removed as completely as possible. The siRNA is now precipitated from the aqueous phase.
  • the quality of the siRNA is checked in the denaturing and possibly also in the native acrylamide gel.
  • siRNA The quality of siRNA is determined over the full length of the single strands and the
  • Double-strandedness defined. Using a native acrylamide gel, you can
  • the gel must be pre-run with TBE buffer for 30 min (80 V, 100 mA) to achieve the required
  • a maximum of 2 ⁇ g siRNA per slot should be applied, otherwise the gel will be overloaded.
  • the samples are taken up in a total volume of 9 ⁇ l. Then add 1 ⁇ l of Blue Juice loading buffer. The samples are applied to the previous gel and separated for 1 h at 100 mA.
  • Staining the gel The gel is removed from the apparatus after electrophoresis. Approx. 200 ml Stains All working solution (20 ml stock solution, 180 ml formamide, 200 ml water) are added to the gel. The gel is stained in the dark for 30-60 min in the Stains All solution. The solution is then removed from the gel and the gel is decolorized under the influence of light in the water (approx. 30 min-2 h depending on the light intensity) . The siRNA remains colored, whereas the background is completely decolored again.
  • HepG2 cells are sown in 96-well plates 2 days before the transfection, so that they show a cell density of 60-80% on the day of the transfection (0.02-0.2 x 10 5 in 100 ⁇ l, usually 1 x 10 4 ) , Two plates (centrifugation and control incubation) are prepared, which are otherwise treated identically.
  • liposome dilutions with and without cargo
  • transfection mix of commercial control transfection reagents (e.g. Lipofectamine 2000, oligofecate mine, siPort amine, siPort lipid) on a 96-well plate with serum-free medium (approx. 160 ng antisense / well).
  • the liposome dilution will be added to the cells in a volume of 25-50 ⁇ l.
  • the cells are washed with serum-free medium (1x) and mixed with serum-containing or serum-free medium, e.g. 75 ⁇ l per well if the liposome dilutions were prepared in such a way that the corresponding amount of antisense / well is contained in 25 ⁇ l.
  • a multiwell plate is centrifuged at 1,500 rpm (342 g), 1 h, 37 ° C., the control plate is incubated for 1 h (37 ° C., 5% CO 2 ). Then both plates are incubated for 3 h (37 ° C, 5% CO 2 ). Remove medium from all wells completely, wash 1 x with PBS, 2 x with serum-containing medium; Add serum-containing medium to all wells, microscopic control for vitality, then incubate both plates overnight (37 ° C, 5% CO 2 ).
  • Figure 3 shows a fluorescence image next to a phase contrast image for cell localization.
  • Example 7 Determination of the serum stability of amphoteric liposomes with and without cholesterol and / or matrix lipid
  • E1 DC-Chol / DOPA (66/34) E2 DC-Chol / DOPA / Chol (40/20/40) E3 DMPC / DC-Chol / DOPA (60/27/13) E4 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (20/27/13/40) E5 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (30/20/10/40) E6 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (40/13/7/40)
  • the liposomes were floated after extrusion to separate the outside FITC dextran.
  • the following data were measured on the Zetasizer at pH 3.9 (10 mM Hepes 150 NaCI HAc) or pH 9.0 (10 mM Tris 150 mM NaCI):
  • ⁇ 1 mM liposomes were incubated for 3 hours at 37 ° C. in human serum and then floated.
  • the fluorescence was determined both in the non-floated sample and in the lower layer (serum layer) of the floated sample and the cargo release was calculated therefrom.
  • the proportion outside FITC-dextran at the start of the test was determined in the same way by appropriate dilution in buffer pH 3.9 and subsequent flotation.

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Abstract

Die Erfindung betrifft amphotere liposomale Formulierungen, die besondere Serumstabilität zeigen und sich zum intrazellulären Delivery von Oligonukleotiden eignen.

Description

Serumstabile amphotere Liposomen
Die Erfindung betrifft amphotere liposomale Formulierungen, die besondere Serumstabilität zeigen und sich zum intrazellulären Delivery von Oligonukleotiden eignen.
Eine recht neue Klasse von potentiellen pharmazeutischen Wirkstoffen stellen die so genannten kurzen interferierenden Ribonukleinsäuren (siRNA) dar, die als Doppelstrang eingesetzt werden, um einzelne Gene gezielt in ihrer Aktivität herunterzuregeln oder auszuschalten. Ihr großes Potential in Therapie und Diagnostik ist leider mit dem Nachteil der starken Instabilität gegenüber Körperflüssigkeiten verbunden. Insbesondere im Blut werden kleine Nukleinsäuren sehr rasch abgebaut. Durch chemische Modifizierung der Nukleinsäuren wird versucht die Empfindlichkeit dieser Moleküle herabzusetzen, was als Nachteil oft eine verringerte bis fehlende biologische Aktivität zur Folge haben kann.
Ein anderer Ansatz ist die Verwendung eines Trägers, der die siRNA vor Angriffen von Enzymen schützt und zum Wirkort transportieren kann. Liposomen werden schon seit einiger Zeit als pharmazeutische Träger für Arzneistoffe eingesetzt.
Zahlreiche Publikationen beschäftigen sich mit der Anwendung von meist kationischen liposomalen Systemen zum intrazellulären Delivery von Oligonukleotiden in vivo (z.B. Molecular Membrane Biology, 16, 129-140, (1999); BBA 1464, 251-261, (2000); Reviews in Biology and Biotechnology, 1(2), 27-33, (2001). All diesen Systemen gemein ist jedoch die Tatsache, dass die verwendeten Lipid-Mischungen aus ungesättigten und kationischen Lipiden wie z.B. DOTAP und/oder DOPE aufgebaut sind und aus diesem Grund nicht serumstabil sind. Dadurch bedingt setzen diese Liposomen eingeschlossenen Wirkstoff sehr schnell nach einer parenteralen Applikation frei. Häufig werden für die oben genannten Anwendungen auch Komplexe aus vdrgeformten Liposomen und Nukleinsäuren hergestellt (z.B. Lipoplexe). Die Komple>!bildung bzw. die meist nicht im Serum stabilen liposomalen Formulierungen führen dazu, dass die Stabilität der Oligonukleotide über einen längeren Zeitraum nicht gewährleistet ist.
Amphotere Liposomen sind eine neue Klasse von Liposomen, die vorteilhafte Eigenschaften gegenüber konventionellen Liposomen und rein kationischen Systemen für ein intrazelluläres Delivery bieten. Negativ geladene Wirkstoffe, wie die Nukleinsäuren lassen sich effektiv in das Innere dieser Liposomen verpacken, obwohl die Gesamtladung der Liposomen bei physiologischem pH negativ bleibt. Durch Änderung des Umgebungs-pH, wie er bei der endosomalen Aufnahme von Liposomen in Zellen vorkommt, von neutral nach leicht sauer, ändert sich auch die Ladung der amphoteren Liposomen von anionisch nach leicht kationisch und die Vorteile eines kationischen Transfektionsreagenzes werden ausgenutzt. In der WO 02/66012 A2 sind diese Liposomen erstmals beschrieben. Die WO 02/66490 und WO 02/66489 (WO 03/070220 und WO 03/070735) stellen pH-sensitive Lipide vor, die sich zum Aufbau von amphoteren Liposomen eignen.
