WO2005098017A1 - Procede de production de banques de peptides - Google Patents

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WO2005098017A1
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screening
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Malcolm Buckle
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
École Normale Supérieure Paris-Saclay
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure de Cachan
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of peptide banks by cleavage / cleavage of cellular proteins, to the peptide banks obtained by this process and to a process for screening peptides from this bank having an affinity for an immobilized target molecule.
  • the therapeutic pharmacology aims in particular to discover new molecules which intervene in cellular and metabolic processes. Most of these processes involve macromolecular interactions, such as protein-protein and protein-nucleic acid interactions. These interactions themselves are fundamental to cell metabolism and are therefore involved in normal or pathological cellular processes as diverse as proliferation, differentiation, oncology, growth, immunodeficiency and senescence.
  • the search for new active principles generally involves the knowledge of one or more biological targets and the search for molecules capable of binding to these targets.
  • This second step requires having recourse either to the design of molecules by molecular modeling, or to the screening of the greatest possible number of molecules in order to optimize the chances of finding a molecule having the desired activity. Then, the molecule which is fixed on the target is analyzed and the interaction is quantified.
  • the analysis of protein partners in macromolecular complexes is conventionally carried out by proteomics techniques, in particular by electrophoretic analysis on 2D gel, and the identification of these proteins is carried out subsequently by mass spectrometry.
  • proteomics techniques which aim to characterize the proteome (total protein content of a cell) at a given time, have neither the resolution nor the sensitivity required to identify a protein in a mixture at a concentration about a few femtomoles in a hundred microliters of cell extracts (final concentration below the pico mole).
  • 2D gels allow at best to visualize 10,000 proteins - the most numerous proteins in a cell - that is to say a limited number of proteins present. Consequently, proteins existing in small quantities will not be detected. This problem is accentuated by the fact that the techniques of isolation and preparation of multi-protein complexes used prior to analysis often damage or even destroy them. In the field of research for new molecules with therapeutic potential, there is a real need to define the peptides which are involved in biological interactions. The attachment of peptides to protein targets is commonly determined by standard physico-chemical techniques (bridging, fluorescence, SPR, ELISA, RIA).
  • the inhibitory effects of the peptides are characterized by in vitro tests based on a possible demonstration of a non-competitive (desirable) or competitive (less desirable) effect of these peptides with respect to the target protein.
  • the peptides with a high affinity and / or an inhibitory effect are then selected to be tested during the phase of clinical trials.
  • the techniques listed above have the disadvantages of being laborious, especially if a large number of peptides must be analyzed; they generate artifacts such as false positives or false negatives; they are non-quantitative. In addition, they often require labeling of the molecules by radioactivity or fluorescence and are often of inadequate sensitivity (ELISA, Biacore ®, RIA).
  • This approach made it possible to isolate calmodulin from bovine brain extracts and to characterize the affinity of calmodulin for a fragment of myosin.
  • the authors of this article indicate that the SPR technique makes it possible to determine in real time the specificity of binding, the concentration of biologically active molecules in a sample, as well as the protein and peptide binding and affinity kinetics.
  • the SPR / MS coupling has the advantage of making it possible to dispense with any labeling of the molecules of the analyte by a fluorescent or radioactive element. In this way, it is possible to reduce the risks of alteration of the structure and activity of the molecules to be analyzed, and not to expose oneself to the problems inherent in fluorescence and spectrometry techniques.
  • the problem posed was the isolation of a molecule from a raw biological sample.
  • the problem which the present invention seeks to solve is that of the preparation of a library of peptides of random nature with a view to carrying out screening on targets of biological interest.
  • the peptide libraries produced up to now have generally been prepared by chemical synthesis or by the technique known as "phage presentation", which are extremely expensive techniques. If these routes make it possible to prepare peptides of random sequence, they are too costly to allow the use of the peptide banks resulting therefrom systematically.
  • molecular modeling experiments are more generally used in order to define the general profile of the molecules likely to have an affinity for this target, then to the synthesis of molecules corresponding to this profile.
  • a human cell has a genome that contains a limited number of genes (about 40,000), but it is able to generate more than a million different proteins thanks to the alternative splicing system, post-translational modifications and variability of protein folding.
  • the invention therefore proposes to use the high protein richness of the cell to build peptide banks.
  • the subject of the present invention is a process for producing a library of peptides, characterized in that: (i) the starting product is one or more cells; (ii) the protein components of the cell are isolated to form a protein composition; (iii) the protein composition obtained in step (ii) is subjected to a cleavage treatment.
  • the protein material contained in the cells is isolated from the cells in known manner by appropriate physical, chemical or biological treatment.
  • the protein composition can either be made up of a single type of protein, or a mixture of different proteins. Proteins can be phosphorylated, glycosylated, mistrylées or be carrying any substituent of natural or synthetic origin.
  • the protein composition is then subjected to a cleavage treatment.
  • the cleavage of proteins can be done by physicochemical, biological treatment or by a combination of treatments.
  • treatment with hydroxyl radicals which consists in administering to the protein composition a product which generates hydroxyl radicals (HO * ) in the aqueous solution in which the proteins.
  • Such treatment may consist of administration of H 2 O 2 .
  • Treatment with hydroxyl radicals causes a breakdown of peptide bonds which occurs randomly on any peptide bond of any protein.
  • the concentration of hydroxyl radicals determines the importance of the number of cleavages operated and therefore the more or less significant length of the peptide fragments resulting from this treatment.
  • Other chemical treatments can also be used, for example the treatment with cyanogen bromide (CNBr) which specifically cleaves the peptide bonds at the level of the carboxylic group of the methionyl residues.
  • CNBr cyanogen bromide
  • the proteins are cut off by a process which comprises at least one step of enzymatic treatment.
  • proteases The enzymes that perform proteolysis, called proteases, cut proteins at specific locations. Each protease generally recognizes a sequence of amino acids within which it always makes the same cut. Certain proteases recognize a single amino acid or a sequence of two amino acids between which they operate, other proteases recognize only longer sequences. These proteases can be endoproteases or exoproteases.
  • proteases there are: - specific enzymes such as trypsin which splits the peptide bond at the level of the carboxylic group of the Arg and Lys residues, the endolysin which cleaves the peptide bond of the group -CO of lysines, chymotrypsin which hydrolyzes the peptide bond at the level of the carboxylic group of aromatic residues (Phe, Tyr and Trp), the pepsin which cuts at the level of the NH 2 group of aromatic residues (Phe, Tyr and Trp), the N8 protease of the N8 strain of Staphylococcus aureus which cleaves the peptide bond at the level of the carboxylic group of the Glu residue; - non-specific enzymes such as thermolysin from the bacterium Baeillus thermoproteolyticus which hydrolyzes the peptide bond of the ⁇ H 2 group of hydrophobic amino acids (Xaa-Leu, Xaa-I
  • the cells are obtained from a biological sample.
  • biological sample is meant a product resulting from an extraction or a sample from a human, animal or plant organism.
  • a biological sample usable in the method of the present invention consists of one or more cells.
  • the biological sample usable in the process of the invention can also be a biological tissue such as for example a tissue taken during a biopsy; it can be a bodily or vegetable fluid such as blood, urine, sap.
  • the cells can also come from a cell line in culture.
  • the sample is subjected to a first treatment aimed at isolating the cells contained in this sample then these cells are themselves subjected to a treatment intended to isolate the protein material contained in these cells.
  • a first treatment aimed at isolating the cells contained in this sample then these cells are themselves subjected to a treatment intended to isolate the protein material contained in these cells.
