Utilisation d'un hydrolysat de protéines de crucifères en tant qu'agent dépigmentant dans ou pour une composition cosmétique et/ou pharmaceutique.
L'invention concerne le domaine de la cosmétique et de la pharmaceutique, notamment le domaine de la dermatologie. La présente invention a pour objet l'utilisation d'une quantité efficace d'un hydrolysat de protéines de plantes appartenant à la famille des crucifères, en tant qu'agent blanchissant et/ou dépigmentant de la peau, dans ou pour la préparation d'une composition cosmétique et/où dermatologique et/ou pharmaceutique. La couleur de la peau et des cheveux des mammifères est sous l'influence de différents facteurs, des facteurs génétiques, bien sûr, mais aussi environnementaux tels que, par exemple, l'exposition au soleil. Cette couleur repose essentiellement sur la présence d'un pigment particulier, la mélanine. Cette mélanine joue en effet un rôle fondamental dans la détermination de la couleur de la peau. Elle est synthétisée par de larges cellules dendritiques : les melanocytes, cellules localisées dans la jonction dermo-épidermique. La mélanine existe sous deux formes différentes : la phaeomélanine, pigment de couleur jaune, et l'eumélanine de couleur noire. Ce sont les différentes proportions et la taille de ces pigments, sans oublier les caroténoïdes et la micro-circulation sanguine, qui donnent à la peau sa grande diversité de couleur. Les deux types de mélanines sont synthétisés à partir d'un même acide aminé, la tyrosine. Cette synthèse est sous la dépendance d'une enzyme clé, la tyrosinase, qui transforme la tyrosine en DOPA, puis en DOPA-quinone. La DOPA-quinone donnant naissance à la phaeomélanine ou bien à l'eumélanine. En présence de cystéine, un acide aminé riche en soufre, la DOPA-quinone sera transformée en Cystéinyl-DOPA, intermédiaire dans la synthèse dé phaeomélanine. Tandis qu'en l'absence de cystéine, de l'indole 5-6 quinone sera formé et de l'eumélanine sera synthétisée. Les melanocytes transfèrent ensuite la mélanine dans les cellules adjacentes, c'est-à-dire les kératinocytes. La production de mélanine, ainsi que son transport, sont régulés par différents facteurs tels que, par exemple, le rayonnement UV, les hormones ou les produits chimiques. Ainsi, une augmentation de l'exposition aux rayonnements UV provoque la synthèse de pigments et résulte en un assombrissement de la peau. Des perturbations de cette pigmentation, plus ou moins bénignes, peuvent apparaître. Elles se manifestent, par exemple, par des taches de rousseur, des grains de beauté, des taches diffuses telles que les taches de grossesse, le chloasma ainsi que par d'autres désordres hyperpigmentaires comme par exemple le
lentigo. En outre, le vieillissement peut moduler la pigmentation cutanée. Ainsi, certaines personnes peuvent voir apparaître des taches sur la peau, plus ou moins foncées ou colorées, conférant des zones de colorations hétérogènes formant des taches de sénescence. L'utilisation d'inhibiteur ou de régulateur de la synthèse de mélanine, ainsi que de tout autre produit dépigmentant et/ou blanchissant, est donc particulièrement intéressant en cosmétologie et/ou en dermatologie. Cette utilisation est non seulement intéressante lorsqu'une véritable dépigmentation de la peau est recherchée, comme dans le cas de blanchiment de peau fortement pigmentée ou encore lors d'inhibition de zones cutanées hyperpigmentées résultant en un aspect inesthétique de la peau ; mais elle l'est également dans certaines applications visant à éclaircir le teint, à donner de la luminosité à la peau ou encore à donner de l'éclat aux tissus de surface. Jusqu'à ce jour, de nombreuses molécules ont été proposées mais très peu sont véritablement utilisées car beaucoup d'entre elles présentent des problèmes d'irritation voire de toxicité. Parmi ces molécules, on peut citer des dérivés du phénol tels que l'hydroquinone et le résorcinol qui inhibent une série de réaction de la conversion de la L- tyrosine en mélanine par inhibition de l'activité de la tyrosinase (Takano, 1984). On peut citer aussi l'acide L-ascorbique et ses dérivés, le magnésium ascorbyl acétate, l'acide kojique ou encore l'acide lactique. De nouveaux produits et molécules ont été mis au point afin de résoudre ces problèmes. Ainsi, le document GB 1349955 décrit une composition blanchissante contenant de l'hydroquinone, un agent desquamant et un corticostéroïde anti- inflammatoire. Le document EP98401360 décrit l'utilisation de sulfites ou métalsulfites dans une composition cosmétique à activité dépigmentante. Un certain nombre de substances introduites dans des produits cosmétiques ou pharmaceutiques ont ainsi vu le jour. Mais il reste, cependant, encore des progrès à faire afin de pouvoir disposer de produits capables de régler ces problèmes de manière satisfaisante. Il subsiste, notamment, le besoin d'une composition dépigmentante et/ou blanchissante qui, bien qu'étant convenablement tolérée par la peau, soit plus efficace que les compositions mentionnées ci-dessus. Le problème technique à résoudre a donc été, pour les inventeurs, de trouver une nouvelle substance, cosmetiquement ou pharmaceutiquement acceptable, qui soit capable d'avoir une réelle activité blanchissante et/ou dépigmentante au niveau de la peau tout en n'ayant pas des effets secondaires indésirables tels que, par exemple, des réactions de toxicité ou d'irritation cutanée.
