WO2005103260A1 - ジペプチドの製造法 - Google Patents

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WO2005103260A1
WO2005103260A1 PCT/JP2005/007626 JP2005007626W WO2005103260A1 WO 2005103260 A1 WO2005103260 A1 WO 2005103260A1 JP 2005007626 W JP2005007626 W JP 2005007626W WO 2005103260 A1 WO2005103260 A1 WO 2005103260A1
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dipeptide
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culture
microorganism
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Shin-Ichi Hashimoto
Kazuhiko Tabata
Ayako Noguchi
Yugo Adachi
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a protein having a dipeptide synthesis activity or a protein for dipeptide synthesis, a method for producing a protein having a dipeptide synthesis activity, a method for producing a dipeptide using a protein having a dipeptide synthesis activity or a protein for dipeptide synthesis, and dipeptide synthesis.
  • the present invention relates to a microorganism or a transformant that produces a protein having an activity or a protein for synthesizing a dipeptide, and a method for producing a dipeptide using the microorganism or the transformant.
  • thermostable aminoacyl t-RNA synthetase Utilizes thermostable aminoacyl t-RNA synthetase
  • it is difficult to express the enzyme using DNA recombination method due to the large size of the enzyme molecule, and the supply of 4'-phosphopantetheine which is a coenzyme It is necessary to have an efficient manufacturing method.
  • 4'-phosphopantetheine which is a coenzyme smaller than SNRPS, does not require ⁇ -glutamylcysteinesynthetase, y-glutamylcysteinesynthetase, glutathione synthetase, D A group of peptide synthetases such as D-Alanine (D-Ala—D-Ala) ligase (D-Ala—D-Alaligase) and poly- ⁇ -glutamate synthetase are also known. . Most of these enzymes have characteristics such as using D-amino acid as a substrate or catalyzing the formation of peptide bond at the ⁇ -carboxyl group. It cannot be used for the synthesis of dipeptides.
  • basilin synthase a dipeptide antibiotic derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus, is known to produce dipeptides by the activity of forming a peptide bond at the ⁇ -carboxyl group of the L amino acid. It is known that basilicin synthase has the activity of synthesizing basilicin (L-Ala-L-anticapsin) and L-Ala-L-alanin (L-Ala-L-Ala). The activity of other dipeptides is not known [J. Ind. Microbiol, 2, 201-208 (1987),
  • An object of the present invention is to provide a protein having a dipeptide synthesis activity or a protein for dipeptide synthesis, a DNA encoding a protein having a dipeptide synthesis activity or a protein for dipeptide synthesis, and a recombinant DNA containing the DNA.
  • a transformant having the recombinant DNA a method for producing a protein having a dipeptide synthesis activity, an enzymatic synthesis method of a dipeptide using a protein having a dipeptide synthesis activity or a protein for dipeptide synthesis, and dipeptide synthesis.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a dipeptide using a microorganism or a culture of a transformant capable of producing a protein having an activity or a protein for synthesizing a dipeptide as an enzyme source.
  • the present invention relates to the following (1) to (24).
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 one or more amino acids are deleted, substituted or added, and
  • R 1 and R 2 represent the same or different amino acids
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having the formula (I)
  • R 1 and R 2 represent the same or different amino acids
  • a protein for dipeptide synthesis having a dipeptide synthesis activity represented by
  • a dipeptide synthesis protein comprising an amino acid sequence having 65% or more homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a dipeptide synthesis activity represented by the formula (I)
  • R 1 and R 2 represent the same or different amino acids
  • the transformant according to any one of the above (5) to (7) is cultured in a medium, and the protein of the above (1) is produced and accumulated in the culture. From the above (1) ) A method for producing a protein.
  • microorganism is a microorganism belonging to the genus StreDtomvces.
  • the protein of the above (1) or the protein for synthesizing the dipeptide of the above (2), one or more amino acids, and ATP are made to exist in an aqueous medium.
  • a method for producing the dipeptide comprising generating and accumulating a dipeptide represented by the formula:
  • a method for producing the dipeptide comprising generating and accumulating a dipeptide represented by the formula:
  • the microorganism having the ability to produce the protein of (1) is a Streptomyces genus.
  • microorganism is a microorganism belonging to the genus Streptomyces having the ability to produce arvonorcin and belonging to the genus Streptomyces alborus or Streptomyces norsei.
  • the processed product of the culture is a concentrate of the culture, a dried product of the culture, cells obtained by centrifuging the culture, a dried product of the cells, a lyophilized product of the cells, Detergent of bacterial cells, ultrasonically treated bacterial cells, mechanically milled bacterial cells, solvent-treated bacterial cells, enzymatically treated bacterial cells, protein of the bacterial cells.
  • R 3 and R 4 are the same or different and each represents an L-form or D-form amino acid, glycine, / 3-alanine or a derivative thereof. !, One of the manufacturing methods.
  • L-form or D-form amino acid powers alanine, glutamine, glutamic acid, norin, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine, serine, Leonin, cysteine, asparagine, tyrosine, lysine, anoreginin, histidine, aspartic acid, a-aminobutyric acid, azaserine, theanine, 4-hydroxyproline, 3-hydroxyproline, ortin, citrulline and 6-diazo-5- (22) or (23), which is an amino acid selected from oxonorleucine.
  • a protein having a dipeptide synthesis activity or a protein for dipeptide synthesis a DNA encoding a protein having a dipeptide synthesis activity or a protein for dipeptide synthesis, and a recombinant DNA containing the DNA are provided.
  • a transformant having the recombinant DNA a method for producing a protein having a dipeptide synthesis activity, an enzymatic synthesis method of a dipeptide using a protein having a dipeptide synthesis activity or a protein for dipeptide synthesis, and dipeptide synthesis.
  • the present invention can provide a method for producing a dipeptide using, as an enzyme source, a microorganism or a culture of a transformant capable of producing a protein having activity or a protein for synthesizing a dipeptide.
  • FIG. 1 is a diagram showing the construction process of pAL-nou and pAL-alb, which are expression plasmid vectors for a protein having a dipeptide synthetic activity.
  • albC ⁇ gene or ⁇ similar gene
  • the proteins of the present invention include the following proteins [1] to [3] (excluding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1),
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 one or more amino acids are deleted, substituted or added, and
  • R 1 -R 2 (I) (Wherein, R 1 and R 2 represent the same or different amino acids) and a protein having a dipeptide synthesis activity, and
  • the dipeptide synthesis protein of the present invention includes the following dipeptide synthesis proteins described in [4] to [6]:
  • a dipeptide synthesizing protein having an amino acid sequence having homology of not less than% and having an activity of synthesizing the peptide represented by the formula (I),
  • the protein of the present invention and the protein for synthesizing a dipeptide may be collectively referred to as the protein of the present invention.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having the activity of synthesizing the dipeptide represented by the formula (I) is referred to as Molecular loning, A Laboratory Manual, Third Edition. Old SpnngHarbor Laboratory Press (1989) (hereinafter abbreviated as Molecular ⁇ 3rd edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter the current 'protocols'in') Molecular ⁇ . Biology), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited. However, the number of amino acids that can be deleted, substituted or added by a well-known method such as the site-directed mutagenesis described above is one. The number is preferably several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to: LO, and still more preferably 1 to 5.
  • One or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 when one or more amino acids are deleted, substituted or added at an arbitrary position in the same sequence. You may.
  • Amino acids capable of amino acid substitution include, for example, amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 1 and 2 that are stored in all amino acid sequences when compared using known alignment software. Being able to give amino acids.
  • Known alignment software includes, for example, alignment analysis software included in gene analysis software Genetyx (Software Development Co., Ltd.). Default values can be used as the analysis parameters of the analysis software.
  • amino acid positions where amino acids can be deleted or added include the N-terminal side and the C-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2. Deletions, substitutions or additions may occur simultaneously, and the amino acids to be substituted or added may be either natural or non-natural.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-parin, L-cysteine and the like.
  • amino acids included in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, norin, norparin, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, 0-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanan, cyclohexane Xinorelanin
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, orditin, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • the homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is 65% or more, preferably 80% or more, It is more preferable that the homology is 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the protein of the present invention is a protein having a dipeptide synthesizing activity represented by the formula (I)
  • transformation using a DNA recombination method to express the protein of the present invention is used.
  • the protein of the present invention After producing the protein of the present invention using the transformant, the protein of the present invention, one or more amino acids, and ATP are allowed to exist in an aqueous medium, and the above-mentioned formula is added to the aqueous medium. Determine the ability to generate and accumulate the dipeptide represented by (I) by HPLC, etc. There are more ways to analyze.
  • the DNA of the present invention includes DNAs described in the following [1] to [3] (however, excluding a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3),
  • DNAs that can be used in the method for producing the dipeptide represented by the formula (I) of the present invention include, in addition to the DNAs described in [1] to [3] above, the following [4] to [4] DNA according to [6],
  • Hybridizing means that the DNA hybridizes to DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Therefore, DNA having the specific nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the DNA is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or a DNA having a length that can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. There may be.
  • DNA used as a probe DNA having at least 100 bases or more, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more can be used, but DNA having at least 10 bases or more, preferably 15 bases or more can be used. That's a little.
  • the above stringent conditions include, for example, a method in which a DNA-immobilized filter and a probe DNA are combined with 50% formamide, 5X SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate. (PH 7.6), 5X Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and a solution containing g / 1 denatured salmon sperm DNA at 42 ° C. Conditions for washing the filter in a 0.2 X SSC solution of C are preferred, but lower stringent conditions can be used. Stringent conditions can be changed by adjusting the concentration of formamide (the lower the concentration of formamide, the lower the stringency), and by changing the salt concentration and temperature conditions.
  • Low stringency conditions include, for example, 6 X SSCE (20 X SSCE is 3 mol / l sodium chloride, 0.2 mol / l sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / l EDTA, pH 7.4) After incubation at 37 ° C in a solution containing 0.5% SDS, 30% formamide, 100 ⁇ g / 1 denatured salmon sperm DNA, 1X SSC, 0.1% SDS at 50 ° C Conditions for washing with a solution can be raised. Further, as an even lower stringent condition, a condition in which hybridization is performed using a solution having a high salt concentration (for example, 5 ⁇ SSC) under the above-described low stringent condition and then washing is performed. It comes out.
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing a blocking reagent used to suppress the background of the experiment of hybridization.
  • the addition of the blocking reagent described above may involve a change in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • the DNA that can be hybridized under the above-mentioned stringent conditions is represented by SEQ ID NO: 3 or 4 when calculated based on the above-mentioned parameters using BLAST, FASTA or the like described above.
  • a DNA having at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more homology with the nucleotide sequence can be mentioned.
  • the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is, for example, encoded by the DNA using a recombinant DNA method as described above. It can be confirmed by producing a protein and measuring the activity of the protein.
  • the DNA used in the method for producing the DNA of the present invention and the protein or dipeptide of the present invention (hereinafter, also simply referred to as the production method of the present invention) is designed based on, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • a probe that can be used to design a chromosomal DNA library of a microorganism belonging to the genus Streptomyces based on Southern nucleotide hybridization, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the obtained primers can be obtained by PCR using the chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces using type I DNA [PCR Protocols, Academic Press (1990)].
  • the base sequence of the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is 75% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, for various gene sequence databases. More preferably, a sequence having a homology of 95% or more, particularly preferably 98% or more, most preferably 99% or more is searched, and based on the base sequence obtained by the search, the chromosome of an organism having the base sequence is searched. This refers to obtaining the DNA of the present invention or the DNA used in the production method of the present invention from a DNA or cDNA library by the above-described method.
  • the obtained DNA is used as it is or is cut with an appropriate restriction enzyme or the like, incorporated into a vector by a conventional method, and the obtained recombinant DNA is introduced into host cells.
  • the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] uses a base sequence analyzer such as 373A DNA Sequencer (Perkin Elmer). By analyzing the DNA, the nucleotide sequence of the DNA can be determined.
  • the target DNA is prepared by chemically synthesizing it using an 8905 DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems.
  • Examples of the DNA obtained as described above include a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • Examples of the vector incorporating the DNA of the present invention and the DNA used in the production method of the present invention include pBluescriptll KS (+) (Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)], pCR- Examples include Script Amp SK (+) (Stratagene), pT7Blue (Novagen), pCR II (Invitrogen), and pCR-TRAP (GeneHunter).
  • Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli (Escherichia coH) XL1—Blue Escherichia coli XL2—Blue Escherichia coli.
  • any method for introducing the DNA into the above host cells can be used.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 69, 2110 (1972)]
  • protoplast method Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-248394
  • elect-portion method Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)
  • microorganism having the DNA used in the production method of the present invention obtained by the above method examples include, for example, Escherichia's microorganism, which is a microorganism having a recombinant DNA containing the DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 3. Coli NM522 / pAL-nou. (ii) Method for producing the protein of the present invention and the protein for synthesizing the dipeptide of the present invention
  • the protein of the present invention and the protein for synthesizing the dipeptide of the present invention are described in Molecular Claw Jung, Third Edition, Current Protocols in Molecular Biology, etc.
  • the DNA of the present invention obtained by the above method (i) and the DNA used in the production method of the present invention can be expressed in host cells by the following method, for example, by the following method, for example. it can.
  • an appropriate length containing a portion encoding the protein of the present invention or the protein for synthesizing the dipeptide of the present invention is prepared. Further, by substituting the nucleotide sequence of the portion encoding the protein so that the nucleotide sequence becomes an optimal codon for expression in the host, the production rate of the protein can be improved.
  • Recombinant DNA is prepared by inserting the DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant producing the protein of the present invention By introducing the recombinant DNA into a host cell suitable for the expression vector, a transformant producing the protein of the present invention can be obtained.
  • any cell that can express the gene of interest such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc.
  • bacteria more preferably Escherichia, Microorganisms belonging to the genus Bacillus or Corynebacterium, more preferably microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • the expression vector contains a promoter at a position capable of autonomous replication in the host cell or integration into a chromosome and capable of transcribing the DNA of the present invention or the DNA used in the production method of the present invention. , Is used.