  • cell cultures it is possible to use cell cultures as a starting biological sample and in this case the isolation of the cells is not necessary.
  • the starting material is biological tissue
  • this is subjected to a first treatment aimed at breaking down the cell walls.
  • the treatment can be physical, chemical or biological in nature as described above, then the protein fraction is recovered using techniques such as centrifugation.
  • the great variety of the proteome contained in a single cell means that the treatment of this proteome with a single protease makes it possible to obtain peptides of extremely varied sequence and length. If it is impossible to obtain by this method the infinite variety of sequences resulting from systematic combinations of natural amino acids, nevertheless, the method of the invention makes it possible to obtain a set of peptides containing a large number of peptides and of great variety both in terms of length and in terms of sequences.
  • the variety and richness of the peptide libraries obtained by the process of the invention is greater than that which can be obtained by synthesis under acceptable economic conditions. If it is desired to limit the size of the peptides constituting the peptide bank, it is possible, after the proteolysis step, to select the peptides according to their size. This can be done for example by chromatography on a size exclusion column. The peptide banks can also be sorted according to the charge or the hydrophilicity / hydrophobicity of their constituents.
  • the present invention also relates to libraries of peptides capable of being obtained by the method of the invention.
  • the peptide libraries of the invention are characterized by the large number of different peptides which they comprise.
  • a human cell comprising more than 20,000 different proteins, the peptide libraries of the invention can contain more than 20,000 distinct peptides, preferably more than 40,000 distinct peptides, even more preferably more than 10 distinct peptides, advantageously still more than 10 distinct peptides.
  • the present invention also relates to the use of a library of peptides obtained by the method of the invention, for the screening of molecules having an affinity for a given target molecule.
  • target molecule or “target” is understood to mean any molecule or any fragment of a molecule generally of biological origin, the behavior and the affinities of which are sought to be studied. It is most often a macromolecule (protein, DNA molecule, carbohydrate or lipid) or even an entire cell. It can also be a peptide, a co-factor such as acetyl coA or cyclic AMP, a group of hemes or a chemical compound such as a steroid, an amino acid amended....
  • the screening of peptide libraries of the invention is useful in pharmacology, in particular for searching for new peptides with therapeutic potential which may have a modulating role (activator or inhibitor) on already known molecules.
  • the peptides obtained after screening can be used during the diagnosis of pathological states, or as markers (cellular or other).
  • the screening of peptide libraries is also useful for studying the mechanisms of action of known therapeutic compounds: it is possible to search with which peptide sequences these therapeutic compounds have an affinity and thus find their biological targets. Such a study makes it easier, for example, to predict the side effects of such a compound.
  • a subject of the invention is also a screening kit for searching for molecules having an affinity for a chosen target, this screening kit comprising a library of peptides as described above.
  • the subject of the invention is also a method of screening for peptides having an affinity for a target molecule, characterized in that it comprises the steps of: (i) production of a library of peptides by the method of the invention such as described above; (ii) bringing the peptide bank into contact with the target molecule (s) fixed on a support; (iii) elimination of peptides having no affinity for the target molecule (s); (iv) isolation and characterization of the peptides having an affinity for the target molecule (s).
  • screening defines any method allowing the search, identification and sorting of peptide (s) from among the peptide bank (s).
  • the target molecule is a protein.
  • the target molecule is fixed on a solid support such as a polymer (chromatography resin, filter for example), magnetic beads, a glass or silicon plate ...
  • the contacting of the peptide bank with the target is made by impregnating the peptide bank on the support when the latter is a plate, a chromatography column or a filter or by mixing the peptide bank with solid particles on which the targets are fixed.
  • the elimination of peptides which have no affinity for the target molecule is done in a known manner by elution, filtration and / or washing.
  • the peptides having an affinity for the target molecule are then isolated in a known manner from the support to which the target molecule is attached and analyzed by any means known to those skilled in the art, in particular by nuclear magnetic resonance or by mass spectrometry.
  • the screening of the peptide library is carried out using a technique which makes it possible to quantify the interaction of the peptides with the target coupled with a technique allowing the identification of the peptides having interacted with the molecule (s). targets.
  • an interaction measurement technique is chosen which makes it possible to provide a quantification of the interaction in real time.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the surface plasmon resonance phenomenon takes place on the surface of a thin layer of metal on which a polarized light source comes to the surface with a defined angle; the intensity of the reflected light is continuously recorded.
  • the peptides interacting with one or more target molecules are screened in the following manner: a) production of a library of peptides by the method of the invention as described above; b) immobilization of one or more target molecule (s) on a suitable support; c) bringing the peptide library into contact (incubation) with the target molecule (s); d) analysis of the binding affinity of the peptides on the target molecules by means of the SPR technique; e) elimination of peptides having no affinity for the target molecule (s); f) elution of the peptides attached to the target molecules; g) identification of these peptides by mass spectrometry; Steps d) and e) can be carried out in reverse order.
  • the purpose of this method is to quantitatively determine the specific interactions between one or more peptide (s) and one or more immobilized target molecule (s), then to identify the peptides which have a determined affinity for the one or more target molecule (s) immobilized.
  • the support suitable for the immobilization of one or more target molecules according to the invention is a surface which allows a sensitive fixation analysis and in real time using techniques such as SPR and optionally which also allows the practice of mass spectrometry.
  • a biochip is used as a support for immobilizing the target molecule (s).
  • a biochip is generally a glass surface covered by a thin film of gold.
  • Biochips which are particularly suitable for the invention, mention may be made of those of the Biacore® type (sold by the company Biacore), there are different types depending on the type of target molecules to be immobilized on the support.
  • Target molecules can be immobilized on a surface prior to the use of the SPR technique according to a variety of protocols; the choice of protocol being dictated by the very nature of the SPR device and / or by the nature of the target molecule.
  • a current and appropriate immobilization involves the use of biotinylated nucleic acids on surfaces covered with streptavidin.
  • the nucleic acids can be fixed using streptavidin adducts located at the 5 'or 3' end of the nucleic acid chain, on a surface covered by biotin.
  • Target proteins can either be directly immobilized chemically via charged residues (lysines) on surfaces having carboxylic or epoxy groups in an SPR device, or indirectly by means of appropriate tags (“tags”) such as extensions. based on N or C terminal hexahistidine or glutathione. Target proteins can be captured on chelation surfaces or coated with glutathione S transferase. There are a growing number of techniques for the derivation and production of biochip surfaces.
  • surfaces methylated by carboxylic groups can be activated by treatment with carbodiimide and / or hydroxysuccinimide to generate activated carboxylic groups capable of forming covalent bonds with non-protonated amines (usually side chain residues based on lysine) of a protein.
  • the protocol for immobilizing target molecules on a support according to the BIAcore® configuration is particularly suited to the invention (we can refer to http://www.biacore.com/home.lasso).
  • SPR technique a mixture of peptides or a preselected fraction of a mixture is brought into contact with the immobilized target molecules to measure the interaction by changes in the resonance of the surface plasmons.
  • the fractionation can be carried out on the basis of some physicochemical properties of the peptide such as its size, its charge or its hydrophobicity index.
  • the peptides which have been physically retained by the target molecule are eluted or made volatile (desorbed) for characterization.
  • Surfaces which have not been treated with target molecules are used as negative controls; these negative controls are then subjected to the same treatment as above.
  • This technique makes it possible to characterize the interaction between the peptides and the target molecules by physico-chemical parameters such as the dissociation constant at equilibrium (Ko).
