WO2006021673A2 - Marqueurs et procedes pour le depistage prenatal d'anomalies chromosomiques - Google Patents

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Pierre-Yves Simonin
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to prenatal screening for chromosomal abnormalities. More particularly, the invention is based on the identification of novel markers of chromosomal abnormalities, in particular trisomy 21, whose assay from a biological fluid sample of the pregnant woman allows, alone or in combination with other assays, to determine the probability that the fetus is suffering from a chromosomal abnormality, with greater accuracy than the tests currently used.
  • Trisomy 21 or Down syndrome is the most common of the viable chromosome abnormalities. At the origin of psychomotor handicaps, it affects one birth in 800, and knowing that about 800 000 births are observed in France, the incidence is 1000 children with Down Syndrome per year.
  • the risk of trisomy increases with maternal age, especially after age 35 (exponential growth). The risk is also increased if one of the parents carries a balanced translocation or if the couple has already given birth to a child with a chromosomal abnormality. Fetal abnormalities detected on echography may also lead to the prescription of a fetal karyotype.
  • Antenatal screening for Trisomy 21 consists of studying the fetal karyotype, either on amniotic cells, on trophoblastic cells, or on cord blood. The sample is at risk of miscarriage.
  • the caiyotype is a long examination that is performed in a specialized laboratory and authorized by the Ministry of Health. It is therefore reserved for a population of women called "at high risk of chromosomal abnormalities".
  • Ultrasound call signs demonstrated morphological abnormalities of the fetus, internal or external, proven intrauterine growth retardation, amniotic fluid quantity abnormalities.
  • AFP alpha-fetoprotein
  • hCG chorionic gonadotropin hormone
  • ThCG ThCG
  • AFP unconjugated estriol
  • uE3 unconjugated estriol
  • ⁇ subunit of hCG ⁇ subunit of hCG.
  • the maternal serum markers hCG, uE3 and AFP
  • the next test is B145 or 39 euros 15.
  • a blood sample between the 15th and 18th week of gestation, for the determination of at least two of these markers is carried out, allowing a calculation of risk taking into account the risk a priori of the age of the mother modulated according to the observed values of these markers.
  • the threshold risk considered as decision-making for prenatal screening is arbitrarily set at 1: 250.
  • the determination of serum markers alone does not establish the diagnosis of trisomy 21. It is a screening test that makes it possible to estimate the risk of the presence of a child with Down Syndrome.
  • Screening sensitivity is approximately 60% if the risk threshold chosen for access to amniocentesis is 1/250. This leads to an amnio ⁇ centesis for about 5% of pregnant women.
  • the positive predictive value (speci ⁇ city) is of the order of 1 to 2%.
  • the sensitivity of the screening is better, with equal amniocentesis rate, if the markers are more discriminating and combined with each other.
  • the most commonly used combinations are the triple test (hCG + AFP + uE3) and the double tests, hCG + AFP or hCG + uE3, the latter being the best.
  • False positives of screening are amniocentesis with normal karyotype. The number of false positives should be reduced as much as possible because of the risk of fetal loss after amniocentesis (about 1%). Moreover, they can generate great anxiety in women while waiting for karyotype results.
  • the false negatives of screening are trisomy 21 cases not detected. They aggravate the emotional shock at the time of birth. In fact, couples who have benefited from a serum marker assay do not understand the notion of residual risk and often think that the test is a diagnostic tool. The failure of screening is then strongly felt. This situation is unsatisfactory in that it allows 30 to 40% of pregnancies with trisomy 21 to be missed. It is necessary to find a technique aimed at increasing sensitivity and specificity, reducing the number of useless procedures. invasive (false positives) and especially reduce the number of false negatives (30 to 40%).
  • serum markers in the first trimester of pregnancy are the PAPP-A protein, the hCG free beta subunit, and the nuchal translucency measurement at 12 weeks of amenorrhea. Some teams are also trying to develop the detection of fetal cells or free fetal DNA in maternal blood without effective screening.
  • the performance of the serum markers depends on the chosen strategy: risk threshold beyond which an amniocentesis is proposed, nature of the markers used, and type of association between them. Some combinations of markers perform better than others (WaId et al, Lancet, 2003, 8, 361, 855-6).
  • the inventors conducted studies from 280 frozen sera of women. pregnant with trisomic fetuses 21 (including those that were detected and those not detected by serum markers in the second trimester), and more than 280 control sera of women without fetuses trisomic 21 whose outcomes are known.
  • the placenta is a barrier between the mother and the fetus, but there is evidence that some molecules of small molecular weight pass this barrier.
  • the inventors have therefore chosen to apply the proteomic technique in the serum of pregnant women, in order to determine a differential expression profile making it possible to almost certainly distinguish those with trisomic fetuses 21 by comparison. her with sera of normal pregnant women. This approach, illustrated in the experimental part below, allowed them to identify several markers allowing to virtually distinguish serums of women with fetuses with trisomic 21 compared with sera of pregnant women with normal fetuses.
  • the present invention thus relates, in the first place, to the use of one or more marker (s) chosen from (i) the human neutrophil defensins HNP-2, HNP-I and HNP-3, and / or (ii) detectable molecular species in mass spectrometry with anion exchange type separation at the following molecular weights: 4461.60 Da; 4570.90 Da; 4630.70 Da; 4714.30 Da; 4859.10 Da; 8195.65 Da; 8905.85 Da; 9121.00 Da; 9700.50 Da, and / or (iii) molecular species detectable by mass spectrometry with a hydrophobic type separation, at the following molecular weights: 2625.47 Da; 4068.5 Da; 4075.95 Da; 4084.3 Da; 4084.7 Da; 4093.13 Da; 4320.79 Da; 4642.66 Da; 4658.47 Da; 6419.80 Da; 8107 Da; 8124.5 Da; 8140.5 Da; 8155 Da;
  • molecular species refers here, inter alia, to any protein, glycosylated or otherwise, phosphorylated or otherwise, any protein complex, any product of metabolism, or any fragment of any of these entities.
  • the molecular weights reported herein were obtained under experimental conditions specified below. Some technologies, different from those used by the inventors, usable to implement the invention, are cited below. It is clear that some variation is likely to occur when using different technologies and / or equipment. Nevertheless, it is also very clear that the person skilled in the art is able to transpose the results described in the experimental section below to other technologies, with a satisfactory recovery rate, and to easily identify the signals. (peaks,%) Corresponding to the markers highlighted by the inventors.
  • the molecular weights listed above must be heard with an accuracy of ⁇ 20%, preferably ⁇ 10%, even ⁇ 5%, and in good conditions ⁇ 1%. It should be noted that under the conditions described in the experimental section below, the measurement of the molecular weights of the different markers is reproducible, with a coefficient of variation that is very much less than 10%, typically of the order of 0.3. at 0.5%, for molecular weight markers less than 12000 Da. An accuracy of ⁇ 0.1% is even obtained up to 6000 Da. Due to the calibrators used, this coefficient of variation is of the order of 10 to 25% for molecular weight markers greater than 12000 Da.
  • the choice of the calibrator does not influence the values of the intensities of the peaks observed.
  • the use of different calibrators from those used by the inventors may possibly lead to a variation in the mass measured for the marker, the peaks corresponding to each of the markers nevertheless remaining always identifiable.
  • the invention also relates to an in vitro screening method for determining whether a pregnant woman is carrying a fetus suffering from an abnormality, comprising a detection or assaying step, in a biological sample of said pregnant woman, of at least one marker selected from any one of the groups (i) to (iii) defined above.
  • the word "assay” refers to a quantitative or semi-quantitative measurement in the broad sense, for example a relative quantification of a compound, with respect to the same compound in another sample, or with respect to another composed in the same sample.
  • a comparison of profiles, obtained for example by mass spectrometry is considered a "dosage”.
  • the method of the invention comprises a step of assaying at least two or three markers, at least one of which is selected from groups (i) and / or (ii) and / or or (iii) above, and the other one or two others are (are) selected from either the same groups or from the markers already characterized and used today, here constituting group (iv), including second-trimester markers - chorionic gonadotropin hormone (hCG) or its free ⁇ subunit, unconjugated estriol (uE3), p ⁇ -fetoprotein (AFP) and / or inhibin A - or first trimester - under -unit ⁇ free of hCG and / or protein Plasma associated with pregnancy (PAPP-A).
  • group (iv) including second-trimester markers - chorionic gonadotropin hormone (hCG) or its free ⁇ subunit, unconjugated estriol (uE3), p ⁇ -fetoprotein (AFP) and / or inhibin A -
  • an "improved triple test”, based on the hCG assay, uE3, and one of the markers cited above, is an integral part of the invention.
  • the assay of a marker of groups (i) to (iii) above may be combined with one or more other known test (s), such as for example the examination of the nuchal translucency.
  • the method of the invention involves a dosage step from a biological sample from the pregnant woman, which may be any body fluid, such as a sample of blood, serum, plasma, urine. ..
  • the number of markers selected from the molecules identified by the inventors may be equal to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 or more, whether markers selected from groups (i), (ii), (iii) or (iv) (at least one of the markers being selected from one of groups (i) to (iii)).
  • markers selected from groups (i), (ii), (iii) or (iv) at least one of the markers being selected from one of groups (i) to (iii)).
  • Those skilled in the art will determine the number of markers to be assayed according to efficiency constraints (search for the most sensitive and selective test possible), and economic constraints.
  • these methods also comprise, for each measured marker, a step of comparing the measured concentration of this marker in the biological sample of the pregnant woman, with values of reference to the concentration of this marker in pregnant women with normal fetuses, and in pregnant women with fetuses with a known chromosomal and / or genetic abnormality, the comparison being indicative of the risk that the pregnant woman has a fetus. a chromosomal and / or genetic anomaly.
  • These references will be chosen by those skilled in the art so as to correspond to the gestational age of the sample taken in the pregnant woman.
  • the assay of at least one marker is carried out by mass spectrometry, for example by low-resolution or high-resolution mass spectrometry.
  • mass spectrometry for example by low-resolution or high-resolution mass spectrometry.
  • other separation techniques, purification, or dosing can be used in the context of the invention.
  • two types of technology can be envisaged to develop a diagnostic device according to the invention: the comparison of profiles, or the spot dosage of the markers.
  • this method comprises a step of analyzing at least one spectrum obtained from a biological sample from a pregnant woman; according to this variant, the signal of at least 2 peaks selected from (i) the peaks corresponding to the human neutrophil defenders HNP-2, HNP-I and HNP-3, and / or (ii) the observable peaks is measured.
  • the term “spectrum” here designates any type of spectrum (mass, MALDI, MALDI-TOF, SELDI, SELDI-TOF, plasmon resonance surface, liquid chromatography, ICAT, ESI, ESI-TOF, etc.), the person skilled in the art knowing how to transpose the results presented hereinafter in mass spectrometry to another technology and find the relevant peaks.
  • the term “signal” refers to any observable (statistical variable) or observable ratio, such as intensity, signal on noise, Tof ⁇ time offlighi area), half-height Tof ⁇ Tof Width), resolution, etc.
  • the markers characterized by the inventors three have been identified as the human neutrophil defensins HNP-2, HNP-I and HNP-3 (see experimental part, D-9). These defensins are overexpressed or expressed normally in controls, and under-expressed in trisomy 21 ( Figure 15).
  • at least one of the markers for which the assay is carried out is selected from HNP -2, HNP-I and HNP-3.
  • a high rate of the marker in question is indicative of a healthy fetus, while a low rate is indicative of a high probability of trisomy 21.
  • the inventors have found that the ratios between these defensins HNP-2, HNP-I and HNP-3 vary depending on whether the fetus has Down syndrome or not.
  • the longitudinal ratios HNP-1 / HNP-3 and HNP-2 / HNP-3 are statistically higher in case of trisomy 21 than when the pregnant woman is a carrier of a non-trisomic fetus.
  • These ratios which are particularly indicative, also have the advantage of being independent of the calibration of the measuring apparatus.
  • the inventors have furthermore found that the expression levels of the defensins HNP2, HNP1 and HNP3, as well as the ratios between these different levels are not correlated with the age of the pregnant woman, nor with the pregnancy week, nor with any markers currently used (AFP, uE3 and HCG in particular), nor with any of the other markers identified in the studies. reported here.
  • the ratio between the concentrations of HNP-3 and HNP-I and / or HNP -2 in the sample is measured.
  • these ratios can be measured from a spectrum obtained according to any of the techniques mentioned above. It is also possible to measure the expression ratios of defensins by a nucleic acid amplification technique, for example by quantitative or semi-quantitative RT-PCR, from the biological sample, or from RNA. extracted from this sample. Primers that can be used for this purpose are, for example, described in the article by Linzmeier, RM and T. Ganz. Human defensin gene copy number polymorphisms: Comprehensive analysis of independent variation in alpha- and beta-defensin regions at 8p22-p23 Genomics 2005 ).
  • the first detected marker is the sum of the defensins HNP-2, HNP-I and HNP-3.
  • This detection can in particular be carried out by immunological techniques, for example by ELISA or PCR.
  • HNP-I human neutrophil defensins selected from HNP-I, HNP-2 and HNP-3
  • HND-I, HND-2 and HND-3 also denoted HND-I, HND-2 and HND-3
  • Antibodies can be produced against the markers of the invention, by any technique, including monoclonal antibodies, chemical synthesis, biological production (animal route [example Bioprotein etc.], vegetal route [example Lemna-Biolex-Bayer] , Meristems Therapeutics also etc ...]). They can then be used, either to directly perform an immunoassay of the corresponding markers, or to purify the markers prior to their assay.
  • Immuno Assay Immuno Assay, or IA Assay: Different technologies, known to those skilled in the art, may be envisaged, such as the Sandwich Immunoassay (Sandwich IA), the surface interaction (Surface Plasma Resonance). , or SPR), or immunoprecipitation (eg by the Atto-Lab developed Q-MAP technology).
  • Sandwich Immunoassay Sandwich IA
  • surface interaction Surface Plasma Resonance
  • SPR Surface Plasma Resonance
  • immunoprecipitation eg by the Atto-Lab developed Q-MAP technology.
  • the Sandwich IA approach is based on the double recognition of the marker - or antigen - by specific antibodies: the so-called “capture” antibodies immobilized on the chosen support (micro-titration plate, magnetic ball, etc.), and the so-called “detection” antibodies, in solution and coupled to a reactive molecule, responsible for the emission of the binding signal (directly or indirectly).
  • This set of non-overlapping specific antibodies constitutes the reagents common to the various current detection systems.
  • antigen recognition can be accomplished using aptamers, which are single-stranded oligonucleotide (DNA or RNA) sequences selected in vitro for their binding capacity to a given molecule; this selection can be done, for example, by the SELEX method (Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment) as described in US Pat. No. 5,270,163.
  • a functionalized aptamer may, for example, be used in place of a secondary antibody in a Sandwich ELISA immunoassay, as described by Sumedha Jayasena (Clinical Chemistry 1999, 45 (9): 1628-50, FIG. 6).
  • Aptamers can be optimized by different modifications (Sumedha Jayasena, supra, Fig. 2).
  • aptans it is possible to modify the aptans so that activation by UV after binding of their target ensures the covalent bonding of this target to the support (photoaptamers).
  • the different components of a diagnostic device of the immuno-reaction type also depend on the detection system used. Some reagents and supports that can be used to implement the invention are summarized in Table 1 below, as well as examples of suitable instrumentation.
  • Protein chips can be designed to determine selected protein expression patterns involving the desired markers. This technology is presented in the review paper by Sydor and Nock (Proteome Science, 2003, June 10; 1 (1): 3). Of course, those skilled in the art can improve the techno ⁇ logies presented in this article by using his general knowledge in this field.
  • MAP technology Luminex Corp
  • Bio Bar Codes Nanotechnologies Inc.
  • LumiPhos markers 530 and 480 Lumigen
  • RCA Rolling-circle Amplification
  • MAP technology Luminex Corp combines flow cytometry and microparticles in an IFA (Immunofuorescent Assay) type format.
  • IFA Immunofuorescent Assay
  • This technology logie proposes a double fluorescence analysis.
  • the first detection system makes it possible to capture the fluorescence emitted by the capture beads of the markers (one ball corresponds to one marker and one fluorescence); the second makes it possible to measure the fluorescence associated with the detection antibodies, that is to say with the quantification of the markers.
  • Bio Bar Codes (Nanotechnologies Inc.) Combine Nanoparticles and Scanning (Silver), Introducing a New Detection System Based on Hybridization of Unique Nucleic Acid Probes (Marker Identification)
  • LumiPhos 530 and 480 (Lumigen) markers combine chemiluminescent and fluorescent detection systems, thereby ensuring signal optimization.
  • RCA rolling-circle amplification
  • This technolo ⁇ gy described by Schweitzer et al involves the polymerization of a long chain of single-stranded DNA attached to the analyte (eg, an antibody) from a circular DNA template. This technology minimizes sample volumes and the use of expensive materials (monoclonal antibodies and enzymes).
  • signal amplification systems as another category of reagent in particular in the context of IFA and CLIA (eg biotin / avidin).
