WO2005106481A2 - Procede d'identification d'un ligand capable de moduler selectivement une cascade fonctionnelle impliquant une cible, et ses applications pour le criblage a haut-debit de molecules d'interet. - Google Patents

Procede d'identification d'un ligand capable de moduler selectivement une cascade fonctionnelle impliquant une cible, et ses applications pour le criblage a haut-debit de molecules d'interet. Download PDF

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying a ligand capable of selectively modulating a functional cascade involving a target or target molecule, as well as to its applications for high-throughput screening of molecules of interest, in particular therapeutic (drug).
  • the discovery of new drugs involves developing methods of high-throughput screening of libraries of molecules that are effective, that is to say allowing to isolate from a limited number of selected molecules ( keys or hits), molecules active in vivo on the pathology that we are trying to treat (leads or leads).
  • the functional tests in vitro in cell culture or in vivo in an appropriate animal model
  • the isolated molecules must be able to specifically modulate the property of interest of the target without affecting its other activities whose modulation could have deleterious effects for the cell.
  • screening must be highly specific in order to limit as much as possible the number of hits identified, so as to have only to test a small number in functional tests in vivo.
  • screening methods must also be easy to implement and applicable to any target.
  • screening methods based on the identification of molecules (mimotopes) mimicking the interaction between the target and a peptide or an oligonucleotide (aptamer) have been proposed. Screening methods using aptamers and / or peptides are illustrated in Lapan et al., Expert Opin. Ther. Targets, 2002, 6, 507-516; Green et al., BioTechniques, 2001, 30, 1094-1110; Burgstaller et al., Drug Discovery Today,
  • aptamers / peptides capable of binding to the target are selected in vitro and then their modulating activity, with respect to the target, is verified by a functional test in vitro in an appropriate cell system or in vivo in an appropriate animal model.
  • the aptamers / peptides having modulating activity on the target are used in competitive binding tests to identify hits capable of displacing the existing bond between the aptamer / peptide and the target.
  • the modulating activity of the keys vis-à-vis the target is verified by a functional test in vitro in cell culture or in vivo in an appropriate animal model, so as to isolate molecules "heads of series" (leads) .
  • targets such as the platelet-derived human growth factor isoform BB (PDGF BB) and the human immunodeficiency virus (NIH) Rev protein.
  • PDGF BB platelet-derived human growth factor isoform BB
  • NASH human immunodeficiency virus
  • Antibodies have the advantage of recognizing any region of a protein, specifically and with a high affinity (of the order of nM).
  • the inventors screened a library of 3000 molecules using an antibody directed against the SH2 domains of the protein tyrosine kinase Syk and capable of inhibiting the PLC ⁇ -2 pathway; among the 10 ligands of the Syk protein which they selected, at least one was an inhibitor molecule in vivo, acting on the path of PLC- ⁇ 2, without altering that of Ras also dependent on the Syk protein.
  • aptamers and peptides are capable of recognizing any epitope on the surface of an antigen.
  • peptides and aptamers are more suitable for interacting in the target cavities rather than on the surface, which is favorable for the inhibition of an enzymatic activity but not very interesting for inhibiting functional cascades.
  • a number of recombinant monoclonal antibodies are used in therapeutic treatments.
  • cetuximab anti-EGFR
  • rituximab anti-CD20
  • infliximab anti-TNF
  • the screening process proposed by the inventors makes it possible to replace these antibodies with chemical molecules having the same inhibitory properties, which are easier to produce at a very much lower cost (by at least a factor of 10).
  • the subject of the present invention is therefore a method of identifying a ligand capable of selectively modulating a functional cascade involving a target, characterized in that it comprises at least the following steps: a) identifying a antibody or an antibody fragment comprising at least one of the variable domains of an immunoglobulin chain, capable of binding to said target and of modulating said functional cascade involving said target, b) screening, from a library of molecules, ligands which modulate the binding between said target and the antibody or the antibody fragment identified in a), and c) identification from the modulating ligands obtained in b), of those capable of modulating said functional cascade.
  • a positive or negative modulation activation or inhibition, total or partial, • "target involved in a functional cascade", any molecule of a cell of an organism (human, animal, plant) or of a microorganism (virus, bacteria , fungus, parasite) which is capable of interacting with one or more ligands (or natural partners, known or unknown), each binding to a site or region distinct from said target (FIG. 2); the binding of the ligand modulates a functional cascade involved in a physiological or pathological process of said cell or of said microorganism and results in a measurable biological activity in said cell or said microorganism.
  • target involved in a functional cascade any molecule of a cell of an organism (human, animal, plant) or of a microorganism (virus, bacteria , fungus, parasite) which is capable of interacting with one or more ligands (or natural partners, known or unknown), each binding to a site or region distinct from said target (FIG. 2); the binding of the ligand
  • Said target can be in particular: a protein, a peptide, a polynucleotide (DNA, RNA), a lipid, a sugar or a derivative of the above (glycoprotein, glycolipid ).
  • FIG. 3 illustrates the example of the protein tyrosine kinase (PTK) Syk which is a multifunctional protein involved inter alia in two activation cascades: the first (cascade 1) which leads to the activation of the Ras protein then of the MAPK, is involved in the growth and differentiation of certain cells of the lymphoid line including B cells, mast cells, basophils and a subpopulation of T cells (first biological activity), and the second (cascade 2) which leads to activation of PTK Btk, phospholipase C- ⁇ 2 (PLC ⁇ 2) and increased intracellular calcium flow, results in degranulation and the release of allergic mediators by mast cells (second biological activity).
  • PTK protein tyrosine kinase
  • cascade 2 which has applications in the prevention and / or treatment of allergies, while cascade 1 should not be inhibited as it could result in harmful side effects for cells (tumor aggressiveness; Coopman et al., Nature, 2000, 406, 742-747).
  • molecule bank or chemistry library.
  • a set of molecules other than antibodies or fragments of antibodies related by their structure, their origin or their function, in particular a combinatorial library including molecules which differ from one another by the systematic or random replacement of their elementary constituents, for example a bank of oligomers such as peptides, oligonucleotides (aptameres) and oligosaccharides or else a bank of organic molecules other than oligomers, cyclic or non-cyclic, in particular small organic molecules, that is to say of mass molecular less than 2500 Da, preferably less than 2000 Da, more preferably less than 1500 Da, more preferably less than 1000 Da, even more preferably less than 750 Da.
  • oligomers such as peptides, oligonucleotides (aptameres) and oligosaccharides
  • organic molecules other than oligomers cyclic or non-cyclic, in particular small organic molecules, that is to say of mass molecular less than 2500 Da, preferably less than 2000 Da, more
  • antibody fragment a fragment capable of binding to a target, comprising at least the variable domain of a heavy chain (NH) and / or the variable domain of a light chain (NL) of an immunoglobulin standard, or the variable domain of a single chain immunoglobulin, such as the Fab, Fv, scFv or NHH fragments.
  • antibody or antibody fragment capable of binding to said target and of modulating a functional cascade involving said target an antibody or an antibody fragment capable of binding to said target and of mimicking the in vivo interaction of said target with its ligand (natural partner), at the site of interest; the target epitope recognized by said antibody or antibody fragment is partially or totally overlapping with the site of interest of said target (FIG. 2B).
  • step b) The screening of the bank of molecules [step b)] or of a bank of antibodies or of antibody fragments [step a) of identification of the antibodies or antibody fragments capable of binding to the target] are produced by any method known to those skilled in the art allowing the measurement of the interaction between two partners (ELISA, energy transfer by resonance (FRET), fluorescence polarization , surface plasmon resonance).
  • Steps a) and b) are carried out using a target or a derivative of the target such as a fragment comprising at least the site of interest, a mimotope, or alternatively an anti-idiotypic antibody representing the internal image of said target site of interest.
  • Said target and its derivatives or the antibody or the antibody fragment are optionally immobilized on an appropriate support, and / or labeled by any means allowing a measurable signal to be obtained, known to those skilled in the art.
  • the identification of ligands or of antibodies or antibody fragments capable of selectively modulating a functional cascade involving said target is carried out by a functional test making it possible to measure the biological activity resulting from said functional cascade. It is, in particular an in vitro test, in an appropriate cellular system or in vivo, in an appropriate organism.
  • the cells in culture can be immortalized or in primary culture, adherent or in suspension.
  • the living organism can be any organism or microorganism of laboratory or study (animal (rodents, rabbits, pigs, cattle, sheep ...) or transgenic or non-transgenic plant, parasite, ..).
  • animal rodents, rabbits, pigs, cattle, sheep
  • transgenic or non-transgenic plant parasite, ..
  • the cellular systems and appropriate organisms there may be mentioned in particular those which are models of the physiological or pathological process involving said functional cascade, such as, without limitation, models of diabetes, allergy, arthritis or asthma.
  • the identification of antibodies or antibody fragments capable of modulating a functional cascade involving said target is carried out in cells modified by an expression vector for said antibodies or their fragments (antibodies or fragments of intracellular antibodies).
