WO2006025525A1

WO2006025525A1 - 樹状細胞において抗原提示されやすいタンパク質の選択方法

Info

Publication number: WO2006025525A1
Application number: PCT/JP2005/016110
Authority: WO
Inventors: Jun Imai; Mikako Maruya; Hironori Hasegawa; Shigeo Koyasu; Ichiro Yahara
Original assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd; Keio University
Current assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd; Keio University
Priority date: 2004-09-03
Filing date: 2005-09-02
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2007-03-03
Also published as: JPWO2006025525A1; EP1801230A4; US20080064048A1; EP1801230A1

Abstract

　樹状細胞の抗原クロスプレゼンテーション機構の解明に取り組み、樹状細胞に取り込まれた外来抗原がポリユビキチン化を受けた後にプロテアソームにより分解されることを明らかにした。樹状細胞による抗原タンパク質取り込み量やポリユビキチン化される量と抗原タンパク質による抗原提示レベルとの間に正の相関関係があることを発見した。これらに基づき、抗原タンパク質の取り込み量やポリユビキチン化タンパク質を測定し、該抗原タンパク質によるクロスプレゼンテーションの強さを予測する方法を生みだした。この方法を用いれば、複数のタンパク質の中から抗原提示されやすい抗原タンパク質を選別することができる。本発明の方法は、より適切な癌特異的タンパク質の選別により、適切な癌免疫ワクチンの提供を可能にする。

Description

明細書

樹状細胞にぉレヽて抗原提示されやすレヽタンパク質の選択方法

技術分野

[0001] 本発明は、榭状細胞によるクロスプレゼンテーション機構に基づいた、榭状細胞にぉヽて抗原提示されやす!ヽタンパク質の選択方法に関する。

背景技術

[0002] 生体で細胞が癌化すると、本来、免疫防御機構が働!、て癌化した細胞は排除される。癌化した細胞が免疫防御機構による監視の目を逃れると、癌が発生すると考えられている。癌化した細胞を排除するのは、主として細胞性免疫である。

[0003] 細胞性免疫機構は、適当な手法によって活性化されれば、一度発生した癌に対しても強くアタックし癌を排除する作用を示すことができる。したがって、細胞性免疫の活性ィ匕は癌細胞の効率的除去方法となり得る。既に、癌治療の一つの手段として癌免疫療法は注目されており、これまでに、 LAK細胞や CTL細胞等を投与する細胞移入療法、榭状細胞やペプチドをワクチンとして投与するワクチン療法等、数々の方法が研究 *開発されてきている。しかし、細胞性免疫の活性化は免疫寛容の誘導と背中合わせであり、いかにして標的に対応した特異的、効率的な活性ィ匕を図るかということが、腫瘍免疫の最大の課題となっている。

[0004] 榭状細胞ワクチン療法は、患者から榭状細胞を採取し、該榭状細胞に体外で癌抗原タンパク質を貪食させ、抗原ペプチドを提示した状態となった榭状細胞を癌患者の体内に戻し、癌に対する免疫を特異的に増強することにより癌を治療する方法である。しかし、患者により有効な癌抗原が異なること等の理由から、榭状細胞ワクチン療法は必ずしも全ての患者に対し有効な治療法とはなって!/、な!、。榭状細胞の抗原提示を有効に行うことのできる癌抗原タンパク質を事前に選別することができれば、榭状細胞ワクチン療法の有効率も向上すると考えられる。し力しながら現在のところ、癌抗原タンパク質の有効性を評価する実用的な評価系は存在しなヽ。

[0005] 実験的な評価系としては、 DC2.4細胞と OT-Iマウスのナイーブ CD8+T細胞とを用いた抗原提示レベルの評価系が構築されている。 DC2.4細胞は、 MHCクラス Iハプロタイブが H- 2Kbであるマウス細胞株である。 OT- I (H- 2Kb)マウスは、 H- 2Kb分子上に提示された OVA由来の抗原ペプチド（SIINFEKL) (配列番号 15)を認識する T細胞受容体 (TCR α , β )を発現するトランスジニックマウスである。すなわち ΟΤ-Ιマウスの CD8+細胞は、 DC2.4細胞が提示する OVAペプチドを認識し、活性化される。活性ィ匕された OT-I CD8+T細胞によって産生される IL-2量は、 DC2.4細胞によって提示された OVA抗原による T細胞刺激の指標となる。し力しこの評価系は、特定の抗原に対する特異的 TCR発現動物を必要とする。抗原タンパク質一般について、上記評価系と同様な評価系を構築することは、全く不可能といわざるをえない。

[0006] より有効性の高い免疫療法を提供するには、免疫システムの理解が不可欠である。

細胞性免疫は、獲得免疫の一つである。獲得免疫は液性免疫と細胞性免疫の二種類に大別される。液性免疫とは細菌や寄生虫等の感染に対して抗体を介して行われる免疫反応で、抗体産生を行う B細胞が主に活性ィ匕される。一方の細胞性免疫は、癌化した細胞やウィルスに感染した細胞を直接破壊する反応で、 CD8+の細胞傷害性 T細胞が活性化される。

[0007] T細胞は、自己の細胞膜上に発現した T細胞受容体 (TcR)を使って、他の細胞上の主要組織適合遺伝子複合体 (MHC)と呼ばれる一群の蛋白質複合体を認識する。 M HC遺伝子にコードされる MHC分子は、細胞内で蛋白質が分解されて生じたオリゴぺプチドと複合体を形成して細胞表面に発現する。

[0008] MHC分子にはクラス Iとクラス IIの 2種類がある。 MHC IIは α鎖と j8鎖からなり、抗原提示細胞にのみ発現し、主に細胞外から取り込まれた抗原 (感染病原体など）由来のペプチドをヘルパー T細胞に提示し、液性免疫の発現に必須の役割をはたす。

[0009] これに対し、主鎖と副鎖（ j8 2ミクログロブリン）力なる MHC Iは、ほとんど全ての有核細胞の細胞膜に発現している。一般に、 MHC Iは自己の細胞内にある蛋白質の分解産物に由来するオリゴペプチドを結合しており、細胞性免疫における自己の標識となっている。自己非自己の識別において、 MHCクラス I分子が自己の蛋白由来のぺプチドを提示している場合には、自己と認識され、細胞性免疫反応は誘導されない。一方、非自己蛋白由来 (例えば、癌化した細胞やウィルス感染した細胞、あるいは移植された臓器など）のペプチドを提示してヽる場合には細胞性免疫反応を誘導する。 [0010] 細胞性免疫を活性ィ匕するには、 CD8抗原陽性 T細胞に対して、非自己由来のぺプチドが共刺激因子と共に MHC I上に提示されることが必須である。この活性ィ匕が効率的に行われない場合、非自己を認識する CD8+T細胞が存在していても、非自己抗原を提示して!/ヽる細胞に対して細胞傷害性を発揮する活性化された細胞 (CTL)へと分ィ匕することができない。