Les inventeurs ont réussi à sélectionner des substances particulières présentant des propriétés remarquables lorsque celles-ci sont appliquées sur la peau. Ils ont, notamment, découvert qu'un hydrolysat de protéines de plantes appartenant à la famille des crucifères a des propriétés remarquables sur la peau et, plus particulièrement, des propriétés blanchissantes. Ce composé permet, en effet, d'inhiber significativement la synthèse de mélanine des cellules de la peau. Les végétaux de la famille des crucifères (latinisée en Cruciferae) se regroupent dans une large famille qui compte environ 3200 espèces réparties en 375 genres à travers le monde. Les crucifères sont également appelées Brassicaceae. Ces plantes se trouvent principalement dans les régions tempérées de l'hémisphère Nord et, plus particulièrement, dans le pourtour méditerranéen. Les crucifères tirent leur nom de la disposition en croix de leurs sépales et pétales. Ce sont des plantes herbacées, vivaces, annuelles et assez couramment bisannuelles. Leur racine est pivotante et tubérisée. Le feuillage est alterne, à stipules réduites et caduques, voire même absentes. Le fruit est une silique, sa forme, sa longueur ou encore son épaisseur servent à la reconnaissance des espèces. Les graines se détachent progressivement ; elles sont dépourvues d'albumen, les réserves étant essentiellement d'origine lipidique. Comme plante appartenant à cette famille on peut citer des plantes de grandes cultures, oléagineuses, tel le colza (Brassica napus, var. oleifera) ; des plantes alimentaires comme toutes les variétés de "chou" (du genre Brassica) ; des condiments tel que la moutarde (du genre Sinapis) ; ou encore des plantes à intérêt ornemental tel que la giroflée ou la corbeille d'or (du genre Alyssum). Il a déjà été proposé, dans des documents antérieurs, des compositions cosmétiques contenant des extraits de Brassicaceae. Ainsi, par exemple, le brevet FR 2802417 décrit une préparation cosmétique et/ou pharmaceutique contenant une quantité efficace d'un extrait de Brassicaceae et un corps gras et/ou des émulsifiants. Cependant, à la connaissance de la demanderesse, il n'a jamais été décrit, dans l'art antérieur, l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de plantes appartenant à la famille des crucifères, en tant qu'agent blanchissant et/ou dépigmentant en cosmétique et/ou en dermatologie et/ou en pharmaceutique. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une quantité efficace d'un hydrolysat de protéines de plantes appartenant à la famille des crucifères comme principe actif blanchissant dans ou pour la préparation d'une composition cosmétique et/ou dermatologique et/ou pharmaceutique. Selon un mode de
réalisation de l'invention tout particulièrement préféré, l'hydrolysat est un hydrolysat de protéines fermentées de plantes appartenant à la famille des crucifères. Le terme "hydrolysat" désigne toute substance ayant subi une hydrolyse. L'hydrolyse se définit comme le clivage d'une molécule par une molécule d'eau. L'hydrolyse peut être enzymatique ou chimique, préférentiellement selon l'invention l'hydrolyse est enzymatique. Un hydrolysat de protéines désigne donc le produit obtenu après hydrolyse des protéines de la plantes. L'hydrolyse des protéines, plus ou moins poussée, permet d'obtenir un hydrolysat contenant soit des peptides de poids moléculaires variables, soit des acides aminés. Les protéines ainsi hydrolysées ont été examinées pour leurs propriétés dans le domaine des cosmétiques et de la dermatologie. Préférentiellement selon l'invention, l'hydrolysat de protéines est préparé à partir de protéines fermentées, c'est-à-dire à partir de protéines qui ont subi une étape de fermentation. Par fermentation, on entend une transformation des substances organiques sous l'action de micro-organismes. Préférentiellement selon l'invention, les micro- organismes utilisés sont des levures, et plus particulièrement des levures du genre Rhizopus, Aspergillus ou Pénicillium. L'hydrolysat de protéines de plantes appartenant à la famille des crucifères doit s'entendre comme un hydrolysat d'au moins un végétal appartenant à la famille des crucifères. Bien entendu cet hydrolysat peut être préparé à partir d'au moins l'un quelconque des nombreux genres et espèces appartenant à la famille des crucifères. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la plante utilisée afin d'obtenir l'hydrolysat de protéines fermentées, appartenant à la famille des crucifères, est le colza (Brassica napus). Préférentiellement, l'hydrolysat de protéines de plantes appartenant à la famille des crucifères est obtenu à partir de la graine de ces végétaux. Ainsi, selon une méthode de réalisation préférée de l'invention, l'hydrolysat de protéines est obtenu à partir des graines de colza. Toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée afin de préparer l'hydrolysat selon l'invention. On peut, par exemple, dans une première étape, délipider des graines de crucifères, telles que des graines de colza, par un simple pressage et/ou par l'action d'un solvant organique classique (comme par exemple un alcool, un hexane ou de l'acétone). Après séchage du produit ainsi obtenu, on obtient un résidu enrichi en protéines communément appelé « tourteau ». Une étape de fermentation est, ensuite, avantageusement réalisée à partir de ce tourteau.
Selon une autre technique, on peut envisager de réaliser l'extraction d'une fraction protéique obtenue à partir de ce tourteau, cette fraction protéique servira ensuite de substrat à la fermentation. L'étape d'extraction des protéines proprement dite est réalisée en milieu aqueux, neutre ou basique. Préférentiellement selon l'invention l'extraction des protéines sera réalisée en milieu aqueux, légèrement basique, et à chaud. Les protéines seront récupérées par précipitation ou par concentration. L'étape de fermentation est réalisée de préférence avec des levures, préférentiellement avec des levures des genres Rhizopus, Aspergillus ou Pénicillium. Dans le milieu de fermentation, l'extrait de colza, source de matières azotées, est supplémenté en sucres (glucoses) ainsi qu'en divers éléments nécessaires à la croissance des levures, tels que, par exemple, des acides aminés et des sels minéraux. Une faible concentration d'alcool ou de glycérol peut être ajoutée. La culture s'effectue en fermenteur sous agitation lente (10 à 60 tours/min), à une température comprise entre 20 et 40°C et à un pH variant de 5 à 7,5, le débit d'air étant constant. La durée de cette étape est très variable, elle peut en effet varier de douze heures à vingt jours. Le milieu de culture est, par la suite, soumis à un traitement thermique, c'est-à-dire à une température comprise entre 80°C et 135°C. L'étape finale d'hydrolyse des protéines est réalisée par des protéases d'origine végétale telle que, par exemple, la papaïne ou bromélaïne ; ou bien par des enzymes dites « industrielles » telles que les alcalases, la flavourzyme... Le milieu de culture ainsi hydrolyse est centrifugé, filtré jusqu'à l'obtention d'un hydrolysat de protéines fermentées de crucifères. Cet hydrolysat est mis en solution dans un ou plusieurs solvants. On peut en particulier citer des solvants aqueux. Par solvant aqueux, on entend tout solvant constitué totalement ou partiellement d'eau. On peut citer l'eau elle-même, les solvants hydroalcooliques en toutes proportions ou encore les solvants constitués d'eau et d'un composé comme le propylène glycol ou le butylène glycol en toutes proportions. Les hydrolysats de protéines fermentées de plantes appartenant à la famille des crucifères sont analysés pour leur teneur en composés de nature protéique. On entend, par composés de nature protéique, les fragments de protéines, les peptides et les acides aminés libres présents dans le mélange. Les peptides, acides aminés et fragments de protéines sont dosés selon les techniques classiques, bien connues de l'homme du métier. Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'hydrolysat contient une quantité de composés de nature protéique représentant entre 30 et 90 % du poids total de la matière
sèche, plus particulièrement cette quantité est comprise entre 50 et 80 % du poids total de la matière sèche. L'invention a, en outre, pour objet l'utilisation d'une quantité efficace d'un hydrolysat de protéines de plantes appartenant à la famille des crucifères, tel que défini précédemment, dans ou pour la préparation d'une composition ; l'extrait ou la composition étant destinés à dépigmenter et/ou blanchir et/ou éclaircir la peau. Préférentiellement selon l'invention l'hydrolysat de protéines de plantes appartenant à la famille des crucifères est un hydrolysat de protéines fermentées, c'est-à-dire ayant subi une étape de fermentation. L'agent actif selon l'invention, ou la composition le contenant, permettra d'éclaircir, voire de blanchir la peau. La peau pouvant être, au départ, plus ou moins colorée ou plus ou moins foncée ; cette couleur ayant une origine naturelle, ou bien