  • the markers can also be detected by a nucleic acid amplification technique by polymerase chain reaction (PCR or other technique).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the invention makes it possible to detect chromosomal abnormalities, in particular Down syndrome (trisomy 21), Edwards syndrome (trisomy 18), Patau syndrome (Trisomy 13), Turner syndrome, Klinefelter syndrome, monosomy X, fragile X syndrome, and penta X syndrome and a deletion of the long arm of chromosome 7, but also other congenital anomalies, currently detected by ultrasound, for example Spina Bifida.
  • the invention can be applied to the detection of genetic or infectious (viral, bacterial, or parasitic) or metabolic fetal diseases, or to the search for a specific phenotype and in particular the sex of the fetus.
  • the invention is particularly suitable for the prenatal diagnosis of Down syndrome.
  • the present invention is applicable to prenatal screening during the second trimester, or earlier, during the first trimester of pregnancy.
  • the screening methods according to the invention may also include an initial step of preparing the sample.
  • this step may comprise fractionation as a function of the mass of the proteins, and / or a stage of depletion of albumin or other transport proteins, and / or a step of purifying the proteins on an anion-type preparative surface and / or hydrophobe.
  • the present invention also relates to a prenatal diagnostic kit for chromosomal abnormalities, comprising means suitable for carrying out one of the methods described above.
  • a prenatal diagnostic kit may for example comprise specific antibodies and / or aptamers of one or more markers mentioned above and / or amplification primers as well as probes.
  • each antibody, aptamer or primer is specific for a single marker.
  • each solution is preferably a specific single marker, or a group of associated markers (for example, defensins HND-I, HND-2 and HND-3).
  • anti-HND antibodies such as those marketed by Tebu-Bio SA (39 rue de Houdan, F-78612 Le Perray en Yvelines ) under the reference 038NCL-DEFENSIN (Anti-Neutrophil Defensin Mouse IgG1 Clone D21, 1 ml).
  • a diagnostic kit comprises, for at least one of the markers of the invention, a set of non-overlapping specific antibodies, that is to say at least two antibodies capable of simultaneously recognizing the marker by question, which makes it possible to carry out sandwich-type immuno-reaction tests.
  • the antibodies in particular the so-called “capture” antibodies, can be immobilized on a support, and the so-called “detection” antibodies coupled to a molecule allowing the detection.
  • supports and molecules for detection usable in the context of the invention, are mentioned above.
  • the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention and to the appended drawings, in which which:
  • FIG. 1 illustrates the experimental strategy used
  • FIG. 2 illustrates a schematic preparation of the samples
  • FIG. 3 summarizes the different recording conditions, as a function of the molecular mass of the proteins to be detected
  • FIG. 4 illustrates the experimental scheme used in studies E1, E2, E3, E4 and E6;
  • FIG. 5 represents the spectra obtained on the spectral zone
  • FIGS 6-8 illustrate the spectra centered on the 4000 Dalton area (FIG. 6: spectra in global views, FIG. 7: pseudo-gels, FIG. 8: spectra in staggered views);
  • FIGS. 9-11 illustrate the spectra centered on the area 5000-6000 Daltons (FIG. 9: spectra in global views; FIG. 10: pseudo-gels; FIG.
  • Figures 12 to 14 illustrate the spectra centered on the spectral zone 3000-10000 Daltons (Figure 12: spectra in global views, Figure 13: pseudo-gels, Figure 14: views offset); FIG. 15 illustrates the spectra centered on the area 3000-4000
  • FIGS. 16 to 18 illustrate the spectra respectively centered on the areas 4000-5000 Daltons, 5000-7000 Daltons and 7000-10000 Daltons (spectra in global views);
  • FIG. 19 illustrates the spectra in global, standardized and superimposed views by clinical category, for the control group, the T21 group, and the Tl 8 group, on the 3000-10000 Dalton spectral zone (study E6);
  • FIGS. 20 and 21 show, for the same spectral zone as that of FIG. 19, the pseudo-gel views (FIG. 20) and the staggered views (FIG. 21) only for the control group and the T21 group;
  • FIGS. 22-24 show spectra on the spectral zone 3000-2000 Daltons, respectively in global views (standardized and superimposed spectra by clinical category) for the control groups, T21 and Tl8, in pseudo-gel views for the control groups and T21, and in staggered views for the same groups (study E6);
  • - Figure 25 shows the spectra centered on the 6500 zone, after normalization with respect to the intensity of the PM6622 cluster (studies E4 and E5). This figure shows the superposition of the spectra for the control and T21 categories (study E6);
  • FIG. 26 shows the spectra centered on the 6500 zone after normalization on the PM6622 peak (standardized and superimposed spectra by clinical category), for the T21, control, and Tl groups.
  • the peak referenced N corresponds to PM6622 cluster and is used to standardize spectra;
  • FIGS. 27 to 30 show examples of distribution statistics of the intensities of different clusters, for the control and T21 groups:
  • FIG. 27 peak (cluster) PM3371, anionic separation phase, any pH> 4.
  • FIG. 28 PM3442 peak, anionic separation phase, all pH> 4.
  • FIG. 29 PM3486 peak, anionic separation phase, all pH> 4.
  • FIG. 30 PM6423 peak, hydrophobic separation phase, normali ⁇ tion on the intensity of the PM6620 peak (PM is represented by MW in this figure);
  • FIG. 31 shows the ROC curves for the molecular weight markers 3371, 3442, 3486, and 6423 Da (MW is represented by MW in this figure);
  • FIG. 32 shows the result of a build with the Genecluster Software Version 1999 (Eisen M.) and Treeview Version 1.60 (Eisen M.) (Hierarchical classification on Data Set of the E6 study (95% CI) , Anionic Surface Q10);
  • Fig. 33 illustrates the principal component analysis for defensins (anion exchange surface Q10)
  • FIG. 34 illustrates the procedure for identifying the clusters PM6423, PM6439, PM6620 and PM6636 (PM is represented by MW in this figure).
  • FIG. 35 shows mass spectra acquired under conditions Q10, pH4, crude serum, -80 ° C., for the zone corresponding to the HNPs, for a control group and a group of sera of women carrying fetuses carrying trisomy 21. .
  • FIG. 36 presents the statistical data on the HNP, in signal on noise, in the form of "box plots" (box plots).
  • A signal on noise of each peak.
  • B longitudinal ratios of the signals / noise.
  • FIGS. 37 and 38 show the binormal ROC distributions and curves corresponding to each HNP (Fig. 37A: HNP1;
  • FIGS. 39 and 40 show mass spectra acquired under the same conditions as the spectrum of FIG. 35, centered on different zones.
  • FIG. 41 shows the distributions and ROC curves bi-normals associated with peaks other than PST identified as discriminants in QlO condi ⁇ tions, pH4, crude serum -8O 0 C.
  • FIG. 42 summarizes the data (in signal / noise) of the relevant peaks (other than the HNP) of the NS502 study, in the form of boxplots (box plots). Isolated points represent abnormal (outliers) values that fall outside the confidence interval.
  • FIGS. 43 to 48 show spectra acquired under purification conditions on H50, for certain zones identified as relevant in the studies NS526c and NS526d.
  • Figures 49 and 50 present the data for each peak (from NS526c and NS526d, respectively) in the form of distribution curves and ROC curves.
  • FIG. 51 and 52 show the results, in the form of box plots, for the markers identified in NS526c and NS526d.
  • Week of pregnancy adjusted to the number of days of the week at harvest number of days of gestation
  • Sex of the fetus, - Biological markers: hCG in IU / ml, uE3 in pg / ml, ⁇ -fetoprotein in IU / ml, the 3 converted into a multiple of the median (MoM measured value / median value),
  • Fetal karyotype outcome (conventional techniques) Outcome of pregnancy (birth, IMG, MFIU fetal death in utero, possibly histopathological findings).
  • the samples are partially depleted of abundant proteins such as albumin or immunoglobulins. Enrichment of Proteins Associated with Transport Molecules The transport proteins and the molecules associated with them are purified, thereby increasing the relative concentration of the molecules transported in the fraction of the sample analyzed. Serums fractionated according to native mass
  • Raw or partially depleted or enriched samples are fractionated under native conditions by separation as a function of protein mass. Synthesis of sample preparation
  • biochemical properties specific to each protein are used in order to separate them from each other according to their apparent surface charges (ionic properties) and their hydrophobicity. In parallel, their relative concentration within the sample and / or the analyzed fraction of the sample is studied. Four different approaches are used: Normal phase chromatography
  • a positively charged functional group e.g., quaternary amines
  • anionic character negatively charged
  • Two variable parameters are generally explored: the pH at which the incubation-association phase takes place and the degree of stringency of the eluent used.
  • a negatively charged functional group eg, carboxylate group
  • a known cationic character positively charged
  • various experimental combinations are applied to the association and elution phases. Hydrophobic interactions Hydrophobic interactions release structured water surrounding hydrophobic sectors of biomolecules. This has the effect of increasing the entropy, making the thermodynamically favorable interactions.
  • a chromato ⁇ graphy using a carbon chain for example: C 18 ) can be used. The association and elution conditions depend on the degree of hydrophobicity of the eluent used. Targeted purification
  • Two experimental schemes were used for a targeted approach to protein purification.
  • the biological characteristics of the proteins to be purified reveal the capacity of association with a metal ligand and / or chemical.
  • the identity of the protein to be isolated is known, allows to use an immune strategy, thus using an antibody specific for the targeted protein.
  • Laser desorption mass spectrometry Proteins are deposited on an active surface (SELDI mass spectrometry - Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation), or passive (MALDI mass spectrometry - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation), associated with a chemical matrix allowing, under vacuum, their ionization by a laser beam. Once ionized, they are accelerated and directed under electrostatic stress to a detector placed at the end of a vacuum tube. The speed at which they reach the detector (TOF - Time of Flighf) is proportional to the square root of their mass. y Electrospray mass spectrometry
  • the proteins are nebulized and then ionized under the action of an inert gas, passing through a very fine, highly charged needle.
  • the analyzer is most often a "TOF" of the same type as for laser desorption mass spectrometry.
  • the recordings and the analysis of the spectra are carried out according to different protocols, which depend on the surface and the apparatus (laser intensity, mass sensitivity of the detector, gain of the detector, adjustment of the deflector). These parameters are optimized according to the zone of the mass range to be analyzed.
  • the standardization factors used are mainly Total Current Ion (TIC), some markers having a specific standardization.
  • Figure 3 summarizes the different recording conditions, depending on the molecular weight of the proteins to be detected.
  • the spectra and the associated clusters are annotated according to two complementary procedures, one automatic, the other manual pertaining to the art of signal processing. The two procedures are then confronted with each other.
  • the samples were either analyzed native unfractionated or analyzed fractionated according to the mass of proteins.
  • the eluates were used either native or analyzed after albumin depletion or other transport proteins, and then separated and purified in two modes, one anionic, the other hydrophobic.
  • An analyzer of the SELDI-TOF mass spectrometer type was used to acquire the spectral information. Interest, Associativity and Purification on anionic surface
  • the spectra presented are obtained on anionic separating surface.
  • the peaks of interest mentioned are present at pH 4 and at any pH value greater than 4, insofar as no protein aggregation or precipitation phenomenon occurs at basic pH.
  • FIG. 4 shows the experimental scheme that was used.
  • Protein chips were prepared according to the following procedure:
  • the protein chips are inserted into the mass spectrometer or any other appropriate reading or sequencing apparatus.
  • the different separation and purification conditions used and their preparation protocols are summarized in Table 2 above.
  • the protein chips are inserted into the mass spectrometer for reading according to the different intensities described above and in FIG. 3, or any other suitable reading device, optimized and adjusted accordingly.
  • the skilled person will choose the intensity of the laser to allow the proteins to fly, depending on their mass, some of their physicochemical properties, and any interactions they establish with partners.
  • the antibodies used have been described above.
  • Calibrators used on Normal Phase / Silicon Oxide and Maldi mode are as described in Table 3.
  • Fraction A molecular weight ⁇ 10 kDa
  • Fraction B 10 kDa ⁇ molecular weight ⁇ 50 kDa
  • Fraction C 50 kDa ⁇ molecular weight ⁇ 100 IcDa
  • Fraction D molecular weight> 100 kDa
  • Mass fractionation is intended to increase the relative protein concentration of a fraction relative to the total protein concentration without altering the absolute concentration of the separated proteins.
  • albumin is normally found as a major element, and can be specifically deleted if necessary. This deletion was not performed in the experiments described here; the removal of albumin will detect an additional peak corresponding to ⁇ -fetoprotein, which is currently masked by the albumin peak.
  • Vivaspin 500 from Vivascience with 3 distinct cutoffs: 10, 50 and 100 kDa.
  • the separation by filtration on membrane takes place in PBS IX, pH 7.4, in non-denaturing conditions. All that passes through the membrane is of smaller mass than the cutoff threshold, all that remains in the dead volume above the membrane is of mass greater than the cutoff threshold.
  • the proteins remaining in the upper part of Vivaspin 500 with a cut-off threshold of 100 kDa therefore have a native mass> 100 kDa. This is also true of heterogeneous multimeric complexes as well as homogeneous ones.
  • C - 3 Instrumentation (Example: Study E6 - Anionic Purification) Acquisition Parameters
  • the Total Ion Currenf (TIC) standardization method allows for each spectrum to average the intensities, and adjusts the average intensities of each spectrum so that the data is normalized.
  • the normalization parameters used corresponded to a "Total Ion Current” normalization starting at 3000, and ending at 20000, with subtraction of the baseline, a normalization coefficient of 0.2691 12, and without normalization to ground.
  • the calibration is made according to the mass range observed. In zone 3 at 20 kDa, three calibrations are used, depending on whether the calibrator is: Cytochrome C bovine insulin, bovine ⁇ -lactoglobulin-A, bovine
  • the calibration is made on insulin peaks (bovine) (5733.58 + 1H), and bovine insulin 2H + (2866.79 + 1H).
  • the calibration equation used is quadratic: m / z
  • the clustering consists in grouping the value of the intensity of the peaks corresponding to this protein for all the recorded spectra.
  • a cluster is therefore defined as a table returning the value of the intensity of the peak considered for each spectrum studied.
  • Controls Control
  • DS Down Syndrome
  • ES Edward Syndrome
  • the peaks are manually annotated.
  • the clusters are then completed by searching within a window of ⁇ 0.3% of the M + H value of a signal such as signal / noise - 2, otherwise the local background noise is used.
  • the viewing area is between 3 000 Da and 20 000 Da
  • cytochrome C (bovine) is used to calibrate.
  • ⁇ -lactoglobulin A (bovine) is used to calibrate.
  • the choice of the calibrator does not influence the intensity values in any way. Their values do not vary according to the calibration used.
  • the calibration makes it possible to increase the accuracy of the values of the masses of the peaks recorded, over a restricted spectral zone.
  • other calibrators may be used. Table 12 below presents a list of calibrators that can be used, as well as their molecular weight.
  • Tables 13 and 14 in the data obtained from the spectra obtained (one spectrum per sample of the populations of the three groups Control, DS (T21) and ES (Tl 8), out of group -80 ° C, except for the special case of the samples A7 and Al 5, recorded in triplicate during the study E6).
  • the number of manually annotated clusters is reduced according to the criterion "present in at least 30% of the spectral population".
  • Table 16 indicates for a few clusters observed during the experiments of the E6 study, the flight time (TOF), the p value of the cluster and for each group (Control, T21, Tl 8 ), the mean, minimum and maximum intensities as well as the standard intensity deviation.
  • FIG. 5 shows the spectra obtained in the spectral zone 3000-2000 Daltons, in global views, for the control group, the T21 group and the Tl 8 group.
  • the standardized spectra are superimposed thereon by clinical category.
  • Figures 6, 7 and 8 show, respectively, the spectral views (normalized and superimposed spectra by clinical category), the pseudo-gel views, and the shifted view spectra (study E6), centered on the area 4000 Da.
  • Figures 9, 10 and 11 show, respectively, the spectral views (normalized and superimposed spectra by clinical category), the pseudo-gel views, and the offset-view spectra (study E6), centered on the 5000-6000 Da area.
  • FIGS. 12 to 18 show the spectra centered on the spectral area 3000-10000 Daltons, respectively in global views (standardized and superimposed spectra by clinical category), pseudo-gel view, and offset views (El to E5).
  • Figure 15 shows the spectra centered on the spectral area 3000-4000 Daltons (E1 to E5).
  • Figures 16 to 18 show the spectra, normalized and superimposed by clinical category, respectively centered on the areas 4000-5000 Daltons, 5000-7000 Daltons, and 7000-10000 Daltons (studies E1 to E5). Profiles obtained by separation according to the hydrophobicity of the H50 proteins (study E6)
  • Figure 32 shows the result of a build with Genecluster Version 1999 (Eisen M.) and Treeview Version 1.60 (Eisen M.) software (Hierarchical Classifi cation on Data Set of Study E6 (95% CI), Anionic surface Q10).