  • the complex mixtures of peptides which are eluted from the immobilization surface are analyzed after analysis by SPR using any suitable means.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • SELDI® mass spectrometry SELDI® mass spectrometry
  • gel electrophoresis a preferred variant of the method of the invention, the peptides eluted or directly desorbed from the SPR support are then identified by their mass and by their structure by means of mass spectrometry (MS).
  • MS mass spectrometry
  • mass spectrometry makes it possible, among other things, to: measure the molecular mass of the peptides eluted from the surface, and thus to characterize the proteins by mapping the masses of the eluted peptides; identify peptides at very low concentrations; partially or totally sequence the eluted peptides. Characterization of the peptides by mass spectrometry is carried out by coupling a desorption / ionization means with a mass measurement means.
  • peptides with therapeutic potential having an activating or inhibiting role on already known molecules.
  • These peptides can be: ligands having a quantified affinity for an immobilized macromolecule; - very interesting candidates as inhibitors of the immobilized macromolecule; partners in protein complexes.
  • said method can provide reagents capable of being used in diagnostic tests, as well as of generating new affinity markers.
  • the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the present invention as well as to the appended drawing, in which: - Figure 1 shows all the peptides obtained after digestion of bovine serum albumin (BSA) with trypsin, protease N8 from Staphylococcus aureus and chymotrypsin.
  • BSA bovine serum albumin
  • Example 1 Production of a peptide bank by enzymatic digestion 1.1 Cell lysis
  • a lysis buffer Tris HC1 50 mM pH 8.3; glycerol 5%; maCl 300 mM; 0.05% deoxycholate
  • the homogenate is then centrifuged at 11,000 g for 60 minutes at 4 ° C.
  • Precipitation of the proteins The proteins of the supernatant originating from cell lysis are precipitated by addition of ammonium sulphate to a final concentration of 40% (weight / volume) and the solution is stirred at 4 ° C.
  • Digestion of proteins Digestion is carried out with trypsin under denaturing conditions. Trypsin cleaves after lysine (K) or arginine (R) residues in a protein sequence.
  • the protein pellet is suspended in 0.5 ml of denaturation buffer (0.375 g KCl, 0.09 g of EDTA, 1.15 g of ⁇ H 4 H 2 PO 4 , 50 g of guanidine-HCl and supplemented with water up to 100 ml). The pH is adjusted to 8.5.
  • the reaction is stopped by adding TFA to a final concentration of 0.1% (or by any acid suitable for lowering the pH).
  • the mixture obtained can then be further purified by elution on a size exclusion column making it possible to recover proteins and peptides of molecular weight less than approximately 700O Da using, for example, columns with peptides of Superdex type (Amersham Bioscience) on an HPLC device.
  • EXAMPLE 2 Peptides Obtained by Digestion of BSA with Various Proteases
  • BSA bovine serum albumin
  • Figure 1 shows the peptides generated by the treatment with trypsin, protease V8 of the bacterium Staphylococcus aureus and with chymotrypsin. Trypsin digestion makes it possible to generate a series of 38 peptides having between 7 and 21 amino acids; the entire BSA protein is represented since the total length of the peptides is 447 amino acids. Banks of different peptides are obtained after digestion with other proteases, such as chymotrypsin (sequences of a complementary nature). In this example, a single small protein was digested with one or more protease (s).
  • protease protease
  • Example 3 Protocol for Evaluating the Interaction with a Target Molecule Fixed on a Biacore® 2.1 Type Surface - Immobilization of the Target Molecules on a Surface Suitable for the Use of the SPR Technique
  • Buckle M 'Surface Plasmon Resonance applied to DNA-protein complexes' in DNA-Protein interactions principles and protocols 2nd edition (Tom Moss ed) (2001) vol 148 535-546; Persson, B., Buckle, M & Stockley, PG 'Kinetics of DNA interactions studied by surface plasmon resonance'in Protein-DNA Interactions: A Practical Approach (M. Buckle & A.

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Abstract

Procédé de production de banques de peptides par coupure/clivage de protéines cellulaires. Banques de peptides obtenues par ce procédé. Procédé de criblage de peptides ayant une affinité pour une molécule cible immobilisée.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE BANQUES DE PEPTIDES Lia présente invention est relative à un procédé de production de banques de peptides par coupure/clivage de protéines cellulaires, aux banques de peptides obtenues par ce procédé et à un procédé de criblage de peptides issus de cette banque ayant une affinité pour une molécule cible immobilisée. La pharmacologie thérapeutique a notamment pour objectif de découvrir de nouvelles molécules qui interviennent dans les processus cellulaires et métaboliques. La plupart de ces processus impliquent des interactions macromoléculaires, comme par exemple, des interactions protéine-protéine et protéine-acide nucléique. Ces interactions elles-mêmes sont fondamentales pour le métabolisme des cellules et sont donc impliquées dans des processus cellulaires normaux ou pathologiques aussi divers que la prolifération, la différenciation, Poncologie, la croissance, Pimmunodéficience et la sénescence. La recherche de nouveaux principes actifs implique généralement la connaissance d'une ou de plusieurs cibles biologiques et la recherche de molécules susceptibles de se lier à ces cibles. Cette seconde étape nécessite d'avoir recours, soit à la conception de molécules par modélisation moléculaire, soit au criblage du plus grand nombre possible de molécules afin d'optimiser les chances de trouver une molécule ayant l'activité souhaitée. Ensuite, la molécule qui s'est fixée sur la cible est analysée et l'interaction est quantifiée. L'analyse des partenaires protéiques dans les complexes macromoléculaires est classiquement effectuée par des techniques de protéomique, notamment par l'analyse électrophorétique sur gel 2D, et l'identification de ces protéines est réalisée ultérieurement par spectrométrie de masse. Les technologies émergentes comme la spectrométrie de masse de type SELDI (« surface enhanced laser desorption/ionisation ») et les puces à protéines (ProteinChip™) peuvent remplacer l'analyse sur gel 2D pour l'étude des protéines ; elles présentent l'avantage de mettre en évidence la fonctionnalité des interactions dans les complexes macromoléculaires. Or, ces techniques en protéomique, qui ont pour but la caractérisation du protéome (contenu total en protéines d'une cellule) à un instant donné, ne possèdent ni la résolution, ni la sensibilité requises pour identifier une protéine dans un mélange à une concentration d'environ quelques femtomoles dans une centaine de microlitres d'extraits cellulaires (concentration finale inférieure à la pico mole). En effet, les gels 2D permettent au mieux de visualiser 10.000 protéines - soit les protéines les plus nombreuses dans une cellule - c'est-à-dire un nombre restreint de protéines présentes. Par conséquent, les protéines existant en faible quantité ne seront pas détectées. Ce problème est accentué par le fait que les techniques d'isolement et de préparation des complexes multi-protéiques utilisés préalablement à l'analyse souvent endommagent ou même détruisent ceux-ci. Dans le domaine de la recherche de nouvelles molécules à potentiel thérapeutique, il existe un besoin réel de définir les peptides qui sont impliqués dans des interactions biologiques. La fixation des peptides sur les cibles protéiques est déterminée couramment par les techniques physico-chimiques classiques (pontage, fluorescence, SPR, ELISA, RIA). Les effets inhibiteurs des peptides sont caractérisés par des essais in vitro basés sur une éventuelle mise en évidence d'un effet non compétitif (souhaitable) ou compétitif (moins souhaitable) de ces peptides par rapport à la protéine cible. Les peptides présentant une forte affinité et/ou un effet inhibiteur sont alors sélectionnés pour être testés au cours de la phase d'essais cliniques. Les techniques énumérées ci-dessus présentent comme inconvénients d'être laborieuses, surtout si un nombre important de peptides doit être analysé ; elles engendrent des artefacts comme des faux-positifs ou des faux-négatifs ; elles sont non-quantitatives. De plus, elles nécessitent souvent de marquer les molécules par radioactivité ou fluorescence et sont souvent d'une sensibilité inadéquate (ELISA, Biacore ®, RIA). Il en résulte que la proportion de peptides identifiés comme inhibiteurs qui sont ultérieurement soumis aux essais cliniques reste très faible, en grande partie parce que ces peptides présentent souvent des effets inhibiteurs non souhaités. En outre, la synthèse puis le marquage de peptides sont des opérations longues et coûteuses. Des études antérieures ont montré qu'il était possible d'isoler et d'identifier des protéines spécifiques en faible quantité dans des échantillons biologiques grâce à l'utilisation de la technique dite de résonance des plasmons de surface (SPR) couplée à la spectrométrie de masse (MS) (A. Zhukov et al., PharmaGenomics, March/April 2002). Les Auteurs de cet article précisent que l'association en tandem des techniques SPR et MS permet de fournir sur les protéines cibles des informations aussi bien fonctionnelles que structurales. Cette démarche a permis d'isoler la calmoduline à partir d'extraits de cerveau bovin et de caractériser l'affinité de la calmoduline pour un fragment de myosine. Les auteurs de cet article indiquent que la technique SPR permet de déterminer en temps réel la spécificité de liaison, la concentration des molécules biologiquement actives dans un échantillon, ainsi que les cinétiques de liaison et d'affinité protéine/peptide. Le couplage SPR/MS a pour avantage de permettre de s'affranchir de tout marquage des molécules de l'analyte par un élément fluorescent ou radioactif. De cette manière, il est possible de réduire les risques d'altération de la structure et de l'activité des molécules à analyser, et de ne pas s'exposer aux problèmes inhérents aux techniques de fluorescence et de spectrométrie. Toutefois dans le procédé décrit dans cet article, le problème posé était l'isolement d'une molécule à partir d'un échantillon biologique brut. Le problème que la présente invention cherche à résoudre est celui de la préparation d'une banque de peptides à caractère aléatoire en vue de réaliser un criblage sur des cibles d'intérêt biologique. Les banques de peptides produites jusqu'à ce jour étaient généralement préparées par synthèse chimique ou par la technique dite de « présentation des phages », qui sont des techniques extrêmement coûteuses. Si ces voies permettent de préparer des peptides de séquence aléatoire, elles présentent un coût trop élevé pour permettre l'utilisation des banques de peptides en résultant de façon systématique. Lorsqu'une cible biologique est identifiée et isolée, on a plus généralement recours à des expériences de modélisation moléculaire de façon à définir le profil général des molécules susceptibles d'avoir une affinité pour cette cible, puis à la synthèse de molécules correspondant à ce profil général et enfin à des tests biologiques sur la cible. Cette démarche n'a pas le caractère systématique du criblage de banques de molécules engendrées de façon aléatoire. On a donc cherché à mettre au point un procédé de préparation d'une banque de peptides qui permette d'accéder à un mélange de peptides variés, à caractère aléatoire, et qui soit suffisamment économique pour permettre son utilisation dans les expériences de routine. Une cellule humaine possède un génome qui contient un nombre limité de gènes (environ 40.000), mais elle est capable de générer plus d'un million de protéines différentes grâce au système d'épissage alternatif, aux modifications post- traductionnelles et à la variabilité de repliement des protéines. L'invention se propose donc d'utiliser la grande richesse protéique de la cellule pour construire des banques de peptides. La présente invention a pour objet un procédé de production d'une banque de peptides, caractérisé en ce que : (i) le produit de départ est une ou plusieurs cellules ; (ii) les constituants protéiques de la cellule sont isolés pour former une composition de protéines ; (iii) la composition de protéines obtenue à l'étape (ii) est soumise à un traitement de clivage. L'isolement du matériau protéique contenu dans les cellules à partir des cellules est fait, de façon connue, par un traitement physique, chimique ou biologique approprié. On peut, par exemple, réaliser une lyse (disruption) des cellules permettant de favoriser la libération des protéines. Cette lyse est généralement effectuée grâce à un homogénéisateur. D'autres méthodes peuvent être utilisées, comme par exemple la provocation d'un choc osmotique (avec éventuellement l'ajout de détergents comme le NP-40 ou Triton X-100), la sonication, l'utilisation d'une bombe à disruption ou de billes de verre, l'application d'une pression élevée à la cellule (technique dite de « french press »). Lorsque les cellules sont rompues, on isole la fraction protéique qui peut être plus ou moins pure, en utilisant une ou plusieurs des techniques connues dont la précipitation par le sulfate d'ammonium, la centrifugation, la chromatographie (chromatographie par échange d'ion, chromatographie d'exclusion de taille, chromatographie d'affinité de type hydrophile/hydrophobe). Ce traitement permet d'éliminer les autres constituants de la cellule tels que les sucres, les acides nucléiques, les lipides... A partir d'un échantillon biologique qui peut provenir d'un prélèvement ou d'une culture, on a donc obtenu une ou plusieurs cellules et à partir de ces cellules on a isolé le matériau protéique les constituant. La composition de protéines peut être soit constituée d'un seul type de protéines, ou alors d'un mélange de protéines différentes. Les protéines peuvent être phosphorylées, glycosylées, mistrylées ou être porteuses de tout substituant d'origine naturel ou synthétique.