Hafez et al. (Biophysical Journal 2000 (79), 1438-46) und Shi et al. (Journal of Controlled Release 2002 (80), 309-319) beschreiben die Herstellung pH-sensitiver Liposomen, die ohne Neutrallipid formuliert werden. Diese Liposomen sind bei physiologischen pH-Werten negativ geladen und enthalten pH-sensitive Komponenten, welche schwach anionische oder schwach kationische Amphiphile enthalten. Die Lipide bilden stabile Liposomen bei neutralem oder basischem pH. Im sauren Milieu werden die anionischen bzw. kationischen Lipide protoniert und dadurch entladen bzw. umgeladen. Durch die elektrostatische Destabilisierung aggregieren die Liposomen schneller, was die Membranfusion fördert. Jedoch sind Liposomen, die ausschließlich aus geladenen Komponenten bestehen aufgrund ihrer geringen Stabilität im Serum nicht für in vivo Anwendungen geeignet.
Bei systemischer Applikation ist neben den üblichen Bedingungen für parenterale Applikation, wie Sterilität, Isoosmolarität, Reinheits- und Toxizitätsanforderungen, die Stabilität und Aggregationsfreiheit einer liposomalen Formulierung in humanem Serum eine Vorraussetzung für eine erfolgreiche Anwendung. So sehen auch die Richtlinien der US-amerikanischen Aufsichtsbehörde FDA für liposomale Formulierungen (http://www.fda.gov/cder/guigance/index.htm, Liposome Drug Products) besondere Prüfungen vor. Dabei wird verlangt, dass das Verhältnis verkapselter zu freiem Arzneistoff in vitro, sowie in vivo über den Zeitraum der Zirkulation zu bestimmen ist. Serumkomponenten können die liposomale Membran permeabilisieren und Wirkstoff freisetzen. Ob ein Wirkstoff schnell, langsam oder nicht freigesetzt wird, hängt auch von den molekularen Dimensionen des Wirkstoffes ab. So verbleibt ein Plasmid mit mehreren tausend Basenpaaren eher im Liposom als kleine Oligonucleotide. Für ein intrazelluläres Delivery ist es wesentlich, dass die Freisetzung möglichst gering ist. Überraschenderweise wurde gefunden, dass die in der WO 02/66012 A2 offenbarten amphoteren Liposomen sich stark in ihrer Serumstabilität bei Verwendung von kleinen Oligonukleotiden unterscheiden. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, Formulierungen von amphoteren Liposomen bereitzustellen, die kleine Oligonukleotide, wie siRNA und/oder Antisense-Moleküle, in ihren Innenraum einschließen und unter Serumbedingung nicht, oder nur zu einem kleinen Teil freisetzen und sich somit zur parenteralen Gabe eignen.
Die Erfindung löst die Aufgabe durch Bereitstellung von liposomalen Formulierungen mit einem wässrigen Innenraum umfassend
- neutrale Lipide mit einem Membrananteil von 10 - 60 mol%,
- Cholesterol mit einem Anteil von 30 - 50 mol%, als ladungstragende Lipide entweder
- amphotere Lipide mit einem Anteil von 5 - 30mol%, oder Mischungen von kationischen und anionischen Lipiden mit einem Gesamtanteil von höchstens 50 mol%, wobei die Formulierung als einen Wirkstoff im wässrigen Innenraum mindestens ein Oligonukleotid umfasst.
Die für diese Ausführung der Erfindung relevanten Oligonukleotide sind aus 5-100, bevorzugt aus 5-40 und besonders bevorzugt aus 10-25 Nukleotiden oder Basenpaaren aufgebaut. Darüber hinaus können die Oligonukleotide als Einzelstrang (z.B. Antisense-Oligonukleotide), als Doppelstrang (z.B. small-interfering RNA, Decoy- Oligonukleotide) oder in komplexer Faltung (z.B. Aptamere, Spiegelmere, Ribozyme) vorliegen. Alle für diese Erfindung relevanten Oligonukleotide sind aus Desoxyribonukleotiden oder aus Ribonukleotiden sowie aus deren chemischmodifizierten Derivaten aufgebaut, wie beispielsweise Phosphorothioate DNA (PS), 2'- O-methyl RNA (OMe), 2'-O-methoxy-ethyl RNA (MOE), Peptide nucleic acid (PNA), N3'-P5' Phosphoroamidate (NP), 2'-fluoro-arabino nucleic acid (FANA), Locked nucleic acid (LNA), Morpholino phosphoroamidate (MF), Cyclohexene nucleic acid (CeNA), Tricyclo-DNA (tcDNA)). Darüber können Copolymere und Block-Copolymere verschiedener Nukleotide und sogenannte Gapmere in die Liposomen eingeschlossen werden-.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden Aptamere oder Spiegelmere in die Liposomen eingeschlossen. Aptamere sind DNA- oder RNA-basierte Oligonukleotide mit komplexer dreidimensionaler Struktur. Aufgrund dieser Struktur können Aptamere sehr spezifisch und hochaffin an Proteintargets binden und wirken somit therapeutisch, meist extrazellulär. Ihre Funktionalität ist nahezu identisch zu monoklonalen Antikörpern. Spiegelmere sind im Gegensatz zu D-Oligonukleotiden aus L-Ribose- und L-2'- Desoxyribose-Einheiten aufgebaut. Genau wie Aptamere binden diese spiegelbildlichen Nukleinsäuren spezifisch an Proteintargets. Aufgrund der chiralen Inversion besitzen Spiegelmere im Gegensatz zu herkömmlichen D-Oligonukleotiden eine erhöhte Stabilität gegenüber einem enzymatischen Abbau.
Das Grundgerüst der erfindungsgemäßen amphoteren Liposomen wird von neutralen Gerüstlipiden gebildet, die einen Anteil an der Membran von 5 bis 65 mol%, bevorzugt von 10 bis 60 mol% besitzen. Geeignete Lipide sind Phoshatidylcholine, wie DMPC, DPPC, DSPC, DOPC und POPC, die sowohl synthetischen als auch natürlichen oder halbsynthetischen Ursprungs sein können.
Es ist dem Fachmann bekannt, dass sich die Serumstabilität von Liposomen durch Zusatz von Cholesterol in der Membran erhöhen lässt. Dies wurde auch für amphotere Liposomen gefunden. Die erfindungsgemäßen Liposomen besitzen vorzugsweise einen Gehalt von 30 bis 50 mol%, bevorzugt von 35 - 45 mol% Cholesterol in der Membran.