  • Construction method Data adjustment by logarithmic transforma ⁇ tion then normalization in order, according to the spectra then the clusters. Then hierarchical clustering simultaneously on Spearman's clusters and correlation spectra.
  • the software used is Stata SE 8 software and Ciphergen Express Version 1.0 software. Both software confirm the results.
  • the eigenvalues confirm the presence and the molecular weight of the peaks identified as defensins whose masses are: PM3371, PM3442 and PM3486.
  • results obtained for the peaks in the 3000 Dalton zone, on anionic surface Q10 are shown in Table 17. These three peaks are under-expressed or absent in the T21 group, reflecting a significant decrease in immunity, and expressed normally. or over-expressed in the control group. Further study of the results will determine the detection threshold for these three peaks, which are correlated and dependent, such that at least one negative sign among the three or one positive sign among the three signifies the disease or absence of disease, respectively.
  • the results presented in Table 17 show variability for these three peaks, mainly related to the fact that they were obtained with samples stored at -2O 0 C, showing some degradation.
  • Table 18 presents the results and applications for the peaks in the 4000 - 9000 Dalton area, on anionic surface Q10.
  • Table 19 shows the results and applications for peaks in the 4000 -17500 Dalton area, on H50 hydrophobic surface.
  • HNPs Human Neutrophil Defensins
  • peptides have correlated biophysicochemical properties. They are present in a native fraction of the samples such that the mass of the products is between 50 and 100 kDa as well as in a fraction of native mass greater than 100 IcDa. They are thus peptides associated with several distinct proteins, such that the mass of the complexes thus constituted is between 50 and 100 kDa, or greater than 100 kDa. Considerations about mass deviations and possible identification
  • PM6636 - PM6439 197 Da +/- IDa valine + proline (196 Da) or Proline + Threonine (198 Da)
  • PM6636 - PM6423 181 Da +/- IDa ⁇ No combination of amino acids
  • PM6620 - PM6439 181 Da + / - IDa ⁇ No amino acid combination
  • PM6620 - PM6423 197 Da +/- IDa -> valine + proline (196 Da) or proline + threonine (198 Da)
  • PM6439 - PM6423 16 Da Possible hydrolysis of a proline in hydroxyproline
  • the mass peaks PM 3371, PM3442, PM 3486, identified as defensins are under-expressed in the T21 groups and overexpressed or normally expressed in the controls.
  • the mass peaks PM 6423, PM 6439, PM6620, PM6636 are identified in pairs by hydrolysis of a proline to hydroxyproline (+16 Da).
  • the inventors have calculated the longitudinal ratios ⁇ le., Between 2 peaks of the same spectrum) between the intensities of the peaks corresponding to the different HNPs. Remarkably, they observed, only in native serum condition, a significant difference in these ratios, depending on whether it is a sample of a woman carrying a fetus with trisomy 21 or a woman with a healthy fetus.
  • the results of three of these studies are presented below, as well as in Figures 35 to 38.
  • the studies whose results are presented in detail were made from three datasets. They are identified as follows:
  • IC or CI confidence interval
  • Dataset dataset
  • Obs. number of samples observed
  • GC or CG control group
  • Down Down syndrome
  • Err. Std. standard error
  • SN signal on noise
  • Avg. average
  • AUC Area under curve, or area under the curve
  • var AUC variance of AUC
  • pAUC (8%) Partial Area Under Curve, a false positive rate (FP) of 8% was imposed on the Dataset.
  • Cluster 3 Dataset
  • Cluster 4 Cluster 5 (Longitudinal Ratio HNPx / HNPy)
  • Cluster Cluster 3 Cluster 4
  • Cluster 5 Longitudinal Ratio HNPx / HNPy
  • the peak intensity ratios of HNP-1 / HNP-3, and HNP-2 / HNP-3 are particularly discriminatory markers for detecting pregnant women who may carry a fetus with Down syndrome.
  • the peaks at 4859.10 Da and 8195.65 Da respectively correspond to the peaks at 4860 Da and 8206 Da identified in the preliminary studies (see Table 14 above).
  • the peaks at approximately 4068.5 Da, 4320.79 Da, 4619.80 Da, 8107 Da, 8269.10 Da and 8610.30 Da respectively correspond to the peaks at 4067 Da, 4317 Da, 6423 Da, 8112 Da, 8263 Da, and 8627 Da identified in the preliminary studies (see Table 14 above), and the doublet at 4642.66 Da and 4658.47 Da corresponds to the peak at 4650 Da identified initially.
  • Peaks 36, 37 and 38 of the NS526c study represent multicharged proteins corresponding to the proteins revealed by the peaks 8, 9 and 11 of this same study. Similarly, peaks 59, 60 and 61 of study NS526d correspond to peaks 20, 21 and 24.
  • Figures 43 to 48 show spectra on which some of the above-mentioned peaks occur in H50 purification cases.
  • Figures 49 and 50 present the data for each peak (from NS526c and NS526d respectively) as distribution curves and ROC curves.
  • Figures 51 and 52 show the results for these new markers, in the form of box plots. The points outside the boxes represent the aberrant points.
  • MassStart 880
  • MassRange: MassEnd 25118.9
  • CutOffMass 900
  • Table 42 shows the performances (sensitivity, specificity, etc.) of a combination of two ratios between the HNP defensins, and a combination of these same ratios with the hcg, on the dataset. NS502.
  • Other associations can be made between the different markers identified by the inventors.

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Abstract

Dépistage prénatal d'anomalies chromosomiques, plus particulièrement, par l'identification de nouveaux marqueurs d'anomalies chromosomiques, notamment de la trisomie 21, dont le dosage à partir d'un échantillon de fluide biologique de la femme enceinte permet, seul ou en en combinaison avec d'autres dosages, de déterminer la probabilité que le foeus soit atteint d'une anomalie chromosomique, avec une précision supérieure à celle des tests actuellement utilisés.

Description

MARQUEURS ET PROCEDES POUR LE DEPISTAGE PRENATAL D'ANOMALIES CHROMOSOMIQUES
La présente invention concerne le dépistage prénatal d'anomalies chromosomiques. Plus particulièrement, l'invention est basée sur l'identification de nouveaux marqueurs d'anomalies chromosomiques, notamment de la trisomie 21, dont le dosage à partir d'un échantillon de fluide biologique de la femme enceinte permet, seul ou en combinaison avec d'autres dosages, de déterminer la probabilité que le fœtus soit atteint d'une anomalie chromosomique, avec une précision supérieure à celle des tests actuellement utilisés. La trisomie 21 ou Syndrome de Down est la plus fréquente des anomalies chromosomiques viables. A l'origine de handicaps psychomoteurs, elle affecte une naissance sur 800, et sachant qu'environ 800 000 naissances sont obser¬ vées en France, l'incidence est de 1000 enfants trisomiques par an.
Son phénotype caractéristique permet le diagnostic clinique à la naissance. Environ 40% des enfants atteints de trisomie 21 sont également porteurs de malformations, dont les plus fréquentes sont des cardiopathies congénitales. Leur espérance de vie est maintenant de plus de 50 ans.
Le risque de trisomie augmente avec l'âge maternel, surtout après 35 ans (croissance exponentielle). Le risque est également augmenté si l'un des parents est porteur d'une translocation équilibrée ou si le couple a déjà donné naissance à un enfant avec anomalie chromosomique. Les anomalies fœtales dépistées à l'écho- graphie peuvent également conduire à la prescription d'un caryotype fœtal.
Le dépistage anténatal de la trisomie 21 consiste en l'étude du caryotype fœtal, soit sur cellules amniotiques, soit sur cellules trophoblastiques, soit sur sang de cordon. Le prélèvement est à risque de fausse couche. Le caiyotype est un examen long qui se pratique en laboratoire spécialisé et autorisé par le Ministère de la Santé. Il est donc réservé à une population de femmes dites "à risque élevé d'anomalies chromosomiques".
La proportion de cas de trisomie 21 dépistés sur des critères d'âge maternel et de signes d'appel échographiques est actuellement d'environ un tiers. Cependant la prévalence de la trisomie 21 à la naissance n'a pas significativement diminuée en raison de l'augmentation régulière de l'âge moyen des femmes enceintes. Depuis 1980, la prise en charge du caryotype fœtal par l'Assurance Maladie est fixée par voie réglementaire (Arrêté du 29 octobre 1991 paru au Journal officiel du 16 novembre 1991). Le caryotype fœtal est pris en charge financièrement en présence de l'une des indications suivantes : 1. Âge de la femme égal ou supérieur à 38 ans à la date du prélèvement
2. Anomalie chromosomique parentale
3. Antécédent, pour le couple, de grossesse(s) avec caryotype anormal
4. Diagnostic du sexe pour les maladies liées au sexe
5. Signes d'appel échographiques suivants : anomalies morphologiques du fœtus démontrées, internes ou externes, retard de croissance intra-utérin avéré, anomalies de quantité de liquide amniotique.
Depuis quelques années, de nombreuses équipes cherchent donc à identifier un ou des marqueurs sériques mesurables dans le sang maternel et qui pourraient permettre une évaluation du risque sérique maternel sur une population plus large.
En 1984, un premier marqueur sérique maternel de risque, l'alpha- fœtoprotéine (AFP), a été identifié : le taux d'AFP, en moyenne plus bas dans les grossesses avec trisomie 21, peut être utilisé pour calculer le risque de trisomie. En 1987, un autre marqueur, l'hormone gonadotrophine chorionique (hCG) s'est révélé plus élevé dans les grossesses avec trisomie 21. Depuis, beaucoup d'autres marqueurs sériques de risque de trisomie 21 ont été identifiés.
Les marqueurs les plus étudiés ont été : ThCG, l'AFP, l'oestriol non conjugué (uE3), la sous-unité β de l'hCG. Chaque marqueur utilisé individuellement est moins performant que son association à un ou plusieurs autres. En France, une étude pilote nationale multicentrique et plusieurs études régionales ont été effectuées. La demande des femmes s'est progressivement affirmée et, en 1994, plus de 10% des femmes enceintes ont eu un dosage de marqueurs sériques.
Ainsi, en France, depuis 1997, les marqueurs sériques maternels (hCG, uE3 et AFP) sont dosés et pris en charge par la Sécurité Sociale. Le test est côté B145 soit 39 euros 15. Un prélèvement de sang entre la 15ème et la 18ème semaine d'aménorrhée, pour le dosage d'au moins deux de ces marqueurs, est effectué, permettant un calcul de risque tenant compte du risque a priori de l'âge de la mère modulé selon les valeurs observées de ces marqueurs. Le risque seuil considéré comme décisionnel pour proposer un dépistage prénatal (amniocentèse) est arbitrai¬ rement fixé à 1/250. Le dosage des marqueurs sériques n'établit pas à lui seul le diagnos¬ tic de trisomie 21. C'est un test de dépistage qui permet d'estimer le risque de présence d'un enfant trisomique 21.
L'évaluation du risque de trisomie 21 par dosage des marqueurs sériques chez les femmes qui le souhaitent est largement effectuée aujourd'hui. En 1998, une étude menée par PINSERM permettait d'estimer le nombre de dosages à 572000 soit 76 % des naissances (certainement 85 % en 2004).
Cette politique est également appliquée dans les autres pays européens et anglo-saxons où la fréquence de la trisomie 21 est la même.
La sensibilité du dépistage est d'environ 60 % si le seuil de risque choisi pour accéder à l'amniocentèse est de 1/250. Cela conduit à proposer une amnio¬ centèse à environ 5 % des femmes enceintes. La valeur prédictive positive (spécifi¬ cité) est de l'ordre de 1 à 2 %. La sensibilité du dépistage est meilleure, à taux d'amniocentèse égal, si les marqueurs sont plus discriminants et combinés entre eux. Les combinaisons les plus utilisées actuellement sont le triple test (hCG + AFP + uE3) et les doubles tests, hCG + AFP ou hCG +uE3, ce dernier étant le meilleur.
Les faux-positifs du dépistage sont les amniocentèses à caryotype normal. Le nombre de faux-positifs doit être réduit le plus possible du fait du risque de perte fœtale après amniocentèse (environ 1 %). Par ailleurs, ils peuvent générer une grande anxiété chez les femmes dans l'attente des résultats du caryotype. Les faux négatifs du dépistage sont les cas de trisomie 21 non dépistés. Ils aggravent le choc émotionnel au moment de la naissance. En effet, les couples ayant bénéficié d'un dosage de marqueurs sériques comprennent mal la notion de risque résiduel et pensent souvent que le test est un moyen diagnostique. L'échec du dépistage est alors durement ressenti. Cette situation n'est pas satisfaisante dans la mesure où elle laisse passer 30 à 40 % des grossesses avec trisomie 21. Il faut trouver une technique visant à augmenter la sensibilité et la spécificité, réduire le nombre de procédures inutile- ment invasives (faux positifs) et surtout réduire le nombre de faux négatifs (30 à 40 %).
D'autres procédures sont en cours d'évaluation et non remboursées par la Sécurité Sociale, notamment les marqueurs sériques du premier trimestre de la grossesse. Il s'agit de la protéine PAPP-A (pregnancy associated plasma protein A), de la sous-unité bêta libre de hCG et de la mesure de la clarté nucale à 12 semaines d'aménorrhée. Certaines équipes essayent également de mettre au point la mise en évidence de cellules foetales ou de l'ADN foetal libre dans le sang maternel sans parve¬ nir aujourd'hui à un dépistage efficace. Les performances des marqueurs sériques dépendent de la stratégie choisie : seuil de risque au-delà duquel une amniocentèse est proposée, nature des marqueurs utilisés, et type d'associations entre eux. Certaines combinaisons de marqueurs sont plus performantes que d'autres (WaId et al, Lancet, 2003, 8, 361, 855- 6). Une étude récente portant sur 120 000 grossesses a montré que les fœtus trisomiques 21 détectés en prénatal par les marqueurs sériques ou anomalies échographiques (clarté nucale) auraient avorté spontanément plus que les fœtus trisomiques non détectables par ces méthodes (Leporrier N. et al., BJOG, 2003, 110, 1, 18-21). Ceci diminue donc l'efficacité de ce dépistage et incite à rechercher d'autres bio-marqueurs plus performants.
Dans une démarche originale visant à découvrir de nouveaux bio¬ marqueurs plus spécifiques de la trisomie 21, et/ou à déterminer un profil d'expression particulier, basé sur plusieurs molécules, les inventeurs ont conduit des études à partir de 280 sérums congelés de femmes enceintes avec fœtus trisomiques 21 (incluant celles qui ont été détectées et celles qui n'ont pas été détectées par les marqueurs sériques du second trimestre), et plus de 280 sérums témoins de femmes sans fœtus trisomiques 21 dont les issues sont connues.
Le placenta est une barrière entre la mère et le fœtus, mais il est prouvé que certaines molécules de petite masse moléculaire passent cette barrière. Les inventeurs ont donc choisi d'appliquer la technique protéomique dans le sérum des femmes enceintes, afin de déterminer un profil d'expression différentielle permettant de distinguer de façon quasi certaine celles avec fœtus trisomiques 21 par comparai- son avec des sérums de femmes enceintes normales. Cette démarche, illustrée dans la partie expérimentale ci-après, leur a permis d'identifier plusieurs marqueurs permet¬ tant de distinguer de façon quasi certaine les sérums de femmes avec foetus trisomiques 21 par comparaison avec des sérums de femmes enceintes portant des fœtus normaux.
La présente invention porte donc, en premier lieu, sur l'utilisation d'un ou plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi (i) les défensines neutrophiles humaines HNP-2, HNP-I et HNP-3, et/ou (ii) les espèces moléculaires détectables en spectro- métrie de masse avec une séparation de type échangeuse d'anions, aux poids molécu- laires suivants : 4461.60 Da ; 4570.90 Da ; 4630.70 Da ; 4714.30 Da ; 4859.10 Da ; 8195.65 Da ; 8905.85 Da ; 9121.00 Da ; 9700.50 Da, et/ou (iii) les espèces molécu¬ laires détectables en spectrométrie de masse avec une séparation de type hydrophobe, aux poids moléculaires suivants : 2625.47 Da ; 4068.5 Da ; 4075.95 Da ; 4084.3 Da ; 4084.7 Da ; 4093.13 Da ; 4320.79 Da ; 4642.66 Da ; 4658.47 Da ; 6419.80 Da ; 8107 Da ; 8124.5 Da ; 8140.5 Da ; 8155 Da ; 8269.10 Da ; 8338.80 Da ; 8610.30 Da, pour le diagnostic prénatal d'une anomalie fœtale.