  • the recombinant DNA having the DNA of the present invention or the DNA used in the production method of the present invention is capable of autonomous replication in a prokaryote and has a promoter, It is preferably a recombinant DNA comprising a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, the DNA used in the production method of the present invention, and a transcription termination sequence. Contains the gene that controls the promoter!
  • Examples of expression vectors include pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (both manufactured by Boehringer Mannheim), pHelixl (manufactured by Roche Diagnostics Inc.), pKK233-2 (manufactured by Amersham's Fanole Macia Biotech), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-II (Promega), pQE8 (Qiagen), pQE60 (Qiagen), pET-3 (Novagen), pKYPIO (JP-A-58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol.
  • any promoter can be used as long as it functions in a host cell such as Escherichia coli, etc.! / ⁇ ⁇ .
  • trp iac L motor p promoter, p promoter, etc., derived from E. coli, phage, etc.
  • the promoter SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter and the like can be used. Also, promoters with two Ps in series, ⁇ promoter, lacT7
  • Mouth motors and artificially designed and modified promoters such as the let I promoter can also be used.
  • the xylA promoter for expression in a microorganism belonging to the genus Bacillus [Appl.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not always necessary, but a transcription termination sequence is provided immediately below the structural gene. It is preferable to arrange them.
  • Examples of such a recombinant DNA include pAL-nuo and pAL-alb.
  • Prokaryotes include the genera Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibata The genus Terevim (Brevibacterium), the genus Corynebacterium (Corvnebacterium), the genus Microbatterium (Microbacterium), the genus Pseudomonas, the genus Agrobacterium (Agrobacterium), the genus Alicyclobatinoles (Alicvclobacillus), Genus (Anabena), genus Anacvstis, genus Arthrobacter, genus Azotobacter, genus Chromatium, genus Enwinevia, genus Erwinia, genus Methylobacterium, Phordium ), Rhodobacterium, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Scenedesmus, Streptomyces, Svnechoccus, Zymomonas, etc.
  • a cow belonging to the category Objects, for example, Escherichia 'Coli XL1-Blue, Escherichich A. coli XL2-Blue, E. coli DH1, D. coli DH5a, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli 49 , Escherichia coli K3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522, Bacillus subtilis ATCC33712, Bacillus megaterium, Bacillus sp. Berillus sp.
  • Agrobacterium 'Radobacter (Agrobacterium) radiobacter), Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Anabaena cvlindrica, Anabaena doliolum, Anabaena doliolum flos-aauae), Arthrobacter aurescens, Arthrobacter citreus, Arthrobacter citreus, Arthrobacter globformis, Arthrobacter globformis, Arthrobacter globformis hvdrocarboglutamicus), ⁇ Surono, Kuta 1 ⁇ ⁇ - Sorensu (Arthrobacter mvsorens), ⁇ Surobakuta scratch.
  • Nicotiana (Arthrobacter nicotianae), Asurobakuta one-Roh Rafuineusu (Arthrobacter paraffineus), Asuronoku Kuta one proto off Honore Mie (Arthrobacter protophormiae ⁇ Surono ⁇ Guta 1 ⁇ ⁇ and Russia Arthrobacter roseoparaffinus, Arthrobacter sullureus, Arthrobacter sullureus, Arthrobacter ureafaciens, Chromatium buderi, Chromatium tephydam Chromatium vinosum, Chromatium warmingii, Chromatium funorevia Tatile (Chromatium fluviatile), Enolevinia uredovora, Erwinia uredovora, Erwinia carotoneria, Erwinia carotovinawina (Erwinia herbicola), (Erwinia punctata), (Erwinia terreus), (Methvlobacterium rhodesianum
  • Streptomvcesgnseus Stref. Tommyces-Richtans (Streptomvces lividans, Streptomvces olivogriseus), Streptomvces rameus, Streptomyces tacho, Noen, Noss (Streptomvces
  • tanashiensis Saultiensis
  • examples include Tomyces vinaceus (Streptomvces vinaceus) and Symmonas mobilis (Zvmomonas mobilis), and preferably microorganisms belonging to the genus Escherichia, Bacillus, Streptomyces or Corynebacterium.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cells.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 69, 2110 (1972)]
  • protoplast method Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-248394
  • elect-portion method Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)
  • YEpl3 ATCC37115
  • YEp24 ATCC37051
  • YCp50 ATCC37419
  • pHS19 pHS15 and the like
  • Yogu example be used any one as long as it can function in yeast strains, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH flop port motor, gal i promoter, gal 10 promoter, Promoters such as heat shock polypeptide promoter, MFa1 promoter, CUP1 promoter and the like can be mentioned.
  • yeast strains belonging to the genus Candida include Saccharomyces (Saccharomvces), Schizosaccharomvces, Kluweromvces fyu, Trichosporon Trichosporon, Schwanniomvces, and Pichia. And yeast strains belonging to the genus Candida and the like.Specifically, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomvces pombe, and Kunorei heromyces fuku "Chairs (Kluweromvces lactis), Trichosporon Dullulans, Schomyoses albi Us (Schwanniomvces alluvius), Pichia pastoris, Candida utilis and the like.
  • any method for introducing DNA into yeast can be used.
  • electoporation method [Methods EnzymoL, 194, 182 (1990)], Sufero Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)]
  • the lithium acetate method [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)].
  • expression vectors include pcDNAU pcDM8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-22979), and pAS3-3 (Japanese Unexamined Patent Publication No.
  • pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pAMo , PAMoA, etc. can be used.
  • any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • the promoter of the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV) include a thionine promoter, a retroviral promoter, a heat shock promoter, and an SRa promoter.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Host cells include mouse 'myeloma cells, rat'myeloma cells, mouse' hybridoma cells, Namalwa cells or Namalva KJM-1 cells which are human cells, human fetal kidney cells, human leukemia cells, African green monkey kidney cells, Chinese hamster cells such as CHO cells, HBT5637 (JP-A-63-299), and the like.
  • Mouse / myeloma cells include SP2 / 0, NSO, etc.
  • rat's myeloma cells include YB2 / 0, etc.
  • human fetal kidney cells include HEK293 (ATCC CRL-1573)
  • human leukemia cells include BALL-1, etc.
  • African green monkey kidney cells include COS-1 and COS-7.
  • any method for introducing the recombinant DNA any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • electoporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate method Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 2-227075
  • lipofection method Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]
  • the methods described in Virology, 52, 456 (1973). can do.
  • insect cells are used as hosts, for example, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992), Current-Proto-Cornoles' In 'Molecular' Noriology, MolecularBiology, A Laboratory Manual Protein can be produced by the method described in Bio / Technology, 6, 47 (1988).
  • a recombinant gene transfer vector and a baculovirus are co-transfected into insect cells to obtain a recombinant virus in an insect cell culture supernatant, the recombinant virus is further transmitted to insect cells to produce proteins. Can be done.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (V, deviation also from Invitrogen) and the like.
  • baculovirus for example, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects insects of the night moth family, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, and the like can be used. o.
  • Insect cells include ovary cells of Spodoptera frueiperda
  • cultured cells derived from the ovaries of TrichoDlusia ni and silkworm ovaries can be used.
  • the ovarian cells of Spodoptera frugaverda are S19, S11 (baculovirus 'expresion', vector vector 'laboratory', 'ma-ual'), etc., and the ovarian cells of Trichoplusia 'second ovary' are High 5, ⁇ - ⁇ -5 ⁇ 1-4 (Invitrogen) and Bombvx mori N4 can be mentioned as a cultured cell derived from silkworm ovary.
  • a method for co-transferring the above-described recombinant gene transfer vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus includes, for example, a calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), a lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)].
  • examples of the expression vector include Ti plasmid, tobacco mosaic virus vector and the like.
  • Any promoter can be used as long as it functions in plant cells. Examples include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and the rice actin 1 promoter.
  • Examples of the host cell include plant cells such as tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, rape, alfalfa, rice, wheat, and wheat.
  • Any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • a method using agrobacterium (Agrobacterium) JP-A-59-140885, Japanese Patent Laid-Open No. 60-70080, WO94 / 00977), an election port method (Japanese Patent Laid-Open No. 60-251887), a method using a particle gun (gene gun) (Patent No. 2606856, Patent No. 2517813), and the like.
  • the protein By culturing the transformant obtained as described above in a medium, producing and accumulating the protein of the present invention in the culture, and collecting the protein from the culture, the protein can be produced.
  • the host of the transformant for producing the protein of the present invention may be any of bacteria, yeast, animal cells, insect cells and the like, and plant cells, but is preferably a bacterium, more preferably a genus Escherichia. Microorganisms, more preferably microorganisms belonging to Escherichia coli.
  • the above transformant can be cultured in a medium according to a usual method used for culturing a host.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be used by the organism. As long as the culture medium allows efficient culture of transformants, you can use the natural / synthetic media! ,.
  • a carbon source glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, acetic acid, propionic acid, etc. Organic acids, alcohols such as ethanol and propanol, and the like can be used.
  • a nitrogen source ammonia, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other nitrogen-containing compounds.
  • Compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digested products thereof, and the like can be used.
  • potassium monophosphate potassium monophosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, or the like can be used. it can.
  • the cultivation is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culturing temperature is 15 to 40 ° C, and the culturing time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, alkali solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • a microorganism transformed with an expression vector using the im promoter may be used, for example, isopropyl-1- ⁇ -D-thiogalatatopyranoside.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host commonly used RPMI1640 medium [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)], Eagle (Eagle) ) Medium [Science, ⁇ , 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)] or these mediums
  • a culture medium or the like obtained by adding fetal bovine serum or the like can be used.
  • the cultivation is usually performed for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 25 to 40 ° C, and 5% CO.
  • antibiotics such as kanamycin, penicillin, and streptomycin may be added to the medium during the culturing.
  • TNM-FH medium Pharmingen
  • Sf-900 II SFM medium Sf-900 II SFM medium
  • ExCell400 ExCell405 [all manufactured by JRH Biosciences]
  • Grace'slnsect Medium 195, 788 (1962)
  • the cultivation is usually performed under conditions of pH 6 to 7, 25 to 30 ° C and the like for 1 to 5 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the cultivation.
  • the transformant obtained using the plant cell as a host may be cultured as a cell or after being differentiated into a plant cell or organ. can do.
  • a medium for culturing the transformant a commonly used Murashige 'and' Sturg (MS) medium, a white (White) medium, or a medium supplemented with a plant hormone such as auxin or cytokinin is used. It is possible to use a fresh medium or the like.
  • Culture is usually performed at pH 5 to 9 and 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • an antibiotic such as kanamycin or hygromycin may be added to the medium during the culturing.
  • a transformant derived from a microorganism, insect cell, animal cell, or plant cell having a recombinant DNA in which the DNA of the present invention or the DNA used in the production method of the present invention is linked to an expression vector is used.
  • the protein can be produced by culturing according to a conventional culturing method to produce and accumulate the protein of the present invention, and collecting the protein from the culture.
  • Methods for producing the protein of the present invention include a method of producing the protein in a host cell, a method of secreting the protein out of the host cell, and a method of producing the protein on the host cell outer membrane.
  • the host cell to be used may be selected and the structure of the protein to be produced may be changed.
  • the protein can be proactively extracellular to the host cell. Can be secreted.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • the transgenic animal or plant cells are redistributed to create an animal (transgenic non-human animal) or plant (transgenic plant) into which the gene has been introduced.
  • the protein of the present invention can also be produced using these individuals.
  • the transformant producing the protein of the present invention is an animal or plant individual, it is bred or cultivated according to a usual method to produce and accumulate the protein, and the protein is collected from the animal or plant individual. By doing so, the protein can be produced.
  • a transgenic non-human animal into which the DNA of the present invention or the DNA used in the production method of the present invention has been introduced is bred, and the protein of the present invention is produced and accumulated in the animal.
  • the protein By collecting the protein from an animal, the protein can be produced. Examples of places where the animal is produced and accumulated include milk (JP-A-63-309192), eggs and the like of the animal.
  • the promoter used at this time may be any promoter that functions in animals.For example, a casein promoter, 13 casein promoter, ⁇ -lactoglobulin promoter, whey An acidic protein promoter or the like is preferably used.
  • a transgenic plant into which DNA encoding the protein of the present invention has been introduced can be prepared by a known method [tissue culture, ⁇ (1994); Culture, 21 (1995), Trends BiotechnoL, 15, 45 (1997)].
  • a method of producing the protein by producing and accumulating the protein in the plant, and collecting the protein from the plant.
  • the cell when the protein of the present invention is produced in a lysed state in a cell, the cell is collected by centrifugation after completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a french press, a Menton. The cells are disrupted with a Gaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, or a precipitation method using an organic solvent is used.
  • dimethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose anion exchange chromatography using a resin such as DIAION HPA-75 (Mitsubishi Kasei), and resin such as S-SepharoseFF (Pharmacia) Cation exchange chromatography method, hydrophobic chromatography method using resins such as butyl sepharose, phenylsepharose, gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, chromatofocusing method, isoelectric focusing
  • a purified sample can be obtained by using techniques such as electrophoresis alone or in combination.
  • the protein is produced by forming an insoluble substance in the cells, the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to obtain a precipitate fraction obtained by a conventional method. After recovering the protein, the insoluble form of the protein is soluble with a protein denaturant.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein of the present invention or a derivative such as a modified sugar thereof When the protein of the present invention or a derivative such as a modified sugar thereof is secreted extracellularly, the protein or a derivative such as a sugar adduct thereof can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified preparation is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Obtainable. [0083] Examples of the protein thus obtained include a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the protein of the present invention as a fusion protein with another protein, and to purify the protein using affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein.
  • the proteins to be fused include j8-galatatosidase, protein A, an IgG-binding region of protein A, chloramue-col 'acetyltransferase, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose binding protein, glutathione S -Transferase, polyhistidine chain (His-tag), S peptide, DNA binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green 'fluorescent' protein, FLAG peptide, and any antibody epitope [Yamakawa, Akio Medicine, 13,469-474 (1995)].
  • Substances having an affinity for the above-mentioned proteins to be fused include ⁇ -galatatosidase, protein tin ⁇ , immu- noglobulin G-binding region of protein ⁇ , chloramue-cole 'acetyltransferase, poly (Arg), poly (Arg), and poly (Arg).