Conformément au procédé de l'invention, la composition de protéines est alors soumise à un traitement de clivage. Le clivage des protéines peut être fait par un traitement physico-chimique, biologique ou par une combinaison de traitements. Parmi les traitements utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer le traitement par des radicaux hydroxyles qui consiste à administrer à la composition de protéines un produit qui génère des radicaux hydroxyles (HO*) dans la solution aqueuse dans laquelle se trouvent les protéines. Un tel traitement peut consister en une administration de H2O2. Le traitement par les radicaux hydroxyles provoque une coupure des liaisons peptidiques qui se fait de manière aléatoire sur n'importe quelle liaison peptidique de n'importe quelle protéine. La concentration en radicaux hydroxyles détermine l'importance du nombre de clivages opérés et donc la longueur plus ou moins importante des fragments peptidiques issus de ce traitement. D'autres traitements chimiques peuvent être également utilisés comme par exemple le traitement par le bromure de cyanogène (CNBr) qui scinde spécifiquement les liaisons peptidiques au niveau du groupe carboxylique des résidus méthionyl. Il est également possible de réaliser un clivage acide partiel au niveau des résidus aspartyl par chauffage à 100°C d'une solution de protéines dans de l'acide trifluoroacétique. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la coupure des protéines est effectuée par un procédé qui comporte au moins une étape de traitement enzymatique. L'avantage que présente ce traitement par rapport au traitement physico-chimique réside dans le fait qu'il préserve davantage la structure des protéines, et qu'il est plus facile à contrôler. Par « traitement enzymatique », on entend l'action simple ou combinée d'une ou de plusieurs enzymes dans des conditions de réaction appropriées. Les enzymes effectuant la protéolyse, appelées protéases, coupent les protéines à des endroits spécifiques. Chaque protéase reconnaît généralement une séquence d'acides aminés au sein desquels elle effectue toujours la même coupure. Certaines protéases reconnaissent un seul acide aminé ou une séquence de deux acides aminés entre lesquels elles opèrent un clivage, d'autres protéases ne reconnaissent que des séquences plus longues. Ces protéases peuvent être des endoprotéases ou des exoprotéases. Parmi les protéases connues, on trouve : - les enzymes spécifiques comme la trypsine qui scinde la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique des résidus Arg et Lys, l'endolysine qui clive la liaison peptidique du groupe -CO des lysines, la chymotrypsine qui hydrolyse la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique des résidus aromatiques (Phe, Tyr et Trp), la pepsine qui coupe au niveau du groupe NH2 des résidus aromatiques (Phe, Tyr et Trp), la protéase N8 de la souche N8 de Staphylococcus aureus qui clive la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique du résidu Glu ; - les enzymes non-spécifiques comme la thermolysine provenant de la bactérie Baeillus thermoproteolyticus qui hydrolyse la liaison peptidique du groupe ΝH2 des acides aminés hydrophobes (Xaa-Leu, Xaa-Ile, Xaa-Phe), la subtilisine et la pronase qui sont des protéases bactériennes qui hydrolysent pratiquement toutes les liaisons et peuvent transformer les protéines en oligopeptides dans des conditions de réaction contrôlées (concentration en enzyme et durée de réaction). D'autres protéases sont décrites avec leur mode de fonctionnement notamment dans http://cgat.ukm.my/protease/bacterial.html. Plusieurs protéases peuvent être utilisées de façon simultanée, si leurs modes d'action sont compatibles, ou elles peuvent être utilisées de façon successive. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, les cellules sont obtenues à partir d'un échantillon biologique. Par « échantillon biologique », on entend un produit résultant d'une extraction ou d'un prélèvement à partir d'un organisme humain, animal ou végétal. Un échantillon biologique utilisable dans le procédé de la présente invention est constitué d'une ou de plusieurs cellules. L'échantillon biologique utilisable dans le procédé de l'invention peut être également un tissu biologique comme par exemple un tissu prélevé lors d'une biopsie ; il peut être un fluide corporel ou végétal comme du sang, de l'urine, de la sève.
Les cellules peuvent également être issues d'une lignée cellulaire en culture.
De préférence, l'échantillon est soumis à un premier traitement visant à isoler les cellules contenues dans cet échantillon puis ces cellules sont elles- mêmes soumises à un traitement destiné à isoler le matériau protéique contenu dans ces cellules. Bien entendu il est possible d'utiliser des cultures de cellules comme un échantillon biologique de départ et dans ce cas l'isolement des cellules n'est pas nécessaire.
Lorsque le produit de départ est un tissu biologique, celui-ci est soumis à un premier traitement visant à rompre les parois cellulaires. Le traitement peut être de nature physique, chimique ou biologique tel qu'exposé ci-dessus puis la fraction protéique est récupérée en utilisant des techniques telles que la centrifugation. La grande variété du protéome contenu dans une seule cellule fait que le traitement de ce protéome par une seule protéase permet d'obtenir des peptides de séquences et de longueur extrêmement variées. S'il est impossible d'obtenir par ce procédé l'infinie variété des séquences résultant de combinaisons systématiques d'acides aminés naturels, néanmoins, le procédé de l'invention permet d'obtenir un ensemble de peptides contenant un nombre important de peptides et d'une grande variété tant en terme de longueur qu'en terme de séquences. L'utilisation de plusieurs cellules différentes et/ou de plusieurs méthodes de clivage différentes permet d'accroître encore la variété des ensembles de peptides obtenus. La combinaison systématique d'acides aminés naturels en vue de produire toutes les séquences possibles pour un peptide d'une taille donnée ne pourrait être faite que par voie de synthèse et représenterait un travail faramineux, irréalisable du point de vue économique. Si l'on veut en plus obtenir une banque de peptides de tailles variées, la difficulté est encore plus grande. Le procédé de l'invention permet de préparer des banques de peptides qui n'ont pas un caractère exhaustif, ce qui serait impossible à obtenir, quelle que soit la méthode envisagée. En revanche, ces banques de peptides présentent une variété de peptides en terme de taille et de séquence, qui sont suffisantes pour qu'elles puissent être considérées comme un échantillon prélevé aléatoirement dans la totalité des peptides existants. Elles peuvent être considérées comme un échantillon représentatif de l'infinie variété des peptides naturels. La variété et la richesse des banques de peptides obtenues par le procédé de l'invention est supérieure à ce qui peut être obtenu par voie de synthèse dans des conditions économiques acceptables. Si l'on souhaite limiter la taille des peptides constituant la banque de peptides, il est possible, après l'étape de protéolyse, de sélectionner les peptides en fonction de leur taille. Ceci peut être réalisé par exemple par chromatographie sur colonne d'exclusion de taille. On peut également trier les banques de peptides en fonction de la charge ou de l'hydrophilie/hydrophobie de leurs constituants. La présente invention a également pour objet des banques de peptides susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention. Les banques de peptides de l'invention se caractérisent par le grand nombre de peptides différents qu'elles comprennent. Une cellule humaine comprenant plus de 20000 protéines différentes, les banques de peptides de l'invention peut contenir plus de 20000 peptides distincts, préférentiellement plus de 40000 peptides distincts, encore plus préférentiellement plus de 10 peptides distincts, avantageusement encore plus de 10 peptides distincts.
Le caractère aléatoire des banques de peptides obtenues par le procédé de l'invention associé au coût réduit pour leur obtention permet alors de les utiliser dans des tests de routine lors du criblage de molécules.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une banque de peptides obtenue par le procédé de l'invention, pour le criblage de molécules ayant une affinité pour une molécule cible donnée. Au sens de la présente invention, on définit par « molécule cible » ou « cible » toute molécule ou tout fragment de molécule généralement d'origine biologique, dont on cherche à étudier le comportement et les affinités. Il s'agit le plus souvent d'une macromolécule (protéine, molécule d'ADN, glucide ou lipide) ou même une cellule entière. Il peut également s'agir d'un peptide, d'un co-facteur comme l'acétyl coA ou l'AMP cyclique, d'un groupe d'hèmes ou d'un composé chimique tel qu'un stéroïde, un acide aminé modifié....
Le criblage des banques de peptides de l'invention est utile en pharmacologie, notamment pour rechercher de nouveaux peptides à potentiel thérapeutique qui peuvent avoir un rôle modulateur (activateur ou inhibiteur) sur des molécules déjà connues. En outre, les peptides obtenus après criblage peuvent être utilisés lors du diagnostic d'états pathologiques, ou comme marqueurs (cellulaires ou autres).
Le criblage de banques de peptides est également utile pour l'étude des mécanismes d'action de composés thérapeutiques connus : on peut rechercher avec quelles séquences peptidiques ces composés thérapeutiques ont une affinité et ainsi retrouver leurs cibles biologiques. Une telle étude permet par exemple de prévoir plus facilement les effets secondaires d'un tel composé.
L'invention a également pour objet un kit de criblage en vue de rechercher des molécules ayant une affinité pour une cible choisie, ce kit de criblage comprenant une banque de peptides telle que décrite ci-dessus.
L'invention a également pour objet un procédé de criblage de peptides ayant une affinité pour une molécule cible, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (i) production d'une banque de peptides par le procédé de l'invention tel que décrit ci-dessus ; (ii) mise en contact de la banque de peptides avec la ou les molécule(s) cible(s) fixée(s) sur un support ; (iii) élimination des peptides n'ayant pas d'affinité pour la ou les molécule(s) cible(s) ; (iv) isolement et caractérisation des peptides ayant une affinité pour la ou les molécule(s) cible(s). On définit par le terme « criblage » toute méthode permettant la recherche, l'identification et le tri de peptide(s) parmi la ou les banque(s) de peptides.
