WO2006011678A1 - ハイブリダイズ装置およびハイブリダイズ方法 - Google Patents

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WO2006011678A1
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cavity
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substrate
cover member
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Mitsuo Kawase
Yasuko Yoshida
Kazunari Yamada
Tomokazu Takase
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NGK Insulators Ltd
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    • B01L2300/165—Specific details about hydrophobic, oleophobic surfaces

Definitions

  • the present invention relates to a hybridizing device, a hybridizing method, and a nucleic acid array for hybridizing a nucleic acid.
  • Variations and instabilities such as signal intensity obtained as a result of the hybridization reaction are mainly caused during the hybridization reaction.
  • the means of adding external force to the reaction space or the internal fluid component that is the field of the eight hybrids reaction not only the instability of the hybridization reaction is increased, but also the purpose of increasing the efficiency of the hybridization reaction.
  • sufficient effects have not been obtained. Therefore, even in the present situation, the instability of the hybridization reaction in the minute reaction space is still a key to solve the heterogeneity. There is hope, but no specific solution has been found.
  • one object of the present invention is to provide a high-pridizing apparatus and a high-pridizing method capable of realizing a hybridization reaction with good reproducibility.
  • Another object of the present invention is to provide a hybridization apparatus and a hybridization method capable of realizing an eight-hybridization reaction with good accuracy (accuracy).
  • the present inventors have studied the above-mentioned problems. As a result, the surface characteristics and the structure of the cavity exposed to the cavity where the hyper-soybean reaction is carried out have a large signal intensity and its variation (coefficient of variation). It was found that the signal intensity was improved by controlling these, and the hybrid reaction with good reproducibility could be carried out by suppressing the variation, and the present invention was completed. That is, according to the present invention, the following means are provided.
  • a hybridizing apparatus for nucleic acid hybridizing reaction including a fixing region of the nucleic acid probe on a substrate on which a nucleic acid probe is fixed.
  • An apparatus includes a cover member that forms a cavity capable of storing a liquid for reaction, and has a hydrophobic region in at least a part of the region exposed to the inside of the cavity.
  • at least a part of the cover member has a hydrophobic region
  • the cover member has a hydrophobic region in a region facing the fixed region of the nucleic acid probe.
  • the hydrophobic region preferably has a water contact angle of 30 ° or more.
  • a hybridizing apparatus for a hybridizing reaction of a nucleic acid comprising a fixed region of the nucleic acid probe on a substrate on which the nucleic acid probe is fixed.
  • a device is provided in which the thickness of the region facing the fixed region of the cable is 300 im or more.
  • the cover member has a hydrophobic region in at least a part of the region exposed in the cavity.
  • a hybridizing apparatus for nucleic acid hybridizing reaction comprising the nucleic acid probe fixing region of the substrate on which the nucleic acid probe is fixed.
  • a device is provided that includes a cover member that forms a cavity capable of storing a liquid for a reaction, and a coefficient of variation of a spatial height in a fixed region of the nucleic acid probe in the cavity is 50% or less.
  • the space height is preferably 15 or more
  • the cover member has a hydrophobic region in at least a part of the region exposed in the cavity. Is a preferred embodiment.
  • the cover partial member includes at least a sheet body and a spacer interposed between the sheet body and the substrate.
  • the cover member has an opening for supplying a liquid into the chamber in a region facing the nucleic acid probe fixing region, and the opening is a part of the opening. It is preferable that the inner peripheral wall constituting the cavity is formed so as to form a bulged portion that bulges outward. In this aspect, the opening is a longitudinal direction of the cavity. It is preferable that they are respectively formed at both end portions.
  • the material that forms the region of the cover member facing the nucleic acid probe fixing region is polycarbonate, polyolefin, polyamide, polyimide, acrylic resin, and fluorides and polyhalogens thereof.
  • a preferred embodiment is one or more selected from the group consisting of vinyl halides.
  • the region of the force bar member facing the nucleic acid probe fixing region includes a recess and Z or It is preferable to have a convex part.
  • the cover member is provided with a tab layer that is detachably integrated with the substrate and has an exposed end portion that is exposed from the outer extension of the substrate and the cover member. It is preferable that
  • a nucleic acid hybridizing method for hybridizing reaction of any of the above nucleic acids to a substrate having a fixed region on which a nucleic acid probe is fixed. And a hybrid reaction between the test nucleic acid and the nucleic acid probe in a liquid containing the test nucleic acid supplied to the cavity in the cavity formed including the fixed region.
  • a method comprising:
  • the hybridizing step is performed by leaving the substrate and the hybridizing device stationary.
  • the high-pridation step stirs the liquid in the cavity.
  • the liquid may be stirred by moving the substrate on which the cavity is formed and the hybrid device.
  • a gas is present in the cavity, and the liquid is preferably stirred by moving the gas in the cavity.
  • a method for hybridizing nucleic acids wherein a liquid for hybridization including a fixed region of a substrate having a fixed region to which a nucleic acid probe is fixed is contained.
  • Carrying out a hybridization reaction between the test nucleic acid and the nucleic acid probe in a liquid containing the test nucleic acid supplied to the cavity in the cavity formed to be storable, and the hybridization step comprises
  • the method includes a step of stirring the liquid by moving the gas present in the cavity in the cavity.
  • the hybridizing step may be performed by moving a member constituting the cavity including the substrate.
  • the hybridizing step May be performed by applying an external force to an elastically deformable cover member that is combined with the substrate to form the cavity.
  • a hybridization reaction kit for a nucleic acid hybridization reaction the substrate having an immobilization region for immobilizing a nucleic acid probe, and A cover member for forming a cavity capable of storing a liquid for the hybridization reaction including the immobilization area of the nucleic acid probe on the substrate, and a hydrophobic area in at least a part of the area exposed to the interior of the cavity
  • a kit is provided.
  • a region of the cover member facing the nucleic acid probe fixing region has a concave portion and / or a convex portion.
  • the said cover member is provided with the tab layer which is integrated with the said board
  • a nucleic acid array comprising a substrate having a fixed region to which one or more nucleic acid probes are fixed, and the fixed region is included. And a cover member that forms a cavity capable of storing a liquid for a nucleic acid hybridization reaction, and has an hydrophobic region at least partially exposed inside the cavity.
  • the cover member is detachably attached to the substrate.
  • the substrate and the cover member are integrated with the substrate so as to be peelable, and are exposed through a tab layer having an exposed end portion that is exposed from the outer extension of the substrate and the cover member and can be gripped. It is preferable that they are laminated.
  • the region of the cover member facing the nucleic acid probe fixing region has a concave portion and a groove or convex portion.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a hybridizing apparatus of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a plan view and a cross-sectional view of the hybrid device shown in FIG.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a measurement site for measuring the space height.
  • FIG. 4 is an array diagram of c D N A spots in the D N A microarray fabricated in Example 1.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the material of the eight hybrid device and the signal intensity.
  • Fig. 6 is a diagram showing the relationship between the thickness of the opposing region of the high pre-hydidizer and the signal intensity.
  • Fig. 7 shows the relationship between the variation coefficient of the spatial height of the cavity and the variation coefficient of the signal intensity.
  • Figure 8 shows the relationship between the spatial height of the cavity and the coefficient of variation of the signal intensity.
  • FIG. 9 is a view showing a cover member having a tab layer and an array.
  • Fig. 10 shows the relationship between the spatial height of the cavity and the variation coefficient of signal intensity.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating a cover member and an array according to the sixth embodiment. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the hybridizing device of the present invention is a hybridizing device for nucleic acid hybridization reaction, and includes a fixed region of the nucleic acid probe of a substrate on which a nucleic acid probe is fixed. A cover member capable of forming a cavity capable of storing the liquid.
  • the hybrid device according to the first aspect is characterized in that a hydrophobic region is provided in at least a part of the region exposed in the cavity. According to this hyper-pridizing device, hybridization can be promoted, and the detection intensity (signal intensity) of the hybridization product can be increased. For this reason, an efficient hybridization reaction can be realized over the entire fixed region of the nucleic acid probe, and as a result, the reproducibility of the hybridization reaction can be improved. Can be improved.
  • Providing a hydrophobic region in a microcavity in which a liquid for a nucleic acid hybridization reaction is stored can provide such an eight-blyidization reaction promoting effect that exceeds our expectation.
  • the present invention is not theoretically constrained, the above effect of the present invention has a hydrophobic region in the cavity, which promotes convection of the hybrid solution and diffusion of the test nucleic acid in the cavity. It is inferred that this is due to the increased probability of contact with nucleic acids and eight hybridisation.
  • the hybrid device is characterized in that the thickness of the region of the cover member facing the nucleic acid probe fixing region is 300 m or more. According to this hybridizing apparatus, variation in the signal intensity of the hybridized product can be reduced, and the detection accuracy and reproducibility of high pre-hybridization can be improved.
  • the present invention is not theoretically constrained, when the thickness of the cover member in the region facing the fixed region of the nucleic acid probe is 300'm or more, the hybrid solution is stored and heated in the cavity. However, it can be inferred that the hybridization reaction at multiple positions on the substrate can be performed uniformly because it becomes a thermal buffer material with a certain heat capacity.
  • the hybrid device is characterized in that a coefficient of variation of a spatial height in a fixed region of the nucleic acid probe in the cavity is 50% or less. .
  • this hybridizing apparatus variation in the signal intensity of the hybridized product can be reduced, and the detection accuracy of the hybridization can be increased.
  • the present invention is not theoretically constrained, if the coefficient of variation of the spatial height of the cavity is 50% or less, convection of the hyper-soybean solution or diffusion of the test nucleic acid due to the surface characteristics and shape of the cavity inner wall It is inferred that the hybridizing reaction at a plurality of positions on the substrate can be carried out uniformly by suppressing adverse effects on the substrate.
  • the nucleic acid hybridization method of the present invention includes the above-mentioned fixed region of the substrate having the fixed region to which the nucleic acid probe is fixed, in the cavity formed so as to be able to store a liquid for hybridization.
  • a step of performing a hybridization reaction between the test nucleic acid and the nucleic acid probe in a liquid containing the test nucleic acid supplied to the cavity, and the gas in the hybridization step is moved in the cavity. It is a special feature. According to this hybridizing method, as a result of improving the high-pridation efficiency during the eight-pridation reaction, it is possible to increase the signal intensity due to the hyper-pridation product, and to reduce variations.
  • FIG. 1 shows an example of the hybridizer together with a substrate
  • FIG. 2 shows a plan view and a cross-sectional view thereof.
  • the hybridizer 2 is a device for hybridizing reaction of nucleic acids.
  • the nucleic acid may be any nucleic acid that at least partially hybridizes with other nucleic acids by nucleic acid base pairing. Therefore, nucleic acid is a concept that includes both oligomers and polymers of natural or synthetic nucleotides, and also includes DNA, genomic DNA, RNA such as cDNA, RNA, mRNA, and peptide nucleic acids.
  • Hybridization reaction means a binding reaction between complementary strands by base pairing between nucleic acid molecules.
  • the substrate 4 to which the present hybridizer 2 is applied includes at least a nucleic acid fixing region 6 to which a nucleic acid probe is fixed.
  • the nucleic acid immobilization region 6 is formed with one or more minute regions (also referred to as spots) each having a nucleic acid probe immobilized thereon. Alternatively, it is an area prepared for forming the minute area.
  • the nucleic acid probe immobilization method and immobilization form to the substrate 4 are not particularly limited and include all known forms at the time of the present application. It is preferable that the nucleic acid immobilization region 6 on the substrate 4 is substantially flat even when it has a minute three-dimensional shape.
  • the substrate 4 can have one or more nucleic acid immobilization regions 6 directly on the substrate 4 or through inclusions such as a porous body as necessary. When the substrate 4 has two or more nucleic acid immobilization regions 6, these may be separated from each other by a hydrophobic separation portion.
  • the shape of the substrate 4 is not particularly limited.
  • a concave body having a flat bottom that functions as the base plate 4 can be mentioned.
  • various materials can be used in addition to various materials conventionally used for this type of substrate.
  • ceramics containing silicon-based ceramics such as glass, silicon dioxide, and silicon nitride, resins such as silicone, polymethyl methacrylate, and poly (methacrylate), metals such as gold, silver, and copper can be used.
  • Appropriate coats may be applied to impart desired surface properties.
  • glass substrates, silicones, and acrylic resins can be used.
  • the most typical example of such a substrate 4 is a substrate for a DNA chip or a DNA microarray to which a DNA probe or the like is immobilized, or a DNA microarray or a DNA microarray or the like not to be immobilized (should be immobilized). is there.
  • the hybridized device 2 includes a cover member 10 used for the substrate 4.
  • the cover member 10 constitutes a cavity 12 for a hybridization reaction including the nucleic acid fixing region 6 of the substrate 4.
  • the cover member 10 may be attached to the substrate 4, but as a result of being attached to the substrate holder that accommodates or holds the substrate 4, the cover member 10 is fixed to the substrate 4. 1 2 may be included.
  • Examples of the former include a flat or flat bottom
  • Examples of the latter include a form that is mounted on a substrate holding body having a flat part or a concave part on which a flat board is placed. Can be mentioned.
  • the cavity 12 is a space including the nucleic acid immobilization region 6, and is a space formed so as to be able to store a liquid for the hybridization reaction (hereinafter simply referred to as a hybridization liquid). .
  • the cavity 1 2 preferably has a space having a predetermined space height (or space thickness) on the nucleic acid fixing region 6. That is, the cover member 10 is a region facing the nucleic acid fixing region 6 of the substrate 4 (hereinafter simply referred to as a facing region) 14 even when the hybridized liquid is not stored. It is preferable to have a configuration that can be held.
  • the cover member 10 Since the cover member 10 has such a configuration, the cover member 10 can be attached to the nucleic acid immobilization region 6 only by attaching the cover member 10 to the substrate 4 or the like without performing any special operation on the substrate 4.
  • a cavity having a space height can be formed. [0 0 2 6]
  • the cavity 12 At least the nucleic acid fixing region 6 of the substrate 4 and the opposing region 14 of the force bar member 10 are exposed, and in addition to these regions, the cavity 12 is The additional surfaces necessary for shielding from the outside are exposed.
  • the additional surface may be a part of the substrate 4 or the cover member 10, or may be constituted by a separate member.
  • the planar form of the cavity 12 is not particularly limited, but it is preferable that the cavity 12 has no protrusions or corners.
  • the hybridized liquid tends to stay in such a place.
  • the portion bulges outward if the portion is formed in the vicinity of a side wall portion having a curved shape or the like that is sufficiently small to prevent liquid retention as a whole, Residence is suppressed.
  • Preferred plane forms include ellipses and circles as shown in FIGS.
  • the facing region 14 of the cavity 12 may be convex or concave with respect to the direction away from the substrate 4, but is preferably flat. If it is flat, the cavity has a roughly constant spatial height relative to the nucleic acid fixation region 6 1 2 This is because it can be configured easily.