Le terme "espèce moléculaire" désigne ici, entre autres, toute protéine, glycosylée ou non, phosphorylée ou non, tout complexe protéique, tout produit du métabolisme, ou tout fragment d'une quelconque de ces entités. Les poids moléculaire indiqués ici ont été obtenus dans des condi¬ tions expérimentales spécifiées ci-dessous. Certaines technologies, différentes de celles utilisées par les inventeurs, utilisables pour mettre en œuvre l'invention, sont citées ci-après. Il est clair qu'une certaine variation est susceptible d'apparaître lors de l'utilisation de technologies et/ou d'appareillages différents. Néanmoins, il est égale- ment très clair que l'homme du métier est capable de transposer les résultats décrits dans la partie expérimentale ci-dessous à d'autres technologies, avec un taux de recouvrement satisfaisant, et d'identifier sans peine les signaux (pics, ...) corres¬ pondants aux marqueurs mis en évidence par les inventeurs. Du fait de cette variation liée aux technologies (et aux spécifications des fabricants d'appareils de spectro- métrie, qui utilisent notamment des logiciels de traitement de l'information susceptibles d'entraîner des décalages de pics), les poids moléculaires indiqués ci- dessus doivent être entendus avec une précision de ± 20%, de préférence ± 10%, voire ± 5%, et, dans de bonnes conditions, ± 1%. Il convient de noter que dans les conditions décrites dans la partie expérimentale ci-après, la mesure des poids molécu¬ laires des différents marqueurs est reproductible, avec un coefficient de variation très inférieur à 10 %, typiquement de l'ordre de 0,3 à 0,5 %, pour les marqueurs de poids moléculaire inférieur à 12000 Da. Une précision de ± 0,1 % est même obtenue jusqu'à 6000 Da. Du fait des calibrants utilisés, ce coefficient de variation est de l'ordre de 10 à 25 % pour les marqueurs de poids moléculaire supérieur à 12000 Da. Comme précisé dans la partie expérimentale ci-dessous (titre C-3), le choix du calibrant n'influence pas les valeurs des intensités des pics observés. L'utilisation de calibrants différents de ceux utilisés par les inventeurs peut éventuellement conduire à une variation au niveau de la masse mesurée pour le marqueur, les pics correspondant à chacun des marqueurs restant toutefois toujours identifiables.
L'invention porte également sur un procédé de dépistage in vitro pour déterminer si une femme enceinte est porteuse d'un fœtus atteint d'une anomalie, comprenant une étape de détection ou de dosage, dans un échantillon biologique de ladite femme enceinte, d'au moins un marqueur sélectionné dans l'un quelconque des groupes (i) à (iii) définis ci-dessus.
Au sens de la présente invention, le mot "dosage" désigne une mesure quantitative ou semi-quantitative au sens large, par exemple une quantification relative d'un composé, par rapport au même composé dans un autre échantillon, ou par rapport à un autre composé dans le même échantillon. Ainsi, dans le présent texte, une comparaison de profils, obtenus par exemple par spectrométrie de masse, est assimilé à un "dosage".
Dans une mise en œuvre préférée du procédé de l'invention, il comprend une étape de dosage d'au moins deux ou trois marqueurs, dont l'un au moins est sélectionné dans les groupes (i) et/ou (ii) et/ou (iii) ci-dessus, et l'autre ou les deux autres est (sont) sélectionné(s) soit dans ces mêmes groupes, soit parmi les marqueurs déjà caractérisés et utilisés aujourd'hui, constituant ici le groupe (iv), comprenant les marqueurs du second trimestre - l'hormone gonadotrophine chorionique (hCG) ou sa sous-unité β libre, Pœstriol non conjugué (uE3), Pα-fœtoprotéine (AFP) et/ou l'inhibine A - ou du premier trimestre -sous-unité β libre d'hCG et/ou protéine plasmatique associée à la grossesse (PAPP-A). Alternativement, un des dosages peut être remplacé par l'observation de la clarté nucale, au premier trimestre.
Par exemple, un "triple test amélioré", basé sur le dosage de hCG, uE3, et un des marqueurs cités ci-dessus, est partie intégrante de l'invention. Alternati- vement, le dosage d'un marqueur des groupes (i) à (iii) ci-dessus peut être combiné à un ou plusieurs autre(s) test(s) connu(s), comme par exemple l'examen de la clarté nucale.
Le procédé de l'invention implique une étape de dosage à partir d'un échantillon biologique provenant de la femme enceinte, lequel peut être constitué de n'importe quel fluide corporel, tel qu'un échantillon de sang, sérum, plasma, urines...
Selon différentes variantes de l'invention, le nombre de marqueurs sélectionnés parmi les molécules identifiées par les inventeurs peut être égal à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou davantage, qu'il s'agisse de marqueurs sélectionnés dans les groupes (i), (ii), (iii) ou (iv) (au moins un des marqueurs étant sélectionné dans un des groupes (i) à (iii)). L'homme du métier déterminera le nombre de marqueurs à doser en fonction de contraintes d'efficacité (recherche d'un test le plus sensible et sélectif possible), et de contraintes économiques.
Dans une mise en œuvre préférée des procédés de l'invention, ces procédés comportent également, pour chaque marqueur dosé, une étape de comparai- son de la concentration mesurée de ce marqueur dans l'échantillon biologique de la femme enceinte, à des valeurs de référence de la concentration de ce marqueur chez des femmes enceintes portant des fœtus normaux, et chez des femmes enceintes portant des fœtus atteints d'une anomalie chromosomique et/ou génétique connue, la comparaison étant indicatrice du risque que la femme enceinte porte un fœtus atteint d'une anomalie chromosomique et/ou génétique. Ces références seront choisies par l'homme du métier de façon à correspondre à l'âge gestationnel du prélèvement effec¬ tué chez la femme enceinte.
Dans une réalisation particulière des procédés de l'invention, illustrée dans les exemples, le dosage d'au moins un marqueur est effectué par spectrométrie de masse, par exemple par spectrométrie de masse à basse résolution ou à haute résolution. Bien entendu, d'autres techniques de séparation, purification, ou de dosage peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention. En particulier, deux types de technologies peuvent être envisagées pour développer un dispositif de diagnostic selon l'invention : la comparaison de profils, ou le dosage ponctuel des marqueurs. A titre d'exemples non limitatifs, on peut citer les techniques suivantes :
• Techniques de séparation : H.P.L.C., L.C. (Liquid Chromatography), CE. {Capillary Electrophoresis) toutes technologies de type "microfluidique", gels bi- ou mono-dimensionnels, séparation en mode réverse {reverse phase) sur support solide plan ou non (planar surface, bead surface), les échantillons biologiques pouvant être ou non préalablement pré-fractionnés, par exemple sur membrane (Type Vivaspin de Vivascience mais aussi les spin columns de Millipore, Type Proteospin), et/ou dépiétés ou non des protéines majoritaires (albumine, ovalbumine, immunoglobulines etc.), et/ou associés par affinité.
• Dosage par comparaison de profils (spectres de masse) : outre les technologies décrites dans la partie expérimentale, on peut citer à titre d'exemple de spectromètre de masse utilisable dans le cadre de l'invention, le système ClinProt™ développé par la société Bruker Daltonics, qui utilise des microparticules magnétiques avec une surface fonctionnalisée.
Dans le cadre des dosages par comparaison de profils, plusieurs méthodes de détection du signal peuvent être utilisées, seules ou en couplage avec des procédés séparatifs (Technologies TOF, laser-MS et MS-MS, ESI-MS, LC-MS, MALDI, tandem, Q-Trap etc.... SELDI-MS, SELDI-MS-MS, chémoluminescence (Mesoscale, Roche diagnostics), technologie Elecsys, fluorescence, ICAT, signal piézoélectrique, signal optique comme la "surface plasmon résonance" ou S.P.R., etc.), pour mettre en évidence et doser les molécules issues des profils, soit sous forme native, soit sous forme ionique (1+, 2+, 3+, 4+, 5+ etc .), applicables aux protéines, aux glycoprotéines et aux lipoprotéines.
Selon une mise en œuvre particulière du procédé de l'invention, ce procédé comprend une étape d'analyse d'au moins un spectre obtenu à partir d'un échantillon biologique provenant d'une femme enceinte ; selon cette variante, on mesure le signal d'au moins 2 pics choisis parmi (i) les pics correspondant aux défen- sines neutrophiles humaines HNP-2, HNP-I et HNP-3, et/ou (ii) les pics observables en spectrométrie de masse avec une séparation de type anionique, aux poids molécu¬ laires suivants : 4461.60 Da ; 4570.90 Da ; 4630.70 Da ; 4714.30 Da ; 4859.10 Da ; 8195.65 Da ; 8905.85 Da ; 9121.00 Da ; 9700.50 Da, et/ou (iii) les pics observables en spectrométrie de masse avec une séparation de type hydrophobe, aux poids molé- culaires suivants : 2625.47 Da ; 4068.5 Da ; 4075.95 Da ; 4084.3 Da ; 4084.7 Da ; 4093.13 Da ; 4320.79 Da ; 4642.66 Da ; 4658.47 Da ; 6419.80 Da ; 8107 Da ; 8124.5 Da ; 8140.5 Da ; 8155 Da ; 8269.10 Da ; 8338.80 Da ; et 8610.30 Da.
Comme expliqué plus haut, le terme "spectre" désigne ici n'importe quel type de spectre (de masse, MALDI, MALDI-TOF, SELDI, SELDI-TOF, surface plasmon résonance, chromatographie liquide, ICAT, ESI, ESI-TOF, etc), l'homme du métier sachant transposer les résultats présentés ci-après en spectrométrie de masse à une autre technologie et retrouver les pics pertinents. De même, le terme "signal" désigne toute observable (variable statistique) ou ratio d'observables, tels que l'intensité, le signal sur bruit, l'aire du Tof {time offlighi), le Tof à mi-hauteur {Tof Width), la résolution, etc.
Parmi les marqueurs caractérisés par les inventeurs, trois ont été identifiés comme étant les défensines neutrophiles humaines HNP-2, HNP-I et HNP- 3, (voir partie expérimentale, D-9). Ces défensines sont surexprimées ou exprimées normalement chez les contrôles, et sous-exprimées en cas de trisomie 21 (fig. 15). Selon une mise en œuvre préférée du procédé de l'invention, au moins un des marqueurs pour lesquels le dosage est effectué est sélectionné parmi HNP -2, HNP-I et HNP-3. Un taux élevé du marqueur en question est indicatif d'un fœtus sain, tandis qu'un taux bas est indicatif d'une probabilité élevée de trisomie 21.
De plus, et de façon particulièrement surprenante et intéressante, les inventeurs ont constaté que les ratios entre ces défensines HNP-2, HNP-I et HNP-3 varient suivant que le fœtus est atteint du syndrome de Down ou non. Comme cela est détaillé dans la partie expérimentale ci-dessous (partie F), les ratios longitudinaux HNP-l/HNP-3 et HNP-2/HNP-3 sont statistiquement plus élevés en cas de trisomie 21 que lorsque la femme enceinte est porteuse d'un fœtus non trisomique. Ces ratios, particulièrement indicatifs, présentent en outre l'avantage d'être indépendants de la calibration de l'appareil de mesure. Les inventeurs ont par ailleurs constaté que les niveaux d'expression des défensines HNP2, HNPl et HNP3, ainsi que les ratios entre ces différents niveaux, ne sont corrélés ni avec l'âge de la femme enceinte, ni avec la semaine de grossesse, ni avec aucun des marqueurs utilisés actuellement (AFP, uE3 et HCG notamment), ni avec aucun des autres marqueurs identifiés dans les études rapportées ici. Ainsi, selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention, le ratio entre les concentrations de HNP-3 et de HNP-I et/ou HNP -2 dans l'échantillon est mesuré.
Bien entendu, ces ratios peuvent être mesurés à partir d'un spectre obtenu selon l'une quelconque des techniques citées ci-dessus. Il est également possible de mesurer les ratios d'expression des défensines par une technique d'amplification d'acide nucléique, par exemple par RT-PCR quantitative ou semi- quantitative, à partir de l'échantillon biologique, ou à partir d'ARN extrait de cet échantillon. Des amorces utilisables pour cela sont par exemple décrites dans l'article de Linzmeier, R. M. et T. Ganz Ç'Human defensin gène copy number polymorphisms: Comprehensive analysis of independent variation in alpha- and beta-defensin régions at 8p22-p23" Genomics 2005).
De façon alternative, il est également possible de mesurer, dans l'échantillon biologique, la somme totale des défensines HNP-I, HNP-2 et HNP-3, qui sont toutes sous-exprimées en cas de trisomie 21. Selon une mise en œuvre particu- lière du procédé de l'invention, le premier marqueur détecté est donc la somme des défensines HNP-2, HNP-I et HNP-3. Cette détection peut en particulier être réalisée par des techniques immunologiques, par exemple par ELISA ou PCR.
De manière générale, l'utilisation d'une ou plusieurs défensines neutrophiles humaines choisies parmi HNP-I, HNP-2 et HNP-3 (également notées HND-I, HND-2 et HND-3), comme marqueur(s) pour le diagnostic prénatal d'une anomalie chromosomique, est donc partie intégrante de la présente invention.
Comme évoqué ci-dessus, il est possible de mettre en œuvre les procédés de l'invention en effectuant un dosage ponctuel d'au moins certains marqueurs. A titre d'exemples non limitatifs de technologies utilisables pour cela (lesquelles peuvent aussi être couplées aux technologies chromatographiques citées plus haut), on peut citer les technologies suivantes : • Des anticorps peuvent être produits contre les marqueurs de l'invention, par n'importe quelle technique, y compris anticorps monoclonaux, synthèse chimique, production biologique (voie animale [exemple Bioprotein etc.], voie végétale [exemple Lemna - Biolex-Bayer, Meristems Therapeutics aussi etc...]). Ils peuvent ensuite être utilisés, soit pour effectuer directement un immuno-dosage des marqueurs correspondants, soit pour purifier les marqueurs préalablement à leur dosage.
• Dosage par immuno-réaction (Immuno Assay, ou IA) : diffé¬ rentes technologies, connues de l'homme du métier, peuvent être envisagées, telles que le Sandwich ImmunoÀssay (Sandwich IA), l'interaction de surface {Surface Plasma Résonance, ou SPR), ou l'immuno-précipitation (par exemple par la technologie Q- MAP développée par Atto-Lab).
L'approche Sandwich IA se base sur la double reconnaissance du marqueur - ou antigène - par des anticorps spécifiques : les anticorps dits "de capture" immobilisés sur le support choisi (plaque de micro-titration, bille magnétique...), et les anticorps dits "de détection", en solution et couplés à une molécule réactive, responsable de l'émission du signal de liaison (directement ou indirectement). Ce jeu d'anticorps spécifiques non recouvrant {Pair Matched Antibodies) constitue les réactifs communs aux différents systèmes de détection actuels. Alternativement, la reconnaissance de l'antigène peut se faire en utilisant des aptamères, qui sont des séquences oligonucléotidiques (ADN ou ARN) simples brins sélectionnées in vitro pour leur capacité de liaison à une molécule donnée ; cette sélection peut se faire, par exemple, par la méthode SELEX {Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment) telle que décrite dans le Brevet US 5,270,163. Un aptamère fonctionnalisé peut, par exemple, être utilisé à la place d'un anticorps secondaire dans un test immunologique de type "Sandwich ELISA", comme décrit par Sumedha Jayasena {Clinical Chemistry 1999, 45(9) : 1628-50, Fig. 6). Les aptamères peuvent faire l'objet d'une optimisation par différentes modifications (Sumedha Jayasena, supra, Fig. 2). Il est notamment possible de modifier les apta- mères de telle sorte que l'activation par UV après liaison de leur cible assure la liaison covalente de cette cible au support (photoaptamères). Les différentes composantes d'un dispositif diagnostic de type immuno-réaction dépendent également du système de détection utilisé. Certains réactifs et supports utilisables pour mettre en œuvre l'invention sont résumés dans le Tableau 1 ci-dessous, ainsi que des exemples d'instrumentation adaptés.
Figure imgf000013_0001
Des puces à protéines peuvent être conçues pour déterminer des profils d'expression protéique choisis, impliquant les marqueurs souhaités. Cette technologie est présentée dans l'article de revue de Sydor et Nock (Proteome Science, 2003, June 10; 1(1) : 3). Bien entendu, l'homme du métier peut améliorer les techno¬ logies présentées dans cet article en utilisant ses connaissances générales dans ce domaine.
A titre d'exemples particuliers de technologies d'immuno-réaction innovantes utilisables dans le cadre de l'invention, on citera la technologie MAP (Luminex Corp), les Bio Bar Codes (Nanotechnologies Inc.), les marqueurs LumiPhos 530 et 480 (Lumigen), et Ia RCA (Rolling-circle Amplification).
La technologie MAP (Luminex Corp) allie cytométrie de flux et microparticules sous un format de type IFA {Immunofuorescent Assay). Cette techno- logie propose une analyse en double fluorescence. Le premier système de détection permet de capter la fluorescence émise par les billes de capture des marqueurs (à une bille correspondent un marqueur et une fluorescence) ; le second permet quant à lui la mesure de la fluorescence associée aux anticorps de détection, c'est-à-dire à la quanti- fîcation des marqueurs.
Les Bio Bar Codes (Nanotechnologies Inc.) allient nanoparticules et scanométrie (Argent), introduisant un nouveau système de détection basé sur l'hybridation de sondes d'acides nucléiques uniques (identification des marqueurs)
{Nanoparticle-Based Bio-Bar Codes for the Uîtrasensitive Détection of Proteins, Jwa Min Nam and al., Science 2003).