étant sous l'influence de facteurs extérieurs tel que, par exemple, le rayonnement UV ou l'âge. Par ailleurs, l'agent actif selon l'invention, ou la composition le contenant, permettra, d'une manière plus ou moins directe, de faire disparaître les taches pigmentaires de la peau et/ou permettra de dépigmenter les poils et/ou les cheveux. Il permettra ainsi de faire éclaircir les régions hyperpigmentées, c'est-à-dire les zones cutanées contenant une grande quantité de mélanine. Par taches pigmentaires de la peau, on entend toutes les modifications de la pigmentation de la peau résultant en un assombrissement général ou bien en un assombrissement localisé, formant ainsi des taches plus ou moins sombres. Ces modifications peuvent être d'origines naturelles ou induites par différents agents comme, par exemple, le rayonnement UV ou encore les produits chimiques. Ces désordres d'ordres pigmentaires peuvent se manifester par des taches de rousseurs des grains de beauté ou des taches diffuses telles que les taches de grossesses, le chloasma ainsi que par d'autres désordres hyperpigmentaires comme par exemple le lentigo. Des perturbations de cette pigmentation, plus ou moins bénignes, peuvent aussi apparaître naturellement avec le vieillissement. Certaines personnes peuvent ainsi voir apparaître des taches sur la peau plus ou moins foncées et/ou colorées, conférant à la peau des zones de colorations hétérogènes formant des taches de sénescence. Plus généralement, l'hydrolysat selon l'invention permet de réguler la pigmentation cutanée. L'actif selon l'invention est un agent actif blanchissant ou dépigmentant efficace qui agit, entre autres, en inhibant la formation de mélanine au niveau des melanocytes. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention est relative à l'utilisation d'un hydrolysat de protéines fermentées de plantes appartenant à la famille des crucifères, tel que défini précédemment,
dans ou pour la préparation d'une composition, afin d'inhiber et/ou de diminuer l'activité de la tyrosinase, et/ou afin d'inhiber et/ou de diminuer la synthèse de mélanine. L'invention a pour autre objet une composition contenant comme principe actif, dans un milieu cosmetiquement ou pharmaceutiquement acceptable, un hydrolysat de protéines de plantes appartenant à la famille des crucifères tel que défini précédemment. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition contient un hydrolysat de protéines fermentées de plantes appartenant à la famille des crucifères. L'invention concerne une composition cosmétique et/ou dermatologique contenant un actif dépigmentant ainsi que son utilisation afin d'obtenir un éclaircissement de la peau ou afin de traiter les taches pigmentaires. La composition selon l'invention peut être une composition cosmétique et/ou dermatologique et/ou pharmaceutique. Préférentiellement selon l'invention, la composition est une composition cosmétique, car elle est destinée à améliorer l'aspect et les performances cutanées générales de l'individu qui en fait usage. Plus particulièrement, cette composition est adaptée à une utilisation dans le but de blanchir et/ou de décolorer la peau, de dépigmenter les poils et/ou les cheveux, ou de traiter les taches pigmentaires de la peau. La composition selon l'invention est préférentiellement une composition cosmétique et/ou dermatologique adaptée à l'administration par voie topique cutanée comprenant un milieu cosmetiquement ou dermatologiquement acceptable. Il est bien évident que l'invention s'adresse aux mammifères en général et plus particulièrement aux êtres humains. La quantité efficace de principe actif correspond à la quantité nécessaire afin d'obtenir le résultat désiré. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'hydrolysat de protéines précité est présent, dans les compositions de l'invention, à une concentration comprise entre 0,0001 % et 20 % environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 % et 10 % environ en poids par rapport au poids total de la composition finale. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'hydrolysat précité est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs solvants cosmetiquement ou pharmaceutiquement acceptables comme l'eau, l'éthanol, le propanol ou l'isopropanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés ou tout mélange de ces solvants. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'hydrolysat précité est préalablement solubilisé dans un vecteur cosmétique ou pharmaceutique comme les liposomes ou adsorbés sur des polymères
organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisés dans ou fixés sur, tout vecteur cosmetiquement ou pharmaceutiquement acceptable. Quelle que soit la forme de l'invention, la composition selon l'invention peut être ingérée, injectée ou appliquée sur la peau (sur toute zone cutanée du corps), les cheveux, les ongles ou les muqueuses. Selon le mode d'administration, la composition selon l'invention peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées. Préférentiellement, les compositions selon la présente invention se présenteront sous une forme galénique adaptée à l'administration par voie topique cutanée. Elles couvrent toutes les formes cosmétiques ou dermatologiques. Ces compositions doivent donc contenir un milieu cosmetiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau, les poils ou les cheveux. Ces compositions peuvent notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ; d'une émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ; elles peuvent aussi se présenter sous forme de crèmes, de suspensions ou encore de poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les cheveux. Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un shampooing, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol. Elles peuvent être utilisées comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage de la peau. Ces compositions comprennent, en outre, tout additif usuellement utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des anti-oxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des actifs cosmétiques ou pharmaceutiques, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc. Dans tous les cas, l'homme du métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre de 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la
composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition. Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir les éventuels composés complémentaires, actifs ou non-actifs, et/ou leurs quantités, de telle sorte que les propriétés avantageuses du mélange ne soient pas, ou sensiblement pas, altérées par l'adjonction envisagée. Les compositions selon l'invention trouvent une application notamment comme composition cosmétique ou pharmaceutique pour la peau, mais aussi comme composition cosmétique pour les cheveux et/ou les poils. Elles trouvent une application toute particulière en tant que produit de dépigmentation et/ou de décoloration de la peau et/ou des poils. La composition selon l'invention peut aussi être une composition permettant de lutter contre les taches pigmentaires de la peau. Selon l'invention, on peut ajouter, entre autres, à la composition divers agents actifs destinés, notamment, à la prévention et/ou au traitement des désordres d'ordre pigmentaire. Par ailleurs, la composition selon l'invention peut associer, à l'hydrolysat de protéines tel que défini précédemment, d'autres agents actifs favorisant son action. Ainsi, il peut être ajouté des agents actifs ayant une action kératolytique, c'est-à-dire des agents desquamants ayant une action exfoliante, tels que, par exemples, les alpha-hydroxyacides et les béta- hydroxyacides. Ces agents agissant de manière efficace sur les mécanismes de la pigmentation. Selon un autre aspect, la composition selon l'invention peut être une composition solaire, c'est-à-dire une composition aidant à la protection contre le rayonnement solaire. Ainsi, il peut être avantageusement ajouté, à la composition selon l'invention, des actifs aidant à la protection solaire tel que, par exemple, des filtres solaires. Les compositions, objet de l'invention, trouvent leur application dans grand nombre de traitements notamment cosmétiques ou dermatologiques. Elles peuvent constituer une composition cosmétique, notamment pour le traitement, la protection, le soin, le démaquillage et/ou le nettoyage de la peau et/ou des cheveux, et/ou pour le maquillage de la peau, des lèvres, des cils et/ou du corps. La composition selon l'invention peut également consister en des préparations solides comprenant également des savons ou des pains de nettoyage. La composition peut être aussi conditionnée sous forme d'une composition pour aérosol comprenant également un agent propulseur sous pression.