  • such a cover member 10 has a predetermined height around the flat plate body 10 a including the opposed region 14 when the substrate 4 is a flat plate. It is also possible to adopt a form having the spacer 8.
  • the cover member 10 is between the plate-like body 10 a having substantially the same size as the substrate 4 and having a substantially flat surface at least on the side facing the substrate 4, and the substrate 4 on the periphery thereof. And a spacer 8 interposed therebetween.
  • it may be a form having a dome having a predetermined shape covering itself with the nucleic acid fixing region 6.
  • the cover member 10 having such a configuration can be a molded body of a polymer material.
  • the substrate 4 when the substrate 4 is a concave body having the bottom of the concave portion as the nucleic acid fixing region 6 or has a peripheral portion of a predetermined height on the outer periphery of the nucleic acid fixing region 6, the substrate 4 further has a bottom portion such as a substrate holder.
  • the nucleic acid immobilization region 6 is positioned at the bottom of the concave portion when the cover member 10 is mounted, the flat plate-like body mounted on the vertical wall portion of the peripheral edge of the concave portion should be used. You can also.
  • spacer 8 As a material of the spacer 8, for example, acrylic resin, thermoplastic elastomer, natural or synthetic rubber, silicone, polyolefin, polyamide, polyimide, vinyl halide, polycarbonate can be used. . [0 0 2 9] (Hydrophobic region)
  • the hybrid device 2 has a hydrophobic region 16 in at least a part of the region exposed in the cavity 12.
  • Hydrophobic means at least surface characteristics showing water repellency, and preferably means having higher water repellency than general soda glass not subjected to hydrophilic treatment or the like.
  • water repellency can be expressed by the contact angle of water on a flat surface.
  • the water contact angle of the hydrophobic region is preferably 30 ° or more, more preferably 60 ° or more, and further preferably 70 ° or more. Most preferably, it is 90 ° or more.
  • the contact angle means that when a droplet is placed on a horizontal solid plate, The angle of the part in contact with the solid shall be said.
  • As the contact angle a static contact angle, a forward contact angle or a receding contact angle as a critical value, and a dynamic contact angle can be used, but a static contact angle measured by a droplet method should be used. Is preferred.
  • tangential method (2) ⁇ / 2 method
  • (3) three-point click method for measuring the static contact angle.
  • the tangent method of (1) is a method of directly obtaining the contact angle by using a scanning microscope or the like to align the cursor with the tangent of the droplet. This is a method to obtain the contact angle by doubling the angle between the connecting straight line and the solid surface.
  • (3) The three-point click method uses two points of contact between the droplet and the solid surface and the vertices on the computer image. This method is obtained by clicking and image processing. In these droplet methods, it is preferable to obtain the contact angle by the methods (2) and (3).
  • the hydrophobic region 16 may be provided in at least a part of the region exposed in the cavity 12, but is preferably provided in the cover member 10. By providing the cover member 10 with the hydrophobic region 16, the signal intensity can be effectively improved.
  • the cover member 10 preferably has a hydrophobic region 16 in the opposing region 14, and more preferably, uniformly in the entire opposing region 14 corresponding to approximately the entire nucleic acid fixing region 6. It is preferable to provide a hydrophobic region 16.
  • a plurality of hydrophobic regions 16 may be provided in a dispersed manner in the opposing region 14, but are preferably provided continuously so as to cover approximately the entire opposing region 14. Further, the entire region exposed to the cavity 12 of the cover member 10 may be a hydrophobic region 16.
  • the hydrophobic region 16 can be formed, for example, by using a hydrophobic material as the material of the cover member 10 itself, or against the region where the hydrophobic region 16 is to be formed. It can also be formed by imparting a hydrophobic material and a surface morphology that exhibits Z or hydrophobicity (water repellency). Construct hydrophobic region 1 6
  • the hydrophobic material include polyolefins such as polycarbonate, polyethylene, and polypropylene, vinyl halides, polyamides, polyimides, acrylic resins, and fluorides or chlorides of these resins.
  • Examples of the surface form exhibiting water repellency include forms in which the surface of various materials is roughened so that the contact angle becomes 90 ° or more by chemical modification or mechanical treatment.
  • the distance between the nucleic acid immobilization region 6 in the cavity 12 and the opposite region 14 facing it is preferably 50% or less.
  • the variation coefficient of the spatial height in the nucleic acid fixing region 6 is 50% or less, it is possible to suppress variation in the signal intensity of the hyper-soybean product. Suppressing variations in signal intensity means that highly accurate detection is possible and that an eight-ibridz reaction with high reproducibility can be realized. For example, if the spatial height variation coefficient is 50% or less, the signal intensity variation coefficient can be easily suppressed to 20% or less.
  • the variation coefficient of the space height is more preferably 40% or less, further preferably 30% or less, and most preferably 20% or less. According to the knowledge obtained by the present inventors this time, the coefficient of variation of the spatial height of the nucleic acid fixing region 6 in the cavity 12 is below a certain value, indicating that the hybridizing solution per unit area of the nucleic acid fixing region 6 It has been found that it greatly contributes to the uniformity of volume (liquid thickness).
  • the average height of the space of the cavity 12 is preferably 15 m or more. This is because when the distance is 15 m or more, variations in the signal intensity of the hybridized product are well suppressed. More preferably, it is 20 ⁇ m or more.
  • the spatial height of the cavity 12 is 20 m or more.
  • the effect of the area exposed in the cavity 12 2 is suppressed by the liquid thickness in the nucleic acid fixing area 6 secured by the cavity 12 and thereby hybridizing. Ensure liquid convection or diffusion of test nucleic acid I can keep it.
  • the upper limit of the average value of the space height is preferably 100 m or less.
  • the area on the substrate 4 such Kiyabiti 1 2 is compartment is preferably 1 mm 2 or more 2 0 0 0 mm 2 or less.
  • the average value of the spatial height and the coefficient of variation of the spatial height in the cavity 1 2 should be measured, for example, by the following method (hereinafter referred to as the height-surface waviness method). Can do.
  • a dividing line that divides the cavity 12 formed by the cover member 10, preferably the center line of the cavity 12 or the dividing line of the equal dividing line is used as a measurement part.
  • the measurement site can be a combination of two dividing lines that bisect each of the longitudinal direction and the short direction of the cavity 12 (the dividing line is a total line). Two).
  • it can also be a combination of dividing lines that are equally divided into four in the longitudinal direction and the short direction (total of 6 dividing lines).
  • Fig. 3 (c) it can be a combination of a dividing line that is equally divided into 8 in the longitudinal direction and a dividing line that is divided into 4 in the short direction (total of 10 dividing lines).
  • the reference height (H) is the nucleic acid fixation at the peripheral edge of the cover member 10 corresponding to the outer edge of the cavity 12 formed when the cover member 10 is mounted so as to face the nucleic acid fixation region 6 of the substrate 4. This is the average height from the surface including region 6 (hereinafter referred to as the peripheral edge height).
  • the edge height is measured at the edge on the dividing line, as shown in Figure 3. Since the dividing line divides the cavity 12, the height of the peripheral part of one dividing line is measured at two points on the opposing peripheral part. Therefore, the number of measurement points for the peripheral height is the number of dividing lines X2.
  • the number of measurement points of the peripheral height preferable for obtaining the number is 4 or more, and more preferably 20 or more.
  • the amount of undulation on the surface of the cover member 10 is the unevenness of the surface relative to the peripheral portion of the outer surface (the surface on the side not facing the substrate 4) corresponding to the facing region 14 of the cover member 10 on the dividing line. Measured as the amount of fluctuation. As the amount of waviness, it is only necessary to measure one dividing line as the measurement trajectory and use only the maximum value and the minimum value. As a result, the number of measurement points for the undulation amount is two for each dividing line, and the number of dividing lines X2 is the number of measurement points for the undulation amount. It should be noted that the number of waviness measurement points that are preferable for obtaining the average value and coefficient of variation of the space height is 4 or more, and more preferably 20 or more.
  • the film thickness of the cover member 10 means the film thickness of the counter area 14, and the average value (Tave) of the film thickness of the counter area 14 may be used, or the maximum value of the above swell amount may be used.
  • the film thickness (Tmax, Tmin)) of the part where the minimum value is measured may be used, but the average value is preferably used.
  • the film thickness can be measured by a known measuring device such as a measuring device such as a caliper.
  • the maximum space height and the minimum space height can be obtained from the maximum value and the minimum value of the waviness (M A X and M I N respectively).
  • Maximum space height standard height (H) + maximum value of swell (MAX) — film thickness (T ave or Tmax)
  • Minimum space height reference height (H) + minimum waviness (MIN) — thickness (Tave or Tmin).
  • the height of the peripheral edge of the cover member 10 at a predetermined position can be measured by, for example, a digital length measuring device (Digimicro, manufactured by Nikon Corporation).
  • the amount of waviness can be measured with a surface roughness shape measuring machine (Surfcom, manufactured by Tokyo Seimitsu Co., Ltd.).
  • the capacity of the cavity 12 is appropriately designed as necessary, but is preferably 0.1 L or more and 2 00 or less. More preferably, it is at least 1 0 0 0 / x L or less.
  • the portion including the facing region 14 of the cover member 10 has light transmittance so that the inside of the cavity 12 can be visually recognized from the outside.
  • the average thickness is preferably 300 m or more. This is because when the average thickness is 300 m or more, the variation coefficient of the signal intensity of the hybridized product is well suppressed.
  • the thickness is more preferably 3500; m or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but it is preferably 300 m or less in consideration of the fact that the heat capacity becomes too large due to the thickness and nonuniformity of the temperature distribution of the cavity occurs during heating.
  • the cover member 10 has an opening 20 for injecting the hybridized liquid. It is preferable to provide two or more openings 20, and it is preferable that at least one opening 20 is opened in the vicinity of the contour defining the cavity 12 in the cover member 10. By opening at such a site, the hybrid liquid injected into the cavity 12 is less likely to stay on the inner wall of the cavity 12, and the hybrid liquid is easily diffused throughout the entire cavity 12. More preferably, the opening 2 0 is the front More preferably, the inner wall of the cavity 12 is formed by the opening 20 so as to form a bulging portion bulging outward. That is, as shown in FIG.
  • the openings 20 opened circularly in the cover member 10 are formed at both ends in the major axis direction of the elliptical cavity 12 having a planar shape, and the both ends A part of the opening edge of the opening 20 is formed so that both ends of the cavity 12 bulge outward.
  • the hyperpredation liquid is easily diffused to both sides and the opposite side of the opening 20.
  • the opening 20 is sealed with a suitable sealing material.
  • the cover member 10 used in the hybrid device 2 is formed by laminating the spacer 8 on the flat plate member 10 a that substantially constitutes the cover member 10 via the seal layer 5. Can be obtained.
  • the seal layer 5 can be an adhesive layer or a pressure-sensitive adhesive layer that bonds the flat plate 10 a and the spacer 8 together.
  • the force bar member 10 that forms a plurality of cavities 12 on the substrate 4 by using the spacer 8 configured to block adjacent sections with respect to one cover member 10 is also easy. Can get to.
  • the cover member 10 can be obtained not as a composite but as an integral resin molded body. Further, it is preferable to form an adhesive or pressure-sensitive adhesive layer on the portion of the cover member 10 to be attached to the substrate 4 or the substrate holder, and such an adhesive. The layer is preferably protected by a peelable sheet. Therefore, as another embodiment of the present invention, a hybrid reaction kit including the hybrid device 2 and the substrate 4 is also provided. If a nucleic acid probe or the like is fixed to the substrate 4 provided in such a kit, an effective and preferable nucleic acid array can be obtained.
  • the cover member 10 may be provided separately to the substrate 4 or the substrate holder and may not be provided so as to be able to be mounted in a timely manner.
  • Cover member 10 is substrate 4 or substrate holding It may be previously integrated with the body by adhesion, or may be integrated as a molded body integrated with the substrate 4 or the like. Further, the cover member 10 may be formed so as to be detachable from the substrate 4 or the like, or may be integrated with the substrate 4 or the like for cleaning or signal detection.
  • a portion including the facing region 14 of the cover member 10 may be formed so as to be capable of inertial deformation.
  • the liquid in the cavity 12 is agitated by applying a gas pressure or mechanical external force to the opposing region 14 and deforming it. be able to.
  • the side exposed to the cavity 12 of the facing region 14 of the cover member 10 (the surface on the side facing the substrate 4) is provided with a concave portion and / or a convex portion. Can do. When the liquid in the cavity 12 is agitated, this unevenness can complicate the flow of the liquid to improve the agitation efficiency, and thus improve the hybrid efficiency.
  • Such concave portions and Z or convex portions may be provided integrally with the material constituting the opposed region 14 of the cover member 10, or may be provided on the surface of the cover member 10 on the side facing the substrate 4. It can also be formed by attaching a sheet-like body having a concave portion and / or a convex portion.
  • the size of the concave and convex portions is not particularly limited, and is set according to the space height of the cavity. In addition, you may provide the hydrophobic area
  • the cover member 10 of the cover member 10 A tab layer for releasing the laminated state of the cover member 10 and the substrate 4 can be provided at the contact portion with the surface.
  • the tab layer 30 has an exposed end exposed from the outer extension of the substrate 4 and the cover member 10 in a state where the cavity 12 is formed by the substrate 4 and the cover member 10. preferable.
  • the exposed end portion 32 is preferably exposed with a length that allows gripping.
  • the tab layer 30 is integrated so that it can be peeled at least from the substrate 4.
  • the substrate 4 side of the tab layer 30 has an adhesive property that can be peeled off, or is integrated with the substrate 4 through an adhesive layer having the same adhesive property. For this reason, when releasing the laminated form of the substrate 4 and the cover member 10 such as after hybridization, the exposed end portion 32 of the tab layer 30 is grasped and pulled outward. The laminated state of the tab layer 30 and the substrate 4 collapses. As a result, the laminated state of the substrate 4 and the force bar member 10 is also released. According to such a release mode, the cover member 10 can be easily removed without imposing a large load on the substrate 4.
  • the exposed end portion 3 2 of the tab layer 30 is only required to be gripped by a tool or a finger, and may be a small part of the tab layer 30 or the substrate 4. It may be provided over the periphery of the laminated body with the cover one member 10.
  • the tab layer 30 is preferably formed of an adhesive material that can be peeled off from the substrate 4 (for example, a resin material or a rubber material such as silicon rubber). In this case, a special adhesive layer is not necessary between the substrate 4 and the substrate 4. Further, the tab layer 30 may or may not be a part of the cover member 10.
  • the force bar member 10 may be integrated so as to be peelable. In the latter case, the load on the substrate 4 can be further reduced as a result.
  • the hybridization reaction using this hybridization apparatus 2 can be performed according to a conventional method.