Les marqueurs LumiPhos 530 et 480 (Lumigen) combinent les systèmes de détections chemiluminescent et fluorescent, assurant par là une optimisa¬ tion du signal.
La RCA (Rolling-circle Amplification) permet la détection de protéines avec une sensibilité de l'ordre de la zeptomole (10"21 moles). Cette technolo¬ gie, décrite par Schweitzer et al (Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Aug 29;97(18):10113-9), implique la polymérisation d'une longue chaîne d'ADN simple brin fixée à l'analyte (par exemple, un anticorps), à partir d'une matrice d'ADN circulaire. Cette technologie permet de minimiser les volumes d'échantillons et l'utili- sation de matériels coûteux (anticorps monoclonaux et enzymes).
On notera également la possibilité d'utilisation de systèmes d'amplification du signal comme autre catégorie de réactif dans le cadre notamment des IFA et CLIA (ex : biotine/avidine).
Les marqueurs peuvent également être détectés par une technique d'amplification d'acide nucléique par polymérisation en chaîne (PCR ou autre technique).
L'invention permet de dépister des anomalies chromosomiques, en particulier le syndrome de Down (trisomie 21), le syndrome d'Edwards (trisomie 18), le syndrome de Patau (trisomie 13), le syndrome de Turner, le syndrome de Klinefelter, la monosomie X, le syndrome de l'X fragile, et le syndrome penta X et une délétion du bras long du chromosome 7, mais également d'autres anomalies congénitales, dépistées actuellement par échographie, par exemple le Spina Bifida. En outre, l'invention peut être appliquée au dépistage de pathologies génétiques ou infectieuses (virale, bactérienne, ou parasitaire) ou métaboliques du fœtus, ou à la recherche d'un phénotype précis et en particulier du sexe du fœtus. L'invention est particulièrement adaptée au diagnostic prénatal du syndrome de Down. La présente invention est applicable au dépistage prénatal au cours du second trimestre, ou plus précocement, au cours du premier trimestre de la grossesse.
Bien entendu, les connaissances de l'homme du métier lui permettent de compléter les procédés de l'invention, par exemple en tenant compte de l'âge de la femme enceinte ou de toute autre variable (semaine de gestation, ...) utilisée comme critère d'ajustement.
Les procédés de dépistage selon l'invention peuvent également comporter une étape initiale de préparation de l'échantillon. Par exemple, cette étape peut comprendre un fractionnement en fonction de la masse des protéines, et/ou une étape de déplétion en albumine ou autres protéines de transport, et/ou une étape de purification des protéines sur une surface préparative de type anionique et/ou hydro- phobe.
La présente invention porte également sur une trousse de diagnostic prénatal d'anomalies chromosomiques, comprenant des moyens appropriés pour mettre en œuvre un des procédés décrits plus haut.
L'homme du métier est capable de sélectionner, suivant les techniques de dosage et de détection qu'il souhaite utiliser pour mettre en œuvre l'invention, les éléments à intégrer dans une telle trousse de diagnostic : anticorps spécifiques, anticorps secondaires, aptamères, réactifs de détection (composés fluores- cents, enzymes, anticorps modifiés pour utiliser la technologire RCA, ...), amorces et/ou sondes, etc .. Il peut choisir au moins certains de ces éléments parmi les élé¬ ments mentionnés ci-dessus, et compléter la trousse, le cas échéant, à l'aide de ses connaissances générales et d'ouvrages de référence sur la purification, le dosage, ou la détection de molécules biologiques. Une trousse de diagnostic prénatal selon l'invention peut par exemple comporter des anticorps spécifiques et/ou des aptamères d'un ou plusieurs marqueurs cités ci-dessus et/ou des amorces d'amplification ainsi que des sondes. Bien entendu, dans une trousse qui contient plusieurs anticorps, aptamères ou amorces spécifiques de marqueurs, chaque anticorps, aptamère ou amorce est spécifique d'un seul marqueur. Lorsque ces composés sont en solution, chaque solution est de préfé¬ rence spécifique d'un seul marqueur, ou d'un groupe de marqueurs associés (par exemple, les défensines HND-I, HND-2 et HND-3). A titre d'exemples d'anticorps qui peuvent être inclus dans une trousse selon l'invention, on peut citer les anticorps anti- HND tels que ceux commercialisés par Tebu-Bio SA (39 rue de Houdan, F-78612 Le Perray en Yvelines) sous la référence 038NCL-DEFENSIN (Anti Neutrophil Defensins Mouse IgGl Clone D21, 1 ml). Avantageusement, une trousse de diagnostic selon l'invention comprend, pour au moins un des marqueurs de l'invention, un jeu d'anticorps spécifiques non recouvrant, c'est-à-dire au moins deux anticorps capables de reconnaître simultanément le marqueur en question, ce qui permet de réaliser des tests d'immuno-réaction de type "sandwich". Les anticorps, en particulier les anticorps dits "de capture", peuvent être immobilisés sur un support, et les anticorps dits "de détection" couplés à une molécule permettant la détection. Des exemples non limitatifs de supports et de molécules permettant la détection, utilisables dans le cadre de l'invention, sont mentionnés ci-dessus. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 illustre la stratégie expérimentale utilisée ; - la figure 2 illustre une préparation schématique des échantillons ;
- la figure 3 résume les différentes conditions d'enregistrement, en fonction de la masse moléculaire des protéines à détecter ;
- la figure 4 illustre le schéma expérimental utilisé dans les études El, E2, E3, E4 et E6 ; - la figure 5 représente les spectres obtenus sur la zone spectrale
3000-20000 Daltons, en vues globales, pour le groupe contrôle, le groupe T21 et le groupe Tl 8 ; - les figures 6-8 illustrent les spectres centrés sur la zone 4000 Daltons (figure 6 : spectres en vues globales ; figure 7 : pseudo-gels ; figure 8 : spectres en vues décalées) ;
- les figures 9-11 illustrent les spectres centrés sur la zone 5000- 6000 Daltons (figure 9 : spectres en vues globales ; figure 10 : pseudo-gels ; figure
11 : vues décalées) ;
- les figures 12 à 14 illustrent les spectres centrés sur la zone spectrale 3000-10000 Daltons (figure 12 : spectres en vues globales ; figure 13 : pseudo-gels ; figure 14 : vues décalées) ; - la figure 15 illustre les spectres centrés sur la zone 3000-4000
Daltons (spectres en vues globales) ;
- les figures 16 à 18 illustrent les spectres centrés respectivement sur les zones 4000-5000 Daltons, 5000-7000 Daltons et 7000-10000 Daltons (spectres en vues globales) ; - la figure 19 illustre les spectres en vues globales, normalisés et superposés par catégorie clinique, pour le groupe contrôle, le groupe T21, et le groupe Tl 8, sur la zone spectrale 3000-10000 Daltons (étude E6) ;
- les figures 20 et 21 illustrent, pour la même zone spectrale que celle de la figure 19, les vues en pseudo-gels (figure 20) et les vues décalées (figure 21) uniquement pour le groupe contrôle et le groupe T21 ;
- les figures 22-24 présentent les spectres sur la zone spectrale 3000- 2000 Daltons, respectivement en vues globales (spectres normalisés et superposés par catégorie clinique) pour les groupes contrôle, T21 et Tl 8, en vues pseudo-gels pour les groupes contrôle et T21, et en vues décalées pour les mêmes groupes (étude E6) ; - la figure 25 montre les spectres centrés sur la zone 6500, après normalisation par rapport à l'intensité du cluster PM6622 (études E4 et E5). Cette figure montre la superposition des spectres pour les catégories contrôle et T21 (étude E6) ;
- la figure 26 montre les spectres centrés sur la zone 6500 après normalisation sur le pic PM6622, (spectres normalisés et superposés par catégorie clinique), pour les groupes T21, contrôle, et Tl 8. Sur cette figure, le pic référencé N correspond au cluster PM6622 et sert à normaliser les spectres ; - les figures 27 à 30 montrent des exemples de statistiques de distri¬ bution des intensités de différents clusters, pour les groupes contrôle et T21 :
. figure 27 : pic (cluster) PM3371, phase séparative anionique, tout pH > 4. . figure 28 : pic PM3442, phase séparative anionique, tout pH > 4.
. figure 29 : pic PM3486, phase séparative anionique, tout pH > 4.
(PM est représenté par MW dans ces figures).
. figure 30 : pic PM6423, phase séparative hydrophobique, normali¬ sation sur l'intensité du pic PM6620 (PM est représenté par MW dans cette figure) ; - la figure 31 montre les courbes ROC pour les marqueurs de poids moléculaires 3371, 3442, 3486, et 6423 Da (PM est représenté par MW dans cette figure) ;
- la figure 32 montre le résultat d'une construction avec les logiciels Genecluster Version 1999 (Eisen M.) et Treeview Version 1.60 (Eisen M.) (Classifi- cation hiérarchique sur Jeu de Données de l'étude E6 (IC 95%), Surface Anionique QlO) ;
- la figure 33 illustre l'analyse en composante principale pour les défensines (surface échangeuse d'anions QlO) ;
- la figure 34 illustre la procédure d'identification des pics (clusters) PM6423, PM6439, PM6620 et PM6636 (PM est représenté par MW dans cette figure).
- la figure 35 montre des spectres de masse acquis en conditions QlO, pH4, sérum brut, -8O0C, pour la zone correspondant aux HNP, pour un groupe contrôle et un groupe de sérums de femmes porteuses de foetus porteurs de la trisomie 21.
- la figure 36 présente les données statistiques relatives aux HNP, en signal sur bruit, sous forme de "boîtes à moustaches" {box plots). A : signal sur bruit de chaque pic. B : ratios longitudinaux des signaux/bruit.
- les figures 37 et 38 présentent les distributions et courbes ROC binormales (binormal Roc curve) correspondant à chaque HNP (fig. 37A : HNPl ;
37B :HNP2 ; 37C :HNP3) et à chaque ratio longitudinal entre deux HNP (fig. 38A : 1/2 ; 38B : 1/3 ; 38C : 2/3), le tout en signal/bruit. Pour ces figures, ainsi que les figures 41, 49 et 50, le numéro du pic et son poids moléculaire (PM) sont indiqués, et les termes suivants sont utilisés : Empirical A UC estimation = estimation empirique de l'aire sous la courbe, qui est une estimation non paramétrique calculée sur les données continues du rapport signal sur bruit ; TP rate = taux de vrais positifs ; FP rate = taux de faux positifs ; normal density = densité normale ; CTRL = contrôle ; DS = syndrome de Down ; mean ≈ moyenne ; sd- déviation standard.
- les figures 39 et 40 montrent des spectres de masse acquis dans les mêmes conditions que le spectre de la figure 35, centrés sur des zones différentes.
- la figure 41 présente les distributions et courbes ROC binormales associées aux pics autres que les HNP identifiés comme discriminants dans les condi¬ tions QlO, pH4, sérum brut, -8O0C.
- la figure 42 résume les données (en signal/bruit) des pics pertinents (autres que les HNP) de l'étude NS502, sous forme de boîtes à moustaches (box plots). Les points isolés représentent les valeurs anormales (aberrantes), qui sortent de l'intervalle de confiance.
- les figures 43 à 48 présentent des spectres acquis en conditions de purification sur H50, pour certaines zones identifiées comme pertinentes dans les études NS526c et NS526d.
- les figures 49 et 50 présentent les données afférentes à chaque pic (de l'étude NS526c et de l'étude NS526d, respectivement), sous forme de courbes de distributions et de courbes ROC.
- les figures 51 et 52 montrent les résultats, sous forme de boîtes à moustaches (box plots), pour les marqueurs identifiés dans les études NS526c et NS526d. - la figure 53 présente des spectres acquis avec un spectromètre de masse à haute résolution, dans les conditions spécifiées dans la partie H-2 ci-dessous. Crude sera = sérums bruts ; native MW = poids moléculaire natif.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLES
A - MATERIELS ET METHODES
A - I Echantillons Biologiques - Population d'Etude
Recueillis rétrospectivement et prospectivement dans un cadre multicentrique, les échantillons biologiques de sang maternel ont été prélevés selon les recommandations et pratiques actuelles entre la 14eme et la 25ème semaine de grossesse, acheminés en procédure centralisée, conservés à + 40C selon les procédures actuelles en vigueur, aliquotés et congelés à - 200C (échantillons historiques).
Dans le but de vérifier la faisabilité en routine, la robustesse de la méthode, ainsi que la comparabilité des résultats entre différentes conditions de congélation, et en regard des futures procédures et recommandations du domaine, de nouveaux échantillons ont été recueillis sur la même base méthodologique clinique, acheminés à + 4°C, mais aliquotés et congelés directement à - 800C (échantillons contemporains). Dans tous les cas, les échantillons ont été stockés et congelés à -
800C.
Les annotations suivantes, constituant les données cliniques et biologiques de chaque échantillon, ont été recueillies :
Numéro de dossier, - Date du prélèvement,
Âge et poids de la mère
Semaine de grossesse ajustée au nombre de jours de la semaine au prélèvement = nombre de jours de gestation
Sexe du fœtus, - Marqueurs Biologiques : hCG en Ul/ml, uE3 en pg/ml, α- fœtoprotéine en Ul/ml, les 3 convertis en multiple de la médiane (MoM = valeur mesurée/valeur médiane),
Risque, calculé en fonction de l'âge de la femme enceinte et de ses données en MoM, - Indication (âge, marqueurs, signes cliniques échographiques)
Résultat du caryotype fœtal (techniques conventionnelles) Issue de la grossesse (naissance, IMG, MFIU mort fœtale in utero, éventuellement résultats anatomopathologiques).
Les échantillons dont l'issue est connue puisque les études ont été menées rétrospectivement ont été répartis en plusieurs groupes, dont un groupe de mères porteuses d'enfants normaux et un groupe de mères porteuses d'enfants atteints du Syndrome de Down (T21). La robustesse des études est par ailleurs renforcée par la présence de mères porteuses d'autres anomalies (Trisomie 18 ou Syndrome d'Edwards, Syndrome de Turner, Délétion terminale du bras long du chromosome 7 (del 7q)). Dans le but de contrôler la validité interne des études, les échantil¬ lons ont été analysés en aveugle ou double aveugle dans les études cas-contrôle (afin de s'affranchir des biais de suivi pendant les analyses et des biais d'attrition).
Toutes les études rétrospectives l'ont été sur échantillons appariés (cases and controls matched), afin de s'affranchir des biais de confusion et rendre comparables les études. Un suivi longitudinal des expériences a été réalisé afin de contrôler la variabilité expérimentale (instrumentale et humaine). La taille des popula¬ tions étudiées et la puissance requise assurent la validité externe des résultats. A - 2 Matériels et Méthodes d'Analyse des Protéines
Toutes les recherches ont été réalisées en environnement de bonnes Pratiques de Laboratoire, ou B.F.L.(G.L.P.), en particulier : Matériels et Consommables
Un spectromètre de masse de type PBS II c équipé du logiciel d'acquisition des spectres ProteinChip® Software V.3.1.1 et du Bio Marker Wizard (B.M.W) Software Version 3.1. (Ciphergen Biosystems Inc., Fremont, CA, USA) a été utilisé.
En complément des études réalisées sur surface hydrophobe H50 (mélange de chaînes C6 à C 12) avec le spectromètre de masse Ciphergen, les échan¬ tillons ont été passés sur un spectromètre de plus haute résolution, en l'occurrence un spectromètre Ultraflex Bruker (partie H-2 ci-dessous et figure 53). Les inventeurs ont utilisé différentes surfaces de purification en approche avec et sans fractionnement, avec ou sans déplétion en albumine, en mode "reverse phase", en mode ciblé avec des anticorps, en mode étude des phosphoryla- tions comme des glycosylations, dont les chimies de surface, d'interaction, et les matrices utilisées pour l'ionisation des protéines sont récapitulées dans le Tableau 2 ci-dessous. Les références indiquées sont, pour chaque surface, les références du fournisseur (Ciphergen Biosystems Inc., Fremont, CA, USA).
Figure imgf000022_0001
La résolution et la précision en masse ont été vérifiées mensuellement, avant, pendant et après chaque expérience, dans le cadre de procédures de contrôle qualité mettant en œuvre des tests sur puce dorée en mode MALDI et sur puces à oxyde de silice en mode SELDI et utilisant les calibrants du Tableau 3 ci-après. Les références indiquées sont les références du fournisseur (Ciphergen Biosystems Inc., Fremont, CA, USA).
Figure imgf000023_0001
Les conditions expérimentales utilisées en routine dans un mode particulier (tampons, matrices, chimies de surfaces, pH de travail, Intensités laser) sont toujours réalisées en environnement contrôlé (20°C-25°C) ; elles sont listées dans le Tableau 4 ci-après.