Viele Lipide, die als Ladungsträger für amphotere Liposomen verwendet werden können, leiten sich von der chemischen Grundstruktur des Cholesterol ab (beispielsweise die offenbarten Verbindungen in WO 02/66490 und WO 02/6648). Überraschenderweise wurde gefunden, dass diese Cholesterolderivate im Allgemeinen, besonders MoChol, HisChol, Chems, HistChol nicht die stabilisierende Wirkung des nativen Cholesterols besitzen, daher ist es von Vorteil, wenn die Summe aller sterolbasierenden Lipide 60 mol% nicht übersteigt.
Das amphotere Ladungsverhalten kann auf zwei Weisen gebildet werden: durch Verwendung von amphoteren Lipiden oder durch geeignete Mischungen von pH- sensitiven kationischen und anionischen Lipiden, wie sie in der WO 02/066012 offenbart werden. Werden amphotere Lipide verwendet, so beträgt der Membranteil zwischen 5 und 30 mol%, weiter bevorzugt zwischen 5 und 20 mol%, bei Mischungen beträgt der Gesamtladungsträgeranteil bevorzugt nicht mehr als 50 mol%, weiter bevorzugt zwischen 15 und 45 mol%. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden amphotere Formulierungen wie folgt zusammengesetzt:
- Grundlipid ausgewählt aus der Gruppe DMPC, DPPC, DSPC mit 10 bis 60 mol%
- Cholesterol, mit 35 - 45 mo_% - amphoteres Lipid, ausgewählt aus der Gruppe HistChol, HistDG, isoHistSuccDG, Acylcamosin, HCChol mit 5 - 20 mol%.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Formulierungen wie folgt zusammengesetzt: - Grundlipid ausgewählt aus der Gruppe DMPC, DPPC, DSPC mit 10 bis 50 mol%
- Cholesterol, mit 35 - 45 mol%
- Mischung kationischer und anionischer Lipide, davon mindestens eines pH-sensitiv, ausgewählt aus den Gruppen a) kationisch: DMTAP, DPTAP, DOTAP, DC-Chol, MoChol, HisChol, DPIM, CHIM, DORIE, DDAB, DAC-Chol, TC-Chol, DOTMA, DOGS, C(18)2Gly+N,N- dioctadecylamidoglycin, CTAP, CpyC, DODAP, und DOEPC mit 5 bis 40 mol%. b) anionisch: DGSucc, DMPS, DPPS.DOPS.POPS, DMPG, DPPG, DOPG, POPG, DMPA, DPPA.DOPA, POPA, Chems und CetylP mit 5 bis 40 mol% mit einem Anteil an der liposomalen Membran von insgesamt 15-45 mol%.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Formulierung und ihre Zusammensetzung ausgewählt aus Tabelle 3.
Für eine Verwendung der erfindungsgemäßen Formulierungen als Arzneimittelträger kann es zweckmäßig sein, Substanzen, die die Haltbarkeit erhöhen, die zur Regulierung des osmotischen Drucks dienen, zuzusetzen.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Liposomen kann durch Verfahren nach dem Stand der Technik erfolgen, wie beispielsweise Extrusion durch Membranen definierter Porengröße, Ethanolinjektion oder Hochdruckhomogenisation. Beispielhafte Ausführungen sind in den Beispielen gegeben.
Nicht eingeschlossener Wirkstoff wird abgetrennt. Dazu werden geeignete Trennverfahren verwendet, so dass der Wirkstoff zu mindestens 90% im Liposom eingeschlossen ist und weniger als 10% des Wirkstoffes sich ausserhalb des Liposoms befinden. Hierfür können chromatographische Verfahren, Zentrifugation, Dialyse oder Ultrafiltration verwendet werden. Die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen können zur therapeutischen Behandlung eines Säugetieres verwendet werden. Auch zur therapeutischen Behandlung von Menschen können sie verwendet werden.
Insbesondere zur parenteralen Applikation, bevorzugt zur intravenösen Applikation sind die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen geeignet. Die Erfindung betrifft demgemäß auch einen Kit, der die erfindungsgemäße liposomale Formulierung gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Träger umfasst, sowie die Verwendung des Kits in Diagnose und Therapie.
Tabelle 1
m 73
>
H N 00
73 m O m r σ>
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Tabelle 3
Figure imgf000009_0001
Anschließend wird die Erfindung anhand von Beispielen weiter erläutert, ohne auf diese Beispiele begrenzt zu sein.
Abkürzungen:
DMPC Dimyristoylphosphatidylcholin
DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholin
DSPC Distearoylphosphatidylcholin
POPC Palmitoyl-oleoylphosphatidylcholin
DOPC Dioleoylphosphatidylcholin
DOPG Dioleoylphosphatidylglycerol
POPG Palmitoyl-oleoylphosphatidylglycerol
DMPG Dimyristoylphosphatidylglycerol
DPPG Dipalmitoylphosphatidylglycerol
DMPS Dimyristoylphosphatidylserin
DPPS Dipalmitoylphosphatidylserin
DOPS Dioleoylphosphatidylserin
POPS Palmitoyl-oleoylphosphatidylserin
DMPA Dimyristoylphosphatidic acid
DPPA Dipalmitoylphosphatidic acid
DOPA Dioleoylphosphatidic acid
POPA Palmitoyl-oleoylphosphatidic acid
DOPE Dioleoylphosphatidylethanolamin
Chems Cholesterolhemisuccinat
DC-Chol 3-ß-[N-(N',N'-dimethylethane) carbamoyljcholesterol
CetylP Cetylphosphat
DODAP (1 ,2)-dioleoyloxypropyl)-N,N-dimethylammonium Chloride
DOEPC 1 ,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin DAC-Chol 3-ß-[N-(N,N'-dimethylethane) carbamoyljcholesterol
TC-Chol 3-ß-[N-(N',N', N'-trimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol
DOTMA (1 ,2-dioIeyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) (Lipofectin®)
DOGS ((C18)2GlySper3+) N,N-dioctadecylamido-glycyl-spermin (Transfectam®)
CTAB Cetyl-trimethylammoniumbromid,
CPyC Cetyl-pyridiniumchlorid
DOTAP (1 ,2-dioleoyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium Salz
DMTAP (1 ,2-dimyristoyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium Salz
DPTAP (1 ,2-dipalmitoyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium Salz
DOTMA (1 ,2-dioleyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium chlorid)
DORIE (1 ,2-dioleyloxypropyl)-3 dimethylhydroxyethyl ammoniumbromid)
DDAB Dimethyldioctadecylammonium bromid
DPIM Dipalmitoyl-oxypropyl-methylimidazol
CHIM Histaminyl-Cholesterolcarbamat
MoChol 4-(2-Aminoethyl)-Morpholino-Cholesterolhemisuccinat
HisChol Histaminyl-Cholesterolhemisuccinat
HCChol Nά-Histidinyl-Cholesterolcarbamat
HistChol Nά-Histidinyl-Cholesterol-hemisuccinat.