  • the hybridizing process using the hybridizing apparatus 2 or the cover member 10 can be performed as follows.
  • a cover member 10 having a seal layer on the mounting side to the substrate 4 is attached to the DNA microarray as the substrate 4 through the seal layer, and a hybrid solution prepared by a predetermined method is injected from the opening 2.
  • Both of the two openings 20 are sealed with a sealing material, and left at a temperature of 25 to 80 and the temperature below for a predetermined time.
  • the present hybridizing device 2 or the cover member 10 can be preferably used in a high-pridizing method for performing a hybridization reaction in a stationary state and various inspection methods including such a hyper-pridizing step.
  • the hybridizing reaction can be sufficiently promoted even by standing still, the variation factor by the operator such as the difference in the handling operation of the substrate 4 and the cover member 10 by the operator and the hybridizing device 2 at the time of hybridization can be obtained. It is possible to obtain highly reproducible hybrid results by suppressing the influence of variation factors due to the external environment, such as the horizontal position of the place of stationary and the magnitude of external force.
  • the spatial height of the cavity 12 and the coefficient of variation thereof are controlled, and the thickness of the opposing region 14 is controlled.
  • the signal intensity of the hyper-soybean product can be achieved with a simple configuration without using the various methods previously described for suppressing variations in the signal intensity of the hybridized product.
  • the effect of suppressing the variation in the amount can be obtained.
  • Such a structure or dimensional control of the cavity 12 is an effect obtained by homogenizing the amount of the hybridizing solution per unit area of the nucleic acid fixing region 6 or by a thermal buffering effect.
  • the substrate constituting the cavity 1 2 4 and the cover member 10 may be stirred to stir the liquid inside. Since at least a part of the cavity 1 2 has the hydrophobic region 16, the liquid is repelled in the hydrophobic region 16 when the aqueous liquid in the cavity 1 2 is agitated. 12 The movement of the hybrid solution in 2 is promoted, and as a result, the hybrid efficiency is further improved.
  • a gas for example, air
  • an inert gas such as nitrogen
  • the gas is held at a fixed position. Therefore, in the gas retaining part (gas reservoir), the hybridization is not performed.
  • the movement of the liquid in the cavity 1 2 can be promoted by applying an external force that moves the liquid in the cavity 1 2 in the presence of gas.
  • the hybridization reaction can be promoted.
  • the operation mode for moving the gas reservoir in the cavity 12 while maintaining its shape approximately is preferably a rotational motion, a seesaw motion, or a combination thereof. According to such an operation mode, the inside of the cavity 12 can be stably moved to the gas reservoir.
  • the rotating radius the distance from the center of rotation to the center of gravity of the array (hybridizing device and substrate)
  • the rotation speed (rpm) force is preferably 60 rpm or less. If it is 60 rpm or less, the form of the gas reservoir tends to be stably maintained.
  • it is 20 rpm or less, more preferably Is less than l O rpm. This is because if the pressure is less than O rpm, the gas can be stably moved in the cavity 1 2 without much separation. Most preferably, it is 5 rpm or less. This is because if it is 5 rpm or less, the gas can be stably moved in the cavity 12 without temporarily separating the gas, and the variation can be suppressed well as the signal intensity increases.
  • the distance from the fulcrum (the distance from the fulcrum to the center of gravity of the array (hybridizer and substrate)) is 0 to 76 mm, and the vertical movement is more than 5 ° in total angle 100 ° In the following range, it is preferable that the seesaw motion (one up / down motion) is 1 to 120 times.
  • the facing region 14 of the cover member 10 can be deformed by inertia and the facing region 14 is deformed by an external force.
  • the volume of the gas may be in a range in which such a promoting effect is obtained, but is preferably 50% or less of the total volume of the cavity 12. If it is 50% or less, the hybridizing reaction can be carried out while suppressing adverse effects on the hybridizing reaction due to the presence of bubbles. More preferably, it is 30% or less. If it is 30% or less, the gas expansion during heating and the effect when the air remaining on the bonding surface during the production of the chamber expands can be suppressed, and the hybridization can be ensured. More preferably, it is 15% or less, and even if it is 5%, a good hybridization reaction can be performed.
  • a substrate 4 having a nucleic acid immobilization region on which one or more nucleic acid probes are immobilized in advance, and a nucleic acid containing the nucleic acid immobilization region.
  • a nucleic acid array comprising a cover member 10 forming a cavity capable of storing a liquid for a hyperpridation reaction, and having a hydrophobic region at least partially exposed inside the cavity.
  • the cover member 10 can be integrated in advance with the substrate 4 or the substrate holder by bonding or molding. Further, the cover member 10 integrated in advance with respect to the substrate 4 or the substrate holder may be separable from the substrate 4 or the like.
  • the array may also have an evening layer 3 2. In this array, the various aspects of the cover member 10 and the substrate 4 described above are applied as they are.
  • the test in the hybridizing solution supplied to the cavity 12 in the cavity 12 including the fixing region 6 of the substrate 4 is performed.
  • a nucleic acid hybridization method in which an insoluble gas present in the cavity 2 is moved in the cavity in a hybridization step in which a hybridization reaction between the nucleic acid and the nucleic acid probe is performed.
  • the cavity 12 in this hybridizing method does not need to have the hydrophobic region 16, and even if it does not have the hydrophobic region 16, the liquid in the cavity 12 can be agitated by the movement of the gas reservoir. it can.
  • the various aspects described above can be applied as they are for the movement of the gas or the gas reservoir.
  • the cavity 12 in the hybridizing method may have a concave portion and / or a convex portion in the opposing region 14 facing the fixed region 6 of the substrate.
  • a cavity 12 formed by a cover member 10 having a concave portion and a Z or convex portion on the side facing the substrate 4 of the opposing region 14 facing the fixed region 6 of the substrate 4 and the substrate 4.
  • the moving range of the gas reservoir is also changed by the unevenness facing the fixed region 6, so that a higher stirring effect can be obtained.
  • an improvement in signal intensity when a hybrid device (cover member) having a hydrophobic region was used was evaluated.
  • a force bar member made of a hydrophobic material is set on a DNA microarray in which cDNA is fixed on a glass substrate, and complementary cDNA hybridization is performed. The signal intensity of the hybridized product is thereby increased. evaluated.
  • a slide glass was used as a cover member.
  • rat-derived cDNA were prepared, and as shown in Fig. 4, a fixed amount was spotted on a glass substrate coated with poly L-lysine at 500 points. A total of 9 spots of genes were spotted. The spot diameter at 5000 points was about 150 m, and the spot diameter at 9 points was also about 150 m. The glass substrate on which the cDNA was spotted was heat-treated at 80 ° C.
  • a spacer material (PET thickness 160 m) having the same size on one side of a 76.2 mm ⁇ 25.4 mm double-sided adhesive film and an adhesive surface on one side.
  • a laminated body having an oblong hole portion (major axis: about 50 mm x minor axis: about 20 mm) that has been punched out with an oval blade.
  • a 76.2 ⁇ 25.4 polycarbonate film (film thickness 300 izm) was attached to the other side of the film to obtain a hybrid device.
  • This hybrid device is attached to the array to form an ellipse on the array to form a cavity, and an opening for supplying the hybrid liquid is formed at both ends along the major axis direction of the cavity.
  • This hybridizing apparatus was operated in the same manner as in the Example except that a glass plate (thickness 300 fim) was used instead of the polycarbonate film, thereby obtaining a hybrid apparatus as a control example. Hybridization was carried out by the following method for the hyperpridation apparatus of the example and the control example, and then the signal intensity was measured by fluorescence and numerical analysis was performed.
  • the hybridization is performed by attaching the hybridization device to the prepared array, and using the labeled cDNA (final concentration 5 XSSC, 0.5% SDS) prepared from one opening. Poured and sealed both openings.
  • the array and the hybridization apparatus in this state were hybridized in a stationary state at 16 ° C. for 16 hours (42 ° C.). 1 After 6 hours, detach the hybridizer from the array and remove the array in the order of (2 XSSC, 0.1 SDS) solution, (1 XSSC) solution, and (0.1 XSSC) solution for 5 minutes. Washed by shaking.
  • Example 2 the relationship between the thickness of the cover member facing region (the region of the cover member facing the nucleic acid fixing region of the substrate) and the variation coefficient of the signal intensity is evaluated.
  • the coefficient of variation of the signal intensity is one of the effective indicators that show the success or failure of high predization.
  • Example 1 the same operation was carried out as in Example 1 except that two types of hybridizers were prepared using polycarbonate films having a film thickness of 300 and 100 / m, respectively. The signal intensity was measured at 9 spots where the cDNA of the gene was spotted, and the coefficient of variation was calculated. The result is shown in FIG.
  • the variation coefficient of the signal intensity was approximately half or less than that of using the same thickness of 100 m.
  • the average signal intensity was almost the same. From this result, it was found that by increasing the thickness of the opposing region, the eight-primed reaction at different positions in the nucleic acid fixing region was homogenized, and the eight-primed reaction with good accuracy and reproducibility could be performed.
  • the relationship between the control of the spatial height (variation coefficient) of the cavity formed by the hybrid device and the variation coefficient of the signal intensity is evaluated.
  • the signal intensity of the nine spots where the cDNA of the same gene was spotted was measured in the same manner as in Example 1, The coefficient of variation was calculated.
  • the hybridizer uses a spacer material with a height of 160 mm, and a polycarbonate film (thickness, average value 300 m) laminated on the spacer material.
  • a device was made.
  • the average value and coefficient of variation of the spatial height were measured by the height-surface waviness method described above.
  • draw 7 dividing lines to divide the cavity into 8 equal parts in the longitudinal direction
  • draw 3 dividing lines divided into 4 equal parts in the short direction.
  • the maximum and minimum values of surface waviness were obtained.
  • the peripheral height was measured with a digital length measuring device (Digimicro, manufactured by Nikon Corporation), and the surface waviness was measured with a surface roughness shape measuring device (Surfcom, manufactured by Tokyo Seimitsu Co., Ltd.). The results are shown in FIG.
  • the coefficient of variation of signal intensity increased as the coefficient of variation of spatial height increased, but the coefficient of variation of spatial height was less than 50%.
  • the variation coefficient of the signal intensity was suppressed to 20% or less, and the rate of increase of the variation coefficient of the signal intensity was also increased, but when the spatial height fluctuation coefficient exceeded 50%, the fluctuation of the signal intensity
  • the coefficient increased and the rate of increase also increased. From the above, it was found that the variation coefficient of the space height of the cavity is preferably 50% or less.
  • the relationship between the control of the spatial height (size) of the cavity formed by the hybrid device and the variation coefficient of the signal intensity is evaluated.
  • the signal intensity of 9 spots where the cDNA of the same gene was spotted was measured in the same manner as in Example 1, The coefficient of variation was calculated.
  • Hybridizer equipment is 5m, 10m, 15m, 20rn, 40m, 80m, 120m, 160m, 180m as spacer material.
  • the area that is the opposite area of the polycarbonate film (thickness, average value 300 m) that is laminated on the spacer materials of various heights is approximately 3 O mm x 1 O mm.
  • the spatial height of the cavity becomes smaller, the coefficient of variation of the signal intensity becomes remarkably larger, but when it is 15 or more, it is 30% or less, and when it is 20 m or more, it is almost stable. It was about 20%. Based on the above, it was found that a highly repeatable hyper-lysidation reaction can be realized because the spatial height of the cavity can suppress the variation coefficient of the signal intensity in the range of 15 m to 200 m.
  • the relationship between stirring (rotating) the liquid in the cavity formed by the hybrid device and the signal intensity was evaluated.
  • This example was performed in the same manner as in Example 1 except that the following operations and hybridization conditions were used, and the fluorescence intensity was quantified. That is, the amount of labeled cDNA injected is 1 lO ⁇ L, the hybridization temperature is 60, the hybridization is performed (16 hours), the array and the hybridization device are connected to the hybridization device (TA Set the center of gravity of the array at a radius of about 75 mm with respect to the rotary axis of the rotary unit of I ⁇ 1 ID81 ZID IAT I ON I NCUBAT ⁇ R (HB-100)). In the state of ashamedy, I moved the rotation speed to 4 rpm.
  • the signal intensity of Example 5 in which the substrate and the hybridizer were rotated was about 5 times the signal intensity of the control example.
  • C V was 13% in the control example, while Example 5 was 5%.
  • air gas
  • the substrate and the hybrid device are operated (rotated) so that the air moves, so that the hybrid
  • the improvement in signal intensity greatly contributes to the improvement in accuracy and reproducibility, so that the agitation mode can improve the accuracy and reproducibility.
  • Example 2 the relationship between agitation (set of a seesaw) of the liquid in the cavity formed by the hybrid device and the signal intensity was evaluated.
  • This example is different from Example 1 except that the capacity of 400 i L is constructed using the cover member having the structure shown in FIG. 11 and that the following operation and eight hybrid conditions are used. In the same manner, the fluorescence intensity was digitized.
  • the hybridizing device (cover member 110) of this example was manufactured as follows. First, acrylic resin pieces 102 were produced by cutting acrylic resin into a spacer shape. On the other hand, a single-sided seal having a peelable adhesive layer was laminated on the adhesive layer of the double-sided seal and punched out in the same shape as the acrylic resin pieces 10 2 to produce a sealing material 10 4. In addition, a sealing material 10 6 in which only a double-sided seal was punched into the same shape as the acrylic resin piece 10 2 was also produced. Next, on one side of the acrylic resin piece 1 0 2 Sealing material 104 was attached, and sealing material 106 was attached to the other surface.
  • a polycarbonate film 107 (thickness 0.3 mm, inlet processing completed) 107 was laminated on the adhesive layer of the sealing material 106 of this laminate. Furthermore, a silicon rubber piece 108 having a contour that swells slightly outward from the acrylic resin piece 102 is prepared, and the periphery of the silicon rubber piece 108 is marked against the peelable adhesive layer of the sealant 104.
  • the cover member 110 (total thickness: 5 mm) was produced by sticking it so as to protrude outside the resin piece 102. This cover member was affixed to an array produced in the same manner as in Example 1, and left in a vacuum state (one 98 kPa) for 30 minutes or longer. Thus, a reaction cavity was constructed by the hybridizing apparatus of this example.
  • the amount of labeled cDNA injected was 200, the hybridization temperature was 60 ° C, and the hybridization device (Labn) was connected between the array and the hybridization device during the hybridization (16 hours).
  • et Internationa Benchtop Rocker 35/35 D) was used to move the array (substrate) and hybridizer under seesaw conditions of up / down motion angle ⁇ 20 ° and up / down motion 50 times .
  • the array was set so that its center of gravity coincided with the seesaw fulcrum. According to this seesaw condition, the air in the cavity (about 200 L, 50 V o 1%) was moving slowly in the cavity with its shape roughly maintained.
  • the fluorescence intensity was digitized in the same manner as a control example except that it was left in the eight-hybridization procedure.