On entend par « affinité » la formation d'une liaison covalente ou non covalente entre un peptide et une molécule cible. Selon un mode de réalisation avantageux, la molécule cible est une protéine. Généralement, la molécule cible est fixée sur un support solide tel qu'un polymère (résine de chromatographie, filtre par exemple), des billes magnétiques, une plaque de verre ou de silicium... La mise en contact de la banque de peptides avec la cible se fait par imprégnation de la banque de peptide sur le support lorsque ce dernier est une plaque, une colonne de chromatographie ou un filtre ou par mélange de la banque de peptides avec des particules solides sur lesquelles sont fixées les cibles. L'élimination des peptides n'ayant pas d'affinité pour la molécule cible se fait de façon connue par élution, filtration et/ou lavage. Les peptides ayant une affinité pour la molécule cible sont ensuite isolés de façon connue du support auquel est fixée la molécule cible et analysés par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment par résonance magnétique nucléaire ou par spectrométrie de masse. De façon préférentielle dans la présente invention, le criblage de la banque de peptides est réalisé en utilisant une technique qui permet de quantifier l'interaction des peptides avec la cible couplée à une technique permettant l'identification des peptides ayant interagi avec la ou les molécules cibles. De préférence, on choisit une technique de mesure de l'interaction qui permet de fournir une quantification de l'interaction en temps réel. Parmi ces techniques, on peut citer la technique dite « résonance de plasmons de surface » (SPR pour « surface plasmons résonance »).
Le phénomène de résonance des plasmons de surface a lieu à la surface d'une mince couche de métal sur laquelle une source lumineuse polarisée arrive à la surface avec un angle défini ; on enregistre continuellement l'intensité de la lumière réfléchie. Par cette technique, il est possible d'enregistrer des changements très faibles dans la résonance optique lorsque des molécules se fixent ou se dissocient d'une autre molécule biologique ayant été préalablement fixée de façon covalente à une surface métallique (comme par exemple une biopuce recouverte d'une pellicule d'or). Selon un mode de réalisation préféré, on procède au criblage des peptides interagissant avec une ou plusieurs molécules cibles de la façon suivante : a) production d'une banque de peptides par le procédé de l'invention tel que décrit ci-dessus ; b) immobilisation d'une ou de plusieurs molécule(s) cible(s) sur un support convenable ; c) mise en contact (incubation) de la banque de peptides avec la ou les molécule(s) cible(s) ; d) analyse de l'affinité de fixation des peptides sur les molécules cibles au moyen de la technique SPR ; e) élimination des peptides n'ayant pas d'affinité pour la ou les molécule(s) cible(s) ; f) élution des peptides fixés sur les molécules cibles ; g) identification de ces peptides par spectrométrie de masse ; Les étapes d) et e) peuvent être mises en œuvre dans l'ordre inverse. Ce procédé a pour but de déterminer de façon quantitative les interactions spécifiques entre un ou plusieurs peptide(s) et une ou plusieurs molécules cible(s) immobilisée(s), puis d'identifier les peptides qui possèdent une affinité déterminée pour la ou les molécules cîble(s) immobilisée(s). Le support convenant à l'immobilisation d'une ou plusieurs molécules cibles selon l'invention est une surface qui permet une analyse de fixation sensible et en temps réel en utilisant des techniques telles que la SPR et de façon éventuelle qui permette aussi de pratiquer la spectrométrie de masse. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, on utilise une biopuce comme support d'immobilisation de la ou des molécules cibles. Une biopuce est en général une surface de verre recouverte par une fine pellicule d'or. Parmi les biopuces particulièrement adaptées à l 'invention, on peut citer celles de type Biacore® ( commercialisées par la société Biacore), il en existe de différents types selon le type de molécules cibles à immobiliser sur le support. Les molécules cibles peuvent être immobilisées sur une surface préalablement à l'utilisation de la technique SPR selon une variété de protocoles ; le choix du protocole étant dicté par la nature même de l'appareil SPR et/ou par la nature de la molécule cible. Dans le cas où la molécule cible est un acide nucléique, alors une immobilisation courante et appropriée implique l'utilisation d'acides nucléiques biotinylés sur des surfaces recouvertes par la streptavidine. Alternativement, les acides nucléiques peuvent être fixés grâce à des adducts de streptavidine situés à l'extrémité 5' ou 3' de la chaîne d'acide nucléique, sur une surface recouverte par la biotine. Les protéines cibles peuvent être soit directement immobilisées par voie chimique par l'intermédiaire de résidus chargés (lysines) sur des surfaces ayant des groupes carboxyliques ou époxy dans un appareil SPR, soit indirectement grâce à des étiquettes (« tags ») appropriées comme les extensions à base d'hexahistidine N ou C terminale ou de glutathion. Les protéines cibles peuvent être capturées sur des surfaces de chélation ou recouvertes par la glutathion S transférase. Il existe un nombre croissant de techniques permettant la dérivation et la production de surfaces de biopuces. En l'absence d'une étiquette convenable, les surfaces méthylées par des groupes carboxyliques peuvent être activées par un traitement par la carbodiimide et/ou l'hydroxysuccinimide pour générer des groupes carboxyliques activés capables de former des liaisons covalentes avec des aminés non-protonées (généralement des résidus à chaîne latérale à base de lysine) d'une protéine. Le protocole d'immobilisation des molécules cibles sur un support selon la configuration BIAcore® est particulièrement adapté à l'invention (on peut se reporter à http://www.biacore.com/home.lasso). Lors de l'utilisation de la technique dite SPR, un mélange de peptides ou une fraction pré-sélectionnée d'un mélange est mise en contact avec les molécules cibles immobilisées pour mesurer l'interaction par les changements dans la résonance des plasmons de surface. Le cas échéant, le fractionnement peut être réalisé sur la base de quelques propriétés physico-chimiques du peptide telles que sa taille, sa charge ou son index d'hydrophobicité. Après un lavage de la surface de façon à éliminer les molécules n'ayant pas été fixées, les peptides qui ont été physiquement retenus par la molécule cible sont élues ou rendus volatiles (désorbés) en vue de leur caractérisation. On utilise comme témoins négatifs des surfaces qui n'ont pas été traitées par des molécules cibles ; on soumet alors ces témoins négatifs au même traitement que précédemment. Cette technique permet de caractériser l'interaction entre les peptides et les molécules cibles par des paramètres physico-chimiques tels la constante de dissociation à l'équilibre (Ko). Il est alors possible de déterminer les caractéristiques comme : a) la spécificité de la liaison entre le peptide et la molécule cible ; b) la concentration en peptide ; c) la cinétique d'association ou de dissociation ; d) l'affinité de la liaison. L'utilisation de cette technique permet ainsi d'accélérer la recherche initiale notamment de molécules à potentiel médicamenteux qui peuvent entrer dans des essais en phase clinique. Dans le cas où des systèmes complètement automatiques sont utilisés, comme par exemple la technologie SPR Biacore®, il est possible d'analyser un grand nombre d'échantillons en un laps de temps très réduit. Cette méthode constitue alors un outil de choix pour un criblage dans des délais raccourcis par rapport à l'emploi d'autres techniques. La mise en œuvre de la technique SPR est réalisée de façon connue comme illustré dans les exemples ci-dessous ou comme décrit dans : A. Zhukov et al., PharmaGenomics, March/April 2002 ; Fâgerstam, L. (1991) in Techniques in Protein Chemistry II, ed. Nillafranca J. J. (Académie Press inc, New York), pp. 65-71 ; Malmquist, M. (1993) Nature 361, 186-187 ;. Bondeson, K. & Frostell-Karlsson, A. (1993) Analytical Biochemistry 214, 245-251 ; Nice, E. & Lackmann, M. (1994) J. Chromatography A. 660, 169-185 ; Buckle M, 'Surface Plasmon Résonance applied to DNA-protein complexes' in DNA-Protein interactions principles and protocols 2nd édition (Tom Moss ed) (2001) vol 148 535-546 ; Persson, B., Buckle, M & Stockley, P. G. 