WO2006025421A1 - 精子膜タンパク質obfの利用 - Google Patents

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    • Y10T436/145555—Hetero-N

Definitions

  • the present invention relates to a sperm membrane protein OBF (Oocyte binding / lusion factor) and a method for using an antibody against OBF.
  • OBF sperm membrane protein
  • sperm membrane protein OBF Oocyte binding / lusion factor
  • Non-Patent Document 1 Miyado, K. et al., Science (2000) 287, 321-324
  • Non-Patent Document 2 Capacitation related changes in antigen distribution on mouse sperm heads and its relation to fertilization rate in vitro. J. Reproductive Immunology, 11, 91-100 (1987)
  • Non-Patent Document 3 Effect of monoclonal anti-mouse sperm antibody (OBF13) on the inter action of mouse sperm with zona— free mouse and hamster eggs.
  • OPF13 monoclonal anti-mouse sperm antibody
  • Patent Document 4 An anti-mouse sperm monoclonal antibody (OBF13) and its inhibitory activity on fertilization. Japanese Journal of Infertility 33, 473-478 (1988)
  • Non-Patent Document 5 OBF13 J. Reproductive. Immunology. 16, 71-82 (1989)
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to clarify a fusion factor on the sperm side, to provide the factor, an antibody against the factor, and a method for using them. It is in. More specifically, an antibody against the factor, a contraceptive containing the antibody, a contraceptive vaccine using the factor, use of an OBF protein or a fragment thereof as a factor related to the binding or fusion of sperm and ovum, the factor An object of the present invention is to provide a non-human animal in which the function of a gene encoding the gene is suppressed, a method for screening a contraceptive using the factor, a method for testing infertility using the factor as an index, a test agent, and the like.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems.
  • a unique monoclonal antibody that specifically reacts only with sperm after the acrosome reaction was obtained, and the antigen (OBF) recognized by this antibody was identified.
  • OBF antigen
  • mouse sperm treated with the same antibody the ability to bind and transfect the ovum was normal, but the ability to fuse with the subsequent ovum was inhibited depending on the antibody treatment concentration.
  • OBF gene knockout mouse was prepared and analyzed. As a result, it was found that OBF gene knockout male mice are infertile, and sperm of OBF knockout mice can bind to mouse ova but have no fusion ability at all.
  • OBF knockout mice In experiments using hamster eggs that can be fused with various animal species, it was found that the sperm of OBF knockout mice binds to hamster eggs but cannot be fused at all. In addition, from experiments using human OBF polyclonal antibodies, it became clear that human sperm did not fuse or even bind to hamster naked eggs. From these results, it was found that OBF is an essential molecule for binding or fusion with eggs during fertilization across animal species. OB Fertility in mice lacking F could be restored by expressing OBF as a transgene. In other words, infertility with such causes may be treated with OBF genes or protein supplements. In addition, the protein referred to as OBF in the present specification is referred to as Izu mo in other literatures (for example, Nature 434, 234-238 (2005)).
  • the present invention provides the following [1] to [17].
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, or 6, No .:
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, or 6
  • a contraceptive vaccine containing the protein or fragment thereof according to [2] as an active ingredient containing the protein or fragment thereof according to [2] as an active ingredient.
  • a screening method for a contraceptive candidate compound comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for a contraceptive candidate compound comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for a contraceptive candidate compound comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for a contraceptive candidate compound comprising the following steps (a) to (d):
  • a method for screening a contraceptive candidate compound comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for a contraceptive candidate compound comprising the following steps (a) to (c):
  • [12] A non-human animal cell in which the function of the gene encoding the protein according to [2] is artificially suppressed.
  • a screening method for a candidate compound for a fertility drug comprising the following steps (a) to (c):
  • [14] A method for examining infertility, comprising a step of measuring the expression level of a gene encoding the protein according to [2].
  • [15] A method for examining infertility, comprising a step of detecting a mutation in a gene region encoding the protein according to [2].
  • test agent for use in the method according to [14], comprising an antibody having the protein or fragment thereof according to [2] as an antigen.
  • FIG. 1 Photographs of fluorescent immunostaining before and after acrosome reaction of sperm using OBF13 antibody. The top force is also in order: 1. Fresh sperm, 2. Freeze-thawed and increased membrane permeability, 3. Acrosome reaction under culture, 4. Acrosome reaction under culture.
  • FIG. 2 A photograph and a graph showing the results of a fertilization inhibition experiment using naked eggs incorporating hexist 33342.
  • FIG. 3A is a photograph showing a result of a wet stamp lot by two-dimensional electrophoresis of mouse sperm using an OBF13 monoclonal antibody.
  • FIG. 3B is a view showing the primary structure of the identified OBF13 antigen.
  • the underline indicates the signal sequence
  • the box indicates the immunoglobulin-like domain
  • the dotted line indicates the transmembrane region.
  • a disulfide bond is expected between the cysteine at residue 182 and the cysteine at residue 233.
  • FIG. 3C is a photograph showing the results of Western blotting of each tissue using a polyclonal antibody against mouse OBF.
  • FIG. 3D shows the primary structure of the OBF protein.
  • FIG. 4 (A) shows the structure of a targeting vector in which the 0BF gene is replaced with a neomycin resistance gene.
  • FIG. 5 is a graph of the average number of offspring of OBF knockout male and female mice.
  • B is a graph showing the results of in vitro fertilization (IVF) of OBF knockout sperm.
  • IVF in vitro fertilization
  • C is a graph showing the result of fusion analysis of OBF knockout sperm with ovum.
  • D Photographs showing the results of in vitro fertilization and fusion analysis using OBF knockout sperm and CD9 knockout ovum.
  • FIG. 6 A photograph showing the results of fusion analysis of mouse OBF ⁇ / ⁇ sperm and hamster naked eggs.
  • FIG. 7 is a photograph showing that fertilization ability is restored in a mouse in which the OBF gene cDNA sequence is incorporated into an OBF knockout mouse.
  • the present invention relates to an antibody having an activity that inhibits the binding or fusion between sperm and ovum, the antibody using as an antigen the sperm membrane protein OBF or a fragment thereof essential for the binding or fusion between sperm and ovum (Except OBF13 antibody).
  • the present invention also provides a contraceptive containing an antibody containing OBF or a fragment thereof as an antigen (including an OBF13 antibody) as an active ingredient, and a contraceptive vaccine containing OBF or a fragment thereof as an active ingredient.
  • the OBF antigen of the present invention includes a protein encoded by a DNA containing the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, and 5 or a fragment thereof, and any of SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 A protein or fragment thereof comprising the amino acid sequence described in any one of the above, an amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, and 6, wherein one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added.
  • protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 is a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 And a fusion protein comprising a protein consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, and 6.
  • amino acid sequence according to any one of the above “SEQ ID NOs: 2, 4, 6” includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added.
  • Protein includes a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and Z or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, or 6, and the protein Fusion proteins containing Substitutions, deletions, insertions, and Z or supplements occur in nature, and the number of substitutions, deletions, insertions, and Zs or additions is usually within 30 amino acids, preferably It is within 15 amino acids, more preferably within 5 amino acids (for example, within 3 amino acids), and even more preferably within 2 amino acids.
  • proteins and peptides to be fused with the protein of the present invention are not particularly limited as long as the fusion protein is a functionally equivalent protein of the protein of the present invention.
  • Other peptides that are subjected to fusion with the protein of the present invention include, for example, FLA G (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204- 1210), and 6 His (histidine) residues.
  • FLA G Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204- 1210
  • 6 His histidine residues.
  • Known peptides such as 6 X His and 10 X His can be used.
  • Examples of other proteins that are subjected to fusion with the protein of the present invention include GST (Dalthione S transferase).
  • “functionally equivalent” means the target protein strength.
  • Whether the target protein has the same properties as the protein having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 2, 4, or 6 is determined by, for example, obtaining an antibody against the target protein. Antibody binds or fuses sperm and egg Judgment can be made based on the ability to inhibit.
  • a protein functionally equivalent to the protein having the amino acid sequence ability described in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 is a protein functionally equivalent to the protein having the amino acid sequence ability described in any of SEQ ID NOs: 2, 4, and 6. It has the same or similar structural features as the protein. Structural features include, for example, a signal sequence, an extracellular region, a transmembrane region, and an intracellular region, a single Ig-like (Immunoglobulin-like) domain in the extracellular region, and The N-linked glycosylation sequence is present in the Ig-like domain.
  • Hybridization conditions for isolating DNA encoding a protein functionally equivalent to the OBF protein can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • conditions for high pre-dialysis include low stringency conditions.
  • the low stringent conditions are, for example, 42 ° C, 5 X SSC, 0.1% SDS, and preferably 50 ° C, 5 X SSC, 0.1% SDS in the post-hybridization washing. It is a condition.
  • More preferable hybridization conditions include highly stringent conditions.
  • High stringent conditions are, for example, conditions of 65 ° C, 0.1 X SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased.
  • multiple factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors that affect the stringency of a hybridization, and those skilled in the art can select a similar stringency by appropriately selecting these factors. It is possible to realize.
  • a protein functionally equivalent to the OBF protein encoded by the DNA isolated by the hybridization technique or gene amplification technique usually has a high homology in the amino acid sequence with the OBF protein.
  • High homology is usually at least 50% identity, preferably 75% identity, more preferably 85%, with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, or 6.
  • the above identity more preferably 95% identity or more.
  • the identity of amino acid sequences and base sequences is the same as that of Karlin and Altschul. It can be determined by the Gorythm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993). Based on this algorithm, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (Altschul et al. J. Mol.
  • antigen fragment of the present invention examples include, but are not limited to, an Ig-like domain (for example, amino acids 167 to 253 of mouse OBF).
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it can recognize the OBF protein and inhibit the binding or fusion between sperm and ovum, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • mouse antibodies, rat antibodies, rabbit antibodies, Hedge antibodies, camel antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and the like can be used as appropriate for the antibodies of the present invention.
  • a low molecular weight antibody etc. can also be used as an antibody of this invention.
  • Polyclonal antibodies and monoclonal antibodies can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared as follows using known techniques. That is, a desired antigen or a cell that expresses the desired antigen is used as a sensitizing antigen, and this is immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cell is combined with a known parent cell by a normal cell fusion method. It can be prepared by fusing and screening monoclonal antibody-producing cells (neubridoma) by conventional screening methods.
  • mammals such as mice, rats, rabbits, hidges, monkeys and the like can be used.
  • the antigen can be prepared according to a known method, for example, a method using baculovirus (W098 / 46777 etc.).
  • baculovirus W098 / 46777 etc.
  • a gp64 transgenic mouse can be used as an immune animal (Japanese Patent Application No. 2 002-180351, Japanese Patent Application 2002-164834).
  • Hypridoma can be produced, for example, according to the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
  • immunization may be performed by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin.
  • a recombinant antibody produced by using gene recombination techniques can be used, in which an antibody gene is cloned into a high-pridoma force, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and the like.
  • an antibody gene is cloned into a high-pridoma force, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and the like.
  • a recombinant antibody produced by using gene recombination techniques
  • an antibody gene is cloned into a high-pridoma force, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and the like.
  • V region variable region
  • DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing DNA of the antibody C region. It is incorporated into the expression vector so that it is expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express antibodies.
  • a genetically modified antibody such as a chimeric antibody or a humanized antibody, which has been artificially modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity to humans, etc.
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is an antibody comprising a heavy chain and a light chain variable region of a mouse antibody other than a human, for example, a mouse antibody heavy chain and a light chain constant region, and encodes a mouse antibody variable region. It can be obtained by ligating DNA with DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and a complementarity determining region (CDR) of a mammal other than a human, for example, a mouse antibody, is used as the complementarity determining region of a human antibody. It is transplanted and its general genetic recombination technique is also known. Specifically, the DNA sequence designed to link the CDR region of the mouse antibody and the framework region (FR) of the human antibody overlaps the terminal region. It synthesize
  • the obtained DNA is ligated with DNA encoding the constant region of a human antibody, and then incorporated into an expression vector and introduced into a host for production (European Patent Application Publication No. EP 239400, International Patent application publication number WO 96/02576).
  • the FRs of human antibodies ligated via CDR are selected such that the complementarity determining region forms a good antigen binding site. If necessary, the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, Ketal, Cancer Res. (1993) 53, 851—856).
  • human lymphocytes are sensitized with a desired antigen or cells expressing the desired antigen in vitro, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells such as U266, and the desired human antibody having activity to bind to the antigen.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • variable region of a human antibody can be expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector can be prepared from the sequence to obtain a human antibody.
  • an antibody gene is once isolated and introduced into an appropriate host to produce an antibody
  • a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • animal cells include (1) mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, (2) amphibian cells such as Xenopus oocytes, or (3 ) Insect cells such as sl9, sf21, and Tn5 are known.
  • Known plant cells include cells derived from the genus Nicotiana (eg, Nicotiana tabacum), which may be cultured in callus.
  • fungal cells examples include yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces ser evisiae, and filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger. ing.
  • yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces ser evisiae
  • filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger.
  • prokaryotic cells there are production systems that use bacterial cells.
  • bacteria cells Escherichia coli and Bacillus subtilis are known.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation and culturing the transformed cells in vitro.
  • the antibody may be a low molecular weight antibody as long as it binds to the OBF protein and inhibits the function of the OBF protein.
  • the low molecular weight antibody is not particularly limited as long as it includes an antibody fragment in which a part of a full-length antibody (such as whole IgG, for example) is deleted and has an ability to bind to an antigen.
  • the antibody fragment of the present invention is not particularly limited as long as it is a part of a full-length antibody, but preferably contains a heavy chain variable region (VH) or Z and a light chain variable region (VL).
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • the amino acid sequence of VH or VL may be substituted, deleted, added and Z or inserted.
  • variable region may be chimerized or humanized.
  • Specific examples of the antibody fragment include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, and Fv.
  • Specific examples of the low molecular weight antibody include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, scFv (single chain Fv), Diabody, sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2).
  • the "Fv” fragment is the smallest antibody fragment, and contains a complete antigen recognition site and a binding site.
  • An “Fv” fragment is a dimer (VH-VL dimer) in which one VH and VL are strongly linked by non-covalent bonds.
  • the three complementarity determining regions (CDRs) of each variable region interact to form an antigen-binding site on the surface of the VH-VL dimer.
  • Six CDRs confer antigen binding sites on the antibody.
  • one variable region or half of an Fv containing only three CDRs specific to the antigen
  • scFv contains the VH and VL of an antibody, and these regions are in a single polypeptide chain.
  • Fv further contains a peptide linker between VH and VL, which allows scFv to form the structure necessary for antigen binding (for a review of scFv, see Pluckthun The Pharmacology of Monoclonal Antibodies JVol.113 (see Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994)).
  • the linker in the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the expression of the antibody variable region linked to both ends of the linker! ,.
  • the DNA encoding scFv is a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody, and a DNA encoding the L chain or L chain V region.
  • a DNA portion encoding a desired amino acid sequence is made into a saddle shape, amplified by PCR using a primer pair that defines both ends, and then further DNA that encodes a peptide linker portion, and both ends are H chain, L It is obtained by combining and amplifying primer pairs that are defined so as to be linked to a strand.
  • an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method, and the host should be used.
  • scF V can be obtained according to a conventional method.
  • Diabody refers to a bivalent antibody fragment constructed by gene fusion (Holliger
  • a diabody is a dimer composed of two polypeptide chains, and each polypeptide chain is usually short enough to prevent VL and VH forces from binding to each other in the same chain, for example, a linker of about 5 residues. Are combined. Since VL and VH encoded on the same polypeptide chain cannot form a single-chain variable region fragment because the linker between them is short, Diabody forms two antigen-binding sites. Will have.
  • sc (Fv) 2 is a low molecular weight antibody in which two VHs and two VLs are combined with a linker etc. to form a single chain (Hudson et al, J Immunol. Methods 1999; 231: 177 -189).
  • sc (Fv) 2 can be prepared by linking scFv with a linker.
  • the order of the two VHs and the two VLs is not particularly limited and can be arranged in any order.
  • any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker see, for example, Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996) 1 can be used.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose. Usually, it is 1 to 100 amino acids, preferably 3 to 50 amino acids, more preferably 5 to 30 amino acids. Particularly preferred is 12 to 18 amino acids (for example, 15 amino acids). However, the length and sequence of the peptide linker can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • Synthetic chemical linkers are commonly used for cross-linking peptides such as N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bismuth. (Sulfosuccinimidyl) suberate (BS 3 ), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiopis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol Bis (succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (Sulfo-DST), bis [2- (succinimidoxycarboxyl) ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimidoc
  • a modified antibody an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used. It is also possible to bind a radioisotope, a chemotherapeutic agent, a cytotoxic substance such as a bacterial-derived toxin to the antibody. Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field!
  • the antibody used in the present invention may be a bispecific antibody.
  • a bispecific antibody may be a bispecific antibody having an antigen binding site that recognizes different epitopes on the OBF protein molecule, and one antigen binding site recognizes the OBF protein and the other antigen binding site.
  • the site may recognize cytotoxic substances such as radioactive substances, chemotherapeutic agents, and cell-derived toxins!
  • Bispecific antibodies bind HL pairs of two antibodies It is also possible to produce a bispecific antibody-producing fused cell by fusing a hybridoma that produces different monoclonal antibodies and hybridoma. Furthermore, bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • an antibody having a modified sugar chain it is also possible to use an antibody having a modified sugar chain.
  • Antibody sugar chain modification techniques are already known (for example, WO00 / 61739, WO02 / 31140, etc.). These antibodies are also included in the “antibody” in the present invention.
  • the antibody expressed and produced as described above can be purified by a known method used in normal protein purification.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining affinity columns such as protein A columns, chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (Ant3 ⁇ 4odies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cola Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • a known means can be used to measure the antigen binding activity of an antibody (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Old Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent immunoassay can be used.
  • Whether or not a specific molecule binds to an OBF protein can be measured by a known method.
  • Known methods include, for example, immunoprecipitation, West Western blotting, ELISA, EIA, RIA, fluorescence immunization, and a method using a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon.
  • the antibody of the present invention can be used as a contraceptive.
  • the subject to which the antibody is administered is not particularly limited, and examples thereof include humans, pets, livestock, outdoor animals, and birds.
  • the contraceptive of the present invention is capable of being administered either orally or parenterally, preferably parenterally, and specifically includes injection, nasal administration, pulmonary administration, trans Examples include a skin administration type and a vaginal administration type.
  • Examples of the injection form can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dosage can be selected, for example, within the range of O.OOOlmg to lOOOmg per kg body weight. Alternatively, for example, the dose may be in the range of 0.001 to 100,000 mg / body per patient. You can choose.
  • the antibody of the present invention when used as a contraceptive, it can be formulated by methods known to those skilled in the art.
  • a contraceptive containing the antibody of the present invention used for such a therapeutic purpose is formulated by mixing with a suitable pharmaceutically acceptable carrier, vehicle, etc. inert to them as necessary. be able to.
  • a suitable pharmaceutically acceptable carrier for example, sterilized water, physiological saline, stabilizers, excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), buffers (phosphoric acid, citrate, other organic acids, etc.), preservatives, surface active agents ( PEG, Tween, etc.), chelating agents (EDTA, etc.), binders and the like.
  • low molecular weight polypeptides proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin, amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine and lysine, saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides, mannitol, It may contain a sugar alcohol such as sorbitol.
  • a sugar alcohol such as sorbitol.
  • isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-manntol, and sodium chloride sodium salt.
  • a suitable solubilizer such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50) and the like.
  • the present invention provides a contraceptive vaccine containing an OBF antigen (OBF or a fragment thereof) as an active ingredient.
  • OBF antigen in the contraceptive vaccine of the present invention can be prepared not only as a natural protein but also as a recombinant protein using a known genetic recombination technique.
  • the OBF antigen in the contraceptive vaccine of the present invention can also be prepared in a state expressed in cells.
  • the biological species derived from the OBF antigen in the contraceptive vaccine of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the species to which the contraceptive vaccine is administered.
  • a natural protein can be prepared by a method using affinity chromatography using an antibody against OBF protein, for example, for an extract of tissues such as testis and sperm where OBF protein is expressed. It is.
  • a recombinant protein can be prepared by those skilled in the art, for example, as an OBF protein or a fragment thereof by a known method.
  • the OBF protein or a fragment thereof is obtained by incorporating DNA encoding the OBF protein into an appropriate expression vector. Transformants obtained by introducing these into appropriate host cells are recovered, and an extract is obtained. Then, chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, or an antibody against OBF protein is immobilized on the column. It can be purified and prepared by applying affinity chromatography or by combining several of these columns.
  • OBF protein when expressed as a fusion protein with glutathione S-transferase protein, or as OBF protein to which multiple histidines are added, it is expressed in a host cell (eg, animal cell or E. coli). Alternatively, the expressed OBF protein can be purified using a dartathione column or a nickel column. In order to prepare a fusion protein, for example, DNA encoding OBF protein and DNA encoding other protein or peptide are ligated in the same frame and introduced into the expression vector. It can be expressed.
  • Escherichia coli when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in Escherichia coli in order to amplify it in large quantities using Escherichia coli (for example, JM109, DH5a, HB101, XLlBlue) and the like. If you have an “ori” for selection and have a selection gene for transformed E. coli (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphe-chol)) There are no particular restrictions
  • vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • pGEM-T for the purpose of cDNA subcloning and excision, in addition to the above-mentioned vectors, for example, pGEM-T, pDIRECT, pT7 and the like can be mentioned.
  • An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing an OBF protein.
  • the host may be E. coli such as JM109, DH5 «, HB101, XLl-Blue.
  • a promoter that can be efficiently expressed in E. coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter ( Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), or having a T7 promoter or the like is essential.
  • the lacZ promoter Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427
  • araB promoter Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043
  • T7 promoter or the like is essential.
  • PGEX-5X-1 manufactured by Falumasia
  • QIAex press system
  • pEGFP or pET.
  • the vector also includes a signal sequence for protein secretion!
  • the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli.