  • the signal intensity of Example 6 in which the substrate and the hybridizer were moved in a seesaw manner was about 5 times the signal intensity of the control example. From the above, air (gas) is contained in the cavity composed of the substrate and the hybrid device, and the substrate and the hybrid device are operated (seesaw motion) so that the air moves, so that the hybridize is achieved. It was found that the efficiency of the signal can be improved and the signal intensity can be improved. Increased signal strength is accurate This greatly contributes to the improvement of reproducibility, and according to such a stirring mode, the accuracy and the reproducibility can be improved.
  • the cover member 110 in the present embodiment has the silicon rubber piece 108 that functions as a tab layer, so that the cover member 110 is separated from the substrate with a small force without imposing a burden on the array. I was able to.
  • the present invention is based on Japanese Patent Application No. 2 004-221807 filed on July 29, 2004, and the entire contents thereof are incorporated.

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Abstract

本発明は、再現性の良好なハイブリダイズ反応を実現可能なハイブリダイズ装置を提供することを目的とし、この目的のために、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置２を、核酸プローブが固定された基板の該核酸プローブの固定領域６を含んでハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティ１２を形成するカバー部材１０を備え、キャビティ１２の内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域１８を有するものとする。ハイブリダイズ反応を実施するキャビティに露出される領域の表面特性を制御することで、シグナル強度を向上させ、また、そのバラツキを抑制して再現性の良好なハイブリダイズ反応を実施できる。

Description

明細書 ハイブリダイズ装置およびハイブリダイズ方法 技術分野
【0001】 本発明は、 核酸のハイブリダィズ反応のためのハイブリダィズ装 置、 ハイブリダィズ方法および核酸アレイに関する。 背景技術 ，
【0002】 従来、 DNAマイクロアレイなどの核酸プローブを固定した基板 における核酸ハイブリダイズ反応を行ぅハイブリダイズ装置としては、例えば、 特表 2003— 517156号、 特表 2003— 517591号に示されるよ うに、 基板と基板に付着される可撓性層とを備えるものが提案されている。 こ れらのハイブリダィズ装置では、 作業者によるバラツキを低減し、 小さな反応 空間での核酸のハイブリダィズ効率を向上させるものとして、 かかる空間内の 流体成分に可撓性層を介してローラーにより外力を加えて積極的に混合を行わ せている。 発明の概要
【0003】 ハイブリダィズ反応の結果得られるシグナル強度などのバラツキ や不安定性は主としてハイブリダィズ反応中において生じるものである。 しか しながら、 かかる八イブリダィズ反応の場である反応空間あるいは内部の流体 成分への外力の付加という手段によっては、 ハイブリダイズ反応の不安定性が 増大するばかりかハイブリダイズ反応の効率の増大という目的に対しても十分 な効果が得られていない。 したがって、 現状においても依然として、 微小な反 応空間におけるハイブリダイズ反応の不安定性ゃ不均一性を解決するという要 望が存在しているが、 具体的解決策は見出されていない。
【0 0 0 4】 そこで、 本発明の一つの目的は、 再現性の良好なハイブリダィズ 反応を実現可能なハイプリダイズ装置およびハイプリダイズ方法を提供するこ とである。 また、 本発明の他の一つの目的は、 精度 （正確性） の良好な八イブ リダイズ反応を実現可能なハイブリダイズ装置およびハイブリダイズ方法を提 供することである。
【0 0 0 5】 本発明者らは、 上記した課題について検討したところ、 ハイプリ ダイズ反応を実施するキヤビティに露出される領域の表面特性やキヤビティの 構造等が大きくシグナル強度やそのバラツキ （変動係数） に影響していること を見出し、 これらを制御することでシグナル強度を向上させ、 また、 そのバラ ツキを抑制して再現性の良好なハイブリダィズ反応を実施できることを見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明によれば、 以下の手段が提供される。
【0 0 0 6】 本発明の一つの形態によれば、 核酸のハイブリダィズ反応のため のハイブリダィズ装置であって、 核酸プローブが固定される基板の該核酸プロ ーブの固定領域を含んで前記ハイブリダィズ反応のための液体を貯留可能なキ ャビティを形成するカバー部材を備え、 前記キヤビティの内部に露出される領 域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、 装置が提供される。 この形態 においては、 前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有していること が好ましい態様であり、 さらに、 前記カバー部材は、 前記核酸プローブの固定 領域に対向する領域に前記疎水性領域を有'していることが好ましい態様である。 これらの態様において、 前記疎水性領域は、 水の接触角が 3 0 ° 以上であるこ とが好ましい態様である。
【0 0 0 7】 本発明の他の一つの形態によれば、 核酸のハイブリダィズ反応の ためのハイブリダィズ装置であって、 核酸プローブが固定される基板の該核酸 プローブの固定領域を含んで前記八イブリダィズ反応のための液体を貯留可能 なキヤビティを形成するカバー部材を備え、 前記カバー部材の前記核酸プロ一 ブの固定領域に対向する領域の厚みが 3 0 0 i m以上である、 装置が提供され る。 この形態において、 前記カバー部材は前記キヤビティ内に露出される領域 の少なくとも一部に疎水性領域を有していることが好ましい態様である。
【0 0 0 8】 本発明の他の一つの形態によれば、 核酸のハイブリダィズ反応の ためのハイブリダィズ装置であって、 核酸プローブが固定される基板の該核酸 プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダィズ反応のための液体を貯留可能 なキヤビティを形成するカバ一部材を備え、 前記キヤビティ内の前記核酸プロ ーブの固定領域における空間高さの変動係数が 5 0 %以下である、 装置が提供 される。 この形態においては、 前記空間高さは 1 5 以上であることが好ま しい態様であり、 前記カバー部材は前記キヤビティ内に露出される領域の少な くとも一部に疎水性領域を有していることが好ましい態様である。
【0 0 0 9】 これらのいずれかのハイブリダィズ装置において、 前記カバ一部 材は、 少なくともシート体と、 該シート体と前記基板との間に介在させるスぺ —ザと、 を備える、 装置が提供される。 また、 上記したいずれかのハイブリダ ィズ装置において、 前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する 領域には前記チャンバー内に液体を供給するための開口を有し、 該開口はその 一部によって前記キヤビティを構成する内周壁が外側に膨出した膨出状部を構 成するように形成されていることが好ましい態様であり、この態様においては、 前記開口は、 前記キヤビティの長尺方向の両端部位にそれぞれ形成されている ことが好ましい。 また、 上記したいずれかのハイブリダィズ装置において、 前 記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域を形成する材料は、 ポリカーボネート、 ポリオレフイン、 ポリアミド、 ポリイミド、 アクリル樹脂 ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択さ れる 1種あるいは 2種以上からなることが好ましい態様である。
【0 0 1 0】 また、 これらのいずれかのハイブリダィズ装置において、 前記力 バー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、 凹部及び Z又は 凸部を有していることが好ましい。 また、 これらのいずれかのハイブリダィズ 装置においては、 前記カバー部材には、 前記基板に剥離可能に一体化され、 前 記基板及び前記カバー部材の外延から露出される露出端部を有するタブ層を備 えることが好ましい。
【0 0 1 1】 本発明の他の一つの形態によれば、 核酸のハイブリダィズ方法で あって、 核酸プローブが固定された固定領域を有する基板に対して上記いずれ かの核酸のハイブリダィズ反応のためのハイブリダイズ装置をセットする工程 と、 前記固定領域を含んで形成されたキヤビティ内において該キヤビティに供 給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとの八ィ ブリダィズ反応を実施する工程と、 を備える、 方法が提供される。 この形態に おいては、 前記ハイブリダィズ工程は、 前記基板と前記ハイブリダィズ装置と を静置して行うことが好ましい態様である。 また、 この形態においては、 前記 ハイプリダイズ工程は、 前記キヤビティ内の液体を攪拌することが好ましい態 様である。 この態様においては、 前記液体の攪拌を、 前記キヤビティを形成し た基板及びハイブリダィズ装置を動かして行ってもよい。 さらに、 この態様に おいては、 前記キヤビティ内にガスを存在させた状態とすることが好ましく、 ガスをキヤビティ内で移動させて前記液体を撹拌することが好ましい。
【0 0 1 2】 本発明の他の一つの形態によれば、 核酸のハイブリダィズ方法で あって、 核酸プローブが固定された固定領域を有する基板の前記固定領域を含 んでハイブリダィズのための液体を貯留可能に形成されたキヤビティ内におい て該キヤビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核 酸プローブとのハイブリダィズ反応を実施する工程、 を備え、 前記ハイブリダ ィズ工程は前記キヤビティ内に存在させたガスをキヤビティ内で移動させて前 記液体を撹拌する工程を含むことが好ましい態様である。この態様においては、 前記ハイブリダィズ工程は、 前記基板を含む前記キヤビティを構成する部材を 動かして行ってもよい。 また、 この態様においては、 前記ハイブリダィズ工程 は、 前記基板と組み合わされて前記キヤビティを形成する弾性変形可能なカバ 一部材に外力を付加して行ってもよい。
【0 0 1 3】 さらに、 本発明の他の一つの形態によれば、 核酸のハイブリダィ ズ反応のためのハイブリダィズ反応キッ卜であって、 核酸プローブが固定され るための固定領域を有する基板と、 該基板の前記核酸プローブの固定領域を含 んで前記ハイブリダィズ反応のための液体を貯留可能なキヤビティを形成する カバー部材を備え、 前記キヤビティの内部に露出される領域の少なくとも一部 に疎水性領域を有している、 キットが提供される。 このキットにおいては、 前 記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、 凹部及び 又は凸部を有していることが好ましい。 また、 前記カバー部材は、 前記基板に 剥離可能に一体化され、 前記基板及び前記カバー部材の外延から露出される露 出端部を有するタブ層を備えることが好ましい。
【0 0 1 4】 さらに、 本発明の他の一つの形態によれば、 核酸のアレイであつ て、 1あるいは 2以上の核酸プローブが固定された固定領域を有する基板と、 前記固定領域を含んで核酸ハイブリダィズ反応のための液体を貯留可能なキヤ ビティを形成するカバー部材と、 を備え、 前記キヤビティ内部に露出される少 なくとも一部に疎水性領域を有する、 アレイが提供される。 このアレイにおい ては、 前記カバ一部材は前記基板に対して分離可能に装着されていることが好 ましい態様である。 また、 このアレイにおいては、 前記基板と前記カバー部材 とは、 前記基板に剥離可能に一体化され、 前記基板及び前記カバー部材の外延 から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を介して積層されていること が好ましい。 また、 前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する 領域には、 凹部及びノ又は凸部を有していることが好ましい。 図面の簡単な説明
【0 0 1 5】 図 1は、 本発明のハイブリダィズ装置の一例を示す図である。 図 2は、図 1に示すハイブリダィズ装置の平面図と断面図とを示す図である。 図 3は、 空間高さを測定するための測定部位を例示する図である。
図 4は、 実施例 1において作製する D N Aマイクロアレイにおける c D N A のスポッ卜のアレイ図である。
図 5は、八イブリダィズ装置の材質とシグナル強度との関係を示す図である。 図 6は、 ハイプリダイズ装置の対向領域の厚みとシグナル強度との関係を示 す図である。
図 7は、 キヤビティの空間高さの変動係数とシグナル強度の変動係数との関 係を示す図である。
図 8は、 キヤビティの空間高さがとシグナル強度の変動係数との関係を示す 図である。
図 9は、 タブ層を有するカバー部材及びァレイを示す図である。
図 1 0は、 キヤビティの空間高さがとシグナル強度の変動係数との関係を示 す図である。
図 1 1は、 実施例 6におけるカバー部材及びアレイを示す図である。 発明を実施するための最良の形態