  • the functional test involved in this verification in vitro, in a cellular system or in vivo in an appropriate organism depends on the biological activity which one seeks to modulate for a therapeutic or non-therapeutic aim.
  • biological activity measurable in cells there may be mentioned in particular: division, migration, degranulation, transport to across membranes, differentiation, apoptosis, replication, transcription and the production of factors such as cytokines.
  • the functional tests making it possible to measure said biological activity in vitro or in vivo are known to a person skilled in the art.
  • the identification of said antibody or antibody fragment in a) is carried out by screening a bank of antibodies or antibody fragments, preferably a bank of scFv fragments, preferably, a phage library expressing scFv fragments on their surface.
  • the identification of said antibody can comprise: - a first step of screening for antibodies or antibody fragments capable of binding to said target, in particular in phage-ELISA and - a second step of identification of antibodies or antibody fragments capable of modulating said functional cascade, in particular in cells modified by an expression vector for said antibodies or antibody fragments (antibody or intracellular antibody fragments).
  • the antibodies or the antibody fragments, in particular the scFv fragments selected during the screening step can then be cloned in an appropriate vector and expressed in cells, in particular eukaryotic cells such as mammalian cells modified by the recombinant vector thus obtained.
  • eukaryotic cells such as mammalian cells modified by the recombinant vector thus obtained.
  • Such antibodies or fragments of antibodies called intracellular antibodies (Cattaneo et al., Trends in Biotechnology, 1999, 17, 115-121), are expressed in functional form, capable of binding the target in the compartment of the modified cells in which it is expressed (nucleus, cytoplasm, secretory compartment).
  • mutations can be introduced into the sequence of antibodies or selected antibody fragments, so as to improve their solubility and / or their conformation in cells, in particular in eukaryotes.
  • mutations that may be envisaged, mention may be made in particular of the point mutations described in Hurle et al., PNAS USA, 1994, 91, 5446-5450 and Martineau et al., J. Mol. Biol., 1998, 280, 117-127.
  • antibodies or antibody fragments with increased stability and / or affinity can be selected by a additional phenotypic selection step, as described in Cattaneo et al., cited above.
  • step b) of screening comprises: contacting the bank of molecules to be tested with the target or one of its derivatives as defined above, - the addition of the antibody or of the fragment of antibody, optionally labeled, and - the measurement, by any appropriate means, of the relative quantity of antibody bound to the target, in the presence or in the absence of said library of molecules.
  • step b) of screening is carried out by a binding test of said target, in competition with said antibody or said antibody fragment, so as to isolate ligands from said target which displace said antibody or antibody fragment from the target / antibody complex or antibody fragment.
  • An example of this embodiment includes: - bringing the antibody or antibody fragment, optionally labeled, into contact with the target or one of its derivatives as defined above, - addition of the library of molecules to be tested so as to detect the molecules capable of displacing the antibody or the antibody fragment from its complex with the target fragment, and - measuring, by any suitable means, the relative quantity of antibody bound to the target, in the presence or in the absence of said library of molecules.
  • Another example of this mode of implementation comprises: the mixing of the antibody or of the antibody fragment, optionally labeled, with the library of molecules to be tested, - bringing the mixture into contact with the target or one of its derivatives as defined above, and - measuring, by any suitable means, the relative amount of antibody bound to the target, in the presence or in the absence of said bank of molecules.
  • the capacity of a molecule to modulate the binding between the target and the antibody is determined by comparing the value of the binding signal of the antibody, in the presence or in the absence of each of the molecules of the library, tested separately.
  • steps a) and c) are carried out by a functional test making it possible to measure the biological activity resulting from said functional cascade, in particular by an in vitro test, in an appropriate cell system or in vivo, in an appropriate organism.
  • said target is selected from: an enzyme, a receptor, an adapter protein, a transporter, a chaperone protein, a regulatory protein.
  • enzymes such as tyrosine kinase proteins such as the Syk protein; cytokine receptors such as the IL-13, EGF or TNF receptor, adapter proteins such as SLP-76 and E6-AP; chaperone proteins such as HSP70 and HSP60; regulatory proteins such as NF- ⁇ B, I- ⁇ B, Akt, PSAT-1, p53, p73 and the Bcl2 family.
  • said antibody or antibody fragment in a) is directed against the SH2 domains of the Syk protein and it is capable of inhibiting the PLC ⁇ -2 pathway.
  • said bank of molecules in b) is a bank of small organic molecules.
  • the present invention also relates to a kit for implementing the method as defined above, characterized in that it comprises at least: a target involved in a functional cascade, a fragment of said target comprising at least the site of interest, a mimotope of said target, or alternatively an anti-idiotypic antibody representing the internal image of said site of interest of the target as defined above, - an antibody or an antibody fragment comprising at least one of the variable domains of an immunoglobulin chain, capable of binding to said target and of modulating said functional cascade involving said target or a bank of antibodies or antibody fragments, as defined above, and - a bank of molecules to be tested, as defined above.
  • the method according to the invention can be used to screen any type of molecule of therapeutic or non-therapeutic interest, capable of acting on a physiological or pathological process of any type of cell or microorganism such as defined above. It can be used to screen new families of molecules with new properties of therapeutic or non-therapeutic interest or derivatives of these molecules with specific activity and / or improved therapeutic index.
  • the banks of molecules are prepared according to conventional methods of combinatorial chemical synthesis, known to those skilled in the art.
  • the antibody or the antibody fragment as defined above are prepared by standard techniques known to those skilled in the art, such as those described in Antibodies: A Laboratory Manual, E. Howell and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
  • the monoclonal antibodies are produced from hybridomas obtained by fusion between B lymphocytes of an immunized animal and myelomas, according to the technique of Kohler and Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497); the hybridomas are cultivated in vitro, in particular in fermenters or produced in vivo, in the form of ascites; alternatively, said monoclonal antibodies are produced by genetic engineering as described in Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display Methods and Protocols, P.M. O'Brien and R. Aitken. Humana Press, Vol. 178, 2002.
  • suitable animals are repeatedly immunized with the target or one of its fragments, according to a standard protocol comprising a first immunization by intraperitoneal injection of the antigen in an equivalent volume of complete Freund's adjuvant then a second immunization (booster) 15 days later under identical conditions but this time with incomplete Freund's adjuvant.
  • the monoclonal antibodies are produced according to a standard protocol comprising the sacrifice of the animals two weeks after the last booster, the removal of the spleen, the suspension of the spleen lymphocytes and the fusion of these lymphocytes with the murine cell line SP2 / 0 which does not produces no murine antibody, which is immortalized, and has all the machinery necessary for the secretion of immunoglobulins.
  • the antibody banks are either natural banks produced from the V regions H and N
  • the specific antibodies of the target are isolated by screening of the banks as defined above, in particular of the phage banks; after several selection steps, the phages which express the target-specific antibody fragments are isolated and the cDNAs corresponding to said fragments are expressed in an appropriate expression system, by conventional techniques of cloning and DNA expression recombinant.
  • said cDNAs are cloned both into a prokaryotic and eukaryotic expression vector, in the form of a fusion protein comprising at least at its end -NH 2 or COOH, a label for the detection of said antibody fragment, for example an epitope (c-myc, HA).
  • Said fusion protein may optionally include, at one end, a label for the purification of the antibody fragment, for example a polyhistidine sequence for purification on a nickel-agarose column.
  • Said eukaryotic expression vector contains, in addition to the appropriate transcription / translation regulatory elements (promoter, enhancer, Kozak consensus sequence, polyadenylation signal .7) under the control of which are inserted the coding sequences as defined above, the elements essential for the expression of said fragments in the appropriate cell compartment as defined above, in particular in the cytoplasm, and optionally a selection marker (gene for resistance to an antibiotic, etc.) for the selection of cell lines, in particular eukaryotes, modified in a stable manner by said expression vector and producing intracellular antibodies.
  • the monoclonal antibodies or their fragments as defined above are purified by conventional techniques known to those skilled in the art, in particular by affinity chromatography.
  • the target or the fragment comprising the site of interest can be either purified from tissues or cells, by standard techniques known to those skilled in the art, or produced by standard recombinant DNA techniques known from A person skilled in the art, following standard protocols such as those described in particular in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. A USUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA).
  • the polynucleotide encoding said protein or said fragment is cloned into an expression vector (plasmid, virus, etc.) in which said polynucleotide is placed under the control of regulatory elements for appropriate transcription and translation.
  • said vector can comprise sequences (labels or tags) fused in phase with the 5 ′ and / or 3 ′ end of said polynucleotide, useful for the immobilization, and / or the detection and / or purification of the protein.
  • expressed from said vector said protein is then expressed in appropriate host cells (bacteria, yeasts, insect or mammalian cells) and optionally purified.
  • appropriate host cells bacteria, yeasts, insect or mammalian cells
  • the fragment comprising the site of interest is synthesized in solid phase, according to the method originally described by Merrifield et al. (J Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149-).