  • Introduction of the vector into the host cell can be carried out using, for example, the calcium chloride method or the electrovolatility method.
  • vectors for producing OBF protein include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen)) and pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990).
  • mammalian-derived expression vectors for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen)
  • pEGF-BOS Nucleic Acids. Res. 1990.
  • insect cell-derived expression vector for example, “Bac-to- BAC baculovairus expression system” (manufactured by Gibco BRL), pBacP AK8), plant-derived expression vector (For example, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (for example, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (for example, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (for example, “Pichia Expression Kit” ( Invitrogen), pNVll, SP-Q01), Bacillus subtilis-derived expression vectors (eg, pPL608, pK 50) and the like.
  • insect cell-derived expression vector for example, “Bac-to- BAC baculovairus expression system” (manufactured by Gibco BRL), pBacP AK8), plant-derived expression vector (For example, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (for example, pH
  • promoters required for expression in cells such as SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277 108), MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc. are essential, and are selected for transformation into cells. It is more preferable to have a gene for this purpose (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.)). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • Examples of a system for producing a protein in vivo include a production system using animals and a production system using plants. DNA that encodes OBF protein is introduced into this animal or plant, and OBF protein is produced and collected in the body of the animal or plant.
  • mammals and insects there are production systems using mammals and insects.
  • a mammal Can be used for goats, pigs, hidges, mice, tusks (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
  • a transgenic animal can be used.
  • DNA encoding OBF protein is prepared as a fusion gene with a gene encoding a protein inherently produced in milk such as goat ⁇ -casein.
  • the DNA fragment containing this fusion gene is injected into a goat embryo and the embryo is transferred to a female goat.
  • An OBF protein can be obtained from milk produced by a transgene goat born or a descendant of a goat that has received the embryo. Hormones may be used in transgenes as appropriate to increase milk production, including the proteins produced by transgeneenca (Ebert, KM et al., Bio / Technology). (1994) 12, 699-702).
  • a silkworm can be used as an insect.
  • OBF proteins can be obtained from body fluids of silkworms by infecting silkworms with baculovirus inserted with DNA encoding OBF protein (Susumu, M. et al., Nature ( 1985) 315, 592-594).
  • tobacco when plants are used, for example, tobacco can be used.
  • DNA encoding OBF protein is introduced into a plant expression vector such as pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • the bacteria can be infected with tobacco, for example Nicotiana tabacum, and OBF protein can be obtained from the leaves of this tobacco (Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol (1994) 24, 131-138).
  • the OBF protein thus obtained can be isolated from the inside of the host cell or outside the cell (eg, a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous protein.
  • the separation and purification of the protein is not limited in any way as long as the separation and purification methods used in normal protein purification are used. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. When combined, proteins can be separated and purified.
  • an appropriate protein-modifying enzyme is used before or after purification of the OBF protein of the present invention. By allowing them to act, the peptide can be arbitrarily modified or the peptide can be partially removed.
  • the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, darcosidase and the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be added to the vaccine preparation of the present invention.
  • a pharmaceutically acceptable carrier means a pharmaceutically acceptable material that is different from an antigen (or immunogenicity) and can be administered together with an antigen in vaccine administration.
  • the power that can be exemplified by vaccine additives such as adjuvants, preservatives, and stabilizers is not limited thereto.
  • adjuvants aluminum phosphate, aluminum hydroxide, MF59, etc. can be used as adjuvants approved for human vaccines, but are not limited thereto.
  • the ability to use about 0.2% of gelatin dextran, 0.1-1.0% sodium glutamate, or about 5% lactose or about 2% sorbitol is limited to these. Is not to be done.
  • As preservatives, about 0.01% thimerosal, about 0.1% betapropionolaton, and about 0.5% phenoxyethanol can be used, but are not limited thereto.
  • a pH adjusting agent, a buffer, a stabilizer, a preservative and the like are added, and a subcutaneous, intramuscular and intravenous injection is prepared by a conventional method.
  • the injection may be a solid preparation or a preparation prepared at the time of use by lyophilization after storing the solution in a container.
  • One dose may be stored in a container, or a dose may be stored in the same container.
  • inoculation method of the vaccine of the present invention various known methods can be used.
  • examples of the inoculation method include subcutaneous injection, intramuscular injection, nasal inoculation, oral inoculation, transdermal inoculation, and vaginal inoculation.
  • the appropriate vaccination method is determined in consideration of the type of vaccine antigen, dosage form, antibody expression time, antibody duration, age of the person to be vaccinated, etc. Inoculation methods are finalized through expert clinical trials, and these methods are well known to those skilled in the art. A product for single inoculation or a product for multiple inoculations may be used. The dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose. [0062]
  • the OBF protein of the present invention or a fragment thereof can be used as a factor related to the binding or fusion of sperm and egg.
  • an OBF protein or a fragment thereof can be added to the sperm of an infertile male caused by OBF deficiency or dysfunction to restore fertility.
  • OBF protein or a fragment thereof can be administered directly into the vagina to competitively inhibit the binding of OBF protein on sperm and OBF protein-binding molecule on egg and induce contraceptive action.
  • test compound used in the screening method of the present invention is not particularly limited.
  • natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, antibodies, peptides, etc. single compounds, compound libraries, genes
  • libraries include library expression products, antibody libraries, cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, and the like.
  • the first aspect of the screening method of the present invention relates to screening for compounds that bind to OBF protein or a fragment thereof.
  • a test compound is brought into contact with the OBF protein or a fragment thereof.
  • the binding between the OBF protein or a fragment thereof and the test compound is detected.
  • a test compound that binds to the OBF protein or a fragment thereof is selected.
  • the isolated compound can become a candidate contraceptive compound. It can also be used as a test compound in the screening method described below.
  • a method for screening a protein that binds to OBF protein many methods known to those skilled in the art can be used. Such screening can be performed, for example, by immunoprecipitation. Specifically, this can be done as follows. By inserting DNA encoding OBF protein into an exogenous gene expression vector such as pSV2neo, pcDNA I, or pCD8, the gene can be expressed in animal cells.
  • the promoter used for expression is SV40 early promoter (Rigby In Williamson (ed.), Genetic Engineering, Vol. 3. Academic Press, London, p. 83-141 (1982)), EF-1 promoter (Kim et al.
  • the fusion protein having the monoclonal antibody recognition site becomes a manifestation of specificity.
  • OBF protein can be expressed.
  • Epitopes to be used-commercially available antibody systems can be used (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)).
  • a vector capable of expressing a fusion protein with 13 galactosidase, maltose-binding protein, dartathione S-transferase, green fluorescent protein (GFP), etc. via a multicloning site is commercially available.
  • poly-histidine His-tag
  • influenza Enza agglutinin HA human c-myc
  • FLAG Vesicular stomatitis virus glycoprotein
  • T7 gene 10 protein T7-tag
  • HS V-tag human herpes simplex virus glycoprotein
  • Epitopes such as E-tag (epitopes on monoclonal phages) and monoclonal antibodies that recognize them can be used as epitobu antibody systems for screening for proteins that bind to OBF protein (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995). )).
  • these antibodies are added to a cell lysate prepared using an appropriate surfactant to form an immune complex.
  • This immune complex also becomes an OBF protein, a protein capable of binding to it, and an antibody.
  • An antibody against OBF protein can be obtained by, for example, introducing DNA encoding OBF protein into an appropriate E. coli expression vector, expressing it in E. coli, and purifying the expressed protein. It can be prepared by immunizing moths and birds. It can also be prepared by immunizing the above animal with the synthesized partial peptide of OBF protein.
  • the immune complex can be precipitated using Protein A Sepharose or Protein G Sepharose.
  • the OBF protein is prepared, for example, as a fusion protein with an epitope such as GST, a substance that specifically binds to such an epitope such as dartathione-Sepharose 4B is used to produce an OBF protein. Similar to the case of using an antibody, an immune complex can be formed.
  • SDS-PAGE is generally used for the analysis of immunoprecipitated proteins.
  • a gel with an appropriate concentration it is possible to analyze the proteins that are bound by the molecular weight of the protein.
  • the radioactive isotope 35 S-methionine or Detection sensitivity is improved by culturing cells in a medium containing 35 S-cysteine, labeling the proteins in the cells, and detecting them. Can be made.
  • the protein of interest can be purified directly from SDS-polyacrylamide gel and its sequence determined.
  • a method for isolating a protein that binds to OBF protein or a fragment thereof for example, the method of Skolnik et al. (Skolnik, EY et al. Cell (1991) 65, 83-90) can be used. Can do. That is, a cDNA library using a phage vector (gtll, ZAP, etc.) is prepared from cells and tissues expressing a protein expected to bind to OBF protein or a fragment thereof, and this is expressed on LB-agarose.
  • a cDNA library using a phage vector gtll, ZAP, etc.
  • a protein or fragment thereof expressed on a filter is immobilized, purified and labeled OBF protein or fragment thereof is reacted with the filter, and a plaque expressing a protein bound to OBF protein or fragment thereof is expressed. If you detect by the label.
  • a method for labeling OBF protein or a fragment thereof a method utilizing the binding property of piotin and avidin, specifically binding to OBF protein or a fragment thereof or a protein fused to OBF protein or a fragment thereof (for example, GST).
  • a method using an antibody, a method using a radioisotope, a method using fluorescence, and the like are examples of a method using an antibody, a method using a radioisotope, a method using fluorescence, and the like.
  • a 2-neubrid system using cells Fields, S., and Sternglanz, R., Trends. Genet. (1994) 10, 286— 292, Dalt on S, and Treisman R (1992) Characterization of SAP- 1, a protein recruited by seru m response factor to the c- fos serum response element.Cell 68, 597-612, MATC HMARKER Two-Hybrid System , “Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit J, TMATCHMAKER One-Hybrid System J (all manufactured by Clontech),“ HybriZAP Two-Hybrid Vector System ”(manufactured by Stratagene)).
  • the OBF protein or a fragment thereof is fused with the SRF DNA binding region or the GAL4 DNA binding region and expressed in yeast cells.
  • a cDNA library that is expressed in a form fused with the VP16 or GAL4 transcriptional activity region is prepared and introduced into the yeast cell.
  • the library-derived cDNA is isolated from the detected positive clone (if a protein that binds to the OBF protein is expressed in yeast cells, the binding of the two results in the activation of the reporter gene, resulting in a positive clone. Can be confirmed).
  • a protein encoding the cDNA force S can be obtained. This makes it possible to prepare a protein that binds to OBF protein or its gene.
  • Examples of the reporter gene used in the 2-hybrid system include HIS 3 gene, Ade2 gene, LacZ gene, CAT gene, luciferase gene, PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor typel) gene, and the like. However, it is not limited to these. Screening by the two-hybrid method can be performed using mammalian cells in addition to yeast.
  • Screening for a compound that binds to the OBF protein or a fragment thereof can also be carried out using affinity chromatography.
  • an OBF protein or a fragment thereof is immobilized on a carrier of a utility column, and a test compound that is expected to express a protein that binds to the OBF protein or a fragment thereof is applied thereto.
  • test compounds in this case include cell extracts and cell lysates. After applying the test compound, the column can be washed to prepare a protein bound to the OBF protein or a fragment thereof.
  • the obtained protein is analyzed for its amino acid sequence, an oligo DNA is synthesized based on the amino acid sequence, and a cDNA library is screened using the DNA as a probe to obtain DNA encoding the protein. be able to.
  • a method for isolating a compound that binds to an OBF protein or a fragment thereof, not limited to a protein includes, for example, a synthetic compound, a natural product bank, or a random phage peptide bound to an immobilized OBF protein or a fragment thereof.
  • a biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon can also be used as a means for detecting or measuring the bound compound.
  • Biosensors using the surface plasmon resonance phenomenon can observe the interaction between the OBF protein or a fragment thereof and the test compound in real time as a surface plasmon resonance signal using a small amount of protein and without labeling. Possible (eg from BIAcore, Pharmacia).
  • Another embodiment of the screening method of the present invention relates to screening for compounds that reduce the expression level of DNA encoding OBF protein.
  • Compounds that reduce the expression level of DNA encoding the OBF protein can be candidates for contraceptives.
  • a test compound is brought into contact with a cell having DNA encoding an OBF protein.
  • cells having DNA encoding OBF protein include sperm, sperm cells, and muscle cells. Such cells include sperm and sperm cells in mice and sperm, sperm cells and muscle cells in humans.
  • contact can be performed, for example, by adding a test compound to a cell culture medium.
  • the expression level of the DNA encoding the OBF protein in the cell is then measured and contacted with a test compound, so that a compound that decreases the expression level of the DNA as compared with the case. select.
  • the expression level of DNA can be measured by methods known to those skilled in the art.
  • the expression level of DNA can be measured by extracting mRNA according to a standard method and performing the Northern hybridization method or RT-PCR method using this mRNA as a cage. It is also possible to measure the expression level of DNA using DNA array technology.
  • a fraction containing an OBF protein can be collected according to a conventional method, and the expression level of the OBF protein can be detected by electrophoresis such as SDS-PAGE, thereby measuring the translation level of the gene.
  • test compound is administered to a non-human animal having DNA encoding OBF protein.
  • a test compound is administered to a non-human animal having DNA encoding OBF protein.
  • experimental animals such as mice, rats, rabbits, guinea pigs, guinea pigs, pigs, cats, monkeys, gerbils, hamsters, etc. as non-human animals having DNA encoding OBF protein. It is not a thing.
  • Administration of a test compound to a non-human animal can be performed, for example, orally or parenterally, but is not limited thereto.
  • the test compound is a protein
  • a virus vector having a gene encoding the protein can be constructed, and the gene can be introduced into a non-human animal using its infectivity.
  • the expression level of the DNA encoding the OBF protein in the non-human animal is then measured, and the expression level of the DNA is compared with the case where the test compound is administered. Select a compound that reduces.
  • the expression level of DNA can be measured by the method described above.
  • Screening for compounds that reduce the expression level of the OBF gene can also be performed in a system using a reporter gene.
  • a cell or cell extract having DNA with a reporter gene operably linked downstream of the promoter region of the OBF gene is provided.
  • operably linked means that the promoter region of the OBF gene and the reporter gene are bound so that expression of the reporter gene is induced by binding of a transcription factor to the promoter region of the OBF gene. It means that Therefore, even when one reporter gene is linked to another gene and forms a fusion protein with another gene product, the fusion protein is bound by the transcription factor binding to the promoter region of the OBF gene. Any expression that induces expression is included in the meaning of “functionally linked”.
  • the reporter gene is not particularly limited as long as its expression can be detected.
  • a CAT gene a lacZ gene, a luciferase gene, List of dase gene (GUS) and GFP gene be able to.
  • GUS List of dase gene
  • the test compound is then brought into contact with the cells or the cell extract.
  • the expression level of the reporter gene in the cell or the cell extract is measured.
  • the expression level of the reporter gene can be measured by methods known to those skilled in the art depending on the type of reporter gene used. For example, when the reporter gene is a CAT gene, the expression level of the reporter gene can be measured by detecting the acetylation of chloramphae-coal by the gene product.
  • Reporter gene force In the case of a cZ gene, by detecting the color development of a dye compound by the catalytic action of the gene expression product, and in the case of a luciferase gene, the catalytic action of the gene expression product In the case of the j8-darc mouth-dase gene (GUS), the luminescence of Glucuron (ICN) or 5-bromo- By detecting the coloration of 4-chromium- 3-indolyl- 18-darc mouth-mud (X-Glue) and, in the case of a GFP gene, by detecting fluorescence due to the GFP protein, The expression level of the reporter gene can be measured.
  • a compound that reduces the expression level of the reporter gene is then selected as compared with the case where the test compound is not contacted.
  • Another aspect of the screening method of the present invention is to first contact a sperm collected from a male animal including a human with a compound selected by one or more combinations of the screening methods described above or below. . Next, the fertility of the sperm is confirmed, and a compound that inhibits fertility is selected. Confirmation of fertility is, for example, whether or not the fertilization is established by contact of the sperm with an unfertilized egg collected from a female animal of the same species, and whether or not the sperm and the hamster naked egg are fused. Can be used as an indicator.
  • Collection of animal sperm and unfertilized eggs, contact between sperm and compound, contact between sperm and unfertilized egg, and confirmation of fertilization can be carried out using methods well known to those skilled in the art.
  • observe bulging of the sperm head that occurs after fertilization observe the presence or absence of pronuclei formation thereafter using a phase-contrast microscope, or continue culturing and observe cleavage. Can also be done.
  • Still another embodiment of the screening method of the present invention is the screening method described above.
  • the compound selected by one or more combinations of the administration methods is administered to a non-human male animal.
  • the fertilizing ability of the sperm of the non-human male animal is confirmed, and a compound that inhibits the fertilizing ability is selected.
  • Confirmation of fertility is, for example, whether or not a non-human male animal to which a compound has been administered and a non-human female animal of the same species can be bred (or whether or not pregnancy can be confirmed) Whether non-human male animals to which the compound has been administered is also fertilized by contact between the collected sperm and an unfertilized egg collected from the same kind of female animal, and the non-human male animal power to which the compound has been administered This can be done using whether the collected sperm and the hamster egg are fused or not.
  • the present invention also provides a method for screening a fertility drug using a non-human animal in which the function of the OBF gene is artificially suppressed.
  • a method for screening a fertility drug using a non-human animal in which the function of the OBF gene is artificially suppressed As such a method, first, the test compound is administered to the non-human male animal of the present invention. The test compound can be administered to the non-human male animal of the present invention by the method described above. Next, it is determined whether or not the test compound substitutes for the function of the OBF protein, and a compound that substitutes for the function of the OBF protein is selected as compared with the case where the test compound is not administered.
  • the ability of the test compound to substitute for the function of the OBF protein can be determined by, for example, whether or not a litter can be obtained by mating the non-human male animal with the same kind of non-human female animal (or whether pregnancy is confirmed). Force that can be produced), non-human female animal of the same species as sperm collected from the non-human male animal, whether fertilization is established by contact with the unfertilized egg collected, or from the genetically modified non-human male animal It is possible to determine whether or not the power of the fusion between the collected sperm and the hamster naked egg is established.
  • the present invention also provides a non-human animal in which the function of the OBF gene is artificially suppressed.
  • non-human animal can be used as a model non-human animal for infertility for screening the above-mentioned fertility treatment drug.
  • the present invention also provides a non-human animal cell in which the function of the OBF gene is artificially suppressed.
  • the cells include sperm and sperm cells.
  • sperm of a non-human animal in which the function of the OBF gene is artificially suppressed can be a model sperm without fertilization ability.
  • the function of the OBF gene is artificially suppressed usually means that a genetic mutation such as nucleotide insertion, deletion, substitution or the like is present in one or both of the OBF gene pair. Refers to a state in which the expression of the gene is suppressed by It is also possible to artificially suppress the function of the OBF gene by a method using a sense DNA, a method using a DNA encoding a ribozyme, a method using RNAi technology, or the like.
  • the case where the function as a normal OBF protein is decreased or lost and the mutant OBF protein is expressed is also included in the "suppression of the function of the OBF gene".
  • the “suppression” includes not only the case where the expression of the OBF gene is completely suppressed, but also the case where the expression of only one gene of the gene pair of the gene is suppressed.
  • the site where the gene mutation is present in the present invention is not particularly limited as long as the gene expression is suppressed, and examples thereof include an exon site and a promoter site.
  • the biological species from which the animal that is the target of modification of the OBF gene is usually a mammal other than a human, and preferably a rodent such as a mouse, a rat, a mouse, a muster, a rabbit, or a pig. Among them, mice are particularly preferable.
  • means for artificially suppressing the function of the OBF gene include a method of deleting the entire OBF gene or a part thereof, a whole or part of the OBF gene expression control region.
  • the method of inactivating the OBF gene by inserting a foreign gene into one or both of the OBF gene pair is preferable. That is, in a preferred embodiment of the present invention, the non-human animal is characterized in that a foreign gene is inserted into one or both of the OBF gene pair.
  • the non-human animal of the present invention can be produced by those skilled in the art by generally known genetic engineering techniques.
  • a mouse in which the gene function is suppressed can be produced as follows. First, isolate the DNA containing the exon part of the OBF gene with mouse force, insert an appropriate marker gene into this DNA fragment, and construct a targeting vector. This targeting vector is introduced into a mouse ES cell line by means of the electopore method, etc., and a cell line that has undergone homologous recombination is selected.
  • the marker to be inserted is preferably an antibiotic resistance gene such as a neomycin resistance gene.
  • a cell line that has undergone homologous recombination can be selected simply by culturing in a medium containing the antibiotic.
  • a thymidine kinase gene or the like is bound to a targeting vector. It is also possible to leave. This can eliminate cell lines that have undergone non-homologous recombination.
  • homologous recombinants can be assayed by PCR and Southern blotting to efficiently obtain a cell line in which one of the OBF gene pair is inactivated.
  • an ES cell line in which both OBF gene pairs are inactivated can also be obtained by the following method. That is, by culturing an ES cell line in which one of the gene pair is inactivated in a medium containing a high concentration of antibiotics, the cell line in which the other gene pair is also inactivated, that is, the gene pair of the OBF gene ES cell lines in which both are inactivated can be obtained. Alternatively, it can also be prepared by selecting an ES cell line in which one of the gene pair is inactivated, introducing a targeting vector again into this cell line, and selecting a cell line that has undergone homologous recombination.
  • the marker gene to be inserted into the targeting vector is preferably different from the marker gene described above. By differentiating the generated ES cells, it is possible to obtain spermatozoa in which both OBF gene pairs are inactivated.
  • the present invention also provides a method for examining infertility, which includes the step of measuring the expression level of an OBF gene.
  • OBF gene expression includes not only OBF mRNA expression but also OBF protein expression.
  • RNA sample of a subject is prepared.
  • the RNA sample can be extracted, for example, from the sperm or testis of the subject.
  • the amount of RNA encoding the OBF protein contained in the RNA sample is measured.
  • the amount of RNA measured is then compared to a control. Examples of such methods include Northern blotting, DNA array, or RT-PCR.
  • test method can be carried out as follows by measuring the expression level of OBF protein.
  • a protein sample is prepared from a subject.