【0 0 1 6】 本発明のハイブリダィズ装置は、 核酸のハイブリダィズ反応のた めのハイブリダィズ装置であって、 核酸プローブが固定される基板の該核酸プ ローブの固定領域を含んで前記ハイブリダィズ反応のための液体を貯留可能な キヤビティを形成可能なカバー部材を備えている。 そして、 第 1の形態のハイ ブリダィズ装置においては、 前記キヤビティ内に露出される領域の少なくとも 一部に疎水性領域を有することを特徴としている。 このハイプリダイズ装置に よれば、 ハイブリダィズを促進し、 ハイブリダィズ産物の検出強度 （シグナル 強度） を高めることができる。 このため、 核酸プローブの固定領域全体で効率 的なハイブリダィズ反応を実現でき、 結果的にハイブリダィズ反応の再現性を 向上させることができる。 核酸のハイブリダィズ反応のための液体が貯留され る微小なキヤビティにおいて疎水性領域を設けることによりこのような八イブ リダィズ反応の促進効果を得られることは本発明者らの予想を超えるものであ つた。 本発明を理論的に拘束するものではないが、 本発明の上記効果はキヤビ ティ内に疎水性領域を有することで、 キヤビティ内でのハイブリダィズ液の対 流および被験核酸の拡散が促進され、 プローブ核酸との接触確率および八イブ リダイズが促進されたことによると推論される。
【0 0 1 7】 また、 本発明の第 2の形態のハイブリダィズ装置は、 前記カバー 部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域の厚みが 3 0 0 m以上で あることを特徴としている。 このハイブリダィズ装置によれば、 ハイブリダィ ズ産物のシグナル強度のバラツキを低減することができ、 ハイプリダイゼーシ ョンの検出精度と再現性とを高めることができる。 本発明を理論的に拘束する ものではないが、 核酸プローブの固定領域に対向する領域のカバー部材の厚み が 3 0 0' m以上であることにより、 キヤビティ内にハイブリダィズ液を貯留 し加熱したときにおいても、 一定の熱容量を持つことによる熱緩衝材となるた め、 基板上における複数位置のハイブリダィズ反応を均一に行うことができる と推論される。
【0 0 1 8】 さらに、 本発明の第 3の形態のハイブリダィズ装置は、 前記キヤ ビティ内の前記核酸プローブの固定領域における空間高さの変動係数が 5 0 % 以下であることを特徴としている。 このハイブリダィズ装置によれば、 ハイブ リダイズ産物のシグナル強度のバラツキを低減することができ、 ハイブリダイ ゼ一シヨンの検出精度を高めることができる。 本発明を理論的に拘束するもの ではないが、 前記キヤビティの空間高さの変動係数が 5 0 %以下であると、 キ ャビティ内壁の表面特性および形状によるハイプリダイズ液の対流ないし被験 核酸の拡散への悪影響が抑制されて基板上における複数位置のハイブリダィズ 反応を均一に行うことができると推論される。 【0 0 1 9】 また、 本発明の核酸ハイブリダィズ方法は、 核酸プローブが固定 された固定領域を有する基板の前記固定領域を含んでハイブリダィズのための 液体を貯留可能に形成されたキヤビティ内において該キヤビティに供給された 被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダィ ズ反応を実施する工程、 を備え、 前記ハイブリダィズ工程を前記キヤビティ内 に存在させたガスをキヤビティ内で移動させて行うことを特徵とする。 このハ ィプリダイズ方法によれば、 八ィプリダイズ反応中のハイプリダイズ効率を向 上させることができる結果、 ハイプリダイズ産物によるシグナル強度を増大さ せることができ、 また、 そのバラツキを低減することができる。
【0 0 2 0】 以下、 本発明を実施するための最良の形態について、 まず、 これ ら第 1〜第 3のハイブリダイズ装置について説明しつつ、 これらのハイブリダ ィズ装置を用いたハイブリダィズ方法、 ハイブリダィズキッ卜について、''図面 を適宜参照しながら説明する。 図 1には、 本ハイブリダィズ装置の一例が基板 とともに示されており、 図 2には、 その平面図と断面図とが示されている。 【0 0 2 1】 （八イブリダィズ装置）
ハイブリダィズ装置 2は核酸のハイブリダィズ反応のための装置である。 ここ で、 核酸とは、 少なくとも一部に核酸の塩基対合によって他の核酸とハイプリ ダイズするものであればよい。 したがって、 核酸とは、 天然あるいは合成のヌ クレオチドのオリゴマーおよびポリマーの双方を含み、 さらにゲノム D N A、 c D N Aなどの D N A、 P C R産物、 mR N Aなどの R N A、 ペプチド核酸を 含む概念である。 また、 ハイブリダィズ反応とは、 核酸分子間における塩基の 対合による相補鎖間の結合反応を意味している。
【0 0 2 2】 （基板）
本ハイブリダィズ装置 2が適用される基板 4は、 少なくとも核酸プローブが固 定される核酸固定領域 6を備えている。 核酸固定領域 6は、 それぞれ核酸プロ —ブが固定された微小な 1 以上の領域 （スポットともいう。） が形成された、 あるいは該微小領域が形成されるために準備された領域である。 なお、 本発明 においては、 基板 4に対する核酸プローブの固定方法や固定形態については特 に限定することなく本出願時における公知の全ての形態を包含するものである。 基板 4における核酸固定領域 6は、 微小な三次元形状を有している場合も含め 実質的に平坦であることが好ましい。 また、 基板 4は、 基板 4上に直接あるい は必要に応じて多孔質体などの介在物を介して核酸固定領域 6を単数あるいは 2以上有することができる。 基板 4に 2以上の核酸固定領域 6を有する場合に は、 これらは疎水性の離隔部によって互いに隔てられていてもよい。
【0 0 2 3】 また、 基板 4の形状は特に限定しない。 例えば、 平板のほか、 基 板 4として機能する平坦な底部を有する凹状体が挙げられる。 基板 4を構成す る材料は、 従来この種の基板に用いられている各種の材料の他各種の材料を使 用できる。 例えば、 ガラス、 二酸化ケイ素、 窒化ゲイ素などのシリコン系セラ ミックスを含むセラミックス、シリコーン、ポリメチルメタクリレート、ポリ（メ 夕）ァクリレートなどの樹脂、 金、 銀、 銅等の金属などを用いることができる。 所望の表面特性を付与するために適当なコートが施されていてもよい。 なかで も、 ガラス基板、 シリコーン、 アクリル樹脂を使用することができる。 こうし た基板 4の最も典型例は、 c D N Aプローブ等が固定された D N Aチップ若し くは D N Aマイクロアレイまたは c D NA等が固定されていない （固定される べき） D N Aマイクロアレイ用等の基板である。
【0 0 2 4】 （カバー部材）
本ハイブリダィズ装置 2は、 基板 4に対して使用されるカバー部材 1 0を備え ている。 カバー部材 1 0は、 基板 4の核酸固定領域 6を含んだハイブリダィズ 反応のためのキヤビティ 1 2を構成する。 カバ一部材 1 0は、 基板 4に対して 装着されるものとすることもできるが、 基板 4を収容あるいは保持する基板保 持体に対して装着された結果として、 基板 4との間でキヤビティ 1 2を構成す るものであってもよい。 前者の例としては、 平板状あるいは平坦な底部を有す る凹状の基板に対して装着される形態を挙げることができ、後者の例としては、 平板状の基板を載置する平坦部あるいは凹状部を備える基板保持体に対して装 着される形態を挙げることができる。
【0 0 2 5】 キヤビティ 1 2は、 核酸固定領域 6を含んだ空間であって、 前記 ハイブリダィズ反応のための液体（以下、単にハイブリダィズ液という。） を貯 留可能に形成される空間である。 キヤビティ 1 2は、 核酸固定領域 6上におい て所定の空間高さ （あるいは空間の厚み） を有する空間を有していることが好 ましい。 すなわち、 カバー部材 1 0は、 ハイブリダィズ液が貯留されない状態 であっても基板 4の核酸固定領域 6に対向する領域 （以下、 単に対向領域とい う。） 1 4を基板 4からいくらかの距離離れて保持できる構成を有していること が好ましい。 カバ一部材 1 0がこうした形態を有することで、 基板 4に対して 特別な操作を施すことなく、 カバ一部材 1 0を基板 4等に対して装着するだけ で、 核酸固定領域 6に所定の空間高さを有するキヤビティ 1 2を形成できる。 【0 0 2 6】 キヤビティ 1 2内には、 少なくとも基板 4の核酸固定領域 6と力 バー部材 1 0の対向領域 1 4とが露出されている他、 これらの領域以外にキヤ ビティ 1 2を外部と遮断するために必要な追加の面が露出されている。 追加の 面は、 基板 4あるいはカバー部材 1 0の一部であってもよいし、 さらに別個の 部材で構成されていてもよい。キヤビティ 1 2の平面形態は特に限定しないが、 突状部や角部を有しないことが好ましい。 このような個所には、 ハイブリダィ ズ液が滞留しやすいからである。 なお、 後述するように外側に膨出する個所で あっても、 該個所が、 十分に小さく全体として液体の滞留が抑制されるような 曲線形態などを有する側壁部分近傍に形成されていれば、 滞留が抑制される。 好ましい平面形態としては、 図 1および図 2に示すような長円や円などが挙げ られる。 また、 キヤビティ 1 2の対向領域 1 4は基板 4から離れる方向に対し て凸状としても凹状としてもよいが、 平坦であることが好ましい。 平坦である と、 核酸固定領域 6に対しておおよそ一定の空間高さを備えるキヤビティ 1 2 を容易に構成できるからである。
【0 0 2 7】 このようなカバー部材 1 0は、 図 1に示すように、 基板 4が平板 である場合には、 対向領域 1 4を含む平板状体 1 0 aの周囲に所定高さのスぺ ーサ 8を有する形態とすることもできる。図 1においては、カバー部材 1 0は、 基板 4とほぼ同じ大きさで少なくとも基板 4に対向する側にはほぼ平坦な表面 を有する板状体 1 0 aと、 その周縁に基板 4との間に介在されるスぺーサ 8と を有している。 他の形態としては、 それ自体が核酸固定領域 6を覆う所定形状 のドームを有する形態とすることもできる。 このような形態のカバ一部材 1 0 は、 高分子材料の成形体とすることができる。 一方、 基板 4が凹状部の底部を 核酸固定領域 6とする凹状体であるとか核酸固定領域 6の外周に所定高さの周 縁部を有する場合、 さらには基板 4が基板保持体などの底部に収容される場合 など、 カバー部材 1 0を装着するのにあたり核酸固定領域 6が凹状部の底部に 位置されるときには、 これら凹状部の周縁の縦壁部分に装着される平板状体と することもできる。
【0 0 2 8】 スぺーサ 8の材料としては、 例えば、 アクリル榭脂、 熱可塑性ェ ラストマー、 天然あるいは合成ゴム、 シリコーン、 ポリオレフイン、 ポリアミ ド、ポリイミド、ハロゲン化ビニル、ポリカーボネートを用いることができる。 【0 0 2 9】 （疎水性領域）
本ハイブリダィズ装置 2は、 キヤビティ 1 2内に露出される領域の少なくとも 一部に疎水性領域 1 6を有している。 疎水性とは、 少なくとも撥水性を示す表 面特性を意味し、 好ましくは、 親水処理など施されていない一般的なゲイ酸ソ ーダガラスよりも高い撥水性を有していることを意味する。 撥水性は、 一般に 平坦な表面における水の接触角で表現することができる。 本発明における疎水 性領域の水の接触角は、 3 0 ° 以上であることが好ましく、 より好ましくは 6 0 ° 以上であり、さらに好ましくは 7 0 ° 以上である。最も好ましくは、 9 0 ° 以上である。 なお、 接触角とは、 液滴を水平な固体板状に置いたときに液滴が 固体と接している部分の角度をいうものとする。 接触角は、 静的接触角や臨界 値としての前進接触角あるいは後退接触角、 さらには動的接触角などをも用い ることができるが、 液滴法によって測定した静的接触角を用いることが好まし い。
【0 0 3 0】 なお、 静的接触角を測定する液滴法は、 （1 ) 接線法、 （2 ) Θ / 2法および （3 ) 3点クリック法がある。 （1 ) の接線法は、 読み取り顕微鏡等 を利用してカーソルを液滴の接線に合わせて接触角を直接求める方法であり、 ( 2 ) の 0 2法は、 液滴の片端と頂点とを結ぶ直線と固体面との角度を 2倍 して接触角として求める方法であり、 （3 )の 3点クリック法は、液滴と固体面 との接点 2ケ所と頂点をコンピュー夕画像上等でクリックして画像処理により 求める方法である。 これらの液滴法においては、 上記 （2 ) および （3 ) の方 法にて接触角を求めることが好ましい。
【0 0 3 1】 疎水性領域 1 6は、 キヤビティ 1 2内に露出される領域の少なく とも一部に備えられていればよいが、 好ましくは、 カバー部材 1 0に備えられ る。 カバー部材 1 0に疎水性領域 1 6を備えることで、 シグナル強度を効果的 に向上させることができる。 カバ一部材 1 0においては、 対向領域 1 4に疎水 性領域 1 6を有していることが好ましく、 さらに好ましくは、 核酸固定領域 6 のおおよそ全体に対応する対向領域 1 4の全体に均一に疎水性領域 1 6を備え ることが好ましい。 疎水性領域 1 6は、 対向領域 1 4において複数個分散して 備えられていてもよいが、 好ましくは、 対向領域 1 4のおおよそ全体を被覆す るような連続状に備えられている。 さらに、 カバー部材 1 0のキヤビティ 1 2 に露出される全領域が疎水性領域 1 6であってもよい。
【0 0 3 2】 疎水性領域 1 6は、 例えば、 カバー部材 1 0自体の材質を疎水性 材料を用いることで形成することもできるし、 疎水性領域 1 6を形成しようと する領域に対して疎水性材料および Zまたは疎水性 (撥水性)を呈する表面形態 を付与することによつても形成することができる。 疎水性領域 1 6を構成する 疎水性材料としては、 ポリカーボネート、 ポリエチレン、 ポリプロピレンなど のポリオレフイン、 ハロゲン化ビニル、 ポリアミド、 ポリイミド、 アクリル樹 脂およびこれらの樹脂のフッ化又は塩化物を挙げることができる。 また、 撥水 性を呈する表面形態としては、 例えば、 各種材料表面に化学的な修飾や機械的 処理により接触角が 9 0 ° 以上になるように粗面化された形態を挙げることが できる。
【0 0 3 3】 キヤビティ 1 2における核酸固定領域 6とこれに対向する対向領 域 1 4との距離、 すなわち、 核酸固定領域 6におけるキヤビティ 1 2の空間高 さの変動係数（標準偏差 平均値 X 1 0 0 ( %) ) が 5 0 %以下であることが好 ましい。 核酸固定領域 6において空間高さの変動係数が 5 0 %以下であると、 ハイプリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを抑制することができる。 シグ ナル強度のバラツキが抑制されることは、 精度の高い検出が可能となるととも に、 再現性の高い八イブリダィズ反応が実現できることを意味する。 例えば、 空間高さの変動係数が 5 0 %以下であるとシグナル強度の変動係数を 2 0 %以 下程度に容易に抑制することができる。 空間高さの変動係数はより好ましくは 4 0 %以下であり、さらに好ましくは 3 0 %以下であり、最も好ましくは 2 0 % 以下である。 本発明者らの今回得られた知見によれば、 キヤビティ 1 2内の核 酸固定領域 6の空間高さの変動係数が一定以下であることは、 核酸固定領域 6 の単位面積あたりのハイブリダィズ液量 （液厚） の均一性に大きく寄与してい ることがわかっている。
【0 0 3 4】 また、 キヤビティ 1 2の空間の高さの平均値は、 1 5 m以上で あることが好ましい。 1 5 m以上であると、 ハイブリダィズ産物のシグナル 強度のバラツキがよく抑制されるからである。 より好ましくは、 2 0 ^ m以上 である。 キヤビティ 1 2の空間高さを 2 0 m以上とすることで、 それによつ て確保される核酸固定領域 6における液厚により、 キヤビティ 1 2内に露出さ れる領域の影響を抑制してハイブリダイズ液の対流ないし被験核酸の拡散を確 保できる。 また、 空間高さの平均値の上限は、 好ましくは 1 0 0 0 m以下で ある。 さらに、 こうしたキヤビティ 1 2が区画する基板 4上の面積は、 1 mm 2以上 2 0 0 0 mm2以下であることが好ましい。