  • (Glu) protein G, maltose binding protein, glutathione S-transferase, polyhistidine chain (His-tag), S peptide, DNA binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green 'fluorescent' protein, FLAG peptide or Antibodies that recognize any antibody epitope, such as immunoglobulin G, can be mentioned.
  • the present invention can be carried out by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbol method) and the tBoc method (t-butyloxycarbol method). Protein can be produced.
  • Fmoc method fluorenylmethyloxycarbol method
  • tBoc method t-butyloxycarbol method
  • the enzymatic production method of the dipeptide includes a method of preparing a protein or a protein for synthesizing a dipeptide of the present invention, one or more amino acids, and ATP in an aqueous medium.
  • a method of producing and accumulating the dipeptide represented by I) and collecting the dipeptide from the medium can be given.
  • one or more amino acids, preferably one or two amino acids, used as a substrate include L-form or D-form amino acids, glycine (Gly), ⁇ -alanine (Ala) and Derivative power of amino acids selected, preferably L-amino acids, Gly and
  • L-form or D-form amino acids include alanine (Ala), glutamine (Gin), glutamic acid (Glu), norin (Val), leucine (Leu), isoleucine (lie), proline (Pro), and phenylalanine.
  • L-Ala L-Gln, L-Glu, Gly ⁇ L-Val, L-Leu ⁇ L-Ile, L- Pro, L- Phe ⁇ L- Trp ⁇ L- Met ⁇ L- Ser ⁇ L- Thr, L- Cys, L- Asn, L- Tyr, L- Lys, L- Arg, L- His, L- Asp, L-a-AB,
  • amino acid derivatives include, for example, hydroxy amino acids (j8-hydroxyglutamine, ⁇
  • L-Ala one kind of amino acid selected from L-Leu and L-Phe, or two kinds of amino acids consisting of L-Leu and L-Phe can be mentioned.
  • the protein or protein for synthesizing dipeptide of the present invention is added in an amount of 0.01 to 100 mg, preferably 0.1 to 10 mg per mg of amino acid used as a substrate.
  • the amino acid used as a substrate is added to an aqueous medium initially or during the reaction so as to have a concentration of 0.1 to 500 g / L, preferably 0.2 to 200 g / L.
  • ATP used as an energy source is used at a concentration of 0.5 mmol / L to 10 mol / L.
  • the aqueous medium used in the above production method may be an aqueous medium of any component and composition as long as it does not inhibit the dipeptide formation reaction.
  • examples include water, phosphate, carbonate, acetate, and boric acid.
  • Buffers such as salts, citrates and Tris can be mentioned. It may also contain alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, ketones such as acetone, and amides such as acetoamide.
  • the dipeptide formation reaction is carried out in an aqueous medium under conditions of pH 5 to II, preferably pH 6 to 10, 20 to 50 ° C, preferably 25 to 45 ° C for 2 to 150 hours, preferably 6 to 120 hours.
  • Examples of the dipeptide produced by the above method include a dipeptide represented by the formula (I), and preferably, in the formula (I), R 1 and R 2 are the same or different, and are L-form or L-form.
  • Examples include a dipeptide which is a D-form amino acid, glycine, ⁇ -alanine or a derivative thereof, and more preferably a dipeptide which is an L-form amino acid, glycine, / 3-alanine or a derivative thereof.
  • L-form amino acids and amino acid derivatives include the above-mentioned substances. More preferable dipeptides produced by the above-mentioned method include L-l-isyl-L-hue-l-alanine and L-hue-l-a-l-an L-leucine, L-leu-lu-L-alanine, L-mouth isinore L-leucine and L-pheninoleraninole L-pheninolealanine.
  • a transformant having the ability to produce the protein of the present invention or a protein for synthesizing a dipeptide, Using a culture of a microorganism having a capability of producing a protein or a protein for synthesizing a dipeptide or a processed product of the culture as an enzyme source, causing the enzyme source and one or more amino acids to be present in an aqueous medium; And a method for producing the dipeptide represented by the formula (I), accumulating the dipeptide, and collecting the dipeptide.
  • Examples of the transformant used in the above-mentioned production method include a transformant that can be produced by the above-mentioned method (ii) and produces the protein of the present invention or the protein for dipeptide synthesis.
  • Examples of the host of the transformant include bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and other plant cells. Preferred are bacteria, more preferably bacteria, Bacillus, Streptomyces or Corynebacterium. Microorganisms belonging to the genus Mus.
  • Microorganisms belonging to the genus Escherichia include preferably microorganisms belonging to the genus Escherichia coli, and microorganisms belonging to the genus Bacillus are preferably Bacillus sachii. Microorganisms belonging to the squirrel or Bacillus megaterium and the like can be mentioned, and microorganisms belonging to the genus Streptomyces preferably include Streptomyces lividans, and microorganisms belonging to the genus Corynebacterium and preferably Examples of such microorganisms include microorganisms belonging to Corynebacterium glutamicum or Corynebacterium terminum ammoniagenes.
  • the microorganism used in the above-mentioned production method may be any microorganism, preferably a microorganism of the genus Streptomyces, as long as it is capable of producing the protein of the present invention or the protein for synthesizing a dipeptide. And more preferably a microorganism belonging to the genus Streptomyces having albonorcin-synthesizing activity, still more preferably a microorganism belonging to a species selected from Streptomyces albolas or Streptomyces noursii, most preferably streptomyces. Myces 'Albolus IFO 14147, Streptomyces' Noulsey ATCC 11455 or IF015452.
  • the processed product of the culture may be any processed product of a culture that has been subjected to any known treatment, as long as the same activity as that of the culture is maintained. Concentrate, dried culture, bacterial cells obtained by centrifuging the culture, dried bacterial cells, freeze-dried bacterial cells, surfactant-treated bacterial cells, bacterial cells Solvent-processed cells, enzymatically treated cells, treated cells with viable cells, such as immobilization of the cells, ultrasonically treated cells, mechanical grinding of the cells Products, protein fractions of the cells and enzyme preparations obtained by extraction from the cells.
  • the aqueous medium used in the production method using a culture of a microorganism or a processed product of the culture as an enzyme source includes the aqueous medium used in the enzymatic production method (1) of (m) above.
  • the culture of the transformant or microorganism used as the enzyme source can also be used as the aqueous medium.
  • ATP or a compound capable of producing ATP by metabolism of a transformant or a microorganism, such as glucose may be used as a source of ATP.
  • a transformant or a microorganism such as glucose
  • Such saccharides, alcohols such as ethanol, organic acids such as acetic acid, and the like can be added to an aqueous medium.
  • surfactants include polyoxyethylene'octadecylamine (e.g.
  • Nonionic surfactants such as S-215, manufactured by NOF Corporation, cetyltrimethylammonium-bromide and alkyldimethyl.benzylammonium-perchloride (eg, cation
  • Cationic surfactants such as F2-40E, manufactured by NOF Corporation, ionic surfactants such as lauroyl 'sarcosinate, and tertiary agents such as alkyldimethylamine (e.g., tertiary amine FB, manufactured by NOF Corporation) Any type such as amines may be used as long as it promotes the production of the dipeptide, and one type or a mixture of several types may be used.
  • the surfactant is generally used at a concentration of 0.1 to 50 g / l.
  • the organic solvent include xylene, toluene, aliphatic alcohol, acetone, and ethyl acetate, which are usually used at a concentration of 0.1 to 50 ml / 1.
  • the amount of the enzyme source varies depending on the specific activity and the like of the enzyme source. 5 to 1000 mg, preferably 10 to 400 mg.
  • the dipeptide formation reaction is carried out in an aqueous medium under the conditions of pH 5 to 11, preferably pH 6 to 10, 20 to 65 ° C, preferably 25 to 55 ° C, more preferably 30 to 45 ° C, usually for 1 minute to 150 hours. , Preferably for 3 minutes to 120 hours, more preferably for 30 minutes to 100 hours.
  • collection of the peptides generated and accumulated in the aqueous medium can be carried out by a usual method using activated carbon, ion-exchange resin, or the like.
  • the extraction can be performed by extraction with an organic solvent, crystallization, thin-layer chromatography, high-performance liquid chromatography, or the like.
  • the albC gene and its related genes were obtained from Streptomyces' Noulsey and Streptomyces. Acquired by the way. First, a Streptomyces noursii IFO 15452 strain and a Streptomyces alborus IF014147 strain were each added to a 1% glycine-added KM73 medium [2 g / l yeast extract (manufactured by Difco), 10 g soluble starch (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • KP medium [15 g / l glucose, lOg / 1 glycerol, lOg / 1 polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), lOg / 1 meat extract (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.), 4 g / l carbonate Calcium] and shaking culture at 28 ° C overnight.
  • Streptomyces noursii IF015452 strain and Streptomyces alboras IF014147 strain are the National Institute of Technology and Evaluation (NITti, Biological Resource Center (BR)) ⁇ 292 -0818 Received a sale from Kisarazu Kazusa Kamatari 2-5-8), Chiba Prefecture.
  • the chromosomal DNA of the microorganism was isolated and purified according to the method described in InnesFoundation. Based on the nucleotide sequence of the albC gene, a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 5 and 6 (hereinafter referred to as primer A and primer B, respectively) using an 8905 DNA synthesizer manufactured by Perseptive Biosystems, Inc. ) was synthesized. Primer A is obtained by adding a base sequence containing a tol recognition sequence to the 5 'end of the region containing the initiation codon of the albC gene of the chromosomal DNA of Streptomyces' Noulsey. Primer B is obtained by adding a base sequence containing a ⁇ recognition sequence to the 5 'end of a base sequence complementary to a sequence containing a stop codon of the albC gene.
  • PCR was performed using the above primers A and B as a primer set and chromosome DNA of Streptomyces noulsei or Streptomyces alborus as type I. PCR was performed by using 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA as type III, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of Tafl DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), and 5 ⁇ L of E (I X10 buffer for DNA polymerase.
  • the amplified DNA was digested with restriction enzymes and ⁇ , DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and Gene Clean II kit (GENECLEANII kit, manufactured by BIO101) was used. Each of them was used to recover a 700 bp DNA fragment.
  • Plasmids were extracted from the thus grown colonies of the transformant in accordance with a known method, and the structure was analyzed using a restriction enzyme. Thus, DNA derived from Streptomyces noursei was ligated downstream of the phage T5 promoter. It was confirmed that pAL-nou, an expression vector, and pAL-alb, an expression vector to which DNA derived from Streptomyces albras was ligated, were obtained (FIG. 1).
  • the base sequence of the DNA portion derived from actinomycetes inserted into each plasmid was determined using a base sequencer 373A. DNA sequencer. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was found in pAL_alb. PAL-nou contains a DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, that is, a DNA encoding a protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, It was confirmed that DNA having the base sequence represented by 4 was contained.
  • linear dipeptide was subjected to derivatization by the F-mockey method and then analyzed by HPLC analysis.
  • the Escherichia coli NM522 / pAL-nuo strain was cultured in the same manner as in Example 2. After completion of the culture, wet cells were obtained by centrifugation, washed with a 60 mmol / l potassium phosphate buffer (pH 7.2), and suspended in a 20 mmol / l potassium phosphate buffer containing 10 mmol / l imidazole. This suspension was sonicated at 4 ° C to obtain a cell lysate.
  • This cell lysate (10 ml, protein (Including 0.863 mg) through an Amersham His tag purification column, washing by passing through 15 ml of a 20 mmol / l potassium phosphate buffer containing 10 mmol / l imidazole, and washing the albC protein with His tag in the column. And purified.
  • reaction solution composition 60 mmol / L potassium phosphate buffer (pH 7.2), 10 mmol / L magnesium chloride, 2 ml of a reaction solution consisting of 10 mmol / L ATP, lg / L L-Leu, and lg / L L-Phe
  • reaction solution in the column was dissolved with 3 ml of the reaction solution having the same composition, and the cyclodipeptide and dipeptide in the reaction solution were removed in the same manner as in Example 2.
  • Example 3 An enzymatic reaction was carried out in the same manner as in Example 3 except that the amino acid of the substrate was replaced with another amino acid, and the product was analyzed.
  • the reaction solution used was a solution having the same composition as in Example 2 except that the amino acid of the substrate was replaced with L-Ala, L-Leu or L-Phe of lg / L.