  • the protein sample can be prepared, for example, from a subject's sperm or testis.
  • the amount of OBF protein contained in the protein sample is measured.
  • the amount of OBF protein measured is then compared to a control.
  • Such methods include SDS polyacrylamide electrophoresis, Western blotting, dot blotting, immunoprecipitation, enzyme-linked immunoassay (ELISA) using antibodies that bind to OBF protein, And immunofluorescence can be exemplified.
  • the present invention also provides a method for detecting infertility, which comprises the step of detecting a mutation in the OBF gene region.
  • the OBF gene region means a region that affects the OBF gene and the expression of the gene.
  • the region that affects the expression of the gene is not particularly limited. Examples thereof include a promoter region.
  • the mutation in the present invention is not limited in type, number, site, etc. as long as it causes a decrease or disappearance of fertilizing ability of sperm.
  • Examples of the type of mutation include deletion, substitution, or insertion mutation.
  • the method of this invention is not limited to those methods.
  • a DNA sample is prepared from a subject.
  • a DNA sample can be prepared based on, for example, chromosomal DNA or RNA.
  • DNA containing the OBF gene region is then isolated. Isolation of the gene region can be performed, for example, by PCR using a primer that hybridizes to the DNA containing the gene region and chromosome DNA or RNA as a cage.
  • the base sequence of the isolated DNA is determined in the following. Isolated DNA
  • the base sequence of can be determined by methods known to those skilled in the art.
  • the determined DNA base sequence is then compared with a control.
  • the control refers to DNA containing a normal (wild-type) OBF gene region.
  • the DNA sequence containing the OBF gene region of a healthy person is considered to be normal, so the above “comparison with the control” is usually compared with the DNA sequence containing the OBF gene region of a healthy person. It means to do.
  • Detection of mutations in the present invention can also be performed by the following method. First, a DNA sample is prepared from a subject. Next, the prepared DNA sample is cut with a restriction enzyme. The DNA fragments are then separated according to their size. The size of the detected DNA fragment is then compared to a control. In another embodiment, a DNA sample is first prepared from a subject. Next, DNA containing the OBF gene region is amplified. Sarako, cleave the amplified DNA with restriction enzymes. The DNA fragments are then separated according to their size. The size of the detected DNA fragment is then compared to a control.
  • Examples of such a method include a method using restriction enzyme fragment length mutation (Restriction Fragment Length Polymorphism ZRFLP) and a PCR-RFLP method. Specifically, if there is a mutation in the recognition site of a restriction enzyme, or if there is a base insertion or deletion in the DNA fragment generated by the restriction enzyme treatment, the size of the fragment produced after the restriction enzyme treatment is small. Change compared to control. By amplifying a portion containing this mutation by PCR and treating with each restriction enzyme, these mutations can be detected as a difference in mobility of bands after electrophoresis.
  • restriction enzyme fragment length mutation Restriction Fragment Length Polymorphism ZRFLP
  • PCR-RFLP method Specifically, if there is a mutation in the recognition site of a restriction enzyme, or if there is a base insertion or deletion in the DNA fragment generated by the restriction enzyme treatment, the size of the fragment produced after the restriction enzyme treatment is small. Change compared to control. By amplifying a portion containing
  • the presence or absence of mutation can be detected by treating chromosomal DNA with these restriction enzymes, performing electrophoresis, and performing Southern blotting using the probe DNA of the present invention.
  • the restriction enzyme used can be appropriately selected according to each mutation.
  • RNA prepared by the subject in addition to genomic DNA, RNA prepared by the subject can also be converted to cDNA using reverse transcriptase, cut directly with restriction enzymes, and then subjected to Southern blotting. It is also possible to examine the difference in mobility after amplifying DNA containing the OBF gene region by PCR using this cDNA as a saddle and cleaving it with a restriction enzyme.
  • a DNA sample is first prepared from a subject. Then OBF Amplify the DNA containing the gene region. Furthermore, the amplified DNA is dissociated into single-stranded DNA. The dissociated single-stranded DNA is then separated on a non-denaturing gel. The mobility of the separated single-stranded DNA on the gel is compared with the control.
  • Examples of the method include PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method (Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorpnism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome. cs. 1992 Jan 1; 12 (1): 139- 146. Detection of p53 gene mutations in human brain tu mors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain react ion products.Oncogene. 1991 Aug 1; 6 (8): 1313- 1318. Multiple fluorescence-base PCR-SSCP analysis with postlabeling. PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4 (5): 275-282.).
  • This method is particularly suitable for screening a large number of DNA samples because it is relatively easy to operate and has the advantage that the amount of the test compound is small.
  • the principle is as follows. When a double-stranded DNA fragment is dissociated into single strands, each strand forms a unique higher-order structure that depends on its base sequence. When this dissociated DNA strand is electrophoresed in a polyacrylamide gel without a denaturing agent, single-stranded DNA with the same complementary strand length moves to a different position depending on the difference in each higher-order structure. . Substitution of single base also changes the higher-order structure of this single-stranded DNA, and shows different mobility in polyacrylamide gel electrophoresis. Therefore, by detecting this change in mobility, it is possible to detect the presence of mutations due to point mutations, deletions or insertions in the DNA fragment.
  • DNA containing the OBF gene region is amplified by PCR or the like.
  • a length of about 200 400 bp is usually preferable.
  • Those skilled in the art can perform PCR by appropriately selecting reaction conditions and the like.
  • the amplified DNA product can be labeled by using a ply labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or piotin.
  • the amplified DNA product can be labeled by adding a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or piotin to the PCR reaction solution.
  • substrates labeled with isotopes such as 32 P, fluorescent dyes, or piotin using a talenou enzyme after the PCR reaction
  • Labeling can also be accomplished by adding a base to the amplified DNA fragment.
  • the labeled DNA fragment thus obtained is denatured by applying heat or the like and electrophoresed on a polyacrylamide gel containing no denaturing agent such as urea.
  • the conditions for separating DNA fragments can be improved by adding an appropriate amount (approximately 5 to 10%) of glycerol to the polyacrylamide gel.
  • Electrophoretic conditions vary depending on the nature of each DNA fragment, but are usually performed at room temperature (20 to 25 ° C), and optimal mobility can be achieved at temperatures from 4 to 30 ° C when favorable separation cannot be obtained. Examine the temperature to be applied. After electrophoresis, the mobility of DNA fragments is detected and analyzed by autoradiography using X-ray film or a scanner that detects fluorescence. If a band with a difference in mobility is detected, this band can be excised directly from the gel, amplified again by PCR, and sequenced directly to confirm the presence of the mutation. Even when labeled DNA is not used, bands can be detected by staining the gel after electrophoresis with ethidium bromide or silver staining.
  • a DNA sample is first prepared from a subject.
  • DNA containing the OBF gene region is amplified.
  • the amplified DNA is separated on a gel with increasing concentrations of DNA denaturing agents. The mobility of the separated DNA on the gel is then compared to the control.
  • Examples of such a method include denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE method).
  • the DGGE method is a method in which a mixture of DNA fragments is run in a polyacrylamide gel with a denaturing agent concentration gradient, and the DNA fragments are separated according to the difference in instability.
  • DGGE method is a method in which a mixture of DNA fragments is run in a polyacrylamide gel with a denaturing agent concentration gradient, and the DNA fragments are separated according to the difference in instability.
  • the DNA sequence around the mismatch is partially dissociated into single strands due to its instability.
  • the mobility of this partially dissociated DNA fragment is very slow and can be separated from the mobility of a complete double-stranded DNA without a dissociated part.
  • a polyacrylamide gel in which DNA containing the OBF gene region is amplified by a PCR method using the primer of the present invention and the like and gradually increases as the concentration of denaturing agents such as urea moves. Electrophorese in and compare to control. Lower denaturants for DNA fragments with mutations Since the DNA fragment becomes single-stranded at the concentration position and the movement speed becomes extremely slow, the presence or absence of mutation can be detected by detecting this difference in mobility.
  • a DNA containing an OBF gene region prepared from a subject and a substrate on which a nucleotide probe that hybridizes to the DNA is immobilized are provided.
  • the “substrate” means a plate-like material on which a nucleotide probe can be fixed.
  • nucleotides include oligonucleotides and polynucleotides.
  • the substrate of the present invention is not particularly limited as long as the nucleotide probe can be immobilized, but a substrate generally used in DNA array technology can be preferably used.
  • a DNA array consists of thousands of nucleotides printed on a substrate at high density. Usually, these DNAs are printed on the surface of a non-porous substrate.
  • the surface layer of the substrate is generally glass, but a porous membrane, such as a trocellulose membrane, can be used.
  • an oligonucleotide-based array developed by Aifymetrix can be exemplified as a method for immobilizing (arraying) nucleotides.
  • oligonucleotides are usually synthesized in situ.
  • photolithographic techniques Aifymetrix
  • in-situ synthesis methods of oligonucleotides using an ink-jet (Rosetta Inpharmatics) technique for immobilizing chemical substances are already known.
  • the nucleotide probe immobilized on the substrate is not particularly limited as long as it can detect a mutation in the OBF gene region. That is, the probe is, for example, a probe that hybridizes to DNA containing the OBF gene region. If specific hybridization is possible, the nucleotide probe need not be completely complementary to the DNA containing the gene region.
  • the length of the nucleotide probe to be bound to the substrate is usually 10 to 100 bp, preferably 10 to 50 bp, more preferably 15 to 25 bp when the oligonucleotide is immobilized.
  • the DNA containing the OBF gene region is brought into contact with the substrate.
  • DNA is hybridized to the nucleotide probe.
  • the reaction solution and reaction conditions for the hybridization can vary depending on various factors such as the length of the nucleotide probe immobilized on the substrate, but can generally be performed by methods well known to those skilled in the art.
  • the intensity of hybridization between the DNA containing the OBF gene region and the nucleotide probe immobilized on the substrate is then detected.
  • This detection can be performed, for example, by reading a fluorescent signal with a scanner or the like.
  • DNA arrays DNA fixed on a slide glass is generally called a probe, while labeled DNA in a solution is called a target. Therefore, the above nucleotide fixed to the substrate is referred to as a nucleotide probe in this specification.
  • the intensity of the detected hybrid is further compared with that of a control.
  • DNA array method SNP gene mutation strategy, Kenichi Matsubara • Yoshiyuki Tsuji, Nakayama Shoten, pl28-135, Nature Genetics (1999) 22: 164-167), etc.
  • an allele specific oligonucleotide (ASO) hybridization method can be used for the purpose of detecting only a mutation at a specific position. If an oligonucleotide containing a nucleotide sequence that is considered to have a mutation is prepared and subjected to hybridization with DNA, the efficiency of hybridization will be reduced if the mutation is present. This can be detected by Southern blotting or a method that uses the property of quenching by intercalating a special fluorescent reagent into the hybrid gap.
  • the MALDI-TOF / MS method SNP gene polymorphism strategy, Kenichi Matsubara, Yoshiyuki Tsuji, Nakayama Shoten, pl06-117, Trends Biotechnol (2000): 18: 77- 84
  • TaqMan PCR method SNP gene polymorphism strategy, Kenichi Matsubara 'Yoshiyuki Tsuji, Nakayama Shoten, p94-105, Genet Anal.
  • the present invention provides a test agent for use in the test method of the present invention. That One embodiment is a test agent that contains an oligonucleotide that hybridizes to the 0BF gene region and has a chain length of at least 15 nucleotides.
  • the oligonucleotide specifically hybridizes to DNA (normal DNA or mutant DNA) containing the OBF gene region.
  • DNA normal DNA or mutant DNA
  • “specifically hybridize” means normal hybridization conditions, preferably stringent hybridization conditions (for example, Sambnorec et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, In the USA, 2nd edition, 1989), which means that DNA encoding other proteins, crosno, and hybridization are not significantly generated.
  • the oligonucleotide need not be completely complementary to the DNA containing the OBF gene region, if specific noidisation is possible! /.
  • Oligonucleotides that hybridize to DNA containing the OBF gene region and have a chain length of at least 15 nucleotides can be used as probes (including substrates on which the probes are immobilized) and primers in the test method of the present invention. it can.
  • the oligonucleotide is used as a primer, the length is usually 15 bp to 100 bp, preferably 17 bp to 30 bp.
  • the primer is not particularly limited as long as it can amplify at least a part of the OBF gene region including the mutated portion.
  • the probe is not particularly limited as long as it specifically hybridizes to DNA containing an OBF gene region.
  • the probe may be a synthetic oligonucleotide and usually has a chain length of at least 15 bp.
  • the oligonucleotide of the present invention can be prepared by, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer.
  • the probe can be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
  • the oligonucleotide of the present invention is used as a probe, it is preferably used after being appropriately labeled.
  • T4 polynucleotide kinase is used to label the oligonucleotide by phosphorylating the 5 ′ end with 32 P, and a random hexamer oligonucleotide is used using a DNA polymerase such as a Talenow enzyme.
  • Substrate bases labeled with isotopes such as 32 P, fluorescent dyes, or piotin using nucleotides as primers Examples of the incorporation method (random prime method, etc.) can be given.
  • test agent of the present invention is a test reagent containing an antibody that recognizes the OBF antigen of the present invention.
  • the antibody is not particularly limited as long as it can be used for testing.
  • the antibody is labeled as necessary.
  • oligonucleotides and antibodies that are active ingredients for example, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, surfactants, lipids, solubilizers, buffers, Protein stabilizers (BSA, gelatin, etc.), preservatives, etc. may be mixed if necessary! All prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
  • spleen cells (lxlO 8 ) were extracted from mouse spleen and fused with myeloma cell line P3U1 (lxlO 7 ) using polyethylene glycol 4000 (Sigma Chem.).
  • Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) (Flow Lab.) With 100 IU / m 1 penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin (Flow Lab.), 1 ⁇ g / ml Fungizone (Flow Lab.), 80 ⁇ g / ml Gentacin (Shionogi Pharm.
  • mice sperm medium (TYH) (Toyoda, Y., et al. Jpn J Anim Reprod 16, 147-51 (1971).) For 2 hours, then these sperm (lxlO 5 ) was allowed to react with 50 ⁇ l of the culture supernatant obtained from the hybridoma (OBF13) for 2 hours at 37 ° C. After several washes with PBS (-), FITC-conjugated anti-mouse IgM (Miles- Yeda) diluted to 25 ⁇ g / ml with a solution of 5% NBCS (new-born calf serum) in PBS. Ltd.) was added for 20 ⁇ l and allowed to react for 1 hour. After several washes with PBS (-), their sperm were observed under a fluorescence microscope
  • Superovulation was performed by injecting 5 IU pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) (Teikoku Zoki) into the abdominal cavity of female BDF1 mice over 8 weeks of age, and 5 IU human chorionic gonadotropin (hCG) (Tei koku Zoki) 48 hours later. I was made. After 13-15 hours, unfertilized eggs were collected from the enormous part of the fallopian tube, and unfertilized eggs from which cumulus cells were removed by 0.01% (w / v) Hyaluronidase (Sigma Chem.) Were used.
  • PMSG pregnant mare serum gonadotropin
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • Sperm is extracted from the epididymis, cultured in TYH medium at 37 ° C for 1 hour, supplemented with OBF13 monoclonal antibody, incubated for 1 hour, and medium containing egg to a final concentration of 2xl0 5 sperm / ml Added to.
  • fertilized eggs were identified in TYH medium based on pronuclear formation under a phase contrast microscope using Hoffman contrast.
  • the epididymis and vas deferens were removed from ICR male mice (10 mice) 12 weeks of age or older. After collecting sperm, Lysis buffer (1% TritonX-114, PBS ⁇ 10 mM Benzamidine ⁇ 1 mM PMSF, 1 ⁇ g / Sperm was solubilized using ml P epstatin, 1 ⁇ g / ml Leupeptin). The solubilized protein was removed by centrifugation of the insoluble fraction, layered on 6% Sucrose, and left at 37 ° C for 5 minutes. It was.
  • Lysis buffer 1% TritonX-114, PBS ⁇ 10 mM Benzamidine ⁇ 1 mM PMSF, 1 ⁇ g / Sperm was solubilized using ml P epstatin, 1 ⁇ g / ml Leupeptin). The solubilized protein was removed by centrifugation of the insoluble fraction, layered on 6% Sucrose,
  • Plasmid DNA for expressing OBF protein is a mammalian expression vector, pCXN2 (Niwa, H., et al. Gene), constructed by adding a Kozak sequence at the N-terminus and a histidine tag at the C-terminus. 108, 193-9 (1991). These plasmid DNAs were introduced into RK13 cells (RIKEN Cell Bank) derived from rabbit kidney using lipofectamine 2000 (Invitrogen). After selecting cells with 600 ⁇ g / ml G418 (Invitrogen), a penicillin cup was used. And cloned.
  • DMEM Dulbecco's Modification of Eagle's Medium
  • Invitrogen 100 IU / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 2 mM L-glutmine, 0.1 mM MEM
  • Non-essential amino acids Invtrogen
  • 10% fetal calf serum JRH Biosciences
  • a cell line prepared as in 3-1 was used as the OBF protein antigen. Seven lxlO cells were collected from these cell lines using 10 mM EDTA, washed several times with PBS ( ⁇ ), and suspended in 0.5 ml PBS ( ⁇ ). 0.6 ml of Freund's complete adjuvant (Difco) was added to this PBS (-) suspension solution to make emulsions, and immunization was performed in the vicinity of the lymph nodes on both legs of the Usagi four times a week. After the fourth immunization, a boost was performed and blood smelt was collected.
  • Difco Freund's complete adjuvant
  • Serum IgG was precipitated using 33% final concentration of ammonium sulfate, dialyzed against PBS (-) and stored at -80 ° C (Inoue, N., et al. J Immunol 166, 424-31 (2001).).
  • Proteins from various mouse tissues can be obtained from each tissue at 100 mg / ml in lysis buffer (1% (v / v) Trit on X—100, PBS ⁇ 10 mM Benzamidine ⁇ 1 mM PMSF, 1 ⁇ g / ml Pepstatin, 1 ( ⁇ g / ml Leupeptin), and the tissue was crushed using a Potter type homogenizer and soluble. The soluble sample was centrifuged at 4 ° C, 20,000xg, 30 minutes, and the soluble fraction was collected.
  • the soluble fraction was quantified by the BBB equivalent of the protein amount by the CBB method, and 30 ⁇ g was separated by SDS-PAGE (10% polyacrylamide gel) and applied to polyvinylidene difluoride (PVDF).
  • the transferred membrane was blocked with 10% skim milk blocking buffer (0.15% Tween 20, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HC1 (pH 7.4), and then added to the blocking buffer at 1 g / ml.
  • a targeting vector in which exons 2 to 10 are replaced with the neomycin metagene as shown in Fig. 4A is prepared and introduced into the D3 embryonic stem (ES) cell by the electoporation method. did. After selection with 150 ⁇ g / ml G418 (Invitrogen), 4 positive colonies were selected from the genomic DNA by PCR. In addition, 4 clones were selected by Southern blotting, as expected. These four cell lines were injected into blastcyst embryos of C57BL / 6 mice. As a result, a chimeric mouse was obtained that conveys the targeting aryl to offspring.
  • an OBF hetero mouse was obtained (F1 mouse). Furthermore, OBF knockout mice were obtained by crossing F1 mice (F2 mice). For the analysis, F2 mice or F3 mice that have obtained mating ability between F2 mice were mainly used.
  • the gel is denatured using denaturation buffer (0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl), and neutralized using neutralization buffer (0.5 M Tris-HCl (pH 7.5), 3 M NaCl). And transferred to a nylon membrane (Hybond-N +, Amersham).
  • the transfer membrane was prepared by labeling the DNA prepared on the outside of the long arm with 32 P and allowed to react at 60 ° C. for 1 hour in a hybridization buffer (Express Hybridization buf fer, Clontech).
  • Membrane cleaning solution cleaning solution 1; 2xSSC, 0.0 After washing several times using 5% SDS, washing solution 2; O. lxSSC, 0.1% SDS), the transfer film was exposed to an X-ray film (Hyper film MP, Amersham).
  • RNA from testis using TRIZOL Reagent (Invtrogen), separate 20 ⁇ g each on 1% agarose gel containing lx MOPS, 18% formaldehyde, and denature the gel using denaturation buffer (50 mM NaOH). Using sum buffer (200 mM CH COONa)
  • the gel was neutralized and transferred to a nylon membrane (Hybond-N +, Amersham).
  • the nylon membrane to which RNA was transferred was reacted with a 32 P-labeled ORF full-length OBF fragment in a hybridization buffer (Express Hybridization buffer, Clontech) at 68 ° C for 1 hour.
  • the membrane was exposed to an X-ray film (Hyper film MP, Amersham) after several washes using a membrane cleaning solution (cleaning solution 1; 2xSSC, 0.05% SDS, cleaning solution 2; O. lxSSC, 0.1% SDS).
  • the method of Western blot was according to 3-3. Testis and sperm were extracted from 12-week-old mice of each genotype, and then the protein was soluble using lysis buffer. Each protein was separated by SDS-PAGE using 10% acrylamide at 30 / zg, 1 ⁇ g / ⁇ OBF polyclonal antibody, 10 ⁇ g / ml mouse CD46 polyclonal antibody (Inoue, N., et al.
  • Semen was collected by a manual procedure from a healthy volunteer man. This semen was liquefied by incubating at 37 ° C for 1 hour, and 0.5 ml was added to the bottom of 2 ml of BWW medium (Overstreet, JW, et al. Fertil Steril 33, 534-42 (1980).) In a test tube. ml of liquefied semen was added and incubated for 1 hour with the tube angle kept at 30 °. Swim-up sperm was recovered from 1.5 ml of supernatant, washed once with BWW, suspended in 200 1 BWW, added to 200 1 drop (total 400 ⁇ 1), and incubated at 37 ° C for 6 hours .
  • Eggs were prepared in the same manner as in vitro fertilization, and cumulus cells were removed using 0.01% (w / v) Hyaluronidase (Sigma Chem.). Unfertilized eggs are washed several times with a drop of kSOM (Ho, Y., et al. Mol Reprod Dev 41, 232-8 (1995)), then placed in another kSOM drop at 37 ° C, 5% CO
  • mice with OBF-/-and OBF transgene were prepared by crossing with.