【0 0 3 5】 キヤビティ 1 2における上記空間高さの平均値および空間高さの 変動係数は、 例えば、 以下の方法 （以下、 高さ一表面うねり量法という。） によ り測定することができる。
( 1 ) 計測部位
カバー部材 1 0によって形成されるキヤビティ 1 2を分割する分割線、 好ま しくは、 キヤビティ 1 2の中心線あるいは等分割線の分割線上を計測部位とす る。 計測部位は、 例えば、 図 3 ( a ) に示すように、 キヤビティ 1 2の長手方 向および短手方向のそれぞれ 2等分する 2本の分割線の組み合わせとすること もできる （分割線は計 2本）。 また、 図 3 ( b ) に示すように、 長手方向および 短手方向にそれぞれ 4等分する分割線の組み合わせとすることもできる （分割 線は計 6本）。 さらに、 図 3 ( c ) に示すように、 長手方向に 8等分する分割線 と短手方向に 4分割する分割線との組み合わせとすることもできる （分割線は 計 1 0本）。
( 2 ) 周縁高さの測定と基準高さの算出
まず基準高さ （H) を求める。 基準高さ （H) とは、 カバー部材 1 0を基板 4の核酸固定領域 6に対向するように装着したとき形成されるキヤビティ 1 2 の外縁に対応するカバー部材 1 0の周縁部の核酸固定領域 6を含む表面からの 高さ （以下、 周縁部高さという。） の平均値である。 周縁部高さは、 図 3に示す とおり、 分割線上の周縁部において計測する。 分割線は、 キヤビティ 1 2を分 割しているため、 一つの分割線について周縁部の高さは対向する周縁部の 2点 を計測することになる。 したがって、 周縁高さの測定箇所数は、 分割線の数 X 2となる。 すべての分割線上における周縁部高さを測定し、 これらから平均値 を求め、 これを基準高さ （H) とする。 なお、 空間高さの平均値および変動係 数を得るのに好ましい周縁高さの測定個所は、 4箇所以上であり、 より好まし くは、 2 0箇所以上である。
( 3 ) カバー部材の表面のうねり量の測定
カバー部材 1 0の表面のうねり量は、 分割線上のカバー部材 1 0の対向領域 1 4に対応する領域の外表面 （基板 4と対向しない側の表面） の周縁部を基準 とした表面の凹凸の変動量として測定する。 うねり量としては、 一つの分割線 をその測定軌跡として測定し、 最高値と最低値とのみを用いればよい。 したが つて、 うねり量の測定箇所は、 結果として各分割線に対して 2箇所ということ になり、 分割線の数 X 2がうねり量の測定箇所数となる。 なお、 空間高さの平 均値および変動係数を得るのに好ましいうねり量の測定個所は、 4箇所以上で あり、 より好ましくは、 2 0箇所以上である。
( 4 ) 膜厚の測定
カバー部材 1 0の膜厚は、 対向領域 1 4の膜厚を意味しており、 対向領域 1 4の膜厚の平均値 （Tave) を用いてもよいし、 あるいは上記うねり量の最高 値と最低値とをそれぞれ測定した部位の膜厚 （Tmax、 Tmin) ) を用いてもよ いが、 好ましくは平均値を用いる。 なお、 膜厚は、 ノギスなどの計測装置など 公知の計測装置により測定できる。
( 5 ) 空間高さの算出
これらのデータから一つの分割線上において複数の空間高さを求めることが できる。 一つの分割線上においては、 うねり量の最高値と最低値 （それぞれ M A Xおよび M I Nとする） から最大の空間高さと最小の空間高さとを求めるこ とができる。
最大空間高さ =基準高さ （H) +うねり量の最高値 （MA X) —膜厚 （Tave あるいは Tmax)
最小空間高さ =基準高さ （H) +うねり量の最低値 （M I N) —膜厚 （Tave あるいは Tmin) として得ることができる。 こうして、 一つの分割線から最大空間高さと最小空間高さを得て、 他の分割 線からも同様に最大空間高さと最小空間高さとを得て、 これらの平均値を、 空 間高さの平均値とし、 標準偏差 Z空間高さの平均値 X 1 0 0を変動係数 （％) とする。
【0 0 3 6】 なお、 カバー部材 1 0の所定位置における周縁高さは、 例えば、 デジタル測長機 （デジマイクロ、 株式会社 Nikon製） によって測定することが でき、カバー部材 1 0の表面のうねり量は、表面粗さ形状測定機（サーフコム、 株式会社東京精密製） にて測定することができる。
【0 0 3 7】 さらに、 キヤビティ 1 2の容積は、 必要に応じ適宜設計されるも のであるが、 0 . 1 L以上 2 0 0 0 以下であることが好ましい。 より好 ましくは 以上 1 0 0 0 /x L以下である。
【0 0 3 8】 さらに、 カバー部材 1 0の対向領域 1 4を含む部分は、 外部から キヤビティ 1 2内を視認可能な光透過性を有することが好ましいが、 対向領域 1 4を含む部分の厚みの平均値が 3 0 0 m以上であることが好ましい。 厚み の平均値が 3 0 0 m以上であると、 ハイブリダィズ産物のシグナル強度の変 動係数がよく抑制されるからである。 該厚みはより好ましくは 3 5 0； m以上 である。 なお、 上限は特に限定しないが、 厚いため熱容量が大きくなり過ぎて 加熱時にキヤビティの温度分布の不均一性が生起してしまうことを考慮すれば 3 0 0 0 m以下であることが好ましい。
【0 0 3 9】 （その他の構造）
カバ一部材 1 0にはハイブリダィズ液を注入するための開口 2 0を備えてい る。 開口 2 0は 2以上備えることが好ましく、 少なくとも一つの開口 2 0は、 カバー部材 1 0においてキヤビティ 1 2を区画する輪郭近傍に開口しているこ とが好ましい。 かかる部位に開口されていることで、 キヤビティ 1 2に注入し たハイブリダィズ液がキヤビティ 1 2の内壁に留まりにくくキヤビティ 1 2全 体にハイブリダィズ液が容易に拡散される。 より好ましくは、 開口 2 0は、 前 記輪郭に沿って形成されおり、 さらに好ましくは、 前記開口 2 0によってキヤ ビティ 1 2の内壁が外側に膨出した膨出部を構成するように形成されている。 すなわち、 図 1に示すように、 円形上にカバー部材 1 0に開口された開口 2 0 は、 平面形態が長円状のキヤビティ 1 2の長径方向の両端に形成されるととも に、 該両端部において開口 2 0の開口端縁の一部がキヤビティ 1 2の両端を外 側に膨出させるように形成されている。 かかる開口 2 0から八イブリダィズ液 が注入されると、 開口 2 0の両側および反対側のいずれにもハイプリダイズ液 が容易に拡散されることになる。 なお、 開口 2 0は、 適当なシール材によって 密閉される。
【0 0 4 0】 こうした本ハイブリダィズ装置 2に用いるカバー部材 1 0は、 実 質的にカバー部材 1 0を構成する平板状体 1 0 aにシール層 5を介してスぺー サ 8を積層することにより得ることができる。 シール層 5としては、 平板状体 1 0 aとスぺーサ 8とを接着する接着剤層あるいは粘着剤層とすることができ る。 また、 一つのカバー部材 1 0に対して、 隣合う区画を遮断するような形態 のスぺーサ 8を用いることで基板 4上に複数個のキヤビティ 1 2を形成する力 バー部材 1 0も容易に得ることができる。
【0 0 4 1】 また、 カバー部材 1 0は、 複合体としてではなく一体の樹脂の成 形体として得ることもできる。 さらに、 こうしたカバ一部材 1 0の基板 4ある いは基板保持体に対して装着するための部位には、 接着剤や粘着剤の層を形成 しておくことが好ましく、 さらに、 このような接着層は剥離可能なシートによ つて保護されていることが好ましい。 したがって、 本発明の別の形態として、 このハイブリダィズ装置 2と基板 4とを備えるハイブリダィズ反応用キットも 提供されることになる。 このようなキットに備えられる基板 4に核酸プローブ などを固定すれば有効な好ましい核酸アレイを得ることができる。 なお、 カバ —部材 1 0は、 基板 4あるいは基板保持体に対して別個に備えられて適時に装 着可能に備えられなくてもよい。 カバー部材 1 0は、 基板 4あるいは基板保持 体に対して接着により予め一体化されていてもよく、 また、 基板 4等と一体の 成形体として一体化されていてもよい。 また、 カバー部材 1 0は洗浄やシグナ ル検出のために基板 4等に対し、 該基板 4等から分離可能に装着可能に形成さ れていてもよく、 あるいは一体化されていてもよい。
【0 0 4 2】 カバー部材 1 0の対向領域 1 4を含む部分を弹性変形可能に形成 してもよい。 この部分あるいはカバー部材 1 0の全体を弾性変形可能な材料で 形成することにより、 対向領域 1 4にガス圧又は機械的外力を付加して変形さ せることでキヤビティ 1 2内の液体を攪拌することができる。
【0 0 4 3】 また、 カバー部材 1 0の対向領域 1 4のキヤビティ 1 2に露出さ れる側 （基板 4と対向される側の表面） には、 凹部及び/又は凸部を備えるこ とができる。 この凹凸は、 キヤビティ 1 2内の液体を撹拌する場合に、 液体の 流れを複雑化して撹拌効率を向上させ、 ひいてはハイブリダィズ効率を向上さ せることができる。 こうした凹部及び Z又は凸部は、 カバー部材 1 0の対向領 域 1 4を構成する材料で一体に備えていてもよいし、 カバ一部材 1 0の基板 4 に対向される側の表面にこうした凹部及び 又は凸部を備えるフィルムゃシー ト状体を付着させることによつても形成できる。 こうした凹部及び凸部の大き さは、 特に限定しないで、 キヤビティの空間高さに応じて設定される。 なお、 こうした凹部及び 又は凸部に疎水性領域を備えていてもよい。
【0 0 4 4】 また、 図 9に示すように、 カバ一部材 1 0が基板 4の固定領域 6 の存在する表面に積層されて一体化される場合、 カバ一部材 1 0の基板 4の表 面への当接部分には、 カバー部材 1 0と基板 4との積層状態を解除するための タブ層を設けることができる。 タブ層 3 0は、 基板 4とカバ一部材 1 0とによ りキヤビティ 1 2が形成された状態において基板 4及びカバー部材 1 0の外延 から露出される露出端部を有していることが好ましい。 この露出端部 3 2は、 把持可能な程度の長さで露出されていることが好ましい。 また、 このタブ層 3 0は、少なくとも基板 4との間においては剥離可能な程度に一体化されている。 具体的には、 タブ層 3 0の基板 4側は剥離可能な程度の粘着性を有しているか あるいは同様の粘着程度の粘着剤層を介して基板 4に一体化されている。 この ため、 ハイブリダィゼーシヨン後など、 基板 4とカバー部材 1 0との積層形態 を解除する場合には、 このタブ層 3 0の露出端部 3 2を把持して外側に引っ張 ることで、 タブ層 3 0と基板 4との積層状態が崩壊し、 この結果、 基板 4と力 バー部材 1 0との積層状態も解除されることになる。 こうした解除形態によれ ば、基板 4に大きな負荷をかけることなく容易にカバー部材 1 0を除去できる。 【0 0 4 5】 タブ層 3 0の有する露出端部 3 2は、 器具又は手指等によって把 持可能であればよく、 タブ層 3 0のごく一部であってもよいし、 基板 4とカバ 一部材 1 0との積層体の周囲にわたって備えられていてもよい。 また、 タブ層 3 0は、 基板 4と剥離可能な粘着性を有する材料 （例えば、 樹脂材料ゃシリコ ンゴムなどのゴム材料） で形成されていることが好ましい。 この場合、 基板 4 との間においては、 特別な粘着剤層は必要がなくなるからである。 また、 タブ 層 3 0は、 カバー部材 1 0の一部であってもよいし、 そうでなくてもよい。 力 バー部材 1 0に対しても剥離可能な程度に一体化されていてもよい。 後者の場 合には、 結果として、 基板 4への負荷を一層軽減できる。
【0 0 4 6】 （核酸のハイプリダイズ方法）
このハイブリダイズ装置 2を用いたハイブリダイズ反応は常法に準じて行うこ とができる。 例えば、 本ハイブリダィズ装置 2あるいはカバー部材 1 0を用い るハイブリダィズ工程は次のようにして行うことができる。 基板 4としての D N Aマイクロアレイに、 基板 4への装着側にシール層を有するカバ一部材 1 0 を該シール層を介して貼着し、 開口 2から所定の方法で調製したハイブリダイ ズ液を注入し、 2つの開口 2 0の双方をシール材でシールして、 2 5で以上 8 0で以下の温度で所定時間静置する。
【0 0 4 7】 本ハイブリダィズ装置 2によれば、 キヤビティ 1 2内に露出され る少なくとも一部に疎水性領域 1 6を有するため、 攪拌、 振動、 摩擦、 噴流等 を基板 4に対して付与するなど、 外力を加えなくても、 キヤビティ 1 2内にお けるハイブリダイズ液の対流あるいは被験核酸の拡散を促進してハイブリダイ ズ反応を促進しその効率を向上させることができる。 したがって、 本ハイプリ ダイズ装置 2あるいはカバー部材 1 0は、 静置状態でハイブリダィズ反応を行 うハイプリダイズ方法およびかかるハイプリダイズ工程を含む各種の検査方法 に好ましく用いることができる。 さらに、 静置によっても十分なハイブリダィ ズ反応の促進効果を有するため、 作業者の基板 4やカバー部材 1 0の取り扱い 操作の違いなどの作業者によるバラツキ要因およびハイブリダイズ時のハイブ リダィズ装置 2の静置場所の水平性や外力の大小などの外部環境によるバラッ キ要因による影響を抑制して再現性の高いハイブリダィズ結果を得ることがで さる。
【0 0 4 8】 また、 本ハイブリダィズ装置 2およびカバー部材 1 0が形成する キヤビティ 1 2においてキヤビティ 1 2の空間高さおよびその変動係数の制御 ならびに対向領域 1 4部分の厚みの制御することで、 ハイブリダィズ産物のシ グナル強度のバラツキを抑制して精度の高いシグナル検出が可能となる。 この ようなキヤビティ 1 2の構造あるいは寸法制御によって、 ハイブリダィズ産物 のシグナル強度のバラツキ抑制のための従来採用されていた各種の上記した手 法を採用することなく簡易な構成でハイプリダイズ産物のシグナル強度のバラ ツキ抑制という効果が得ることができる。 なお、 このようなキヤビティ 1 2の 構造あるいは寸法制御は、 核酸固定領域 6の単位面積当たりのハイブリダィズ 液量を均一化あるいは熱緩衝効果によって得られた効果であるということもで さる。
【0 0 4 9】 また、 カバー部材 1 0の対向領域 1 4の基板 4に対向される側に 凹部及び 又は凸部を有している場合には、 静置によっても、 好ましい液体の 対流が得られ、 ハイブリダィズ反応の効率を向上させることができる。
【0 0 5 0】 ハイブリダィズ工程においては、 キヤビティ 1 2を構成する基板 4及びカバー部材 1 0を内の液体を攪拌する撹拌工程を実施してもよい。 キヤ ビティ 1 2内の少なくとも一部には疎水領域 1 6を有するため、 キヤビティ 1 2内の水性の液体が撹拌された際に、 疎水性領域 1 6において液体が撥液され ることにより、 キヤビティ 1 2内のハイブリダィズ液の移動が促進され、 この 結果、 より一層ハイブリダィズ効率が向上される。