[0011] 榭状細胞は、マクロファージゃ B細胞とともに、プロフェッショナル抗原提示細胞と称される力外来抗原の抗原提示において、とりわけ重要かつ特別な役割を果たす細胞である。榭状細胞は、癌化した細胞やウィルスに感染した細胞の死骸や断片を取り込んで、それらに含まれるタンパク質を MHCクラス I上に提示する。すなわち、マク口ファージゃ B細胞では外来抗原は MHCクラス II分子上に提示されるが、榭状細胞では外来抗原を MHCクラス II分子に加えて MHCクラス Iに提示される。この現象は、抗原のクロスプレゼンテーションと呼ばれており、榭状細胞に特有のものである。榭状細胞による外来抗原のクロスプレゼンテーションは、感染細胞や癌細胞の除去において決定的に重要な役割を担っている。

[0012] 榭状細胞に取り込まれた外来抗原タンパク質は、運搬'分解処理され、抗原タンパク質由来のペプチドが MHCクラス Iと複合体を形成し、細胞膜に発現するが、その一連の機構は一部が解明されているに過ぎない。これまでのところ、榭状細胞によるクロスプレゼンテーションの細胞機構は、下記のように説明されている。まず、癌細胞やウィルス感染細胞由来の抗原タンパク質は、エンドサイト一シス (ファゴサイト一シス、免疫複合体の取り込みなどをも含む）によって榭状細胞の細胞内腔 (膜によってとり囲まれたコンパートメント）に取り込まれる。取り込まれた抗原タンパク質あるいはその分解物は、未知の機構によって、膜を通過して細胞質に移行する。その後は、内在性の抗原タンパク質と同様に、プロテアソームによって分解され、分解産物のぺプチドは、 TAPトランスポーターによって ERに輸送され、 ER内部で MHC Iと複合体を形成し、通常の経路によって細胞膜に発現される。しかし、外部力も抗原タンパク質がどのような細胞内コンパートメントに取り込まれるのカゝ、取り込まれた抗原タンパク質あるいはその分解物力どのようにして膜を通過して細胞質へ移行するの力、といった点については、未解決のままである。発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0013] 本発明はこの様な状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しょうとする課題は、榭状細胞の抗原クロスプレゼンテーション機構の解明および抗原提示されやす、抗原タンパク質の選択方法を提供することである。

課題を解決するための手段

[0014] 上記課題を解決すベぐ本発明者らは榭状細胞の抗原クロスプレゼンテーション機構の解明に取り組んだ。榭状細胞の抗原クロスプレゼンテーション機構の解明において、鍵となる反応は、 1)外部力も抗原タンパク質力どのような細胞内コンパ一トメントに取り込まれるのか、 2)取り込まれた抗原タンパク質あるいはその分解物力どのようにして膜を通過して細胞質へ移行するの力、の二つである。

[0015] 上記機構を解明するにあたり、細胞分画法、ウェスタンブロッテイングを実施し、取り込まれた外来抗原の細胞内局在および時間経過に伴う変化を観察した。これらの結果から、取り込まれた外来抗原は未分解の状態で膜状のオルガネラに蓄積され、ュビキチン-プロテアソーム経路を通じて分解されることが、初めて明らかになった。さらに、本発明者らは上記経路が ER関連分解と本質的に同一であることに気付き、榭状細胞中に蓄積された外来抗原は、 ERADによって、または極めて類似したタンパク質分解機構によって分解されるとの仮説を立てた。

[0016] 本発明者らは、この仮説の立証を 3種類の方法により試みた。第一に、共免疫沈澱法を実施し、蓄積された外来抗原と各種 ER関連タンパク質との間に相互作用がある力どうか検討した。二番目の方法として、榭状細胞に ERAD阻害処理を行い、蓄積された外来抗原の分解が影響を受ける力否かを調べた。第三番目に、 ER関連タンパク質を RNAi法でノックダウンし、蓄積された外来抗原への影響を検討した。

[0017] 上記検討の結果、榭状細胞クロスプレゼンテーションにお、て、外来抗原は膜小胞に取り込まれた後、 BiPやカルレティキュリン等の小胞体分子シャペロンと結合し、細胞質へ逆行輸送されること、細胞質へ移った外来抗原は未分解の状態でポリュビキチンィ匕されること、上記ポリュビキチンィ匕に関与するュビキチン E3ライゲースが CHIP であること、ポリュビキチンィ匕された外来抗原はプロテアソームによる分解を受けることが明らかになった。これらは、いずれも本発明者らによって初めて見出された新規知見であり、上記仮説を裏付けるものである。

さらに本発明者らは、榭状細胞へ取り込まれた抗原タンパク質の測定、取り込み後にポリュビキチンィ匕を受けた抗原タンパク質の測定に成功し、抗原タンパク質が榭状細胞に取り込まれる量やポリュビキチンィ匕される量と抗原タンパク質による抗原提示レベルとの間に正の相関関係があることを発見した。本発明者らは、これらの新規知見に基づき、抗原タンパク質の取り込み量やポリュビキチンィ匕タンパク質を測定し、該抗原タンパク質によるクロスプレゼンテーションの強さを予測する方法を生みだした。この方法を用いて複数の抗原タンパク質の抗原提示されやすさを測定すれば、その中から抗原提示されやす、抗原タンパク質を選別することができる。すなわち本発明は、抗原提示されやすい抗原タンパク質の選択方法に関する。より具体的には、下記の発明を提供するものである。

(1)単離された榭状細胞にタンパク質を接触させる工程の後、少なくとも下記の（a)から（c)のヽずれか一つ以上の工程を含む、榭状細胞にお!ヽて抗原提示されやす、タンパク質の選択方法。

(a)該榭状細胞に取り込まれたタンパク質の量を測定する工程

(b)該榭状細胞中のポリュビキチン化されたタンパク質量を測定する工程

(c)該榭状細胞に取り込まれたタンパク質の榭状細胞中に残存する量を測定するェ程。

(2)単離された榭状細胞にタンパク質を接触させる工程と、下記の（a)から (c)に記載したタンパク質の量のうち少なくともいずれか一つ以上を測定する工程と、当該工程の測定値に基づヽてタンパク質を取り込んだ榭状細胞を選択する工程と、該選択する工程において選択された榭状細胞を回収する工程とを含む、 CTL誘導能の高い榭状細胞の製造方法。

(a)該榭状細胞に取り込まれたタンパク質の量

(b)榭状細胞中のポリュビキチンィ匕されたタンパク質の量

(c)榭状細胞に取り込まれたタンパク質の榭状細胞中に残存するタンパク質の量

(3)タンパク質を標識して用いることを特徴とする、上記（1)または上記（2)に記載の方法、

(4)榭状細胞中のポリュビキチンィ匕されたタンパク質量を測定する工程において、抗ュビキチン抗体を用いることを特徴とする、上記（1)から上記（3)の、ずれかに記載の方法、