  • the vector used for the mouse OBF transgenic mouse was constructed so that it was expressed under the control of the testis-specific carmedin promoter (Ikawa, M., et al. Dev Biol 240, 254-61 (2001)). ).
  • Superovulatory mice were prepared as in 1-3, and mated with male mice after hCG injection and mated.
  • the males used were (1) OBF +/ ⁇ , (2) OBF ⁇ , and (3) OBF ⁇ / ⁇ , a double transgenic mouse that is also an OBF transgene.
  • the next morning the female vagina was observed, and after confirming the plug indicating mating, eggs were collected from the enormous portion of the fallopian tube. At this time, eggs with abnormal cytoplasm were removed, and fertilized eggs were identified based on pronuclear formation under a microscope using Hoffman contrast.
  • the present researchers also extracted sperm from the epididymal strength of C57BL / 6 male mice and immunized them to female mice of the same strain.
  • a number of monoclonal antibodies were prepared. Among them, one clone of a unique monoclonal antibody that specifically reacts only to the sperm after the acrosome reaction, which is a morphological change caused by the fusion of the sperm cell membrane and the outer membrane of the acrosome so that the sperm can be fertilized Obtained.
  • This antibody (OBF13) gradually spreads throughout the sperm head as the acrosome reaction occurs. It reacts with strong antigens (Fig.
  • sperm after OBF13 treatment had no effect on the binding and passage to the zona pellucida, but showed an inhibitory effect on the subsequent fusion with the ovum depending on the antibody treatment concentration (Table 1). 2).
  • ** p 0.01 A statistically significant difference from the control at a risk rate of 1% or less
  • the antigen recognized by this antibody is a molecule that is essential for sperm binding or fusion to the ovum, and the epididymal strength of 10 ICR male mice also collected the sperm and collected the membrane.
  • Triton X-114 a surfactant that can be roughly extracted into the fraction and the aqueous fraction, was used for soluble identification and attempted to identify the antigen.
  • the membrane fraction was separated by two-dimensional electrophoresis (first dimension: pH 4.0-7.0, second dimension: 7.5% SDS-PAGE polyacrylamide gel). After transfer to PVDF membrane, Western blotting was performed using OBF13 to identify the location of the antigen spot (Fig. 3A). Next, the gel force was cut out from the identified spot, and the primary structure was determined by LC-MS / MS (FIG. 3B).
  • OBF13 antigen has already been registered in the cDNA capacity of the full-length ORF ⁇ CBI database as an unknown function molecule (accession number: XM_133424), and the mRNA sequence could be estimated.
  • RT-PCR and DNA sequencing were performed on the total RNA extracted from mouse testis, and the sequence was confirmed.
  • Analysis of the motif of this molecule (OBF (Oocyte binding / lusion factor)) revealed that it is a typical type I membrane protein with signal sequence, extracellular region, transmembrane region, and intracellular region. (Figure 3B).
  • OBF was present not only in mice but also at least in humans and rats, and the homology at each amino acid sequence level was as high as more than 57%.
  • the base sequence of OBF for human, mouse or rat is shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 5, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6. It was speculated that the extracellular region of OBF in all these animal species has one Ig-like (Immunoglobulin-like) domain, and this domain is formed by disulfide bonds between cysteines (Fig. 3D). .
  • the N-linked glycosylation sequence in this domain was completely conserved among all animal species.
  • Mouse OBF has been shown to be expressed in the testis and brain in the EST database.
  • polyclonal antibodies against mouse OBF are prepared and Western blotting of each tissue is performed, it exists specifically at the protein level in the testis and sperm. ( Figure 3C).
  • a knockout mouse was prepared and analyzed. Targeting to replace exon 2 to 10 of OBF gene consisting of 10 exons with neomycin resistance gene A vector was constructed, and ES cells that caused homologous recombination were cloned as usual to produce knockout mice (FIG. 4A). The presence of homologous recombination in individual mice was examined by Southern blot, Northern blot, and Western blot (Fig. 4B-D). As a result, it was confirmed that mRNAs and proteins derived from the OBF gene were deleted in mice subjected to homologous recombination.
  • OBF is an important molecule indispensable for binding and fusion with the egg, which is the most important step of fertilization, in humans as well as in mice.
  • this antibody since this antibody has an effect of inhibiting fertilization, it can be used as an antigen for a contraceptive vaccine. Conversely, by examining OBF, it can also be applied to the diagnosis of infertility.
  • the present invention provides a method for using the protein OBF essential for binding or fusion of sperm and ovum and its antibody.
  • OBF can be used as a contraceptive vaccine and antibody against OBF Can be used as a contraceptive.
  • screening of contraceptives and infertility testing methods using OBF protein expression as an index can be provided.
  • a non-human animal in which the function of the OBF gene is suppressed can be used as a model animal for infertility.

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Abstract

　先体反応後の精子にのみ特異的に反応する、ユニークなモノクローナル抗体を得、この抗体の認識する抗原（OBF）を同定した。この抗体により、マウス精子と卵子との融合が阻害されることが分かった。さらに、OBFの生体内での機能を解明するため、OBF遺伝子ノックアウトマウスを作製し解析した。その結果、OBF遺伝子ノックアウト雄マウスは不妊であり、その精子は、卵子に結合することができるにもかかわらず、全く融合能を有していないことが分かった。

Description

明 細 書
精子膜タンパク質 OBFの利用
技術分野
[0001] 本発明は、精子膜タンパク質 OBF (Oocyte binding/lusion factor),及び OBFに対 する抗体の利用法に関する。
背景技術
[0002] 受精は、生命現象の始まりという極めて重要な現象にもかかわらず、分子生物学的 な機構については分力つていない点が多い。しかし、近年ジーンターゲテイング法に よる遺伝子改変動物の作製により受精における重要な因子が報告され始めた。しか し、融合のステップに関しては、卵子上の CD9が融合に必須な分子として最近報告さ れたのみである (非特許文献 1)。精子側の融合因子を明らかにすることにより、受精 の基礎研究の発展のみならずその抗原を用いた避妊ワクチンにも応用できる可能性 があり、臨床的な応用も期待される。
[0003] 本発明者らはこれまでに、精子膜タンパク質 OBF (Oocyte binding/lusion factor)に 関し、以下の報告をしてきた。まず、精子を抗原としていくつかの Mabを作製した。そ のうちの OBF13と名づけた抗体は精子染色パターンが精子を培養するあいだに変わ り、その様子は精子の受精能と相関していることを明らかにした (非特許文献 2)。 OB F13を体外受精の系にいれると、受精 (融合）が阻害されたが、ハムスターとの融合は 阻害されなかった (非特許文献 3)。また、腹水をメスに投与する受動免疫で、受精（ 融合)が阻害される様子を報告した (非特許文献 4)。さらに、 OBF13と反応する精子 は 3つの染色パターンに別れ、それを FACSで分別できることを報告した (非特許文献 5)。
[0004] 非特許文献 1 : Miyado, K. et al., Science (2000) 287, 321-324
非特許文献 2： Capacitation related changes in antigen distribution on mouse sperm heads and its relation to fertilization rate in vitro. J. Reproductive Immunology, 11, 91-100 (1987)
非特許文献 3 : Effect of monoclonal anti-mouse sperm antibody (OBF13) on the inter action of mouse sperm with zona— free mouse and hamster eggs. J. Reproductive Im munology 13, 211-219 (1988)
特許文献 4: An anti-mouse sperm monoclonal antibody (OBF13) and its inhibitory activity on fertilization. 日本不妊学会雑誌 33, 473-478 (1988)
非特許文献 5 : OBF13 J. Reproductive. Immunology. 16, 71-82 (1989)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、精子側の融合 因子を明らかにし、該因子、該因子に対する抗体、およびそれらの利用法を提供す ることにある。より具体的には、該因子に対する抗体、該抗体を含む避妊薬、該因子 を用いた避妊ワクチン、 OBFタンパク質またはその断片の精子と卵子との結合または 融合に関連する因子としての使用、該因子をコードする遺伝子の機能が抑制された 非ヒト動物、該因子を用いた避妊薬のスクリーニング方法、該因子を指標とした不妊 の検査方法および検査薬などを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、先体反応 後の精子にのみ特異的に反応する、ユニークなモノクローナル抗体を得、この抗体 の認識する抗原（OBF)を同定した。同抗体で処理したマウス精子においては、卵子 透明体結合能、通過能は正常であったものの、その後の卵子との融合能に関しては 、抗体処理濃度依存的に阻害された。さらに、 OBFの生体内での機能を解明するた めに、 OBF遺伝子ノックアウトマウスを作製し、解析した。その結果、 OBF遺伝子ノック アウト雄マウスは不妊であり、 OBFノックアウトマウスの精子は、マウス卵子に結合する ことができるにもかかわらず、全く融合能を有していないことが分力つた。様々な動物 種が融合可能なハムスター裸卵を用いた実験においては、 OBFノックアウトマウスの 精子はハムスター裸卵に結合するが、全く融合できないことが判明した。また、ヒト OB Fポリクローナル抗体を用いた実験から、ヒト精子はハムスター裸卵に対して融合はお ろか結合さえしなくなることが明ら力となった。これらの結果から、 OBFは、動物種をこ えて受精における卵子との結合または融合に必須な分子であることが分力つた。 OB Fを欠損したマウスの受精能は、トランスジーンとして OBFを発現させることにより回復 することができた。すなわち、このような原因をもつ不妊は OBFの遺伝子またはタンパ ク質の添カ卩により、治療できる可能性がある。なお、本明細書において OBFと称され るタンパク質は、その他の文献等（例えば Nature 434, 234-238 (2005))において Izu moと称される。
本発明は、以下の〔1〕〜〔17〕を提供するものである。
〔1〕 精子と卵子との結合または融合を阻害する活性を有する抗体であって、以下の (a)〜（d)の 、ずれかに記載のタンパク質またはその断片を抗原とする抗体 (OBF13 抗体を除く)。
(a)配列番号： 1、 3、 5のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAよりコードされるタン パク質
(b)配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
(c)配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァ ミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を含むタンパク質で あって、配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質と機 能的に同等なタンパク質
(d)配列番号： 1、 3、 5のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAとストリンジェントな 条件下でノ、イブリダィズする天然由来の DNAよりコードされるタンパク質であって、配 列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同 等なタンパク質
〔2〕 精子と卵子との結合または融合を阻害する活性を有する抗体であって、以下の (a)〜 (d)の ヽずれかに記載のタンパク質またはその断片を抗原とする抗体を有効 成分として含有する避妊薬。
(a)配列番号： 1、 3、 5のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAよりコードされるタン パク質
(b)配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
(c)配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァ ミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を含むタンパク質で あって、配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質と機 能的に同等なタンパク質
(d)配列番号： 1、 3、 5のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAとストリンジェントな 条件下でノ、イブリダィズする天然由来の DNAよりコードされるタンパク質であって、配 列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同 等なタンパク質
〔3〕 〔2〕に記載のタンパク質またはその断片を有効成分として含有する避妊ワクチ ン。
〔4〕 〔2〕に記載のタンパク質またはその断片の精子と卵子との結合または融合に関 連する因子としての使用。
〔5〕 以下の (a)〜 (c)の工程を含む、避妊薬の候補ィ匕合物のスクリーニング方法。
(a)〔2〕に記載のタンパク質またはその断片に被検化合物を接触させる工程
(b)該〔2〕に記載のタンパク質またはその断片と被検化合物との結合を検出するェ 程
(c)該〔2〕に記載のタンパク質またはその断片と結合する被検化合物を選択するェ 程
〔6〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、避妊薬の候補ィ匕合物のスクリーニング方法。
(a)〔2〕に記載のタンパク質をコードする DNAを有する細胞に被検化合物を接触させ る工程
(b)該細胞における〔2〕に記載のタンパク質をコードする DNAの発現レベルを測定す る工程
(c)被検化合物を接触させて ヽな 、場合と比較して、該 DNAの発現レベルを減少さ せる化合物を選択する工程
〔7〕 以下の (a)〜 (c)の工程を含む、避妊薬の候補ィ匕合物のスクリーニング方法。
(a)〔2〕に記載のタンパク質をコードする DNAを有する非ヒト動物に被検化合物を投 与する工程
(b)該非ヒト動物における〔2〕に記載のタンパク質をコードする DNAの発現レベルを 測定する工程 (c)被検化合物を投与して ヽな 、場合と比較して、該 DNAの発現レベルを減少させ る化合物を選択する工程
〔8〕 以下の (a)〜 (d)の工程を含む、避妊薬の候補ィ匕合物のスクリーニング方法。
(a)〔2〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポ一 ター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または細胞抽出液を提供するェ 程
(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定 する工程
(d)被検化合物を接触させて!/、な!、場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レ ベルを減少させる化合物を選択する工程
〔9〕 以下の (a)〜 (c)の工程を含む、避妊薬の候補ィ匕合物のスクリーニング方法。
(a)〔5〕〜〔8〕に記載の方法の 1または複数の組み合わせによって選択されたィ匕合 物を、雄性動物の精子に接触させる工程
(b)該精子の受精能を確認する工程
(c)該精子の受精能を阻害する化合物を選択する工程
〔10〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、避妊薬の候補ィ匕合物のスクリーニング方法。
(a)〔5〕〜〔8〕に記載の方法の 1または複数の組み合わせによって選択されたィ匕合 物を、非ヒト雄性動物に投与する工程
(b)該非ヒト雄性動物の精子の受精能を確認する工程
(c)該非ヒト雄性動物の精子の受精能を阻害する化合物を選択する工程
〔11〕 〔2〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の機能が人為的に抑制された非 ヒト動物。
〔12〕 〔2〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の機能が人為的に抑制された非 ヒト動物細胞。
〔13〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、不妊治療薬の候補化合物のスクリーニング 方法。
(a)被検化合物を〔11〕に記載の非ヒト動物に投与する工程 (b)被検化合物が〔2〕に記載のタンパク質の機能を代替している力否かを判定する 工程
(c)被検化合物を投与して!ヽな ヽ場合と比較して、該タンパク質の機能を代替する化 合物を選択する工程
〔14〕 〔2〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程を含む 、不妊の検査方法。
〔15〕 〔2〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子領域における変異を検出するェ 程を含む、不妊の検査方法。
〔16〕 〔2〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子領域にハイブリダィズし、少なくと も 15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、〔14〕または〔15〕に記載 の方法に用いるための検査薬。
〔17〕 〔2〕に記載のタンパク質またはその断片を抗原とする抗体を含む、〔14〕に記 載の方法に用いるための検査薬。
図面の簡単な説明
[図 1] (A) OBF13抗体を用いた精子の先体反応前後の蛍光免疫染色の写真である。 上力も順に、 1.新鮮精子、 2.凍結融解して膜の透過性を上げたもの、 3.培養下で 先体反応を起したもの、 4.培養下で先体反応を起したもの。（B)卵透明帯通過後の OBF13抗体を用いた蛍光免疫染色の写真である。
[図 2]へキスト 33342を取り込ませた裸卵を用いた、受精阻害実験の結果を示す写真 およびグラフである。
[図 3A]OBF13モノクローナル抗体を用いた、マウス精子の二次元電気泳動によるゥ エスタンプロットの結果を示す写真である。
[図 3B]同定した OBF13抗原の一次構造を示す図である。図中の、下線はシグナル配 列を示し、囲み線は Immunoglobulin-likeドメインを示し、点線は細胞膜貫通領域を示 す。また、 182残基目のシスティンと 233残基目のシスティン間ではジスルフイド結合 が予想される。
[図 3C]マウス OBFに対するポリクローナル抗体を用いた各組織のウェスタンブロット の結果を示す写真である。 [図 3D]OBFタンパク質の一次構造図を示すものである。
[図 4] (A) 0BF遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子に置き換えたターゲテイングべクタ 一の構造を示す図である。（B) - (D)サザンブロット、ノーザンブロット、ウェスタンブロ ットによる、マウス個体で相同組換えの有無の評価の結果を示す写真である。
[図 5] (A) OBFノックアウト雄および雌マウスの平均産仔数のグラフである。 (B) OBFノ ックアウト精子の体外受精（IVF)の結果を示すグラフである。（C) OBFノックアウト精 子の卵子との融合解析の結果を示すグラフである。 (D) OBFノックアウト精子と CD9ノ ックアウト卵子を用いた体外受精、および融合解析の結果を示す写真である。
[図 6] (A)マウスの OBF -/-精子とハムスター裸卵の融合解析の結果を示す写真で ある。（B)ヒト OBFポリクローナル抗体を用いた、ヒト精子とハムスター裸卵の融合解 祈の結果を示す写真およびグラフである。
[図 7]OBFノックアウトマウスに OBF遺伝子の cDNA配列を組み込んだマウスで受精能 が回復することを示した写真である。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明は、精子と卵子との結合または融合を阻害する活性を有する抗体であって、 精子と卵子との結合または融合に必須な精子膜タンパク質 OBFまたはその断片を抗 原とする抗体 (OBF13抗体を除く）を提供する。
また、本発明は、 OBFまたはその断片を抗原とする抗体 (OBF13抗体を含む)を有 効成分として含有する避妊薬、 OBFまたはその断片を有効成分として含有する避妊 ワクチンを提供する。
[0010] 本発明の OBF抗原としては、配列番号： 1、 3、 5のいずれかに記載の塩基配列を含 む DNAよりコードされるタンパク質またはその断片、配列番号： 2、 4、 6のいずれかに 記載のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその断片、配列番号： 2、 4、 6のいずれ かに記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およ び Zまたは付加したアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号： 2、 4、 6のい ずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質と機能的に同等なタンパク質または その断片、または、配列番号： 1、 3、 5のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAとス トリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする天然由来の DNAよりコードされるタンパク 質であって、配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質 と機能的に同等なタンパク質またはその断片が挙げられる。
[0011] 上記の「配列番号： 2、 4、 6の 、ずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質」とし ては、配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、およ び配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む融 合タンパク質が挙げられる。
[0012] また、上記の「配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若し くは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を含む タンパク質」としては、配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1 若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列か らなるタンパク質、および該タンパク質を含む融合タンパク質が挙げられる。置換、欠 失、挿入、および Zまたは付カ卩は自然界において生じたものであり、置換、欠失、挿 入、および Zまたは付加されるアミノ酸数は、通常、 30アミノ酸以内であり、好ましくは 15アミノ酸以内であり、より好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 3アミノ酸以内）であり、さ らに好ましくは 2アミノ酸以内である。
[0013] 本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質やペプチドとしては、融合タ ンパク質が本発明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質である限り、特に限定さ れない。本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、 FLA G (Hopp, T. P. et al.， BioTechnology (1988) 6, 1204- 1210 )、 6個の His (ヒスチジン） 残基からなる 6 X His、 10 X His等の公知のペプチドを使用することができる。また、本 発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、 GST (ダルタ チオン S トランスフェラーゼ)等が挙げられる。
[0014] ここで「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質力 配列番号： 2、 4、 6のいずれ 力に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の生物学的機能、生化学的機能 を有することを指す。該生物学的機能としては、精子と卵子との結合または融合に必 須な機能が挙げられる。対象となるタンパク質が、配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記 載のアミノ酸配列力 なるタンパク質と同様の性質を有する力否かは、例えば、対象 となるタンパク質に対する抗体を得て、その抗体が精子と卵子との結合または融合を 阻害する力否かで判定することができる。
[0015] 配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質と機能的に 同等なタンパク質は、配列番号：2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタ ンパク質と共通または類似の構造的特徴を有する。構造的特徴としては、例えば、シ グナル配列、細胞外領域、細胞膜貫通領域、および細胞内領域を有する点、細胞外 領域には 1つの Ig-like (Immunoglobulin-like)ドメインを有する点、また、 Ig-likeドメイ ン内に N結合型糖鎖付加配列が存在する点、などが挙げられる。
[0016] OBFタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNAを単離するためのハ イブリダィゼーシヨンの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイプリ ダイゼーシヨンの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ス トリンジェントな条件とは、ハイブリダィゼーシヨン後の洗浄において、例えば 42°C、 5 X SSC、 0.1%SDSの条件であり、好ましくは 50°C、 5 X SSC、 0.1%SDSの条件である。 より好ましいハイブリダィゼーシヨンの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げら れる。高ストリンジヱントな条件とは、例えば 65°C、 0.1 X SSC及び 0.1%SDSの条件で ある。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有する DNAが効率的 に得られることが期待できる。但し、ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーに影 響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれ ら要素を適宜選択することで同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。