  • the labeling of the target, of the antibody or of its fragment and the detection of the antibody / target and ligand / target bond are carried out by the conventional techniques known to those skilled in the art: (i) by fusion of the sequence coding with the sequence of an epitope (c-myc, HA), (ii) by coupling with an appropriate marker such as a fluorophore, an enzyme (alkaline phosphatase, peroxidase), an isotope radioactive, or biotin, (iii) by a labeled secondary antibody or by any specific interaction with an appropriate marker.
  • an appropriate marker such as a fluorophore, an enzyme (alkaline phosphatase, peroxidase), an isotope radioactive, or biotin
  • the antibody / target and ligand / target bond is detected by fluorescence transfer between two complementary fluorescent proteins (Philipps et al., J.
  • two complementary fluorophores fluorescein / teramethylrhodamine
  • said target or said fragment comprise an acceptor or donor fluorophore respectively at their NH end 2 and / or COOH
  • the antibody or the antibody fragment comprise the complementary fluorophore at their NH and / or COOH end.
  • the method according to the invention has the following advantages: • it makes it possible to identify new molecules which act selectively and specifically on a pathophysiological process, potentially usable as a drug, by the combination of two screening steps: - a screening step by a binding test, easily automatable and adaptable to broadband, molecules which mimic the interaction of a target with an antibody or an antibody fragment (idiotypic approach) and are therefore capable of modulating the functional cascade involving said target, and - a step of low-throughput screening, by a functional test in cell culture or in an appropriate animal model, of molecules capable of modulating the functional cascade involving said target, in particular by measuring the biological activity resulting from said cascade.
  • the results obtained from a library of 3000 molecules show that the efficiency of the first step of screening with the anti-Syk antibody is such that the second step of functional screening on a limited number of molecules (10 molecules), makes it possible to isolate at least one inhibitory molecule active in vivo on the selected functional cascade.
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of screening for molecules capable of selectively modulating the degranulation of mast cells, using a scFv fragment directed against the SH2 domains of the Syk target, of the PTK family (protein tyrosine kinase), as well as in the appended drawings in which: - Figure 1 is a schematic representation of the process according to the invention, - Figure 2 is a schematic representation of a target and the functional cascade in which it is involved, - FIG. 3 is a schematic representation of the activation cascades involving the protein tyrosine kinase Syk and the resulting biological activities, - FIG.
  • FIG. 4 illustrates validation of the method according to the invention using the Syk protein as target and the scFv G4G11 fragment as antibody for the screening of a chemo library.
  • the ten molecules resulting from the ELISA screening at least one of them strongly inhibits the release of inflammation mediators in the beta-hexosaminidase release test: at the concentration of 3 ⁇ M the drug inhibits 93% the degranulation induced by IgE but not that induced by ionomycin, - Figure 5 illustrates the comparison of the biological effects of the drug with the inhibition observed with scFv.
  • Lysates of non-activated (NA) and activated (A) RBL-2H3 cells in the presence of the molecule selected in ELISA (drug) at a final concentration of 1.5 to 12 ⁇ M (a and b) or 3 ⁇ M ( c and d) or in the absence of this molecule, were analyzed by: a and b: immunoblot using an anti-phosphotyrosine 4G10 antibody (a), an anti-phosphoMAPK antibody (bl) or an anti-MAPK antibody (b2); c and d: immunoprecipitation using an anti-Syk (c) or anti-PLC- ⁇ 2 (d) antibody then immunoblot using the same antibody used as control, or the anti-phosphotyrosine 4G10 antibody .
  • the Syk protein is a multifunctional protein tyrosine kinase which plays an important role in the activation of certain cells of the lymphoid line, including B lymphocytes, mast cells and basophils, and a subpopulation of T lymphocytes.
  • the mast cell line following recognition by the IgE receptor (Fc ⁇ RI), of IgE associated with an allergen, results in the release of allergic mediators such as histamine and serotonin.
  • the aggregation of the Fc ⁇ RI receptor rapidly leads to the phosphorylation of the Syk protein and its activation.
  • Syk thus activated in turn phosphorylates its cytoplasmic substrates including the protein tyrosine kinase Btk and phospholipase C- ⁇ 2 (PLC- ⁇ 2), both involved in the activation cascade which results in the degranulation of mast cells and the release of allergic mediators ( PLC ⁇ -2 pathway; Figure 3).
  • the Syk protein intervenes in a second path (FIG. 3) which leads to the activation of the Ras protein and then of the MAP kinase (MAPK).
  • the secondary antibody is the monoclonal antibody 9E10 directed against the c-myc epitope (EQKLISEEDLN), coupled to peroxidase (Munro et al., Cell, 1986, 46, 291-300).
  • the bank of molecules to be tested is a bank of 3000 small organic molecules (ChemBridge Corporation; http://chembridge.com). All dilutions and incubations were carried out in 0.1% PBS / Tween 20 / 0.1% BSA buffer. The washes were carried out in a 0.1% PBS / Tween 20 buffer.
  • the substrate is tetramethylbenzidine dihydrochloride 0.1 mg / ml in a phosphate citrate buffer pH 5, supplemented with H O 2 (0.03%).
  • the scFv fragment was then added at a concentration of 150 nM in a volume of 50 ⁇ l and the plates were incubated for 1 hour at room temperature. After a new wash, 50 ⁇ l of secondary antibody labeled with peroxidase were added and the plates were incubated for 30 minutes at room temperature. After a final wash, the peroxidase reaction substrate was added in a volume of 100 ⁇ l, then the plates were incubated for 5 minutes and the reaction was stopped by adding 50 ⁇ l of H 2 SO 4 2N. The optical density at 450 mm was then measured using an automatic reader for ELISA plate.
  • the RBL-2H3 cells (basophilic rat leukemia line) are seeded in a 96-well plate at the rate of 2.10 5 cells / well. They are sensitized in the presence of an anti-DNP IgE monoclonal antibody, overnight at 37 ° C. The cells are then incubated for 2 hours at 37 ° C., in the presence of different concentrations of the molecule selected by ELISA, then they are activated by the DNP-BSA antigen, 3 minutes at 37 ° C. The culture supernatant is then harvested and stored at 4 ° C (SI). Adherent cells are lysed in the presence of a lysis buffer containing 0.1% Triton X-100 and protease inhibitors.
  • Cell lysates are also harvested and stored at 4 ° C (S2).
  • S2 the solutions S1 and S2 are incubated with the substrate of the enzyme: 4-nitrophenyl-2-deoxy- ⁇ -D-glucopyranoside, for 1 h 30 at 37 ° C.
  • the enzymatic reaction is stopped by adding a glycine solution pH 3 and the optical density is read at 405 nm.
  • the quantity of ⁇ -hexosaminidase released corresponds to: Hex Sl x 100 (Hex Sl + Hex S2)
  • a degranulation test with a calcium ionophore (ionomycin) was carried out as a control.
  • mice Verification of the modulating power of the selected molecules, in vivo, in mice.
  • mice BALB / c mice receiving no drugs and making it possible to measure the maximum anaphylactic shock (positive control).
  • the effect of the molecule on anaphylactic shock was then determined by measuring the release of Evans blue, by extravasation. To do this, the mice were sacrificed, then their ears were cut off. Equal surfaces of the ears were removed, using a cookie cutter, then they were chopped, and put in a solution of formamide, overnight at 55 ° C. The following day, the release of Evans blue in the formamide solution was determined by measuring the optical density at 610 nm. The results show a 70% reduction in the extravasation of Evans blue in the mice having received the active molecule in the mast cell degranulation inhibition test (FIG. 4), compared to the control mice receiving no molecule. or an inactive molecule. These results demonstrate the capacity of the molecule selected by the screening method according to the invention, to protect an animal from anaphylactic shock.

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Abstract

Procédé d'identification d'un ligand capable de moduler sélectivement une cascade fonctionnelle impliquant une molécule-cible ou cible, ainsi que ses applications pour le criblage à haut-débit de molécules d'intérêt, notamment thérapeutique (médicament). Ledit procédé comprend au moins les étapes suivantes : a) l'identification d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps comprenant au moins l'un des domaines variables d'une chaîne d'immunoglobuline, capable de se lier à ladite cible et de moduler ladite cascade fonctionnelle impliquant ladite cible, b) le criblage à partir d'une banque de molécules, des ligands modulateurs de la liaison entre ladite cible et l'anticorps ou le fragment d'anticorps identifié en a) , et c) l'identification à partir des ligands modulateurs obtenus en b), de ceux capables de moduler ladite cascade fonctionnelle.