(5)上記（1)、上記（3)、上記 (4)のいずれかに記載の方法を含む癌抗原ワクチン資格検定方法。

図面の簡単な説明

[図 1]DC2.4細胞に取り込まれた OVAの特徴を示す図である。（a)サイトゾル及びミクロソーム分画を各種抗体でウェスタンブロットした図である。ミクロソーム分画のトリプシン処理は、蓄積 OVAと BiPに影響を与えな力つた。膜を溶解するために、 TritonX-1 00を使用した。 (b) bOVA蓄積に対するプロテアソーム阻害剤とリソソーム阻害剤の影響を示す図である。プロテアソーム阻害剤である MG-132 (MG: 10 μ U)とラタタスタチン（LC:2 μ Μ)は細胞に取り込まれた bOVA分解を減少させたが、 NH4C1 (50mM)は減少させなかった。 DC2.4細胞を bOVAでパルスし、追跡した。 bOVAを SAビーズで回収し、 SDS-PAGEで分離した後、 SA-HRPを用いたウェスタンブロットを行った。 Ctl : 阻害剤を含まなヽコントロール。 (c)上記 (b)で示したものを定量ィ匕した結果を示す図である。（d) bOVAが分解前にポリュビキチンィ匕を受けることを示す図である。細胞に結合した bOVAがインタタト OVAと同じ分子量を有する。 bOVAの一部は、ポリュビキチン化されている。左パネル中のアスタリスクは、 SA-HRPとの非特異的結合を示す。

[図 2]ERAD関連タンパク質が細胞に結合した OVAと相互作用することを示す図である。（a) Sec61 o^¾OVAと相互作用することを示す図である。 DC2.4細胞を bOVAとィンキュベーシヨンし、抗 Sec61 aとの共免疫沈降を行った。 bOVAを免疫沈降の前に 2. 5mg ml—¹で細胞ライセートに添カ卩した（各パネルの左二つのレーン）。 SDS-PAGE後、 SA-HRPおよび抗 Sec61 α抗体を用いてブロッテイングした。（b) Sec61 βカ¾0¥ と相互作用することを示す図である。（c) VCPが bOVAと相互作用することを示す図である。（d) BiPが bOVAと相互作用することを示す図である。（e) PDIが bOVAと相互作用することを示す図である。（f) Calreticulinが bOVAと相互作用することを示す図である。 ( g) CHIPが bOVAと相互作用することを示す図である。（h) TAPlは bOVAと相互作用しないことを示す図である。（i) TAP2は bOVAと相互作用しないことを示す図である。 (j) BMDC中でも、 bOVAが Sec61 βと相互作用することを示す図である。（k) BMDC中でも、 bOVAが VCPと相互作用することを示す図である。

[図 3]ERAD関連タンパク質が細胞に取り込まれた bOVAと同時精製されることを示す図である。（a) DC2.4細胞由来 ERAD関連物質と同時精製した図である。（b) BMDC細胞由来 BiPと VCPとの同時精製の結果を示す図である。

[図 4]ERAD阻害および RNAi法による ERAD関連タンパク質ノックダウン力 bOVA分解を減少させることを示す図である。（a) bOVAの分解が Ca²⁺枯渴により阻害され、 Ca² +再添カ卩（ImM)により回復することを示す図である。（b)thapsigargin (Tg:300nM)または tunicamycin(Tm2 μ g)によって阻害されることを示す図である。（c) RNAi法による E RAD関連タンパク質のノックダウンの影響を示す図である。 RNAiをトランスフエタトした、クローン化していない安定なトランスフエクタント（S22;Sec61-22, V41;VCP-41; C 4;CHIP-4)及びクローン化したノックダウン細胞株（S22-3;S-22由来， V41-1 ;V_41由来； C4F-1;C4由来）では、 ERAD関連タンパク質発現の減少が示された（レーン, 3,5, 7,9,10,11)。コントロールとして、レーン 2 ;S22、レーン 4;S22-3、レーン 6 ;V41、レーン 8 ;V41- 1、レーン 10 ;C4、レーン 12 ;C4F- 1。（d)親 DC2.4細胞とノックダウン DC2.4細胞をそれぞれ bOVAとインキュベートしたときの、 bOVA分解を示す図である。（e)上記 (d)の結果を定量ィ匕した図である。 (f) C4で bOVAのポリュビキチンィ匕が減少したことを示す図である。レーン 1,2, 5,6はコントローノレ、レーン 3,4,7,8は C4。

[図 5]RNAi法による TAP1ノックダウンは bOVA分解に影響を与えないことを示す図である。（a)親 DC2.4細胞（レーン 1)と比較して、クローンィ匕していない安定トランスフエクタント（レーン 2 ;TAP1- 145、レーン 3 ;TAP1-149)は、 TAP-1タンパク質の発現に関し、特異的な減少を示した。（b)親 DC2.4細胞とノックダウン DC2.4細胞とをそれぞれ b OVAとインキュベートした後、 bOVAの分解を測定した結果を示す図である。左から、 0時間、 2時間、 4時間。（c)上記 (b)の結果を定量ィ匕した図である。

[図 6]DC2.4細胞における外因性添加 OVAの細胞内局在を示す図である。 OVAの細胞内局在を、抗 OVA抗体で標識して (赤色)検出した。（a)は初期エンドノーム、 (b) は caveosome、（c)は後期エンドノーム、（d)および（e)は小胞体、（f)はゴルジ装置が緑色で示されている。（C)において、細胞の縁部を点線で示した。（C)と（d)における挿入図は、四角で示した細胞をより高い拡大率で示したものである。

[図 7]DC2.4細胞の膜画分にっ、て密度勾配遠心を行った結果を示す図である。 (a) OVAとインキュベートした DC2.4細胞を、ホモジナイズして膜画分を調製し、 2.5-30% の Optiprep density gradient centrifogationにかけた。上パネノレは、各画分を SDS- PA GEで分離し、抗 OVA抗体を用いてブロットした図である。下パネルは、上パネルで示した膜シートと同じものを、各種抗体でプロットした図である。（b)膜画分を 10-30%密度勾配で解析した。レーン番号は、各密度勾配のフラクションを示す。

[図 8]Sec61、 VCP、 CHIPをノックダウンした結果を示す図である。親 DC2.4細胞またはノックダウン DC2.4細胞をそれぞれ SIINFEKL (配列番号 15)ペプチドまたは OVAとインキュペートし、 IL-2産生量を指標として OT-I CD8+T細胞の刺激を観察した。 (a) OVA と IL-2産生との関係を示す用量反応曲線である。白カラムは OVAを、黒カラムは bOV Aを示す。（b)ラタタスタチン（10 μ Μ)と MG— 132 (25 μ Μ)は OVA〖こよる刺激（黒バー）を抑制した力 SIINFEKL (配列番号 15)ペプチドによる刺激（白バー）は抑制しな、。 ( c) Sec61 (S22)、 VC(V41)、 CHIP(C4)をノックダウンした DC2.4細胞は、 OVA刺激の減少が観察された。 (d)ノックダウンした細胞のクローンは、本質的に (c)と同じ結果を示した。

[図 9]DC2.4細胞による MHCクラスとクラス IIによる抗原提示に対する NH C1の効果を

4

観察した図である。 NH C1存在下で前処理した DC2.4細胞を、 OVAと培養し、 MHCク

4

ラス抗原提示に対する OT-I CD8+T細胞の刺激 (丸）および MHCクラス II抗原提示に対する ΟΤ-Π CD4+T細胞の刺激 (三角）を、 IL-2産生量の測定により決定した。 NH C

