WO2005106029A1 - 核酸の解析方法 - Google Patents

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hybrid
analyzing
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Tomonori Nagaoka
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Olympus Corp
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a nucleic acid.
  • Gene expression frequency analysis is mainly performed by a dual fluorescent labeling method using a DNA microarray (for example, see Non-Patent Document 1).
  • This analysis method is a system that looks at differences in gene expression. That is, a difference in gene expression is detected between mRNA samples obtained from two groups under different conditions.
  • the mRNA samples of each group are labeled with different fluorescent labels, and then subjected to a competitive hybridization reaction on a DNA microarray on which probes are immobilized, and the fluorescence of each group is measured and compared. I do. In this way, it is possible to estimate whether the frequency of occurrence of a specific gene in one group is increasing or decreasing with respect to the other group.
  • This method is effective for examining relative changes in the frequency of gene expression, since it detects a signal that reflects the result of competition and hybridization on the same spot.
  • an array comparative genomic hybridization (ACGH) method is a method that enables comprehensive detection of an increase or decrease in a specific base sequence present in a chromosome (for example, see Patent Document 1).
  • an array is prepared by spotting a large number of cloned DNA fragments and synthetic oligo DNAs on a slide glass or the like, and chromosomal DNAs derived from two or more different cells are combined with different fluorescent dyes (eg, Cy3 and Cy5). , And then subjected to a competitive hybridization reaction. Based on the intensity ratio of the obtained fluorescent signals, increase the copy number of DNA between cells in the region corresponding to the arrayed DNA fragments! ], Deletion and other changes can be detected.
  • fluorescent dyes eg, Cy3 and Cy5
  • Patent Document 1 JP-T-Hei 11 510681
  • Non-Patent Document l Zhi-Jun Tan et al., "World Journal of Gastroenterology", 2003, No. 9, p. 818-823 Disclosure of the Invention
  • the same conditions except for the type of the fluorescent label should be used between these cells. Attempts were made to suppress variations in comparative analysis values due to differences in uptake efficiency. However, when clinical samples are actually used, even if the amount of nucleic acids is adjusted, the extracted nucleic acid samples show differences in quality due to contamination with proteins and polysaccharides. Sometimes. As a result, the incorporation efficiency of the fluorescent label between the comparative samples was different, and the dispersion of the analysis results was large.
  • the amount of immobilized synthetic oligo DNA or cDNA used as the immobilized probe nucleic acid must be within a certain range for all chips to be prepared when the array is prepared. It was necessary to make a spot so that it would always be a constant amount within it. If the force could not be produced to a certain amount, there was a possibility of an error due to the variation in the amount of solid phase immobilized.
  • the present invention has been made in view of such problems, and an object of the present invention is to eliminate or correct the possibility of errors caused by nucleic acids used as standards, probes, probe spots, and the like, An object of the present invention is to analyze the expression frequency of a gene with good reproducibility. Another object of the present invention is to analyze changes in primary structure in a sample nucleic acid.
  • the nucleic acid analysis method of the present invention is a method for analyzing the primary structure of a sample nucleic acid, and detecting a signal from the sample nucleic acid and a sample nucleic acid hybrid consisting of a probe protein to detect a signal in the sample nucleic acid.
  • a method for analyzing the primary structure of one or more target nucleotide sequences comprising:
  • a synthetic standard nucleic acid comprising the one or more target base sequences, and a synthetic standard
  • the primary structure of the sample nucleic acid is analyzed by detecting a signal from the quasi-nucleic acid hybrid and correcting the signal from the sample nucleic acid hybrid with reference to the signal from the synthetic standard nucleic acid hybrid.
  • the synthetic standard nucleic acid is preliminarily bulled and utilized using a synthetic standard nucleic acid having the same pool strength.
  • the synthetic nucleic acid is synthesized by chromosome force extracted from control cell force.
  • the synthetic nucleic acid is preferably synthesized based on a known base sequence.
  • the synthetic nucleic acid can contain two or more target base sequences in one molecule.
  • the method for analyzing a sample nucleic acid it is preferable to previously measure the nucleic acid concentration and the quality of the pooled synthetic standard nucleic acid.
  • the nucleic acid concentration and quality of the synthetic standard nucleic acid and the signal value specific to the synthetic standard nucleic acid are registered in a database, and the database is used to correct the signal specific to the sample nucleic acid and to perform Z or multiple It is preferably used for comparison of signals between sample nucleic acids.
  • the database is set in accordance with one or more categories selected from analysis conditions, probe base sequences, combinations of the conditions and the base sequences, and power.
  • a sample nucleic acid subjected to a first labeling treatment the synthetic standard nucleic acid subjected to a second labeling treatment different from the first labeling treatment, a first labeling treatment and a second
  • a third labeling treatment different from the labeling treatment or immobilized on the carrier surface Using the probe that has been subjected to a third labeling treatment different from the labeling treatment or immobilized on the carrier surface,
  • the carrier is preferably a microarray.
  • the formation of the first hybrid and the formation of the second hybrid are preferably performed on the same microarray.
  • the method further includes a step of correcting a variation between the first signal intensity and the second signal intensity.
  • the third step it is preferable that a variation in the first signal intensity caused by the amount of the immobilized probe is corrected based on the second signal intensity. Further, it is preferable that the first step and the second step are performed by a force-inductive assembly.
  • the reaction be performed by changing at least one condition selected from the temperature, pH, and composition of the reaction solution of the force-independent Atseuca.
  • a fluorescent dye In the first labeling process and the second labeling process, it is preferable to use a fluorescent dye.
  • the first hybrid body formation and the second hybrid body formation with respect to the same probe are carried out independently for each of the various probes. It is possible to carry out a method further comprising a step of measuring the binding amount ratio of the synthetic standard nucleic acid and the sample nucleic acid to various probes and a step of confirming the combination of the binding amount ratios of all the probes.
  • the synthetic standard nucleic acid contains two or more types of target base sequences.
  • the method of the present invention is also suitable for two or more types of sample nucleic acids.
  • the nucleic acid analysis kit of the present invention is used in the nucleic acid analysis method of the present invention.
  • the present invention it is possible to eliminate or correct the possibility of errors caused by nucleic acids used as standards, probes, probe spots, and the like. Therefore, the expression frequency of the gene can be analyzed with good reproducibility. In addition, changes in the primary structure within the sample nucleic acid can be analyzed.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing a chromosome model in Example 1.
  • FIG. 2 is a plan view showing an arrangement of probes used in Example 1 in an array.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram showing a model of a target sample solution I in Example 1.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram showing a model of a target sample solution II in Example 1.
  • FIG. 5 is a graph showing a profile of a standard solution (fluorescence intensity with respect to probe type) in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing profiles (fluorescence intensity with respect to probe type) of a standard solution and a target sample I, and an estimated primary structure in Example 1.
  • FIG. 7 is a graph showing profiles (fluorescence intensity with respect to probe type) of a standard solution and a target sample II in Example 1, and an estimated primary structure.
  • FIG. 8 is a plan view showing an arrangement of probes used in Example 2 in an array.
  • the nucleic acid analysis method of the present invention is a method of analyzing the primary structure of a sample nucleic acid having a specific base sequence. Detecting a signal from the synthetic standard nucleic acid hybrid comprising the one or more target base sequences and a signal from the synthetic standard nucleic acid hybrid as a probe, and using the signal from the synthetic standard nucleic acid hybrid as a reference, The primary structure of the sample nucleic acid is analyzed by correcting the signal from the sample nucleic acid.
  • the primary structure of a nucleic acid includes the presence or absence of a target base sequence in a nucleic acid molecule. It also includes the presence / absence of deletion, amplification, translocation, inversion, insertion, etc. of a specific region as compared with a normal chromosome or another sample.
  • the signal from the synthetic standard nucleic acid hybrid is always used as a reference regardless of the time of analysis, the type of probe, etc., regardless of the type of analysis device (for example, microarray).
  • the force of using a synthetic nucleic acid synthesized in advance as a standard nucleic acid is pooled, and is used multiple times, multiple devices, multiple types of probes (for example, multiple Can be commonly stored and used through analysis across a single spot.
  • the use of pooled synthetic standard nucleic acids completely eliminates the possibility of errors due to the nucleic acid amount of the standard nucleic acid to be analyzed for comparative analysis, nucleic acid amount adjustment operations, variations in the efficiency of fluorescence incorporation due to impurities, etc. Will be able to do it.
  • the type of the probe refers to the type of the nucleotide sequence of the probe.
  • the primary structure in the sample nucleic acid can be identified and the primary structure change can be determined not only by detecting the change in the DNA copy number in the region corresponding to the arrayed DNA fragments. be able to.
  • the conventional ACGH method which uses cell nucleic acid extracted for each analysis as a standard nucleic acid, analyzes changes in the primary structure of chromosomal DNA derived from a target cell, the following obstacles will occur.
  • hybridization of the standard nucleic acid and sample nucleic acid with multiple types of probes corresponding to the primary structure analysis region is performed, there is an error factor on the standard nucleic acid side.
  • the signal intensity of the hybrid corresponding to each probe type cannot be quantitatively compared among the probe types by means for correcting errors due to the amount, spot size, shape, etc.
  • the present invention since the possibility of an error caused by the standard nucleic acid can be excluded, an error caused by a factor derived from a probe, a probe spot or the like can be determined and corrected. Therefore, it is possible to quantitatively compare the signal strength of the hybrid body formed with the sample nucleic acid with respect to the various probes, that is, the abundance of the target base sequence complementary to the various probes in the sample nucleic acid. Thus, a change in the primary structure of the nucleic acid sequence in the sample nucleic acid can be accurately determined.
  • the signal strength force for the probe type Regardless of the immobilized spot of the probe, the microarray, or the hybridization time, the intensity profile can be generated as a reliable common one.
  • the present invention by using a synthetic standard nucleic acid as a reference, it is possible to further compare the examination results corresponding to two or more kinds of sample nucleic acids—probe types. Therefore, the difference in primary structure between two or more sample nucleic acids can be determined with high reliability, which is advantageous over the conventional method.
  • the cell force used for the standard does not need to perform the operation of extracting and labeling the nucleic acid each time the analysis is performed, so that time and cost can be reduced.