Description

PROCEDE D'IDENTIFICATION D'UN LIGAND CAPABLE DE MODULER SELECTIVEMENT UNE CASCADE FONCTIONNELLE IMPLIQUANT UNE CIBLE, ET SES APPLICATIONS POUR LE CRIBLAGE A HAUT-DEBIT DE MOLECULES D'INTERET. La présente invention est relative à un procédé d'identification d'un ligand capable de moduler sélectivement une cascade fonctionnelle impliquant une molécule-cible ou cible, ainsi qu'à ses applications pour le criblage à haut-débit de molécules d'intérêt, notamment thérapeutique (médicament). Les avancées récentes dans le domaine de la génomique et de la protéomique, qui ont conduit à l'identification d'un nombre considérable de nouvelles cibles thérapeutique potentielles, ont ouvert des perspectives très intéressantes dans le domaine pharmaceutique. Toutefois, la découverte de nouveaux médicaments implique de mettre au point des méthodes de criblage à haut-débit de banques de molécules qui soient efficaces, c'est-à-dire permettant d'isoler à partir d'un nombre restreint de molécules sélectionnées (touches ou hits), des molécules actives in vivo sur la pathologie que l'on cherche à traiter (têtes de série ou leads). En effet, les tests fonctionnels (in vitro en culture cellulaire ou in vivo dans un modèle animal approprié) qui permettent de vérifier l'activité des touches sélectionnées lors du criblage ne sont généralement pas adaptables au haut-débit. La plupart des protéines eucaryotes étant multi-fonctionnelles et impliquées dans plusieurs cascades fonctionnelles, les molécules isolées doivent être capables de moduler spécifiquement la propriété d'intérêt de la cible sans affecter ses autres activités dont la modulation pourrait avoir des effets délétères pour la cellule. En conséquence, le criblage doit être hautement spécifique pour restreindre au maximum le nombre de touches (hits) identifiées, de façon à n'avoir qu'à en tester un faible nombre dans des tests fonctionnels in vivo. Ces méthodes de criblage doivent en outre être faciles à mettre en œuvre et applicables à toute cible. Dans ce but, des méthodes de criblage reposant sur l'identification de molécules (mimotopes) mimant l'interaction entre la cible et un peptide ou un oligo- nucléotide (aptamère) ont été proposées. Les méthodes de criblage utilisant des aptameres et/ou des peptides sont illustrées dans Lapan et al., Expert Opin. Ther. Targets, 2002, 6, 507-516 ; Green et al., BioTechniques, 2001, 30, 1094-1110 ; Burgstaller et al., Drug Discovery Today,
2002, 7, 1221-1228 ; Demandes Internationales PCT WO 98/19162 et WO 03/059943 et Brevet américain US 6,329,145. Dans un premier temps, des aptamères/peptides capables de se lier à la cible sont sélectionnés in vitro puis leur activité modulatrice, vis-à-vis de la cible est vérifiée par un test fonctionnel in vitro dans un système cellulaire approprié ou in vivo dans un modèle animal approprié. Dans un deuxième temps, les aptamères/peptides possédant une activité modulatrice sur la cible sont utilisés dans des tests de liaison compétitive pour identifier des touches (hits) capables de déplacer la liaison existante entre l'aptamère/peptide et la cible. Ensuite, l'activité modulatrice des touches vis-à-vis de la cible est vérifiée par un test fonctionnel in vitro en culture cellulaire ou in vivo dans un modèle animal approprié, de façon à isoler des molécules "têtes de série" (leads). Ces méthodes ont été validées avec des cibles telles que l 'isoforme BB du facteur de croissance humain dérivé des plaquettes (PDGF BB) et la protéine Rev du virus de l'immunodéficience humaine (NIH). Les Inventeurs se sont donné pour but, la mise au point de méthodes de criblage alternatives. Ils ont montré que la substitution des aptameres ou des peptides modulateurs par des anticorps ou des fragments d'anticorps modulateurs, dans les méthodes de criblage telles que décrites dans l'art antérieur, permettait d'identifier des molécules capables de moduler sélectivement une cascade fonctionnelle impliquant une cible (cascade métabolique, cascade d'activation, cascade de signalisation...). Les anticorps présentent l'avantage de reconnaître n'importe quelle région d'une protéine, de manière spécifique et avec une affinité élevée (de l'ordre du nM). En particulier, ils peuvent reconnaître les sites de surface de cette protéine et sont donc très intéressants pour inhiber spécifiquement les régions de protéines impliquées dans des cascades fonctionnelles via des interactions protéine-protéine ; il a notamment été montré que des fragments d'anticorps (scFv) dirigés contre les domaines SH2 de la protéine tyrosine inase Syk, étaient capables d'inhiber spécifiquement in vivo, la voie de la phospholipase C-γ2 (PLC-γ2 ; Dauvillliers et al., J. Immunol., 2002, 169, 2274-2283). En conséquence, les mimotopes isolés par un procédé de criblage mettant en œuvre des anticorps ou des fragments d'anticorps devraient présenter les mêmes propriétés, notamment en terme affinité/spécificité pour la cible. Par exemple, les Inventeurs ont criblé une banque de 3000 molécules à l'aide d'un anticorps dirigé contre les domaines SH2 de la protéine tyrosine kinase Syk et capable d'inhiber la voie de la PLCγ-2 ; parmi les 10 ligands de la protéine Syk qu'ils ont sélectionnés, l'un au moins était une molécule inhibitrice in vivo, agissant sur la voie de la PLC-γ2, sans altérer celle de Ras également dépendante de la protéine Syk. Au contraire, il n'a pas été démontré que des aptameres et des peptides étaient capables de reconnaître tout épitope en surface d'un antigène. De part leur petite taille, les peptides et les aptameres, sont plus adaptés pour interagir dans les cavités des cibles plutôt qu'en surface, ce qui est favorable à l'inhibition d'une activité enzymatique mais peu intéressant pour inhiber des cascades fonctionnelles. Par ailleurs, un certain nombre d'anticorps monoclonaux recombinants sont utilisés dans les traitements thérapeutiques. On peut citer par exemple, le cétuximab (anti-EGFR), le rituximab (anti-CD20), l'infliximab (anti-TNF)... Ces anticorps sont, soit des anticorps chimériques, le plus souvent souris/humain, soit des anticorps humanisés. Ces anticorps sont difficiles à produire et présentent un coût élevé. Le procédé de criblage proposé par les Inventeurs permet de substituer ces anticorps par des molécules chimiques ayant les mêmes propriétés inhibitrices, plus faciles à produire à un coût très largement inférieur (d'au moins un facteur 10). La présente invention a en conséquence pour objet, un procédé d'identification d'un ligand capable de moduler sélectivement une cascade fonctionnelle impliquant une cible, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) l'identification d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps comprenant au moins l'un des domaines variables d'une chaîne d'immunoglobuline, capable de se lier à ladite cible et de moduler ladite cascade fonctionnelle impliquant ladite cible, b) le criblage à partir d'une banque de molécules, des ligands modulateurs de la liaison entre ladite cible et l'anticorps ou le fragment d'anticorps identifié en a) , et c) l'identification à partir des ligands modulateurs obtenus en b), de ceux capables de moduler ladite cascade fonctionnelle. Les étapes du procédé selon l'invention, telles que définies ci -dessus sont schématisées dans la figure 1. Définitions On entend par : • « cascade fonctionnelle », une voie métabolique, une voie de signalisation ou une cascade d'activation impliquant une succession de réactions (réactions enzymatiques, interactions moléculaires, changements de conformation, modifications chimiques) dans une cellule, chacune des réactions étant dépendante des précédentes et aboutissant à une activité biologique mesurable dans ladite cellule, • « modulation ». une modulation positive ou négative : activation ou inhibition, totale ou partielle, • « cible impliquée dans une cascade fonctionnelle», toute molécule d'une cellule d'un organisme (humain, animal, végétal) ou d'un microorganisme (virus, bactérie, champignon, parasite) qui est capable d'interagir avec un ou plusieurs ligands (ou partenaires naturels, connus ou inconnus), chacun se liant à un site ou région distinct de ladite cible (figure 2) ; la liaison du ligand module une cascade fonctionnelle impliquée dans un processus physiologique ou pathologique de ladite cellule ou dudit microorganisme et résulte en une activité biologique mesurable dans ladite cellule ou ledit microorganisme. Ladite cible peut être notamment : une protéine, un peptide, un polynucléotide (ADN, ARN), un lipide, un sucre ou un dérivé des précédents (glycoprotéine, glycolipide...). La figure 3 illustre l'exemple de la protéine tyrosine kinase (PTK) Syk qui est une protéine multifonctionnelle impliquée entre autre dans deux cascades d'activation : la première (cascade 1) qui conduit à l' activation de la protéine Ras puis de la MAPK, intervient dans la croissance et la différenciation de certaines cellules de la lignée lymphoïde dont les lymphocytes B, les mastocytes, les basophiles et une sous-population de lymphocytes T (première activité biologique), et la seconde (cascade 2) qui conduit à l'activation de la PTK Btk, de la phospholipase C-γ2 (PLCγ2) et à l'augmentation du flux de calcium intracellulaire, résulte en la dégranulation et la libération de médiateurs allergiques par les mastocytes (seconde activité biologique). La cascade fonctionnelle que l'on cherche à inhiber sélectivement est la cascade 2 qui a des applications dans la prévention et/ou le traitement des allergies, alors que la cascade 1 ne doit pas être inhibée car elle pourrait résulter en des effets secondaires néfastes pour les cellules (agressivité des tumeurs ; Coopman et al., Nature, 2000, 