4

1存在下の IL-2産生量はコントロール（IL-2産生は OT-Iに対し 700pg/ml、 OT- IIに対し 20pg/ml)に対する相対比としてあらわした。

[図 10]GST- OVAまたは GST- OVA-KDELを HSP90存在下または非存在下で DC2.4 細胞とインキュベートし、該細胞から GST- OVAを回収し、 SDS- PAGEおよびゥエスタンブロットを行った結果を示す図である。レーン 1,2は細胞のみ、レーン 3,4は細胞を G ST-OVAと HSP90非存在下または存在下でインキュベートした結果を示す図である。レーン 4およびそのコントロール（レーン 3)について、取り込まれた GST- OVA量（下側の図）とポリュビキチン化された GST- OVA量を比較すると、 HSP90存在による取り込み量の増加はそれほど多くないが、 HSP90存在によるポリュビキチン化の増加が非常に顕著であることがわかる。レーン 6をレーン 4と比較すると、レーン 6はポリュビキチン化された GST- OVA量が顕著に多い。このこと力、 Hsp90が存在するとき KDEL (配列番号 3)付加が GST-OVAの取り込みを増加させ、かつポリュビキチンィ匕を促進していることがわかった。

[図 ll] (a) DC2.4細胞あるいは BMDCと OVAとを HSP90存在下または非存在下でインキュペートし、 OT-I CD8+細胞に対する抗原提示を測定した結果を示す図である。 H SP90を添加すると、抗原提示が高まることが明ら力となった。（b)前記 (a)の DC2.4細胞のデータと同じ条件で、ただし、 Hsp90の濃度を変えて測定した（10 g/ml,50 g/ ml)。 Hsp90の濃度依存的に抗原提示能力が高くなることが示された。

[図 12]DC2.4細胞と OVAを、 lactacystin (LC)存在下あるいは非存在下、 Hsp90存在下あるいは非存在下でインキュベートし、細胞に取り込まれた OVAを測定した結果を示す図である。時間はインキュベート時間を表す。右側の 8レーンが示すように、 Hsp9 0が存在すると、 OVAの取り込みが増加した。

発明を実施するための最良の形態

[0020] 本発明は、榭状細胞によって抗原提示されやすいタンパク質の選択方法に関する。本発明は、抗原提示されやすいタンパク質、すなわち、 CTL誘導能力の高いタンパク質ある、は免疫誘導効果の高、タンパク質を選択する方法である。タンパク質の免疫誘導効果を直接的かつ一般的に評価する方法が存在し得ないため、これに代わる方法として、榭状細胞のクロスプレゼンテーションの一連の過程を 3段階にわけ、各段階について数値ィ匕し、これら各段階の数値にもとづき、タンパク質の抗原提示されやすさの相対的評価を行う方法である。

[0021] 本発明の方法は、少なくとも、「単離された榭状細胞に被験タンパク質を接触させ、該榭状細胞に取り込まれた被験タンパク質の量を測定する工程」（以下、「取り込み量測定工程」と省略)、「単離された榭状細胞に被験タンパク質を接触させ、榭状細胞中のポリュビキチンィ匕された被験タンパク質量を測定する工程」（以下、「ポリュビキチン化量測定工程」と省略)、「単離された榭状細胞に被験タンパク質を接触させ、榭状細胞に取り込まれた被験タンパク質残存量を測定する工程」（以下、「残存量測定工程」と省略）のヽずれか一つ以上の工程を含む。少なくとも一つの工程が含まれていればよぐいずれか二つの工程の組み合わせでも、三つの工程全てを含んでいてもよい。

[0022] 本発明の方法の被験タンパク質は、榭状細胞による貪食の対象となり、プロテアソーム分解の対象となり得るものであればよぐ種類や大きさは問わない。一般的には、ポリペプチド鎖力構成されている分子のうち、分子量力 ,000以上のものをタンパク質、以下のものをペプチドとよんで区別することが多いとされているが（東京化学同人化学大辞典)、榭状細胞によって取り込まれ、プロテアソーム分解を受ける限り、分子量にはこだわらず、本発明の被験タンパク質に含まれる。また、単純タンパク質であってもよぐ核タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、色素タンパク質、金属タンパク質、等の複合タンパク質であってもよい。癌抗原タンパク質や感染したウィルス由来タンパク質は、本方法の好適な対象である。

[0023] 本発明の方法に用いる榭状細胞は、哺乳類由来の細胞が好ましぐより好ましくは、ヒト由来の細胞である。単離された細胞の代わりに、細胞株を用いてもよい。テーラ一メード治療を行うことを目的としてタンパク質の選択を行う場合は、治療対象となる患者本人由来の細胞を用いることが好ましい。

[0024] 本発明の方法に用いる榭状細胞は、未成熟なものを用いることが好ま U、。榭状細胞は未成熟なときに、外部から抗原をよく取り込み、成熟するにしたがって、取り込んだ抗原を強く提示するようになるからである。このような榭状細胞は、骨髄あるいは末梢血の CD34陽性前駆細胞力ある、は単球から、 GM-CSFを用いて誘導する方法、および末梢血単核球より直接分離する方法等により調製することができる。

[0025] クロスプレゼンテーションにより外来抗原タンパク質由来ペプチドが榭状細胞表面に抗原提示されるためには、まず、外来抗原タンパク質が榭状細胞に取り込まれる必要がある。取り込み量測定工程は、榭状細胞に取り込まれた被験タンパク質の量を測定する工程である。基本的には、榭状細胞に被験タンパク質を取り込ませること、および、細胞内に取り込まれたタンパク質を測定することを実施すればよい。

[0026] 榭状細胞に被験タンパク質を取り込ませるためには、榭状細胞と被験タンパク質を接触させる工程を実施すればよい。被験タンパク質に接触した榭状細胞は、該タンパク質を貪食あるいはエンドサイト一シスにより細胞内に取り込む。このとき、取り込まれたタンパク質がプロテアソームによって分解されるのを防止するため、両者の接触は、ラタタスタチンや MG-132等のプロテアソーム阻害剤存在下で行ってもよ!、。

[0027] タンパク質を取り込んだ榭状細胞は、遠心分離法でミクロソーム分画を調製して測定用サンプルとすることができる。ミクロソーム分画を用いるのは、抗原タンパク質が榭状細胞に取り込まれると、小胞体または後期エンドソーム力なる膜小胞に蓄積されるからである。または、細胞を十分に洗浄してから細胞抽出液を調製し、測定用サンプルとしてもよい。

[0028] 榭状細胞に取り込まれた被験タンパク質の量の測定は、被験タンパク質に対する抗体を用いて行うことができる。または、あらかじめ被験タンパク質を標識し、標識を利用して測定してもよい。例えば、ピオチン、ヒスチジン、 GSTや、 FITC、 Cy3、 Cy5、 GFP等の蛍光標識物質、または放射性標識物質などによって標識することができる。標識物質は、抗原性に影響を与えな、物質を選択することが望ま、。

[0029] 測定法は、ピオチン標識ィ匕した OVA抗原の実施例にあるように、サンプルを SDS- 電気泳動後、ストレプトアビジンを用いてウェスタンブロッテイングを行い、画像解析により数値ィ匕する方法を採用することができる。あるいは、 EIA法、 ELISA法、 RIA法、 CLIA法、 CLEIA法等の各種公知免疫測定法により、サンプル中のタンパク質を測定してちよい。