AC Acylcarnosin, Stearyl- & Palmitoylcarnosin HistSuccDG 1 ,2 — Dipalmitoylglycerol-hemisuccinat-Nα-Histidinyl-hemisuccinat, & Distearoyl- .Dimyristoyl, Dioleoyl or palmitoyl-oleoylderivatives
IsoHistSuccDG 1 ,2 — Dipalmitoylglycerol-Oα-Histidinyl-Nα-hemisuccinat, & Distearoyl-, Dimyristoyl, Dioleoyl or palmitoyl-oleoylderivatives
DGSucc 1 ,2 — Dipalmitoyglycerol-3-hemisuccinat & Distearoyl-, dimyristoyl-
Dioleoyl or palmitoyl-oleoylderivatives
Abbildungen
Abbildung 1 : Chemische Formeln von Lipiden
Abbildung 2: Belegung einer 96-well Mikrotiterplatte für den Serumsstabilitätstest, gemessen wird die Freisetzung des Floureszenzmarkers CF Abbildung 3: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme neben einer Phasenkontrastaufnahme zur Zelllokalisierung.
Beispiel 1
Herstellung von amphoteren Liposomen
Ein Gemisch aus den in Tabelle 1 benannten Lipiden wird in den angegebenen molaren Verhältnissen in Chloroform gelöst und anschließend im Rotationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet.
Der Lipidfilm wird mit 10 mM Hepes, 150 mM NaCI, pH 7.5 versetzt, dass eine 100 mM
Suspension entsteht. Anschließend wird diese Suspension für 45 Minuten im
Wasserbad bei 50°C unter Rotieren hydratisiert und für weitere 5 Minuten im
Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Lösung eingefroren.
Nach dem Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer
Porenweite von 400 nm extrudiert.
CF - (Carboxyfluorescein) - gefüllte Liposomen
Die Herstellung erfolgt analog dem Voranstehenden, nur wird zur Hydratation des
Lipidfilms eine Lösung des Farbstoffes verwendet, nach: 500 mg CF werden in 130 μl 5
M NaCI , 12,5 ml 10 mM Hepes pH 7,5 und 630 μl 5 N NaOH gelöst. Der pH-Wert wird kontrolliert und gegebenenfalls nachgestellt (auf pH 7,5).
Die Abtrennung des nicht eingeschlossenen CF erfolgt über Gelfiltration.
Beispiel 2:
Einschluss von Cy5.5 anti CD40 ODN (floereszenzmarkiertes Antisense-
Oligonukleotid) in amphotere Liposomen
Eine Lipidmischung folgender Zusammensetzung DMPC/MoChol/DG-Succ/Chol 40:10:10:40 (mol%) wird bei 50°C in Chloroform gelöst und anschließend im Rotationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet.
Der Lipidfilm wird mit soviel Cy5.5-anti-CD40-ODN (Antisense-Oligonukleotid) (150 μg/ml in 10 mM NaAcetat, 300 mM Sucrose, pH 4,5) versetzt, dass eine 15 mM Suspension entsteht. Anschließend wird diese Suspension für 45 Minuten im Wasserbad bei 50°C unter Schwenken hydratisiert und für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Suspension eingefroren. Es folgen 3 Einfrier- und Auftauprozesse, wobei nach dem Auftauen jeweils eine 5-minütige Behandlung im Ultraschallbad erfolgt.
Nach dem letzten Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 200 nm oder 400 nm extrudiert (Avestin LiposoFast, Polycarbonat-Membran mit einer Porenweite von 200 oder 400nm). Nach der Extrusion wird durch Zugabe einer 1 mol/L HEPES-Stammlösung ein pH von 7,5 eingestellt. Der Anteil des eingeschlossenen Cy5.5-anti-CD40-ODN (Antisense-Oligonukleotid) wird nach Abtrennung des frei vorliegenden Wirkstoffes durch dreimalige Sedimentation in der Ultrazentrifuge bei 60000 x g über 45 min fluoreszenzspektroskopisch ermittelt.
Die Einschlusseffizienz des Oligonukleotids wird durch Bestimmung des Lipidgehaltes und der fluorimetrischen Cy5.5-Bestimmung im Verhältnis zu zum Materialeinsatz von Lipid und ODN gesehen und beträgt für die Formulierung 53%.
Beispiel 3
Bestimmung der Serumstabilität
Als Modellwirkstoff wird Carboxyflourescein (CF) eingesetzt, der wie Oligonukleotide bei physiologischem pH negativ geladen ist. Die Serumstabilität der CF-gefüllten Liposomen wird über den Zeitraum von insgesamt 24 h bei 37°C beobachtet. Es wird dabei die Freisetzung des CF aus den Liposomen über die Zeit per Fluoreszenzmessung beobachtet. Es können 3 verschiedene
Liposomenformulierungen pro 96-well-Platte getestet werden. Zur Bestimmung der prozentual freigesetzten Menge an CF wird die in Puffer inkubierte Probe sowohl direkt vermessen (Basiswert) als auch nach Öffnung der Liposomen durch Zugabe von Triton (Tritonwert oder 100%-Wert).
In einem Gesamtvolumen von 500 μl werden sterilfiltriertes Serum und 1 mM Liposomen zusammengegeben. Derselbe Ansatz wird als Kontrolle mit Puffer anstelle des Serums vorbereitet.
Eine 96-well-Platte wird folgendermaßen vor den jeweiligen Probennahmen vorbereitet: in die Wells einer Zeile, Spalten 1, 3, 5, 7, 9 und 11 werden jeweils 5 μl Puffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCI, pH 7,5) vorgelegt. In die Spalten 2, 4, 6, 8, 10 und 12 jeweils 5 μl 10 % Triton X-100.
Die 96-well-Platte wird wie in Figur 2 dargestellt belegt. In die Spalten 1-6 werden je 5 μl der in Puffer inkubierten Liposomen gegeben, in die Spalten 7-12 die in Serum inkubierten. Zu den 5 μl Probe plus 5 μl Puffer bzw. Triton werden 290 μl Puffer gegeben. Es wird jeweils wieder ein Basis- und ein Triton-Wert genommen. Auf diese Weise kann man drei Formulierungen über 8 Zeitpunkte pro Platte testen. Die Zeitpunkte sind die folgenden: null, null, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 5 h, 24 h. Für die Messungen der Fluoreszenz wird ein Plattenreader mit 485/530 nm Filtern verwendet. Aus den gemessenen Floureszenzdaten werden die reltiven Freisetzungswerte errechnet, indem der Tritonwert 100% Freisetzung entspricht. Tabelle 1 zeigt eine Reihe von getesteten Formulierungen. Es zeigt sich, dass nur erfindungsgemäße Zusammensetzungen eine hohe Serumstabilität besitzen.