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de traitement cosmétique destiné à éclaircir la peau et/ou les poils. L'invention concerne aussi un procédé de traitement cosmétique destiné à traiter les désordres de la pigmentation de la peau. Ces procédés, de traitement cosmétique de la peau et/ou des cheveux, consistent à appliquer sur la surface de la peau, les poils ou les cheveux, une quantité efficace d'un hydrolysat de protéines de plantes de la famille des crucifères tel que défini précédemment, afin d'obtenir l'action désirée. Préférentiellement, le procédé consiste à appliquer sur la surface de la peau, les poils ou les cheveux, une quantité efficace d'un hydrolysat de protéines fermentées de plantes de la famille des crucifères tel que défini précédemment. Des modes de réalisation particuliers de ce procédé de traitement cosmétique résultent également de la description précédente. Le procédé de traitement cosmétique de l'invention peut être, notamment, mis en œuvre en appliquant les compositions cosmétiques telles que définies ci-dessus, selon la technique d'utilisation habituelle de ces compositions, par exemple : application de crèmes, de gels, de sérums, de lotions, de laits, de shampooings ou de compositions anti-solaires, sur la peau ou sur les cheveux, ou encore, application de dentifrice sur les gencives. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif. Exemple 1 : Préparation d'un l'hydrolysat de protéines fermentées de végétaux appartenant au genre des crucifères. Dans une première étape, 1 kg des graines de colza sont délipidées par l'action d'un solvant organique : l'hexane. Après séchage du produit, on obtient un résidu enrichi en protéines (le tourteau). Une étape de fermentation est ensuite réalisée. Le milieu de culture de la fermentation est constitué : - d'un tourteau de colza à une concentration de 18g/l, - de glucose à une concentration de 20g/l, - de chlorure de sodium à une concentration de 4g/l, - de HPO4 à une concentration de 2g/l. Ce milieu est à un pH de 6,5. Il est ensemencé par des levures du genre Rhysopus. La culture s'effectue dans un fermenteur, sous agitation lente (30 tours/minute), à 30°C, durant 24 heures. Le mélange est ensuite mis à l'autoclave durant vingt minutes à 120°C puis il est hydrolyse, par ajout d'une enzyme : la papaïne, à 60°C pendant 4 heures sous
agitation. Ce mélange est ensuite chauffé à 80 °C, centrifugé et filtré jusqu'à l'obtention d'une solution limpide. Il est ensuite concentré sous vide, puis filtré de nouveau sur des filtres-plaques puis sur cartouche stérilisante. On obtient alors une hydrolysat de couleur brune titrant à 30g/l de composés de nature protéique. C'est-à-dire on obtient un hydrolysat contenant une quantité de composés de nature protéique représentant environ 65 % du poids total de la matière sèche. Cet hydrolysat est remis en solution dans du dipropylène glycol. On peut, cependant, effectuer une étape d'extraction d'une fraction protéique à partir du tourteau au préalable de la fermentation ; cette fraction protéique servira ensuite de substrat à la fermentation. Cette extraction est réalisée à l'aide d'une solution aqueuse, basique (à pH 11) et à chaud (50°C), sous agitation constante durant une heure. Le milieu d'extraction est ensuite amené vers un pH de 3 ou 4, par une solution acide, préférentiellement par un acide minéral (acide chlorhydrique ou sulfurique). Un précipité de nature protéique est formé, il est recueilli par centrifugation puis par filtration. Ce mélange est remis en suspension afin de servir de substrat à la fermentation.
Exemple 2 : Mise en évidence de l'effet dépigmentant de l'extrait de l'exemple 1 par des tests ex vivo. L'activité dépigmentante de l'hydrolysat selon l'exemple 1 a été mise en évidence sur un échantillon de peau. Des biopsies de 6 mm de diamètre sont prélevées sur des échantillons de peau humaine. Ces biopsies sont maintenues en survie ex vivo par culture en présence d'un milieu spécifique (DMEM lg/L, HAMF12, S VF et antibiotiques) sur des inserts déposés dans des plaques 6 puits. Les biopsies sont alors traitées avec l'actif à la concentration de 1 % suivant différentes conditions. Des contrôles, c'est-à-dire sans l'application d'actif, sont aussi réalisés pour chacune des conditions. - Condition A : l'actif a été appliqué durant 5 jours, à raison de 2 applications par jour. - Condition B : une irradiation de la peau à 100 mJ/cm2 est réalisée, l'actif est ensuite appliqué 2 fois sur 24 heures. - Condition C : un pré-traitement avec l'actif est réalisé pendant 24 heures (2 applications), suivi de 4 jours de culture sans application, puis une irradiation à 100 mJ/cm2 est réalisée, l'actif est ensuite appliqué 2 fois sur 24 heures.