  • chromosomal DNA extracted from a specimen or the like may be subjected to the method of the present invention as it is, or chromosomal DNA may be subjected to an amplification treatment and supplied.
  • the method of the amplification treatment is not particularly limited, and a known method can be used.
  • the synthetic standard nucleic acid used in the present invention comprises a synthetic nucleic acid synthesized in advance, contains one or more target base sequences, and is a pooled one.
  • the target base sequence is a base sequence whose presence or absence is to be detected in a sample nucleic acid for the purpose of primary structure analysis.
  • the synthetic standard nucleic acid may contain one kind of target base sequence or may contain two or more kinds of target base sequences.
  • the synthetic standard nucleic acid may be a mixture of two or more synthetic nucleic acid molecules each containing a different target base sequence, or may be a mixture of two or more.
  • a synthetic nucleic acid molecule containing a target base sequence in one molecule may be used, it is preferable that the synthetic nucleic acid contains two or more target base sequences in one molecule.
  • the target base sequence is present in a close region on the chromosome, and the synthetic standard nucleic acid used in such a case is brought closer to the actual sample. Therefore, the analysis error can be further reduced.
  • the target base sequence is present in a nearby region on the chromosome, it may be a small number of types of synthetic nucleic acids, Since various types of target base sequences can be corrected, it is advantageous in that the number of prepared synthetic nucleic acids can be reduced.
  • the synthesis of synthetic nucleic acids can be performed, for example, by enzymatic reactions or chemically.
  • an enzymatic reaction the same enzymatic reaction as in the amplification treatment on the sample nucleic acid or a different enzymatic reaction may be used.
  • the synthetic nucleic acid is preferably synthesized from chromosomes extracted from control cells.
  • the probe used in the present invention has a base sequence complementary to the target base sequence contained in the synthetic standard nucleic acid. When there are two or more target base sequences to be detected in the sample nucleic acid, it is preferable to prepare probes complementary to each target base sequence.
  • the primary structure of a specific sample nucleic acid can be estimated without the need to compare a plurality of sample nucleic acids.
  • the quality index examples include the type of base sequence contained in the whole synthetic standard nucleic acid, the content of each base sequence, and the content of impurities such as proteins and polysaccharides.
  • Nucleic acid concentration and quality of the synthetic standard nucleic acid, and a signal specific to the synthetic standard nucleic acid Preferably, the intensity values are registered in a database, and the database is used for correcting a signal specific to the sample nucleic acid and comparing signals between Z or a plurality of sample nucleic acids.
  • the database is preferably set in accordance with one or more divisions selected from analysis conditions, a base sequence of a probe, and a combination of the conditions and the base sequence.
  • the analysis conditions include the conditions for the hybridization reaction described below, the type of labeling treatment for the sample nucleic acid'synthetic standard nucleic acid, and the conditions for detecting the signal intensity.
  • a sample nucleic acid subjected to a first labeling treatment, the synthetic standard nucleic acid subjected to a second labeling treatment different from the first labeling treatment, a first labeling treatment and a second labeling Using the probe that has been subjected to a third labeling treatment different from the treatment or immobilized on a carrier surface, and bringing the sample nucleic acid into contact with the probe to form a first hybrid, In a first step of measuring a first signal intensity specific to the first hybrid, a fixed amount of the synthetic standard nucleic acid is brought into contact with the probe to form a second hybrid, and the second hybrid is formed. There is a second step of measuring a second signal intensity specific to the hybrid, and a third step of correcting the first signal intensity based on the second signal intensity.
  • the sample nucleic acid is previously subjected to the first labeling treatment.
  • the synthetic standard nucleic acid is subjected to a second labeling treatment. It is assumed that the probe has been subjected to the third labeling treatment or has been immobilized on the surface of the carrier. Therefore, the first hybrid formed from the probe and the sample nucleic acid and the second hybrid formed from the probe and the synthetic nucleic acid can be detected in accordance with the type of the probe.
  • These first, second and third labeling treatments are not particularly limited as long as they can be detected separately in the respective detection steps.
  • various fluorescent substances can be used as labels, and in addition to various fluorescent dyes, fluorescent glass particles, fluorescent semiconductor particles, and the like can be used.
  • detection using scattered light or reflected light is possible, and metal particles and dielectric particles can be detected.
  • fine particles such as gold fine particles, silver, platinum, and silicon, and latex particles can be used.
  • fine particles of metals such as gold, silver, and platinum are particularly preferable because the particle size is 10 to: LOOnm, and the speed of the particles in the motion state is optimal.
  • latex particles having a particle size of 0.1 to 1 ⁇ m are also preferable because the speed of the particles in a moving state is optimized.
  • the motion state of the particles includes, for example, brown motion and vibration.
  • the appropriate particle size is appropriately determined depending on the specific gravity of the particles, the speed of Brownian motion, and the like.
  • a fluorescent dye for labeling.
  • the first process and the second process may be performed sequentially in any order, or may be performed simultaneously.
  • the sample nucleic acid is brought into contact with the probe.
  • a first hybrid having the probe and sample nucleic acid power is formed.
  • a first signal intensity specific to the first hybrid is measured.
  • the synthetic standard nucleic acid is brought into contact with the probe.
  • the probe and a synthetic nucleic acid are formed to form a second, hybrid form.
  • a second signal intensity specific to the second hybrid is measured.
  • the types of probes used in the first and second steps are common to each other.
  • the formation of the first, the hybrid and the second hybrid may be carried out competitively by simultaneously contacting the sample nucleic acid and the synthetic standard nucleic acid with the same probe, or may be performed on the same probe. On the other hand, contact may be made sequentially and non-competitively. If the type of the probe is common, the sample nucleic acid and the synthetic standard nucleic acid may be brought into contact with different probe molecules, respectively.
  • the first and second steps can be performed, for example, by the following method.
  • a reaction solution containing the synthetic standard nucleic acid and the sample nucleic acid is brought into contact with the probe to perform a hybridization reaction.
  • the temperature, time, method and the like for the hybridization reaction are not limited.
  • the pH, salt concentration, and the like of the reaction solution are not limited.
  • the signal intensity specific to the first labeling process and the signal intensity specific to the second labeling process are measured for each probe spot.
  • the first signal intensity is corrected based on the second signal intensity.
  • a step of removing nucleic acids that have not formed a hybrid form with the probe may be performed.
  • the carrier surface may be washed.
  • a probe bonded to a magnetic bead or the like is used as the probe, a hybrid containing unreacted nucleic acid and a magnetic solution by applying a magnetic field to the reaction solution is not included. It is also possible to separate unreacted nucleic acids. When this method is used, it is possible to carry out reactions and measurements in a liquid phase without going through a reaction in a solid phase.
  • the synthetic standard nucleic acid is previously synthesized and pooled, and is based on a second signal intensity specific to a second hybrid containing the synthetic standard nucleic acid. By correcting the first signal intensity, the synthetic standard nucleic acid is always used as a reference.
  • one kind of probe may be used, or two or more kinds of probes may be used.
  • the method using two or more types of probes is particularly suitable for determining a change in the primary structure in a specific region of a sample nucleic acid. A method suitable for analyzing the primary structure in a specific region will be described later in detail.
  • the first signal caused by the amount of the immobilized probe is determined based on the second signal intensity. Can be corrected.
  • the synthetic standard nucleic acid regardless of the time of analysis, the first signal intensity variation due to variation in the amount of immobilized probe between analysis times when a particular probe is focused on is corrected. be able to. Therefore, the absolute or relative abundance of the target base sequence in the sample nucleic acid can be determined with good reproducibility.
  • the amount of immobilized probe among the probe types varies when focusing on the sample nucleic acid. Can be corrected. Therefore, the first signal intensities specific to each probe type can be quantitatively compared.
  • the synthetic standard nucleic acid having a known quality is preferably used in a fixed amount, and the first signal intensity is corrected based on the second signal intensity.
  • the amount of the target base sequence present in the sample nucleic acid can be quantified with good reproducibility.
  • the content of the target base sequence in the synthetic standard nucleic acid was adjusted to the composition corresponding to the known normal or mutant gene. This makes it possible to easily determine the normal or mutant type of the sample nucleic acid.
  • the first step and the second step are independently performed for each sample nucleic acid, and a plurality of first signals corresponding to each sample nucleic acid are obtained. Get.
  • the quality of the synthetic standard nucleic acid may not be measured in advance.
  • the primary structure can be accurately compared between sample nucleic acids derived from different sites in the same individual, from the same sample of the same individual at different collection points, from a control group and an experimental group, and the like. For example, it is possible to accurately determine whether the target base sequence has increased or decreased in one sample nucleic acid with respect to the other sample nucleic acid.
  • the probe when the probe is immobilized on the surface of the carrier, various forms of the carrier can be applied.
  • various forms of the carrier can be applied.
  • a membrane filter, a microtiter plate, various glass beads and resin beads, various porous substrates, and various gels can be applied.
  • a plurality of types of probe nucleic acids can be immobilized on the same or different spots on a carrier such as a microarray.
  • the formation of the first hybrid (first hybrid) and the formation of the second hybrid (second hybrid) are preferably performed on the same microarray. Furthermore, it is preferred that the formation of the first hybrid and the second hybrid be performed competitively with the same probe.
  • the method further includes a step of correcting a variation between the first signal intensity and the second signal intensity. This is advantageous for correcting the difference in hybridization efficiency due to the difference between the sample nucleic acid and the synthetic standard nucleic acid, and performing more accurate analysis of the primary structure of the nucleic acid.
  • the first step and the second step are performed by a force-inductive assembly.
  • a plurality of hybridization reaction conditions described above may be set, and data of signal intensity values may be acquired in force-intensity.
  • the acquisition of force-independent data means that the acquisition is performed while changing the measurement conditions or detection conditions of the hybrid formation reaction due to complementarity between the target base sequence and the probe.
  • Force-independent data acquisition is not a fixed point with respect to time, for example, the temperature, pH, and composition of the reaction solution are varied.One or more conditions are selected, and the measurement time is within the range of several minutes to several hours. .
  • the reaction conditions can be changed stepwise or continuously.
  • the first and second processes are performed by force-inductive assay, and by performing force-independent data acquisition, the hybridization reaction proceeds under a plurality of reaction conditions and is measured over time. It becomes possible.