[0030] 上記のようにして、各被験タンパク質の量につ!ヽてそれぞれ測定値を得る。被験タンパク質の中でより高い測定値が観察されたタンパク質は、被験タンパク質の中で相対的に榭状細胞に取り込まれやすいタンパク質である。

[0031] 一例を挙げて説明する。まず、被験タンパク質を複数用意する。被験タンパク質をピオチンで標識する。次に、標識タンパク質を榭状細胞に取り込ませるため、榭状細胞と標識タンパク質を一定時間インキュベートする。 SDS—電気泳動後、ストレブトァビジンを用いたウェスタンブロッテイングを行、、定量化する。

[0032] ポリュビキチン化量測定工程は、榭状細胞に取り込まれた外来抗原タンパク質のうち、ポリュビキチンィ匕を受けたタンパク質の量を測定する工程である。この工程は、本発明者らにより、榭状細胞のクロスプレゼンテーションの過程において、外来抗原タンパク質がプロテアソーム分解の前提としてポリュビキチンィ匕を受けることが明らかになったことに基づく。実施例に示すように、ポリュビキチン化タンパク質の測定値は、そのタンパク質による抗原提示レベルと正の相関関係があることが確認された。したがって、ポリュビキチンィ匕量の測定は、抗原提示の強弱を知るための一つの指標になりうる。

[0033] ポリュビキチン化量測定工程は、被験タンパク質に対する抗体またはタンパク質を標識した場合は標識結合物質と、抗ポリュビキチン抗体の両方を用いて実施することができる。

[0034] 一例を示せば、実施例のように、ピオチン標識した被験タンパク質を榭状細胞とプ口テアソーム阻害剤存在下でインキュベートして細胞抽出液を作製し、ストレプトアビジンと抗ポリュビキチンィ匕抗体を用いたウェスタンブロッテイングを行、、ポリュビキチン化された抗原タンパク質の量を定量ィ匕することができる。あるいは、抗被験タンパク質抗体または標識結合物質を用いたァフィユティーカラムにより精製し、精製物質中のポリュビキチンィ匕タンパク質の量を、抗ポリュビキチン抗体を用いた各種免疫測定法により測定する方法も考えられる。

[0035] 残存量測定工程は、本質的に、ポリュビキチンィ匕された外来抗原タンパク質のプロテアソームによる分解速度を知ることを目的とする。外来抗原が抗原提示されるためには、榭状細胞中でプロテアソーム分解を受けることが必要である。したがって、プロテアソーム分解速度は、外来抗原が抗原提示されやすヽかどうかを知るための一つの指標となりうる。プロテアソーム分解速度を知るには、ポリュビキチンィ匕された外来抗原タンパク質のうち、プロテアソーム分解を受けてヽな、まま残存して、るタンパク質の量を、時間経過を追って測定することで可能となる。未分解量の減少速度は、プ口テアソーム分解速度を反映する。

[0036] 具体的には、プロテアソーム阻害剤非存在下で榭状細胞と被験タンパク質を接触させ、榭状細胞中の被験タンパク質の量を、時間経過を追って測定する。測定方法は、取り込み量測定工程と同様、抗被験タンパク質抗体を用いて、または標識を利用して、各種公知方法で行うことができる。一例を挙げて説明する。標識した被験タンパク質と榭状細胞を、プロテアソーム阻害剤非存在下でインキュベートする。 0時から経時的にサンプルを回収する。細胞を洗浄後、抽出液を作製し、 SDS-電気泳動およびウェスタンブロッテイングを実施して残存した標識タンパク質を定量する。残存タンパク質の経時的変化から、速度を計算する。

[0037] このようにして得られた各工程の測定値は、被験タンパク質の抗原提示されやすさの指標となる。被験タンパク質は、取り込み量測定工程とポリュビキチンィ匕量測定ェ程は測定値が高い方が、残存量測定工程では、残存量減少速度が高い方が、より抗原提示されやすい。各被験タンパク質の測定値を比較して、どのタンパク質が相対的に抗原提示されやすいかを評価することができる。抗原タンパク質の抗原提示されやすさの評価は、上記三工程の測定値全てを指標としてもよいし、いずれか一つまたは二つの工程の測定値を指標としてもょ、。

[0038] また本発明は、 CTL誘導能の高い榭状細胞の製造方法に関する。本製造方法は、上記「榭状細胞にお!ヽて抗原提示されやす!ヽタンパク質等の選択方法」の実施と、該方法によって選択されたタンパク質を取り込んだ榭状細胞の回収とを特徴とする。抗原提示されやす!ヽタンパク質を取り込んだ榭状細胞は、榭状細胞表面上の該タンノク質由来ペプチドを介し、高い CTL誘導能を発揮すると考えられる。

[0039] 榭状細胞を回収する工程は、抗原提示されやす!/ヽタンパク質を選択する過程の途中に行ってもよいし、タンパク質の選択が完了した後に行ってもよい。一例を説明する。まず、榭状細胞と複数の抗原タンパク質を用意する。各抗原タンパク質をそれぞれ榭状細胞と接触させて培養する。各抗原タンパク質と接触させた榭状細胞にっヽて、取り込み量測定工程、ポリュビキチンィ匕量測定工程、残存量測定工程の各工程を実施するが、測定は培養細胞の一部のみを用いて行う。各工程の測定値に基づき抗原提示されやすいタンパク質を選択する。残しておいた細胞のうち、選択されたタンパク質存在下で培養された榭状細胞は、榭状細胞表面上に「抗原提示されやすヽタンパク質」由来ペプチドを提示し、高い CTL誘導能を発揮すると考えられ、そのまま「CTL誘導能の高い榭状細胞」とすることができる。あるいは、最初に上記「榭状細胞にお!ヽて抗原提示されやす!ヽタンパク質等の選択方法」により抗原提示されやすヽタンパク質を選択し、次に、選択されたタンパク質を榭状細胞に取り込ませ、該榭状細胞を回収してもよい。

[0040] 本発明の「榭状細胞にお!ヽて抗原提示されやす！ヽタンパク質等の選択方法」および「CTL誘導能の高い榭状細胞の製造方法」は、癌免疫療法において特に有用である。本発明の方法によって選択されたタンパク質等や製造された榭状細胞を使用した榭状細胞ワクチンは、癌に対する免疫を強く誘導すると考えられ、治療効果の向上が期待できる。すなわち、本発明の「榭状細胞において抗原提示されやすいタンパク質等の選択方法」および「CTL誘導能の高い榭状細胞の製造方法」は、あるタンノク質あるいは榭状細胞が癌抗原を利用したワクチンとして適切に使用できるかどうか検定する目的で使用できる。さらに、感染性微生物由来タンパク質について本発明の方法を実施すれば、感染症治療用の榭状細胞ワクチンの製造も可能になると考えられる。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0041] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