406, 742-747). - « banque de molécules » ou chimiothèque. un ensemble de molécules autres que des anticorps ou des fragments d'anticorps, apparentées par leur structure, leur origine ou leur fonction, notamment une banque combinatoire incluant des molécules qui diffèrent entre elles par le remplacement systématique ou aléatoire de leurs constituants élémentaires, par exemple une banque d Oligomères tels que des peptides, des oligonucléotides (aptameres) et des oligosaccharides ou bien une banque de molécules organiques autres que des oligomères, cycliques ou non-cycliques, notamment des petites molécules organiques, c'est-à-dire de masse moléculaire inférieure à 2500 Da, de préférence inférieure à 2000 Da, de manière préférée inférieure à 1500 Da, de manière plus préférée inférieure à 1000 Da, de manière encore plus préférée inférieure à 750 Da. - "fragment d'anticorps", un fragment capable de se lier à une cible, comportant au moins le domaine variable d'une chaîne lourde (NH) et/ou le domaine variable d'une chaîne légère (NL) d'une immunoglobuline classique, ou bien le domaine variable d'une immunoglobuline à chaîne unique, tel que les fragments Fab, Fv, scFv ou NHH. - « anticorps ou fragment d'anticorps capable de se lier à ladite cible et de moduler une cascade fonctionnelle impliquant ladite cible », un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à ladite cible et de mimer l'interaction in vivo de ladite cible avec son ligand (partenaire naturel), au niveau du site d'intérêt ; l'épitope de la cible reconnu par ledit anticorps ou fragment d'anticorps est partielle- ment ou totalement chevauchant avec le site d'intérêt de ladite cible (figure 2B). Le criblage de la banque de molécules [étape b)] ou d'une banque d'anticorps ou de fragments d'anticorps [étape a) d'identification des anticorps ou fragments d'anticorps capables de se lier à la cible] sont réalisées par toute méthode connue de l'Homme du métier permettant la mesure de l'interaction entre deux partenaires (ELISA, transfert d'énergie par résonance (FRET), polarisation de fluorescence, résonance plasmonique de surface). Les étapes a) et b) sont réalisées à l'aide d'une cible ou d'un dérivé de la cible tel qu'un fragment comprenant au moins le site d'intérêt, un mimotope, ou bien encore un anticorps anti-idiotypique représentant l'image interne dudit site d'intérêt de la cible. La dite cible et ses dérivés ou bien l'anticorps ou le fragment d'anticorps sont éventuellement, immobilisés sur un support approprié, et/ou marqués par tout moyen permettant l'obtention d'un signal mesurable, connus de l'Homme du métier. L'identification des ligands ou bien des anticorps ou fragments d'anticorps capables de moduler sélectivement une cascade fonctionnelle impliquant ladite cible est réalisée par un test fonctionnel permettant de mesurer l'activité biologique résultant de ladite cascade fonctionnelle. Il s'agit, notamment d'un test in vitro, dans un système cellulaire approprié ou in vivo, chez un organisme approprié. Les cellules en culture peuvent être immortalisées ou en culture primaire, adhérentes ou en suspension. L'organisme vivant peut être n'importe quel organisme ou microorganisme de laboratoire ou d'étude (animal (rongeurs, lapins, porcs, bovins, ovins...) ou plante transgénique ou non-transgénique, parasite,..). Parmi les systèmes cellulaires et les organismes appropriés, on peut citer notamment ceux qui sont des modèles du processus physiologique ou pathologique impliquant ladite cascade fonctionnelle, tels que de façon non-limitative, des modèles du diabète, de l'allergie, de l'arthrite ou de l'asthme. Avantageusement, l'identification des anticorps ou fragments d'anticorps capables de moduler une cascade fonctionnelle impliquant ladite cible est réalisée dans des cellules modifiées par un vecteur d'expression desdits anticorps ou de leurs fragments (anticorps ou fragments d'anticorps intracellulaires). Le test fonctionnel mis en jeu dans cette vérification in vitro, dans un système cellulaire ou in vivo dans un organisme approprié, dépend de l'activité bio- logique que l'on cherche à moduler dans un but thérapeutique ou non-thérapeutique. A titre d'exemple non-limitatif d'activité biologique mesurable dans des cellules, on peut citer notamment : la division, la migration, la dégranulation, le transport au travers de membranes, la différenciation, l'apoptose, la réplication, la transcription et la production de facteurs comme des cytokines. Les tests fonctionnels permettant de mesurer ladite activité biologique in vitro ou in vivo sont connus de l'Homme du métier. Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, l'identification dudit anticorps ou fragment d'anticorps en a) est réalisée par criblage d'une banque d'anticorps ou de fragments d'anticorps, de préférence une banque de fragments scFv, de manière préférée, une banque de phages exprimant des fragments scFv à leur surface. L'identification dudit anticorps peut comprendre : - une première étape de criblage des anticorps ou des fragments d'anticorps capables de se lier à ladite cible, notamment en phage-ELISA et - une seconde étape d'identification des anticorps ou fragments d'anticorps capables de moduler ladite cascade fonctionnelle, en particulier dans des cellules modifiées par un vecteur d'expression desdits anticorps ou fragments d'anticorps (anticorps ou fragments d'anticorps intracellulaires). De manière plus précise, les anticorps ou les fragments d'anticorps, notamment les fragments scFv sélectionnés lors de l'étape de criblage peuvent ensuite être clones dans un vecteur approprié et exprimés dans des cellules, notamment des cellules eucaryotes telles que des cellules de mammifère modifiées par le vecteur recombinant ainsi obtenu. De tels anticorps ou fragments d'anticorps, dénommés anticorps intracellulaires (Cattaneo et al., Trends in Biotechnology, 1999, 17, 115-121), sont exprimés sous forme fonctionnelle, capables de lier la cible dans le compartiment des cellules modifiées dans lequel elle est exprimée (noyau, cytoplasme, comparti- ment sécrétoire). En outre, des mutations peuvent être introduites dans la séquence des anticorps ou des fragments d'anticorps sélectionnés, de façon à améliorer leur solubilité et/ou leur conformation dans les cellules, notamment chez les eucaryotes. Parmi les mutations envisageables, on peut citer notamment les mutations ponctuelles décrites dans Hurle et al., PNAS USA, 1994, 91, 5446-5450 et Martineau et al., J. Mol. Biol., 1998, 280, 117-127. En outre, des anticorps ou des fragments d'anticorps présentant une stabilité et/ou une affinité augmentée peuvent être sélectionnés par une étape additionnelle de sélection phénotypique, comme décrit dans Cattaneo et al., précité. Alternativement, l'identification des anticorps ou fragments d'anticorps capables de moduler ladite cascade fonctionnelle est réalisée par une sélection phénotypique appropriée, de cellules modifiées par une banque d'anticorps ou de fragments d'anticorps, selon le principe tel que décrit dans Cattaneo et al., précité. Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, l'étape b) de criblage comprend : - la mise en contact de la banque de molécules à tester avec la cible ou l'un de ses dérivés tels que définis ci-dessus, - l'addition de l'anticorps ou du fragment d'anticorps, éventuellement marqué, et - la mesure, par tout moyen approprié, de la quantité relative d'anticorps lié à la cible, en présence ou en l'absence de ladite banque de molécules. Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, l'étape b) de criblage est réalisée par un test de liaison de ladite cible, en compétition avec ledit anticorps ou ledit fragment d'anticorps, de façon à isoler des ligands de ladite cible qui déplacent ledit anticorps ou ledit fragment d'anticorps du complexe cible/anticorps ou fragment d'anticorps. Un exemple de ce mode de mise en œuvre comprend : - la mise en contact de l'anticorps ou du fragment d'anticorps, éventuellement marqué, avec la cible ou l'un de ses dérivés tels que définis ci-dessus, - l'addition de la banque de molécules à tester de façon à détecter les molécules capables de déplacer l'anticorps ou le fragment d'anticorps de son complexe avec le fragment de la cible, et - la mesure, par tout moyen approprié, de la quantité relative d'anticorps lié à la cible, en présence ou en l'absence de ladite banque de molécules. Un autre exemple de ce mode de mise en œuvre comprend : - le mélange de l'anticorps ou du fragment d'anticorps, éventuellement marqué, avec la banque de molécules à tester, - la mise en contact du mélange avec la cible ou l'un de ses dérivés tels que définis ci-dessus, et - la mesure, par tout moyen approprié, de la quantité relative d'anticorps lié à la cible, en présence ou en l'absence de ladite banque de molécules. La capacité d'une molécule à moduler la liaison entre la cible et l'anticorps est déterminée en comparant la valeur du signal de liaison de l'anticorps, en présence ou en l'absence de chacune des molécules de la banque, testées séparément. Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, les étapes a) et c) sont réalisées par un test fonctionnel permettant de mesurer l'activité biologique résultant de ladite cascade fonctionnelle, notamment par un test in vitro, dans un système cellulaire approprié ou in vivo, chez un organisme approprié. Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, ladite cible est sélectionnée parmi : une enzyme, un récepteur, une protéine adapta- trice, un transporteur, une protéine chaperone, une protéine régulatrice. A titre d'exemple non-limitatif de ces protéines, on peut citer : des enzymes telles que des protéines tyrosine kinase comme la protéine Syk ; des récepteurs de cytokines comme le récepteur de l'IL-13, de l'EGF ou du TNF, des protéines adaptatrices comme SLP-76 et E6-AP ; des protéines chaperones comme HSP70 et HSP60 ; des protéines régulatrices comme NF-κB, I-κB, Akt, PSAT-1, p53, p73 et la famille Bcl2. Selon encore un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, ledit anticorps ou fragment d'anticorps en a) est dirigé contre les domaines SH2 de la protéine Syk et il est capable d'inhiber la voie de la PLCγ-2. Un tel anti- corps permet d'identifier des médicaments agissant spécifiquement sur les réactions d'hypersensibilité de type I, utiles pour la prévention et ou le traitement de patho- logies telles que la conjonctive ou la rhinite allergique, l'asthme extrinsèque, l'œdème de Quincke et le choc anaphylactique, dans les cas les plus graves. Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, ladite banque de molécules en b) est une banque de petites molécules organiques. La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en œuvre du procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins : - une cible impliquée dans une cascade fonctionnelle, un fragment de ladite cible comprenant au moins le site d'intérêt, un mimotope de ladite cible, ou bien encore un anticorps anti-idiotypique représentant l'image interne dudit site d'intérêt de la cible tels que définis ci-dessus, - un anticorps ou un fragment d'anticorps comprenant au moins l'un des domaines variables d'une chaîne d' immunoglobuline, capable de se lier à ladite cible et de moduler ladite cascade fonctionnelle impliquant ladite cible ou une banque d'anticorps ou de fragments d'anticorps, tels que définis ci-dessus, et - une banque de molécules à tester, telle que définie ci-dessus. Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour cribler n'importe quel type de molécule d'intérêt thérapeutique ou non-thérapeutique, capable d'agir sur un processus physiologique ou pathologique de n'importe quel type de cellule ou de microorganisme tels que définis ci-dessus. Il peut être utilisé pour cribler de nouvelles familles de molécules présentant de nouvelles propriétés d'intérêt thérapeutique ou non-thérapeutique ou des dérivés de ces molécules présentant une activité spécifique et/ou un index thérapeutique améliorés. Les banques de molécules sont préparées selon les méthodes classiques de synthèse chimique combinatoire, connues de l'Homme du métier. L'anticorps ou le fragment d'anticorps tels que définis ci-dessus sont préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, telles que celles décrites dans Antibodies : A Laboratory Manual, E. Howell and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. De manière plus précise : - les anticorps monoclonaux sont produits à partir d'hybridomes obtenus par fusion entre des lymphocytes B d'un animal immunisé et des myélomes, selon la technique de Kôhler et Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497) ; les hybri- domes sont cultivés in vitro, notamment dans des fermenteurs ou produits in vivo, sous forme d'ascite ; alternativement, lesdits anticorps monoclonaux sont produits par génie génétique comme décrit dans Methods in Molecular Biology : Antibody Phage Display Methods and Protocols, P.M. O'Brien and R. Aitken. Humana Press, Vol. 178, 2002. Par exemple, des animaux appropriés sont immunisés de façon répétée avec la cible ou l'un de ses fragments, selon un protocole standard comprenant une première immunisation par injection intrapéritonéale de l'antigène dans un volume équivalent d'adjuvant complet de Freund puis une deuxième immunisation (rappel) 15 jours plus tard dans des conditions identiques mais avec cette fois de l'adjuvant incomplet de Freund. Les anticorps monoclonaux sont produits selon un protocole standard comprenant le sacrifice des animaux deux semaines après le dernier rappel, le prélèvement de la rate, la mise en suspension des lymphocytes spléniques et la fusion de ces lymphocytes avec la lignée cellulaire murine SP2/0 qui ne produit aucun anticorps murin, qui est immortalisée, et possède toute la machinerie nécessaire à la sécrétion d'immunoglobulines. - les banques d'anticorps sont, soit des banques naturelles produites à partir des régions VH et NL clonées à partir des ARΝm d'hybridomes ou de lymphocytes spléniques d'individus naïfs ou préalablement immunisés, soit des banques recombinantes; par exemple, les fragments Fv, scFv ou Fab sont exprimés à la surface de phages filamenteux selon la technique initialement décrite dans Winter et Milstein, Nature, 1991 , 349, 293-299 (Methods in Molecular Biology : Antibody Phage Display Methods and Protocols, P.M. O'Brien and R. Aitken. Humana Press, Vol. 178, 2002 ; Knappik et al., J. Mol. Biol., 2000, 296, 57-86 ; Naughan et al, Nature Biotech, 1996, 14, 309-314). - les anticorps spécifiques de la cible sont isolés par criblage des banques telles que définies ci-dessus, notamment des banques de phages ; après plusieurs étapes de sélection, les phages qui expriment les fragments d'anticorps spécifiques de la cible sont isolés et les ADNc correspondant auxdits fragments sont exprimés dans un système d'expression approprié, par les techniques classiques de clonage et d'expression d'ADN recombinant. De préférence, lesdits ADNc sont clones à la fois dans un vecteur d'expression procaryote et eucaryote, sous forme d'une protéine de fusion comprenant au moins à son extrémité -NH2 ou COOH, une étiquette pour la détection dudit fragment d'anticorps, par exemple un épitope (c-myc, HA). Ladite protéine de fusion peut éventuellement comprendre, à l'une des extrémités, une étiquette pour la purification du fragment d'anticorps, par exemple une séquence polyhistidine pour la purification sur une colonne de nickel-agarose. Ledit vecteur d'expression eucaryote contient, outre les éléments régulateurs de la transcription/traduction appropriés (promoteur, enhancer, séquence consensus de Kozak, signal de polyadénylation....) sous le contrôle desquels sont insérées les séquences codantes telles que définies ci-dessus, les éléments indispensables à l'expression desdits fragments dans le compartiment cellulaire approprié tel que défini ci-dessus, notamment dans le cytoplasme, et éventuellement un marqueur de sélection (gène de résistance à un antibiotique,..) pour la sélection de lignées de cellules, notamment eucaryotes, modifiées de façon stable par ledit vecteur d'expression et produisant les anticorps intracellulaires. Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments tels que définis ci- dessus, sont purifiés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, notamment par chromatographie d'affinité. La cible ou le fragment comprenant le site d'intérêt peuvent être, soit purifiés à partir de tissus ou de cellules, par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, soit produits par les techniques classiques d'ADN recombinant connues de l'Homme du métier, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits notamment dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. A USUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Le polynucléotide codant pour ladite protéine ou ledit fragment est clone dans un vecteur d'expression (plasmide, virus..) dans lequel ledit polynucléotide est placé sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. En outre, ledit vecteur peut comprendre des séquences (étiquettes ou tag) fusionnées en phase avec l'extrémité 5' et/ou 3' dudit polynucléotide, utiles pour l'immobilisation, et/ou la détection et/ou la purification de la protéine exprimée à partir dudit vecteur ; ladite protéine est ensuite exprimée dans des cellules hôtes appropriées (bactéries, levures, cellules d'insecte ou de mammifère) et éventuellement purifiée. Alternativement, le fragment comprenant le site d'intérêt est synthétisé en phase solide, selon la méthode originellement décrite par Merrifield et al. (J Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149-). Le marquage de la cible, de l'anticorps ou de son fragment et la détection de la liaison anticorps/cible et ligand/cible, sont réalisés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier : (i) par fusion de la séquence codante avec la séquence d'un épitope (c-myc, HA), (ii) par couplage avec un marqueur approprié tel qu'un fluorophore, une enzyme (phosphatase alcaline, peroxydase), un isotope radioactif, ou la biotine, (iii) par un anticorps secondaire marqué ou bien par toute interaction spécifique avec un marqueur approprié. Par exemple, la liaison anticorps/cible et ligand/cible est détectée par transfert de fluorescence entre deux protéines fluorescentes complémentaires (Philipps et al., J. Mol. Biol., 2003, 327, 239), deux fluorophores complémentaires (fluorescéine/téraméthylrhodamine) ou une combinaison des deux. Par exemple, la dite cible ou ledit fragment comprennent un fiuorophore accepteur ou donneur respectivement à leur extrémité NH2 et/ou COOH et l'anticorps ou le fragment d'anticorps comprennent le fiuorophore complémentaire à leur extrémité NH et/ou COOH. Le procédé selon l'invention présente les avantages suivants : • il permet d'identifier de nouvelles molécules agissant de façon sélective et spécifique sur un processus physiopathologique, potentiellement utilisables comme médicament, par la combinaison de deux étapes de criblage : - une étape de criblage par un test de liaison, aisément automa- tisable et adaptable au haut débit, des molécules qui miment l'interaction d'une cible avec un anticorps ou un fragment d'anticorps (approche idiotypique) et sont donc susceptibles de moduler la cascade fonctionnelle impliquant ladite cible, et - une étape de criblage à bas débit, par un test fonctionnel