Beispiel 4
Einschluß von FITC-ODN (fluoreszenzmarkierte Antisense-DNA)
Das verwendete Antisense-Oligonukleotid (ODN) ist ein 18-rner Phosphorothioat mit einer FITC-Markierung am 5'-Ende (Fluorescein-isothiocyanat). Liposomen mit FITC- ODN wurden hergestellt: 0,5 ml einer 1 mM Lipidlösung mit 9 μg ODN. Zwei Ansätze mit unterschiedlichem molaren Verhältnis der kationischen Lipid-Ladungen zu anionischen ODN-Ladungen 3:1 und 4,5:1
- Jeweils DPPC/DOTAP/DG-Succ/Chol 20/10/30/40
- Hydratisierungs- bzw. ODN-Lösung: 10 mM NaAc pH 4,5, 300 mM Sucrose
- Zur Abtrennung nicht eingeschlossenen ODNs wurden die Liposomen in einem diskontinuierlichen Sucrosegradienten mit 0, 0,8 und 1 ,2 M Sucrose in Hep10, NaCI150 flotiert (10mM Hepes, 150 mM NaCI).
Bestimmung des Einbaus an FITC-ODN aus der Summe der gemessenen FITC-ODN - Fluoreszenzen (100 %) bzw. des Input und daraus abgeleitet dem Verhältnis von freier zu eingebauter Fluoreszenz:
% Liposomen Lipo-Reste Puffer/Sucr. freie ODN gesamt 3:1 43,3 14,7 5,4 36,6 100,0 4,5:1 46,3 10,7 4,5 38,5 100,0
Beispiel 5
Einschluß von siRNA (anti GFP) in amphotere Liposomen Als Ladungsverhältnis von kationischem Lipid zu anionischer siRNA wird 5:1 bis 10:1 gewählt. Die siRNA (in 10 mM Hepes, 10 mM NaCI pH 7,2) wird mit dem Hydratisierungspuffer (10 mM NaAcetat, 10 mM NaCI, 280 mM Sucrose, pH 4,5) vermischt und auf den Lipidfilm gegeben, sodass eine 5-10 mM Lipidsuspension entsteht. Die Lipide werden durch Ultraschallbehandlung von der Kolbenwand gelöst (max. 10 min). Hydratisiert wird für 15 min bei Raumtemperatur (PO PC als Trägerlipid) bzw. bei 50 °C (bei DMPC, DPPC als Trägerlipid). Es folgt ein mindestens dreimaliges Einfrieren bei -70 °C (10 min für 1 ml Volumen, 30 min für Volumina bis 15 ml) und wieder Auftauen im Wasserbad (Temperatur wie beim Hydratisieren). Der Kolben wird aufgetaut und bei größeren Volumina werden 3 ml der Lösung entnommen (in 8 ml Glasröhrchen). Der restliche Ansatz wird wieder bei -70 °C eingefroren. Die Extrusion erfolgt durch 100 nm-Filter. Anschließend wird der pH Wert mit 1/10 Volumen 1 M Hepes auf pH 8,0 eingestellt. Flotation der Liposomen:
Die Liposomen Fraktionen werden mit dem selben Volumen 2,4 M Sucrose in H2O versetzt (d.h. es entsteht eine 1 ,2 M Lösung). Den Gradienten schichtet man mit Puffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCI, pH 7,5), darunter 0,8 M Sucrose in Puffer und zuunterst die Liposomen in 1 ,2 M Sucrose in H2O. Das Volumen des Gradienten beträgt maximal 4,5 ml. Die Flotation erfolgt bei Raumtemperatur für 45 min bei 50.000 rpm in einer Ultrazentrifuge. Die Liposomen, welche sich zwischen der 0,8 M Sucrose- und der Pufferschicht befinden, werden abgenommen.
RNA-Mengenbestimmung mit Ribo Green RNA Quantitation Reagent
Der Assay wird im Endvolumen von 200 μl durchgeführt. Zuerst fertigt man eine Eichreihe der siRNA zwischen 1 ng und 10 ng an (10-100 μl 100 ng/ml siRNA). Das Ribo Green verdünnt man 1 :2000 in TE-Puffer. Zu jedem Ansatz werden 100 μl Ribo Green zugegeben, dann inkubiert man 5 min bei Raumtemperatur und misst die Fluoreszenz bei 485/520 nm. Die Ansätze werden mit je 4 μl 10 % Triton (Endkonzentration 0,2 mM) versetzt. Diese Eichkurve dient später für die Bestimmung der in Liposomen eingeschlossenen Menge an siRNA. Nach ca. 15 min misst man noch einmal die Fluoreszenz. Die Ergebnisse werden graphisch in ein Diagramm eingetragen (je eine Kurve mit und ohne Triton) und Eichgeraden mit den dazu gehörigen Gleichungen aus den Werten generiert.
Die Liposomen verdünnt man in zwei verschiedenen Konzentrationen (z.B. 1 :50 und 1 :100) und misst 2-3 verschiedene Volumina der Verdünnungen (z. B. 5, 10 und 15 μl der Verdünnungen ad 100 μl TE plus 100 μl Ribo Green Reagenz) ohne und mit Triton. Die errechnete Konzentration der siRNA einer Formulierung muss bei den verschiedenen Messungen in etwa übereinstimmen. Ist dies nicht der Fall, lag man mit der siRNA-Menge außerhalb der Eichkurven und sollte diese Werte nicht in die Berechnung der Konzentration einfließen lassen. Die Effizienz, mit der die siRNA in verschiedene Formulierungen eingeschlossen werden konnte zeigt die Tabelle 2.
Tabelle 2: Einschluss siRNA antiGFP in amphotere Liposomen
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Test von siRNA-haltigen Liposomen im Serum
Unmodifizierte siRNA wird im Serum sehr schnell abgebaut. Um den schützenden Effekt der Liposomen auf die siRNA zu untersuchen, wird wie im Folgenden dargestellt vorgegangen. Die Konzentration der eingeschlossenen siRNA wird vor dem Serumtest bestimmt. Für jeden zu testenden Zeitpunkt werden Liposomen mit je 4 μg siRNA pro Zeitpunkt eingesetzt. Getestete Zeitenpunkte: Null, 1 h, 2 h und 4 h. Die Liposomen mit 4 μg siRNA im Innern werden auf 60 μl Volumen ver ünnt mit dem Puffer, in welchem sich die Liposomen befinden (üblicherweise 10 mM Hepes, 150 mM NaCI, pH 7,5). Zu den Ansätzen werden 60 μl Serum zugegeben und bis zu den entsprechenden Zeitpunkten bei 37 °C inkubiert. Der Nullzeitpunkt wird separat bestimmt.