- Condition D : un pré-traitement avec l'actif est réalisé pendant 24 heures (2 applications), suivi d'une irradiation à 100 mJ/cm2, l'actif est ensuite appliqué pendant 2 jours (2 applications). - Condition E : un pré-traitement avec l'actif est réalisé pendant 24 heures (2 applications), suivi d'une irradiation à 100 mJ/cm2, l'actif est ensuite appliqué pendant 5 jours (2 applications). Une évaluation quantitative de la quantité de mélanine présente dans l'épidémie des échantillons de peau est réalisée histologiquement, au microscope optique, après une coloration suivant la méthode de Fontana-Masson. Les biopsies de peau sont incluses dans la paraffine et des coupes histologiques de 4 μm d'épaisseur sont effectuées. Ces coupes sont alors colorées par la technique de Fontana-Masson : les lames sont déparaffinées, hydratées puis traitées avec une solution d'ammoniaque d'argent. Après un passage de deux minutes au micro-onde, les lames sont rincées, traitées avec du sodium thiosulfate, rincées à nouveau et contre-colorées avec de l'hématoxyline avant d'être déshydratées et montées sous lamelles permettant ainsi la visualisation au microscope optique de la mélanine présente dans l' épidémie. La visualisation, au microscope optique, de la quantité de mélanine a permis de dénombrer trois types de pigmentation de la peau : (+) : Peau fortement pigmentée, c'est-à-dire présentant une charge importante en mélanine (dépôt homogène). (-) : Peau moyennement pigmentée, c'est-à-dire présentant une charge modérée en mélanine (grains de mélanines épars, dépôt non homogène). (- -) : Peau faiblement pigmentée ou non pigmentée.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau ci-dessous
Ces résultats nous permettent de conclure qu'en l'absence d'une irradiation par les uvb (condition A), l'actif diminue le taux de mélanine par comparaison avec l'échantillon de peau non traitée. Par ailleurs, la synthèse de mélanine, induite par les irradiations aux
UVB, est atténuée lorsque l'actif est appliqué pendant 2 à 5 jours après irradiation. Cet effet est encore plus marqué lorsque les échantillons sont pré-traités avec l'actif avant l'irradiation. Ainsi, l'actif selon l'invention permet de diminuer significativement la pigmentation de la peau et permet, vraisemblablement, d'obtenir une inhibition de la synthèse de mélanine.
Exemple 3 : Mise en évidence de l'effet dépigmentant de l'extrait de l'exemple 1 par une étude clinique (tests in vivo). 1. Principe du test Un test in vivo a été effectué sur des volontaires de façon à mettre en évidence l'effet dépigmentant de l'hydrolysat selon l'exemple 1. Ce test a été réalisé par l'étude de l'index mélanique de la surface cutanée ainsi que par une analyse des zones de peau traitées avec l'actif. 2. Modèle expérimental Une étude clinique a été effectuée sur un groupe de 15 volontaires âgés de 45 à 76 ans.
Cette étude a été réalisée en double aveugle contre placebo, les volontaires présentant une pigmentation non homogène de la peau (c'est-à-dire des taches pigmentaires) due à l'âge et/ou à une exposition aux UV. Les volontaires ont appliqué l'actif, formulé à 3 % dans une composition, sur une zone délimitée des avant-bras, dosé à 2 mg/cm2, une autre zone recevant le placebo. Cette application a été réalisée deux fois par jours durant 4 semaines. L'effet dépigmentant a été mesuré par une quantification de l'index mélanique réalisée à l'aide d'un instrument spécifique : le Mexameter MX18 (Courage & Khazaka). L'étude a comporté plusieurs visites de contrôle : une visite avant le début du traitement (T0), et une visite chaque semaine pendant 4 semaines. Des photos ont été prises à T0 et T4 à l'aide d'un appareil photo numérique (Minolta dimage 7i). L'évolution de la pigmentation cutanée a été évaluée après observation clinique ainsi que par la quantification de l'index mélanique. 3. Résultats L'évolution de la pigmentation a été mesurée par la quantification de l'index mélanique de la peau, ainsi que par le traitement statistique des données. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous. L'analyse statistique a été réalisée en utilisant le test non paramétrique de Wilcoxon pour les séries appariées, pour chaque sujet. Le résultat est obtenu selon le calcul suivant :
Score = Dlff. A/Un ou PI = T8 A Un OU PI - TO A/Un ou PI A = Actif ; Un = Non traité ; PI = Placebo Région de rejet : dans la mesure où le sens de la différence est prédictible, la région de rejet sera unilatérale. Le niveau de significativité est α < 5 %.
(***) : très significatif (ns) : non significatif
Ces résultats démontrent que l'application de l'actif selon l'invention réduit considérablement le taux de mélanine présent dans la peau. Cette diminution est notamment observée au niveau des régions hyperpigmentées et après 4 semaines d'application de l'actif, cette diminution étant statistiquement signifiante. Ces résultats ont, par ailleurs, été confirmés après examen clinique : 67 % des volontaires ont présenté une diminution de la pigmentation de la région traitée avec l'actif par rapport à la région traitée avec le placebo. Par ailleurs, il a été noté, chez 86 % des volontaires, une diminution apparente des taches pigmentaires. En conclusion, il est constaté que l'hydrolysat selon l'invention, formulé à 3 % dans un gel, possède un effet dépigmentant, c'est-à-dire un effet éclaircissant de la peau ainsi qu'une action véritable dans la lutte contre les taches pigmentaires.