en culture cellulaire ou dans un modèle animal approprié, des molécules capables de moduler la cascade fonctionnelle impliquant ladite cible, notamment par mesure de l'activité biologique résultant de ladite cascade. Par exemple, dans le cas de la protéine tyrosine kinase Syk, les résultats obtenus à partir d'une banque de 3000 molécules montrent que l'efficacité de la première étape de criblage avec l'anticorps anti-Syk est telle que la deuxième étape de criblage fonctionnel sur un nombre restreint de molécules (10 molécules), permet d'isoler au moins une molécule inhibitrice active in vivo sur la cascade fonctionnelle sélectionnée. • dans la mesure où il utilise une approche idiotypique, il présente les avantages suivants à savoir : - il est adapté à toutes les cibles cellulaires, - il est adapté à la reconnaissance de n'importe quel site d'une cible d'intérêt, de manière spécifique et avec une affinité élevée (de l'ordre du nM) et, notamment un site de la surface de ladite cible, susceptible de lier un partenaire par l'intermédiaire d'une interaction du type protéine-protéine ; en conséquence les ligands isolés par ce procédé de criblage devraient présenter les mêmes propriétés, notamment en terme affinité/spécificité pour la cible, - il n'implique pas de connaître le partenaire naturel dont l'interaction avec la cible est mimé par l'anticorps et le ligand sélectionné à partir de la banque de molécules, et • il permet d'identifier de nouvelles molécules permettant avantageusement de remplacer les anticorps monoclonaux recombinants utilisés dans les traitements thérapeutiques comme le cétuximab (anti-EGFR), le rituximab (anti- CD20) et l'infliximab (anti-TNF) qui sont difficiles à produire et présentent un coût élevé. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de criblage de molécules capables de moduler sélectivement la dégranulation des mastocytes, à l'aide d'un fragment scFv dirigé contre les domaines SH2 de la cible Syk, de la famille des PTK (protéine tyrosine kinase), ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 est une représentation schématique du procédé selon l'invention, - la figure 2 est une représentation schématique d'une cible et de la cascade fonctionnelle dans laquelle elle est impliquée, - la figure 3 est une représentation schématique des cascades d'activation impliquant la protéine tyrosine kinase Syk et des activités biologiques résultantes, - la figure 4 illustre la validation du procédé selon l'invention en utilisant la protéine Syk comme cible et le fragment scFv G4G11 comme anticorps pour le criblage d'une chimiothèque. Parmi les dix molécules issues du criblage en ELISA, au moins l'une d'entre elle inhibe fortement le relargage des médiateurs de l'inflammation dans le test de libération de la béta-hexosaminidase : à la concentration de 3 μM la drogue inhibe à 93 % la dégranulation induite par l'IgE mais pas celle induite par l'ionomycine, - la figure 5 illustre la comparaison des effets biologiques de la drogue avec l'inhibition observée avec le scFv. Des lysats de cellules RBL-2H3 non activées (NA) et activées (A), en présence de la molécule sélectionnée en ELISA (drogue) à une concentration finale de 1,5 à 12 μM (a et b) ou de 3 μM (c et d) ou en l'absence de cette molécule, ont été analysés par : a et b : immunoblot à l'aide d'un anticorps anti-phosphotyrosine 4G10 (a), d'un anticorps anti-phosphoMAPK (bl) ou d'un anticorps anti-MAPK (b2) ; c et d : immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps anti-Syk (c) ou anti- PLC-γ2 (d) puis immunoblot à l'aide du même anticorps utilisé comme contrôle, ou de l'anticorps anti-phosphotyrosine 4G10. Exemple : Utilisation d'un fragment scFv dirigé contre les domames SH2 de la protéine Syk pour cribler des molécules capables d'inhiber la cascade d'activation de la PLC-γ2 et de la tyrosine kinase Btk qui conduit à la dégranulation des mastocytes et à la libération des médiateurs de l'inflammation. La protéine Syk est une protéine tyrosine kinase, multifonctionnelle, qui joue un rôle important dans l' activation de certaines cellules de la lignée lymphoïde dont les lymphocytes B, les mastocytes et basophiles, et une sous- population de lymphocytes T. L'activation de la lignée mastocytaire, suite à la reconnaissance par le récepteur des IgE (FcεRI), d'IgE associées à un allergène, résulte en la libération de médiateurs allergiques tels que l'histamine et la sérotonine. De manière plus précise, l'agrégation du récepteur FcεRI entraîne rapidement la phosphorylation de la protéine Syk et son activation. Syk ainsi activée phosphoryle à son tour ses substrats cytoplasmiques dont la protéine tyrosine kinase Btk et la phospholipase C-γ2 (PLC-γ2), toutes deux impliquées dans la cascade d'activation dont résulte la dégranulation des mastocytes et la libération de médiateurs allergiques (voie de la PLCγ-2 ; figure 3). La protéine Syk intervient dans une deuxième voie (figure 3) qui conduit à l'activation de la protéine Ras puis de la MAP kinase (MAPK). Il est important de ne pas perturber cette voie car il a été montré qu'elle intervenait dans la croissance et la différenciation des cellules et que la modification de cette deuxième voie pouvait conduire à des phénomènes malins. Des travaux antérieurs ont permis de montrer que deux scFv interagissant avec les domaines SH2 étaient capables d'inhiber spécifiquement in vivo la voie de la PLCγ-2 (G4G11, G4E4 ; Dauvillier et al, J. Immunol., 2002, 169, 2274- 2283). L'anticorps G4G11 a été utilisé pour cribler des petites molécules organiques capables d'inhiber spécifiquement cette voie, in vivo. 1) Criblage d'une banque de molécules en ELISA a) Matériel La protéine Syk recombinante contenant deux domaines SH2 fusionnés en C terminal de la Glutathion-S-transférase (GST) est produite dans E.coli et purifiée à comme décrit dans Peneff et al., précité. Le fragment scFv d'anticorps humain anti-Syk dénommé G4G11, contenant en C-terminal, une étiquette c-myc, pour la détection à l'aide d'un anticorps et une étiquette polyhistidine pour la purification par chromatographie d'affinité, est produit dans E.coli et purifié comme décrit dans Peneff et al., précité. L'anticorps secondaire est l'anticorps monoclonal 9E10 dirigé contre l'épitope c-myc (EQKLISEEDLN), couplé à la peroxydase (Munro et al., Cell, 1986, 46, 291-300). La banque de molécules à tester est une banque de 3000 petites molécules organiques (ChemBridge Corporation ; http://chembridge.com). Toutes les dilutions et incubations ont été réalisées dans un tampon PBS /Tween 20 0,1% / BSA 0,1%. Les lavages ont été réalisés dans un tampon PBS/Tween 20 0,1 %. Le substrat est le dihydrochlorure de tétraméthylbenzidine à 0,1 mg/ml dans un tampon phosphate citrate pH 5, additionné de H O2 (0,03%). b) Protocole La protéine Syk recombinante (10 μg l en PBS) a été adsorbée sur une plaque 96 puits (Maxisorp®, NUNC ; 100 μl soit 1 μg par puits), pendant une nuit à 4°C. Après un premier lavage, les sites non spécifiques de la plaque ont été saturés avec une solution de PBS/BSA 1% à raison de 250 μl par puit, pendant une nuit à température ambiante. Après lavage de l'excès de solution de saturation, les molécules de la banque (3000 molécules) ont été ajoutées à la concentration de 20 μM dans un volume de 50 μl et les plaques ont été incubées pendant 1 heure à température ambiante. Le fragment scFv a ensuite été ajouté à la concentration de 150 nM dans un volume de 50 μl et les plaques ont été incubées 1 heure à température ambiante. Après un nouveau lavage, 50 μl d'anticorps secondaire marqué à la peroxydase ont été ajoutés et les plaques ont été incubées 30 minutes à température ambiante. Après un dernier lavage, le substrat de réaction de la peroxydase a été ajouté dans un volume de 100 μl, puis les plaques ont été incubées pendant 5 minutes et la réaction a été stoppée par addition de 50 μl de H2SO4 2N. La densité optique à 450 mm a ensuite été mesurée à l'aide d'un lecteur automatique pour plaque ELISA. La banque a été criblée deux fois dans des expériences indépendantes, c) Résultats L'inhibition de la liaison entre le fragment de la protéine Syk et le scFv G4G11 par la molécule à tester est mesurée par le rapport I , égal à : (signal en absence de drogue) - (signal en présence de drogue) (signal en absence de drogue) Les résultats sont les suivants : - 2990 molécules ne produisent pas d'inhibition (1 = 1 ±0,2) - 8 molécules produisent une faible inhibition (0,4 <I< 0,8) - 2 molécules produisent une forte inhibition (I < 0,3)
2) Vérification du pouvoir modulateur des molécules sélectionnées, in vivo, en culture cellulaire La vérification in vivo du pouvoir modulateur des molécules sélectionnées en ELISA a été effectuée par un test de dégranulation des mastocytes, par mesure du relargage de la β-hexosaminidase comme décrit dans Dauvillier et al., précité. De plus, l'effet des molécules sélectionnées en ELISA sur la tyrosine phosphorylation des protéines totales, et des protéines Syk, PLCγ-2 et MAPK a été analysé comme décrit dans Dauvillier et al., précité. Brièvement, les cellules RBL-2H3 (lignée de leucémie basophile de rat) sont ensemencées dans une plaque à 96 puits à raison de 2.105 cellules / puits. Elles sont sensibilisées en présence d'un anticorps monoclonal IgE anti-DNP, pendant une nuit à 37°C. Les cellules sont ensuite incubées 2 heures à 37°C, en présence de différentes concentrations de la molécule sélectionnée en ELISA, puis elles sont activées par l'antigène DNP-BSA, 3 minutes à 37°C. Le surnageant de culture est ensuite récolté et conservé à 4°C (SI). Les cellules adhérentes sont lysées en présence d'un tampon de lyse contenant 0,1% de Triton X-100 et des inhibiteurs de protéases.