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Abstract

　本発明によれば、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を用いたジペプチドの酵素的合成法、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物または形質転換体の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法が提供される。

Description

明 細 書
ジペプチドの製造法
技術分野
[0001] 本発明は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質、 ジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質 またはジペプチド合成用蛋白質を用いたジペプチドの製造法、ジペプチド合成活性 を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を生産する微生物または形質転換 体、および該微生物または形質転換体を用いたジペプチドの製造法に関する。 背景技術
[0002] ペプチドの大量合成法につ!ヽては、化学合成法 (液相法、固相法）、酵素的合成 法および DNA組換え法を用いた生物学的合成法が知られている。現在、 50残基以 上の長鎖のペプチドに関しては酵素的合成法あるいは生物学的合成法が用いられ 、ジペプチドに関しては化学合成法と酵素的合成法が主に用いられている。
化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護'脱保護などの操作が必 要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法と はいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好まし い方法ではない。
[0003] 酵素法によるジペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の 逆反応を利用した方法 [J. Biol. Chem., 119, 707-720 (1937)]、耐熱性アミノアシル t-RNA合成酵素を利用する方法 (特開昭 58-146539号公報、特開昭 58-209991号公 報、特開昭 58-209992号公報、特開昭 59-106298号公報）、非リボゾームペプチドシ ンセターゼ（以下、 NRPSと称す）を利用する方法 [Chem.Biol., 7, 373-384 (2000)、 FEBS Lett., 498, 42-45 (2001)、米国特許第 5795738号、米国特許第 5652116号]が 知られている。
[0004] しかし、タンパク分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能 基の保護'脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反 応の阻止が困難と ヽつた問題点がある。耐熱性アミノアシル t-RNA合成酵素を利用 する方法には、酵素の発現、 目的産物以外の副生反応の阻止が困難という問題点 がある。 NRPSを利用する方法に関しては、酵素分子が巨大なために DNA組換え法 を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素である 4' ホスフォパンテテ イン（4'-phosphopantetheine)の供給が必要であり、効率的な製造法とは 、えな 、。
[0005] 一方、酵素分子量力 SNRPSより小さぐ補酵素である 4'-phosphopantetheineを必要 としな ヽ γ—グノレタミノレシスティンシンセターゼ ( y -glutamylcysteinesynthetase)、グ ルタチオンシンセターゼ（glutathione synthetase)、 D -ァラニン一 D-ァラニン（D- Ala —D- Ala)リガーゼ（D- Ala— D- Alaligase)、ポリ γ グルタミン酸シンセターゼ（ poly- y -glutamate synthetase)等の一群のペプチドシンセターゼも知られている。こ れらの酵素の殆どは D—アミノ酸を基質に用いる、または γ位のカルボキシル基での ペプチド結合の形成を触媒する等の特徴を有するため、 L—アミノ酸のひ位カルボキ シル基でペプチド結合するジペプチドの合成に用いることはできな 、。
[0006] L アミノ酸の α位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性によるジペプチド生 成が知られているのはバチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生物質である バシリシン合成酵素のみである。バシリシン合成酵素は、バシリシン (L ァラ-ルー L アンチカプシン、 L-Ala-L-anticapsin)および L ァラ-ルー L ァラニン（L- Ala -L-Ala)を合成する活性を有することは知られている力 その他のジペプチドの合成 活性については知られていない [J. Ind. Microbiol, 2, 201-208 (1987)、
Enzyme.Microbial.TechnoL, 29, 400-406 (2001)]。
[0007] ある種の微生物は 2つのアミノ酸が環状につながった環状ジペプチド (ジケトビペラ ジン)構造を持つ化合物を生成することも知られている [J. Nat. Prod., 59,293-296 (1996)、 Tetrahedron, 28, 2999(1972)、 J. Appl. Microbiol, 86,29-53 (1999)]。ジケト ピぺラジンの生合成については、 Streptomvces acidiscabiesの Thaxtomin牛.合成渦程 では NRPSによって cyclo-(L- 4- nitrotryptophy卜 L- phenylalanine)構造が合成される [ Mol. Microbiol, 38, 794-804 (2000)]こと、およびバチルス属細菌の NRPSの一部の モジュールの作用によってフエ-ルァラニンとプロリンから cyclo(phenylalany卜 proline) が生成すること [J.Biol. Chem., 273, 22773-22781 (1998)]が報告されている。
[0008] 一方、抗生物質であるアルボノルシン（albonoursin)の生産株として知られて!/、るス トレプトマイセス ·ノルセィ (Streptomvces noursei) ATCC11455株では NRPS酵素とは 全く類似性のな 、蛋白質 (albC遣伝子産物)がシクロ（L フエニルァラ-ル L一口 イシン） [cyclo(L- phenylalany卜 L- leucine)]構造の合成を担っていること、 albC遣伝子 人した Escherichia coliおよび Streptomvces lividansの 佼に cvclo aipeptide oxidaseを作用させるとアルボノルシンが検出されたとの報告はある [Chemistry& Biol, 9, 1355-1364 (2002)]が、 k£遺伝子産物が直鎖状のジペプチドを生成すると の報告はない。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の目的は、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用 蛋白質、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質をコ ードする DNA、該 DNAを含有する組換え体 DNA、該組換え体 DNAを保有する形 質転換体、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチドの合成活性 を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を用いたジペプチドの酵素的合成 法、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を生産す る能力を有する微生物または形質転換体の培養物等を酵素源に用いたジペプチド の製造法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明は、以下の（1)〜（24)に関する。
(1) 以下の [1]〜 [3]のいずれかに記載の蛋白質 (ただし、配列番号 1で表される アミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。
[ 1 ]配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換または付加したアミノ酸配列力もなり、かつ式 (I)
R1 - R2 (I)
(式中、 R1および R2は、同一または異なってアミノ酸を表す)で表されるジペプチドの 合成活性を有する蛋白質
[3]配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、かつ式 (I)で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
(2) 以下の [1]〜 [3]の 、ずれかに記載のジペプチド合成用蛋白質。
[ 1 ]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するジペプチド合成用蛋白質
[2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加したアミノ酸配列からなり、かつ式 (I)
R1 - R2 (I)
(式中、 R1および R2は、同一または異なってアミノ酸を表す）
で表されるジペプチドの合成活性を有するジペプチド合成用蛋白質
[3]配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ式 (I)で表されるジペプチドの合成活性を有するジペプチド合成用蛋白 質
(3) 以下の [1]〜[3]のいずれかに記載の DNA (ただし、配列番号 3で表される 塩基配列からなる DNAを除く）。
[1]上記（1)の蛋白質をコードする DNA
[2]配列番号 4で表される塩基配列を有する DNA
[3]配列番号 4で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ式 (I)
R1 - R2 (I)
(式中、 R1および R2は、同一または異なってアミノ酸を表す)で表されるジペプチド合 成活性を有する蛋白質をコードする DNA
(4) 上記 ）の DNAを含有する組換え体 DNA。
[0011] (5) 上記 (4)の組換え体 DNAを有する形質転換体。
(6) 形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である上記（5)の形 質転換体。
(7) 微生物が、エシ リヒア（Escherichia)属に属する微生物である上記（6)の形 質転換体。
[0012] (8) 上記（5)〜（7)のいずれか 1つに記載の形質転換体を培地に培養し、培養物 中に上記（1)の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（1 )の蛋白質の製造法。
(9) 上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物 中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（1)の蛋白 質の製造法。
[0013] (10) 微生物がストレプトマイセス（StreDtomvces)属に属する微生物である上記（9 )の製造法。
(11) ストレプトマイセス属に属する微生物力 アルボノルシンを生産する能力を有 するストレプトミセス属に属する微生物である上記（10)の製造法。
( 12) アルボノルシンを生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生 物力 ストレプトマイセス 'アルボラス (StreDtomvces alborus)またはストレプトマイセス .ノノレセィ (StreDtomvces noursei)である上記 (11)の製造法。
[0014] (13) 上記（1)の蛋白質または上記（2)のジペプチド合成用蛋白質、 1種以上の アミノ酸、および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式 (I)
R1 - R2 (I)
(式中、 R1および R2は、同一または異なってアミノ酸を表す)で表されるジペプチドを 生成、蓄積させ、該媒体力 該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
[0015] (14) 以下の [1]〜[3]から選ばれる培養物または該培養物の処理物を酵素源に 用い、該酵素源、 1種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式 (I) R1 - R2 (I)
(式中、 R1および R2は、同一または異なってアミノ酸を表す)で表されるジペプチドを 生成、蓄積させ、該媒体力 該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
[1]上記（5)〜（7)の 、ずれか 1つに記載の形質転換体の培養物または該培養物の 処理物
[2]上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の 処理物
[3]上記 (2)のジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物ま たは該培養物の処理物
(15) 上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物が、ストレブトマイセス属 に属する微生物である上記（14)の製造法。
[0016] (16) 上記（2)のジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物が、ス トレプトマイセス属に属する微生物である上記（14)の製造法。
(17) ストレプトマイセス属に属する微生物力 アルボノルシンを生産する能力を有 するストレブトマイセス属に属する微生物である上記（15)または（16)の製造法。
[0017] (18) アルボノルシンを生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生 物力 ストレプトマイセス ·アルボラスまたはストレプトマイセス ·ノルセィに属する微生 物である上記（ 17)の製造法。
(19) 上記 (2)のジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物が、上 記（2)のジペプチド合成用蛋白質をコードする DNAで形質転換された微生物である 上記（14)の製造法。
(20) 上記（2)のジペプチド合成用蛋白質をコードする DNAで形質転換された微 生物が、ェシエリヒア属に属する微生物である上記（19)の製造法。
(21) 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離 して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤 処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理 物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該 菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、上記（14)〜（20)の 、 ずれか 1つの製造法。
[0018] (22) 1種以上のアミノ酸力 L体もしくは D体のアミノ酸、グリシン、 β—ァラニンま たはそれらの誘導体である上記（13)〜（21)のいずれ力 1つの製造法。
(23) ジペプチドが式 (II)
R3 - R4 (II)
(式中、 R3および R4は同一または異なって、 L体もしくは D体のアミノ酸、グリシン、 /3 ーァラニンまたはそれらの誘導体を表す)であらわされるジペプチドである上記（13) 〜（22)の!、ずれか 1つの製造法。
[0019] (24) L体または D体のアミノ酸力 ァラニン、グルタミン、グルタミン酸、ノ リン、ロイ シン、イソロイシン、プロリン、フエ二ルァラニン、トリプトファン、メチォニン、セリン、ス レオニン、システィン、ァスパラギン、チロシン、リジン、ァノレギニン、ヒスチジン、ァス パラギン酸、 a—ァミノ酪酸、ァザセリン、テアニン、 4—ヒドロキシプロリン、 3—ヒドロ キシプロリン、オル-チン、シトルリンおよび 6—ジァゾ -5-ォキソノルロイシンから選ば れるアミノ酸である上記（22)または（23)の製造法。
発明の効果
[0020] 本発明によれば、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用 蛋白質、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質をコ ードする DNA、該 DNAを含有する組換え体 DNA、該組換え体 DNAを保有する形 質転換体、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチドの合成活性 を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を用いたジペプチドの酵素的合成 法、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を生産す る能力を有する微生物または形質転換体の培養物等を酵素源に用いたジペプチド の製造法を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0021] [図 1]図 1は、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の発現プラスミドベクターである pAL- nouおよび pAL- albの構築過程を示す図である。
符号の説明
[0022] Ampr：アンピシリン耐性遺伝子
kef：ラタトースリプレッサー遺伝子
albC： ^^遺伝子または^類似遺伝子
発明を実施するための最良の形態
[0023] 本発明の蛋白質としては、以下の [1]〜[3]記載の蛋白質 (ただし、配列番号 1で 表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質を除く）、
[ 1 ]配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[2]配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換または付加したアミノ酸配列力もなり、かつ式 (I)
R1 - R2 (I) (式中、 R1および R2は、同一または異なってアミノ酸を表す)で表されるジペプチドの 合成活性を有する蛋白質、および
[3]配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列と 65%以上、好ましくは 80%以上、よ り好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、最も 好ましくは 99%以上の相同性を有するアミノ酸配列力 なり、かつ式 (I)で表されるジ ペプチドの合成活性を有する蛋白質、
をあげることができる。
[0024] また、本発明のジペプチド合成用蛋白質としては、以下の [4]〜 [6]記載のジぺプ チド合成用蛋白質、
[4]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するジペプチド合成用蛋白質、
[5]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加したアミノ酸配列力 なり、かつ式 (I)で表されるジペプチドの合成活性を有す るジペプチド合成用蛋白質、
[6]配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 65%以上、好ましくは 80%以上、より好まし くは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、最も好ましく は 99%以上の相同性を有するアミノ酸配列力 なり、かつ式 (I)で表されるジぺプチ ドの合成活性を有するジペプチド合成用蛋白質、
をあげることができる。
[0025] 以下、上記本発明の蛋白質およびジペプチドの合成用蛋白質を合わせて本発明 の蛋白質と称する場合もある。
上記において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からな り、かつ式 (I)で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質は、 Molecular し loning, A Laboratory Manual, Third Edition, し old SpnngHarbor Laboratory Press (1989) (以下、モレキュラ^ ~·クロー-ング第 3版と略す）、 Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons (1987- 1997) (以下、カレント'プロトコールズ 'イン'モレキュラ^ ~·バイオロジーと略す）、 NucleicAcids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,6409(1982), Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13. 4431(1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部 位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列か らなる蛋白質をコードする DNAに部位特異的変異を導入することにより、取得するこ とがでさる。
[0026] 欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されな 、が、上記の部位特異 的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、 1個か ら数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜： LO個、さらに好ましくは 1〜5個で ある。
配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換 または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、 1または複数のアミノ酸 が欠失、置換または付加されていてもよい。
[0027] アミノ酸の置換が可能なアミノ酸としては、例えば配列番号 1または 2で表されるアミ ノ酸配列を公知のァライメントソフトウェアを用いて比較したときに、すべてのアミノ酸 配列にぉ 、て保存されて 、な 、アミノ酸をあげることができる。公知のァライメントソフ トウエアとしては、例えば遺伝子解析ソフトウェア Genetyx (ソフトウェア開発株式会社） に含まれるァライメント解析ソフトをあげることができる。該解析ソフトの解析パラメータ としては、デフォルト値を用いることができる。
[0028] また、アミノ酸の欠失または付カ卩が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列の N末端側および C末端側をあげることができる。 欠失、置換または付カ卩は同時に生じてもよぐ置換または付加されるアミノ酸は天然 型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、 Lーァラニン、 Lーァスパラギン 、 L ァスパラギン酸、 L グルタミン、 L グルタミン酸、グリシン、 L ヒスチジン、 L —イソロイシン、 L ロイシン、 L リジン、 L—メチォニン、 L フエ二ルァラニン、 L— プロリン、 L セリン、 L—スレオニン、 L トリプトファン、 L チロシン、 L—パリン、 L システィンなどがあげられる。
[0029] 以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互 に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2-アミノブ タン酸、メチォニン、 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-ブチルァラニン、シクロへ キシノレァラニン
B群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、グルタミン
D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2,4-ジァミノブタン酸、 2,3-ジァミノプロピオ ン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン
G群：フエ-ルァラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質が式 (I)で表されるジペプチド合成活性を有するためには、 配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列との相同性が 65%以上、好ましくは 80% 以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以 上、最も好ましくは 99%以上の相同性を有して ヽることが望ま ヽ。
[0030] アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム
BLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 2Q,5873(1993)]や FASTA[Methods EnzymoL, 183. 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLASTNや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J.Mol. Biol, 215.