  • the array-specific Even when multiple types of probes with different characteristic values are immobilized on the same array, if force-inductive data acquisition is performed, an experiment is performed taking into account the range of the characteristic values and multiple It is possible to accurately detect the types of sequences almost simultaneously.
  • the method using two or more types of probes is particularly suitable for determining a change in the primary structure in a specific region of a sample nucleic acid.
  • the first hybrid formation and the second hybrid formation for the same probe are performed independently for each probe, and a synthetic standard nucleic acid and
  • the primary structure in a specific region can be estimated by performing a method that further includes a step of measuring the binding amount ratio of the sample nucleic acid and a step of confirming the combination of the binding amount ratios in all the probes.
  • the sample nucleic acid subjected to the first labeling treatment, the synthetic standard nucleic acid subjected to the second labeling treatment different from the first labeling treatment, and the first labeling treatment and And a probe subjected to a third labeling treatment different from the second labeling treatment or immobilized on the carrier surface can be used.
  • mutation examples include deletion, amplification, translocation, inversion, insertion and the like of the base sequence in the specific region.
  • This method can be performed, for example, by the following procedure.
  • the synthetic standard nucleic acid and the sample nucleic acid are hybridized with the probe to form a first hybrid and a second hybrid.
  • For each type of probe measure the first signal intensity specific to the first and the hybrid form. Then, create a standard profile that also has a signal strength corresponding to each probe type. For the same probe, a second signal intensity specific for the second hybrid is measured. And the signal strength force corresponding to each probe type also becomes Create a target profile.
  • the combination of each binding amount ratio in various probes can be indirectly confirmed as a combination of the first and second signal intensity ratios in various probes over a plurality of probes.
  • the synthetic standard nucleic acid is configured to be known as a normal type or a mutant type in advance, it is possible to evaluate the binding amount ratio of each probe using the standard profile and the target profile to determine the normality of a single sample nucleic acid. Type and mutant type can be determined. In addition, it is necessary to conduct a study using the synthesized standard nucleic acid in common for multiple sample nucleic acids, regardless of composition, and compare the examination results with each other to detect differences in primary structure between sample nucleic acids. Can be done.
  • the nucleic acid analysis kit of the present invention is characterized by being used for the nucleic acid analysis method of the present invention described above.
  • This nucleic acid analysis kit is composed of a synthetic nucleic acid synthesized in advance, contains one or more target base sequences, and includes a pooled synthetic standard nucleic acid and a probe having a base sequence complementary to the target base sequence. including.
  • the synthetic standard nucleic acid is preferably subjected to a labeling treatment, and the probe is preferably subjected to a labeling treatment different from that of the synthetic standard nucleic acid or immobilized on a carrier surface.
  • two or more kinds of target base sequences or two or more kinds of probes can be contained in the synthetic standard nucleic acid.
  • FIG. 1 shows a model of a method for determining the presence or absence of a primary structural change (relative to a normal primary structure) of a chromosome based on the present invention.
  • experiments were performed using oligo DNAs corresponding to A, B, C, D, E, and F.
  • the experimental steps were: 1) preparation of microarray, 2) preparation of fluorescent standard sample (synthetic standard nucleic acid), 3) preparation of fluorescent target sample (sample nucleic acid), 4) hybridization of standard sample and target sample to microarray, 5) A step force for data analysis was also constructed.
  • Probe for detecting the base sequence corresponding to A (SEQ ID NO: 12)
  • Probe for detecting the base sequence corresponding to B (SEQ ID NO: 34)
  • Probe for detecting the base sequence corresponding to C (SEQ ID NO: 5-6)
  • a probe that detects the nucleotide sequence corresponding to D (SEQ ID NOS: 7-8)
  • a probe that detects the nucleotide sequence corresponding to E (SEQ ID NO: 910)
  • a probe that detects the nucleotide sequence corresponding to F (SEQ ID NO: 11-12) was immobilized on a substrate having a porous structure in the arrangement shown in FIG.
  • reference numerals A to F correspond to regions A to F shown in FIG.
  • Oligo DNAs having a Cy5 label at the ⁇ terminus of the nucleotide sequence complementary to each of these probe sequences were chemically synthesized.
  • Standard solutions synthetic standard nucleic acid solutions prepared by adjusting each of the synthetic oligo DNAs to 10 mM Tris-HCl pH 7.5 to contain 50 nM were prepared.
  • oligo DNA having a base sequence complementary to each sequence of each probe and labeled with Cy3 at the 5 ′ end was chemically synthesized.
  • a target sample solution I was prepared by adjusting each of A, B, C, D, E, and F to 50 nM with 10 mM Tris-HCl pH 7.5.
  • a target sample solution II was prepared by adjusting 10 mM Tris-HCI pH 7.5 so that A and D each contained 50 nM and B, C, E and F each contained 25 nM.
  • the target sample solution I is a model in which the chromosomal structure remains unchanged in the regions A, B, and C and the regions D, E, and F as shown in FIG.
  • the target sample solution II is normal in areas A and D.
  • LOH loss of heterozygosity
  • the analysis of the hybridization was performed using a PAM microarray system manufactured by Olympus Corporation. Mu: Performed by FD10.
  • the experimental system is designed to automatically drive the solution around the reaction filter, control the temperature, and record images of the fluorescent spots.
  • the standard solution mixed with the hybridization buffer and the target sample solution are added as follows to the reaction area of the dedicated chamber in which the microarray with a diameter of 6 mm is installed, and the solution is driven and the temperature is changed. was imaged.
  • LOH is generated on the chromosome and the amount of DNA is 1Z2.
  • the signal of each fluorescent dye of Cy3 and Cy5 in each spot is detected, signal intensity data is obtained, and the obtained image is analyzed using an analysis software programmed for the fluorescence intensity analysis. did. By observing the intensity of the two-color fluorescence within one spot, the amount of the sequence could be estimated.
  • the horizontal axis of the bar graph indicates the type of probe (probe complementary to each of A to F), and the vertical axis indicates the fluorescence intensity.
  • the hybridization signal of the target sample solution labeled with Cy3 was analyzed. 6 and 7, the hatched bar graphs are the same as the bar graphs shown in FIG. 5 and showing the fluorescence intensities obtained by examining the standard solution.
  • the target sample solution II showed the same profile as the standard solution in A and B (A is about 1.3 times the signal of the standard solution, and D is about the signal of the standard solution).
  • A is about 1.3 times the signal of the standard solution
  • D is about the signal of the standard solution.
  • the amount of fluorescence decreased from 0.65 (B, C) to 0.7 (E, F) the signal of the standard solution. It was estimated that the amount was decreasing.
  • the regions A and D are normal. LOH is generated in the regions B, C, E, and F on the chromosome. Can be estimated to decrease.
  • plasmid pUC18 was cut with a restriction enzyme EcoRI (TaKaRa), and the sequence of SEQ ID NO: 17 was inserted by ligation to prepare sample I. Further, a plasmid pUC18 was digested with Accl, and 515 bp (a DNA fragment of SEQ ID NO: 17 which had been cleaved with the 801st base at 286th base force) obtained by digesting SEQ ID NO: 17 with Accl was inserted.
  • EcoRI EcoRI
  • 515 bp a DNA fragment of SEQ ID NO: 17 which had been cleaved with the 801st base at 286th base force
  • SEQ ID NO: 13 which is the sequence G up to 35 bp in the sequence of SEQ ID NO: 17 and its complementary strand, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 15, whose 2550th force is also the sequence H up to 37 bp, and its complementary strand.
  • Certain SEQ ID NO: 16 was immobilized on a microarray composed of a substrate having a porous structure in the arrangement shown in FIG.
  • Oligos in which the base sequence complementary to each of these probe sequences is labeled with Cy5 at the ⁇ terminal DNA was chemically synthesized, and a standard solution was prepared which was adjusted with 10 mM Tris-HC1 pH 7.5 to contain 50 nM of each oligo DNA.
  • sample I is a sample nucleic acid containing the entire SEQ ID NO: 17, and has sequences G and H.
  • sample II has 515 bp, which is a part of the target base sequence, and has sequence G but not H.
  • sample using only 10 ⁇ l of the PCR product from sample I (normal model sample) and a sample containing 5 ⁇ l of the PCR products of sample I and sample II (deletion model sample: Model where the loss exists and the area ⁇ has been reduced to 1 and 2).
  • the analysis of the hybridization was carried out using a microarray system FD10 manufactured by Olympus Corporation.
  • the experimental system is designed to automatically drive the solution around the reaction filter, control the temperature, and record images of the fluorescent spots.
  • a standard solution mixed with a hybridization buffer and a target sample solution were heated in a reaction section of a dedicated chamber in which a microarray having a diameter of 6 mm was installed, and the solution was driven and temperature was changed.
  • the standard solution and the normal model sample are dissolved in a hybridization buffer so that they become 3x SSPE each in lOul, and the microarray is prepared. After the addition, at 50 ° C., 30 transfers to / from the nucleic acid reaction carrier having a porous structure (drive control) were performed.
  • the standard solution and the deletion type model sample were dissolved in a hybridization buffer at a concentration of 3 ⁇ SSPE in lOul each, and added to the microarray. Then, the device was moved in and out of the nucleic acid reaction carrier having a porous structure 30 times (drive control).
  • the standard solution and each model sample were hybridized with the immobilized probe for detecting the base sequence of the region G and H to form the first and second hybrids.
  • the signal of each fluorescent dye of Cy3 and Cy5 in each spot was detected and obtained.
  • the images were analyzed using analysis software programmed for fluorescence intensity analysis, and the abundance of the sequences was estimated. As a result, the abundance of the sequence could be estimated by observing the intensity of two-color fluorescence within one spot.
  • the hybridization signal of the normal model sample labeled with Cy3 was analyzed.
  • Probes that detect regions G and H show almost the same profile as the standard solution (the ratio of fluorescence intensity to the standard solution is 2 times for G and 1.5 times for H), and there is no change in the structure on the sample nucleic acid. It was estimated that the DNA amount was also normal.
  • the fluorescence amount was reduced to 0.7 times the standard solution and the DNA amount was reduced. could be estimated. Thus, it was possible to estimate the structural change due to the deletion in the molecule amplified by the PCR product.