Figure imgf000024_0001
Pour les études ciblées, les anticorps monoclonaux suivants ont été utilisés :
• Anti-hCG et Bêta hCG, Référence RDI-CBL75 (RDI Research Diagnostics Inc.) • Anti-Alpha-Foetoprotéine humaine, Référence RDI-TRK4F16-4A3 (RDI Research Diagnostics Inc.),
• Anti-P APP-A, Référence RDI-TRK4P41-10E2 (RDI Research Diagnostics Inc.)
Stratéfiie Expérimentale utilisée La stratégie expérimentale utilisée est schématisée à la figure 1.
Préparation des Echantillons Sérums bruts ou natifs
Les échantillons conservés congelés depuis leur collecte, sont décongelés sur lit de glace pour analyse directe et/ou après purification préalable. Dêplétion
Les échantillons sont partiellement dépiétés en protéines abondantes telles que l'albumine ou les immunoglobulines. Enrichissement des protéines associées aux molécules de transport Les protéines de transport et les molécules qui leur sont associées sont purifiées, augmentant de fait la concentration relative des molécules transportées dans la fraction de l'échantillon analysée. Sérums fractionnés en fonction de la masse native
Les échantillons bruts ou partiellement dépiétés ou enrichis sont fractionnés en condition native par séparation en fonction de la masse des protéines. Synthèse de la préparation des échantillons
La préparation des échantillons est présentée sous forme schématique à la figure 2. Procédés de purification
Les échantillons ont été préparés selon différents degrés de fraction- nement et purifiés par chromatographie de rétention sur phase solide de surface et/ou chromatographie liquide. Purification de type biochimique
Les propriétés biochimiques propres à chaque protéine sont utilisées afin de les séparer les unes des autres selon leurs charges apparentes de surface (propriétés ioniques) et leur hydrophobicité. Parallèlement, leur concentration relative au sein de l'échantillon et/ou de la fraction analysée de l'échantillon est étudiée. Quatre approches différentes sont utilisées : Chromatographie en phase normale
Cette approche cliromatographique reposant sur l'utilisation d'oxyde de silice, permet de vérifier la qualité d'un échantillon et d'apprécier la concentration relative d'une protéine. L'association se fait par l'intermédiaire d'arginines, de lysines, de serines et de thréonines. Chromatographie échangeuse d'anions
Un groupement fonctionnel chargé positivement (par exemple : aminés quaternaires) est utilisé pour séparer les molécules ayant un caractère anionique avéré (chargées négativement). Deux paramètres variables sont générale¬ ment explorés : le pH auquel la phase d'association-incubation a lieu et le degré de stringence de l'éluant utilisé. Chromatographie échangeuse de cations
Un groupement fonctionnel chargé négativement (par exemple : groupement carboxylate) est utilisé pour séparer les molécules ayant un caractère cationique avéré (chargées positivement). Comme pour la chromatographie échan¬ geuse d'anions, différentes combinaisons expérimentales sont appliquées aux phases d'association et d'élution. Interactions hydrophobiques Les interactions hydrophobes libèrent l'eau structurée entourant des secteurs hydrophobes des biomolécules. Ceci a pour conséquence d'accroître l'entropie, rendant les interactions thermodynamiquement favorables. Une chromato¬ graphie utilisant une chaîne de carbones (par exemple : C18) peut être utilisée. Les conditions d'association et d'élution dépendent du degré d' hydrophobicité de l'éluant utilisé. Purification ciblée
Deux schémas expérimentaux ont été utilisés pour une approche ciblée de la purification de protéines. Dans un premier cas, les caractéristiques biologiques des protéines à purifier révèlent des capacités d'association à un ligand métallique et/ou chimique. Dans le second cas, l'identité de la protéine à isoler étant connue, permet d'employer une stratégie immunitaire, faisant dès lors appel à un anticorps spécifique de la protéine ciblée.
> Capture par affinité avec un ligand
II s'agit d'une stratégie de purification reposant sur la forte affinité d'une protéine pour un ligand chimique connu. Seules les protéines affines de ce ligand seront retenues sur la surface spécifiquement préparée à cet usage. y Interactions anticorps-antigène
II s'agit d'une stratégie de purification reposant sur la connaissance de la protéine ciblée et l'existence d'anticorps spécifiques de la cible. La très forte affinité existant entre l'anticorps et la protéine contre laquelle il est dirigé est utilisée pour séparer la cible des autres protéines de l'échantillon. La purification simultanée de facteurs associés à la cible est possible. Modes et Procédés d'Acquisition des Données Introduction Différents modes d'analyse des données sont utilisés. Les résultats issus des phases de purification par chromatographie liquide peuvent être visualisés directement lors des différentes phases d'élution des protéines par spectroscopie d'absorption, ou indirectement, par séparation par mobilité électrophorétique en conditions dénaturantes ou encore par spectrométrie de masse. Spectroscopie d 'absorption
L'enregistrement des données a lieu en sortie de colonne de chromatographie par insertion d'un spectrophotomètre UV (λ = 280 nm) en série avant le collecteur. L'absorption à cette longueur d'onde est principalement due au tryptophane et à la tyrosine. Electrophorèse dénaturante
Les différentes fractions de protéines issues des étapes de fraction¬ nement et de purification sont dénaturées par action d'agents dénaturants (détergents, etc ..) et dégradation thermique. Les protéines dénaturées migrent dans une phase poreuse (le gel) sous contrainte électrostatique. Leurs caractéristiques physico¬ chimiques (pi, masse, etc...) assurent une bonne séparation des différents produits. Spectrométrie de masse Les protéines ionisées sont séparées en fonction de leur masse par les technologies suivantes :
> Spectrométrie de masse par désorption laser Les protéines sont déposées sur une surface active (spectrométrie de masse SELDI - Surface Enhanced Laser Désorption Ionisation), ou passive (spectro- métrie de masse MALDI - Matrix Assisted Laser Désorption Ionisation), associées à une matrice chimique permettant, sous vide, leur ionisation par un faisceau laser. Une fois ionisées, elles sont accélérées et dirigées sous contrainte électrostatique vers un détecteur placé à l'extrémité d'un tube sous vide. La vitesse à laquelle elles atteignent le détecteur (TOF - Time of Flighf) est proportionnelle à la racine carrée de leur masse. y Spectrométrie de masse par électrospray
Les protéines sont nébulisées puis ionisées sous l'action d'un gaz inerte en passant dans une aiguille très fine fortement chargée. L'analyseur est le plus souvent un "TOF" du même type que pour la spectrométrie de masse par désorption laser.
Méthodologie d'Enregistrement et d'Analyse des Spectres : Conditions Expérimentales d' enregistrement, d'optimisation et d'annotation
Les enregistrements et l'analyse des spectres sont effectués selon différents protocoles, qui dépendent de la surface et de l'appareillage (intensité laser, sensibilité en masse du détecteur, gain du détecteur, réglage du déflecteur). Ces paramètres sont optimisés en fonction de Ia zone de la gamme de masse à analyser.
Les facteurs de normalisation utilisés sont principalement le Total Ion Courant (TIC), certains marqueurs ayant une normalisation spécifique.
La figure 3 résume les différentes conditions d'enregistrement, en fonction de la masse moléculaire des protéines à détecter.
Lors des étapes préliminaires à l'analyse, les spectres et les clusters associés sont annotés selon deux procédures complémentaires, l'une automatique, l'autre manuelle relevant de l'art du traitement du signal. Les deux procédures sont alors confrontées entre elles.
B - GENERALITES SUR LE MANAGEMENT DES DONNEES ET
L'ANALYSE DES RESULTATS Les résultats obtenus pour chaque groupe clinique sont analysés par confrontation et opposition directe. Différents schémas d'analyses statistiques sont utilisés : courbes montrant le nombre de vrais positifs (sensibilité) en fonction du nombre de faux positifs (1 - spécificité) (ROC - Receiver Operating Characteristic), analyse par composante principale (ACP), analyse par classification (CART - Classi- fication And Régression Tree), corrélations, etc.. L'ensemble, testé et validé, assure la robustesse des modèles prédictifs construits. C - PREMIERE SERIE DΕTUDES EFFECTUEES C - I Introduction
Plusieurs études ont été menées (El, E2, E3, E4, E5, E6), ayant pour objectif d'optimiser la visualisation des protéines dans les zones spectrales expliquées précédemment, d'optimiser leur détection et l'analyse de leur comportement en fonction de leurs propriétés biochimiques intrinsèques et de leurs capacités d'interaction et d'association. Plusieurs conditions ont été définies en fonction des propriétés chimiques des surfaces ou des polymères, des tampons d'incubation, du pH, des matrices dont la fonction est de ioniser les espèces et de faciliter leur désorption, donc leur séparation sous l'impulsion du laser (voir Tableau 2 plus haut décrivant les conditions utilisées).
Les caractéristiques principales de l'étude E6 sont : o Etude menée en aveugle o Etude rétrospective/Cas Contrôle o Stockage des échantillons à l'Hôpital: -20°C & -80°C o Stockage des échantillons à Neurolab: -80°C Trois populations ont été étudiées : o Contrôle = Groupe témoin o DS = Down Syndrome = T21 o ES = Edward Syndrome = Tl 8 o Une quatrième population, constituée d'échantillons congelés et conservés à -8O0C renforce la valeur des pics analysés.
Figure imgf000030_0001
Remarques : Les annotations de Ia population étudiée et les résultats du Triple Test (hCG, uE3, α féto protéine) (examen de référence) montrent que les patientes Al et 3 n'ont pas été dépistées, les enfants sont nés atteints du Syndrome de Down (Trisomie 21).
Les échantillons sont appariés (Contrôle/DS) pour éviter les biais de confusion. En raison de l'excellente reproductibilité des expériences menées dans les études El à E5 en triplicate, un spectre est enregistré par échantillon, sauf pour contrôler la reproductibilité intra-expérience (par exemple : les échantillons A7 et Al 5 qui ont été enregistrés en triplicate lors de l'étude E6).
Les propriétés de la population d'étude sont résumées dans le Tableau 6 suivant et présentent les codifications suivantes:
DS = Down Syndrome - T21 ES = Edward Syndrome = Tl 8 DM = Donnée Manquante à la Date du Rapport N/A = Non Applicable (prélèvements effectués en dehors de la période étudiée)
IMG = Interruption Médicale de Grossesse
PV = perdu de vue. Une partie des données est donc manquante.
Dans cette application particulière (conditions retenues documen¬ tées), les échantillons ont été soit analysés natifs non fractionnés, soit analysés fractionnés en fonction de la masse des protéines. Les éluats ont été utilisés soit natifs soit analysés après déplétion en albumine ou autres protéines de transport, puis séparés et purifiés selon deux modes, l'un anionique, l'autre hydrophobe. Un analy¬ seur de type spectromètre de masse SELDI-TOF a été utilisé pour acquérir les infor¬ mations spectrales. Intérêt, Associativité et Purification sur surface anionique
Les spectres présentés sont obtenus sur surface séparative de type anionique. Les pics d'intérêt mentionnés sont présents à pH 4 et à toute valeur du pH supérieure à 4, dans la mesure où aucun phénomène d'agrégation ou de précipitation des protéines n'intervient à pH basique.
Intérêt, Associativité sur surface hydrophobe
Les spectres présentés sont obtenus sur surface séparative de type hydrophobe, après phase d'incubation et de lavage en tampon Phosphate Bujfer Saline (PBS IX) à pH 7,4 (Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning : A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N.Y.). C - 2 Schéma Expérimental (études El, E2, E3, E4 et E6)
La Figure 4 présente le schéma expérimental qui a été utilisé.
Lors d'études de type profilage, les inventeurs ont travaillé en conditions non dénaturantes comme en conditions dénaturantes. Des puces à protéines ont été préparées selon le mode opératoire suivant :
1. Insertion des barrettes dans les bioprocesseurs ; 2. Hydratation ou pré rinçage des spots avec 5 à 100 μl d'un tampon d'hydratation spécifique ; 3. Élimi¬ nation du surnageant et Ajout de 100 μl d'un tampon d'incubation ; 4. Ajout de 1 μl de sérum par spot ; 5. Incubation 10 minutes à Ih45, 6. Elimination du surnageant ; 7. Lavage de la surface avec 100 μl d'un tampon de lavage spécifique ; 8. Elimination du surnageant ; 9. Ajout de la matrice (CHCA ou SPA) ; 10. Séchage.
Les puces à protéines sont insérées dans le spectromètre de masse ou tout autre appareil de lecture ou de séquençage approprié. Les différentes conditions séparatives et de purification utilisées et leurs protocoles de préparation sont récapitulés dans le Tableau 2 ci-dessus.
Lors d'une autre étude en approche ciblée (de type phosphorylation ou utilisant un anticorps) (étude E2), les inventeurs ont préparé des puces à protéines avec des échantillons biologiques natifs non fractionnés ou fractionnés, selon le mode opératoire suivant :
1. Insertion des barrettes dans les bioprocesseurs ; 2. Hydratation ou pré rinçage des spots avec 20 μl du tampon d'hydratation spécifique, 2 fois 5 minutes ; 3. Association des molécules de capture ; 4. Elimination du surnageant et Ajout de 100 μl d'un tampon d'incubation, 3 fois 5 minutes ; 5. ajout de 1 μl de sérum sur chaque spot ; 6. Incubation 30 minutes ; 7. Elimination du surnageant ; 8. Lavage de la surface avec 3 fois 100 μl, 5 minutes, d'un tampon de lavage spécifique ; 9. Elimina- tion du surnageant et lavage final avec 100 μl d'eau pure ; 10. Ajout de la matrice (CHCA ou SPA diluée au 1/10); 11. Séchage.
Les puces à protéines sont insérées dans le spectromètre de masse pour lecture selon les différentes intensités décrites plus haut et à la Fig. 3, ou dans tout autre appareil de lecture approprié, optimisé et réglé en conséquence. L'homme du métier choisira l'intensité du laser pour permettre de faire voler les protéines, en fonction de leur masse, de certaines de leurs propriétés physico-chimiques, et d'éven¬ tuelles interactions qu'elles établissent avec des partenaires. Les anticorps utilisés ont été décrits plus haut.
Les calibrants utilisés sur puce Phase Normale/Oxyde de silicium et en mode Maldi correspondent à ceux décrits dans le Tableau 3.
Lors de ces différentes études, la séparation avec fractionnement a été réalisée, générant les quatre fractions suivantes : Fraction A : poids moléculaire < 10 kDa Fraction B : 10 kDa < poids moléculaire < 50 kDa Fraction C : 50 kDa < poids moléculaire < 100 IcDa Fraction D : poids moléculaire > 100 kDa
Le fractionnement en fonction de la masse à pour but d'augmenter la concentration relative de protéines d'une fraction par rapport à la concentration en protéines totales, sans pour autant modifier la concentration absolue des protéines séparées. Dans la fraction C, l'albumine est normalement retrouvée comme élément majoritaire, et peut être, le cas échéant, spécifiquement supprimée. Cette suppression n'a pas été effectuée dans les expériences décrites ici ; la suppression de l'albumine permettra de détecter un pic supplémentaire, correspondant à l'α-fétoprotéine, qui est pour l'instant masquée par le pic d'albumine. Ces fractions ont été obtenues en utilisant des séparateurs de type
Vivaspin 500 de la société Vivascience, avec 3 seuils de coupure distincts : 10, 50 et 100 kDa. La séparation par filtration sur membrane a lieu en PBS IX, pH 7,4, en conditions non dénaturantes. Tout ce qui passe au travers de la membrane est de plus petite masse que le seuil de coupure, tout ce qui reste dans le volume mort au-dessus de la membrane est de masse supérieure au seuil de coupure. Les protéines restant dans la partie supérieure du Vivaspin 500 avec un seuil de coupure de 100 kDa ont donc une masse native > à 100 kDa. Cela s'entend également pour les complexes multimériques hétérogènes aussi bien que homogènes. C - 3 Instrumentation (Exemple: Etude E6 - Purification anionique) Paramètres d'acquisition
Système d'acquisition : Proteinchip Biomarker System Type ILc
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Rapport de Normalisation des Spectres
Le procédé de normalisation "Total Ion Currenf (TIC) permet pour chaque spectre de faire la moyenne des intensités, et ajuste les intensités moyennes de chaque spectre de sorte que les données soient normalisées.
Les paramètres de normalisation utilisés correspondaient à une normalisation "Total Ion Current" commençant à 3000, et se terminant à 20000, avec soustraction de la ligne de base, un coefficient de normalisation de 0.2691 12, et sans normalisation par rapport à la masse.
Figure imgf000036_0001
Rapport de Calibration
La calibration est faite en fonction de la gamme de masses observée. Dans la zone 3 à 20 kDa, trois calibrations sont utilisées, selon que le calibrant est : Insuline bovine Cytochrome C, bovin β-Lactoglobuline-A, bovine
Par exemple entre 2.9 et 5.8 kDa, la calibration est faite sur les pics d'insuline (bovine) (5733.58+1H), et d'insuline bovine 2H+ (2866.79+1H).
Equation de calibration
L'équation de calibration utilisée est quadratique : m/ z
= a{t-to} + b
U où m/z est le rapport masse sur charge, U le voltage de la source et t le temps de vol.