403(1990)] o BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、ノ ラメータは例えば Score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えば score = 50、 wordlength=3とする。 BLASTと GappedBLASTプログラムを用いる場合には、各プロ グラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知 で fco (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
[0031] 本発明の蛋白質が、式 (I)で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質であるこ とを確認する手段としては、例えば DNA組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現 する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、本 発明の蛋白質、 1種以上のアミノ酸、および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該水 性媒体中に上記式 (I)で表されるジペプチドが生成、蓄積する力否かを HPLC等に より分析する方法をあげることができる。
[0032] 本発明の DNAとしては、以下の [1]〜[3]記載の DNA (ただし、配列番号 3で表さ れる塩基配列からなる DNAを除く）、
[1]配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA、
[2]配列番号 4で表される塩基配列を有する DNA、および
[3]配列番号 4で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ントな条件下でハイブリダィズし、かつ式 (I)で表されるジペプチド合成活性を有する 蛋白質をコードする DNA、
をあげることができる。
[0033] また、本発明の式 (I)で表されるジペプチドの製造法に用いることができる DNAとし ては、上記 [1]〜[3]記載の DNAに加え、以下の [4]〜[6]記載の DNA、
[4]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA、
[5]配列番号 3で表される塩基配列を有する DNA、および
[6]配列番号 3で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ントな条件下でハイブリダィズし、かつ式 (I)で表されるジペプチド合成活性を有する 蛋白質をコードする DNA、
をあげることができる。
[0034] ここで!/、う「ノ、イブリダィズする」とは、特定の塩基配列を有する DNAまたは該 DNA の一部に DNAがハイブリダィズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有 する DNAまたは該 DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析の プローブとして有用であるか、または PCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして 使用できる長さの DNAであってもよい。プローブとして用いる DNAとしては、少なくと も 100塩基以上、好ましくは 200塩基以上、より好ましくは 500塩基以上の DNAをあ げることができるが、少なくとも 10塩基以上、好ましくは 15塩基以上の DNAであって ちょい。
[0035] DNAのハイブリダィゼーシヨン実験の方法はよく知られており、例えば当業者であ れば本願明細書に従い、ハイブリダィゼーシヨンの条件を決定することができる。該 ハイブリダィゼーシヨンの条件は、モレキュラー 'クローユング第 2版、第 3版（2001年 )、 Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press (1994)、 Immunologymethods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標 準的な教科書に従っておこなうことができる。
[0036] 上記のストリンジェントな条件とは、例えば DNAを固定化したフィルターとプローブ DNAとを 50%ホルムアミド、 5 X SSC (750mMの塩化ナトリウム、 75mMのクェン酸ナト リウム）、 50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6)、 5 Xデンハルト溶液、 10%の硫酸デキスト ラン、および g/1の変性させたサケ精子 DNAを含む溶液中で 42°Cでー晚、イン キュペートした後、例えば約 65°Cの 0.2 X SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件 が好ましいが、より低いストリンジヱント条件を用いることもできる。ストリンジヱンな条件 の変更は、ホルムアミドの濃度調整 (ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェン トになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件と しては、例ぇば6 X SSCE (20 X SSCEは、 3mol/lの塩化ナトリウム、 0.2mol/lのリン酸二 水素ナトリウム、 0.02mol/lの EDTA、 pH7.4)、 0.5%の SDS、 30%のホルムアミド、 100 μ g/1の変性させたサケ精子 DNAを含む溶液中で、 37°Cでー晚インキュベートした 後、 50°Cの 1 X SSC、 0.1%SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また 、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において 、高塩濃度 (例えば 5 X SSC)の溶液を用いてハイブリダィゼーシヨンを行った後、洗 净する条件をあげることがでさる。
[0037] 上記した様々な条件は、ノ、イブリダィゼーシヨン実験のバックグラウンドを抑えるた めに用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。 上記したブロッキング試薬の添カ卩は、条件を適合させるために、ハイブリダィゼーショ ン条件の変更を伴ってもょ 、。
上記したストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズ可能な DNAとしては、例えば上 記した BLASTや FASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づ 、て計算したときに、 配列番号 3または 4で表される塩基配列と少なくとも 90%以上、好ましくは 95%以上 、より好ましくは 98%以上、さらに好ましくは 99%以上の相同性を有する DNAをあげ ることがでさる。
[0038] 配列番号 3または 4で表される塩基配列を有する DNAとストリンジ ントな条件下で ノ、イブリダィズする DNAが、式 (I)で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質 をコードする DNAであることは、例えば上記したように、組換え DNA法を用いて該 D NAにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認するこ とがでさる。
(i)本発明の DNA、および本発明の蛋白質またはジペプチドの製造法に用いられる DNAの調製
本発明の DNA、および本発明の蛋白質またはジペプチドの製造法 (以下、単に本 発明の製造法ともいう）に用いられる DNAは、例えば、配列番号 3または 4で表され る塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、ストレブトマイセス属に 属する微生物の染色体 DNAライブラリーに対するサザンノヽイブリダィゼーシヨン、ま たは配列番号 3または 4で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマ 一 DNAを用いた、ストレプトマイセス属に属する微生物の染色体 DNAを铸型とした PCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
[0039] また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号 1または 2で表されるァミノ 酸配列をコードする DNAの塩基配列と 75%以上、好ましくは 85%以上、より好ましく は 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、最も好ましくは 99%以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基 づき、該塩基配列を有する生物の染色体 DNA、 cDNAライブラリ一等から上記した 方法により本発明の DNA、または本発明の製造法に用いられる DNAを取得するこ とちでさる。
[0040] 取得した DNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりべク ターに組み込み、得られた組換え体 DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられ る塩基配列解析方法、例えばジデォキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]ある!、は 373A · DNAシークェンサ一（パーキン'エルマ一社製）等の塩基配 列分析装置を用いて分析することにより、該 DNAの塩基配列を決定することができ る。
[0041] 塩基配列を決定した結果、取得された DNAが部分長であった場合は、該部分長 D NAをプローブに用いた、染色体 DNAライブラリーに対するサザンハイブリダィゼー シヨン法等により、全長 DNAを取得することができる。
更に、決定された DNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ'バイオシステムズ 社製 8905型 DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とする DNAを調 製することちでさる。
[0042] 上記のようにして取得される DNAとして、例えば、配列番号 3または 4で表される塩 基配列を有する DNAをあげることができる。
本発明の DNAおよび本発明の製造法に用いられる DNAを組み込むベクターとし ては、 pBluescriptll KS(+) (ストラタジーン社製）、 pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18 ,6069 (1990)]、 pCR- Script Amp SK(+) (ストラタジーン社製）、 pT7Blue (ノバジェン社 製）、 pCR II (インビトロジェン社製）および pCR- TRAP (ジーンハンター社製）などをあ げることができる。
[0043] 宿主細胞としては、ェシエリヒア属に属する微生物などをあげることができる。ェシェ リヒア属に属する微生物としては、例えば、ェシエリヒア'コリ (Escherichia coH) XL1— Blueゝェシエリヒア'コリ XL2— Blueゝェシエリヒア'コリ DH1、ェシエリヒア'コリ MC1000、ェシエリヒア'コリ KY3276、ェシエリヒア'コリ W1485、ェシエリヒア'コリ JM109、ェシエリヒア'コリ HB101、ェシエリヒア'コリ No.49、ェシエリヒア'コリ W3110、 ェシエリヒア'コリ NY49、ェシエリヒア'コリ MP347、ェシエリヒア'コリ NM522、ェシエリ ヒア'コリ ME8415等をあげることができる。
[0044] 組換え体 DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394)、エレクト口 ポレーシヨン法 [NucleicAcids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の製造法に用いられる DNAを保有する微生物と しては、例えば配列番号 3で表される配列を有する DNAを含有する組換え体 DNA を保有する微生物であるェシエリヒア'コリ NM522/pAL-nouをあげることができる。 (ii)本発明の蛋白質および本発明のジペプチド合成用蛋白質の製造法
本発明の蛋白質および本発明のジペプチド合成用蛋白質は、モレキュラー 'クロー ユング第 3版、カレント ·プロトコールズ.イン ·モレキュラー ·バイオロジー等に記載さ れた方法等を用い、例えば以下の方法により、上記 (i)の方法により取得した本発明 の DNAおよび本発明の製造法に用いられる DNAを宿主細胞中で発現させて、製 造することができる。
[0045] 本発明の DNAまたは本発明の製造法に用いられる DNAをもとにして、必要に応じ て、本発明の蛋白質または本発明のジペプチド合成用蛋白質をコードする部分を含 む適当な長さの DNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列 を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の 生産率を向上させることができる。
[0046] 該 DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、 組換え体 DNAを作製する。
該組換え体 DNAを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、本 発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする 遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができ、好ましくは細菌、より好 ましくはェシエリヒア属、バチルス属またはコリネバタテリゥム属に属する微生物、さら に好ましくはェシエリヒア属に属する微生物をあげることができる。
[0047] 発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組込が可能で、本発明の DNAまたは本発明の製造法に用いられる DNAを転写 できる位置にプロモーターを含有して 、るものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の DNAまたは本発明 の製造法に用いられる DNAを有する組換え体 DNAは、原核生物中で自立複製可 能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の DNAまたは本発明 の製造法に用いられる DNA、転写終結配列より構成された組換え体 DNAであるこ とが好ま ヽ。プロモーターを制御する遺伝子が含まれて!/ヽてもよ!/、。
[0048] 発現ベクターとしては、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもベーリンガーマンハイ ム社製）、 pHelixl (ロシュ'ダイァグノステイタス社製）、 pKK233-2 (アマシャム'ファノレ マシア'バイオテク社製）、 pSE280 (インビトロジェン社製）、 pGEMEX-Ι (プロメガ社製 )、 pQE8 (キアゲン社製）、 pQE60 (キアゲン社製）、 pET- 3 (ノバジェン社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600)、 pKYP200[Agric.Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、 pLSAl[Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)]、 pGELl[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)] 、 pBluescriptIISK(+)ゝ pBluescript II KS (―) (ストラタジーン社製）、 pTrS30 [ェシエリヒア 'コリ JM109/pTrS30(FERMBP- 5407)より調製]、 pTrS32 [ェシエリヒア'コリ
JM109/pTrS32(FERM BP- 5408)より調製]、 pPAC31(W098/12343)、 pUC19[Gene, 33, 103 (1985)]、 pSTV28(宝酒造社製)、 pUC118 (宝酒造社製）、 pPAl (特開昭 63-233798)等を例示することができる。
[0049] プロモーターとしては、エシ リヒア 'コリ等の宿主細胞中で機能するものであれば V、かなるものでもよ!/ヽ。例えば、 imプロモーター（P )、 プロモーター（P ；)、 Pプ
trp iac L 口モーター、 pプロモーター、 p プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来する
R SE
プロモーター、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモーター等をあ げることができる。また P を 2つ直列させたプロモーター、 ^プロモーター、 lacT7プ
trp
口モーター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用 いることがでさる。
[0050] さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるための xylAプロモーター [Appl.
Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)]ゃコリネバクテリゥム（^001§^&£1§0121) 属に属する微生物中で発現させるための P54-6プロモーター [Appl.Microbiol.