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Abstract

　本発明は、標準として用いる核酸や、プローブ、プローブスポット等に起因する誤差の可能性を排除または補正可能とし、遺伝子の発現頻度を再現性よく解析し、また、試料核酸内における一次構造の変化を解析することを目的とする。本発明は、試料核酸及びプローブからなる試料核酸ハイブリッドからのシグナルを検出することで当該試料核酸中の１種以上の標的塩基配列の一次構造を解析する方法であって、 　該１種以上の標的塩基配列を含む合成標準核酸、及び該プローブからなる合成標準核酸ハイブリッドからのシグナルを検出し、該合成標準核酸ハイブリッドからのシグナルを基準として該試料核酸ハイブリッドからのシグナルを補正することで、該試料核酸の一次構造を解析する方法を提供する。

Description

核酸の解析方法
技術分野
[0001] 本発明は、核酸を解析する方法に関する。
背景技術
[0002] 従来、特定の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸プローブを利用して、試 料核酸における特定遺伝子の発現頻度の解析 (遺伝子発現頻度解析)や、特定塩 基配列のコピー数の増減の解析等が行われて 、る。
遺伝子発現頻度解析は、主に DNAマイクロアレイを用いた二蛍光標識法によって 行われている（例えば、非特許文献 1参照)。この解析方法は、遺伝子発現の差異を 見る系である。即ち、異なる条件の 2群の細胞力も得た mRNAサンプル間で、遺伝 子発現の差を検出するものである。
まず、解析の回ごとに、各群の mRNAサンプルに異なる蛍光標識を施し、プローブ の固相化された DNAマイクロアレイ上で競合的にハイブリダィゼーシヨン反応させ、 各群の蛍光を測定し比較する。このようにして、一方の群における特定遺伝子の発 現頻度が、他方の群に対し増減しているかを推定することができる。
同一スポット上で競合してハイブリダィズした結果を反映するシグナルを検出するの で、この方法は、遺伝子発現頻度の相対的な変化を検討するために有効である。
[0003] 一方、染色体中に存在する特定の塩基配列の増減を網羅的に検出することを可能 にする方法として、 Array Comparative Genomic Hybridization (ACGH)法 が挙げられる (例えば、特許文献 1参照。 )0
この方法では、多数のクローンィ匕 DNA断片や合成オリゴ DNAをスライドグラス等に スポットしたアレイを作製し、 2以上の異なる細胞由来の染色体 DNAを、それぞれ異 なった蛍光色素（例えば Cy3と Cy5など）で標識し、アレイにぉ 、て競合的にハイプリ ダイズ反応させる。得られる蛍光シグナルの強度比をもとに、アレイィ匕された DNA断 片に相当する領域における、細胞間での、 DNAのコピー数の増力！]、欠失等の変化 を検出することができる。このとき、 1コピーレベルで変化を検出することが可能である [0004] 上記の遺伝子発現頻度解析や ACGH法等の解析法を用いて、癌細胞と正常細胞 の核酸量の差を検出し、癌の診断を目指した研究が行われて 、る。
実際にマイクロアレイで臨床検体を解析する場合、解析に用いる臨床検体の核酸 量が少ない事が多ぐこうした場合、臨床検体の核酸を Eberwine RNA amplific ation法や WGA法で増幅させて力 解析することが行われている。
特許文献 1 :特表平 11 510681号公報
非特許文献 l :Zhi-Jun Tanら、「ワールド 'ジャーナル'ォブ'ガストロェンテロロジー (World Journal of Gastroenterology)」、 2003年、第 9号、 p. 818— 823 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 従来の ACGH法では、一つの標的塩基配列に対して、一種類の固相化プローブ を用意し、そこに対するハイブリダィゼーシヨンの有無を解析することによって、試料 核酸について、アレイ化された DNA断片に相当する領域における、 DNAのコピー 数の変化を検出することは行えていたが、試料核酸の分子内における一次構造の変 化は解析できな力つた。
[0006] 従来のマイクロアレイによる遺伝子発現頻度解析や ACGHで、得られる結果を正 確な値にするためには、解析において標準とする細胞 (正常細胞等）は常に一定の 核酸量を持つ必要がある。しかし、実際には採取の方法や培養の条件等により核酸 量にばらつきがみられ、再現性よく正確な比較解析値を得ることが難しかった。また、 異なった細胞由来の核酸量を一定に調整することで、競合的なハイブリダィゼーショ ンに供する核酸量の統一を図る場合も、この調整を行うこと自体で、解析の回ごとや 試料の種類ごとに核酸量のばらつきを生じる可能性がある。
また、比較する細胞間で、核酸への蛍光標識の取り込み効率が異なることを最小限 にするために、これらの細胞間で、蛍光標識の種類以外は同じ条件とすることで、蛍 光標識の取り込み効率の差による比較解析値のばらつきを抑制することが図られて いた。しかし、実際に臨床サンプルを用いる場合には、核酸量を調整しても、抽出し た核酸サンプルにお 、て、タンパク質や多糖類等の混入により品質の違 、が見られ ることがある。このことにより、比較サンプル間での蛍光標識の取り込み効率が異なり 、解析結果のばらつきが大きくなつていた。
また、解析に用いる臨床検体の核酸量が少ない場合は、臨床検体の核酸を増幅す る力 特に核酸量や品質の違いによって、比較解析する染色体 DNA間で増幅量に 差が発生し、精度良く解析することが出来な力 た。
[0007] また、必ず 2つの細胞間での競合的なノ、イブリダィゼーシヨンが必要となり、解析の 回ごとにそれぞれの細胞力 染色体 DNAを抽出し、抽出された染色体 DNAに対し て標識反応を行う必要があり、標識を行うための時間とコストがかかっていた。
[0008] また、解析に用いる DNAマイクロアレイの製造において、ピン先のロットの違いなど によって、得られるプローブスポットのサイズや形状の均一性には限界がある。その 結果、ノ、イブリダィゼーシヨンを利用した解析結果において、充分な再現性が得られ ていな力つた。また、互いに特異性の異なるプローブを固相化したスポット間で、単純 にシグナル値を比較して判定に用いることはできなかった。
また、こうしたマイクロアレイで核酸の定量を行うためには、アレイを作成する際に、 固相化プローブ核酸として用いる合成オリゴ DNAや cDNA等の固相化量を、作成 する全てのチップにおいて、ある範囲内で常に一定量となるようにスポットして作製す る必要があった。一定量となるように作製できな力つた場合、固相化量のばらつきに 起因する誤差の可能性があった。
[0009] 本発明はこのような問題点に鑑みなされたものであり、本発明の目的は、標準として 用いる核酸や、プローブ、プローブスポット等に起因する誤差の可能性を排除または 補正可能とし、遺伝子の発現頻度を再現性よく解析することにある。また、試料核酸 内における一次構造の変化を解析することにある。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明の核酸の解析方法は、試料核酸の一次構造を解析する方法であって、 試料核酸及びプローブカゝらなる試料核酸ノヽイブリツドからのシグナルを検出するこ とで当該試料核酸中の 1種以上の標的塩基配列の一次構造を解析する方法であつ て、
該 1種以上の標的塩基配列を含む合成標準核酸、及び該プローブ力 なる合成標 準核酸ハイブリッドからのシグナルを検出し、該合成標準核酸ハイブリッドからのシグ ナルを基準として該試料核酸ハイブリッドからのシグナルを補正することで、該試料 核酸の一次構造を解析することを特徴とする。
本発明の試料核酸の一次構造の解析においては、前記合成標準核酸を予めブー ルし、同一プール力もの合成標準核酸を利用して行うことが好ま 、。
また前記合成核酸は、対照用細胞力 抽出された染色体力 合成されていることが 好ましい。
更に前記合成核酸は、既知の塩基配列をもとに合成されていることが好ましい。 前記合成核酸は、 2種以上の標的塩基配列を 1分子内に含むことができる。
本発明の試料核酸の解析方法にぉ ヽては、プールされた前記合成標準核酸の核 酸濃度及び品質を、予め測定しておくことが好ましい。
ここで、前記合成標準核酸の核酸濃度、品質、及び該合成標準核酸に特異的なシ グナル値を、データベースに登録し、該データベースを、試料核酸に特異的なシグ ナルの補正及び Z又は複数の試料核酸間におけるシグナルの比較に用いることが 好ましい。
さらに、前記データベースが、解析条件、プローブの塩基配列、並びに、該条件及 び該塩基配列の組み合わせ、力 選ばれる 1以上の区分に従って設定されているこ とが好ましい。
本発明の方法において、第一の標識処理を施された試料核酸と、第一の標識処理 と異なる第二の標識処理を施された前記合成標準核酸と、第一の標識処理及び第 二の標識処理と異なる第三の標識処理を施された又は担体表面に固相化された前 記プローブとを用い、
前記試料核酸を、前記プローブに接触させて第一のハイブリッド体を形成させ、該 第一のハイブリッド体に特異的な第一のシグナル強度を測定する第一過程、 前記合成標準核酸を前記プローブに接触させて第二のハイブリッド体を形成させ、 該第二のハイブリッド体に特異的な第二のシグナル強度を測定する第二過程、 及び、前記第二のシグナル強度を基準として、前記第一のシグナル強度を補正す る第三過程を有する方法を用いることができる。 [0012] 前記担体は、マイクロアレイであることが好ましい。
ここで、前記第一のハイブリッド体の形成および前記第二のハイブリッド体の形成を 、同一のマイクロアレイ上で行うことが好ましい。
第一のシグナル強度及び第二のシグナル強度の間のばらつきを補正する過程をさ らに含むことが好ましい。
前記第三過程において、前記第二のシグナル強度を基準として、固相化されたプ ローブ量に起因する第一のシグナル強度のばらつきを補正することが好ましい。 また、前記第一過程及び第二過程が、力イネティックアツセィにより行われることが 好ましい。