Paramètres d'acquisition (Exemple : Cas de l'insuline)
Deux conditions d'enregistrement des spectres, pour deux concen¬ trations en insuline bovine, ont été utilisées.
Figure imgf000037_0001
Résultats de l 'acquisition après calibration (Cas de l 'insuline)
Figure imgf000037_0002
Après calibration, l'écart par rapport théorique est égal à 0.00 Dalton (J. e., précision supérieure à deux ordres de grandeur). Rapport de clusterisation Définition
Afin de comparer le niveau d'expression d'une protéine selon les échantillons, la clusterisation consiste à regrouper la valeur de l'intensité des pics correspondants à cette protéine pour l'ensemble des spectres enregistrés. Un cluster se définit donc comme un tableau retournant la valeur de l'intensité du pic considéré pour chaque spectre étudié. Clusterisation
Trois groupes sont clusterisés simultanément pour pouvoir faire un comparatif ultérieur : Contrôles (Control), DS (Down Syndrome) et ES (Edward Syndrome).
Les annotations ont été réalisées selon deux modes complémen¬ taires, l'un manuel, par les expérimentateurs, l'autre automatique. Mode de clusterisation manuel
Les pics sont manuellement annotés.
Les clusters sont ensuite complétés par recherche dans une fenêtre de ± 0,3% de la valeur M+H d'un signal tel que signal/bruit - 2, sinon, le bruit de fond local est utilisé. Mode de clusterisation automatique
La détection des pics obéit à 2 critères : o le rapport signal sur bruit doit être > 10 o le pic doit être présent dans 30 % des spectres.
Les clusters sont ensuite complétés par recherche dans une fenêtre de ± 0,3 % de la valeur M+H d'un signal tel que signal/bruit = 2, sinon, le bruit de fond local est utilisé. Conclusion sur la zone Spectrale visualisée dans l 'exemple choisi
Compte tenu de la qualité spectrale (bruit de fond, qualité du signal et du rapport signal/bruit) : - la zone de visualisation est comprise entre 3 000 Da et 20 000 Da
- la zone d'analyse est comprise entre 4 000 Da et 20 000 Da
La calibration est faite sur les pics d'Insuline (bovine)
(5733.58+1H), et d'insuline bovine 2H+ (2866.79+1H). L'objectif est d'optimiser la zone de calibration comprise entre 2800 et 5750 Da. Entre 6 et 12 kDa, le cytochrome C (bovin) est utilisé pour calibrer. Entre 9 et 19 kDa, la β-lactoglobuline A (bovin) est utilisée pour calibrer.
Le choix du calibrant n'influence en aucune façon les valeurs des intensités. Leurs valeurs ne varient pas en fonction de la calibration utilisée. La calibration permet d'accroître la précision des valeurs des masses des pics enregistrés, sur une zone spectrale restreinte. Outre les calibrants mentionnés plus haut, d'autres calibrants peuvent être utilisés. Le Tableau 12 ci-après présente une liste de calibrants qui peuvent être utilisés, ainsi que leur poids moléculaire.
Figure imgf000039_0001
* : indication de poids moléculaire différente suivant les fournisseurs. D - RESULTATS DE LA PREMIERE SERIE D'ETUDES D - I Synthèse des Résultats Analytiques obtenus
Résultats Analytiques = Résolution Spectrale en Masse et en Inten¬ sité Les inventeurs ont identifié des clusters d'intérêt (référencés dans les
Tableaux 13 et 14) dans les données issues des spectres obtenus (un spectre par échantillon des populations des trois groupes Contrôle, DS (T21) et ES (Tl 8), hors groupe -80°C, sauf cas particulier des échantillons A7 et Al 5, enregistrés en triplicate lors de l'étude E6). Le nombre de clusters annotés manuellement est réduit selon le critère "présent dans au moins 30 % de la population spectrale".
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
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Figure imgf000043_0001
Légende du Tableau 14 :
+* : Critère de sélection des clusters moins stringent appliqué à la phase séparative par interactions hydrophobiques : -> [% présent Groupe Contrôle] + [% présent Groupe T21] >= 30
++ : Cluster présentant un signal sur des échantillons stockés à - 8O0C, 10 fois plus important qu'avec des échantillons stockés à -200C.
# : Clusters présentés ultérieurement à titre d'exemple
: pas d'observation
Les clusters définis au Tableau 14 correspondent aux marqueurs de la liste (i) ci-dessus. D - 2 Qualité des données et observations
Plusieurs critères qualitatifs permettent de juger de la qualité des données. On peut citer, à titre d'exemples, la reproductibilité des spectres obtenus pour un même échantillon, les écarts de temps de vol (proportionnels à la masse des protéines analysées) observés pour un même cluster, les paramètres de normalisation des spectres, ou encore la valeur du rapport signal sur bruit, les coefficients de variation souvent très inférieurs à 10% etc... Le Tableau 15 montre un exemple de bonne reproductibilité de la valeur du TOF (donc de la masse réelle observée) et de la qualité du rapport signal sur bruit sur les Etudes El à E6.
Le Tableau 16, présenté également à titre d'exemple, indique pour quelques clusters observés lors des expériences de l'étude E6, le temps de vol (TOF), la valeur p du cluster et pour chaque groupe (Contrôle, T21, Tl 8), les intensités moyenne, minimale et maximale ainsi que la déviation standard sur l'intensité.
JS
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
D - 3 Spectres et Figures
Profils obtenus par séparation et purification de type anionique QlO - étude E6:
La figure 5 montre les spectres obtenus sur la zone spectrale 3000- 20000 Daltons, en vues globales, pour le groupe contrôle, le groupe T21 et le groupe Tl 8. Les spectres normalisés y sont superposés par catégorie clinique.
Les figures 6, 7 et 8 montrent, respectivement, les vues spectrales (spectres normalisés et superposés par catégorie clinique), les vues en pseudo-gels, et les spectres en vues décalées (étude E6), centrés sur la zone 4000 Da.
Les figures 9, 10 et 11 montrent, respectivement, les vues spectrales (spectres normalisés et superposés par catégorie clinique), les vues en pseudo-gels, et les spectres en vues décalées (étude E6), centrés sur la zone 5000-6000 Da. Profils obtenus par séparation de type anionique QlO : El à E5
Ces profils sont montrés sur les figures 12 à 18, pour les deux caté¬ gories cliniques (contrôles et T21). Les figures 12 à 14 montrent les spectres centrés sur la zone spectrale 3000-10000 Daltons, respectivement en vues globales (spectres normalisés et superposés par catégorie clinique), vue pseudo-gel, et vues décalées (El à E5). La figure 15 montre les spectres centrés sur la zone spectrale 3000-4000 Daltons (El à E5). Les figures 16 à 18 montrent les spectres, normalisés et superposés par catégorie clinique, centrés respectivement sur les zones 4000-5000 Daltons, 5000-7000 Daltons, et 7000-10000 Daltons (études El à E5). Profils obtenus par séparation selon l'hydrophobicité des protéines H50 (étude E6)
Ces profils sont présentés dans les figures 19 à 26.
D - 4 Exemples de statistiques de distribution des intensités dans les groupes Les figures 27 à 30 montrent des exemples de statistiques de distri¬ butions des intensités de différents clusters, pour les groupes contrôle et T21. D - 5 Exemples de Courbes ROC construites à partir des Aires sous la courbe des Intensités brutes
Les aires sous la courbe ROC (Receiver Operating Characteristic) des pics d'intérêts, calculées à partir des intensités brutes, sont plus grandes que 0,50, et peuvent atteindre 0,95. La figure 31 montre les courbes ROC pour les marqueurs de poids moléculaires 3371, 3442, 3486, et 6423 Da. D - 6 Exemple de Classification Hiérarchique sur Dataset E6 et Anionique
La figure 32 montre le résultat d'une construction avec les logiciels Genecluster Version 1999 (Eisen M.) et Treeview Version 1.60 (Eisen M.) (Classifi¬ cation hiérarchique sur Jeu de Données de l'étude E6 (IC 95%), Surface Anionique QlO).
Méthode de construction : Ajustement des données par transforma¬ tion logarithmique puis normalisation dans l'ordre, selon les spectres puis les clusters. Puis clusterisation hiérarchique simultanément sur les clusters et les spectres par corrélation de Spearman.
Résultats : Excellente discrimination des Groupes contrôle ("bleu") , T21 ("rouge"), Délétion 7q (Série C), Tl 8 (série E), Série T21 -80°C ("noire"), Série Contrôle -80°C ("verte"). D - 7 Exemple d'Analyse en Composante Principale sur Datasets des études E2 à E5 et Anionique
Les logiciels utilisés sont le logiciel Stata SE 8 et le logiciel Ciphergen Express Version 1.0. Les deux logiciels confirment les résultats.
Les valeurs propres (ou Valeurs de Eigen) confirment la présence et le poids moléculaire des pics identifiés comme étant des défensines dont les masses sont : PM3371, PM3442 et PM3486.
Les résultats sont montrés sur la figure 33. D - 8 Résultats cliniques et applications pour le dépistage
Les résultats obtenus pour les pics dans la zone 3000 Daltons, sur surface anionique QlO, sont présentés dans le Tableau 17. Ces trois pics sont sous- exprimés ou absents dans le groupe T21, traduisant une baisse importante de l'immunité, et exprimés normalement ou sur-exprimés dans le groupe contrôle. Une étude plus approfondie des résultats permettra de déterminer le seuil de détection pour ces trois pics, qui sont corrélés et dépendants, tel qu'au moins un signe négatif parmi les trois ou un signe positif parmi les trois signe la maladie ou l'absence de maladie, respectivement. Les résultats présentés dans le Tableau 17 présentent une variabilité pour ces trois pics, principalement liée au fait qu'ils ont été obtenus avec des échan¬ tillons conservés à -2O0C, présentant une certaine dégradation.
Le Tableau 18 ci-après présente les résultats et applications pour les pics dans la zone 4000 - 9000 Daltons, sur surface anionique QlO. Le Tableau 19 montre les résultats et applications pour les pics dans la zone 4000 -17500 Daltons, sur surface hydrophobe H50.
Figure imgf000050_0001
O
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Oi
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000054_0001
# : Critères sélectifs obtenus après normalisation des clusters par rapport à l'intensité du cluster PM6620
* : Echantillons utilisés exclusivement pour tester les critères de sélection
D - 9 Purification et Identification : quelques exemples
Purification
Parmi diverses combinaisons testées, surfaces de séparation et de purification, conditions de purification etc., on peut citer les suivantes :
Un
Figure imgf000056_0001
Signal fortement perturbé par la présence massive d'albumine. Expériences après déplétion de l'albumine en cours.
Identification Clusters PM3371, PM3442 et PM3486
Considérations sur la masse native
Ces trois peptides ont des propriétés biophysicochimiques corrélées.
Ils sont présents dans une fraction native des échantillons telle que la masse des produits soit comprise entre 50 et 100 kDa ou supérieure à 100 kDa. Il s'agit donc de peptides associés à une ou plusieurs protéines, tel que la masse des complexes ainsi constitués soit supérieure à 50 kDa. Une approche ciblée a permis d'identifier une association possible des HNPs à : l'albumine, l'α-foetoprotéine, et/ou des immuno- globulines G. Considérations sur la phosphorylation
Ces peptides se retrouvent dans une approche ciblée utilisant le gallium comme molécule d'affinité. L'affinité des acides aminés phosphorylés pour le gallium (Posewitz MC, Tempst P., Immobilized gallium(III) affinity chromatography of phosphopeptides. Anal Chem. 1999 JuI 15; 71(14):2883-92.) étant reconnu, il est donc possible d'émettre l'hypothèse que soit ces peptides, soit l'une des molécules qui leur sont associées, possèdent un ou plusieurs acides aminés phosphorylés.
Considérations sur les écarts de masses et possible identification
II s'agit de considérations sur l'écart de masse entre deux des trois peptides. PM3442 - PM3371 = 71 Da → alanine (A)
PM3486 - PM3371 = 115 Da → acide aspartique (D)
PM3486 - PM3442 - 44 Da -→ remplacement d'un acide aspartique (D) par une alanine (A).
Issues des banques de données, seules les séquences des défensines neutrophiles humaines {Human Neutrophil Defensins, ou HNPs) correspondent aux critères énoncés (voir Tableau 21).
Figure imgf000058_0001
Identification des clusters PM6423, PM6439, PM662Q et PM6636 : Considérations sur la masse native
Ces quatre peptides ont des propriétés biophysicochimiques corrélées. Ils sont présents dans une fraction native des échantillons telle que la masse des produits soit comprise entre 50 et 100 kDa ainsi que dans une fraction de masse native supérieure à 100 IcDa. Il s'agit donc de peptides associés à plusieurs protéines distinctes, tels que la masse des complexes ainsi constitués soit comprise entre 50 et 100 kDa, ou supérieure à 100 kDa. Considérations sur les écarts de masses et possible identification
II s'agit de considération sur l'écart de masse entre deux des quatre peptides.
PM6636 - PM6620 = 16 Da Possible hydrolyse d'une proline en hydroxyproline
PM6636 - PM6439 = 197 Da +/- IDa valine + proline (196 Da) ou Proline + Thréonine (198 Da) PM6636 - PM6423 = 181 Da +/- IDa → Pas de combinaison d'acides aminés PM6620 - PM6439 = 181 Da +/- IDa → Pas de combinaison d'acides aminés PM6620 - PM6423 = 197 Da +/- IDa — > valine + proline (196 Da) ou proline + thréonine (198 Da) PM6439 - PM6423 = 16 Da Possible hydrolyse d'une proline en hydroxyproline
Ces considérations sont résumées dans la figure 34. E - CONCLUSIONS SUR LA PREMIERE SERIE DΕTUDES
Les résultats relatifs à 19 marqueurs discriminants des populations Contrôle et T21 sont présentés ci-dessus. L'ensemble des marqueurs présentés au Tableau 14 peuvent être inclus dans des combinaisons, entre eux, ou en combinaison avec le triple test ou bien avec un ou deux marqueurs du triple test. Ces marqueurs, sur-exprimés ou sous-exprimés, dans le groupe contrôle ou dans le groupe malade, présentent tous un intérêt diagnostic.
En particulier, les pics de masse PM 3371, PM3442, PM 3486, identifiés comme des défensines, sont sous-exprimés dans les groupe T21 et sur- exprimés ou normalement exprimés chez les contrôles.
Les pics de masse PM 6423, PM 6439, PM6620, PM6636, sont identifiables deux à deux à une hydrolyse d'une proline en hydroxyproline (+16 Da).
F - ETUDES COMPLEMENTAIRES SUR L'UTILISATION DES DEFENSINES COMME MARQUEURS DE DIAGNOSTIC Des études complémentaires visant à confirmer la pertinence des défensines HNP-2, HNP-I et HNP-3 comme marqueurs de diagnostic prénatal du syndrome de Down ont été réalisées. Différentes conditions expérimentales ont été utilisées. En particulier, les inventeurs ont fait varier le pH de travail et testé différentes conditions de fractionnement (fraction C ou échantillon sérum natif). Ces études ont montré que bien que les défensines soient théorique¬ ment visualisables à pH=7,4, elles ne sont en réalité détectables qu'à un pH inférieur à 5. Ceci est probablement dû au fait qu'au moins une partie de ces défensines est complexée à l'alpha-fœtoprotéine et/ou à l'albumine.
Par ailleurs, les inventeurs ont calculé les ratios longitudinaux {le., entre 2 pics d'un même spectre) entre les intensités des pics correspondants aux diffé¬ rentes HNPs. De façon remarquable, ils ont observé, uniquement en condition de sérum natif, une différence significative de ces ratios, suivant qu'il s'agit d'un échan¬ tillon d'une femme porteuse d'un fœtus atteint de trisomie 21 ou d'une femme porteuse d'un fœtus sain. Les résultats de trois de ces études sont présentés ci-après, ainsi qu'aux figures 35 à 38. Les études dont les résultats sont présentés en détail ont été réalisées à partir de trois ensembles de données (datasets). Elles sont identifiées comme suit :
• NS 502 : purification anionique QlO/Sérum natif/pH=4/- 80°C, à partir des échantillons listés dans le Tableau 22 ci- après,
• NS503 : idem que NS503, mais pH=5, et
• NS403CDsf : purification anionique QlO/Fraction C du sérum /pH=4, à partir des échantillons listés dans le Tableau 23 ci-après
o
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000062_0001
BP= bien portant
Les résultats de ces études sont présentés dans les Tableaux 24 à 29 ci-après, dans lesquels les abréviations et/ou anglicismes suivants sont utilisés : IC ou CI = intervalle de confiance ; Dataset = jeu de données ; Obs. = nombre d'échantillons observés ; GC ou CG = groupe contrôle ; SD ou DS ou S. Down = syndrome de Down ; Err. Std. = erreur standard ; SN = signal sur bruit ; Moy. = moyenne ; AUC = Area under curve, ou aire sous la courbe ; var AUC = variance des AUC ; pAUC (8%) = Partial Area Under Curve, on a imposé un taux de faux positifs (FP) de 8% au Dataset.