【0 0 5 1】 キヤビティ 1 2内の液体の攪拌のためには、 例えば、 キヤビティ 1 2を形成した基板 4やハイブリダィズ装置 2を動かすことが有効である。 具 体的な動作としては、 基板 4を含んでキヤビティ 1 2を構成する部材を、 回転 運動、 旋回運動、 シーソー運動、 往復運動、 転倒運動又はこれらの 2種類以上 の組み合わせなどの各種動作が挙げられる。 他には、 カバー部材 1 0の対向領 域 1 4が弾性変形可能である場合には、 この対向領域 1 4を外力により変形さ せることによつてもキヤビティ 1 2内の液体の攪拌が可能である。具体的には、 ローラーなどの回転体を回転させつつ対向領域 1 4上を移動させたり、 その他 の押圧部材を対向領域 1 4上を押圧しながら移動させることが挙げられる。 こ うした撹拌工程は、 ハイブリダィズ工程の全体を通じて実施してもよいし、 断 続的に又はその一部においてのみ実施してもよい。
【0 0 5 2】 こうしたキヤビティ 1 2内の液体の攪拌にあたっては、 キヤビテ ィ 1 2内にキヤビティ 1 2内の液体と分離して存在する程度に該液体に不溶解 性のガス （例えば、 空気のほか、 窒素などの不活性ガスなど） を存在させた状 態とすることが好ましい。 通常、 ガスがキヤビティ 1 2内に存在する場合、 キ ャビティ 1 2が静置状態であると、 ガスが定位置で保持されるため、 ガスの保 持部分 （ガス溜り） においてはハイブリダィゼ一シヨンが進行しにくいが、 ガ スを存在させた上でキヤビティ 1 2内の液体を移動させるような外力が付加さ れることで、 キヤビティ 1 2内の液体の移動を促進することができ、 これによ り、 ハイブリダィズ反応を促進することができる。
【0 0 5 3】特に、キヤビティ 1 2の一部に疎水性領域 1 6を有する場合には、 ガス溜りの移動にあたり、 水性の液体が疎水性領域 1 6において撥液されるこ とにより、 ガス溜りの移動が促進され、 ガス溜りの移動による撹拌効果が向上 される。 また、 カバ—部材 1 0の対向領域 1 4の基板 4に対向される側に凹部 及び Z又は凸部を有することにより、 ガス溜りの移動範囲も変化するため、 よ り高い撹拌効果が得られる。
【0 0 5 4】 キヤビティ 1 2内にガスを存在させる場合、 キヤビティ 1 2内の ガス溜りをキヤビティ 1 2内における 1個又は 2個以上の撹拌子のようにして 基板 4等を動かすようにすることが好ましい。 より具体的には、 ガス溜りがそ の形態をおおよそ維持した状態でキヤビティ 1 2内を移動するように基板 4等 を動かすことが好ましい。 こうすることで、 ハイブリダィズ反応を効果的に促 進できる。 ここで、 ガス溜りがその形態をおおよそ維持した状態で移動すると は、 撹拌工程の半分以上の範囲においてキヤビティ 1 2内のガスが単一又は 2 個以上のガス溜りとして移動又は保持されることを認識できるものであればよ く、 例えば、 基板 4を激しく振とうしてキヤビティ 2内の液体の全体に分散し て存在することが撹拌工程の優勢となるような状態は排除される。 なお、 ガス 溜りがキヤビティ 1 2内の移動の際に、 一時的に集合したり分離したりしても よいし、 一時的にはガスが液体全体に分散するような形態となってもよい。
【0 0 5 5】 ガス溜りがおおよそその形態を維持してキヤビティ 1 2内を移動 させるための動作形態は、 好ましくは、 回転運動、 シーソー運動あるいはこれ らの組み合わせである。 こうした動作形態によれば、 安定してガス溜りにキヤ ビティ 1 2内を移動させることができる。 例えば回転運動の場合、 水平状の回 転軸によって支持される縦型のロー夕一を備える回転装置においては、 回転半 径 （回転中心からアレイ （ハイブリダィズ装置及び基板） の重心までの距離と する。） が 1 2 mm〜 1 5 0 mmであり、 回転数（ r p m) 力 6 0 r p m以下で あることが好ましい。 6 0 r p m以下であると、 ガス溜りの形態を安定して保 持できる傾向がある。 より好ましくは 2 0 r p m以下であり、 さらに好ましく は l O r p m以下である。 l O r p m以下であると、 ガスをあまり分離するこ となく安定してキヤビティ 1 2内を移動させられるからである。 最も好ましく は 5 r p m以下である。 5 r p m以下であるとガスを一時的にも分離すること なく安定してキヤビティ 1 2内を移動させられ、 シグナル強度の増大とともに バラツキを良く抑えることができるからである。 また、 シーソー運動の場合、 支点からの距離 （支点からアレイ （ハイブリダィズ装置及び基板） の重心まで の距離とする。）が 0〜7 6 mmであり、上下動が総角 5 ° 以上 1 0 0 ° 以下の 範囲である場合、 シーソー運動 （上下動で 1回とする。） は、 1回〜 1 2 0回 分であることが好ましい。
【0 0 5 6】 また、 ガス溜りの移動には、 カバー部材 1 0の対向領域 1 4が弹 性変形可能として、 この対向領域 1 4を外力により変形させることも有効であ る。
【0 0 5 7】 ガスの容量はこうした促進効果が得られる範囲であればよいが、 好ましくは、 キヤビティ 1 2の全容積の 5 0 %以下である。 5 0 %以下であれ ば、 気泡の存在によるハイブリダィズ反応への悪影響を抑制しつつハイブリダ ィズ反応を行うことができる。 より好ましくは、 3 0 %以下である。 3 0 %以 下であれば、 加熱時のガス膨張並びにチャンバ一作製時の接着面等に残留した 空気が膨張したときの影響を抑制して確実に八ィブリダイズすることができる。 さらに好ましくは 1 5 %以下であり、 5 %であっても良好なハイブリダィズ反 応を行うことができる。
【0 0 5 8】 以上のことから、 本発明の別の形態として、 予め 1種あるいは 2 種以上の核酸プローブが固定された核酸固定領域を有する基板 4と、 前記核酸 固定領域を含んで核酸ハイプリダイズ反応のための液体を貯留可能なキヤビテ ィを形成するカバ一部材 1 0と、 を備え、 前記キヤビティ内部に露出される少 なくとも一部に疎水性領域を有する、 核酸アレイも提供される。 こうした核酸 アレイによれば、 カバ一部材 1 0によって効率的なハイブリダィズ反応が可能 なチャンバ一が予め形成されているため、 一層容易かつ効率的に核酸のハイブ リダィズ反応を行うことができる。 カバー部材 1 0は、 既に説明したように、 基板 4あるいは基板保持体に対して接着や成形等により予め一体化させておく ことができる。 さらに、 基板 4や基板保持体に対して予め一体化されたカバー 部材 1 0は、 基板 4等から分離可能とされていてもよい。 また、 アレイは、 夕 ブ層 3 2を備えていてもよい。 このアレイにおいては、 上記したカバー部材 1 0や基板 4における各種の態様がそのまま適用される。
【0 0 5 9】 また、 以上のことから、 本発明のさらに別の形態として、 基板 4 の固定領域 6を含んだキヤビティ 1 2内においてキヤビティ 1 2に供給された ハイブリダイズ液中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応 を実施するハイブリダィズ工程において、 キヤビティ 2内に存在させた不溶解 性のガスをキヤビティ内で移動させる、 核酸のハイブリダィズ方法も提供され る。 なお、 このハイブリダィズ方法におけるキヤビティ 1 2は疎水性領域 1 6 を備える必要はなく、 疎水性領域 1 6を備えていなくても、 ガス溜りの移動に よってキヤビティ 1 2内の液体を撹拌することができる。 この核酸ハイブリダ ィズ方法における、 ガス又はガス溜りの移動については、 上記した各種態様を そのまま適用できる。
【0 0 6 0】 また、 こうしたハイブリダィズ方法におけるキヤビティ 1 2とし ては、 既に説明したように、 基板の固定領域 6の対向する対向領域 1 4に凹部 及び 又は凸部を有していることが好ましい。 すなわち、 基板 4と基板 4の固 定領域 6に対向する対向領域 1 4の基板 4に対向される側に凹部及び Z又は凸 部を有するカバー部材 1 0によって形成されるキヤビティ 1 2が挙げられる。 こうしたキヤビティ 1 2によれば、 固定領域 6に対向される凹凸によって、 ガ ス溜りの移動範囲も変化するため、 より高い撹拌効果が得られる。
【0 0 6 1】 実施例
以下、 本発明の実施例を挙げて具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 に限定されるものではない。
【0062】 （実施例 1 )
本実施例は、 疎水性領域を有するハイブリダィズ装置 （カバー部材） を用いた ときのシグナル強度の向上を評価した例である。 本実施例では、 ガラス基板に c DN Aが固定された DN Aマイクロアレイに対して疎水性材料で形成した力 バー部材をセッ卜して相補的な c DNAハイブリダィズし、 ハイブリダィズ産 物のシグナル強度を評価した。 対照として、 カバ一部材としてスライドガラス を用いた。
【0063】 まず、 ラット由来の c DNAを 5000種を準備し、 図 4に示す ように、 ポリ L—リジンでコートしたガラス基板上にそれぞれ一定量を 500 0点スポットするとともに、うち 1種類の遺伝子を計 9点スポッ卜した。なお、 5000点のスポット径は約 150 mであり、 9点のスポット径も約 150 mであった。 こうして cDN Aをスポッ卜したガラス基板を 80°Cで 1時間 加熱処理し、 次いで、 ブロッキング溶液 （7 OmM無水コハク酸、 0. 1Mホ ゥ酸ナトリウム （pH8. 0)、 1—メチル—2—ピロリ ドン） に 15分間浸漬 した後、沸縢した滅菌水中に 3分間浸潰し、エタノールで脱水後、遠心乾燥し、 DNAマイクロアレイとした。
【0064】 また、 ラットから取得した mRNAを前記アレイに対して 1 g ノ枚用いて、 細胞工学 vo l . 18, No. 7, P 1052- 1053 (19 99) 記載の手順に従って Cy 3標識 c DNAを調製した。
【0065】 一方、 図 2に示すように、 76. 2mmX 25. 4 mmの両面接 着フィルムの一方の面に同一サイズであって片面に接着面を有するスぺーサ材 料 （PET厚み 160 m) の非接着面を重ね、 長円状の刃で型抜きした長円 状孔部 （長径約 50 mm X短径約 20 mm) を有する積層体を形成し、 この積 層体の前記両面接着フィルムの他方の面に 76. 2 X 25. 4のポリカーボネ —トフイルム（フィルム厚 300 izm)を貼着してハイブリダィズ装置とした。 このハイブリダィズ装置は、 アレイに対して装着されることによりアレイ上を 長円状に区画してキヤビティを形成し、 そのキヤビティの長径方向に沿った両 端部には、 ハイブリダィズ液供給用の開口をそれぞれ有していた。 本ハイプリ ダイズ装置は、 ポリカーボネートフィルムに替えてガラスプレート （厚み 3 0 0 fim) を用いる以外は実施例と同様に操作して対照例のハイブリダィズ装置 とした。 実施例および対照例のハイプリダイズ装置について次の方法でハイブ リダィゼーシヨンを実施し、 次いで、 シグナル強度を蛍光測定し、 数値解析し た。
【0 0 6 6】 ハイブリダィゼーシヨンは、 作製したアレイにハイブリダィズ装 置を貼着し、 一つの開口から作製した標識 c DNA (終濃度 5 X S S C、 0. 5 % S D S) を 1 3 0 注入し、 双方の開口を封止した。 この状態のアレイ とハイブリダィズ装置とを、 4 2°Cで 1 6時間 （湿度は特に調整せず） で静置 状態でハイブリダィゼーシヨンした。 1 6時間経過後、 ハイブリダィズ装置を アレイから剥離し、 アレイを （2 X S S C、 0. 1 S D S) 溶液、 （1 X S S C) 溶液および （0. 1 X S S C) 溶液の順でそれぞれの溶液内で 5分間振と うして洗浄した。 ついで、 アレイを遠心 （ 1 0 0 0 r pm、 3分間） して乾燥 させた後、スキャナーで (Scan Array 4 0 0 0 Packard BioChip Technologies 社製)で蛍光を測定し、 数値解析ソフト （Gene PixPro、 Axon社製） で蛍光強 度の数値化を行った。 得られた数値に基づいて蛍光強度の比較を行った結果を 図 5に示す。
【0 0 6 7】 図 5に示すように、 ポリカーボネートフィルムを用いた実施例の ハイブリダィズ装置を用いることで、 ガラス製のハイブリダィズ装置を用いる よりも高いシグナル強度（約 2. 5倍）が得られることがわかった。すなわち、 実施例のハイプリダイズ装置を用いることでハイプリダイズ反応の効率が向上 されることがわかった。
【0 0 6 8】 （実施例 2 ) 本実施例は、 カバー部材の対向領域 （基板の核酸固定領域に対向するカバー部 材の領域） の厚みとシグナル強度の変動係数との関係を評価した例である。 シ グナル強度の変動係数はハイプリダイゼーションの良否を示す有効な指標の一 つである。 本実施例では、 ポリカーボネートフィルムとして膜厚が 3 0 0 と 1 0 0 / mのものとをそれぞれ使用して 2種類のハイブリダィズ装置を作製 した以外は、 実施例 1と同様に操作して、 同一遺伝子の c D N Aがスポットさ れた 9点のスポットのシグナル強度を測定し、 変動係数を算出した。 結果を図 6に示す。
【0 0 6 9】
図 6に示すように、 対向領域の厚みが 3 0 0 であるハイブリダィズ装置を 用いることで、 同厚みが 1 0 0 mを用いるよりもシグナル強度の変動係数が おおよそ半分以下となった。 なお、 シグナル強度の平均はほぼ同一であった。 この結果から、 対向領域の厚みを厚くすることで核酸固定領域の異なる位置に おける八ィプリダイズ反応が均質化され、 精度および再現性の良好な八ィプリ ダイズ反応を実施できることがわかった。
【0 0 7 0】 （実施例 3 )
本実施例は、ハイブリダィズ装置が形成するキヤビティの空間高さ （変動係数） の制御とシグナル強度の変動係数との関係を評価した例である.。本実施例では、 以下のように作製した八イブリダィズ装置を用いる以外は、 実施例 1と同様に 操作して、 同一遺伝子の c D NAがスポットされた 9点のスポットのシグナル 強度を測定し、 その変動係数を算出した。 ハイブリダィズ装置は、 スぺーサ材 料として高さが 1 6 0 ^ mのものを用い、 このスぺーサ—材料に積層されるポ リカーポネートフィルム （膜厚、 平均値 3 0 0 m) の対向領域となる部分を おおよそ 3 O mm x 1 0 mm程度の範囲でアレイ側に凸状に変形させて、 最終 的に得られるキヤビティの空間高さの最大値と最小値とから求めた変動係数が 1 0 %〜1 0 0 % ( 1 0 %きざみで） となるように 1 0種類のハイブリダィズ 装置を作製した。 空間高さの平均値および変動係数は、 既に説明した高さ一表 面うねり量法による測定した。 分割線としては、 キヤビティを長手方向に 8等 分割するように 7本の分割線をひき、 短手方向に 4等分割する 3本の分割線を ひいた上、 これらの分割線上においてそれぞれ周縁高さと表面うねり量の最高 値と最低値とを求めた。 また、 周縁高さは、 デジタル測長機 （デジマイクロ、 株式会社 Nikon製） によって測定し、 表面のうねり量は、 表面粗さ形状測定機 (サーフコム、 株式会社東京精密製） にて測定した。 結果を図 7に示す。
【0 0 7 1】 図 7に示すように、 全体としては、 空間高さの変動係数が増大す るにつれシグナル強度の変動係数も増大したが、 空間高さの変動係数が 5 0 % 以下の範囲では、シグナル強度の変動係数は 2 0 %以下に抑制されるとともに、 シグナル強度の変動係数の増加割合もかったが、 空間高さの変動係数が 5 0 % を超えると、 シグナル強度の変動係数が増大し、 またその増加割合も大きくな つた。 以上のことから、 キヤビティの空間高さの変動係数は 5 0 %以下である ことが好ましいことがわかった。