Exemple 4 : Mise en évidence de l'effet de l'extrait de l'exemple 1 sur la synthèse de mélanine par les melanocytes en culture. 1. Détermination du taux de mélanine Le principe de ce test repose sur un dosage de la mélanine par une méthode spectrométrique. Des boites « diamètre 60 » sont ensemencées avec 1.105 cellules, puis mises en culture durant 24 heures. Ces cellules sont, par la suite, traitées avec l'extrait selon l'invention, en solution à différents pourcentages : 1 %, 3 % et 7% et durant 24 heures. Les cellules sont ensuite récupérées par trypsination. Une moitié de ces cellules est alors utilisée pour le dosage de la mélanine et l'autre moitié pour la détermination du contenu protéique (par la technique de Pierce). Afin de réaliser le dosage de la mélanine,
les cellules sont solubilisées dans 1 mL de NaOH-lN / 10 %-DMSO pendant 2 heures à 80°C, puis centrifugées durant 10 minutes à 10000 g. L'absorbance du surnageant est alors lue à 470 nm puis comparée avec la courbe étalon de la mélanine. Cette courbe étalon est préparée à l'aide de la mélanine synthétique SIGMA ayant des concentrations comprises entre 0,05 et 100 μg/mL et avec une concentration finale enNaOH à 0,2M. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous. Il représent la quantité de mélanine synthétisée, exprimée en pg/μg de protéines, en fonction des différentes conditions d'études.
Ces résultats démontrent que l'extrait selon l'invention permet de faire diminuer significativement la quantité de mélanine présente dans les melanocytes, cet extrait agissant de manière dose-dépendante. 2. Détermination de l'activité de la tyrosinase La tyrosinase est une enzyme-clé dans le mécanisme de formation de la mélanine. La mesure de son activité permet de déterminer la capacité de l'actif selon l'invention à inhiber le mécanisme de formation de celle-ci. Le principe de ce test repose sur une mesure du taux d'oxydation d'un substrat : la L-DOPA. Les cellules sont mises en cultures dans des plaques 6 puits (avec 1.10
5 cellules) durant 24 heures. Elles sont, par la suite, traitées avec l'extrait selon l'invention mis en solution à 3 % durant 24 heures, 48 heures ou 72 heures. Les cellules sont récupérées par trypsination, lavées 3 fois avec du PBS froid puis centrifugées durant 5 minutes à 10000 g. Les cellules sont lysées avec 300μL de tampon sodium phosphate (0,1 M, pH 7) contenant 1 % de triton X-100 + 0,1 mM PMSF. Après une incubation de 30 minutes, l'extrait cellulaire est centrifugé à 10000 g pendant 10 minutes à 4°C, le surnageant est alors récupéré. Le contenu protéique de chaque extrait est déterminé par la technique de Pierce. La L-DOPA est préparée à 2 mg/mL (10 mM) dans un tampon phosphate (0,1 M ; pH7) ; un volume de lOμL de chaque extrait est placé dans une plaque 96 puits et la mesure de l'activité enzymatique est démarée en ajoutant lOOμL de la solution L-DOPA à 37°C, les puits « contôles », contennant 100 μL de tampon de lyse, sont réalisés. La formation du dopachrome est suivie par une mesure de l'absorbance
à 405 nm, toutes les 10 minutes, durant 1 heure, à37°C. Une courbe d'absorbance est alors établie pour chaque condition. L'activité finale de la tyrosinase est présentée en DO/min/g de protéines suivant les différentes conditions d'étude réalisées. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-dessous.
Ces résultats nous permettent de déduire que l'extrait selon l'invention inhibe de manière particulièrement efficace l'activité de la tyrosinase, enzyme-clé dans le mécanisme de formation de la mélanine
Exemple 5 : Préparation de compositions. Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids.
1 - Crème éclat du teint avec protection solaire :
Les constituants de la phase A et de la phase B sont chauffés à une température de 70°C, puis la phase A est émulsionnée dans la phase B. Après émulsion, le Sepigel est incorporé suivi du jus de citron. La phase D est, par la suite, additionnée lorsque la température se situe en dessous de 40°C.
2 - Gel mains anti-tâches :
La phase A est préparée en mélangeant les différentes matières premières la constituant, à 30°C, sous agitation. La phase B est jointe à la phase A en mélangeant avec une agitation à hélice. La phase C est saupoudrée dans le vortex.
3 - Sérum dépigmentant
La phase A est préparée à une température voisine de 30°C, on laisse gonfler le gel ainsi obtenu durant Vi heure. La phase B est ensuite incorporée à froid. La phase C est préparée sous agitation à froid et elle est incorporée au gel. La phase D est ensuite additionnée sous agitation.