ここで、前記力イネティックアツセイカ 反応溶液の温度、 pH、及び組成から選ばれ る 1種以上の条件を変化させて行われることが好ま 、。
第一の標識処理及び第二の標識処理にぉ 、て、蛍光色素を用いることが好ま U、
[0013] また、 2種類以上の前記プローブを用い、同一のプローブに対する前記第一のハイ ブリツド体形成及び前記第二のハイブリッド体形成を、各種プローブにつ!、て互いに 独立に行!、、各種プローブに対する合成標準核酸及び試料核酸の結合量比を測定 する過程と、全プローブにおける結合量比の組み合わせを確認する過程をさらに有 する方法を行うことができる。
ここで、前記合成標準核酸が、 2種類以上の標的塩基配列を含むことが好ましい。
[0014] 本発明の方法は、 2種類以上の試料核酸に対しても好適である。
[0015] 本発明の核酸の解析キットは、本発明の核酸の解析方法に用いられることを特徴と する。
発明の効果
[0016] 本発明によれば、標準として用いる核酸や、プローブ、プローブスポット等に起因す る誤差の可能性を排除または補正可能とすることができる。従って、遺伝子の発現頻 度を再現性よく解析することができる。また、試料核酸内における一次構造の変化を 解析することができる。
図面の簡単な説明 [0017] [図 1]実施例 1における染色体モデルを示す概念図である。
[図 2]実施例 1において用いたプローブの、アレイにおける配置を示す平面図である
[図 3]実施例 1における標的サンプル溶液 Iのモデルを示す概念図である。
[図 4]実施例 1における標的サンプル溶液 IIのモデルを示す概念図である。
[図 5]実施例 1における標準溶液のプロファイル (プローブ種類に対する蛍光強度）を 示すグラフである。
[図 6]実施例 1における、標準溶液及び標的サンプル Iのプロファイル (プローブ種類 に対する蛍光強度)を示すグラフ、並びに推定された一次構造である。
[図 7]実施例 1における標準溶液及び標的サンプル IIのプロファイル (プローブ種類 に対する蛍光強度)を示すグラフ、並びに推定された一次構造である。
[図 8]実施例 2において用いたプローブの、アレイにおける配置を示す平面図である
発明を実施するための最良の形態
[0018] 本発明の核酸の解析方法 (以下、「核酸解析方法」という場合がある）は、特定の塩 基配列を有する試料核酸の一次構造を解析する方法であるが、この方法にぉ 、ては 、該 1種以上の標的塩基配列を含む合成標準核酸、及び該プローブ力 なる合成標 準核酸ハイブリッドからのシグナルを検出し、該合成標準核酸ハイブリッドからのシグ ナルを基準として該試料核酸ハイブリッドからのシグナルを補正することで、該試料 核酸の一次構造を解析することを特徴とする。
本明細書において、核酸の一次構造とは、核酸分子内における標的塩基配列の 有無を包含する。また、正常型染色体あるいは他の試料と対比して特定領域の欠損 、増幅、転座、逆位、挿入等の有無を包含する。
本発明の方法においては、常に、すなわち、解析の回、解析装置 (例えば、マイク ロアレイ）の別、プローブの種類等に関らず、前記合成標準核酸ハイブリッドからのシ グナルを基準とする。
本発明の方法では、標準核酸として、予め合成された合成核酸からなるものを用い る力 これをプールして、複数回、複数装置、複数種のプローブ (例えば複数のプロ 一ブスポット)等に渡る解析を通して共通に保存し使用することができる。プールした 合成標準核酸を使用することにより、比較解析しょうとする標準核酸の核酸量、核酸 量の調整操作、不純物による蛍光取り込み効率のばらつき、等に起因する誤差の可 能性を完全に排除することができるようになる。
したがって、アレイを用いる場合のプローブ固相化量、スポットのサイズ、形状等の 、標準核酸以外の要因によるシグナル強度の誤差を判定し、補正することができる。 よって、特定種のプローブと試料核酸とのハイブリダィゼーシヨンを利用し、シグナ ル強度を検出する検討を複数回行った場合に、複数回に渡る検討結果を互いに補 正できる。したがって、第一に、特定プローブ種に対応する標的塩基配列の存在量（ 核酸量)を再現性よく測定でき、遺伝子発現頻度を、明確に解析することができる。な お本明細書において、プローブの種類とは、プローブの塩基配列の別をいう。
また下記理由により、第二に、アレイ化された DNA断片に相当する領域における D NAのコピー数の変化を検出するのみでなぐ試料核酸内における一次構造を同定 したり、一次構造変化を判定することができる。
即ち、標準核酸として解析ごとに細胞力も抽出したものを用いる従来の ACGH法で 、標的細胞由来の染色体 DNAの一次構造の変化を解析しょうとすると、下記の障害 が発生する。標準核酸、試料核酸と、一次構造解析領域に対応する複数種のプロ一 ブとのハイブリダィゼーシヨンを行わせたとき、標準核酸側に誤差の要因が存在する ため、各プローブの固定化量、スポットサイズ、形状等による誤差を補正する手段が なぐ各プローブ種に対応するハイブリッド体のシグナル強度を、プローブ種類間で 定量的に比較できない。
これに対し、本発明では、標準核酸に起因する誤差の可能性を排除することができ るから、プローブ、プローブスポット等由来の要因による誤差を判定し、補正すること ができる。したがって、各種プローブに対して試料核酸の形成したノヽイブリツド体のシ グナル強度を、即ち、各種プローブに相補的な標的塩基配列の、試料核酸における 存在量を、定量的に比較することができる。このことにより、試料核酸における核酸配 列の一次構造の変化を正確に判定することができる。
具体的には、プローブ種類に対するシグナル強度力 なるプローブ種類 シグナ ル強度プロファイルを、プローブの固相化されたスポットの別、マイクロアレイの別、ハ イブリダィゼーシヨンの回の別に関らず、信頼できる共通のものとして作成できる。
[0020] 本発明によれば、合成標準核酸を基準とすることで、さらに、 2種以上の試料核酸 —プローブ種類に対応した検討結果を比較可能とできる。したがって、 2種以上の試 料核酸間で、一次構造の異同を信頼性よく判定することができ、従来の方法に対し 有利な効果を奏する。
また、解析の回ごとに、標準用に用いる細胞力も核酸を抽出、標識する操作が必要 なくなり、時間、コスト等を低減することができる。
[0021] (試料核酸）
本発明の核酸解析方法によって解析される試料核酸として、検体等から抽出され た染色体 DNAをそのまま本発明の方法に供してもょ 、し、染色体 DNAに増幅処理 を行って力 供してもよい。増幅処理の方法は特に限定されず、公知の方法を用い ることがでさる。
(合成標準核酸）
本発明に用いられる合成標準核酸は、予め合成された合成核酸からなり、 1種以上 の標的塩基配列を含み、かつプールされたものである。
ここで標的塩基配列は、一次構造解析の目的のもと、試料核酸において存否を検 出しようとする塩基配列である。
合成標準核酸は 1種の標的塩基配列を含むものであってもよぐ 2種以上の標的塩 基配列を含むものであってもよ 、。
合成標準核酸が 2種以上の標的塩基配列を含む場合、合成標準核酸は、各々異 なる標的塩基配列を含む合成核酸分子が 2種以上混合された混合物であってもよい し、 2種以上の標的塩基配列を 1分子内に含む合成核酸分子力 なってもよいが、前 記合成核酸が、 1分子内に、 2種以上の標的塩基配列を含むことが好ましい。 1分子 内に 2種以上の標的塩基配列を含ませることで、標的の塩基配列が染色体上の近い 領域に存在して 、る場合に用いる合成標準核酸を、より実サンプルに近 、状態にす ることが可能となるので、解析の誤差をさらに小さくすることができる。標的の塩基配 列が染色体上の近 、領域に存在して 、な 、場合でも、少な 、種類の合成核酸で、 多種の標的塩基配列に関する補正を行えるので、準備する合成核酸の種類を少なく できる点で有利である。
合成核酸の合成は、例えば、酵素反応により又は化学的に行える。酵素反応の場 合、試料核酸における増幅処理と同様の酵素反応によってもよいし、異なる酵素反 応によってもよい。
[0022] 前記合成核酸は、対照用細胞から抽出された染色体から合成されていることが好 ましい。
対照用細胞に由来するものであっても、予め合成され、プールされた合成核酸とし て常に共通のものを用いることで、標準用の核酸に起因する誤差の可能性を排除す ることができる。対照用細胞に由来する合成核酸を用いれば、試料核酸が実験群細 胞由来である場合に、対照群と実験群との一次構造比較を特に簡便に行うことがで きる。
[0023] (プローブ）
本発明に用いられるプローブは、合成標準核酸に含まれる標的塩基配列に相補的 な塩基配列を有する。試料核酸において検出しょうとする標的塩基配列が 2種以上 である場合は、各標的塩基配列に相補的なプローブをそれぞれ準備することが好ま しい。
[0024] 本発明において、プールされた中から常に（例えば、試料核酸の別に関らず)一定 量の合成標準核酸を用いれば、複数の試料核酸における一次構造の差異を検出す ることが可能である。ここで、複数の試料核酸を、互いに異なる実験群由来や異なる 細胞由来とすることで、実験群間や細胞間での核酸一次構造の比較判定が可能で ある。
さらに、プールされた前記合成標準核酸の核酸濃度及び品質を、予め測定してお けば、複数の試料核酸の比較を必要とせずに、特定の試料核酸の一次構造を推定 することができる。
品質の指標としては、合成標準核酸の総体に含まれる塩基配列の種類、各塩基配 列の含有率、タンパク質や多糖類など不純物の含有率、等が挙げられる。
[0025] 前記合成標準核酸の核酸濃度、品質、及び該合成標準核酸に特異的なシグナル 強度値を、データベースに登録し、該データベースを、試料核酸に特異的なシグナ ルの補正及び Z又は複数の試料核酸間におけるシグナルの比較に用いることが好 ましい。
前記データベースは、解析条件、プローブの塩基配列、並びに、該条件及び該塩 基配列の組み合わせ力 選ばれる 1以上の区分に従って設定されていることが好ま しい。
解析条件としては、後述のハイブリダィズ反応の条件、試料核酸'合成標準核酸に 対する標識処理の種類、シグナル強度の検出条件等が挙げられる。