[0017] また、 OBFタンパク質をコードする DNA (配列番号： 1、 3、 5)の配列情報を基に合 成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)法を 利用して、 OBFタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNAを単離する ことも可能である。
[0018] これらハイブリダィゼーシヨン技術や遺伝子増幅技術により単離される DNAがコード する、 OBFタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、 OBFタンパク質とァミノ 酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、配列番号： 2、 4、 6のいずれ かに記載のアミノ酸配列に対して、通常、少なくとも 50%以上の同一性、好ましくは 75 %以上の同一性、さらに好ましくは 85%以上の同一性、さらに好ましくは 95%以上の 同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 Karlin and Altschulによるアル ゴリズム BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定するこ とができる。このアルゴリズムに基づいて、 BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラム が開発されている (Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403- 410, 1990)。 BLASTに基づい て BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータ一はたとえば score = 1 00、 wordlength = 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによってアミノ酸配列を 解析する場合には、パラメーターはたとえば score = 50、 wordlength = 3とする。 BLAS Tと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータ 一を用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である (http：〃 www.ncbi.nlm.n ih.gov.)0
本発明の抗原の断片としては、例えば、 Ig-likeドメイン (例えばマウス OBFのアミノ酸 167〜253番目）が挙げられるがこれに限定されない。
[0019] 本発明の抗体は、 OBFタンパク質を認識し、精子と卵子との結合または融合を阻害 することができれば特に限定されず、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗 体であってもよい。また、本発明の抗体として、マウス抗体、ラット抗体、ゥサギ抗体、 ヒッジ抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる 。さらに本発明の抗体として、低分子化抗体等を用いることもできる。
[0020] ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製す ることができる。モノクローナル抗体を産生するノ、イブリドーマは、基本的には公知技 術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発 現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のス クリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞 (ノヽイブリドーマ）をスクリーニン グすることによって作製できる。免疫される動物としては、例えば、マウス、ラット、ゥサ ギ、ヒッジ、サル、などの哺乳動物を用いることができる。抗原の調製は公知の方法、 例えばバキュロウィルスを用いた方法 (W098/46777など）等に準じて行うことができ る。免疫原として、バキュロウィルス膜上に発現した OBFを用いる場合には、免疫動 物として gp64トランスジエニックマウスを用いることができる（日本特許出願番号特願 2 002-180351,特願 2002- 164834)。 [0021] ハイプリドーマの作製は、たとえば、ミルスティンらの方法（Kohler. G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46 )等に準じて行うことができる。抗原の免疫原 性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を 行えばよい。
[0022] また、抗体遺伝子をハイプリドーマ力 クローユングし、適当なベクターに組み込ん で、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗 体を用いることができる（例えば、 Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THER APEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MA CMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。具体的には、ハイプリドーマの mRNAか ら逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 (V領域)の cDNAを合成する。目的とする抗 体の V領域をコードする DNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域 (C領域)を コードする DNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体の V領域をコ ードする DNAを、抗体 C領域の DNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現 制御領域、例えば、ェンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現べ クタ一に組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発 現させることができる。
[0023] 本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改 変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ (chimeric)抗体、ヒト化 (humanized)抗体 などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。 キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒ ト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコード する DNAをヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組 み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
[0024] ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえば マウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region)をヒト抗 体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知ら れている。具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framewor k region ;FR)を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部 分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。得ら れた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DNAと連結し、次 、で発現ベクターに組み 込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 E P 239400、国際特許出願公開番号 WO 96/02576参照）。 CDRを介して連結されるヒ ト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択され る。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成す るように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよ 、 (Sato, K.e t al, Cancer Res. (1993) 53, 851—856)。
[0025] また、ヒト抗体の取得方法も知られて 、る。例えば、ヒトリンパ球を in vitroで所望の 抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞 、例えば U266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもで きる（特公平 1-59878参照)。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトラ ンスジエニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することがで きる（国際特許出願公開番号 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94 /25585, WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、 パン-ングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領 域を一本鎖抗体 (scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現さ せ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子 を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定す ることができる。抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を適 当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は周知で あり、 WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
[0026] 抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当 な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として 使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞とし ては、（1)哺乳類細胞、例えば、 CHO, COS,ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney ) , HeLa, Vero, (2)両生類細胞、例えば、アフリカッメガエル卵母細胞、あるいは (3) 昆虫細胞、例えば、 sl9, sf21, Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコティア ナ（Nicotiana)属、例えば-コティアナ'タパカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞が 知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッ カロミセス (Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomyces ser evisiae)、糸状菌、例えば、ァスペルギルス（Aspergillus)属、例えばアスペスギルス. 二ガー (Aspergillus niger)などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞 を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌 . coli)、枯草菌が知られている 。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された 細胞を in vitroで培養することにより抗体が得られる。
[0027] また、抗体は OBFタンパク質に結合し、 OBFタンパク質の機能を阻害するかぎり、低 分子化抗体であってもよい。低分子化抗体は、全長抗体 (whole antibody,例えば wh ole IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれ ば特に限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定 されな 、が、重鎖可変領域 (VH)又は Z及び軽鎖可変領域 (VL)を含んで 、ることが 好ましい。 VHまたは VLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び Z又は挿入がされ ていてもよい。さらに抗原への結合能を有する限り、 VH又は/及び VLの一部を欠損さ せてもよい。又、可変領域はキメラ化ゃヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例と しては、例えば、 Fab, Fab'、 F(ab')2、 Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗 体の具体例としては、例えば、 Fab、 Fab'、 F(ab')2、 Fv、 scFv (single chain Fv)、 Diabo dy、 sc(Fv)2 (single chain (Fv)2)などを挙げることができる。
[0028] ここで、 「Fv」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含 む。「Fv」断片は 1つの VHおよび VLが非共有結合により強く連結されたダイマー (VH -VLダイマー）である。各可変領域の 3つの相補鎖決定領域（complementarity deter mining region ; CDR)が相互作用し、 VH-VLダイマーの表面に抗原結合部位を形成 する。 6つの CDRが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、 1つの可変 領域 (または、抗原に特異的な 3つの CDRのみを含む Fvの半分)であっても、全結合 部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
[0029] scFvには、抗体の VHおよび VLが含まれ、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中 に存在する。一般に、 Fvはさらに VHおよび VLの間にペプチドリンカ一を含んでおり、 これにより scFvは、抗原結合のために必要な構造を形成することができる（scFvの総 説については、 Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal AntibodiesJVol.113 (Ro senburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp.269- 315, 1994)を参照)。本 発明におけるリンカ一は、その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するも のでなければ特に限定されな！、。
[0030] scFvをコードする DNAは、前記抗体の H鎖または H鎖 V領域をコードする DNA、およ び L鎖または L鎖 V領域をコードする DNAのうち、それらの配列のうちの全部又は所望 のアミノ酸配列をコードする DNA部分を铸型とし、その両端を規定するプライマー対 を用いて PCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカ一部分をコードする DNA 、およびその両端が各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合 わせて増幅することにより得られる。また、ー且 scFvをコードする DNAが作製されると 、それらを含有する発現ベクター、および該発現べクタ一により形質転換された宿主 を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従って scF Vを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現さ せ、宿主により産生させることができる。
[0031] Diabodyは、遺伝子融合により構築された二価 (bivalent)の抗体断片を指す (Holliger
P et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、 EP404,097号、 W093/111 61号等)。 Diabodyは、 2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、通常、ポリ ペプチド鎖は各々、同じ鎖中で VL及び VH力 互いに結合できない位に短い、例え ば、 5残基程度のリンカ一により結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされ る VLと VHとは、その間のリンカ一が短いため単鎖可変領域フラグメントを形成するこ とが出来ず二量体を形成するため、 Diabodyは 2つの抗原結合部位を有することとな る。
[0032] sc(Fv)2は、 2つの VH及び 2つの VLをリンカ一等で結合して一本鎖にした低分子化 抗体である（Hudson et al、 J Immunol. Methods 1999 ; 231 : 177- 189)。 sc(Fv)2は、例 えば、 scFvをリンカ一で結ぶことによって作製できる。 2つの VHと 2つの VLの順序は特 に限定されず、どのような順序で並べられて 、てもよ 、。 [0033] 抗体の可変領域を結合するリンカ一としては、遺伝子工学により導入し得る任意の ペプチドリンカ一、又は合成化合物リンカ一（例えば、 Protein Engineering, 9(3), 299 -305, 1996参照）に開示されるリンカ一等を用いることができる。ペプチドリンカ一の 長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、 通常、 1〜100アミノ酸、好ましくは 3〜50アミノ酸、更に好ましくは 5〜30アミノ酸、特に 好ましくは 12〜18アミノ酸 (例えば、 15アミノ酸)である。但し、ペプチドリンカ一の長さ や配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
[0034] 合成化学物リンカ一 (ィ匕学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋 剤、例えば N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS)、ジスクシンイミジルスべレート（DSS)、ビ ス（スルホスクシンィミジル)スべレート（BS3)、ジチォビス（スクシンィミジルプロビオネ ート）（DSP)、ジチオピス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP)、エチレン グリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS)、エチレングリコールビス（スルホ スクシンイミジルスクシネート）（スルホー EGS)、ジスクシンィミジル酒石酸塩（DST)、 ジスルホスクシンィミジル酒石酸塩 (スルホー DST)、ビス [2- (スクシンイミドォキシカ ルポ-ルォキシ）ェチル]スルホン（BSOCOES)、ビス [2- (スルホスクシンイミドォキシ カルボ-ルォキシ）ェチル]スルホン (スルホ- BSOCOES)などであり、これらの架橋剤 は市販されている。 4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、 3つのリンカ一 が必要となるが、全て同じリンカ一を用いてもよいし、異なるリンカ一を用いてもよい。
[0035] 抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合した抗体 を使用することもできる。又、抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシ ン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能である。このような抗体修飾物は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修 飾方法はこの分野にお!、て、すでに確立されて!、る。
[0036] 本発明で使用される抗体は二重特異性抗体 (bispecific antibody)であってもよい。
二重特異性抗体は OBFタンパク質分子上の異なるェピトープを認識する抗原結合部 位を有する二重特性抗体であってもよ 、し、一方の抗原結合部位が OBFタンパク質 を認識し、他方の抗原結合部位が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の 細胞障害性物質を認識してもよ!、。二重特異性抗体は 2種類の抗体の HL対を結合 させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するノ、イブリドーマを 融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝 子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
[0037] 又、本発明にお 、ては、糖鎖を改変した抗体などを用いることも可能である。抗体 の糖鎖改変技術は既に知られている（例えば、 WO00/61739, WO02/31140など）。 本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
[0038] 前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている 公知の方法により精製することができる。例えば、プロテイン Aカラムなどのァフィニテ ィーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選 択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる (Ant¾odies A Labor atory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cola Spring Harbor Laboratory, 1988)。
[0039] 抗体の抗原結合活性 (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, C old Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手段を使用することができる 。例えば、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法)、 EIA (酵素免疫測定法)、 RIA (放射免 疫測定法)あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
[0040] 特定の分子が OBFタンパク質に結合するか否かは、公知の方法により測定すること ができる。公知の方法としては、例えば、免疫沈降法、ウェストウェスタンブロッテイン グ法、 ELISA、 EIA、 RIA,蛍光免疫法、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセ ンサーを用いた方法、などが挙げられる。
[0041] 本発明の抗体は、避妊薬として利用できる。抗体の投与を行う対象は特に制限は ないが、例えば、ヒト、愛玩動物、家畜、野外動物、鳥類を挙げることができる。
本発明の避妊薬は、経口、非経口投与のいずれでも可能である力 好ましくは非経 口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型 、経膣投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉 内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる 。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量として は、例えば、一回につき体重 lkgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲で選ぶことが可 能である。あるいは、例えば、患者あたり 0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を 選ぶことができる。
[0042] 本発明の抗体を避妊薬として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化する ことが可能である。このような治療目的で使用される本発明の抗体を含む避妊薬は、 必要に応じ、それらに対して不活性な適当な医薬的に許容される担体、媒体等と混 和して製剤化することができる。例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸 化防止剤 (ァスコルビン酸等)、緩衝剤 (リン酸、クェン酸、他の有機酸等)、防腐剤、界 面活性剤 (PEG、 Tween等)、キレート剤 (EDTA等)、結合剤等を挙げることができる。ま た、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等 の蛋白質、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多 糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マン-トールやソルビトール等の糖アルコールを 含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖や その他の補助薬を含む等張液、例えば、 D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マン-ト ール、塩ィ匕ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール 等)、ポリアルコール (プロピレングリコール、 PEG等)、非イオン性界面活性剤 (ポリソル ペート 80、 HCO- 50)等と併用してもよい。
[0043] 本発明は、 OBF抗原 (OBFまたはその断片）を有効成分として含有する避妊ワクチ ンを提供するものである。本発明の避妊ワクチンにおける OBF抗原は、天然のタンパ ク質の他、公知の遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製するこ とができる。また、本発明の避妊ワクチンにおける OBF抗原は、細胞に発現させた状 態でも調製することができる。本発明の避妊ワクチンにおける OBF抗原の由来する生 物種に特に制限はなぐ避妊ワクチンの投与対象の生物種に応じて適宜選択可能で ある。
[0044] 天然のタンパク質は、例えば OBFタンパク質が発現して 、る精巣、精子等の組織の 抽出液に対し、 OBFタンパク質に対する抗体を用いたァフィユティークロマトグラフィ 一を用いる方法により調製することが可能である。
[0045] 一方、組換えタンパク質は、当業者においては公知の方法により、例えば OBFタン ノ ク質またはその断片として調製することができる。 OBFタンパク質またはその断片は 、例えば、 OBFタンパク質をコードする DNAを、適当な発現ベクターに組み込み、こ れを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン 交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは OBFタンパク質に対する抗 体をカラムに固定したァフィユティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さ らにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である
[0046] また、 OBFタンパク質をグルタチオン S-トランスフェラーゼ蛋白質との融合タンパク 質として、ある 、はヒスチジンを複数付加させた OBFタンパク質として宿主細胞 (例え ば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた OBFタンパク質 はダルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合タ ンパク質を作製するには、例えば、 OBFタンパク質をコードする DNAと他のタンパク質 やペプチドをコードする DNAをフレームが一致するように連結してこれを発現べクタ 一に導入し、宿主で発現させればよい。
[0047] 上記ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（ 例えば、 JM109、 DH5 a、 HB101、 XLlBlue)等で大量に増幅させ大量調製するため に、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺 伝子 (例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラ ムフエ-コール)により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば特に制限はない
。ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript、 pC R-Script等が挙げられる。また、 cDNAのサブクローユング、切り出しを目的とした場合 、上記ベクターの他に、例えば、 pGEM- T、 pDIRECT、 pT7等が挙げられる。 OBFタン パク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクター が有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は 、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主を JM109、 DH5 «、 HB101、 XLl-Blue等の大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現で きるようなプロモーター、例えば、 lacZプロモーター（Wardら， Nature (1989) 341, 544- 546 ; FASEB J. (1992) 6, 2422- 2427)、 araBプロモーター（Betterら， Science (1988) 2 40, 1041-1043 )、または T7プロモーター等を持っていることが不可欠である。このよ うなベクターとしては、上記ベクターの他に PGEX-5X- 1 (フアルマシア社製）、「QIAex press system] (キアゲン社製）、 pEGFP、または pET等が挙げられる。
[0048] また、ベクターには、タンパク質分泌のためのシグナル配列が含まれて!/、てもよ!/、。
タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる 場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)を使用すれ ばよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロボレ ーシヨン法を用いて行うことができる。
[0049] 大腸菌以外にも、例えば、 OBFタンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳 動物由来の発現ベクター（例えば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、 pEGF- BOS (Nu cleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、 pEF、 pCDM8 )、昆虫細胞由来の発現べクタ 一 (例えば「Bac— to— BAC baculovairus expression system」 (ギブコ BRL社製)、 pBacP AK8)、植物由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウィルス由来の発現 ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw )、レトロウイルス由来の発現ベクター（例 えば、 pZIPneo)、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビ トロゲン社製）、 pNVll、 SP- Q01)、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、 pPL608、 pK ΤΗ50)等が挙げられる。