[実施例 1]蓄積 OVAのプロテアソーム依存分解

外来抗原の細胞内局在を細胞分画法により検討した。抗原モデルとして-ヮトリアルブミン Ovalbumin (OVA)、榭状細胞のモデルとして、マウス榭状細胞の培養細胞株である DC2.4 (ノヽプロタイプ H-2Kb)を用いた。 DC2.4細胞株は、榭状細胞由来であり、クロスプレゼンテーション等の榭状細胞の多くの性質を保ったまま株化されたものである。またコントロールとして、ハプロタイプ力 ¾C2.4と同じ H-2Kbである BMDCを用いた。 BMDCは、 C57BL/6マウス（SLC)の骨髄細胞から 5%FCSを添カ卩した RPMI- 164 0中で 5ng/ml GM-CSF (MBL)を用いて誘導し、培養 5日後に細胞を磁性ビーズで精製したものを用いた。

[0042] bOVA抗原を取り込ませた DC2.4細胞を、 250mMスクロースを含む 10mM Tris- HC1

(pH7.4)に懸濁し、ガラスビーズでホモジナイズし、 250,000xgで 30分間遠心して分画した。上清を可溶分画とし、沈澱は上記と同じバッファーで懸濁してミクロソーム分画とした。一定量を 1% TritonX-100存在下または非存在下で 100 g ml—¹トリプシンと共にまたは無しでインキュベートした。 bOVA回収前に大豆トリプシンインヒビター（Si gma)を 500 μ g ml—¹添カ卩した。

[0043] 上記の結果、細胞に取り込まれた bOVAの 70%以上がミクロソーム分画からトリプシン抵抗性として回収された。ミクロソーム分画に回収された bOVAは、トライトン X100で処理すると、トリプシンで分解された。このことは、取り込まれた bOVAの大多数が膜状の細胞成分構造の内部に蓄積していることを示唆する（図 la)。また、同じミクロソーム分画に内在性 ERタンパク質である BiPが検出された（図 la)。すなわち、ミクロソーム分画は ER分画を含むことがわ力つた。

[0044] 次に、 DC2.4.細胞を bOVAと 1時間インキュベートし、 4時間まで追跡した。細胞と結合した bOVAを、総セルライセートからストレプトアビジン-ァガロースで回収し、 SDS-P AGEで分離した。細胞と結合した bOVAは、時間の経過にしたがって減少したが、プ口テアソーム阻害剤であるラクタシスチンまたは MG-132の存在下では、この減少はブロックされた（図 lb,c)。リソソーム阻害剤の塩化アンモ-ゥムは、 bOVA分解に対し顕著な影響は与えなかった（図 lc)。このことは、リソノームのプロテアーゼは抗原分解に関与してヽな、ことを示唆して、る。

[0045] 本質的に同様の結果力 b-OVAの代わりに GST- OVAに曝露した DC2.4細胞や bO VAに曝露した骨髄由来 DC (BMDC)からも得られた (データ示さず)。

[0046] また、細胞に結合した bOVAの大多数は、無処理 bOVAと同じ分子量を示した（図 1 d)。カロえて、抗ポリュビキチン抗体と抗 OVA抗体によって示されるとおり、有意な量の bOVAがポリュビキチン化されたことが見出された（図 Id)。これらの結果は、未分解の bOVAが膜状のオルガネラに蓄積され、ュビキチン-プロテアソーム経路を通じて分解されることを示唆する。このような特徴を持つタンパク質分解は、 ER関連分解 (E RAD)と呼ばれるものと本質的に同じである。本発明者らは、 DC2.4細胞中に蓄積された bOVA力 ERADによって、または同一ではないとしても極めて類似したタンパク質分解機構によって分解されることについて、以下に 3つの証明を示す。

[0047] [実施例 2]蓄積された OVAと ERAD関連タンパク質との関連

上記仮説を立証するため、まず、蓄積された OVAと ERから細胞質への逆行性輸送関連物質との関連にっ、て共免疫沈澱法により検討した。 2xl0⁷個の DC2.4または B MDC細胞を 10 μ M MG- 132を含む培地中で bOVA 250 μ g ml—¹存在下で 4時間培養した。細胞を 1%ジギトニンとプロテアーゼ阻害剤を含む 20mM HEPES pH7.6で溶解し、ピオチン標識サンプルを回収した。サンプルはプロテイン Gセファロース（Amersham Pharmacia Biotech)であらかじめ不要物を除去し、沈降のための抗体（抗 Sec61 β、抗 Sec61 a、抗 VCP、抗 BiP、抗 PDI、抗 calreticulin、抗 TAP1、抗 TAP2)とインキュべートした後、プロテイン Gで免疫沈澱物を回収した。 -ヮトリ抗 CHIP抗体を使った場合は、ゥサギ抗 IgYカラム（Mr.S.Seki,MBL)で免疫沈澱物を回収した。沈降サンプルは、 SDS- PAGEおよびウェスタンブロッテイングで解析した。

[0048] Sec61複合体を抗 Sec61 β抗体または抗 Sec61 a抗体と免疫沈降したところ、ラクタシスチンの存在下または非存在下で bOVAとインキュベートされた DC2.4細胞において、 bOVAの一部が Sec61と結合しているのが観察された（図 2a,b)。 bOVAとインキュペートされた DC2.4細胞力ゝらのサンプルを抗 VCP抗体と免疫沈降した場合もまた、 bO VAと VCPとの結合を示した（図 2c)。 3種類の ER常在タンパク質、 BiP、タンパク質ジスルフイドイソメラーゼ (PDI)、 calreticulinも OVAと結合することが見出された（図 2d-f)。興味深!/、ことに、 bOVAの一部が E3-ュビキチンリガーゼである CHIPと結合して!/、ることが明らかになった（図 2g)。上記タンパク質とは逆に、 bOVAは TAP1または TAP2と結合しなかった（図 2h,i)。

[0049] 上記 ERAD関連タンパク質と bOVAとの結合についてさらに確認するため、共精製実験を実施した。同時精製実験は以下のように行った。 DC2.4細胞と BMDCを、それぞれ bOVA (250 μ g ml"¹)と共にインキュベートし、 PBSで 2回洗浄し、プロテアーゼィンヒビターカクテル（Sigma)と共にジギトニンバッファー（共精製用： l %digitonin in 20 mM HEPES pH7.6)に溶解した。サンプルはストレプトアビジンァガロースビーズ（SA ビーズ）（Novagen)を用いて室温 1時間で沈殿させた。沈殿したサンプルは、 7.5-15 %SDS- PAGE (Biocraft)で分離し、ウェスタンブロッテイングを行うため、 Immobilon P ( Millipore)〖こ移した。タンパク質のバンドは化学発光法（Amersham Pharmacia Biotec h)により可視化した。

[0050] BiP、 Sec61 a、 Sec61 β、 VCP、 calreticulinおよび CHIPと bOVAとの結合は、細胞ライセートからストレプトアビジンビーズを用いた bOVAと上記タンパク質との共精製によっても示された（図 3A)。本精製実験において、 TAP1/2が bOVAと結合しないことが再び観察された。抗 Sec61抗体、抗 VCP抗体とインキュベートした骨髄由来 DC (BMD C)ライセートは、 bOVAと免疫沈降し（図 2j,k)、 BiPと VCPは bOVAと共精製された。