[0026] 以下、本発明の実施態様を例示する。
本実施態様は、第一の標識処理を施された試料核酸と、第一の標識処理と異なる 第二の標識処理を施された前記合成標準核酸と、第一の標識処理及び第二の標識 処理と異なる第三の標識処理を施された又は担体表面に固相化された前記プロ一 ブとを用い、前記試料核酸を、前記プローブに接触させて第一のハイブリッド体を形 成させ、該第一のハイブリッド体に特異的な第一のシグナル強度を測定する第一過 程、一定量の前記合成標準核酸を前記プローブに接触させて第二のハイブリッド体 を形成させ、該第二のハイブリッド体に特異的な第二のシグナル強度を測定する第 二過程、及び、前記第二のシグナル強度を基準として、前記第一のシグナル強度を 補正する第三過程を有する。
本実施態様において、試料核酸には、予め第一の標識処理を施しておく。
[0027] また、合成標準核酸には、第二の標識処理を施しておく。プローブは、第三の標識 処理を施されたもの、又は担体表面に固相化されたものとする。したがって、プロ一 ブと試料核酸から形成される第一のハイブリッド体、及びプローブと合成核酸から形 成される第二のハイブリッド体を、プローブの種類に対応させて検出することができる 。これらの第一、第二、第三の標識処理は、それぞれの検出工程において区別して 検出可能なものであれば特に制限はない。
例えば、種々の蛍光物質を標識として用いることが可能であり、これには種々の蛍 光色素のほかに、蛍光ガラス粒子、蛍光半導体微粒子等も用いることができる。 また、散乱光や反射光による検出を行うことも可能であり、金属粒子や誘電体粒子 を標識として用いることができる。例えば金微粒子、銀、白金、シリコンなどの微粒子 やラテックス粒子を用いることができる。特に、金、銀、白金などの金属の微粒子は、 粒径が 10〜： LOOnmのもの力 運動状態にある粒子の速さが最適となるため特に好 ましい。また、ラテックス粒子は、粒径が 0. 1〜1 μ mのものが、同様に、運動状態に ある粒子の早さが最適となるため好ましい。ここで、粒子の運動状態には、例えばブ ラウン運動や振動などが挙げられる。適切な粒径は、粒子の比重とブラウン運動の速 さ等により、適宜決定される。
また、ピオチンとアビジンの反応のように、特異的な結合を形成する物質を用い、上 述したような、蛍光物質、金属粒子や誘電体粒子等を標識することも可能である。さ らに、酵素を結合した前記特異的な結合を形成する物質を用い、これに基質を供給 して、化学発光やィ匕学反応を利用した検出を行うことも可能である。放射性同位元素 を標識することも可能である。
なお、標識処理の容易性、コスト、および、検出の容易性を考慮すると、標識処理 には蛍光色素を用いることが好まし 、。
[0028] (第一、第二過程）
第一過程と第二過程は、順不同で順次行ってもよいし、同時に行ってもよい。 第一過程においては、前記試料核酸を前記プローブに接触させる。このことにより 、プローブと試料核酸力もなる第一のハイブリッド体を形成させる。そして、前記第一 のハイブリッド体に特異的な第一のシグナル強度を測定する。
第二過程においては、前記合成標準核酸を前記プローブに接触させる。このことに より、プローブと合成核酸力もなる第二のノ、イブリツド体を形成させる。そして、前記第 二のハイブリッド体に特異的な第二のシグナル強度を測定する。
このとき、第一、第二過程に用いるプローブの種類は、互いに共通とする。第一の ノ、イブリツド体及び第二のハイブリッド体の形成は、試料核酸及び合成標準核酸を、 同一のプローブに対し同時に接触させて競合的に行わせてもよいし、同一のプロ一 ブに対し順次接触させて非競合的に行わせてもよい。また、プローブの種類が共通 であれば、試料核酸と合成標準核酸を、各々別のプローブ分子と接触させてもよい。
[0029] 第一、第二過程は、例えば以下の方法によって行える。 まず、前記プローブに、前記合成標準核酸および前記試料核酸を含む反応溶液を 接触させ、ハイブリダィズ反応させる。ここで、ハイブリダィズ反応させる温度、時間、 方式等は限定されない。また、反応溶液の pH、塩濃度等も限定されない。
その後、例えばプローブが担体表面に固相化されている場合はプローブスポット毎 に、第一の標識処理に特異的なシグナル強度と、第二の標識処理に特異的なシグ ナル強度をそれぞれ測定する。
[0030] (第三過程）
前記第一過程及び前記第二過程を行った後、第三過程を行う。
第三過程においては、第二のシグナル強度を基準として、第一のシグナル強度を 補正する。
[0031] 第一及び第二過程の後、第三過程の前に、所望により、プローブに対してハイプリ ッド体を形成していない核酸を除去する過程を行ってもよい。例えば、プローブとして 担体表面に固相化されたものを用いた場合、担体表面を洗浄すればよい。また、プ ローブとして磁気ビーズ等に接合されたものを用いた場合、ハイブリッド体と未反応 核酸力 なる反応溶液に対して磁場をかけて磁気ビーズを含んだハイブリッド体と、 磁気ビーズを含まな ヽ未反応核酸とを分離することも可能である。この方式を利用す る場合には、固相での反応を介することなぐ液相で反応、測定などを行うことが可能 となる。
[0032] 本実施態様にぉ ヽて、前記合成標準核酸は、予め合成されプールされたものであ り、合成標準核酸を含む第二のハイブリッド体に特異的な第二のシグナル強度を基 準として、第一のシグナル強度を補正することにより、合成標準核酸を常に基準とし ている。
ここで、 1種のプローブを用いても、 2種以上のプローブを用いても構わない。 2種以 上のプローブを用いる方式は、試料核酸の特定領域における一次構造の変化を判 定するために特に好適である。特定領域における一次構造の解析に適した方法に ついては、後に詳述する。
[0033] プローブとして、担体に固相化されたものを用いる場合に、前記第三過程において 、前記第二のシグナル強度を基準として、固相化されたプローブ量に起因する第一 のシグナル強度のばらつきを補正することができる。
例えば、解析の回に関らず前記合成標準核酸を用いることで、特定プローブに着 目したとき解析の回どうしでプローブ固相化量がばらつくことによる、第一のシグナル 強度のばらつきを補正することができる。よって、試料核酸における標的塩基配列の 絶対的または相対的な存在量を、再現性よく求めることができる。
また、 2種以上のプローブを用い、プローブの種類に関らず前記合成標準核酸を 用いることで、試料核酸に着目したときプローブ種類間でプローブ固相化量がばらつ くことによる、第一のシグナル強度のばらつきを補正することができる。よって、各プロ ーブ種に特異的な第一シグナル強度どうしを定量的に比較することができる。
[0034] 1種類の試料核酸について解析を行う場合、前記合成標準核酸として品質の明ら かなものを、好ましくは一定量用い、第二のシグナル強度を基準として第一のシグナ ル強度を補正することにより、該試料核酸における標的塩基配列の存在量を再現性 よく定量することができる。さら〖こ、前記合成核酸を、既知の塩基配列をもとに合成さ れたものとして、合成標準核酸における標的塩基配列の含有率を、既知の正常型あ るいは変異型遺伝子に対応する組成とすれば、試料核酸の正常型'変異型判定を 容易に行うことができる。
[0035] 2種以上の試料核酸にっ ヽて解析を行う場合、各試料核酸につ!ヽて、独立に第一 過程及び第二過程を行い、各試料核酸に対応した複数の第一シグナルを得る。この 場合、合成標準核酸の品質は予め測定されていなくてもよい。
プールされた合成標準核酸を、試料核酸の別に関らず一定量用いることで、同種 のプローブに対する各第一シグナル強度を、第二のシグナル強度を基準として補正 し、互いに比較することが可能となる。したがって、同一個体における別個の部位由 来、同一個体の同一部位で採取時点の異なる検体由来、対照群と実験群由来、等 の試料核酸間で、一次構造の比較を正確に行うことができる。例えば、一方の試料 核酸に対して、他方の試料核酸において標的塩基配列が増減したかを、正確に判 定することができる。
[0036] 本実施態様において、プローブが担体表面に固相化されている場合、担体として は、種々の形態のものを適用することが可能である。例えばシリコンウェハやガラスの ような 2次元基板、メンブレンフィルター、マイクロタイタープレート、種々のガラスビー ズゃ榭脂ビーズ、種々の多孔質基板、種々のゲルを適用することが可能である。ここ で、マイクロアレイを使用することが好ましい。マイクロアレイ等の担体には、複数種類 のプローブ核酸を、同一又は別個のスポット上に固相化することができる。
このとき、前記第一のハイブリッド体 (第一ハイブリッド)の形成および前記第二のハ イブリツド体 (第二ハイブリッド）の形成を、同一のマイクロアレイ上で行うことが好まし い。さらに、第一ハイブリッド及び第二ハイブリッドの形成を、同一のプローブに対し 競合的に行わせることが好ま ヽ。
[0037] 本実施態様において、第一のシグナル強度及び第二のシグナル強度の間のばら つきを補正する過程をさらに含むことが好ましい。このことは、試料核酸と合成標準核 酸の違いによるハイブリダィゼーシヨン効率の差を補正し、より正確な核酸の一次構 造の解析を行うために有利である。
[0038] 前記第一過程及び第二過程は、力イネティックアツセィにより行われることが好まし い。
力イネティックアツセィとしては、例えば、上記のハイブリダィズ反応条件を複数設定 し、かつ、シグナル強度値のデータ取得を力イネティックに行えばよい。
力イネティックなデータ取得とは、標的塩基配列とプローブとの相補性によるハイブ リツド形成反応の測定条件又は検出条件を変更しながら行うことを意味する。力イネ ティックなデータ取得は、時間に関して定点ではなぐ例えば反応溶液の温度、 pH、 及び組成力 選ばれる 1種以上の条件を変化させて、測定時間を数分間から数時間 程度の範囲内で行う。反応条件の変更は、段階的に又は連続的に行うこともできる。
ノ、イブリツド形成は通常、配列情報に基づ 、た推定の最適条件にぉ 、て行われる ものである。従ってその条件が本当に最適条件であるかはわ力 ないのが普通であ る。そのために、静的（非力イネティック）に、又は定点的に測定を行う場合には、最 適ではな!/、条件下でのデータ取得を行って 、る可能性がある。