Les lysats cellulaires sont également récoltés et conservés à 4°C (S2). Pour calculer la quantité de l'enzyme β-hexosaminidase relarguée, les solutions SI et S2 sont incubées avec le substrat de l'enzyme : le 4-nitrophényl-2- désoxy-β-D-glucopyranoside, pendant lh30 à 37°C. La réaction enzymatique est arrêtée par addition d'une solution de glycine pH 3 et la densité optique est lue à 405 nm. La quantité de β-hexosaminidase relarguée correspond à : Hex Sl x 100 (Hex Sl + Hex S2) Pour chaque concentration, un test de dégranulation par un ionophore de calcium (ionomycine) a été effectué comme contrôle. Parmi les dix molécules issues du criblage en ELISA ayant un rapport I < 0,8, l'une d'entre elles inhibe fortement la libération de β-hexosaminidase comme le montre la figure 4. En effet, cette molécule inhibe 93% de la dégranulation induite par l'IgE, à une concentration de 3 μM mais n'affecte pas la dégranulation induite par l'ionomycine. Des essais complémentaires ont montré que la molécule identifiée se comporte in vivo comme le scFv G4G11 et inhibe la voie PLC-γ dépendante, sans affecter la voie Ras dépendante (Figure 5) . En effet : - elle n'affecte pas la phosphorylation globale des protéines (figure 5a), elle n'affecte pas la phosphorylation de Syk (figure 5c), elle n'affecte pas la phosphorylation de la MAPK (figure 5b), - elle diminue la phosphorylation de la PLC-γ (figure 5d).
3) Vérification du pouvoir modulateur des molécules sélectionnées, in vivo, chez la souris. La capacité de la molécule la plus active de la figure 4, à inhiber le choc anaphylactique systémique, a été testée chez la souris BALB/c. De manière plus précise, un groupe de souris (groupe 1) a reçu une une injection d'IgE monoclonale anti-DNP, par voie intra-veineuse, à raison delOO μg par souris BALB/c. Quarante sept heures après, et une heure avant l'injection de l'antigène DNP, la molécule a été administrée par voie orale, à raison de 100 mg kg, en une seule prise. Une heure après l'administration de la molécule, l'antigène DNP contenant 2% de bleu d'Evans, a été injecté par voie intra-veineuse, à raison de .1 mg par souris. Trois groupes de souris contrôles ont été testés en parallèle avec le groupe 1 , à savoir :
- groupe 2 : souris BALB/c ne recevant aucune drogue et permettant de mesurer le choc anaphylactique maximum (contrôle positif).
- groupe 3 : souris BALB/c recevant une molécule inactive. - groupe 4 : souris recevant l'IgE mais pas l'antigène DNP (contrôle négatif). L'effet de la molécule sur le choc anaphylactique a ensuite été déterminé par mesure de la libération du bleu d'Evans, par extravasation. Pour ce faire, les souris ont été sacrifiées, puis leurs oreilles ont été coupées. Des surfaces égales des oreilles ont été prélevées, à l'aide d'un emporte-pièce, puis elles ont été hachées, et mises dans une solution de formamide, pendant une nuit à 55°C. Le lendemain, la libération du bleu d'Evans dans la solution de formamide, a été déterminée par mesure de la densité optique à 610 nm. Les résultats montrent une diminution de 70% de l' extravasation du bleu d'Evans chez les souris ayant reçu la molécule active dans le test d'inhibition de la dégranulation des mastocytes (figure 4), par rapport aux souris contrôles ne recevant aucune molécule ou une molécule inactive. Ces résultats démontrent la capacité de la molécule sélectionnée par le procédé de criblage selon l'invention, à protéger un animal du choc anaphylactique.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Procédé d'identification d'un ligand capable de moduler sélectivement une cascade fonctionnelle impliquant une cible, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) l'identification d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps comprenant au moins l'un des domaines variables d'une chaîne d'immunoglobuline, capable de se lier à ladite cible et de moduler ladite cascade fonctionnelle impliquant ladite cible, b) le criblage à partir d'une banque de molécules, des ligands modu- lateurs de la liaison entre ladite cible et l'anticorps ou le fragment d'anticorps identifié en a) , et c) l'identification à partir des ligands modulateurs obtenus en b), de ceux capables de moduler ladite cascade fonctionnelle. 2°) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les étapes a) et b) sont réalisées à l'aide d'une cible ou d'un dérivé de la cible tel qu'un fragment comprenant au moins le site d'intérêt, un mimotope, ou bien encore un anticorps anti- idiotypique représentant l'image interne dudit site d'intérêt de la cible. 3°) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la dite cible et ses dérivés ou bien l'anticorps et le fragment d'anticorps sont immobilisés sur un support approprié et/ou marqués par tout moyen permettant l'obtention d'un signal mesurable. 4°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'identification dudit anticorps ou fragment d'anticorps en a) est réalisée par criblage d'une banque d'anticorps ou de fragments d'anticorps, de préférence une banque de fragments scFv, de manière préférée, une banque de phages exprimant des fragments scFv à leur surface. 5°) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit criblage est réalisé à l'aide de cellules modifiées par un vecteur d'expression de ladite banque ou d'anticorps ou de fragments d'anticorps isolés de ladite banque. 6°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'étape b) de criblage comprend : - la mise en contact de la banque de molécules à tester avec la cible ou l'un de ses dérivés tels que définis à la revendication 2, - l'addition de l'anticorps ou du fragment d'anticorps, éventuellement marqué, et - la mesure, par tout moyen approprié de la quantité relative d'anticorps lié à la cible, en présence ou en l'absence de ladite banque de molécule. 7°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'étape b) de criblage comprend : - la mise en contact de l'anticorps ou du fragment d'anticorps, éven- tuellement marqué, avec la cible ou l'un de ses dérivés tels que définis à la revendication 2, - l'addition de la banque de molécules à tester de façon à détecter les molécules capables de déplacer l'anticorps ou le fragment d'anticorps de son complexe avec le fragment de la cible, et - la mesure, par tout moyen approprié, de la quantité relative d'anticorps lié à la cible, en présence ou en l'absence de ladite banque de molécule. 8°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'étape b) de criblage comprend : - le mélange de l'anticorps ou du fragment d'anticorps, éventuelle- ment marqué, avec la banque de molécules à tester, - la mise en contact du mélange avec la cible ou l'un de ses dérivés tels que définis à la revendication 2, et - la mesure, par tout moyen approprié, de la quantité relative d'anticorps lié à la cible, en présence ou en l'absence de ladite banque de molécules. 9°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les étapes a) et c) sont réalisées par un test fonctionnel permettant de mesurer l'activité biologique résultant de ladite cascade fonctionnelle, notamment par un test in vitro, dans un système cellulaire approprié ou in vivo, chez un organisme approprié. 10°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce ladite cible est sélectionnée dans le groupe constitué par : une enzyme, un récepteur, une protéine adaptatrice, un transporteur, une protéine chaperone et une protéine régulatrice. 11°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ledit anticorps ou fragment d'anticorps identifié en a) est dirigé contre les domaines SH2 de la protéine Syk et capable d'inhiber spécifiquement la voie de la PLCγ-2. 12°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce ladite banque de l'étape b) est une banque de petites molécules organiques. 13°) Kit pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend au moins : - une cible impliquée dans une cascade fonctionnelle, un fragment de ladite cible comprenant au moins le site d'intérêt, un mimotope de ladite cible, ou bien encore un anticorps anti-idiotypique représentant l'image interne dudit site d'intérêt de la cible, - un anticorps ou un fragment d'anticorps comprenant au moins l'un des domaines variables d'une chaîne d'immunoglobuline, capable de se lier à ladite cible et de moduler ladite cascade fonctionnelle impliquant ladite cible, ou bien une banque d'anticorps ou de fragments d'anticorps, et - une banque de molécules à tester.
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