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000066_0001
CΛ σ*
Figure imgf000067_0001
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000069_0001
Tableau 29 : TEST DE SCREENING UNIVARIES SUR DONNES BINORMALES AVEC HNP ou RATIOS
(Datasets NS503 / NS502 / NS403CDsf) avec variable SN
Résultat
Critère de Jugement Principal Signal sur Druit (SN) Diagnostique ou Intensité (SN)
Sur Effectif Total
Dataset NS502 (n=30) HNP Ratios
N° de Clusterdu Dataset Cluster 3 Cluster 4 Cluster 5 (Ratio Longitudinal HNPx /HNPy)
95% IC Exact HNP2 HNP1 HNP3 Ratio12 Ratio13 Ratio23
Sensibilité Se 0.73 0.79 0.84 0.88 0.92 0.96
Spécificité Sp 0.73 0.90 0.62 0.70 0.58 0.51
Positive Prédictive Value PPV 0.77 0.75 0.87 0.85 0.92 0.96
Négative Prédictive Value NPV 0.75 0.77 0.85 0.86 0.92 0.95
95% Simel Cl's
Likehood ratio (+) LR+ 2.15 1.95 4.11 3.14 6.2 10.5
Likehood ratio (-) LR- 1.95 2.15 1.23 1.36 0.92 0.73
Note: Pour cette étude cas-contrôle sur effectif total, nous avons supprimé du dataset analysé les échantillons
MB M9 M16. Les effectifs sont donc de 15 CTRL et 15 S. Down
Sur Effectif Commun avec
NS526
Dataset NS502 (n=22) HNP Ratios
N" de Cluster du dataset Cluster 3 Cluster 4 Cluster 5 ( Ratio Longitudinal HNPx / HNPy)
95% Exact Cl (UP) HNP2 HNP1 HNP3 Ratio 12 Ratio 13 Ratio 23
Sensibilité Se 0.73 0.84 0.88 0.84 0.92 0.96
Spécificité Sp 0.69 0.74 0.64 0.67 0.56 0.50
Positive Prédictive Value PPV 0.73 0.74 0.82 0.8 0.89 0.93
Négative Prédictive Value NPV 0.78 0.84 0.89 0.85 0.93 0.96
95% Simel Cl's
Likehood ratio (+) LR+ 2.22 2.23 3.39 2.94 5.53 8.31
Likehood ratio (-) LR- 1.8 1.73 1.22 1.42 0.92 0.74
Les Effectifs sont de 11 CTRL et 11 S. Down Les figures 35 à 38 présentent les résultats de l'étude statistique NS502, réalisée sur échantillons natifs, conservés à -8O0C, en séparation anionique sur surface QlO, en condition de pH=4 (conditions optimales pour obtenir des ratios longitudinaux indicatifs). Dans les conditions de l'étude NS502, les ratios des intensités des pics HNP-l/HNP-3, et HNP-2/HNP-3 sont des marqueurs particulièrement discrimi¬ nants pour détecter les femmes enceintes susceptibles de porter un fœtus atteint du syndrome de Down. Ceci présente l'avantage considérable de pouvoir obtenir une excellente reproductibilité des résultats, en s 'affranchissant d'éventuels problèmes de calibration et en s' affranchissant d'éventuels problèmes de variabilité du signal, défini tant en masse qu'en intensité ou signal sur bruit ou toute autre variable (par exemple : aire du tof ou Tofarea, Vi hauteur du tof ou tofwidth, avec le tof étant représentatif de la masse de la substance). Les inventeurs ont par ailleurs constaté que les niveaux d'expression des défensines HNP2, HNPl et HNP3, ainsi que les ratios entre ces différents niveaux, ne sont corrélés ni avec l'âge de la femme enceinte, ni avec la semaine de grossesse, ni avec aucun des marqueurs utilisés actuellement (AFP, uE3 et HCG notamment), ni avec aucun des autres marqueurs identifiés dans les études rapportées ici (purification QlO ou H50).
G - ETUDES COMPLEMENTAIRES UTILISANT DES SURFACES ANIONIQUES POUR L'IONISATION DES PROTEINES
L'étude statistique NS502 a également permis d'identifier d'autres pics pertinents en terme de diagnostic du syndrome de Down. Ces pics sont listés dans le tableau 30 ci-après.
Figure imgf000071_0001
Parmi ces pics (ou clusters), les pics à 4859.10 Da et à 8195.65 Da correspondent respectivement aux pics à 4860 Da et 8206 Da identifiés dans les études préliminaires (voir Tableau 14 ci-dessus).
Les pics mentionnés dans le Tableau 30 ont également été validés par analyse visuelle des spectres. Les spectres montrant les pics à 8195.7Da et à
8905.9Da, surexprimés en cas de trisomie 21, sont présentés aux figures 39 et 40, respectivement. Les courbes ROC associées à tous les pics mentionnés au Tableau 30 font l'objet de la figure 41.
H - ETUDES COMPLEMENTAIRES UTILISANT DES SURFACES HYDROPHOBES POUR L'IONISATION DES PROTEINES H-I. Etudes complémentaires sur surface H50
Plusieurs études complémentaires ont été réalisées en purifiant les échantillons sur surface hydrophobe H50. Les résultats de deux de ces études sont présentés ici. Les échantillons à partir desquels ces études ont été réalisées sont listés dans le Tableau 31 ci-après, et les pics pertinents identifiés sont résumés dans le
Tableau 32.
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Parmi ces pics (ou clusters), les pics à environ 4068.5 Da, 4320.79 Da, 4619.80 Da, 8107 Da, 8269.10 Da et 8610.30 Da correspondent respectivement aux pics à 4067 Da, 4317 Da, 6423 Da, 8112 Da, 8263 Da, et 8627 Da identifiés dans les études préliminaires (voir Tableau 14 ci-dessus), et le doublet à 4642.66 Da et 4658.47 Da correspond au pic à 4650 Da identifié initialement.
Les données statistiques relatives à ces pics et à leur utilisation comme marqueurs potentiels pour le diagnostic prénatal du syndrome de Down sont présentées dans les Tableaux 33 à 36 ci-après.
Les valeurs diagnostiques concernant ces marqueurs sont indiquées
10 dans les Tableaux 37 et 38, dans lesquels sont utilisées les abréviations suivantes : PPV = Positive Prédictive Value ; NPV = Négative Prédictive Value; LR+ = Likehood ratio(+); LR- = Likehood ratio (-).
Figure imgf000074_0001
NB : Les pics 36, 37 et 38 de l'étude NS526c représentent des protéines multichargées correspondant aux protéines révélées par les pics 8, 9 et 11 de cette même étude. De même, les pics 59, 60 et 61 de l'étude NS526d correspondent aux pics 20, 21 et 24.
-P-
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
ON
Figure imgf000077_0001
Dans ce Tableau 36 figurent des pics pour lesquels l'AUC est supérieure à 0,6, ce qui indique une surexpression significative, mais également des pics pour lesquels l'AUC est inférieure à 0,4. Ceci correspond à une sous-expression, également discriminante. Dans ce dernier cas, les courbes ROC présentées aux figures 49 et 50 sont inversées (graphe de la sensibilité en fonction de la spécificité, au lieu de la sensibilité en fonction de 1 -spécificité), selon la pratique classique en la matière.
Figure imgf000079_0001
CO
Figure imgf000079_0002
Note: Pour cette étude cas-contrôle sur effectif total, les échantillons M8 M9 Ml 6 ont été supprimés du dataset analysé. Les effectifs sont donc 15 CTRL et 15 DS.
Les figures 43 à 48 montrent des spectres sur lesquels apparaissent certains des pics mentionnés ci-dessus dans les cas de purification sur H50. Les figures 49 et 50 présentent les données afférentes à chaque pic (de l'étude NS526c et de l'étude NS526d, respectivement), sous forme de courbes de distributions et de courbes ROC. Les figures 51 et 52 montrent les résultats pour ces nouveaux marqueurs, sous forme de boîtes à moustaches. Les points en-dehors des boîtes repré¬ sentent les points aberrants.
H-2. Etudes complémentaires sur surface C8-C18, en utilisant un spectromètre de masse à haute résolution
Les résultats obtenus dans les études NS526c et NS526d exposées ci-dessus ont également été confirmés par des études complémentaires réalisées en utilisant un spectromètre de masse de haute résolution. Ces expériences ont permis de confirmer que les marqueurs identifiés dans les études présentées dans la partie H-I ci-dessus sont pertinents, indépendamment de la technologie utilisée.
Les conditions d'obtention des spectres présentés à la figure 53 (étude NP0408-LEP) sont les suivantes :
- purification sur surface hydrophobe C8 ou C 18, en utilisant les kits MB-HIC référencés 223324 (C8) et 223325 (Cl 8) dans le catalogue Bruker. - Matrice : Matrice HCCA Bruker
- Spectromètre : Ultraflex Bruker
- Protocole expérimental et acquisitions : voir Tableau 39 ci- dessous.
Tableau 39 : Paramètres d'acquisition communs aux différents spectres C8 et C18
HighVoltageSupplies:lonSource1 = 25000
HighVoltageSupplies:lonSource2 = 23400
HighVoltageSupplies:Lens = 6000
HighVoltageSupplies:Reflector = 26300
HighVoltageSupplies:Reflector2 = 14000
HighVoltageSupplies:Polarity = 0
HighVoltageSupplies±inearDetector = 1693
HighVoltageSupplies:PieDelay = 0
DigitizerTimebase = 1
Digitizer:BandWidthLimit = 3
DigitizeπElectronicGainLevel = 2
MassRange:MassStart = 880
MassRange:MassEnd = 25118,9
MassRange:Mode = 1
MatrixSuppression:Mode = 2
MatrixSuppression:DeflectionConstant = 0.0554137
MatrixSuppression:CutOffMass = 900
MatrixSuppression:6ateStrength = 1
CID:Switch = 0
Calibration = V3.0CCalibrator 1 1 0 0 -2147483648 2147483647 VlOCHPCData Order O vCoeff V1.OVectorDouble 0 c2 0 cO 0 minMass 0 maxMass 0 bUse 0 endCHPCData
V3.0CTOFCalibrationConstants 26271 0.9999999999999999 420.24145676678 1315083.8221388 -0.019237097616266 2 V3.0CTOFCalibrationConstants 0 0 0 0 0 -1 '
II apparaît sur les spectres présentés à la figure 53 que les pics iden¬ tifiés avec le spectromètre à basse résolution sont identifiables également avec un spectromètre à haute résolution. Bien entendu, l'utilisation d'un spectromètre à plus haute résolution entraîne parfois la démultiplication de pics qui correspondaient à des pics confondus en basse résolution. Les correspondances établies entre les pics obser¬ vés en basse résolution et ceux observés en haute résolution sont détaillées dans les Tableaux 40 et 41 ci-dessous.
Figure imgf000082_0001
Notations communes aux Tableaux 40 et 41 : N = Natif ; X = Condition de sélection ; ~ = intensités égales ; - = pic absent des spectres ; D = fraction D = Protéines ou complexes protéiques de masses natives supérieures à 100 kDa ; D(P+A) = Fraction D, 5 protéines associées à l'albumine ; D(P-A) = Fraction D, déplétée en protéines.
Figure imgf000083_0001
I - EXEMPLES DE COMBINAISONS DE MARQUEURS
A titre illustratif, le Tableau 42 présente les performances (sensibi¬ lité, spécificité etc.) d'une association de deux ratios entre les défensines HNP, et d'une association de ces mêmes ratios avec l'hcg, sur le jeu de données NS502. Bien entendu, d'autres associations, potentiellement encore plus spécifiques et sensibles, peuvent être réalisées entre les différents marqueurs identifiés par les inventeurs.
Figure imgf000084_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de dépistage prénatal in vitro d'anomalies chromo¬ somiques, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection, dans un échantillon biologique provenant d'une femme enceinte, d'au moins un premier marqueur choisi parmi : (i) les défensines neutrophiles humaines HNP-2, HNP-I et HNP-3, et/ou (ii) les espèces moléculaires détectables en spectrométrie de masse avec une séparation de type échangeuse d'anions, aux poids moléculaires suivants : 4461.60 Da ; 4570.90 Da ; 4630.70 Da ; 4714.30 Da ; 4859.10 Da ; 8195.65 Da ; 8905.85 Da ; 9121.00 Da ; 9700.50 Da, et/ou (iii) les espèces moléculaires détectables en spectrométrie de masse avec une séparation de type hydrophobe, aux poids moléculaires suivants : 2625.47 Da ; 4068.5 Da ; 4075.95 Da ; 4084.3 Da ; 4084.7 Da ; 4093.13 Da ; 4320.79 Da ; 4642.66 Da ; 4658.47 Da ; 6419.80 Da ; 8107 Da ; 8124.5 Da ; 8140.5 Da ; 8155 Da ; 8269.10 Da ; 8338.80 Da ; 8610.30 Da, ledit procédé comprenant également une étape de détection d'au moins un deuxième marqueur choisi parmi les groupes (i), (ii) ou (iii), ou parmi le groupe (iv) constitué par l'hormone gonadotrophine chorionique (hCG); la sous-unité β de ThCG; l'œstriol non conjugué (uE3); l'alpha-fœtoprotéine (AFP), l'inhibitine A; et la protéine plasmatique associée à la grossesse (PAPP-A).
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la détection, dans un échantillon biologique provenant d'une femme enceinte, d'au moins trois, de préférence au moins quatre marqueurs indépendants choisis parmi les groupes (i) à (iv).
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caracté¬ risé en ce qu'il comprend une étape de comparaison de la concentration de chacun des marqueurs détectés, à des valeurs de référence de la concentration de ces marqueurs chez des femmes enceintes portant des fœtus normaux, et chez des femmes enceintes portant des foetus atteints d'une anomalie chromosomique et/ou génétique connue.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caracté¬ risé en ce qu'il comprend une étape d'analyse d'au moins un spectre obtenu à partir d'un échantillon biologique provenant d'une femme enceinte, et en ce que l'on mesure le signal d'au moins 2 pics choisis parmi (i) les pics correspondant aux défensines neutrophiles humaines HNP -2, HNP-I et HNP-3, et/ou (ii) les pics observables en spectrométrie de masse avec une séparation de type anionique, aux poids moléculaires suivants : 4461.60 Da ; 4570.90 Da ; 4630.70 Da ; 4714.30 Da ; 4859.10 Da ; 8195.65 Da ; 8905.85 Da ; 9121.00 Da ; 9700.50 Da, et/ou (iii) les pics observables en spectrométrie de masse avec une séparation de type hydrophobe, aux poids moléculaires suivants : 2625.47 Da ; 4068.5 Da ; 4075.95 Da ; 4084.3 Da ; 4084.7 Da ; 4093.13 Da ; 4320.79 Da ; 4642.66 Da ; 4658.47 Da ; 6419.80 Da ; 8107 Da ; 8124.5 Da ; 8140.5 Da ; 8155 Da ; 8269.10 Da ; 8338.80 Da ; et 8610.30 Da.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caracté¬ risé en ce que l'on mesure le ratio entre les concentrations de HNP-3 et de HNP-I et/ou HNP-2 dans l'échantillon.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier marqueur détecté est la somme des défensines HNP -2, HNP-I et HNP-3.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les défensines sont détectées par une technique immunologique.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le niveau d'expression des défensines dans l'échantillon est mesuré par amplification semi-quantitative ou quantitative d'acide nucléique.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les anomalies chromosomiques dépistées sont sélectionnées dans le groupe constitué par le syndrome de Down (trisomie 21), le syndrome d'Edwards (trisomie 18), le syndrome de Patau (trisomie 13), le syndrome de Turner, le syndrome de Klinefelter, le syndrome de PX fragile, et le syndrome penta X.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'une anomalie chromosomique faisant l'objet du dépistage est le syndrome de Down.
11. Utilisation d'une ou plusieurs défensines neutrophiles humaines choisies parmi HND-I, HND-2 et HND-3, comme marqueur(s) pour le diagnostic prénatal d'une anomalie chromosomique.
12. Trousse de diagnostic prénatal d'anomalies chromosomiques, comprenant des moyens nécessaires à la mise en œuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
13. Trousse selon la revendication 12, comprenant des anticorps et/ou des aptamères spécifiques d'un ou plusieurs marqueurs sélectionnés parmi les marqueurs cités dans la revendication 1.
14. Trousse selon la revendication 12 ou la revendication 13, comprenant, pour au moins un des marqueurs cités dans la revendication 1, un jeu d'anticorps spécifiques non recouvrant.
15. Trousse selon la revendication 14, dans laquelle le jeu d'anticorps spécifiques non recouvrant comprend un anticorps de capture, immobilisé sur un support, et un anticorps de détection.
16. Trousse selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, comprenant des amorces pour l'amplification d'acides nucléiques codant pour les défensines HNP-I et/ou HNP-2 et/ou HNP-3.
17. Trousse selon la revendication 16, comprenant en outre au moins une sonde pour détecter le(s) produit(s) d'amplification d'acide nucléique.
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