Eine Phenol/Chloroform-Extraktion wird mit PLG-Eppis (Phase-Lock-Gel- Eppendorfröhrchen) durchgeführt für eine gute Trennung der Serumbestandteile und der Lipide von der siRNA. Die PLG-Eppis werden für 1 min bei 13 000 rpm zentrifugiert und auf Eis gestellt (im folgenden wird bei max. 4 °C gearbeitet). In die PLG-Eppis gibt man 280 μl Puffer (wie oben) und 45 μl 5 M NaCI.
In diese Lösung kommt der Ansatz der Liposomen im Serum (120 μl). Sofort danach erfolgt die Zugabe von 300 μl Phenol/Chloroform-Gemisch. Für den Nullwert gibt man zum Puffer mit NaCI in das PLG-Eppi auch 60 μl Serum. Alles wird sofort gemischt. Es folgt eine Zentrifugation für 10 min bei 13 000 rpm und 4 °C. die wässrige Phase enthält die freie siRNA. Auf den Gradienten werden weitere 300 μl Chloroform gegeben und kurz gemischt. Nach einer weiteren Zentrifugation wie oben ist die wässrige Phase klar und kann möglichst vollständig abgenommen werden. Die siRNA wird nun aus der wässrigen Phase gefällt. Zur siRNA-Lösung gibt man 1/10 Volumen 3 M NaOAc, pH 5,2 und 2,5 Volumenteile Ethanol. Die Lösung wird gut durchmischt und die siRNA 1 h bei -70 °C ausgefällt. Eine weitere Zentrifugation bei 4°C, 13 000 rpm für 10 min folgt. Dabei pelletiert die siRNA. Der Überstand wird vollständig abgenommen und das Pellet wird mit 200 μl 70 % Ethanol gewaschen und für ca. 10 min getrocknet. Die siRNA wird in 5 μl Wasser wieder gelöst.
Die Qualität der siRNA wird im denaturierenden und möglicherweise auch im nativen Acrylamidgel überprüft.
Nachweis der Doppelsträngigkeit von siRNA im nativen Acrylamidgel
Die Qualität von siRNA wird über die vollständige Länge der Einzelstränge und die
Doppelsträngigkeit definiert. Mittels eines nativen Acrylamidgels kann man die
Doppelsträngigkeit einer siRNA überprüfen, da sich doppelsträngige siRNA langsamer im nativen Gel bewegt, als die Einzelstränge.
Das Gel muss mit TBE-Puffer 30 min vorlaufen (80 V, 100 mA), um die erforderliche
Temperatur zu bekommen.
Es werden höchstens 2 μg siRNA pro Slot aufzutragen, da sonst das Gel überladen wird. Die Proben werden in einem Gesamtvolumen von 9 μl aufgenommen. Darauf gibt man 1 μl Blue Juice-Ladepuffer. Die Proben werden auf das vorgelaufene Gel aufgetragen und für 1 h bei 100 mA aufgetrennt.
Färben des Gels: Das Gel wird nach der Elektrophorese aus der Apparatur entnommen. Auf das Gel werden ca. 200 ml Stains All Gebrauchslösung (20 ml Stammlösung, 180 ml Formamid, 200 ml Wasser gegeben. Das Gel wird im Dunklen für 30 -60 min in der Stains All-Lösung gefärbt. Danach wird die Lösung vom Gel genommen und das Gel wird unter Lichtzutritt im Wasser entfärbt (ca. 30 min-2 h je nach Lichtintensität). Die siRNA bleibt gefärbt, wohingegen der Hintergrund wieder völlig entfärbt wird.
Beispiel 6
In vitro Aufnahme von amphoteren Liposomen mit Cy3-BCL2-Antisense in
HepG2 Zellen
HepG2 Zellen werden 2 Tage vor der Transfektion in 96-Wellplatten ausgesät, so dass sie am Tag der Transfektion eine Zelldichte von 60 - 80% zeigen (0,02-0,2 x 10 5 in 100 μl, i.d.R. 1 x 10 4). Es werden 2 Platten (Zentrifugation u. Kontrollinkubation) vorbereitet, die ansonsten identisch behandelt werden.
Transfektion:
Vortemperierung der Zentrifuge (Biofuge Stratos, Heraeus), Rotor # 3048 für Mikrotiterplatten. Cy3-Bcl2-Antisense-haltige Liposomen werden auf eine einheitliche Konzentration mit 10 mM Hepes, 150 mM NaCI, pH 7.5 (HBS) eingestellt (Cy-3 ist ein rot floureszierender Marker).
Herstellung der Liposomenverdünnungen (mit und ohne Cargo) sowie Transfektionsmix von kommerziellen Kontrolltransfektionsreagenzien (z.B. Lipofectamine 2000, Oligofecatmine, siPort Amine, siPort Lipid) auf 96-Well Platte mit serumfreiem Medium (ca. 160 ng Antisense/well). Die Liposomenverdünnung wird in einem Volumen von 25 - 50 μl zu den Zellen gegeben werden.
Die Zellen werden mit serumfreien Medium gewaschen (1x) und mit serumhaltigen oder serumfreien Medium versetzt, z.B. je Well 75 μl, wenn die Liposomenverdünnungen so hergestellt wurden, dass die entsprechende Menge antisense/Well in 25 μl enthalten ist.
Eine Multiwellplatte wird bei 1 ,500 rpm (342 g), 1 h, 37°C zentrifugiert, die Kontrollplatte 1 h inkubiert (37°C, 5% CO2). Anschließend werden beide Platten 3 h inkubiert (37°C, 5% CO2). Medium aller Wells komplett entfernen, 1 x mit PBS waschen, 2 x mit serumhaltigen Medium; Zusatz von serumhaltigen Medium zu allen Wells, mikroskopische Kontrolle auf Vitalität, anschließend beide Platten über Nacht inkubieren (37°C, 5% CO2).
Am Tag nach der Transfektion wird die Aufnahme von Liposomen in die Zellen floureszenzmikroskopisch untersucht. In Abbildung 3 wird Fluoreszenz-aufnahme neben einer Phasenkontrastaufnahme zur Zelllokalisierung gezeigt.
Beispiel 7 Bestimmung der Serumstabilität von amphoteren Liposomen ohne und mit Cholesterol und/oder Matrixlipid
Einschluß von FITC-Dextran in amphotere Liposomen
Folgende Formulierungen wurden mit 15 mg/ml FITC-Dextran hergestellt (in 10 mM Hepes, 150 mM NaCI pH 3.9 (HAc) wie bei Hafez IM, Ansell S, Cullis PR: Tunable pH- sensitive liposomes composed of mixtures of cationic and anionic lipids. Biophys J. 2000 Sep;79(3):1438-46.).