[0050] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（Mulliga nら， Nature (1979) 277, 108)、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1 αプロモーター（Mizu shimaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 CMVプロモーター等を持っていること が不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 (例えば、薬剤 (ネオマ イシン、 G418等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すればさらに好ましい 。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 pBK- CMV、 pOPRSV、 pOP13等が挙げられる。
[0051] また、 in vivoでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系 や植物を使用する産生系が挙げられる。この動物または植物に OBFタンパク質をコ ードする DNAを導入し、動物または植物の体内で OBFタンパク質を産生させ、回収 する。
[0052] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物として は、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェ- ック動物を用いることができる。
[0053] 例えば、 OBFタンパク質をコードする DNAを、ャギ βカゼインのような乳汁中に固有 に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次!ヽで 、この融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ移植す る。胚を受容したャギカ 生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳 汁から、 OBFタンパク質を得ることができる。トランスジエニックャギカも産生されるタン ノ ク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使 用してもよい（Ebert, K.M. et al.， Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。
[0054] また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、 OBF タンパク質をコードする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることによ り、このカイコの体液から OBFタンパク質を得ることができる（Susumu, M. et al.， Natur e (1985) 315, 592—594)。
[0055] さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場 合、 OBFタンパク質をコードする DNAを植物発現用ベクター、例えば pMON 530に揷 入し、このベクターをァグロバタテリゥム'ッメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens )のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ 'タパ力 ム（Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの葉より OBFタンパク質を得ることができ る（Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131—138)。
[0056] これにより得られた OBFタンパク質は、宿主細胞内または細胞外 (培地等)から単離 し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離 、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すれば よぐ何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限 外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル 電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタン パク質を分離、精製することができる。
[0057] なお、本発明の OBFタンパク質を精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を 作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもでき る。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドべプチ ダーゼ、プロテインキナーゼ、ダルコシダーゼ等が用いられる。
[0058] 本発明のワクチン製剤には、医薬上許容される担体を添加してもよい。ここで医薬 上許容される担体とは、それ自体は抗原 (または免疫原性)とは異なる物質であって 、ワクチン投与において抗原とともに投与可能な医薬上許容される材料を意味する。 例えば、アジュバント、保存剤、安定剤等のワクチン添加物が例示できる力 これらに 限定されるものではない。アジュバントとしてはヒト用ワクチンに認可されたアジュバン トとして、リン酸アルミニウム、水酸ィ匕アルミニウム、 MF59などを使用することが出来 るが、これらに限定されるものではない。
[0059] 安定剤としては、 0.2%程度のゲラチンゃデキストラン、 0.1-1.0%のグルタミン酸ナトリ ゥム、あるいは約 5%の乳糖や約 2%のソルビトールなどを使用することが出来る力 これ らに限定されるものではない。保存剤としては、 0.01%程度のチメロサール、 0.1%程度 のベータプロピオノラタトンや、 0.5%程度のフエノキシエタノールなどを使用することが 出来るが、これらに限定されるものではない。
[0060] 注射剤を調製する場合、必要により、 pH調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を 添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に 収納後、凍結乾燥等によって、固形製剤として、用時調製の製剤としてもよい。また、 一投与量を容器に収納してもよぐまた、投与量を同一の容器に収納してもよい。
[0061] 本発明のワクチンの接種法としては、公知の種々の方法が使用できる。接種法とし ては皮下注射、筋肉内注射、経鼻接種、経口接種、経皮接種、経膣接種等が例示 できる。
どの接種方法が適切かはワクチン抗原の種類、剤型、抗体発現時期、抗体持続期 間、接種対象者の年齢、等を考慮して決定される。接種方法は専門家による臨床試 験を通じて最終決定され、これらの方法は同業者にとって公知である。一回接種用 製品でも複数回接種用製品でも良い。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法な どにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能であ る。 [0062] 本発明の OBFタンパク質またはその断片は、精子と卵子との結合または融合に関 連する因子として使用することができる。
精子と卵子との結合または融合に関連する因子としての使用としては、以下のよう な例が挙げられる力 これに限定されない。例えば、体外受精の系において、 OBFタ ンパク質またはその断片を、 OBF欠損又は機能不全が原因である不妊男性の精子 に加え、妊孕性を回復させることができる。逆に、 OBFタンパク質またはその断片を、 直接膣内に投与し、精子上の OBFタンパク質と卵子上の OBFタンパク結合分子との 結合を拮抗阻害させ、避妊作用を誘導することができる。
[0063] 本発明者らは、抗体による OBFタンパク質の阻害、および OBFタンパク質の発現抑 制により、受精が阻害されることを見出した。この結果は、 OBFタンパク質を標的とし た避妊薬のスクリーニングが可能であることを示す。
[0064] 本発明のスクリーニング方法に用いる被検化合物は特に限定されず、例えば、天 然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチドなどの単一化合 物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、抗体ライブラリー、 細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等 を挙げることができる。
[0065] 本発明のスクリーニング方法の第一の態様は、 OBFタンパク質またはその断片と結 合する化合物のスクリーニングに関するものである。このスクリーニングにお 、ては、 まず、 OBFタンパク質またはその断片に被検化合物を接触させる。次いで、該 OBFタ ンパク質またはその断片と被検化合物との結合を検出する。次いで、該 OBFタンパク 質またはその断片と結合する被検化合物を選択する。この方法によって、単離された 化合物は、避妊薬の候補化合物になりうる。また、後述のスクリーニング方法の被検 化合物として使用することもできる。
[0066] OBFタンパク質を用いて、これに結合するタンパク質をスクリーニングする方法とし ては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニン グは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うこと ができる。 OBFタンパク質をコードする DNAを、 pSV2neo, pcDNA I, pCD8などの外 来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させ る。発現に用いるプロモーターとしては SV40 early promoter (Rigby In Williamson (e d.)， Genetic Engineering, Vol.3. Academic Press, London, p.83- 141(1982)), EF- 1 promoter (Kimら Gene 91 , p.217-223 (1990)), CAG promoter (Niwa et al. Gene 1 08, p.193— 200 (1991)), RSV LTR promoter (Cullen Methods in Enzymology 152, p.6 84-704 (1987), SR a promoter (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8, p.466 (1988)), CM V immediate early promoter (Seed and Aruifo Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, p.3365 -3369 (1987》， SV40 late promoter (Gheysen and Fiers J. Mol. Appl. Genet. 1 , p.38 5-394 (1982)), Adenovirus late promoter (Kaulman et al. Mol. Cell. Biol. 9, p. 946 ( 1989)), HSV TK promoter等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用い てもよい。
[0067] 動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクト口 ポレーシヨン法 (Chu, G. et al. Nucl. Acid Res. 15, 1311-1326 (1987》、リン酸カルシ ゥム法 (Chen, C and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987))、 DEAEデ キストラン法 (Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717 (1984); Sussman, D. J. and Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4, 1642-1643 (1985》、リポフエクチン法（Derij ard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B. T. et al. Nature Genetics 5, 22—30 (199 3); Rabindran, S. K. et al. Science 259, 230-234 (1993》等の方法があるが、いずれ の方法によってもよい。
[0068] 特異性の明ら力となって 、るモノクローナル抗体の認識部位 (ェピトープ）を OBFタ ンパク質の N末または C末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有 する融合タンパク質として OBFタンパク質を発現させることができる。用いるェピトープ —抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学 13, 85-90 ( 1995))。マルチクローユングサイトを介して、 13 ガラクトシダーゼ、マルトース結合タ ンパク質、ダルタチオン S-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質 (GFP)などとの融 合タンパク質を発現することができるベクターが市販されている。また、融合タンパク 質にすることにより OBFタンパク質の性質をできるだけ変化させないようにするために 数個から十数個のアミノ酸力もなる小さなェピトープ部分のみを導入して、融合タン パク質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン (His-tag)、インフル ェンザ凝集素 HA、ヒト c- myc、 FLAG, Vesicular stomatitisウィルス糖タンパク質 (VS V- GP)、 T7 gene 10タンパク質（T7- tag)、ヒト単純へルぺスウィルス糖タンパク質（HS V-tag)、 E-tag (モノクローナルファージ上のェピトープ）などのェピトープとそれを認 識するモノクローナル抗体を、 OBFタンパク質に結合するタンパク質のスクリーニング のためのェピトーブー抗体系として利用できる（実験医学 13, 85-90 (1995))。
[0069] 免疫沈降にお!、ては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細 胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は OBFタン パク質、それと結合能を有するタンパク質、および抗体力もなる。上記ェピトープに対 する抗体を用いる以外に、 OBFタンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うこ とも可能である。 OBFタンパク質に対する抗体は、例えば、 OBFタンパク質をコードす る DNAを適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたタ ンパク質を精製し、これをゥサギやマウス、ラット、ャギ、 -ヮトリなどに免疫することで 調製することができる。また、合成した OBFタンパク質の部分ペプチドを上記の動物 に免疫することによって調製することもできる。
[0070] 免疫複合体は、例えば、抗体がマウス IgG抗体であれば、 Protein A Sepharoseや P rotein G Sepharoseを用いて沈降させることができる。また、 OBFタンパク質を、例えば 、 GSTなどのェピトープとの融合タンパク質として調製した場合には、ダルタチオン- S epharose 4Bなどのこれらェピトープに特異的に結合する物質を利用して、 OBFタン ノ^質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
[0071] 免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Harlow,E. and Lane, D.: Ant ibodies, pp.5丄丄一 552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988) )記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
[0072] 免疫沈降されたタンパク質の解析には SDS-PAGEが一般的であり、適当な濃度の ゲルを用いることでタンパク質の分子量により結合して 、たタンパク質を解析すること ができる。また、この際、一般的には OBFタンパク質に結合したタンパク質は、クマシ 一染色や銀染色といったタンパク質の通常の染色法では検出することは困難である ので、放射性同位元素である35 S-メチォニンや35 S-システィンを含んだ培養液で細胞 を培養し、該細胞内のタンパク質を標識して、これを検出することで検出感度を向上 させることができる。タンパク質の分子量が判明すれば直接 SDS-ポリアクリルアミドゲ ルから目的のタンパク質を精製し、その配列を決定することもできる。
[0073] また、 OBFタンパク質またはその断片に結合するタンパク質を単離する方法として は、例えば、 Skolnikらの方法（Skolnik, E. Y. et al.Cell (1991) 65, 83- 90)を用いて 行うことができる。すなわち、 OBFタンパク質またはその断片と結合すると予想される タンパク質を発現している細胞、組織よりファージベクター（ gtll, ZAPなど）を用い た cDNAライブラリーを作製し、これを LB-ァガロース上で発現させフィルターに発現さ せたタンパク質またはその断片を固定し、精製して標識した OBFタンパク質またはそ の断片と上記フィルターとを反応させ、 OBFタンパク質またはその断片と結合したタン ノ ク質を発現するプラークを標識により検出すればょ 、。 OBFタンパク質またはその 断片を標識する方法としては、ピオチンとアビジンの結合性を利用する方法、 OBFタ ンパク質もしくはその断片又は OBFタンパク質もしくはその断片に融合したタンパク質 (例えば GSTなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利 用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
[0074] また、本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、細胞を用いた 2-ノヽイブリ ッドシステム（Fields, S., and Sternglanz, R., Trends. Genet. (1994) 10, 286—292、 Dalt on S, and Treisman R (1992) Characterization of SAP- 1, a protein recruited by seru m response factor to the c- fos serum response element. Cell 68, 597-612、「MATC HMARKER Two-Hybrid System」，「Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit J , TMATCHMAKER One-Hybrid SystemJ (いずれもクロンテック社製)、「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」 (ストラタジーン社製)）を用いて行う方法が挙げられる。
[0075] 2-ハイブリッドシステムにお 、ては、 OBFタンパク質またはその断片（部分ペプチド） を SRF DNA結合領域または GAL4 DNA結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現 させ、 OBFタンパク質またはその断片と結合するタンパク質を発現して 、ることが予想 される細胞より、 VP16または GAL4転写活性ィ匕領域と融合する形で発現するような cD NAライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンか らライブラリー由来 cDNAを単離する（酵母細胞内で OBFタンパク質と結合するタンパ ク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性ィ匕され、陽性のクロー ンが確認できる)。単離した cDNAを大腸菌に導入して発現させることにより、該 cDNA 力 Sコードするタンパク質を得ることができる。これにより OBFタンパク質に結合するタン ノ ク質またはその遺伝子を調製することが可能である。
[0076] 2-ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、 HIS 3遺伝子の他、 Ade2遺伝子、 LacZ遺伝子、 CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、 PAI -1 (Plasminogen activator inhibitor typel)遺伝子等が挙げられるが、これらに制限さ れない。 2ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使つ て行うことちできる。
[0077] OBFタンパク質またはその断片と結合する化合物のスクリーニングは、ァフィ-ティ クロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、 OBFタンパク質またはその断片 をァフィユティーカラムの担体に固定し、ここに OBFタンパク質またはその断片と結合 するタンパク質を発現していることが予想される被検化合物を適用する。この場合の 被検化合物としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検化合物 を適用した後、カラムを洗浄し、 OBFタンパク質またはその断片に結合したタンパク質 を調製することができる。
[0078] 得られたタンパク質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴ DNAを合成し 、該 DNAをプローブとして cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、該タンパ ク質をコードする DNAを得ることができる。
[0079] また、タンパク質に限らず、 OBFタンパク質またはその断片に結合する化合物を単 離する方法としては、例えば、固定した OBFタンパク質またはその断片に、合成化合 物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用 させ、 OBFタンパク質またはその断片に結合する分子をスクリーニングする方法や、 コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（ Wnghton Nし； Farrell FX;し hang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS;Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the p rotein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458— 6 4、 Verdine GL., The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 pi 1—13、 Hogan JC Jr., Directed comDinatorial chemistry. Nature (ENGLA ND) Nov 7 1996, 384 pi 7-9)が当業者に公知である。
[0080] 本発明にお 、て、結合したィ匕合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン 共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現 象を利用したバイオセンサーは、 OBFタンパク質またはその断片と被検化合物との間 の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなぐ表面プラズモン共鳴 シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えば BIAcore、 Pharmacia 製)。
[0081] 本発明におけるスクリーニング方法の別の態様は、 OBFタンパク質をコードする DN Aの発現レベルを減少させる化合物のスクリーニングに関するものである。 OBFタンパ ク質をコードする DNAの発現レベルを減少させる化合物は避妊薬の候補ィ匕合物とな りうる。
[0082] このスクリーニングにおいては、まず、 OBFタンパク質をコードする DNAを有する細 胞に被検化合物を接触させる。 OBFタンパク質をコードする DNAを有する細胞 (ヒト細 胞を含む）としては、精子、精子細胞、筋細胞が例示できる。このような細胞としては、 マウスにおいては精子及び精子細胞、ヒトにおいては精子、精子細胞及び筋細胞が 挙げられる。また、本発明において「接触」は、例えば、細胞の培養液に被検化合物 を添加することにより行うことができる。このスクリーニングにおいては、次いで、該細 胞における OBFタンパク質をコードする DNAの発現レベルを測定し、被検化合物を 接触させて 、な 、場合と比較して、該 DNAの発現レベルを減少させる化合物を選択 する。
[0083] DNAの発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例え ば、 mRNAを定法に従って抽出し、この mRNAを铸型としたノーザンハイブリダィゼー シヨン法、または RT-PCR法を実施することによって DNAの発現レベルの測定を行うこ とができる。さらに、 DNAアレイ技術を用いて、 DNAの発現レベルを測定することも可 能である。また、 OBFタンパク質を含む画分を定法に従って回収し、該 OBFタンパク 質の発現を SDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベル の測定を行うこともできる。また、 OBFタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブ ロッテイング法、ドットブロッテイング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法 (ELISA)、 および免疫蛍光法などを実施し、該 OBFタンパク質の発現を検出することにより、遺 伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
[0084] OBFタンパク質をコードする DNAの発現レベルを減少させる化合物のスクリーニン グの別の態様としては、まず、 OBFタンパク質をコードする DNAを有する非ヒト動物に 被検化合物を投与する。 OBFタンパク質をコードする DNAを有する非ヒト動物として、 例えばマウス、ラット、ゥサギ、モルモット、ィヌ、ブタ、ネコ、サル、スナネズミ、ハムス ター等の実験動物を用いることができる力 これらに制限されるものではない。
[0085] 非ヒト動物への被検化合物の投与は、例えば、経口的または非経口的に行うことが できるが、それらに限定されない。被検化合物がタンパク質である場合には、例えば 、該タンパク質をコードする遺伝子を有するウィルスベクターを構築し、その感染力を 利用して、非ヒト動物に該遺伝子を導入することも可能である。
[0086] このスクリーニングにおいては、次いで、該非ヒト動物における OBFタンパク質をコ ードする DNAの発現レベルを測定し、被検化合物を投与して ヽな ヽ場合と比較して 、該 DNAの発現レベルを減少させる化合物を選択する。 DNAの発現レベルは、上述 の方法で測定することができる。
[0087] OBF遺伝子の発現レベルを減少させる化合物のスクリーニングは、レポーター遺伝 子を用いた系でも行うことができる。まず、 OBF遺伝子のプロモーター領域の下流に レポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または細胞抽出液を提供 する。ここで、「機能的に結合した」とは、 OBF遺伝子のプロモーター領域に転写因子 が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、 OBF遺伝子の プロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポータ 一遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成 する場合であっても、 OBF遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することに よって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合し た」の意に含まれる。
[0088] 上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限さ れず、例えば、当業者において一般的に使用される CAT遺伝子、 lacZ遺伝子、ルシ フェラーゼ遺伝子、 13 -ダルク口-ダーゼ遺伝子 (GUS)および GFP遺伝子等を挙げる ことができる。
[0089] このスクリーニングにお 、ては、次、で、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化 合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺 伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポ一 ター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例え ば、レポーター遺伝子が CAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフ ェ-コールのァセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを 測定することができる。レポーター遺伝子力 cZ遺伝子である場合には、該遺伝子発 現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフ ラ ーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍 光を検出することにより、また、 j8 -ダルク口-ダーゼ遺伝子 (GUS)である場合には、 該遺伝子発現産物の触媒作用による Glucuron (ICN社)の発光や 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリル- 18 -ダルク口-ド (X- Glue)の発色を検出することにより、さらに、 GFP遺 伝子である場合には、 GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺 伝子の発現レベルを測定することができる。
このスクリーニングにおいては、次いで、被検化合物を接触させていない場合と比 較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させる化合物を選択する。
[0090] 本発明におけるスクリーニング方法の別の態様は、まず、上述または後述のスクリ 一-ング方法の 1または複数の組み合わせによって選択された化合物を、ヒトを含む 雄性動物から採取した精子に接触させる。次いで、該精子の受精能を確認し、受精 能を阻害する化合物を選択する。受精能の確認は、例えば、該精子と同種の雌性動 物から採取した未受精卵との接触により受精が成立する力否か、また、該精子とハム スター裸卵が融合する力否か等を指標に行うことができる。動物の精子や未受精卵 の採取、精子と化合物との接触、精子と未受精卵との接触、受精の確認は、当業者 に周知の方法を用いて実施することができる。また、例えば、受精後におこる精子頭 部の膨ィ匕を観察したり、その後におこる前核形成の有無を位相差顕微鏡を用いて観 察したり、あるいはそのまま培養を続けて卵割を観察することで行うこともできる。
[0091] 本発明におけるスクリーニング方法のさらに別の態様は、まず、上述のスクリーニン グ方法の 1または複数の組み合わせによって選択されたィ匕合物を、非ヒト雄性動物に 投与する。次いで、該非ヒト雄性動物の精子の受精能を確認し、受精能を阻害する 化合物を選択する。受精能の確認は、例えば、化合物を投与した非ヒト雄性動物と同 種の非ヒト雌性動物とを交配させることで産仔が得られる力否か (あるいは妊娠が確 認できる力否か)、該化合物を投与した非ヒト雄性動物力も採取した精子と同種の雌 性動物から採取した未受精卵との接触により受精が成立するか否か、また、該化合 物を投与した非ヒト雄性動物力 採取した精子とハムスター裸卵が融合する力否か等 を指標に行うことができる。
[0092] また、本発明は、 OBF遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト動物を用いた不 妊治療薬のスクリーニング方法を提供する。このような方法としては、まず、被検化合 物を本発明の非ヒト雄性動物に投与する。本発明の非ヒト雄性動物への被検化合物 の投与は、上述の方法で実施できる。次いで、被検化合物が OBFタンパク質の機能 を代替している力否かを判定し、被検化合物を投与していない場合と比較して、 OBF タンパク質の機能を代替する化合物を選択する。被検化合物が OBFタンパク質の機 能を代替している力否かは、例えば、上記非ヒト雄性動物と同種の非ヒト雌性動物と の交配により産仔が得られるか否か (あるいは妊娠が確認できる力否力）、上記非ヒト 雄性動物から採取した精子と同種の非ヒト雌性動物力 採取した未受精卵との接触 により受精が成立するか否か、または、上記遺伝子改変非ヒト雄性動物から採取した 精子とハムスター裸卵との融合が成立する力否か、等により判定できる。
[0093] また、本発明は、 OBF遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト動物を提供する。