【0 0 7 2】 （実施例 4 )
本実施例は、 ハイブリダィズ装置が形成するキヤビティの空間高さ （寸法） の 制御とシグナル強度の変動係数との関係を評価した例である。 本実施例では、 以下のように作製したハイブリダィズ装置を用いる以外は、 実施例 1と同様に 操作して、 同一遺伝子の c D N Aがスポッ卜された 9点のスポッ卜のシグナル 強度を測定し、 その変動係数を算出した。 ハイブリダィズ装置は、 スぺーサ材 料として高さが 5 m、 1 0 m、 1 5 .m、 2 0 rn, 4 0 , 8 0 m、 1 2 0 rn, 1 6 0 rn, 1 8 0 mを用いるとともに、 これら各種の高さの スぺーサ—材料に積層されるポリカーボネートフィルム （膜厚、 平均値 3 0 0 m) の対向領域となる部分をおおよそ 3 O mm x 1 O mm程度の範囲でァレ ィ側に凸状に変形させて、 最終的に得られるキヤビティの空間高さの最大値と 最小値とから求めた変動係数が 5 0 %となるように 9種類のハイブリダイズ装 置を作製した。 空間高さの平均値および変動係数の算出は、 実施例 3と同様に 行った。 結果を図 8に示す。
【0073】
図 8に示すように、 キヤビティの空間高さが小さくなるとシグナル強度の変 動係数は顕著に大きくなる一方、 15 以上であれば 30%以下であり、 2 0 m以上であればほぼ安定して 20 %程度であった。 以上のことから、 キヤ ビティの空間高さは 15 m以上 200 m以下の範囲でシグナル強度の変動 係数を抑制できることから再現性の高いハイプリダイズ反応が実現できること がわかった。
【0074】 （実施例 5 )
本実施例は、 ハイブリダィズ装置が形成するキヤビティ内の液体を攪拌 （回転 式） することとシグナル強度との関係を評価した例である。 本実施例は、 以下 のような操作及びハイブリダィズ条件を用いる以外は、実施例 1と同様に行い、 蛍光強度の数値化を行った。 すなわち、 標識 cDNAの注入量を 1 l O ^Lと し、 ハイブリダィズ温度を 60 とし、 ハイブリダィゼーシヨンの間 （16時 間）、 アレイとハイブリダィズ装置とを、 ハイブリダィゼーシヨン装置 （TA I 丁£〇社製 1¥81 I D I ZAT I ON I NCUBAT〇R(HB— 100)) の回転式ュニッ卜の回転軸に対してアレイの重心が半径約 75 mmの位置にな るようにセッ卜した状態で回転数を 4 r pmとして動かした。 この回転条件に よれば、ハイブリダィゼーション中、いずれのアレイのキヤビティ中の空気（約 20 L、 15 vo l %) は、 その形態をおおよそ維持した状態でキヤビティ 内をゆっくりと移動していた。 なお、 ハイブリダィゼーシヨン中静置する以外 は上記と同様に操作したものを対照例として同様に蛍光強度の数値化を行った。 この結果を図 10に示す。
【0075】 図 10に示すように、 基板とハイブリダィズ装置とを回転した実 施例 5のシグナル強度は、 対照例のシグナル強度の約 5倍であった。 また、 C Vも対照例が 1 3 %であるのに対し、 実施例 5は 5 %であった。 以上のことか ら、 基板とハイブリダィズ装置とで構成されるキヤビティ内に空気 （ガス） を 内在させ、 この空気が移動するように基板とハイブリダィズ装置とを動作 （回 転） させることで、 ハイブリダィゼーシヨン効率を向上させ、 シグナル強度を 向上させられることがわかった。 シグナル強度の向上は、 精度と再現性の向上 に大きく寄与するため、 こうした撹拌形態によれば精度と再現性の向上とを向 上させることができる。
【0 0 7 6】 なお、 チャンバ一における空気量を 5 v o l %、 3 0 v o l %及 び 5 0 V o 1 %となるように標識 c D N Aの注入量を 6 5 ^ L、 9 0 μ. L及び 1 1 3 . 5 ti 1の 3種類とした以外は、 上記と同様に操作しハイブリダィズす るとともに、 対照例も同時に準備して蛍光強度の数値化を行った。 その結果、 いずれの空気量であっても、 対照例の約 5倍のシグナル強度を示した。 以上の ことから、 空気量が 5 V o 1 %以上 5 0 V o 1 %以下の範囲において、 好まし いハイプリダイゼーション効率が得られていることがわかった。
【0 0 7 7】 （実施例 6 )
本実施例は、 ハイブリダィズ装置が形成するキヤビティ内の液体を攪拌 （シー ソ一式） することとシグナル強度との関係を評価した例である。 本実施例は、 図 1 1に示す構造のカバー部材を用いて容積 4 0 0 i Lのキヤビティを構成し た点、 及び以下のような操作及び八イブリダィズ条件を用いる以外は、 実施例 1と同様に行い、 蛍光強度の数値化を行った。
【0 0 7 8】 本実施例のハイブリダィズ装置 （カバー部材 1 1 0 ) は、 以下の ように作製した。 まず、 アクリル樹脂をスぺーサ形状に切削加工してアクリル 樹脂片 1 0 2を作製した。 一方、 剥離可能な粘着層を有する片面シールを両面 シールの接着層に積層しアクリル榭脂片 1 0 2と同形状に打ち抜いてシール材 1 0 4を作製した。 また、 両面シールのみをアクリル樹脂片 1 0 2と同形状に 打ち抜いたシール材 1 0 6も作製した。 次に、. アクリル樹脂片 1 0 2の片面に シール材 104を貼着し、 他の面にシール材 106を貼着した。 この積層体の シール材 106の接着層にポリカーボネート製フィルム （厚み 0. 3mm、 注 入口加工済み） 107を積層した。 さらに、 アクリル樹脂片 102よりやや外 側に膨出した輪郭を有するシリコンゴム片 108を準備し、 このシリコンゴム 片 108を、 シール材 104の剥離可能な粘着層に対して、 その周縁がァクリ ル樹脂片 102よりも外側にはみ出すようにして貼着し、カバー部材 1 10(総 厚 5mm) を作製した。 このカバー部材を実施例 1と同様にして作製したァレ ィに貼り付けて、 真空状態 （一 98 kP a) で 30分以上放置した。 こうして 本実施例のハイブリダィズ装置により反応用のキヤビティを構築した。
【0079】 また、 標識 cDNAの注入量を 200 とし、 ハイブリダィズ 温度を 60 °Cとし、 ハイブリダィゼーシヨンの間 （16時間）、 アレイとハイブ リダィズ装置とを、ハイブリダィゼーション装置（L abn e t I n t e r n a t i o n a 1社製 B e n c h t o p Ro c k e r (35/35 D)) を用い て、 上下動角度 ±20° 、 上下動回数 50回 分のシーソー条件でアレイ （基 板） 及びハイブリダィズ装置とを動かした。 アレイは、 その重心がシーソーの 支点に一致するようにセットした。 このシーソー条件によれば、 ハイブリダィ ゼーシヨン中、 キヤビティ中の空気 （約 200 L、 50 V o 1 %) は、 その 形態をおおよそ維持した状態でキヤビティ内をゆつくりと移動していた。なお、 八イブリダィゼーシヨン中静置する以外は上記と同様に操作したものを対照例 として同様に蛍光強度の数値化を行った。
【0080】 この結果、 基板とハイブリダィズ装置とをシーソー式で動かした 実施例 6のシグナル強度は、 対照例のシグナル強度の約 5倍であった。 以上の ことから、 基板とハイブリダィズ装置とで構成されるキヤビティ内に空気 （ガ ス） を内在させ、 この空気が移動するように基板とハイブリダィズ装置とを動 作 （シーソー運動） させることで、 ハイブリダィゼ一シヨン効率を向上させ、 シグナル強度を向上させられることがわかった。 シグナル強度の向上は、 精度 と再現性の向上に大きく寄与するため、 こうした撹拌形態によれば精度と再現 性の向上とを向上できる。
【0081】 また、 本実施例におけるカバー部材 1 10は、 タブ層として機能 するシリコンゴム片 108を有しているため、 アレイに負担をかけることなく また小さな力でカバー部材 1 10を基板から分離させることができた。
【0082】 本発明は、 2004年 7月 29日に出願された日本国特許出願 2 004-221807号を優先権主張の基礎としており、 その内容のすべてが 編入される。

Claims

請求の範囲
1 . 核酸のハイブリダィズ反応のためのハイブリダィズ装置であって、 核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハ イブリダィズ反応のための液体を貯留可能なキヤビティを形成可能なカバー部 材を備え、
前記キヤビティの内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有 している、 装置。
2 . 前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有している、 請求項 1 に記載の装置。
3 . 前記カバー部材は、 前記核酸プローブの固定領域に対向する領域に前記 疎水性領域を有している、 請求項 1または 2に記載の装置。
4 . 前記疎水性領域は、 水の接触角が 3 0 ° 以上である、 請求項 1〜3のい ずれかに記載の装置。
5 . 核酸のハイブリダィズ反応のためのハイブリダィズ装置であって、 核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハ イブリダィズ反応のための液体を貯留可能なキヤビティを形成するカバー部材 を備え、
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域はその厚みが 3 0 0 m以上である、 装置。
6 . 前記カバー部材は前記キヤビティ内に露出される領域の少なくとも一部 に疎水性領域を有している、 請求項 5に記載の装置。
7 . 核酸のハイプリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、 核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハ イブリダィズ反応のための液体を貯留可能なキヤビティを形成するカバー部材 を備え、 前記キヤビティ内の前記核酸プローブの固定領域における空間高さの変動係 数が 5 0 %以下である、 装置。
8 . 前記空間高さの平均値が 1 5 m以上である、 請求項 7に記載の装置。 9 . 前記カバー部材は前記キヤビティ内に露出される領域の少なくとも一部 に疎水性領域を有している、 請求項 7または 8に記載の装置。
1 0 . 前記カバー部材は、 少なくともシート体と、 該シート体と前記基板と の間に介在させるスぺ一サと、 を備える、 請求項 1〜9のいずれかに記載の装 置。
1 1 . 前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には前 記チャンバ一内に液体を供給するための開口を有し、 該開口はその一部によつ て前記キヤビティを構成する内周壁が外側に膨出した膨出状部を構成するよう に形成されている、 請求項 1〜1 0のいずれかに記載の装置。
1 2 . 前,記開口は、 前記キヤビティの長尺方向の両端部位にそれぞれ形成さ れている、 請求項 1 1に記載の装置。
1 3 . 前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域を形成 する材料は、 ポリカーボネート、 ポリオレフイン、 ポリアミド、 ポリイミド、 ァクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハ口ゲン化ビニルからなる 群から選択される 1種あるいは 2種以上である、 請求項 1〜1 2のいずれかに 記載の装置。
1 4 . 前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、 凹 部及び 又は凸部を有している、 請求項 1〜1 3のいずれかに記載の装置。 1 5 . 前記カバー部材は、 前記基板に剥離可能に一体化され、 前記基板及び前 記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を備える、 請求項 1〜 1 4のいずれかに記載の装置。
1 6 . 核酸のハイブリダィズ方法であって、
核酸プローブが固定された固定領域を有する基板に対して請求項 1〜 1 4の いずれかに記載の核酸のハイブリダィズ反応のためのハイブリダィズ装置をセ ットするセット工程と、
前記固定領域を含んで形成されたキヤビティ内において該キヤビティに供給 された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとの八イブ リダイズ反応を実施するハイプリダイズ工程と、
を備える、 方法。
1 7 . 前記ハイブリダィズ工程は、 前記基板と前記ハイブリダィズ装置とを 静置して行う、 請求項 1 6に記載の方法。
1 8 . 前記ハイブリダィズ工程は、 前記キヤビティ内の液体を攪拌することを 含む、 請求項 1 7に記載の方法。
1 9 . 前記ハイブリダィズ工程は、 前記キヤビティ内にガスを存在させた状態 で実施する工程である、 請求項 1 8に記載の方法。
2 0 . 前記ハイブリダィズ工程は、 前記ガスをキヤビティ内で移動させて前記 液体を撹拌することを含む、 請求項 1 9に記載の方法。
2 1 . 前記ハイブリダィズ工程は、 前記キヤビティを形成した基板及びハイブ リダィズ装置を動かして行うことを含む、 請求項 1 8〜 2 0のいずれかに記載 の方法。
2 2 . 核酸の八イブリダィズ方法であって、
核酸プローブが固定された固定領域を有する基板の前記固定領域を含んでハ イブリダィズのための液体を貯留可能に形成されたキヤビティ内において該キ ャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プロ ーブとのハイブリダィズ反応を実施する工程、 を備え、
前記ハイブリダイズ工程は前記キヤビティ内に存在させたガスを移動させて 前記液体を撹拌することを含む、 方法。
2 3 .核酸のハイブリダィズ反応のためのハイブリダィズ反応キッ卜であって、 核酸プローブが固定されるための固定領域を有する基板と、 該基板の前記核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダィズ反応のた めの液体を貯留可能なキヤビティを形成するカバー部材を備え、
前記キヤビティの内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有 している、 キット。
2 4 . 前記カバー部材は、 前記基板に剥離可能に一体化され、 前記基板及び前 記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を備える、 請求項 2 3に記載のキット。
2 5 . 核酸のアレイであって、
1あるいは 2以上の核酸プローブが固定された固定領域を有する基板と、 前記固定領域を含んで核酸ハイブリダィズ反応のための液体を貯留可能なキヤ ビティを形成するカバー部材と、
を備え、
前記キヤビティ内部に露出される少なくとも一部に疎水性領域を有する、 ァ レイ。
2 6 . 前記カバー部材は前記基板に対して分離可能に装着されている、 請求項 2 5に記載のアレイ。
2 7 . 前記基板と前記カバ一部材とは、 前記基板に剥離可能に一体化され、 前 記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有する夕 ブ層を介して積層されている請求項 2 5又は 2 6に記載のアレイ。
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