これに対し、第一、第二過程を、力イネティックアツセィにより行い、力イネティックな データ取得を実施することにより、複数の反応条件でハイブリダィズ反応を進行させ 、それを経時的に測定することが可能となる。従って、例えば Tm値など、配列固有の 特性値が異なる複数種類のプローブが同一アレイ上に固相化されている場合であつ ても、力イネティックなデータ取得を行えば、その特性値の範囲を考慮して実験を行 い、複数種類の配列の検出をほぼ同時に正確に行うことが可能となる。
[0039] 上述の通り、 2種以上のプローブを用いる方式は、試料核酸の特定領域における 一次構造の変化を判定するために特に好適である。例えば、 2種類以上の前記プロ ーブを用い、同一のプローブに対する前記第一のハイブリッド体形成及び前記第二 のハイブリッド体形成を、各種プローブについて互いに独立に行い、各種プローブに 対する合成標準核酸及び試料核酸の結合量比を測定する過程と、全プローブにお ける結合量比の組み合わせを確認する過程をさらに有する方式を行って、特定領域 における一次構造を推定することができる。
結合量比を測定するために、第一の標識処理を施された試料核酸と、第一の標識 処理と異なる第二の標識処理を施された前記合成標準核酸と、第一の標識処理及 び第二の標識処理と異なる第三の標識処理を施された又は担体表面に固相化され たプローブとを利用することができる。
この方式を用 、て、試料核酸の一次構造が正常型 ·変異型の 、ずれであるかの判 定、及び Z又は、 2以上の試料核酸間で一次構造の差異があるかという判定を容易 に行うことができる。
変異の例としては、特定領域における塩基配列の欠損、増幅、転座、逆位、挿入等 が挙げられる。
[0040] この方式は、例えば、以下の手順で行うことができる。
まず、前記合成標準核酸および前記試料核酸を、前記プローブとハイブリダィズ反 応させ、第一のハイブリッド体および第二のハイブリッド体を形成させる。但し、この方 式では、第一、第二のハイブリッド体形成は、同一のプローブに対して競合的又は非 競合的に行わせることが必要である。
プローブの種類ごとに、第一のノ、イブリツド体に特異的な第一のシグナル強度を測 定する。そして、各プローブ種類に対応させたシグナル強度力もなる標準プロフアイ ルを作成する。同一のプローブについて、第二のハイブリッド体に特異的な第二のシ グナル強度を測定する。そして、各プローブ種類に対応させたシグナル強度力もなる 標的プロファイルを作成する。
各種プローブにおける各結合量比の組み合わせは、各種プローブにおける第一、 第二のシグナル強度比の、複数プローブに渡る組み合わせとして、間接的に確認す ることがでさる。
合成標準核酸を正常型、変異型として予め判明した構成にしておけば、標準プロ ファイルと標的プロファイルとを用いて、各プローブにおける結合量比を評価すること で、単一の試料核酸について、正常型、変異型の判定を行うことができる。また、合 成標準核酸を、組成に関らず共通に、複数の試料核酸に対して用いて検討を行い、 検討結果を互いに比較することで、試料核酸間で一次構造の差異を検出することが できる。
2種類以上のプローブを用いる方式において、 2種類以上の標的塩基配列を含む 合成標準核酸を用いることが好まし 、。
[0041] 本発明の核酸解析キットは、以上説明した本発明の核酸解析方法に用いられるこ とを特徴とする。
この核酸解析キットは、予め合成された合成核酸からなり、 1種以上の標的塩基配 列を含み、かつプールされた合成標準核酸と、該標的塩基配列に相補的な塩基配 列を有するプローブとを含む。
なお、合成標準核酸は標識処理を施され、プローブは該合成標準核酸と異なる標 識処理を施された又は担体表面に固相化されたものであることが好ましい。
また、所望に応じて、合成標準核酸に含まれる標的塩基配列を 2種以上としたり、 プローブを 2種以上としたりすることができる。
本発明に基づ!、て行った、染色体の一次構造変化 (正常型一次構造に対して)の 有無を決定する方法のモデルを示す。
実施例 1
[0042] 図 1に示すような染色体の特定の領域 A、 B、 C、 D、 E、 Fを想定した。領域 A、 B、
Cは、同一の染色体 a上に乗っており、また、 D、 E、 Fが別の染色体 b上に存在する ものと想定した。これら、特定領域の染色体の欠失や増幅による一次構造の変化を 解析した。領域 A、 B、 C、 D、 E、 Fに対応する塩基配列が、本実施例における標的 塩基配列となる。
以下、 A、 B、 C、 D、 E、 Fに対応するオリゴ DNAを用いて実験を行った。 実験ステップは、 1)マイクロアレイの作製、 2)蛍光標準サンプル (合成標準核酸） の作成、 3)蛍光標的サンプル (試料核酸)作成、 4)標準サンプルと標的サンプルの マイクロアレイに対するハイブリダィゼーシヨン、 5)データ解析、のステップ力も構成し た。
[0043] 試料として、化学合成したオリゴ DNAを用いた。 Aに対応する塩基配列を検出する プローブ (配列番号 1 2)、 Bに対応する塩基配列を検出するプローブ (配列番号 3 4)、 Cに対応する塩基配列を検出するプローブ (配列番号 5— 6)、 Dに対応する 塩基配列を検出するプローブ (配列番号 7— 8)、 Eに対応する塩基配列を検出する プローブ (配列番号 9 10)、 Fに対応する塩基配列を検出するプローブ (配列番号 11— 12)を、多孔質構造を有する基板上に図 2の配置で固相化した。図 2において 、符号 A〜Fは、図 1に示す領域 A〜Fと対応し、番号 1〜12は、配列番号 1〜12に それぞれ対応する。
[0044] これら各プローブ配列に相補的な塩基配列の^末端に Cy5標識が施されたオリゴ DNAを、化学的に各々合成した。各種の合成オリゴ DNAを各 50nM含むように 10 mM Tris-HCl pH7. 5で調整した標準溶液 (合成標準核酸溶液)を作製した。
[0045] また、各プローブ各配列に相補的な塩基配列を有し、 5'末端に Cy3の標識が施さ れたオリゴ DNAを、化学的に合成した。 A、 B、 C、 D、 E、 Fを各 50nM含むように 10 mM Tris-HCl pH7. 5で調整した標的サンプル溶液 Iを作成した。
さらに、 A、 Dを各 50nM及び B、 C、 E、 Fを各 25nM含むように 10mM Tris— H CI pH7. 5で調整した標的サンプル溶液 IIを作成した。
即ち、標的サンプル溶液 Iは、図 3のように A、 B、 Cの領域及び、 D、 E、 Fの領域に おいて、染色体構造に変化が無ぐ DNA量も正常であるモデルである。標的サンプ ル溶液 IIは、図 4のように A、 Dの領域は正常である力 B、 C、 E、 Fの領域について は、染色体上で LOH (ヘテロ接合性の消失）が生じ、 DNA量が通常の 1Z2になつ ているモデルである。
[0046] ハイブリダィゼーシヨンの分析は、ォリンパス（株）製の PAM マイクロアレイシステ ム： FD10によって行なった。この実験システムは、反応フィルターの周りの溶液駆動 と温度制御、および蛍光スポットの画像の記録を自動的に行なうことが出来るように 設計されて 、る。直径 6mmのマイクロアレイが設置された専用チャンバ一の反応部 分に、ハイブリダィゼーシヨンバッファーと混合した標準溶液と標的サンプル溶液を以 下のように加え、溶液駆動と温度変化を与え、蛍光画像を撮像した。
まず、染色体構造に変化が無ぐ DNA量も正常であるモデルの検証において、標 準溶液及び標的サンプル溶液 Iを lOulずつ、ハイブリダィゼーシヨンバッファーに 3x SSPEになるように溶解し、マイクロアレイに添加後、 50°Cで、 30回の多孔質構造を 有する核酸反応担体への出し入れ (駆動制御)を行った。
また、別のアレイで、染色体上で LOHが生じ、 DNA量が通常の 1Z2になっている モデルの検証においては、標準溶液及び標的サンプル溶液 IIを lOulずつ、ハイプリ ダイゼーシヨンバッファーに 3xSSPEになるように溶解し、マイクロアレイに添カ卩後、 5 0°Cで、 30回の多孔質構造を有する核酸反応担体への出し入れ (駆動制御）を行つ た。
これらの反応で、標準溶液及び各標的サンプル溶液と A〜Fの塩基配列を検出す る固相化プローブがハイブリダィズし、第一及び第二のハイブリッド体を形成した。
[0047] 次に、各スポットにおける Cy3と、 Cy5の各蛍光色素のシグナルを検出し、シグナル 強度データを取得し、得られた画像を蛍光強度解析用にプログラムした解析ソフトゥ エアを利用して解析した。一つのスポット内で、 2色蛍光の強度を観察することにより 、その配列の存在量を推定することができた。
以下、図 5〜7において、棒グラフの横軸はプローブ種類 (A〜Fに各々相補的なプ ローブ）、縦軸は蛍光強度を示す。
[0048] 即ち、標準溶液については、各スポットで Cy5の蛍光が図 5のように見られた。各固 相化プローブに対するハイブリダィゼーシヨン効率は、その高次構造によりばらつい ているが、標準溶液内の各オリゴ DNA量は予め設定されており、基準となる各スポッ トごとの蛍光強度が測定でき、 2つのアレイにおけるノ、イブリダィズした各スポットの蛍 光強度プロファイルは同様の形態を示した。
また、今回用いた 2つのマイクロアレイ間における、スポット固相化量のばらつきは 非常に少なぐ許容範囲内にあることが推定できた。
また、この標準溶液は、プールされているため、後で、実験結果が予想されるものと 一致しな力つた時に、標準サンプルの履歴を確認することができた。
[0049] 次に Cy3で標識した標的サンプル溶液のハイブリダィゼーシヨンシグナルを解析し た。図 6、 7において、斜線で示される棒グラフは、図 5に示した、標準溶液の検討に よる蛍光強度を示す棒グラフと同一である。
図 6のように、標的サンプル溶液 Iにおいては、標準溶液による蛍光強度との差は見 られるものの (A〜Cは標準溶液のシグナルの約 1. 3倍、 D〜Fは標準溶液のシグナ ルの約 1. 4倍）、 A〜Fにおいては標準溶液と同様なプロファイルを示し、染色体上 の構造に変化が無ぐ DNA量も正常であることが推定できた。