このような非ヒト動物は、不妊のモデル非ヒト動物として、上記の不妊治療薬のスクリ 一ユングに利用できる。また、本発明は、 OBF遺伝子の機能が人為的に抑制された 非ヒト動物の細胞を提供する。該細胞としては、例えば、精子及び精子細胞が挙げら れる。特に、 OBF遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト動物の精子は、受精能 がな 、モデノレ精子となりうる。
[0094] 本発明において「OBF遺伝子の機能が人為的に抑制されている」とは、通常、 OBF 遺伝子の遺伝子対の一方または双方に、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換等の遺伝 子変異を有することにより該遺伝子の発現が抑制されている状態を指すが、アンチセ ンス DNAを用いた方法、リボザィムをコードする DNAを用いた方法、または、 RNAi技 術を用いた方法等により、 OBF遺伝子の機能を人為的に抑制することもできる。
[0095] 正常な OBFタンパク質としての機能が減少または喪失して 、る変異 OBFタンパク質 が発現している場合も、この「OBF遺伝子の機能の抑制」に含まれる。上記「抑制」に は、 OBF遺伝子の発現が完全に抑制されている場合のほか、該遺伝子の遺伝子対 の一方の遺伝子の発現のみが抑制されて 、る場合も含まれる。本発明における遺伝 子変異の存在する部位は、該遺伝子の発現が抑制されるような部位であれば特に制 限されず、例えばェクソン部位、プロモーター部位等を挙げることができる。
[0096] 本発明において OBF遺伝子の改変の対象となる動物が由来する生物種は、通常、 ヒト以外の哺乳動物であり、好ましくはマウス、ラット、ノ、ムスター、ゥサギ、ブタ等のげ つ歯類であり、その中でも特にマウスが好ましい。
[0097] 本発明の非ヒト動物において、 OBF遺伝子の機能を人為的に抑制する手段として は、 OBF遺伝子全体またはその一部を欠損させる方法や OBF遺伝子の発現制御領 域の全部またはその一部を欠損させる方法等を例示することができるが、好ましくは OBF遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子を挿入することにより OBF 遺伝子を不活性化する方法である。即ち、本発明の好ましい態様において、非ヒト動 物は、 OBF遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されて 、ること を特徴とする。
[0098] 本発明の非ヒト動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術により 作製することができる。例えば、以下のようにして遺伝子の機能が抑制されたマウスを 作製することができる。まず、マウス力も OBF遺伝子のェクソン部分を含む DNAを単 離し、この DNA断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを 構築する。このターゲッティングベクターをエレクト口ポーレーシヨン法などによりマウ スの ES細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカ 一遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好まし ヽ 。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけ で相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を 行うためには、ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させて おくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除すること ができる。また、 PCRおよびサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行い、 OBF 遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効率よく得ることもできる。
[0099] 相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝 子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメ ラ作製を行うことが好まし ヽ。得られた ES細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションし キメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、 OBF遺伝子の 遺伝子対の一方を不活性ィ匕したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配 させることで、 OBF遺伝子の遺伝子対の双方を不活性ィ匕したマウスを取得することが できる。マウス以外の ES細胞が榭立された動物においても、同様の手法により、遺伝 子改変を行うことができる。
[0100] また、 OBF遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化した ES細胞株は、以下の方法によ り取得することも可能である。すなわち、遺伝子対の一方を不活性化した ES細胞株を 高濃度の抗生物質を含む培地で培養することにより、遺伝子対のもう一方も不活性 化された細胞株、即ち、 OBF遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化した ES細胞株を 得ることができる。また、遺伝子対の一方を不活性化した ES細胞株を選抜し、この細 胞株に再度ターゲッティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細胞株を選択す ることでも作製することができる。ターゲッティングベクターに挿入するマーカー遺伝 子は、前出のマーカー遺伝子とは異なるものを使用することが好ましい。作出した ES 細胞を分化させることで、 OBF遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化した精子を得る ことも可能である。
[0101] また、本発明は、 OBF遺伝子の発現量を測定する工程を含む、不妊の検査方法を 提供するものである。ここで、「OBF遺伝子の発現」には、 OBFの mRNAの発現だけで なぐ OBFタンパク質の発現もまた含まれる。
以下に、本発明の検査方法の態様を例示するが、本発明の検査方法はそれらに 限定されるものではない。上記検査方法の一つの態様としては、まず、被検者の RNA 試料を調製する。 RNA試料は、例えば被検者の精子や精巣カゝら抽出することができ る。 [0102] 本方法においては、次いで、該 RNA試料に含まれる OBFタンパク質をコードする RN Aの量を測定する。次いで、測定された RNAの量を対照と比較する。このような方法と しては、ノーザンブロッテイング法、 DNAアレイ法、または、 RT-PCR法等を例示するこ とがでさる。
[0103] また、上記検査方法は、 OBFタンパク質の発現量を測定することにより、下記の如く 実施することができる。まず、被検者カゝらタンパク質試料を調製する。タンパク質試料 は、例えば被検者の精子や精巣から調製することができる。
本方法においては、次いで、該タンパク質試料に含まれる OBFタンパク質の量を測 定する。次いで、測定された OBFタンパク質の量を対照と比較する。このような方法と しては、 SDSポリアクリルアミド電気泳動法、並びに OBFタンパク質に結合する抗体を 用いた、ウェスタンブロッテイング法、ドットブロッテイング法、免疫沈降法、酵素結合 免疫測定法 (ELISA)、および免疫蛍光法を例示することができる。
[0104] また、本発明は、 OBF遺伝子領域における変異を検出する工程を含む、不妊の検 查方法を提供する。
本発明において、 OBF遺伝子領域とは、 OBF遺伝子および該遺伝子の発現に影 響する領域を意味する。該遺伝子の発現に影響する領域としては、特に制限はない 力 例えば、プロモーター領域などが例示できる。
[0105] また、本発明における変異は、精子の受精能の低下または消失を引き起こす変異 であれば、その種類、その数、その部位などに制限はない。上記変異の種類としては 、例えば、欠失、置換または挿入変異などが挙げられる。
以下、 OBF遺伝子領域に生じた変異を検出する工程を含む検査方法の好ましい態 様を記載するが、本発明の方法はそれらの方法に限定されるものではない。
[0106] 上記検査方法の好ま 、態様にぉ 、ては、まず、被検者から DNA試料を調製する 。 DNA試料は、例えば染色体 DNA、あるいは RNAを基に調製することができる。 本方法においては、次いで、 OBF遺伝子領域を含む DNAを単離する。該遺伝子領 域の単離は、例えば、該遺伝子領域を含む DNAにハイブリダィズするプライマーを用 いて、染色体 DNA、あるいは RNAを铸型とした PCR等によって行うことができる。
[0107] 本方法にお!、ては、次 、で、単離した DNAの塩基配列を決定する。単離した DNA の塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
本方法においては、次いで、決定した DNAの塩基配列を、対照と比較する。本発 明において、対照とは、正常な（野生型の） OBF遺伝子領域を含む DNAを言う。一般 に健常人の OBF遺伝子領域を含む DNAの配列は正常であるものと考えられることか ら、上記「対照と比較する」とは、通常、健常人の OBF遺伝子領域を含む DNAの配列 と比較することを意味する。
[0108] 本発明における変異の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず 、被検者から DNA試料を調製する。次いで、調製した DNA試料を制限酵素により切 断する。次いで、 DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出された DNA 断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者 から DNA試料を調製する。次いで、 OBF遺伝子領域を含む DNAを増幅する。さら〖こ、 増幅した DNAを制限酵素により切断する。次いで、 DNA断片をその大きさに応じて分 離する。次いで、検出された DNA断片の大きさを、対照と比較する。
[0109] このような方法としては、例えば、制限酵素断片長変異（Restriction Fragment Leng th PolymorphismZRFLP)を利用した方法や PCR-RFLP法等が挙げられる。具体的 には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によつ て生じる DNA断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断 片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分を PCR法によって増幅し 、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンド の移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体 DNAをこれらの制限酵 素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブ DNAを用いてサザンブロッテ イングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、 それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノム DNA以外 にも被検者カも調製した RNAを逆転写酵素で cDNAにし、これをそのまま制限酵素で 切断した後、サザンブロッテイングを行うことも可能である。また、この cDNAを铸型とし て PCRで OBF遺伝子領域を含む DNAを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動 度の差を調べることも可能である。
[0110] さらに別の方法においては、まず、被検者から DNA試料を調製する。次いで、 OBF 遺伝子領域を含む DNAを増幅する。さらに、増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離させ る。次いで、解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖 DN Aのゲル上での移動度を対照と比較する。
[0111] 該方法としては、例えば PCR-SSCP(single- strand conformation polymorphism,一 本鎖尚次構造変異)法 (Cloning and polymerase chain reaction-single-strand confor mation polymorpnism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome . Genomi cs. 1992 Jan 1; 12(1): 139- 146. Detection of p53 gene mutations in human brain tu mors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain react ion products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313- 1318. Multiple fluorescence-base d PCR-SSCP analysis with postlabeling. PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275 -282.)が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検化合物の量も少 なくて済む等の利点を有するため、特に多数の DNA試料をスクリーニングするのに好 適である。その原理は次の通りである。二本鎖 DNA断片を一本鎖に解離すると、各 鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離した DNA鎖を、 変性剤を含まな 、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造 の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖 DNAが異なる位置に移動する。一塩基の 置換によってもこの一本鎖 DNAの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳 動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することにより DN A断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異の存在を検出することがで きる。
[0112] 具体的には、まず、 OBF遺伝子領域を含む DNAを PCR法等によって増幅する。増 幅される範囲としては、通常 200 400bp程度の長さが好ましい。 PCRは、当業者にお いては反応条件等を適宜選択して行うことができる。 PCRの際に、 32P等のアイソトー プ、蛍光色素、またはピオチン等によって標識したプライ を用いることにより、増 幅 DNA産物を標識することができる。あるいは PCR反応液に32 P等のアイソトープ、蛍 光色素、またはピオチン等によって標識された基質塩基を加えて PCRを行うことにより 、増幅 DNA産物を標識することも可能である。さらに、 PCR反応後にタレノウ酵素等を 用いて、 32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはピオチン等によって標識された基質 塩基を、増幅 DNA断片に付加することによつても標識を行うことができる。こうして得ら れた標識 DNA断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まな いポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適 量 (5から 10%程度）のグリセロールを添加することにより、 DNA断片の分離の条件を 改善することができる。また、泳動条件は各 DNA断片の性質により変動するが、通常 、室温 (20から 25°C)で行い、好ましい分離が得られないときには 4から 30°Cまでの温 度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、 DNA断片の移動度を、 X線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナ一等で検出 し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルか ら切り出し、 PCRによって再度増幅し、それを直接シークェンシングすることにより、変 異の存在を確認することができる。また、標識した DNAを使わない場合においても、 電気泳動後のゲルをェチジゥムブロマイドや銀染色法などによって染色することによ つて、バンドを検出することができる。
[0113] さらに別の方法においては、まず、被検者から DNA試料を調製する。次いで、 OBF 遺伝子領域を含む DNAを増幅する。さらに、増幅した DNAを、 DNA変性剤の濃度が 次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離した DNAのゲル上での移動度を対照 と比較する。
[0114] このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel ele ctrophoresis : DGGE法）等を例示することができる。 DGGE法は、変性剤の濃度勾配 のあるポリアクリルアミドゲル中で、 DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定 性の違いによって DNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定な DNA断 片カ ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺の DNA配列 はその不安定さのために、部分的に 1本鎖へと解離する。この部分的に解離した DN A断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖 DNAの移動度と 差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、 OBF遺伝子領域を含 む DNAを本発明のプライマー等を用いた PCR法等によって増幅し、これを尿素など の変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなつているポリアクリルアミドゲル中 で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在する DNA断片の場合、より低い変性剤 濃度位置で DNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度 の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
[0115] さらに別の方法においては、まず、被検者から調製した OBF遺伝子領域を含む DN A、および、該 DNAにハイブリダィズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を 提供する。
本発明にお 、て「基板」とは、ヌクレオチドプローブを固定することが可能な板状の 材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌ クレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドプローブを固定することができ れば特に制限はないが、一般に DNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いるこ とができる。一般に DNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチ ドで構成されている。通常これらの DNAは非透過性 (non- porous)の基板の表層にプ リントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性 (porous)の膜、例え ば-トロセルロースメンブレムを使用することができる。
[0116] 本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、 Aifymetrix社開発による オリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにお いて、オリゴヌクレオチドは通常 in situで合成される。例えば、 photolithographicの技 術（Aifymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット (Rosetta Inphar matics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、 いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
[0117] 基板に固定するヌクレオチドプローブは、 OBF遺伝子領域の変異を検出することが できるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、 OBF遺伝子領 域を含む DNAにノ、イブリダィズするようなプローブである。特異的なハイブリダィズが 可能であれば、ヌクレオチドプローブは、該遺伝子領域を含む DNAに対し、完全に 相補的である必要はな 、。本発明にお 、て基板に結合させるヌクレオチドプローブ の長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常 10〜100bpであり、好ましくは 10 〜50bpであり、さらに好ましくは 15〜25bpである。
[0118] 本方法にお!ヽては、次 、で、該 OBF遺伝子領域を含む DNAと該基板を接触させる 。この過程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、 DNAをハイブリダィズさせる。ハ イブリダィゼーシヨンの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプロ ーブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行う ことができる。
[0119] 本方法においては、次いで、該 OBF遺伝子領域を含む DNAと該基板に固定された ヌクレオチドプローブとのノ、イブリダィズの強度を検出する。この検出は、例えば、蛍 光シグナルをスキャナ一等によって読み取ることによって行うことができる。尚、 DNA アレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定した DNAをプローブといい、一方溶 液中のラベルした DNAをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチ ドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。本方法においては、さらに 、検出したハイブリダィズの強度を対照と比較する。
このような方法としては、例えば、 DNAアレイ法 (SNP遺伝子変異の戦略、松原謙一 •榊佳之、中山書店、 pl28-135、 Nature Genetics(1999)22: 164-167)等が挙げられる
[0120] 上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリ ゴヌクレオチド (Allele Specific Oligonucleotide/ASO)ハイブリダィゼーシヨン法が利 用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、 これと DNAでノ、イブリダィゼーシヨンを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド 形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッド のギャップにインターカレーシヨンすることにより消光する性質を利用した方法等によ り検出することができる。
[0121] また、本発明にお 、ては、 MALDI-TOF/MS法 (SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一 · 榊佳之、中山書店、 pl06- 117、 Trends Biotechnol (2000): 18:77-84)、 TaqMan PCR 法 (SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一 '榊佳之、中山書店、 p94-105、 Genet Anal. (1 999)14:143-149)、 Invader法 (SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一 ·榊佳之、中山書店 、 p94- 105、 Genome Research (2000)10:330- 343)、 Pyrosequencing法（Anal. Bioche m. (2000)10: 103- 110)、 AcycloPrime法（Genome Research (1999)9:492-498)、 SNuP E法 (Rapid Vommun Mass Spectrom. (2000)14:950- 959)等も使用することができる。
[0122] さらに、本発明は、本発明の検査方法に使用するための検査薬を提供する。その 一つの態様としては、 0BF遺伝子領域にハイブリダィズし、少なくとも 15ヌクレオチド の鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査薬である。
[0123] 該オリゴヌクレオチドは、 OBF遺伝子領域を含む DNA (正常型 DNAまたは変異型 D NA)に特異的にハイブリダィズするものである。ここで「特異的にハイブリダィズする」 とは、通常のハイブリダィゼーシヨン条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダィ ゼーシヨン条件下（例えば、サムブノレックら, Molecular Cloning.Cold Spring Harbour L aboratory Press, New York,USA,第 2版 1989に記載の条件）において、他のタンパク 質をコードする DNAとクロスノ、イブリダィゼーシヨンを有意に生じないことを意味する。 特異的なノヽイブリダィズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、 OBF遺伝子領域 を含む DNAに対し、完全に相補的である必要はな!/、。
[0124] OBF遺伝子領域を含む DNAにハイブリダィズし、少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を 有するオリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブ (該プローブ が固定された基板を含む)やプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチ ドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常 15bp〜100bpであり、好ましくは 17 bp〜30bpである。プライマーは変異部分を含む OBF遺伝子領域の少なくとも一部を 増幅しうるものであれば、特に制限されな 、。
[0125] また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、 OBF 遺伝子領域を含む DNAに特異的にハイブリダィズするものであれば、特に制限され ない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよぐ通常少なくとも 15bp以上 の鎖長を有する。
[0126] 本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製 することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖 DNA断片 として作製することちできる。
[0127] 本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いるこ とが好ましい。標識する方法としては、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌ クレオチドの 5'端を32 Pでリン酸ィ匕することにより標識する方法、およびタレノウ酵素等 の DNAポリメラーゼを用い、ランダムへキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとし て32 P等のアイソトープ、蛍光色素、またはピオチン等によって標識された基質塩基を 取り込ませる方法 (ランダムプライム法等)を例示することができる。
[0128] 本発明の検査薬の別の態様は、本発明の OBF抗原を認識する抗体を含む検査試 薬である。上記抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はない。 抗体は必要に応じて標識される。
[0129] 上記の検査薬にお!、ては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例え ば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパ ク質安定剤 (BSAやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されて!ヽてもよ!/ヽ。 なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0130] 以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
〔実施例 1〕実験材料と方法
1.抗精子抗体の作製とその抗体を用いた体外受精の阻害解析
1-1 OBF13モノクローナル抗体の作製
12週齢以上の雄の C57BL/6マウス（Japan SLC)の精巣上体尾部の精子を PBS (-) に懸濁し、 2回 PBS (-)で洗浄した。この精子（lxlO6)を Freund' s complete adjuvant, Freund' s incomplete adjuvant (Difco)と混合し、それぞれ免疫開始時と 21日後に雌 の C57BL/6マウスの腹腔内に免疫した。 3回目の免疫（28日後）は PBS (-)と精子を 混合したもので行った。 32日目にマウスの脾臓から脾細胞（lxlO8)を抽出しポリェチ レングリコール 4000 (Sigma Chem.)を用いて myeloma cell line P3U1 (lxlO7)と融合さ せた。 Dulbecco' s Modification of Eagle' s Medium (DMEM) (Flow Lab.)に 100 IU/m 1 penicillin, 100 μ g/ml streptomycin (Flow Lab.), 1 μ g/ml Fungizone (Flow Lab.), 80 μ g/ml Gentacin (Shionogi Pharm. Co., Ltd.), 2x10 5 M 2- mercaptoethanol (Nak arai Chem.), 15% fetal calf serum (M.A. Bioproducts)を添カロし、さらに HAT (hypoxan thine, aminopterin, thymidine)をカ卩えた選択用培地でハイプリドーマを選択後、その 培養上清と 96 well plateを用いた精子の蛍光染色により精子特異的抗体産生クロー ンの選另 ljを行った。 [0131] その中で精子に強く反応する抗体（OBF13)を産生するハイブリドーマ（lxlO8)を、 0.5 mlの pristane (Sigma Chem.)を予め 14日前に投与した CBF1マウスの腹腔内にィ ンジェクシヨンし、さらに 10日から 14日後に腹水を採取した（Okabe, M., et al. J Repro d Immunol 11, 91-100 (1987).) 0
[0132] 1-2精子の蛍光染色
マウスの精巣上体精子をマウス精子用培地（TYH) (Toyoda, Y., et al. Jpn J Anim Reprod 16, 147-51 (1971).)で 2時間培養したのち、これらの精子（lxlO5)をハイブリ ドーマ（OBF13)から得た培養上清 50 μ 1と 2時間、 37°Cで反応させた。 PBS (-)を用 いて数回の洗浄後、 PBSに 5% NBCS (new-born calf serum)をカ卩えた溶液で 25 μ g/ mlに希釈した FITC- conjugated anti-mouse IgM (Miles- Yeda Ltd.)を 20 μ 1加え 1時 間反応させた。 PBS (-)で数回の洗浄後、蛍光顕微鏡下でそれらの精子を観察した
[0133] 1-3 OBF 13モノクローナル抗体による体外受精の阻害
8週齢以上の雌の BDF1マウスの腹腔に 5 IUの pregnant mare serum gonadotropin ( PMSG) (Teikoku Zoki)、 48時間後に 5 IUの human chorionic gonadotropin (hCG) (Tei koku Zoki)を注射し、過排卵をおこさせた。 13-15時間後に卵管膨大部から未受精 卵を回収し、そのまま、あるいは 0.01% (w/v) Hyaluronidase (Sigma Chem.)により卵丘 細胞を取り除いた未受精卵を使用した。精子は精巣上体から抽出し、 TYH培地で 37 °C、 1時間培養後、 OBF13モノクローナル抗体を添カ卩し 1時間インキュベーション後、 終濃度 2xl05 sperm/mlになるように卵子の含まれる培地に加えた。また、受精卵は T YH培地中で、ホフマンコントラストを用いた位相差顕微鏡下で前核形成を基準に識 別した。
[0134] 2. OBF遺伝子のクロー-ング