E1 DC-Chol / DOPA (66/34) E2 DC-Chol / DOPA / Chol (40/20/40) E3 DMPC / DC-Chol / DOPA (60/27/13) E4 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (20/27/13/40) E5 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (30/20/10/40) E6 DMPC / DC-Chol / DOPA / Chol (40/13/7/40)
Die Liposomen wurden nach der Extrusion flotiert, um das outside FITC-Dextran abzutrennen. Am Zetasizer wurden bei pH 3,9 (10 mM Hepes 150 NaCI HAc) bzw. pH 9.0 (10 mM Tris 150 mM NaCI) folgende Daten gemessen:
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Test der FITC-Dextran haltigen Liposomen im Serum
Zum Test der Stabilität dieser Formulierungen in Humanserum wurden ~ 1 mM Liposomen 3 Stunden bei 37°C in Humanserum inkubiert und danach flotiert. Sowohl in der nicht flotierten Probe als auch in der unteren Schicht (Serum-Schicht) der flotierten Probe wurde die Fluoreszenz bestimmt und daraus das cargo release berechnet. Der Anteil outside FITC-Dextran zu Testbeginn wurde durch entsprechende Verdünnung in Puffer pH 3.9 und anschließende Flotation auf die gleiche Weise bestimmt.
% outside bei % release nach Serum- Testbeginn Inkubation E1 13,2 ± 1 ,2 37,0 ± 5,4 E2 25,2 + 1 ,1 52,2 ± 4,2 E3 8,6 40,4 ± 1 ,6 E4 12,0 18,1 ± 0,3 E5 12,0 21 ,2 + 1 ,6 E6 7,6 20,0 ± 0,6
Alle Formulierungen, die sowohl 40% Cholesterol als auch Matrix-Lipid enthalten (E4, E5, E6) sind stabiler als die Formulierungen, die nur Cholesterol (E2) oder nur Matrix- Lipid (E3) oder keines von beiden (E1) enthalten.

Claims

Patentansprüche
1. Serumstabile amphotere liposomale Formulierungen mit mindestens einem Wirkstoff im wässrigen Innenraum, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen - neutrale Lipide mit einem Membrananteil von 10 - 60 rnol% umfassen, - Cholesterol mit einem Anteil von 30 - 50 mol%, als ladungstragende Lipide entweder - amphotere Lipide mit einem Anteil von 5 - 30mol%, oder - Mischungen von kationischen und anionischen Lipiden mit einem Gesamtanteil von höchstens 50 mol%, umfassen und der Wirkstoff mindestens ein Oligonukleotid umfasst.
2. Liposomale Formulierung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Cholesterol einen Anteil von 35 - 45 mol%, die amphoteren Lipide einen Anteil von 5 - 20 mol% und/oder die Mischungen einen Anteil von 15 - 45 mol% aufweisen.
3. Liposomalen Formulierung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide aus 5-100, bevorzugt aus 5-40 und besonders bevorzugt aus 10-25 Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden oder deren chemisch-modifizierten Derivaten aufgebaut sind.
4. Liposomalen Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide als Einzelstrang, als Doppelstrang oder in komplexer Faltung vorliegen.
5. Liposomale Formulierung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Einzelstränge als Antisense-Oligonukleotide, die Doppelstränge als small- interfering RNA und/oder Decoy-Oligonukleotide und/oder die komplexen Faltungen als Aptamere und/oder Spiegelmere vorliegen.
6. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid ein Aptameres ist.
7. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, Hg SS das Oligonukleotid ein Spiegelmeres ist.
8. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/DMPS/Chol 40:10:10:40 hat.
9. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/AC/Chol 50:10:40 hat.
10. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/HisChol/DPPS/Chol 35:10:15:40 hat.
11. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/lsohistsuccDG/Chol 50:10:40 hat.
12. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MOChol/DGSucc/Chol 35:10:15:40 hat.
13. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/DGSucc/Chol 40: 10: 10:40 hat.
14. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/MoChol/DGSucc/Chol 35:10:15:40 hat.
15. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/HistSuccDG/Chol 50:10:40 hat.
16. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/MoChol/DPPS/Chol 40: 10: 10:40 hat.
17. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/DOTAP/DG- Succ/Chol 20:10:30:40 hat.
18. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistChol/Chol 50:10:40 hat.
19. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistSuccDG/Chol 40:20:40 hat.
20. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/MoChol/DG- Succ/Chol 20:10:30:40 hat.
21. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HcChol/Chol 50:15:35 hat.
22. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HcChol/Chol 50:15:35 hat.
23. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HistPS/Chol 50:15:35 hat.
24. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistPS/Chol 50:15:35 hat.
25. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/AC/Chol 50:15:35 hat.
26. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/AC/Chol 50:15:35
27. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistChol/Chol 50:15:35 hat.
28. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 -5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HistChol/Chol 50:15:35 hat.
29. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/DG- Succ/Chol 20:10:30:40 hat.
30. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HistSuccDG/Chol 50:15:35 hat.
31. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/lsoHistSuccDG/Chol 50: 15:35 hat.
32. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistSuccDG/Chol 50:15:35 hat.
33. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/lsoHistSuccDG/Chol 50:15:35 hat.
34. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/DG- Succ/Chol 20: 10:30:40 hat.
35. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/MoChol/Chems/Chol 40:10:10:40 hat.
36. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/HistChol/Chol 50:10:40 hat.
5 37. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/DOTAP/Chems/Chol 30:10:20:40 hat.
38. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, 0 dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/HisChol/DGSucc/Chol 40:10:10:40 hat.
39. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung
5 POPC/HisChol/Chems/Chol 40: 10: 10:40 hat.
40. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/Chems/Chol 40:10:10:40 hat. o
41. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/MoChol/DGSucc/Chol 30:20:10:40 hat.
5 42. Verwendung einer liposomalen Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen Behandlung eines Säugetieres.
43. Verwendung einer liposomalen Formulierung nach dem vorhergehenden Anspruch, 0 dadurch gekennzeichnet, dass das Säugetier ein Mensch ist.
44. Verwendung einer liposomalen Formulierung nach Anspruch 42 oder 43 zur parenteralen Applikation, bevorzugt zur intravenösen Applikation.
5 45. Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 41 , dadurch gekennzeichnet, dass sie einen oder mehrere Wirkstoffe enthält.