'Kinetics of DNA interactions studied by surface plasmon resonance'in Protein- DNA Interactions: A Practical Approach (M. Buckle & A. Travers, eds.), Oxford University Press, Oxford, U.K. (2000). 257-279. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on procède à la résolution de mélanges complexes de peptides qui sont élues de la surface d'immobilisation après analyse par SPR à l'aide de tous moyens appropriés. Parmi les moyens convenant à l'invention, on peut citer notamment la chromatographie liquide à haute performance (CLHP), la chromatographie de rétention sur surface (qui peut être directement couplée avec la spectrométrie de masse SELDI ®), l'électrophorèse sur gel. On peut également envisager de désorber et ioniser directement le complexe peptide-cible à partir du support de SPR en vue de son analyse par spectrométrie de masse. Selon une variante préférée du procédé de l'invention, les peptides élues ou directement désorbés à partir du support SPR sont alors identifiés par leur masse et par leur structure grâce à la spectrométrie de masse (MS). Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on procède au séquençage partiel ou total des peptides élues. L'utilisation de la spectrométrie de masse permet alors, entre autres, de : mesurer la masse moléculaire des peptides élues de la surface, et ainsi de caractériser les protéines par cartographie des masses des peptides élues ; identifier des peptides à des concentrations très faibles ; séquencer partiellement ou totalement les peptides élues. La caractérisation des peptides par spectrométrie de masse est réalisée par couplage d'un moyen de désorption/ionisation avec un moyen de mesure de la masse. Parmi les moyens de désoφtion/ionisation, on peut citer la désoφtion et ionisation au laser assisté par la présence d'une matrice (MALDI), la désorption et ionisation améliorées par une surface active (SELDI), la spectrométrie de masse à ions secondaires (SIMS), la spectrométrie de masse secondaires (SNMS), l'ionisation par nébulisation (ESI), le bombardement d'atomes rapides (FAB) et l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI). Parmi les moyens de mesure de la masse, on peut citer le temps de vol (TOF), la spectrométrie de masse en tandem, spectrométrie de masse multidimensionnelle (MS/MS), quadrupole ou trappe à ion, la spectrométrie de masse à transformée de Fourier (FT-MS ou FT-ICR). Grâce au procédé de criblage de la présente invention, il est possible d'isoler et d'identifier des peptides à potentiel thérapeutique, ayant un rôle d'activateur ou d'inhibiteur sur des molécules déjà connues. Ces peptides peuvent être : des ligands présentant une affinité quantifiée pour une macromolécule immobilisée ; - des candidats très intéressants en tant qu'inhibiteurs de la macromolécule immobilisée ; des partenaires dans des complexes protéiques. En outre, ledit procédé peut fournir des réactifs susceptibles d'être utilisés lors d'essais diagnostiques, ainsi que de générer des nouveaux marqueurs d'affinité. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de la présente invention ainsi qu'au dessin annexé, dans lequel : - la figure 1 présente tous les peptides obtenus après digestion de l'albumine sérique bovine (BSA) par la trypsine, la protéase N8 provenant de Staphylococcus aureus et la chymotrypsine. Exemple 1 : Production d'une banque de peptides par digestion enzymatique 1.1 Lyse cellulaire Un litre de culture de cellules est centrifugé et les cellules humides sont récoltées, mises en suspension dans un tampon de lyse (Tris HC1 50 mM pH 8,3 ; glycérol 5% ; ΝaCl 300 mM ; 0,05% désoxycholate) et soumises à une lyse en utilisant une presse de type Aminco-French. L'homogénat est alors centrifugé à 11 000 g pendant 60 minutes à 4°C. 1.2 Précipitation des protéines Les protéines du surnageant provenant de la lyse cellulaire sont précipitées par addition de sulfate d'ammonium à une concentration finale de 40% (poids/volume) et la solution est agitée à 4°C pendant 30 minutes, puis les protéines sont récupérées dans le culot après centrifugation à 19 600 g pendant 30 minutes à 4°C. 1.3 Digestion des protéines On procède à la digestion par la trypsine dans des conditions dénaturantes. La trypsine clive après des résidus lysine (K) ou arginine (R) dans une séquence de protéine. Le culot de protéines est mis en suspension dans 0,5 ml de tampon de dénaturation (0,375 g KCl, 0,09 g d'EDTA, 1,15 g de ΝH4H2PO4, 50 g de guanidine-HCl et complété par de l'eau jusqu'à 100 ml). Le pH est ajusté à 8,5. On ajoute 20 μl de dithiothréitol 0,8 M et on laisse la suspension cellulaire à température ambiante pendant 10 minutes, puis on ajoute 25 μl d'une solution aqueuse d'acide iodoacétique 0,5M et on laisse à nouveau la suspension cellulaire à température ambiante pendant 10 minutes. On élue l'échantillon sur une colonne Nap-5 (par exemple, Sephadex G-25) pour éliminer les sels grâce à 0,8 ml de tampon contenant 40 mM de NH4HCO3. On procède à deux reprises à la dissolution d'une quantité de 25 μg de trypsine (Boehringer, de qualité convenant au séquençage) dans 25 μl d'eau, et on ajoute cette solution enzymatique à la solution de protéines. On laisse la réaction à température ambiante pendant 18 heures. La réaction est arrêtée par ajout de TFA à une concentration finale de 0,1% (ou par tout acide convenable pour abaisser le pH). Le mélange obtenu peut être ensuite purifié davantage par élution sur une colonne d'exclusion de taille permettant de récupérer des protéines et des peptides de poids moléculaire inférieur à environ 700O Da en utilisant par exemple, des colonnes à peptides de type Superdex (Amersham Bioscience) sur un appareil CLHP. Exemple 2 : Peptides obtenus par digestion de la BSA par diverses protéases A titre illustratif, on a effectué une série de digestions enzymatiques à partir d'albumine sérique bovine (BSA) pour montrer en particulier le caractère varié de la banque de peptides produite tant en termes de longueur de séquence que de variété d'acides aminés. La figure 1 montre les peptides générés par le traitement par la trypsine, la protéase V8 de la bactérie Staphylococcus aureus et par la chymotrypsine. La digestion par la trypsine permet de générer une série de 38 peptides ayant entre 7 et 21 acides aminés ; toute la protéine BSA est représentée puisque la longueur totale des peptides est de 447 acides aminés. On obtient des banques de peptides différentes après digestion par d'autres protéases, comme la chymotrypsine (séquences à caractère complémentaire). Dans cet exemple, une seule protéine de petite taille a été soumise à une digestion par une ou plusieurs protéase(s). Cet exemple permet alors d'entrevoir les possibilités du procédé de la présente invention de générer un nombre très important de peptides différents lorsque le traitement enzymatique est effectué non plus sur un seul type de protéine (comme c'est le cas dans cet exemple), mais sur l'ensemble du protéome d'une cellule. Exemple 3 : Protocole d'évaluation de l'interaction avec une molécule cible fixée sur une surface de type Biacore® 2.1 --mmobilisation des molécules cibles sur une surface convenant à l'utilisation de la technique SPR Concernant ce protocole, on peut se reporter à Buckle M, 'Surface Plasmon Résonance applied to DNA-protein complexes' in DNA-Protein interactions principles and protocols 2nd édition (Tom Moss ed) (2001) vol 148 535-546 ; Persson, B., Buckle, M & Stockley, P. G. 