[0051] CHIPを含む上記分子と結合した DC2.4細胞中の bOVAの多くは、無処置の bOVAと同じ分子量を有することは注目に値する（図 2a-g)これらの結果は変性した bOVAが E Rまたは ER関連構造に分解を受けずに蓄積され、 Sec61トランスポーターを解して細胞質へ輸送され、その後、少なくとも部分的には CHIPが関与するポリュビキチンィ匕を受け、最終的にプロテアソームによる分解に供されることを示唆している。

[0052] [実施例 3] ERAD阻害力 Sもたらす蓄積 OVA分解の減少

次に、 ERADの関与をさらに確かめるため、 ERAD阻害、例えば、 Ca²⁺枯渴ゃ thapsig argin処理によって bOVAの蓄積が影響を受ける力否かを検討した。 ER内の Ca²⁺を枯渴させると ERADが阻害されることが知られている。また、 Thapsigargin(Tg)は ER膜に結合しィオノフォアとして機能することで、 ER内腔の Ca²⁺濃度を低下させ、 ERADを阻害することが知られており、 Tg存在下では bOVAの ERADによる分解は抑制されると予想される。 DC2.4細胞を MG-132存在下で bOVAとパルスし、続いて PBSまたは ImM EGTAを含む PBSで洗浄し、 4時間にわたり追跡した。図 4aに示すように、蓄積した b OVAは Ca²⁺枯渴では減少しなかった。あら力じめ EGTAに曝した細胞に Ca²⁺を再添カロすると、 bOVA分解が回復した（図 4a)。このことは、 Ca²⁺枯渴が DC2.4細胞に不可逆的ダメージを引き起こした可能性を排除する。 thapsigarginもまた蓄積した bOVAの分解を阻害した (図 4b)。

[0053] さらに、 tunicamycin処理による bOVA蓄積への影響を検討した。細胞を tunicamycin

(Tm)処理すると、 N型糖鎖付加が阻害され、 ER内腔にフォールデイングが異常になつたタンパク質が蓄積する。このような構造的に異常なタンパク質は ERADのよい基質となること力ら、取り込まれた bOVAの ERADによる処理を tunicamycin処理によって生じた misfoldedタンパク質が競合阻害すると予想される。 DC2.4細胞を tunicamycinで処理すると、やはり bOVAの分解を阻害した（図 4b)。 tunicamycin処理の結果、 ERAD のよ、基質となるために分解にぉ、て bOVAの競合する N-グリコシルイ匕欠損タンパク質が ER中に蓄積した。

[0054] 上記仮説の 3番目の立証として、 ERAD経路における基質の逆行輸送に関与するタンパク質をノックダウンするために RNAi法を行った（図 4c)。 pSilencerl.0-U6 (Ambion )由来の 1.2kb PvuIIフラグメントを pEGFP- C1 (BD Biosciences)の Smaサイトに挿入し、 p60とした。 p600 A Cは、 p60から 1.3Kb Ase-Bglllフラグメントを削除して作製した。 S ec61、 VCP、 CHIPを標的とする siRNA配列を、業者のプロトコールにしたがって、 p60 A C (Sec61- 22)、 p60 (VCP- 41)、または pSilencer2.1-U6hygroベクター（Ambion) (C HIP-4)に挿入した。 Sec61 aのノックダウンには、 Sec61 aの標的配列 5つのうち 2つが顕著に有効であった。 3つは有効ではなかった。 VCPの標的配列 5つのうち 2つおよび CHIPの標的配列 5つのうち 1つが顕著に有効であった。本実施例で用いた有効な標的配列は、以下のとおりである。

Sec61-22： AATGATCATTACTATCGGT; (配列番号 7)

VCP-41： AATCCTTGAATGAAGTAGGCT; (配列番号 8)

CHIP- 4： CAGTATCGAGGAACGGCGC (配列番号 9)

[0055] Sec61 aノックダウン DC2.4 (S22および S22-3)細胞にお!、て、蓄積 OVAは親 DC2.4 細胞よりも遅い速度で減少した（図 4d,e)。 Sec61 αノックダウン用 siRNAのスクランプル配列は、 Sec61 αの発現量にも bOVA蓄積にも影響を与えな力つた (データ示さず）。これらの結果は、 Sec61 αカ¾0¥ を分解に回すための輸送に関与していることを示唆している。同様に、 VCPノックダウン DC2.4細胞（V41及び V41-1)は、蓄積 bOVA がある程度減少したにもかかわらず、追跡した間は、親 DC2.4細胞よりも多量の bOV Aを維持した（図 4d,e)。

[0056] CHIPノックダウン DC2.4細胞（C4,C4F- 1)を作成し、 CHIPノックダウン下の bOVAポリュビキチン化にっ、て検討したところ、 CHIPノックダウン DC2.4細胞の bOVA取込みは、親 DC2.4細胞への場合の 70%ほどに過ぎなかった（図 4d,f)。この事実にもかかわらず、 bOVAのポリュビキチン化は CHIPノックダウン細胞において 34%に減少した（図 4f)。 OVA蓄積量の減少は、 CHIPノックダウン細胞において減速した（図 4d,e)。逆に、 TAP1ノックダウンは DC2.4細胞中の bOVA分解に影響を与えなかった（図 5)。

[0057] [実施例 4] DC2.4細胞中の蓄積 OVAの局在化上記結果の全てが、 DC2.4細胞に取り込まれた bOVAが ERADを通じて分解されていることを強く支持している。し力しながら、最近になって、プロテオミクス解析や免疫電子顕微鏡観察によって、感染性バクテリアが取り込まれる場所であるファゴソーム力 MHCと、つた抗原提示関連物質や TAP1/2等の ERを構成する一群のタンパク質を含むことが明らかになった。このこと力も本発明者らは、 DC2.4細胞や BMDC中の蓄積 OVAの細胞内局在化について免疫蛍光コンフォーカル顕微鏡によって検討することとした。カルチャースライド（FALCON)上の DC2.4細胞と BMDCを MG-132で 30 分間前処理し、 500 μ g m oVAで 2時間インキュベートした。培地で 3回洗浄した後、細胞を 3.7%ホルムアルデヒドで 10分間固定し、 0.1%TritonX-100 in PBSで室温 10 分間処理して透過処理し、 5%BSA/2%FCSを含む PBS中で所定の抗体により 37°Cで 1 時間インキュベートし、染色した。二次抗体は、 Alexa Fluor488ャギ抗マウス IgG F(ab' )フラグメント、 Alexa Fluor488ャギ抗ラット IgGおよび Alexa Fluor 546ャギ抗ゥサギ F(a

2

b')フラグメント（Molecular Probes)を使用した。画像は、蛍光装置のついた 1X70 (オリ

2

ンパス）倒立顕微鏡を用いて取り込み、 Deltavision deconvolution microscopy softwa re (Applied Precision)によって処理して取得した。