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006048329A1 (en) * 2004-11-05 2006-05-11 Novosom Ag Improvements in or relating to pharmaceutical compositions comprising an oligonucleotide as an active agent
WO2006053646A3 (en) * 2004-11-19 2006-08-17 Novosom Ag Improvements in or relating to pharmaceutical compositions for local administration
EP1764090A1 (de) * 2005-09-15 2007-03-21 Novosom AG Amphotere Liposomen zur lokalen Verabreichung von Arzneistoffen
WO2007064857A3 (en) * 2005-12-01 2007-08-30 Pronai Therapeutics Inc Amphoteric liposome formulation
WO2008043575A3 (en) * 2006-10-13 2008-09-04 Novosom Ag Improvements in or relating to amphoteric liposomes
EP2004141A2 (de) * 2006-03-17 2008-12-24 Novosom AG Effizientes verfahren zum beladen von amphoteren liposomen mit nukleinsäure-wirkstoffen
WO2009047006A3 (en) * 2007-10-12 2009-09-24 Novosom Ag Amphoteric liposomes comprising neutral lipids
EP2141173A1 (de) * 2004-06-01 2010-01-06 Pronai Therapeutics, Inc. Verfahren und Zusammensetzungen zur Hemmung der Genexpression
EP1960415A4 (de) * 2005-11-16 2011-09-21 Idexx Lab Inc Phospholipidgelzusammensetzungen zur verabreichung von aptameren und verfahren zur behandlung von leiden unter anwendung davon
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
WO2014071406A1 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Pronai Therapeutics, Inc. Methods of using biomarkers for the treatment of cancer by modulation of bcl2|expression
EP3000480A1 (de) 2005-12-01 2016-03-30 ProNAi Therapeutics, Inc. Krebstherapien und dabei verwendete pharmazeutische zusammensetzungen
WO2016125163A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. LIPID ASSEMBLIES AND USES THEREOF AND SOME pH AND ELECTROSTATIC MODULATING LIPIDS TO BE USED IN SAID ASSEMBLIES

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8815599B2 (en) * 2004-06-01 2014-08-26 Pronai Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the inhibition of gene expression
GB0720486D0 (en) * 2007-10-19 2007-11-28 Univ Edinburgh Cationic lipids
WO2009149418A2 (en) * 2008-06-06 2009-12-10 Asuragen, Inc. Novel compositions for the in vivo delivery of rnai agents
WO2012091523A2 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Samyang Biopharmaceuticals Corporation Carrier for negatively charged drugs comprising a cationic lipid and a preparation method thereof
CA3071968A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Kyowa Kirin Co., Ltd. Nucleic acid-containing lipid nanoparticle
US12115230B2 (en) 2020-04-09 2024-10-15 Verve Therapeutics, Inc. Base editing of ANGPTL3 and methods of using same for treatment of disease
WO2022060871A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Verve Therapeutics, Inc. Lipid formulations for gene editing
CN118001254B (zh) * 2024-04-09 2024-07-26 北京悦康科创医药科技股份有限公司 靶向抗原呈递细胞的脂质组合物及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6649780B1 (en) * 1998-12-22 2003-11-18 Valentis, Inc. Cationic lipids
DE10109897A1 (de) * 2001-02-21 2002-11-07 Novosom Ag Fakultativ kationische Liposomen und Verwendung dieser
DE10207178A1 (de) * 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen
EP1811960A2 (de) * 2004-11-19 2007-08-01 Novosom AG Verbesserungen von oder im zusammenhang mit pharmazeutischen zusammensetzungen zur lokalen verabreichung

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2141173A1 (de) * 2004-06-01 2010-01-06 Pronai Therapeutics, Inc. Verfahren und Zusammensetzungen zur Hemmung der Genexpression
EP1658839A1 (de) * 2004-11-05 2006-05-24 Novosom AG Kombinationen von Oligonukleotid und Träger, die auf den CD40 zielgerichtet sind
WO2006048329A1 (en) * 2004-11-05 2006-05-11 Novosom Ag Improvements in or relating to pharmaceutical compositions comprising an oligonucleotide as an active agent
WO2006053646A3 (en) * 2004-11-19 2006-08-17 Novosom Ag Improvements in or relating to pharmaceutical compositions for local administration
EP1764090A1 (de) * 2005-09-15 2007-03-21 Novosom AG Amphotere Liposomen zur lokalen Verabreichung von Arzneistoffen
EP1960415A4 (de) * 2005-11-16 2011-09-21 Idexx Lab Inc Phospholipidgelzusammensetzungen zur verabreichung von aptameren und verfahren zur behandlung von leiden unter anwendung davon
WO2007064857A3 (en) * 2005-12-01 2007-08-30 Pronai Therapeutics Inc Amphoteric liposome formulation
EP3000480A1 (de) 2005-12-01 2016-03-30 ProNAi Therapeutics, Inc. Krebstherapien und dabei verwendete pharmazeutische zusammensetzungen
EP2004141A2 (de) * 2006-03-17 2008-12-24 Novosom AG Effizientes verfahren zum beladen von amphoteren liposomen mit nukleinsäure-wirkstoffen
JP2010505899A (ja) * 2006-10-13 2010-02-25 ノヴォソム アクチェンゲゼルシャフト 両性リポソームにおけるまたは両性リポソームに関する改善、両性リポソームを処方する方法および両性リポソームに充填する方法
AU2014203387B2 (en) * 2006-10-13 2016-07-07 Marina Biotech, Inc. Improvements in or relating to amphoteric liposomes
US9283186B2 (en) 2006-10-13 2016-03-15 Marina Biotech, Inc. Amphoteric liposomes, a method of formulating an amphoteric liposome and a method of loading an amphoteric liposome
WO2008043575A3 (en) * 2006-10-13 2008-09-04 Novosom Ag Improvements in or relating to amphoteric liposomes
EP2462924A3 (de) * 2006-10-13 2013-01-23 Marina Biotech, Inc. Verbesserungen an oder im Zusammenhang mit amphoteren Liposomen
AU2007306556B2 (en) * 2006-10-13 2014-04-10 Marina Biotech, Inc. Improvements in or relating to amphoteric liposomes
JP2011500520A (ja) * 2007-10-12 2011-01-06 ノヴォソム アクチェンゲゼルシャフト 中性脂質を含有する両性リポソームの改良または該両性リポソームに関連する改良
AU2008309880B2 (en) * 2007-10-12 2014-07-10 Biontech Delivery Technologies Gmbh Amphoteric liposomes comprising neutral lipids
JP2015110625A (ja) * 2007-10-12 2015-06-18 マリーナ バイオテック，インコーポレイテッド 中性脂質を含む両性リポソーム
WO2009047006A3 (en) * 2007-10-12 2009-09-24 Novosom Ag Amphoteric liposomes comprising neutral lipids
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
WO2014071406A1 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Pronai Therapeutics, Inc. Methods of using biomarkers for the treatment of cancer by modulation of bcl2|expression
WO2016125163A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. LIPID ASSEMBLIES AND USES THEREOF AND SOME pH AND ELECTROSTATIC MODULATING LIPIDS TO BE USED IN SAID ASSEMBLIES
US10722599B2 (en) 2015-02-04 2020-07-28 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Lipid assemblies and uses thereof and some pH and electrostatic modulating lipids to be used in said assemblies

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Publication number Publication date
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