Biotechnol, 53, 674-679 (2000)]、ストレプトマイセス属に属する微生物中で発現さ せるための xylAプロモ ~~タ' ~~ (GeneticManipulation of Streptomyces: a Laboratory
Manuahjohn Innes Foundation)なども用!ヽること力できる 0
[0051] リボソーム結合配列であるシャインーダルガノ（Shine-Dalgarno)配列と開始コドンと の間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ま 、。
本発明の DNAまたは本発明の製造法に用いられる DNAを発現ベクターに結合さ せた組換え体 DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺 伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
[0052] このような組換え体 DNAとしては、例えば pAL-nuoおよび pAL-albをあげることがで きる。
原核生物としては、ェシエリヒア属、セラチア（Serratia)属、バチルス属、ブレビバタ テリゥム（Brevibacterium)属、コリネパクテリゥム（Corvnebacterium)属、ミクロバタテリ ゥム属 (Microbacterium)、シユードモナス (Pseudomonas)属、ァグロノくクテリゥム ( Agrobacterium)属、アリシクロバチノレス属 (Alicvclobacillus)、アナべナ (Anabena)属、 アナシスティス (Anacvstis)属、ァスロバクタ一 (Arthrobacter)属、ァゾパクター（ Azotobacter)属、クロマチゥム (Chromatium)属、エノレビ-ァ (Erwinia)属、メチロノくク テリゥム（Methylobacterium)属、フオルミディウム（Phormidium)属、ロドパクター（ Rhodobacter)属、ロドシユードモナス（Rhodopseudomonas)属、ロドスピリゥム ( Rhodospirillum)属、セネデスムス (Scenedesmus)属、ストレプトマイセス (Streptomvces )属、シネコッカス（Svnechoccus)属、ザィモモナス（Zvmomonas)属等に属する微牛. 物、例えば、ェシエリヒア'コリ XL1- Blue、ェシエリヒア'コリ XL2- Blue、ェシエリヒア'コ リ DH1、ェシエリヒア'コリ DH5 a、ェシエリヒア'コリ MC1000、ェシエリヒア'コリ KY3276,ェシエリヒア'コリ W1485、ェシエリヒア'コリ JM109、ェシエリヒア'コリ HB101 、ェシエリヒア'コリ No.49、ェシエリヒア'コリ W3110、ェシエリヒア'コリ NY49、ェシエリヒ ァ 'コリ MP347、ェシエリヒア'コリ NM522、バチルス ·サチリス ATCC33712、バチルス 'メガテリゥム、バチノレス ·エスピー（Bacillus sp.) FERM BP- 6030、バチルス 'アミロリ ケファスエンス、バチルス 'コアギュランス、バチルス'リケニフォルミス、バチルス'プミ ルス、ブレビパクテリゥム ·アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes)、ブレビ パクテリゥム，イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum)ATCC 14068.ブレビバ クテリウム ·サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolvticum) ATCC14066、ブレビ パクテリゥム ·フラバム（Brevibacterium flavum) ATCC14067,ブレビバタテリゥム'ラタ トフアーメンタム（Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869、コリネノ クテリウム' グルタミカム（Corvnebacterium glutamicum)ATCC 13032、コリネバタテリゥム 'グルタミ カム ATCC14297、コリネパクテリゥム ·ァセトァシドフィルム（Corvnebacterium
acetoacidophilum) ATCC13870、ミクロバタテリゥム ·アンモニアフィルム（
Microbacterium ammoniapnilum) ATCし 15354、セフテフ ·フイカリ /' (Serratia ncana、 セラチア ·フォンチコラ (Serratia fonticola)、セラチア ·リケファシエンス (Serratia liauefaciens)、セラチア ·マノレセッセンス (Serratia marcescens)、シユードモナス ·エス ピー（Pseudomonas sp.) D- 0110、ァグロバタテリゥム 'ラジオバクタ（Agrobacterium radiobacter)、ァグロノくクテリウム ·リゾジーンズ (Agrobacterium rhizogenes)、ァグロノ クテリウム レビ（Agrobacterium rubi)、アナべナ.シリンドリカ (Anabaena cvlindrica)、 アナべナ ·ドリオノレム (Anabaena doliolum)、アナべナ ·フロスアクア (Anabaena flos-aauae)、アースロノくクタ一 ·オーレッセンス (Arthrobacter aurescens)、アースロノく クタ一 .シトレウス (Arthrobacter citreus)、アースロバクタ一 .グロプフォルミス（ Arthrobacter globformis)、アースロノくクタ一 .ヒドロカーボグノレタミカス (Arthrobacter hvdrocarboglutamicus)、 ~~スロノ、クタ1 ~~ · ソレンス (Arthrobacter mvsorens)、 ~~ スロバクタ一 .ニコチアナ (Arthrobacter nicotianae)、アースロバクタ一 ·ノ ラフイネウス (Arthrobacter paraffineus)、アースロノくクタ一 ·プロトフオノレミエ (Arthrobacter protophormiaeゝ ~~スロノヽグタ1 ~~ ·ロセオノヽフフイナス (Arthrobacter roseoparaffinus )、アースロバクタ^ ~ ·スノレフレウス (Arthrobacter sullureus)、アースロバクタ^ ~ ·ゥレア ファシェン (Arthrobacter ureafaciens)、クロマテゥム 'ブテリ (Chromatium buderi)、ク ロマチウム ·テピダム (Chromatium tepidum)、クロマチゥム ·ビノサム (Chromatium vinosum)、クロマチゥム ·ヮーミンギ (Chromatium warmineii)、クロマチゥム ·フノレビア タティレ (Chromatium fluviatile)、エノレビニァ ·ウレドノくラ (Erwinia uredovora)、エノレビ 二了 '力ロトノ ラ (Erwinia carotovora)、エノレビニァ ·ァナス (Erwinia ananas)、エノレビ- ァ .ヘリコラ (Erwinia herbicola)、エノレビニァ ·ノ ンクタタ (Erwinia punctata)、エノレビ- ァ ·テレウス (Erwinia terreus)、メチロバクテリウム ·口デシァナム (Methvlobacterium rhodesianum;、メテロノ クテリゥム ·ェクソトノレクエンス (Methvlobacterium extorquens; 、フオルミディウム ·エスピー（Phormidiumsp.) ATCC29409,ロドパクタ^ ~ ·カプスラタ ス (Rhodobacter capsulatus)、ロトノ クタ1 ~~ 'スフエロィァス (Rnodobacter sphaeroiaes )、ロドシユードモナス'ブラスチカ (Rhodopseudomonas blastica)、ロドシユードモナス' マリナ (Rnodopseudomonas marina;、口 ンュ ~~ドモナス ·ノヽノレストリス (
Rhodopseudomonas palustns)、ロトスピリゥム ·リブフム (Rhodospirillumruprum)、ロト スピリゥム ·サレキシゲンス (Rhodospirillum salexigens)、ロドスピリゥム ·サリナラム ( Rhodospirillum salinarum)、ストレプトマイセス ·アンボファシエンス (Streptomvces ambofaciens)、ストレプトマ セス'才ーレ才ファシエンス (Streptomvces aureofaciens) 、ストレプトマイセス 'ァウレウス（StreQtomyces aureus)、ストレプトマイセス 'フンジシ ディ力 (Streptomvces lungicidicus)、ストレプトマイセス 'グリセォクロモゲナス（ Streptomvces gnseochromogenes)、ストレプトマイセス.グリセウス (
Streptomvcesgnseus)、ストレフ。トマイセス-リヒタンス (Streptomvces lividans,ストレフ トマイセス ·オリボグリセウス (Streptomvces olivogriseus)、ストレプトマイセス ·ラメウス（ Streptomvces rameus)、ストレプトマイセス ·タ丁、ノエン、ノス (Streptomvces
tanashiensis)、ストレフ。トマィセス ·ビナセウス（Streptomvces vinaceus)、サイモモナス •モビリス（Zvmomonas mobilis)等をあげることができ、好ましくはェシエリヒア属、バチ ルス属、ストレプトマオセス属またはコリネバタテリゥム属に属する微生物をあげること ができる。
[0053] 組換え体 DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394)、エレクト口 ポレーシヨン法 [NucleicAcids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEpl3 ( ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等を用 いることがでさる。
[0054] プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプ 口モーター、 gal iプロモーター、 gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモ 一ター、 MF a 1プロモーター、 CUP1プロモーター等のプロモーターをあげることがで きる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Saccharomvces)属、シゾサッカロマイセス（ Schizosaccharomvces)属、クルィベロマイセス (Kluweromvces) f禺、トリコス ロン Trichosporon)属、シヮニォマイミセス（Schwanniomvces)属、ピチア（Pichia)属、また はキャンディダ (Candida)属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、 サッカロマイセス ·セレビシェ (Saccharomvces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス ·ポン へ (achizosaccharomvces pombe)、クノレイへロマィセス ·フク" イス (Kluweromvces lactis)、トリコスポロン'プルランス（Trichosporon Dullulans)、シヮ-ォマイセス 'アルビ ウス (Schwanniomvces alluvius)、ピチア ·ノストリス (Pichia pastoris)、キャンディダ ·ゥ ティリス (Candida utilis)等をあげることができる。
[0055] 組換え体 DNAの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であればいずれ も用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods EnzymoL, 194, 182 (1990)]、スフエロプラスト法 [Proc. Natl.Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)]、酢酸リチ ゥム法 [J.Bacteriol., 153, 163 (1983)]等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAU pcDM8 (フナコシ社より巿販）、 pAGE107 (特開平 3-22979)、 pAS3-3 (特開平
2-227075) , pCDM8[Nature,329, 840 (1987)]、 pcDNAI/Amp (インビトロジェン社製） 、 pREP4 (インビトロジェン社製）、 pAGE103[J.Biochem, 101, 1307 (1987)]、 pAGE210 、 pAMo、 pAMoA等を用いることができる。
[0056] プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモータ 一、 SV40の初期プロモーターあるいはメタ口チォネインのプロモーター、レトロウイノレ スのプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等をあげることがで きる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
[0057] 宿主細胞としては、マウス'ミエローマ細胞、ラット 'ミエローマ細胞、マウス'ハイブリ ドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞またはナマルバ KJM-1細胞、 ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ 'ハム スターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63-299)等をあげることができる。 マウス ·ミエローマ細胞としては、 SP2/0、 NSO等、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293(ATCC CRL-1573)、ヒト白血病細胞とし ては BALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としては COS-l、 COS-7等をあげることが できる。
[0058] 組換え体 DNAの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、リン酸カルシウム法（特開平 2-227075)、リポフエクシヨン法 [Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]、 Virology, 52,456 (1973)に記載の方法等をあげること ができる。
[0059] 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freemanand Company, New York (1992)、カレント-プロト コーノレズ 'イン'モレキュラー'ノ ィォロジ一、 MolecularBiology, A Laboratory Manual 、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を生産すること ができる。
[0060] 即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して 昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに組換えウィルスを昆虫細胞 に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (V、ずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。
[0061] バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトグ ラファ 'カリフオノレニ力 .ヌクレア一 .ポリへドロシス .ウィルス (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用 ヽることがでさ o。
昆虫細胞としては、スポドプテラ ·フルギベルダ (Spodoptera frueiperda)の卵巣細胞
、トリコプルシア，二 (TrichoDlusia ni)の卵巢細朐、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用 いることがでさる。
[0062] スポドプテラ ·フルギベルダの卵巣細胞としては S19、 S1 1 (バキュロウィルス'イクスプ レツシヨン'ベクターズァ 'ラボラトリー 'マ-ユアル)等、トリコプルシア '二の卵巣細胞 としては High5、 ΒΤΙ-ΤΝ-5Β1-4 (インビトロジェン社製)等、カイコ卵巣由来の培養細 胞としてはボンビクス'モリ (Bombvx mori) N4等をあげることができる。
組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクター と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法 (特開平 2- 227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]等をあ げることができる。
[0063] 植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 Tiプラス ミド、タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV)の 35Sプロモーター、ィネアクチ ン 1プロモーター等をあげることができる。
[0064] 宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファ ルファ、イネ、コムギ、ォォムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、ァグロパクテリゥム (Agrobacterium)を用いる方法 ( 特開昭 59-140885、特開昭 60-70080、 WO94/00977)、エレクト口ポレーシヨン法（特 開昭 60-251887)、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法 (特許第 2606856、特 許第 2517813)等をあげることができる。
[0065] 酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは 糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白 質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することがで きる。
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、 動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、より 好ましくはェシエリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはェシエリヒア 'コリに属する 微生物をあげることができる。
[0066] 上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法 に従って行うことができる。
ェシエリヒア'コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形 質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類 等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培 地の!/、ずれを用いてもよ！、。
[0067] 炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース、 スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水 化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類 等を用いることができる。 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化 物等を用いることができる。
[0068] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養 温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pHは 3.0〜 9.0に保持する。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カル シゥム、アンモニア等を用いて行う。
[0069] また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添カロしてちょい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、 k£プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはイソプロピル一 β —D—チォガラタトピラノシド等を、 imプロモーターを用いた発 現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地 に添カ卩してもよい。
[0070] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI1640培地 [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]、イーグル（Eagle)の MEM培地 [Science,^, 501 (1952)]、 DMEM培地 [Virology, 8, 396 (1959)]、 199培地 [Proc. Soc.Biol. Med., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添カ卩した培 地等を用いることができる。
[0071] 培養は、通常 pH6〜8、 25〜40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。
2
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生 物質を培地に添加してもよい。 昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている TNM- FH培地 (ファーミンジェン社製)、 Sf-900 II SFM培地（ライフ'テクノロジ ーズ社製）、 ExCell400、 ExCell405 [いずれも JRHバイオサイエンシーズ社製]、 Grace'slnsect Medium[Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。
[0072] 培養は、通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で 1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい 植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器 官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般 に使用されているムラシゲ'アンド'スターグ (MS)培地、ホワイト (White)培地、またはこ れら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添カ卩した培地等を用いるこ とがでさる。
[0073] 培養は、通常 pH5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地 に添カ卩してもよい。
上記のとおり、本発明の DNAまたは本発明の製造法に用いられる DNAを発現べ クタ一に連結した組換え体 DNAを保有する微生物、昆虫細胞、動物細胞、あるいは 植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明の蛋白質 を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造する ことができる。
[0074] 本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外 に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方 法に応じて、使用する宿主細胞を選択し、生産させる蛋白質の構造を変更すればよ い。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポー ルソンらの方法 [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)]、ロウらの方法 [Proc. Natl.