図 7のように標的サンプル溶液 IIにおいては、 A、 Bにおいては標準溶液と同様な プロファイルを示したが（Aは標準溶液のシグナルの約 1. 3倍、 Dは標準溶液のシグ ナルの約 1. 4倍）、 B、 C、 E、 Fの領域については、蛍光量が標準溶液のシグナルの 0. 65倍（B、 C)から 0. 7倍 (E、 F)に減少し、 DNA量が少なくなつていることが推定 できた。このように標的サンプル溶液 IIは、 A、 Dの領域は正常である力 染色体上 B 、 C、 E、 Fの領域で LOHが生じ、正常型モデルである標的サンプル溶液 Iに対して D NA量が減少して 、ることが推定できた。
実施例 2
[0050] ある PCR産物内での欠失を解析するモデルを示す。
試料として、プラスミド pUC18を制限酵素 EcoRI (TaKaRa)で切断し、配列番号 1 7の配列をライゲーシヨンによって挿入し、試料 Iを作成した。また、プラスミド pUC18 を Acclで切断し、配列番号 17を制限酵素 Acclで切断して得られる 515bp (配列番 号 17の 286番目の塩基力も 801番目の塩基で切断された DNA断片）を挿入した。 配列番号 17の配列の 356番目力も 35bpまでの配列 Gである配列番号 13及びそ の相補鎖である配列番号 14、並びに、 2550番目力も 37bpまでの配列 Hである配列 番号 15及びその相補鎖である配列番号 16を、多孔質の構造を有する基板からなる マイクロアレイ上に、図 8に示す配置で固相化した。
[0051] これら各プローブ配列に相補的な塩基配列の^末端に Cy5の標識を行ったオリゴ DNAを化学的に合成し、各種のオリゴ DNAを各 50nM含むように 10mM Tris— HC1 pH7. 5で調整した標準溶液を作成した。
[0052] また、 5'末端に Cy3ラベルした配列番号 18の M13 Primer M4と配列番号 19 の M13 Primer RVのプライマーを用いて、試料 Iのプラスミドを铸型に PCRで増 幅を行った。また、同様に試料 IIを铸型に増幅を行った。
即ち、試料 Iは、配列番号 17全体を含む試料核酸であり配列 G及び Hを持つ。一方 、試料 IIは、標的塩基配列の一部である 515bpを持ち、配列 Gをは持つが Hは持た ない。
試料 Iからの PCR産物のみを 10 μ 1用いた試料（正常型モデル試料）と、試料 Iと試料 IIの PCR産物を 5 μ 1ずつ混合した試料 (欠失型モデル試料： PCR産物内に欠失が 存在し、領域 Ηが 1,2に減少しているモデル)を作成した。
[0053] ハイブリダィゼーシヨンの分析は、ォリンパス（株）製の ΡΑΜ マイクロアレイシステ ム： FD10によって行なった。この実験システムは、反応フィルターの周りの溶液駆動 と温度制御、および蛍光スポットの画像の記録を自動的に行なうことが出来るように 設計されて 、る。直径 6mmのマイクロアレイが設置された専用チャンバ一の反応部 分に、ハイブリダィゼーシヨンバッファーと混合した標準溶液と標的サンプル溶液をカロ え、溶液駆動と温度変化を与え、蛍光画像を撮像した。
まず、染色体構造に変化が無ぐ DNA量も正常であるモデルの検証において、標 準溶液及び正常型モデル試料を lOulずつ、ハイブリダィゼーシヨンバッファーに 3x SSPEになるように溶解し、マイクロアレイに添加後、 50°Cで、 30回の多孔質構造を 有する核酸反応担体への出し入れ (駆動制御)を行った。
また、別のアレイで、欠失モデルの検証においては、標準溶液及び欠失型モデル 試料を lOulずつ、ハイブリダィゼーシヨンバッファーに 3xSSPEになるように溶解し、 マイクロアレイに添加後、 50°Cで、 30回の多孔質構造を有する核酸反応担体への 出し入れ (駆動制御)を行った。
これらの反応で、標準溶液及び各モデル試料と領域 G及び Hの塩基配列を検出す る固相化プローブがハイブリダィズし、第一及び第二のハイブリッド体を形成した。
[0054] 次に、各スポット〖こおける Cy3と、 Cy5の各蛍光色素のシグナルを検出し、得られた 画像を蛍光強度解析用にプログラムした解析ソフトウェアを利用して解析しその配列 の存在量を推定した。その結果、一つのスポット内で、 2色蛍光の強度を観察するこ とによって、その配列の存在量を推定できた。
[0055] 即ち、標準溶液は、各スポットで Cy5の蛍光が見られ、基準となる各スポットごとの 蛍光強度が測定でき、 2つのアレイにおけるハイブリダィズした各スポットの蛍光強度 プロファイルは同様の形態を示した。
[0056] 次に Cy3で標識した正常型モデル試料のハイブリダィゼーシヨンシグナルを解析し た。領域 G, Hを検出するプローブにおいては標準溶液とほぼ同様なプロファイルを 示し (標準溶液に対する蛍光強度比は Gが 2倍、 Hが 1. 5倍)、試料核酸上の構造に 変化が無ぐ DNA量も正常であることが推定できた。欠失型モデル試料においては 、領域 Gにおいては標準溶液と同様なプロファイルを示した力 領域 Hについては、 蛍光量が標準溶液の 0. 7倍に減少し、 DNA量が少なくなつていることが推定できた 。このように PCR産物によって増幅された分子内での欠失による構造変化を推定す ることがでさた。

Claims

請求の範囲
[1] 試料核酸及びプローブカゝらなる試料核酸ハイブリッドからのシグナルを検出するこ とで当該試料核酸中の 1種以上の標的塩基配列の一次構造を解析する方法であつ て、
該 1種以上の標的塩基配列を含む合成標準核酸及び該プローブカゝらなる合成標 準核酸ハイブリッドからのシグナルを検出し、該合成標準核酸ハイブリッドからのシグ ナルを基準として該試料核酸ハイブリッドからのシグナルを補正することで、該試料 核酸の一次構造を解析する方法。
[2] 前記合成標準核酸を予めプールし、同一プール力 の合成標準核酸を利用して行 う、請求項 1に記載の解析方法。
[3] 前記合成核酸は、対照用細胞から抽出された染色体から合成されていることを特 徴とする請求項 1又は 2に記載の核酸の解析方法。
[4] 前記合成核酸は、既知の塩基配列をもとに合成されていることを特徴とする請求項
1乃至 3の何れか一項に記載の核酸の解析方法。
[5] 前記合成核酸が、 2種以上の標的塩基配列を 1分子内に含むことを特徴とする請 求項 1乃至 4の何れか一項に記載の核酸の解析方法。
[6] プールされた前記合成標準核酸の核酸濃度及び品質を、予め測定しておくことを 特徴とする請求項 2乃至 5の何れか一項に記載の核酸の解析方法。
[7] 前記合成標準核酸の核酸濃度、品質、及び該合成標準核酸に特異的なシグナル 値を、データベースに登録し、該データベースを、試料核酸に特異的なシグナルの 補正及び Z又は複数の試料核酸間におけるシグナルの比較に用いる請求項 6に記 載の核酸の解析方法。
[8] 前記データベースが、解析条件、プローブの塩基配列、並びに、該条件及び該塩 基配列の組み合わせ、力 選ばれる 1以上の区分に従って設定されていることを特 徴とする請求項 7に記載の核酸の解析方法。
[9] 第一の標識処理を施された試料核酸と、第一の標識処理と異なる第二の標識処理 を施された前記合成標準核酸と、第一の標識処理及び第二の標識処理と異なる第 三の標識処理を施された又は担体表面に固相化された前記プローブとを用い、 前記試料核酸を、前記プローブに接触させて第一のハイブリッド体を形成させ、該 第一のハイブリッド体に特異的な第一のシグナル強度を測定する第一過程、 前記合成標準核酸を前記プローブに接触させて第二のハイブリッド体を形成させ、 該第二のハイブリッド体に特異的な第二のシグナル強度を測定する第二過程、及び
前記第二のシグナル強度を基準として、前記第一のシグナル強度を補正する第三 過程
を有することを特徴とする請求項 1ないし 7のいずれかに記載の核酸の解析方法。
[10] 前記担体は、マイクロアレイであることを特徴とする請求項 9に記載の核酸の解析方 法。
[11] 前記第一のハイブリッド体の形成および前記第二のハイブリッド体の形成を、同一 のマイクロアレイ上で行うことを特徴とする請求項 10に記載の核酸の解析方法。
[12] 第一のシグナル強度及び第二のシグナル強度の間のばらつきを補正する過程をさ らに含む請求項 9乃至 11の何れか一項に記載の核酸の解析方法。
[13] 前記第三過程にぉ 、て、前記第二のシグナル強度を基準として、固相化されたプ ローブ量に起因する第一のシグナル強度のばらつきを補正する請求項 9乃至 12の 何れか一項に記載の核酸の解析方法。
[14] 前記第一過程及び第二過程が、力イネティックアツセィにより行われることを特徴と する請求項 9乃至 13の何れか一項に記載の核酸の解析方法。
[15] 前記力イネティックアツセイカ 反応溶液の温度、 pH、及び組成力 選ばれる 1種 以上の条件を変化させて行われることを特徴とする請求項 14に記載の核酸の解析 方法。
[16] 第一の標識処理及び第二の標識処理において、蛍光色素を用いることを特徴とす る請求項 9乃至 15の何れか一項に記載の核酸の解析方法。
[17] 2種類以上の前記プローブを用い、
同一のプローブに対する前記第一のハイブリッド体形成及び前記第二のハイブリツ ド体形成を、各種プローブにつ 、て互いに独立に行！、、
各種プローブに対する合成標準核酸及び試料核酸の結合量比を測定する過程と 全プローブにおける結合量比の組み合わせを確認する過程をさらに有することを 特徴とする請求項 9乃至 16の何れか一項に記載の核酸の解析方法。
[18] 前記合成標準核酸が、 2種類以上の標的塩基配列を含むことを特徴とする請求項
17に記載の核酸の解析方法。
[19] 2種類以上の試料核酸に対して行われることを特徴とする請求項 1乃至 18の何れ か一項に記載の核酸の解析方法。
[20] 請求項 1乃至 19の何れか一項に記載の核酸の解析方法に用いられることを特徴と する核酸の解析キット。
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