'Kinetics of DNA interactions studied by surface plasmon resonance'in Protein-DNA Interactions: A Practical Approach (M. Buckle & A. Travers, eds.), Oxford University Press, Oxford, U.K. (2000). 257-279. On injecte un aliquot de 100 μl de 0,05M NHS(N hydroxyl succinimide)/0,2M EDC (N-éthyl-N'-(diméthylaminopropyι)carbodiimide) sur une surface capteur de type CM5 à un débit de 20 μl/minute dans 10 mM de tampon Hépès (pH 8) contenant 150 mM de NaCl et 1 mM d'EDTA, puis on injecte la fraction protéique à immobiliser à une concentration finale de 1 μM. On arrête d'injecter lorsque la fraction protéique liée est estimée être en excès, c'est à dire normalement autour de la valeur de 50 RU (Unités de Résonance), ce qui correspond à environ 0,05 ng de protéines globulaires. Les groupes carboxyliques n'ayant pas réagi à la surface sont bloqués par traitement avec 50 μl de 1M éthanolamine-HCl. 2.2 Mesure de l'affinité de l'interaction : Pour une macromolécule (D), l'interaction avec un peptide (P) peut être exprimé ainsi: ka D+P DP 0) kd
La fraction des sites (ΘD) occupés par les peptides sur la cible immobilisée est: *,=£ DT (2) Donc la constante d'association Ka est calculée en utilisant :
?D = (4) 1 + KaP Dans une expérience SPR sur une appareil comme le Biacore, à un état stationnaire obtenu à une concentration de peptide donné, la quantité de peptide fixé peut être calculée à partir de l'asymptote de la courbe de changement d'indice de réfraction en fonction du temps. Si on effectue le rapport (ΘD) sur [P]τ on peut estimer Ka et puis K-d = 1/Ka D'une façon parallèle on peut mesurer à la fois le signal à l'équilibre (Req) pour une concentration donnée de peptide sur la surface SPR et le signal de résonance R en fonction du temps t après l'injection à temps t = 0 (quand R = R0) pendant la phase d'association des peptides avec la molécule immobilisée sur la surface. On peut donc calculer une constante d'association apparente (kobs) en utilisant l'équation : Rt = R0 - (Rβq - R0) . (l - e-k«Λ--t) (5) On peut également calculer la constante de dissociation k en mesurant la diminution du signal pendant la dissociation du peptide de la surface en fonction du temps et appliquant l'équation :
Figure imgf000018_0001
Puisque kobs = kon [P] + koff (7) on peut obtenir ko„ et donc puisque koff = konKd (8) on peut calculer la constante d'équilibre (Kd). Méthodologie : 100 μl d'une solution contenant des peptides dissous dans un tampon compatible avec le Biacore à une concentration entre mM et nM sont injectés en flux continu à 20 μl/min sur la surface à une température fixe, généralement 25° C. A la fin de la période d'injection le tampon seul est envoyé sur la surface. Les constantes d'association et de dissociation sont calculées comme indiquée ci-dessus. 2.1.3 Détermination de la masse des peptides élues Nous utilisons deux techniques complémentaires : Spectrométrie de mass électrospray. L'échantillon contenant les peptides est re-suspendu dans un tampon de 70 % acétonitrile / 0.1 % acide acétique / H20 distillée (tampon filtrée a travers une filtre de 0.22 μm). L'ensemble est injecté à 20 μl/min dans le port d'injection d'un spectromètre de mass électrospray. L'analyse du spectre de masse permet de déterminer la masse du peptide. Dans le cas où il y a plusieurs peptides une séparation auparavant par colonne hydrophobe permet de mieux attribuer une masse à chaque peptide.

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'une banque de peptides, caractérisé en ce que : (i) le produit de départ est une ou plusieurs cellules ; (ii) les constituants protéiques de la cellule sont isolés pour former une composition de protéines ; (iii) la composition de protéines obtenue à l'étape (ii) est soumise à un traitement de clivage.
2. Procédé de production d'une banque de peptides selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules sont obtenues à partir d'un échantillon biologique.
3. Procédé de production d'une banque de peptides selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules sont issues d'une lignée cellulaire en culture.
4. Procédé de production d'une banque de peptides selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est choisi parmi un tissu biologique, un fluide corporel ou végétal.
5. Procédé de production d'une banque de peptides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le traitement de clivage comporte au moins une étape de traitement enzymatique.
6. Procédé de production d'une banque de peptides selon la revendication 5, caractérisé en ce que le traitement enzymatique comprend l'action d'au moins une enzyme choisie parmi : la trypsine, l'endolysine, la pepsine, la chymotrypsine, la protéase N8, la thermolysine, la subtiline et la pronase.
7. Procédé de production d'une banque de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le traitement de clivage comporte au moins une étape de traitement par des radicaux hydroxyles.
8. Procédé de production d'une banque de peptides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de séparation des peptides en fonction de leur taille et/ou de leur charge et/ou de leur hydrophilie/hydrophobie.
9. Banque de peptides comportant au moins 20 000 peptides susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications précédentes.
10. Utilisation d'une banque de peptides selon la revendication précédente pour le criblage de molécules ayant une affinité pour une molécule cible donnée.
11. Kit de criblage caractérisé en ce qu'il comporte une banque de peptides selon la revendication 9.
12. Procédé de criblage de peptides ayant une affinité pour une molécule cible, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (i) production d'une banque de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ; (ii) mise en contact de la banque de peptides avec la ou les molécule(s) cible(s) fιxée(s) sur un support ; (iii) élimination des peptides n'ayant pas d'affinité pour la ou les molécule(s) cible(s) ; (iv) isolement et caractérisation des peptides ayant une affinité pour la ou les molécule(s) cible(s).
13. Procédé de criblage de peptides selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la molécule cible est choisie parmi une protéine, un peptide une molécule d'ADN, un co-facteur, un groupe d'hèmes, un composé chimique, un glucide, un lipide, ou une cellule entière.
14. Procédé de criblage de peptides ayant une affinité pour une molécule cible, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) production d'une banque de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ; (b) immobilisation d'une ou de plusieurs molécule(s) cible(s) sur un support convenable ; (c) mise en contact de la banque de peptide avec la ou les molécule(s) cible(s) ; (d) analyse de l'affinité de fixation des peptides sur molécules cibles au moyen de la technique SPR ; (e) élimination des peptides n'ayant pas d'affinité pour la ou les molécule(s) cible(s) ; (f) élution des peptides fixés sur les molécules cibles ; (g) identification des peptides élues par spectrométrie de masse ; les étapes (d) et (e) pouvant être mises en œuvre dans l'ordre inverse.
15. Procédé de criblage de peptides selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce le support est une biopuce.
16. Procédé de criblage de peptides selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de séparation des peptides après leur élution du support et avant leur identification.
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