Acad.Sci., USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)]、または特開平 05-336963、 WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細 胞外に積極的に分泌させることができる。
[0075] すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋 白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿 主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
[0076] さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分ィ匕させることにより、遺伝子 が導入された動物個体 (トランスジエニック非ヒト動物)または植物個体 (トランスジェ- ック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。 本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通 常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体また は植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
[0077] 動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法
[Am. J. Clin. Nutr. , 63, 639S (1996)、 Am. J. Clin. Nutr., 63.627S (1996)、
Bio/Technology, 9, 830 (1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明 の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明の DNAまたは本発明の製造法に用いられる DNAを導入したトランスジエニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中 に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造す ることができる。該動物中の生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク（ 特開昭 63-309192)、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとし ては、動物で機能するものであればいずれも用いることができる力 例えば、乳腺細 胞特異的なプロモーターである aカゼインプロモーター、 13カゼインプロモーター、 βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用い られる。
[0078] 植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白 質をコードする DNAを導入したトランスジエニック植物を公知の方法 [組織培養，^ (1994)、組織培養， 21 (1995)、 Trends BiotechnoL, 15,45 (1997)]に準じて栽培し、該 蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、 該蛋白質を生産する方法があげられる。
[0079] 本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単 離'精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了 後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレン チプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞 抽出液を得る。
[0080] 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精 製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジ ェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION HPA-75 (三菱化成社製)等レジ ンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S- SepharoseFF (フアルマシア社製)等 のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ-ルセ ファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過 法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動 等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることが できる。
[0081] また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回 収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋 白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まな ヽあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質 が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構 造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
[0082] 本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には 、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。 即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性 画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精 製標品を得ることができる。 [0083] このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号 1または 2で表されるアミ ノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白 質に親和性をもつ物質を用いたァフィユティークロマトグラフィーを利用して精製する ことちでさる。
[0084] 融合させる蛋白質としては、 j8 -ガラタトシダーゼ、プロテイン A、プロテイン Aの IgG 結合領域、クロラムフエ-コール'ァセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Arg)、ポリ（Glu) 、プロテイン G、マルトース結合タンパク質、グルタチオン S-トランスフェラーゼ、ポリヒ スチジン鎖（His-tag)、 Sペプチド、 DNA結合タンパク質ドメイン、 Tac抗原、チォレド キシン、グリーン 'フルォレツセント'プロテイン、 FLAGペプチド、および任意の抗体 のェピトープなどがあげられる〔山川彰夫，実験医学， 13,469-474 (1995)〕。
[0085] 上記した融合させる蛋白質に親和性をもつ物質としては、 β -ガラタトシダーゼ、プ 口ティン Α、プロテイン Αのィムノグロブリン G結合領域、クロラムフエ-コール'ァセチ ルトランスフェラーゼ、ポリ（Arg)、ポリ（Glu)、プロテイン G、マルトース結合タンパク 質、グルタチオン S-トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（His-tag)、 Sペプチド、 DN A結合タンパク質ドメイン、 Tac抗原、チォレドキシン、グリーン 'フルォレツセント'プロ ティン、 FLAGペプチドまたは任意の抗体のェピトープを認識する抗体、例えばィム ノグロブリン Gなどをあげることができる。
[0086] また、上記で取得された蛋白質のアミノ酸情報を基に、 Fmoc法 (フルォレニルメチ ルォキシカルボ-ル法）、 tBoc法（t ブチルォキシカルボ-ル法）等の化学合成法 により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、 Advanced ChemTech社、ノ ~" ン，ェルマ^ ~"社、 Pharmacia社、 Protein Technologylnstrument社、
SyntheceU-Vega社、 PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学 合成することちできる。
(iii)本発明のジペプチドの製造法
(1)酵素的製造法
ジペプチドの酵素的製造法としては、本発明の蛋白質またはジペプチド合成用蛋 白質、 1種以上のアミノ酸、および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（ I)で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する方法 をあげることができる。
[0087] 上記製造法において、基質に用いられる 1種以上のアミノ酸、好ましくは 1または 2 種のアミノ酸としては、 L体または D体のアミノ酸、グリシン（Gly)、 β—ァラニン（ Ala )およびそれらの誘導体力 選ばれるアミノ酸、好ましくは L—アミノ酸、 Glyおよび |8 Ala並びにそれらの誘導体力もなる群より選ばれるアミノ酸をあげることができ、該アミ ノ酸であれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。 L体または D体のアミノ酸としては、例えばァラニン (Ala)、グルタミン (Gin)、グルタミン酸 (Glu)、 ノ リン（Val)、ロイシン（Leu)、イソロイシン（lie)、プロリン（Pro)、フエ-ルァラニン（Phe )、トリプトファン（Trp)、メチォニン（Met)、セリン（Ser)、スレオニン（Thr)、システィン（ Cys)、ァスパラギン (Asn)、チロシン（Tyr)、リジン（Lys)、アルギニン (Arg)、ヒスチジ ン（His)、ァスパラギン酸 (Asp)、 a -ァミノ酪酸（ α - ΑΒ)、ァザセリン (Azaserine)、テ ァ-ン（theanine)、 4—ヒドロキシプロリン（4— HYP)、 3—ヒドロキシプロリン（3— HYP)、ォ ル-チン（Orn)、シトルリン（Cit)および 6-ジァゾ -5-ォキソノルロイシン（
6- diazo- 5- OXO- norleucine)などをあげることができ、 L体のアミノ酸としては、 L- Ala、 L-Gln, L-Glu, Glyゝ L- Val、 L- Leuゝ L- Ile、 L- Pro、 L- Pheゝ L- Trpゝ L- Metゝ L- Serゝ L- Thr、 L- Cys、 L- Asn、 L- Tyr、 L- Lys、 L- Arg、 L- His、 L- Asp、 L- a - AB、
L— Azaserineゝ L— theanineゝ L— 4— HYP、 L— 3— HYP、 L— Orn、 L— Citおよび
L— 6— diazo— 5— oxo— norleucineなどをあげることができる。
[0088] アミノ酸の誘導体としては、例えばヒドロキシアミノ酸（ j8—ヒドロキシグルタミン、 β
—ヒドロキシグルタミン酸、 γ—ヒドロキシグルタミン酸、 (X—ヒドロキシグリシン、 J3—ヒ ドロキシバリン、 Ίーヒドロキシバリン、 13ーヒドロキシロイシン、 γ—ヒドロキシロイシン 、 δーヒドロキシロイシン、 13ーヒドロキシイソロイシン、 γ—ヒドロキシイソロイシン、 3 ーヒドロキシプロリン、 4ーヒドロキシプロリン、 13ーヒドロキシフエ二ルァラニン、 3,4—ジ ヒドロキシフエ二ルァラニン、 2,4,5—トリヒドロキシフエ二ルァラニン、 13—ヒドロキシトリ プトファン、 5—ヒドロキシトリプトファン、 α—ヒドロキシメチォニン、 j8—ヒドロキシセリ ン、 γ—ヒドロキシスレオニン、 S—ヒドロキシシスティン、 13ーヒドロキシァスパラギン、 βーヒドロキシチ口シン、 βーヒドロキシリジン、 γ—ヒドロキシリジン、 δーヒドロキシリ ジン、 N ヒドロキシリジン、 βーヒドロキシアルギニン、 δーヒドロキシアルギニン、 Ν ーヒドロキシアルギニン、 13ーヒドロキシヒスチジン、 13ーヒドロキシァスパラギン酸、 13 ーヒドロキシオル二チン、 γ—ヒドロキシオル二チン、 Ν ヒドロキシオル二チン）、 Ν— メチルアミノ酸（Ν—メチルーァラニン、 Ν—メチルーグルタミン、 Ν—メチルーグルタミ ン酸、 Ν—メチルーグリシン、 Ν—メチルーノ リン、 Ν—メチルーロイシン、 Ν—メチル イソロイシン、 Ν—メチループ口リン、 Ν—メチルーフエ二ルァラニン、 Ν—メチルー トリプトファン、 Ν—メチル一メチォニン、 Ν—メチル一セリン、 Ν—メチル一スレオニン 、 Ν—メチノレ一システィン、 Ν—メチノレーアスパラギン、 Ν—メチノレ一チロシン、 Ν—メ チルーリジン、 Ν—メチルーアルギニン、 Ν—メチルーヒスチジン、 Ν—メチルーァス パラギン酸、 Ν—メチル一オル-チン)などをあげることができる。
[0089] 上記製造法に用いられる、より好ましい 1または 2種のアミノ酸としては、 L-Ala、 L-Leuおよび L-Pheから選ばれる 1または 2種のアミノ酸、さらに好ましくは、 L-Ala、 L-Leuおよび L-Pheから選ばれる 1種のアミノ酸、または L-Leuと L-Pheとからなる 2種 のアミノ酸をあげることができる。
上記製造法において、本発明の蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質は、基質と して用いるアミノ酸 lmgあたり 0.01〜100mg、好ましくは 0.1mg〜10mg添カ卩する。
[0090] 上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、全量として 0.1〜500g/L、好ま しくは 0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加す る。
上記製造法において、エネルギー源として用いる ATPは、 0.5mmol/L〜10mol/Lの 濃度で用いる。
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しな ヽ 限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよぐ例えば、水、りん酸塩、炭酸塩 、酢酸塩、ほう酸塩、クェン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、 メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸ェチルなどのエステル類、アセトン などのケトン類、ァセトアミドなどのアミド類を含有して 、てもよ!/、。
[0091] ジペプチドの生成反応は水性媒体中、 pH5〜ll、好ましくは pH6〜10、 20〜50°C、 好ましくは 25〜45°Cの条件で 2〜150時間、好ましくは 6〜120時間行う。 上記方法で製造されるジペプチドとしては、式 (I)で表されるジペプチドをあげるこ とができ、好ましくは、式 (I)において R1および R2が同時にまたは異なって、 L体もしく は D体のアミノ酸、グリシン、 βーァラニンまたはそれらの誘導体であるジペプチド、よ り好ましくは L体のアミノ酸、グリシン、 /3ーァラニンまたはそれらの誘導体であるジぺ プチドをあげることができる。
[0092] L体のアミノ酸およびアミノ酸の誘導体としては、上記した物質をあげることができる 上記方法で製造される、さらに好ましいジペプチドとしては、 L一口イシルー L フエ -ルァラニン、 L フエ-ルァラ -ル一 L ロイシン、 L ァラ-ルー L ァラニン、 L 口イシノレ L ロイシンおよび L フエニノレアラニノレ L フエニノレアラニンなどを あげることができる。
(2)形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用い る製造法
形質転換体または微生物の培養物または培養物の処理物を酵素源として用いるジ ペプチドの製造法としては、本発明の蛋白質もしくはジペプチド合成用蛋白質を生 産する能力を有する形質転換体、または本発明の蛋白質もしくはジペプチド合成用 蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源 に用い、該酵素源、および 1種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体 中に式 (I)で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体力 該ジペプチドを採取 する該ジペプチドの製造法をあげることができる。
[0093] 上記製造法に用いられる形質転換体としては、上記 (ii)の方法により製造すること ができる、本発明の蛋白質もしくはジペプチド合成用蛋白質を生産する形質転換体 をあげることができる。該形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫 細胞等、植物細胞等をあげることができ、好ましく細菌、より好ましくはェシエリヒア属 、バチルス属、ストレブトマイセス属またはコリネバタテリゥム属に属する微生物をあげ ることがでさる。
[0094] ェシエリヒア属に属する微生物としては、好ましくはェシエリヒア'コリに属する微生物 等をあげることができ、バチルス属に属する微生物としては好ましくはバチルス ·サチ リスまたはバチルス 'メガテリゥム等に属する微生物をあげることができ、ストレプトマイ セス属に属する微生物としては、好ましくはストレブトマイセス 'リビダンスをあげること ができ、コリネバタテリゥム属に属する微生物としては好ましくはコリネバクテリウム-グ ルタミカムまたはコリネバタテリゥム 'アンモニアゲネス等に属する微生物をあげること ができる。
[0095] 上記製造法に用いられる微生物は、本発明の蛋白質もしくはジペプチド合成用蛋 白質を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物であってもよぐ好ま しくはストレブトマイセス属に属する微生物、より好ましくはアルボノルシン合成活性を 有するストレプトマイセス属に属する微生物、さらに好ましくはストレプトマイセス ·アル ボラスまたはストレブトマイセス ·ノウルセィより選ばれる種に属する微生物、最も好ま しくは、ストレプトマイセス 'アルボラス IFO 14147株、ストレプトマイセス 'ノウルセィ ATCC 11455株または IF015452株をあげることができる。
[0096] 培養物の処理物としては、培養物と同じ活性を維持している限り、公知のいかなる 処理を施された培養物の処理物であってもよぐ該処理物としては、例えば培養物の 濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、 該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体 の酵素処理物および該菌体の固定ィ匕物等の生細胞力 なる処理物、該菌体の超音 波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の蛋白質分画物および該菌体より 抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
[0097] 上記製造法において、基質として用いるアミノ酸の種類、使用濃度および添加時期 、並びに生産されるジペプチドは、上記 (iii)の（1)の酵素的製造法のものと同様であ る。
また、微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源とした製造法にお!、て用 、られる水性媒体としては、上記 (m)の（1)の酵素的製造法に用いられる水性媒体 に加え、酵素源として用いた形質転換体または微生物の培養液も水性媒体として用 いることがでさる。
[0098] また上記製造法にお!、ては、必要に応じて、 ATPの供給源として、 ATPまたは形 質転換体もしくは微生物が代謝して ATPを生産し得る化合物、例えばグルコースの ような糖類、エタノールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを水性媒体 中に加えることができる。
さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよ い。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン'ォクタデシルァミン (例えばナイミーン
S-215、日本油脂社製)などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモ-ゥム' ブロマイドやアルキルジメチル.ベンジルアンモ -ゥムクロライド（例えばカチオン
F2-40E,日本油脂社製)などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル'ザルコシネート などのァ-オン系界面活性剤、アルキルジメチルァミン (例えば三級アミン FB、 日本 油脂社製)などの三級アミン類など、ジペプチドの生成を促進するものであれば ヽず れでもよく、 1種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常 0.1 〜50g/lの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコ ール、アセトン、酢酸ェチルなどがあげられ、通常 0.1〜50 ml/1の濃度で用いられる。
[0099] 培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は、当 該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸 lmgあたり湿 菌体重量として 5〜1000mg、好ましくは 10〜400mg添カ卩する。