2-1二次元電気泳動
12週齢以上の ICR雄マウス（10匹）から精巣上体と輸精管を摘出し、精子を回収後 、 Lysis buffer (1% TritonX- 114、 PBSゝ 10 mM Benzamidineゝ 1 mM PMSF、 1 μ g/ml P epstatin、 1 ^ g/ml Leupeptin)を用いて精子を可溶化した。可溶化したタンパク質は 、不溶性画分を遠心分離で除いた後、 6% Sucroseの上に重層し 37°C、 5分間静置し た。室温で 600xg、 15分間の遠心分離後、下層の画分に 2Dバッファー（8M Urea, 2% CHAPS, 1 mg/ml OrangeG)を加え、懸濁して、 20,000xg、 20分間遠心後の上清を脱 塩カラムを用いて脱塩処理した。 400 1のサンプルに IPGバッファーを 0.5%カ卩え、 Im mobiline DryStnp Reswelling Tray中で丄 2時間 Immobiline DryStnp pH4- 7 (Amersha m)を膨潤させた。 Multiphor II (Amersham)で等電点電気泳動後、 DryStripを平衡化 バッファー（50 mM Tris/HCl (pH6.8)、 6M Ureaゝ 30% glycerol, 1% SDS)に 20分浸し 非還元条件下で 7.5%ポリアクリルアミドゲルを用いた SDS-PAGEに供した。泳動後の ゲルは銀染色、 1 g/mlの OBF13抗体を用いたウェスタンブロットを行った。
[0135] 2-2配列の決定
二次元電気泳動で同定された OBF13に反応するスポットを CYPRO Ruby protein g el stain (Molecular Probes, Inc.)で染色後、ゲルから切り出し LC- MS/MSによりぺプ チドシーケンスを行った。ペプチド配列をもとに NCBIデータベースにお!/、て配列解 析を行い、 OBF13の抗原の mRNA配列、アミノ酸配列を決定した (accession number: XM_133424)0また、その配列の正確性を確認するために、マウスの精巣力も抽出した total RNAを铸型として RT-PCRと DNAシークェンスを行い配列を決定した。さらに、ヒ ト OBFにつ!/ヽてもマウス OBFとのホモロジ一解析をもとにして、ヒト OBFと推測される遺 伝子を同定し（accession number : BC034769)、マウスと同様の方法でその配列を確 した 0
[0136] 3. OBFポリクローナル抗体の作製と in vitroにおける OBFの機能解析
3-1恒常的にヒト、マウス OBFを発現する細胞株の作製
ヒトおよびマウス OBFに対するポリクローナル抗体を作製するために、 OBFの抗原 の作製を行った。 OBFタンパク質を発現させるためのプラスミド DNAは、 N末端に Koz ak配列、 C末端にヒスチジンタグを付加するように構築した DNA配列をほ乳類発現べ クタ一、 pCXN2 (Niwa, H., et al. Gene 108, 193-9 (1991).)に組込み作製した。これら プラスミド DNAをゥサギの腎臓由来のセルライン RK13細胞（RIKEN Cell Bank)に lipof ectamine 2000 (Invitrogen)を用いて導入し、 600 μ g/ml G418 (Invitrogen)で細胞を 選択後、ペニシリンカップを用いてクローニングした。また細胞の維持は、 Dulbecco' s Modification of Eagle s Medium (DMEM) (Invitrogen)に 100 IU/ml penicillin, 100 μ g/ml streptomycin, 2 mM L- glutamine, 0.1 mM MEM Non-essential amino acids ( Invtrogen), 10% fetal calf serum (JRH Biosciences)を用 ヽて行った。
[0137] 3-2ヒト、マウス OBFポリクローナル抗体の作製
OBFタンパク質の抗原は、 3-1のように作製した細胞株を用いた。これら細胞株に 10 mM EDTAを用いて lxlO7個の細胞を回収し、 PBS (-)で数回洗浄後、 0.5 mlの PBS ( -)に懸濁した。この PBS (-)懸濁溶液に 0.6 mlの Freund' s complete adjuvant (Difco )を加え、ェマルジヨンをつくり、 1週間ごとに計 4回ゥサギの両足のリンパ節付近に免 疫を行った。 4回目の免疫後、ブーストを行い、ゥサギカも採血した。血清中の IgGは 、終濃度 33%の硫酸アンモ-ゥムを用いて沈澱させ、 PBS (-)に対して透析後、 -80°C に保存した（Inoue, N., et al. J Immunol 166, 424-31 (2001).)。
[0138] 3-3マウスの各糸且織を用いたウェスタンブロット
様々なマウス組織のタンパク質は、各組織を 100 mg/mlで lysis buffer (1% (v/v) Trit on X— 100、 PBSゝ 10 mM Benzamidineゝ 1 mM PMSF、 1 μ g/ml Pepstatin、 1 μ g/ml L eupeptin)に懸濁し、 Potter型ホモジナイザーを用いて組織を破砕し、可溶ィ匕した。可 溶ィ匕したサンプルは、 4°C、 20,000xg、 30分で遠心分離し、可溶性画分を回収した。 可溶性画分は、 CBB法でタンパク質量を BAS当量で定量し、 30 μ gを SDS-PAGE (10 % polyacrylamide gel)で分離し、 polyvinylidene difluoride (PVDF) に 与した。転 写後の膜は、 10%スキムミルクを含むブロッキングバッファー（0.15% Tween 20、 0.5 M NaCl、 20 mM Tris- HC1 (pH 7.4》でブロッキングを行ったのち、ブロッキングバッファ 一に加えた 1 g/mlのマウス OBFポリクローナル抗体と室温で 2時間反応させた。メ ンブラン洗浄液（0.1% (v/v) Tween 20, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris- HC1 (pH 7.4))で数 回の膜の洗浄後、ブロッキングバッファーにカ卩えたペルォキシダーゼ標識抗ゥサギ Ig G (1/10,000希釈）（Jackson ImmunoResearch)と室温で 1時間反応させ、再びメンブラ ン洗浄液で洗浄後、 ECL system (Amersham)で発色、検出を行った。
[0139] 3-4抗体を用いたマウス精子と卵子の融合解析
1-3と同じ手順で未受精卵を準備し、ピエゾマ-ュピレーターを用いて透明帯を取り 除いた（Yamagata, K., et al. Dev Biol 250, 348-57 (2002).) 0裸卵は、パラフィンオイ ルでカバーした終濃度 1 μ g/mlのへキスト 33342を含む ΤΥΗドロップ（100 μ 1)中で、 10分間インキュベーションした。裸卵を別のドロップに移して 37°C、 30分間、静置する ことで余分なへキスト 33342 (Molecular probes)を除く操作を 3回繰り返した。精巣上 体の精子は TYH培地中で 2時間と 6時間培養後、終濃度 2xl05 sperm/mlになるように へキスト 33342処理裸卵に添カ卩した。また、 25 μ g/ml OBF13モノクローナル抗体、 25 μ g/ml OBFポリクローナル抗体、 25 μ g/ml CD9ポリクローナル抗体（KMC8.8, San ta Cruz Biotechnology, Inc.)は、媒精 1時間前に精子と卵子のドロップ中に添カ卩した 。精子が卵子と融合すると卵子中のへキスト 33342が精子頭部に移り、蛍光を発する ようになるので、これを融合精子とみなしその数を蛍光顕微鏡下で測定した。
[0140] 4. OBFノックアウトマウスの作製とその解析
4-1 OBFノックアウトマウスの作製
OBFの機能を不活性化するために、図 4Aのようにェキソン 2から 10までをネオマイ シン而性遺伝子と置き換えたターゲティングベクターを作製し、 D3 embryonic stem ( ES) cellにエレクト口ポレーシヨン法により導入した。 150 μ g/ml G418 (Invitrogen)で 選択後、そのゲノム DNAから PCRにより 4個のポジティブコロニーを選別した。さらに、 予想どおり相同糸且換えが起こっている細胞株をサザンブロットにより 4クローン選別し た。この 4つの細胞株は、 C57BL/6マウスのブラストシスト期の胚にインジェクションし た。その結果、子孫にターゲティングァリルを伝えるキメラマウスが得られた。そのマウ スと野生型マウスとの交配により、 OBFヘテロマウスを得た（F1マウス)。さらに F1マウ ス同士の交配により、 OBFノックアウトマウスを得た（F2マウス)。解析には主に、 F2マ ウスまたは、 F2マウス同士の交配力も得た F3マウスを用いた。
[0141] 4-2サザンブロット
ES細胞やマウスの尾からゲノム DNAを抽出し、 Eco RIにより消ィ匕した。 0.8%ァガロー スゲノレ、 ΙχΤΑΕバッファー（0.04 M Tris, 0.04 M CH COOH, 1 mM EDTA (pH 8.0))
3
を用いて電気泳動後、変性バッファー（0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl)を用いてゲルの 変性、中和バッファー（0.5 M Tris-HCl (pH7.5), 3M NaCl)を用いて中和を経て、ナ イロン膜（Hybond- N+, Amersham)に転写した。その転写膜は、長腕の外側に作製し た DNAを32 Pでラベルし、ハイブリダィゼーシヨンバッファー（Express Hybridization buf fer, Clontech)中で 60°C、 1時間反応させた。メンブラン洗浄液（洗浄液 1; 2xSSC, 0.0 5% SDS,洗浄液 2; O. lxSSC, 0.1%SDS)を用いて数回の洗浄後、転写膜を X線フィル ム（Hyper film MP, Amersham)に露光した。
[0142] 4-3ノーザンブロット
精巣から TRIZOL Reagent (Invtrogen)を用いて total RNAを抽出し 20 μ gずつ、 lx MOPS, 18%ホルムアルデヒドを含む 1%ァガロースゲルで分離し、変性バッファー（50 mM NaOH)を用いてゲルの変性、中和バッファー（200 mM CH COONa)を用いて
3
ゲルの中和を行い、ナイロン膜 (Hybond-N+, Amersham)に転写した。 RNAを転写し たナイロン膜は、 32Pでラベルした ORF全長の OBFフラグメントとともにハイブリダィゼ ーシヨンバッファー（Express Hybridization buffer, Clontech)中で 68°C、 1時間反応さ せた。メンブラン洗浄液（洗浄液 1 ; 2xSSC, 0.05% SDS,洗浄液 2; O. lxSSC, 0.1%SDS) を用いて数回の洗浄後、転写膜を X線フィルム（Hyper film MP, Amersham)に露光し た。
[0143] 4-4ウェスタンブロット
ウェスタンブロットの方法は、 3-3に従った。 12週齢の各遺伝子型のマウスから、精 巣、精子を抽出後、 lysis bufferを用いてタンパク質を可溶ィ匕した。各タンパク質を 30 /z gずつ 10%アクリルアミドを用いた SDS- PAGEで分離し、 1 μ g/ \ OBFポリクローナ ル抗体、 10 μ g/mlマウス CD46ポリクローナル抗体（Inoue, N., et al. Mol Cell Biol 2 3, 2614-22 (2003).)、 0.1 μ g/ml sp56モノクローナル抗体 (QED Bioscience Inc.)ゝ 1 μ g/mlマウス CD55ポリクローナル抗体（名古屋大、岡田秀親教授より供与された)、 0.4 μ g/ml CD147ポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 1 μ g/ml F ertilin βモノクローナル抗体（9D, CHEMICON International)でそれぞれのタンパク 質を検出した。
[0144] 4-5平均産仔数
12週齢以上の雄の OBF +/-と- /-マウスと 8週齢以上の雌の C57BL6もしくは、 OBF- /-マウスを同ケージに入れ、プラグを確認後、 自然出産された産仔数をもとに平均産 仔数を測定した。なおそれぞれの遺伝子型について 8ペア一以上つくり、 1ペア一に ついて 2産以上観察した。
[0145] 4-6体外受精と精子と卵子の融合解析 体外受精は 1-3と同様の方法で行った力 未受精卵は卵丘細胞を Hyaluronidaseで 除去せず、結合した状態で行った。
精子と卵子の融合解析は、 3-4と同様の方法で行った。
[0146] 4- 7ハムスター裸卵を用いた融合解析
精液は健康なボランティアの男性より用手法にて採取した。この精液は 37°C、 1時間 インキュベートすることで液化し、試験管に入れた 2 mlの BWW培地（Overstreet, J.W. , et al. Fertil Steril 33, 534-42 (1980).)の底に 0.5 mlの液化精液をカ卩え、試験管の 角度を 30° に保ちながら 1時間インキュベーションした。上清 1.5 mlから Swim-upした 精子を回収し BWWで 1回洗浄し、 200 1の BWWに懸濁後、 200 1のドロップに加え (total 400 μ 1)、 37°C、 6時間インキュベーションした。その間に、凍結ハムスター卵（ 日本農産工業）を融解し、ピエゾマ-ュピレーターを用いて透明帯を外した (Yamagat a, K., et al. Dev Biol 250, 348-57 (2002).) 0 25 μ g/mlヒト OBFポリクローナル抗体 処理精子もしくは、 OBF+/-、 -/-精子を終濃度 lxl0 mlの精子をノヽムスター裸卵とと もに 37°Cでインキュベーションした。 6時間後、 1 g/mlのへキスト 33342で膨化した精 子の頭部を染色し融合した精子の数を蛍光顕微鏡下で観察した。
[0147] 4-8卵細胞質内精子注入法（intracytoplasmic sperm injection: ICSI)
体外受精と同様の方法で卵子を準備し、 0.01% (w/v) Hyaluronidase (Sigma Chem.) を用いて卵丘細胞を除去した。未受精卵は kSOM (Ho, Y., et al. Mol Reprod Dev 41 , 232-8 (1995).)のドロップで数回洗浄後、別の kSOMのドロップに入れ 37°C、 5%CO
2 インキュベーターに保存しておいた。精子は OBF +/-と- /-マウスの精巣上体尾部よ り採取し、 TYHで 1時間、 37°Cで培養後、 lxlO7 sperm/mlの濃度で 10 1ずつチュー ブに分注し液体窒素で凍結した。 ICSIにあたっては、 6 cmシャーレの蓋に約 2 μ ΐの 融解した精子を加えた 12% (w/v) PVP/H-CZB (Chatot, CI., et al. J Reprod Fertil 8 6, 679-88 (1989).)のスポットをつくり、同じシャーレ上に FHM (Lawitts, J.A., & Bigger s, J.D. J Reprod Fertil 91, 543-56 (1991).)でスポットを数個つくり、その中に未受精 卵を入れた。ピエゾマ-ュピレーターを用いて、外径約 7 mのインジェクション針で 精子の頭部のみを未受精卵の細胞質内に入れ込んだ（Kimura, Y. & Yanagimachi, R. Biol Reprod 52, 709-20 (1995).)。これらの受精卵は、 kSOM中で 24時間培養し、 2 細胞期になつてから 0.5日目の偽妊娠雌マウスの卵管に移植した。 19日後、帝王切 開または自然分娩により仔マウスを産出させた。
[0148] 5. OBFレスキューマウスの作製とその解析
5-1 OBFレスキューマウスの作製
OBFノックアウトマウスにおける雄性不妊の原因が本当に OBFタンパク質の欠失に よるものであるのかを確認するために、精巣内で OBFを発現するトランスジエニックマ ウスを作製し、雌の OBF -/-マウスとの交配により OBF -/-で OBF transgeneをもつ雄 マウスを作製した。マウス OBFトランスジエニックマウスに用いたベクターは、精巣特異 的に発現するカルメジンのプロモーター制御下で発現するように作製した (Ikawa, M. , et al. Dev Biol 240, 254-61 (2001).)。このベクターを雄 OBF +/-と過排卵処理後の 雌 OBF -/-マウスとの交配により得た受精卵を用いて、前核期の前核にベクターをィ ンジヱクシヨンする方法力、もしくは 2細胞期にレンチウィルスを用いて感染させ（Ikawa , M., et al. Mol Ther 8, 666-73 (2003).)遺伝子を導入する方法でトランスジエニック マウスを作製した。
[0149] 5-2輸卵管内卵子の受精率の測定
1-3のように過排卵マウスを準備し、 hCG注射後に雄マウスと同ゲージに入れ交配さ せた。使用した雄は、 (1) OBF +/-、 (2) OBF -ト、及び（3) OBF -/-であり OBF trans geneでもあるダブルトランスジエニックマウスである。次の日の朝、雌の膣を観察し、交 尾したことを示すプラグを確認後、卵管膨大部より卵子を採取した。またこの時、細胞 質が異常な卵子を取り除き、受精卵はホフマンコントラストを用いた顕微鏡下で前核 形成を基準に識別した。
[0150] 〔実施例 2〕
本研究者らは、受精機構に寄与する精子上の膜タンパク質を網羅的に同定するた めに、 C57BL/6雄マウスの精巣上体力も精子を抽出し、それを同系統の雌マウスに 免疫し多数のモノクローナル抗体を作製した。それらのなかで、精子が受精可能な 状態になるために精子細胞膜と先体外膜との融合による形態変化である先体反応後 の精子にのみ特異的に反応する、ユニークなモノクローナル抗体が 1クローン得られ た。この抗体（OBF13)は、先体反応が起こるにつれて徐々に精子の頭部全体に広 力 ¾抗原に反応するもので（図 1A)、卵透明帯通過後の精子に対しては頭部全体に 反応した（図 1B)。さらに OBF13処理後の精子は、透明帯への結合、通過には何ら影 響を与えな力つたが、その後の卵子との融合に対して抗体処理濃度依存的に阻害 効果を示した（表 1、 2)。
[0151] [表 1] 体外受精系における精子の卵透明帯通過に対する
モノク口-ーナル抗体 0ΒΠ 3の作用
実験に使用した 囲卵腔内に精子を 腹水の希釈率 実験回数
卵子総数 含有する卵子 a) (%)
― 9 209 65±7. 7
1/10000 9 214 66±6. 2
1/2000 9 211 51 ±7. 2
1/400 9 201 51 ±9. 5
1/80 9 220 55±6. 7 a) 数値は平均土標準誤差として表示した
体外受精系における精子一卵子融合に対する
モノクロー -ナル抗体 0BF13の作用
実験に使用した 雌雄両前核を
腹水の希釈率 実験回数
卵子総数 有する卵子 a) (%)
― 9 210 59±11. 2
1/10000 9 223 17±3. 8**
1/2000 9 202 0
1/400 9 214 0
1/80 9 221 0 a) 数値は平均土標準誤差として表示した
** pく 0. 01 ： 1%以下の危険率でコントロールに対し統計的に有意な差がある
[0153] すなわち、透明帯を取り除いた裸卵にへキスト 33342を取り込ませておいて力 精 子を加えると、卵子に融合した精子はへキスト 33342が移り融合したことが確認される 1S OBF13モノクローナル抗体、マウス OBFポリクローナル抗体で受精阻害実験を行 うと、精子は卵子に正常に結合するにも関わらず、コントロール IgGにくらべ有意に融 合精子が減少していることが分力つた。この作用は、マウス CD9抗体（KMC8.8)を添 カロした時と同様であった（図 2)。
[0154] 本研究者らは、この抗体の認識する抗原は精子が卵子への結合または融合に必 須な分子であると考え、 10匹の ICR雄マウスの精巣上体力も精子を集め、膜画分と水 層画分に粗抽出できる界面活性剤、 Triton X-114を用いて可溶ィ匕し、抗原の同定を 試みた。その後、この膜画分を二次元電気泳動（一次元目： pH 4.0-7.0、二次元目： 7.5% SDS-PAGEポリアクリルアミドゲル）で分離した。 PVDF膜に転写後 OBF13を用 いてウェスタンブロットを行い抗原のスポットの位置を同定した（図 3A)。次いで同定 したスポットをゲル力も切り出して、 LC-MS/MSにより一次構造を決定した（図 3B)。
[0155] OBF13の抗原は、機能未知の分子としてすでに ORF全長の cDNA力 ^CBIデータべ ースに登録されており（accession number :XM_133424)、 mRNAの配列を推定すること ができた。その正確性を確認するために、マウスの精巣カゝら抽出した total RNAを铸 型として RT- PCRと DNAシークェンスを行い配列を確認した。この分子（OBF (Oocyte binding/lusion factor))のモチーフを解析すると、シグナル配列、細胞外領域、細胞 膜貫通領域、細胞内領域をもつ典型的な I型の膜タンパク質であることが分力つた（ 図 3B)。さらにデータベースサーチの結果、 OBFはマウスだけではなく少なくともヒト、 ラットにも存在し、それぞれのアミノ酸配列レベルでの相同性は 57%を超える高 、相同 性を示した。ヒト、マウスまたはラットの OBFの塩基配列を配列番号： 1、 3または 5に、 アミノ酸配列を配列番号： 2、 4または 6に示す。これら全ての動物種の OBFの細胞外 領域は 1つの Ig-like (Immunoglobulin-like)ドメインを有し、システィン同士のジスルフ イド結合でこのドメインを形成していることが推測された（図 3D)。またこのドメイン内に ある N結合型糖鎖付加配列は、全ての動物種間で完全に保存されて 、た。
マウス OBFは、 ESTデータベースにおいて精巣と脳に発現していることが示された 力 マウス OBFに対するポリクローナル抗体を作製し、各組織のウェスタンブロットを 行うと精巣や精子に特異的にタンパク質レベルで存在することが明らかになった（図 3C)。
[0156] OBFが本当に生体内で融合に関与する分子として働いていることを明らかにするた めに、ノックアウトマウスの作製とその解析を行った。 10個のェキソンから成る OBF遺 伝子のェキソン 2から 10までをネオマイシン耐性遺伝子に置き換えるターゲティング ベクターを構築し、常法どおり相同組換えを引き起こした ES細胞をクローユングしてノ ックアウトマウスを作製した（図 4A)。マウス個体で相同組換えの有無の評価は、サザ ンブロット、ノーザンブロット、ウェスタンブロットを行い調べた（図 4B- D)。その結果、 相同組換えが行われたマウスでは OBF遺伝子由来の mRNA、タンパク質が欠失して いることが確認できた。また、調査した限り OBFタンパク質が欠失することによって、他 の精子膜タンパク質（CD46:先体内膜タンパク質， sp56:先体マトリックスタンパク質， CD55;細胞膜タンパク質， CD147; Igスーパーファミリータンパク質， Fertilin β；透 明帯結合に関わるタンパク質）が欠失したり、発現量が減少したりする 2次的な影響 は見られなかった（図 4D)。
[0157] OBF -/-雄マウスの妊孕性を調べるために、 C57BL/6雌マウスとの産仔数を自然 交配させて調べた。その結果、 OBF -/-雌マウスからは正常な数の産仔が得られた 力 SOBF -/-雄マウスからは、全く産仔が得られず不妊であることが示された（図 5A)。 OBF -/-雄マウスの不妊の原因を調べるために、体外受精の系で詳細な検討を行つ た。その結果、 OBF -/_雄マウスの精子は卵丘細胞を拡散することや透明帯に結合 することまた透明帯を通過することができることが確認された力 受精して 2細胞にな るものは得られなかった（図 5B)。さらに裸卵を用いた研究では OBF -/-の精子は、 卵子に結合することができるにもかかわらず、全く融合能を有していないことが分かつ た（図 5C)。また、精子と融合ができない CD9 -/-卵子に OBF -/-精子を加えた場合 でも卵子に結合することはできることから、結合と融合は同時におこる現象ではなく別 々の事象として分別できることが推測された（図 5D)。また、カルメジン、ファーティリン 、 ACEノックアウト雄マウスはいずれも、輸卵管へ精子が上がらないことが不妊の原因 の一つとして知られている。 OBF -/-精子の場合は雌マウスとの交配後、卵管膨大部 の卵子の周辺や囲卵腔に精子が存在することから、正常に精子が上昇して 、ること が分力つた。さらに精巣の大きさや、精子の数、形、運動性などどれも正常であった。
[0158] OBF -/-雄マウスの不妊の原因が融合能の欠失に限られて 、るとすると、融合の過 程をバイパスすることができればその後の受精のステップは正常に起こり、その産仔 が得られるはずである。このことを確認するために、 ICSI (intracytoplasmic sperm inje ction)法により OBF -/-精子に適用した。その結果、 OBF -/-の精子から健康な産 仔が得られた（表 3)。
[0159] [表 3] 細胞質内 注入後の 二細胞期まで 産仔数
精子注入 卵子の生存数 発生した
実施卵子数 卵子数
OBF -ん 95 59 42 (71%) 12 (29%)
OBF十ん 85 54 43 (80%) 6 (14%)
[0160] ハムスター裸卵に対して、様々な動物種の精子が融合可能であることが知られてい る。 OBFの動物種間の多様性を調べるために、マウスの OBF - /-精子を用いて、ハム スター裸卵との融合性について検討した。その結果、 OBF -/-精子はマウス卵子を 用いた場合と同様に結合はする力 全く融合できないことが示された（図 6A)。さらに ヒト OBFポリクローナル抗体を作製し、ヒト精子とハムスター裸卵との融合に及ぼす影 響をみたところ、ヒト精子はハムスター裸卵に対して融合はおろか結合さえしなくなる ことが明ら力となった（図 6B)。これらの結果から、 OBFは、動物種をこえて受精にお ける卵子との結合または融合に必須な分子であることが分力つた。
最後に、精巣特異的な分子シャペロンであるカルメジンのプロモーター制御下に 0 BFを発現するベクターを導入したトランスジエニックマウスを用いて、 OBFノックアウト マウスのレスキューを行ったところ、受精能が回復することが確認され、 OBF -/-マウ スに見られた不妊の表現型は OBF遺伝子欠損によるものであることを確かめた（図 7)
[0161] 以上により、 OBFはマウスに限定されずヒトにおいても、受精の最も大事なステップ である卵子との結合や融合に欠くことのできない重要な分子であることが明らかにな つた。また、この抗体に受精阻害作用があることから、避妊ワクチンの抗原として使用 できる。また逆に OBFを調べることにより不妊の診断にも応用可能である。
産業上の利用可能性
[0162] 本発明により精子と卵子の結合または融合に必須なタンパク質 OBFとその抗体の 利用法が提供される。 OBFは避妊ワクチンとして利用可能であり、 OBFに対する抗体 は避妊薬として利用できる。また、 OBFタンパク質の発現等を指標とした避妊薬のス クリーニングや不妊の検査方法が提供できる。さらに、 OBF遺伝子の機能が抑制され た非ヒト動物は、不妊のモデル動物として利用できる。

Claims

請求の範囲
[1] 精子と卵子との結合または融合を阻害する活性を有する抗体であって、以下の (a) 〜（d)の 、ずれかに記載のタンパク質またはその断片を抗原とする抗体 (OBF13抗 体を除く)。
(a)配列番号： 1、 3、 5のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAよりコードされるタン パク質
(b)配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
(c)配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァ ミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を含むタンパク質で あって、配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質と機 能的に同等なタンパク質
(d)配列番号： 1、 3、 5のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAとストリンジェントな 条件下でノ、イブリダィズする天然由来の DNAよりコードされるタンパク質であって、配 列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同 等なタンパク質
[2] 精子と卵子との結合または融合を阻害する活性を有する抗体であって、以下の (a) 〜 (d)のいずれかに記載のタンパク質またはその断片を抗原とする抗体を有効成分 として含有する避妊薬。
(a)配列番号： 1、 3、 5のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAよりコードされるタン パク質
(b)配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
(c)配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァ ミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を含むタンパク質で あって、配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質と機 能的に同等なタンパク質
(d)配列番号： 1、 3、 5のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAとストリンジェントな 条件下でノ、イブリダィズする天然由来の DNAよりコードされるタンパク質であって、配 列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同 等なタンパク質
[3] 請求項 2に記載のタンパク質またはその断片を有効成分として含有する避妊ワクチン
[4] 請求項 2に記載のタンパク質またはその断片の精子と卵子との結合または融合に関 連する因子としての使用。
[5] 以下の（a)〜 (c)の工程を含む、避妊薬の候補ィ匕合物のスクリーニング方法。
(a)請求項 2に記載のタンパク質またはその断片に被検化合物を接触させる工程
(b)該請求項 2に記載のタンパク質またはその断片と被検化合物との結合を検出す る工程
(c)該請求項 2に記載のタンパク質またはその断片と結合する被検化合物を選択す る工程
[6] 以下の（a)〜 (c)の工程を含む、避妊薬の候補ィ匕合物のスクリーニング方法。
(a)請求項 2に記載のタンパク質をコードする DNAを有する細胞に被検化合物を接 触させる工程
(b)該細胞における請求項 2に記載のタンパク質をコードする DNAの発現レベルを測 定する工程
(c)被検化合物を接触させて ヽな 、場合と比較して、該 DNAの発現レベルを減少さ せる化合物を選択する工程
[7] 以下の（a)〜 (c)の工程を含む、避妊薬の候補ィ匕合物のスクリーニング方法。
(a)請求項 2に記載のタンパク質をコードする DNAを有する非ヒト動物に被検化合物 を投与する工程
(b)該非ヒト動物における請求項 2に記載のタンパク質をコードする DNAの発現レべ ルを測定する工程
(c)被検化合物を投与して ヽな 、場合と比較して、該 DNAの発現レベルを減少させ る化合物を選択する工程
[8] 以下の（a)〜 (d)の工程を含む、避妊薬の候補ィ匕合物のスクリーニング方法。
(a)請求項 2に記載のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレ ポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または細胞抽出液を提供す る工程
(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定 する工程
(d)被検化合物を接触させて!/、な!、場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レ ベルを減少させる化合物を選択する工程
[9] 以下の（a)〜 (c)の工程を含む、避妊薬の候補ィ匕合物のスクリーニング方法。
(a)請求項 5〜8に記載の方法の 1または複数の組み合わせによって選択されたィ匕 合物を、雄性動物の精子に接触させる工程
(b)該精子の受精能を確認する工程
(c)該精子の受精能を阻害する化合物を選択する工程
[10] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、避妊薬の候補ィ匕合物のスクリーニング方法。
(a)請求項 5〜8に記載の方法の 1または複数の組み合わせによって選択されたィ匕 合物を、非ヒト雄性動物に投与する工程
(b)該非ヒト雄性動物の精子の受精能を確認する工程
(c)該非ヒト雄性動物の精子の受精能を阻害する化合物を選択する工程
[11] 請求項 2に記載のタンパク質をコードする遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト 動物。
[12] 請求項 2に記載のタンパク質をコードする遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト 動物細胞。
[13] 以下の（a)〜 (c)の工程を含む、不妊治療薬の候補化合物のスクリーニング方法。
(a)被検化合物を請求項 11に記載の非ヒト動物に投与する工程
(b)被検化合物が請求項 2に記載のタンパク質の機能を代替している力否かを判定 する工程
(c)被検化合物を投与して!ヽな ヽ場合と比較して、該タンパク質の機能を代替する化 合物を選択する工程
[14] 請求項 2に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程を含む、 不妊の検査方法。
[15] 請求項 2に記載のタンパク質をコードする遺伝子領域における変異を検出する工程 を含む、不妊の検査方法。
[16] 請求項 2に記載のタンパク質をコードする遺伝子領域にハイブリダィズし、少なくとも 1
5ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項 14または 15に記載 の方法に用いるための検査薬。
[17] 請求項 2に記載のタンパク質またはその断片を抗原とする抗体を含む、請求項 14に 記載の方法に用いるための検査薬。
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