ジペプチドの生成反応は水性媒体中、 pH5〜ll、好ましくは pH6〜10、 20〜65°C、 好ましくは 25〜55°C、より好ましくは 30〜45°Cの条件で通常 1分間〜 150時間、好まし くは 3分間〜 120時間、より好ましくは 30分間〜 100時間行う。
[0100] 上記 (iii)の（1)または（2)の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジぺプ チドの採取は、活性炭やイオン交換榭脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶 媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により 行うことができる。
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例 1
[oioi] dh£遺伝子およびその類縁遺伝子の取得
ストレプトマイセス 'ノウルセィの albC遺伝子の塩基配列 [Chemistry & Biol., 9, 1355(2002)]に基づき、ストレプトマイセス 'ノウルセィおよびストレプトマイセス.アルボ ラスより albC遺伝子およびその類縁遺伝子を、以下の方法で取得した。 まず、ストレプトマイセス ·ノウルセィ IFO 15452株とストレプトマイセス ·アルボラス IF014147株を、それぞれ、 1%グリシン添カ卩した KM73培地 [2g/lイーストエキス（ディフ コ社製)、 10g 可溶性デンプン (和光純薬工業社製)]、 KP培地 [15g/lグルコース、 lOg/1グリセロール、 lOg/1ポリペプトン（日本製薬株式会社製)、 lOg/1肉エキス (極東 製薬工業株式会社製)、 4g/l炭酸カルシウム]に植菌し 28°Cで一晩振とう培養した。な お、ストレプトマイセス ·ノウルセィ IF015452株およびストレプトマイセス ·アルボラス IF014147株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 生物資源部門 [National Institute of Technology andEvaluation (NITti, Biological Resource Center (BRし) ] 〒292-0818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8)より分譲を受けた。
[0102] 培養後、 Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manuahjohn
InnesFoundationに記載の方法に従って該微生物の染色体 DNAを単離精製した。 albC遺伝子の塩基配列に基づき、パーセプティブ ·バイオシステムズ (Perseptive Biosystems)社製 8905型 DNA合成機を用いて、配列番号 5および 6で表される塩基 配列を有する DNA (以下、それぞれプライマー A、プライマー Bと呼ぶ）を合成した。 プライマー Aは、ストレプトマイセス 'ノウルセィの染色体 DNAの albC遺伝子の開始コ ドンを含む領域の 5'末端に tol認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プ ライマー Bは、 albC遺伝子の終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の 5'末端に Π認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
[0103] 上記のプライマー Aおよびプライマー Bをプライマーセットに、铸型としてストトレプト マイセス ·ノウルセィまたはストレプトマイセス ·アルボラスの染色体 DN Aを用いて PC Rを行った。 PCRは、铸型として 0.1 μ gの染色体 DNA、 0.5 μ mol/Lの各プライマー、 2.5 unitsの Tafl DNAポリメラーゼ (タカラバイオ社製)、 5 μ Lの E [I DNAポリメラー ゼ用 X 10緩衝液 (タカラバイオ社製)、各 200 μ mol/Lの dNTP(dATP、 dGTP、 dCTPお よび dTTP)、 5 μ Lのジメチルスルホキシドを含む反応液 50 μ Lを調製し、 94°Cで 1分 間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 1分間の工程を 30回繰り返すことにより行った。
[0104] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、約 0.7kbの DNA断片が増幅して いることを確認した後、残りの反応液と等量の TE[10mmol/L Tris- HCl(pH8.0)、 1 mmol/L EDTA]飽和フエノール/クロ口ホルム（lvol/lvol)溶液を添カ卩し、混合した。 該溶液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して DNAを沈殿させた後、該 DNAを それぞれ 20 μ Lの ΤΕに溶解した。
[0105] 該溶解液それぞれ 5 μ Lを用い、増幅した DNAを制限酵素 および Πで切断 し、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離した後、ジーンクリーン IIキット（ GENECLEANII kit, BIO 101社製）を用いて、 700bpの DNA断片をそれぞれ回収し た。
ファージ T5プロモーターを含む発現ベクター pQE60 (キアゲン社製） 0.2 μ gを制限 酵素 21および ΜΠで切断後、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、 上記と同様の方法により 3.4kbの DNA断片を回収した。
[0106] 上記で得られた各放線菌由来の 0.7kb断片および pQE60由来の 3.4kbの断片をライ ゲーシヨンキット（タカラバイオ社製)を用いて、 16°Cで 16時間反応させ連結した。 該反応液を用いてェシエリヒア'コリ NM522株 (ストラタジーン社製）を、カルシウムィ オンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]によって形質転換 し、該形質転換体を 50 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地 [10g バクトトリプトン (ディフコ社製)、 5g/lイーストエキス (ディフコ社製)、 5g/l塩ィ匕ナトリウム、寒天 20g/l ]に塗布した後、 30°Cで一晩培養した。
[0107] 生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制 限酵素を用いてその構造を解析することにより、ファージ T5プロモーター下流にスト レプトマイセス ·ノウルセィ由来の DNAが連結された発現ベクターである pAL- nou、 およびストレプトマイセス ·アルブラス由来の DNAが連結された発現ベクターである pAL-albが取得されて!、ることを確認した（図 1)。
[0108] それぞれのプラスミドに挿入された放線菌由来の DNA部分の塩基配列を塩基配 列決定装置 373A.DNAシークェンサ一を使って決定したところ、 pAL_albには配列番 号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA、すなわち配列番号 3 で表される塩基配列を有する DNAが含有され、 pAL-nouには配列番号 2で表される アミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA、すなわち配列番号 4で表される塩基 配列を有する DNAが含有されていることを確認した。 実施例 2
[0109] 菌体を酵素源に用いたジペプチドの製造
実施例 1で得られた pAL- nouまたは pAL- albを保有するェシエリヒア'コリ NM522 (ェ シエリヒア'コリ NM522/pAL- nou株または NM522/pAL- alb株）およびプラスミドを保有 しない NM522株を 50 μ g/mlのアンピシリンを含む 10mlの LB培地 [10g バクトトリプトン (ディフコ社製)、 5g/lイーストエキス (ディフコ社製)、 5g/l塩ィ匕ナトリウム]が入った試 験管 (プラスミドを持たない株の場合にはアンピシリンは無添加、以下同様）に接種し 、 30°Cで 17時間培養した。この培養液 0.5mlを 50mlの LB培地が入った 250ml容の三 角フラスコにそれぞれ植菌し、 30°Cで 1時間振とう培養した後、イソプロピル— β— D —チォガラクトピラノシド (IPTG)を終濃度 lmmol/1になるように添加し、さらに 4時間培 養を継続した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
[0110] 終濃度 100mg/mlの該湿菌体、 60mmol/Lのリン酸カリウムバッファー（pH7.2)、
10mmol/Lの塩化マグネシウム、 10mmol/Lの ATP、 lg/Lの L- Leu、 lg/Lの L- Pheから なる 3.0mlの反応液を調製し、 30°Cで反応を行った。反応 1時間後にサンプリングし、 ァセトニトリルを 20%(v/v)になるようにカ卩えた後、反応生成物を以下の HPLC分析によ り分析した。
分離カラム: ODS-HAカラム (YMC社製）
溶離液: 30%(v/v)ァセトニトリル
流動速度: 0.6ml/ min
検出：紫外吸収 215nm
その結果、ェシエリヒア'コリ NM522/pAL- nuo株の反応液中には 36.7mg/lの cyclo(L-Leu-L-Phe)の蓄積が確認された力 エシ リヒア 'コリ NM522株の反応液中 には cyclo(L-Leu-L-Phe)はまったく検出されなカゝった。同じ反応液を以下の条件で HPLCによって分析し、直鎖状のジペプチドである L -ロイシル -L-フエ-ルァラ- ン (L- Leu- L- Phe)および L—フエ-ルァラ-ル— L—ロイシン (L- Phe- L- Leu)を測定し た。
[0111] 直鎖状のジペプチドは F-mocィ匕法で誘導体ィ匕した後に HPLC分析により分析した。
分離カラム:野村化学社製の ODS- HG- 5カラム 溶離液：
A液- 6ml/L酢酸、 20%(v/v)ァセトニ
B液- 6ml/L酢酸、 70% (v/v)ァセトニ
流動速度: 0.6ml/min
検出：励起波長 254nm、蛍光波長 630nm
溶離液混合比:表 1のとおり
[表 1]
Figure imgf000037_0001
その結果、ェシエリヒア'コリ NM522/pAL- nuo株の反応液中には 21.9mg/lの L- Leu-L-Pheと 12.0mg/lの L-Phe-L-Leuが蓄積して!/、ることが確認された。また対照 株として用いたェシエリヒア 'コリ NM522株の反応液中には!/、ずれの直鎖ジペプチドも 検出されなかった。このことから、本発明で取得されたシクロジペプチド合成酵素は 直鎖状のジペプチドを合成する能力をもつことが明らかになった。
実施例 3
精製酵素を用いたジペプチドの製造（1)
実施例 2と同様にェシエリヒア'コリ NM522/pAL- nuo株を培養した。培養終了後、遠 心分離によって湿菌体を取得し、 60mmol/lのリン酸カリウムバッファー（pH7.2)で洗 浄後、 10mmol/lイミダゾール含有 20mmol/lリン酸カリウムバッファーに懸濁した。この 懸濁を 4°Cで超音波処理して菌体破砕液を取得した。この菌体破砕液 (10ml、蛋白質 0.863mgを含む)をアマシャム社製 Hisタグ精製カラムに通塔し、 10mmol/lイミダゾール 含有 20mmol/lリン酸カリウムバッファー 15mlを通塔することによる洗浄を行 、、 Hisタグ つき albC蛋白質をカラム内にて精製した。次にこの Hisタグ付きの albC蛋白質を保持 するカラムに、実施例 2と同組成の反応液 (反応液組成： 60mmol/Lのリン酸カリウムバ ッファー（pH7.2)、 10mmol/Lの塩化マグネシウム、 10mmol/Lの ATP、 lg/Lの L- Leu、 lg/Lの L-Pheからなる反応液) 2mlを通塔し、カラム内に基質を保持した状態で、 30°C にて、インキュベートした。 24時間後、同組成の反応液 3mlでカラム内の反応液を溶 出し、実施例 2と同様の方法により反応液中のシクロジペプチドおよびジペプチドを 里しァこ。
[0114] その結果、 cyclo(L-Leu-L-Phe) 6.8mg/L、 L— Leu— L— Phe 28.7mg/Lおよび
L- Phe-L-Leul8.5mg/Lが生成して!/、ることが分かった。 ATPを含まな!/、反応液で同 様にインキュベートした場合は、シクロジペプチド、ジペプチドともに検出されなかつ た。
実施例 4
[0115] 精製酵素を用いたジペプチドの製造 (2)
基質のアミノ酸を他のアミノ酸に換える以外は実施例 3と同様の方法で酵素反応を 行い、生成物を分析した。反応液は、基質のアミノ酸を、 lg /Lの L-Ala、 L-Leuまた は L-Pheに置き換えた以外は実施例 2と同じ組成の溶液を用いた。
その結果、反応開始後 24時間で、それぞれ 9.41 mg/Lの L-Ala-L-Ala、 7.85mg/L の L- Leu- L- Leu、または 5.20mg/Lの L- Phe- L- Pheが生成していることが分かった。 配列表フリーテキスト
[0116] 配列番号 5—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 6—人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲 [1] 以下の [1]〜 [3]のいずれかに記載の蛋白質 (ただし、配列番号 1で表されるァミノ 酸配列からなる蛋白質を除く)。 [ 1 ]配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質 [2]配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換または付加したアミノ酸配列力もなり、かつ式 (I) R1 - R2 (I) (式中、 R1および R2は、同一または異なってアミノ酸を表す)で表されるジペプチドの 合成活性を有する蛋白質 [3]配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、かつ式 (I)で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質 [2] 以下の [ 1 ]〜 [3]の 、ずれかに記載のジペプチド合成用蛋白質。 [ 1 ]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するジペプチド合成用蛋白質 [2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加したアミノ酸配列からなり、かつ式 (I) R1 - R2 (I) (式中、 R1および R2は、同一または異なってアミノ酸を表す） で表されるジペプチドの合成活性を有するジペプチド合成用蛋白質 [3]配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ式 (I)で表されるジペプチドの合成活性を有するジペプチド合成用蛋白 質 [3] 以下の [1]〜[3]のいずれかに記載の DNA (ただし、配列番号 3で表される塩基配 列からなる DNAを除く）。
[1]請求項 1記載の蛋白質をコードする DNA
[2]配列番号 4で表される塩基配列を有する DNA
[3]配列番号 4で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ式 (I)
R1 - R2 (I) (式中、 R1および R2は、同一または異なってアミノ酸を表す)で表されるジペプチド合 成活性を有する蛋白質をコードする DNA
[4] 請求項 3記載の DNAを含有する組換え体 DNA。
[5] 請求項 4記載の組換え体 DNAを有する形質転換体。
[6] 形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である請求項 5記載の形質 転換体。
[7] 微生物が、エシ リヒア (Escherichia)属に属する微生物である請求項 6記載の形質 転換体。
[8] 請求項 5〜7のいずれか 1項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求 項 1記載の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項 1記 載の蛋白質の製造法。
[9] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中 に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項 1記載の蛋 白質の製造法。
[10] 微生物がストレプトマイセス (StreDtomvces)属に属する微牛.物である請求項 9記載の 製造法。
[11] ストレプトマイセス属に属する微生物力 アルボノルシンを生産する能力を有するスト レプトミセス属に属する微生物である請求項 10記載の製造法。
[12] アルボノルシンを生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生物力 スト レプトマイセス ·ァノレボラス (Streptomvces alborus)またはストレプトマイセス ·ノウノレセ ィ (Streptomvces noursei)である請求項 11記載の製造法。
[13] 請求項 1記載の蛋白質または請求項 2記載のジペプチド合成用蛋白質、 1種以上の アミノ酸、および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式 (I)
R1 - R2 (I)
(式中、 R1および R2は、同一または異なってアミノ酸を表す)で表されるジペプチドを 生成、蓄積させ、該媒体力 該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
[14] 以下の [1]〜[3]から選ばれる培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該 酵素源、 1種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式 (I) R1 - R2 (I)
(式中、 R1および R2は、同一または異なってアミノ酸を表す)で表される直鎖ジぺプチ ドを生成、蓄積させ、該媒体力 該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
[1]請求項 5〜7のいずれか 1項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処 理物
[2]請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養 物の処理物
[3]請求項 2記載のジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養 物または該培養物の処理物
[15] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が、ストレブトマイセス属に属 する微生物である請求項 14記載の製造法。
[16] 請求項 2記載のジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物が、ストレ プトマイセス属に属する微生物である請求項 14記載の製造法。
[17] ストレプトマイセス属に属する微生物力 アルボノルシンを生産する能力を有するスト レブトマイセス属に属する微生物である請求項 15または 16記載の製造法。
[18] アルボノルシンを生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生物力 スト レプトマイセス ·ァノレボラス (Streptomvces alborus)またはストレプトマイセス ·ノウノレセ ィ（StreDtomvces noursei)に属する微生物である請求項 17記載の製造法。
[19] 請求項 2記載のジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物が、請求 項 2記載のジペプチド合成用蛋白質をコードする DNAで形質転換された微生物で ある請求項 14記載の製造法。
[20] 請求項 2記載のジペプチド合成用蛋白質をコードする DNAで形質転換された微生 物力 エシ リヒア属に属する微生物である請求項 19記載の製造法。
[21] 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得 られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物
、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該 菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体よ り抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、請求項 14〜20のいずれ力 1項 に記載の製造法。
[22] 1種以上のアミノ酸力 L体もしくは D体のアミノ酸、グリシン、 |8—ァラニンまたはそれ らの誘導体である請求項 13〜21のいずれ力 1項に記載の製造法。
[23] ジペプチドが式 (II)
R3 - R4 (II)
(式中、 R3および R4は同一または異なって、 L体もしくは D体のアミノ酸、グリシン、 /3 ーァラニンまたはそれらの誘導体を表す)で表されるジペプチドである請求項 13〜2 2の 、ずれか 1項に記載の製造法。
[24] L体または D体のアミノ酸力 ァラニン、グルタミン、グルタミン酸、ノ リン、ロイシン、ィ ソロイシン、プロリン、フエ二ルァラニン、トリプトファン、メチォニン、セリン、スレオニン 、システィン、ァスパラギン、チロシン、リジン、ァノレギニン、ヒスチジン、ァスパラギン 酸、 α—ァミノ酪酸、ァザセリン、テアニン、 4—ヒドロキシプロリン、 3—ヒドロキシプロリ ン、オル-チン、シトルリンおよび 6—ジァゾ -5-ォキソノルロイシンから選ばれるァミノ 酸である請求項 22または 23記載の製造法。
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