[0058] 細胞中に OV ポットまたはスペックルが検出された力これら OVA分布は外来物質の取込みに関与することが知られて、る初期エンドソーム (EEA1を免疫染色）および caveosome (caveolin-lを免疫染色）のどちらとも重複しなかった（図 6a,b)。その代わりに、 OVA免疫蛍光は少なくとも部分的には後期エンドソーム (抗 Lampl抗体で染色）（図 6c)、 ER (図 6d)と共局在した。抗 KDEL抗体で標識した ERは網目構造を示した力 OVA分布は ER全体に均一ではなかった（図 6d)。同様に、 OVAは後期エンドソームの制限された領域で検出された（図 6c)。 OVAはゴルジ装置 (抗 GM-130抗体で染色）とは共局在しなかった（図 6f)。 ER中の蓄積 OVA局在を、 BMDCについても確認した（図 6e)。これらの結果は、 DCへ取り込まれた OVAは ERADかつ Zまたはファゴソームや後期エンドソームといった ER成分を含む他のオルガネラ中の同様のタンパク質分解経路にしたがうという本発明者らの仮説に一致する。

[0059] [実施例 5]密度勾配遠心による OVA含有膜小胞の細胞成分分画

次に本発明者らは、ィォジキサノール勾配遠心によって DC2.4細胞の膜画分中の蓄積 OVAの分布を検討した。密度勾配遠心のために、 1)θνΑ (500 /ζ g/ml)と 3時間ィンキュペートした DC2.4細胞を、 PBSで 2回洗浄し、 homogenization medium (0.25Mスクロース、 ImM EDTA、 10mM Hepes- NAOH pH7.4)に懸濁し、 Dounce homogenizer の lOstrokesで破壊した。未破壊細胞と核は、 2,000xgで 10分間遠心して除去した。核を除去した（postnuclear)上清を 100,000xgで 45分間遠心してペレットとし、 homogeniz ation mediumに再懸濁し、 2.5- 30または 10- 30%の不連続 Optiprep (Gibco/Invitroge n)グラジェントに重層した。遠心は、 Bechman SW 60Ήローターを用い、 4°Cで 2.5-30 %グラジェントの場合は 200,000xgで 2.5時間、 10-30%グラジェントの場合は 300,000 xgで 3時間行った。各遠心チューブの上層から取得した 11画分を TCA沈殿させた後、 SDS- PAGEおよびウェスタンブロッテイングで解析した。

[0060] OVAは画分を通じて検出された力 OVAのピークは明らかに 2.5-30%密度勾配中のフラクション #10 (図 7a)および 10-30%密度勾配中のフラクション #5 (図 7b)に観察された。画分中の Sec61、 BiP (KDEL)、 Rab5の分布は、 OVAの場合と類似していた（図 7)。逆に、後期エンドソームマーカーである Lamp-1は、 2.5%-30%密度勾配中にフラタシヨン #6と #10の 2つのピークを示した。ゴルジマーカーの GM130とリサイクリングェンドソームマーカーのトランスフェリンレセプター（Tfr)は別々に回収された。これら結果の全ては免疫蛍光顕微鏡によって得られた結果と一致した。

[0061] [実施例 6] Sec61、 VCP、 CHIPのノックダウンによるクロスプレゼンテーション低下

ERADに関与する細胞構成物質のノックダウンが外来性 OVA抗原のクロスプレゼンテーシヨンを低下させるか否かにつ、て、 DC2.4細胞と OT-Iマウスのナイーブ CD8+T 細胞とを用いた抗原提示レベルの評価系によって検討した。榭状細胞のモデルとして用いた DC2.4細胞は、マウス MHCクラスレヽプロタイプが H- 2Kbである。 OT- I (H- 2K b)マウスは、 H-2Kb分子上に提示された OVA由来の抗原ペプチド（SIINFEKL) (配列番号 15)を認識する T細胞受容体 (TCR α , β )を発現するトランスジエニックマウスである。 OT- 1マウスの CD8+細胞は、 DC2.4細胞または Η- 2Kbマウス由来の BMDCが提示する OVAペプチドを認識し、活性化される。 DC2.4細胞を OVAまたは bOVAでインキュペートして固定した後、さらに OT-Iマウスのナイーブ CD8+T細胞とインキュベートしたときに、 OT-I CD8+T細胞によって産生される IL-2量は、 DC2.4細胞によって提示された OVA抗原による T細胞刺激の指標となる。

[0062] 親またはノックダウン DC2.4細胞を、ラクタシスチンまたは MG-132存在下または非存在下において 50 μ g ml—¹ポリミキシン Bを添カ卩した培地で 30分間プレインキュペートし、 OVA (250 μ g ml—¹)または SIINFEKL (配列番号 15)ペプチド（10ng ml—¹)で 6時間ィンキュペートした。細胞を洗浄し、 1%パラホルムアルデヒドで固定し、マイクロタイタープレート（1ゥエルあたり 5xl0⁴)に分注した。 OT-1マウスの脾細胞から磁性ビーズで精製した 5xl0⁴ CD8+ T細胞を各ゥエルにくわえ、 IL- 2分泌を 24時間のインキュベーションの後に ELISA法 (BD Biosciences)で三重測定した。

[0063] 図 8aに示すように、 OVAと bOVAは CD8+ OT-I T細胞の刺激に対し同等に抗原性を示した。プロテアソーム阻害剤は、予想通りに OVA抗原提示を抑制した（図 8b)。逆に NH C1は、 OT-I CD8+ T細胞に対する MHCクラスとの OVA抗原提示を減少させな

4

かったが、 OT-II CD4+細胞への MHCクラス IIとの提示を阻害した（図 9)。 Sec61、 VC Pまたは CHIPのノックダウン効果は、 siRNA発現ベクターを導入した DC2.4のクローン化していないトランスフエクタント（S22,V41,C4)とクローン化したトランスフエクタント（S 22-3,V41-l,C4-l)を用いて試験した（図 8c,d)。 Sec61は ER関連タンパク質の正方向の輸送および逆行輸送の両方に関与していることから、 Sec61のノックダウンが細胞外から添加された OVAの抗原提示を減少させたことは驚くに値しなカゝつた。 ER関連タンパク質の逆行輸送に必要な VCPのノックダウンもまた、 DC2.4細胞による抗原提示を低下させた。これらの結果は、外因的に添加された OVAはクロスプレゼンテーションのために ERADを経由して処理されるという本発明者らの仮説を支持する。さらに、 DC2.4細胞中の OVA蓄積効果と一致して、 CHIPのノックダウンは OVAクロスプレゼンテーシヨンの低下を招いたことから（図 8c,d)、クロスプレゼンテーションの際の OVAポリュビキチンィ匕に対する E3ライゲースとして CHIPが機能していることが示唆される。

[0064] [実施例 7]小胞体局在配列付カ卩によるポリュビキチンィ匕促進

ER内腔に局在するタンパク質のカルボキシル末端に小胞体局在配列である KDEL 配列（Lys-Asp-Glu-Leu) (配列番号 3)を付加すると、 ERとゴルジ体間を繰り返し輸送され、そのタンパク質の ERADが促進されることが報告されている。そこで、 OVAの C 末端に KDEL (配列番号 3)を付カ卩したものを DC2.4細胞に取り込ませ、 SDS-PAGEおよびウェスタンプロットにより、取り込み後にポリュビキチン化された OVAを観察した。 KDEL配列付加 OVAは、下記のようにして構築および発現させた。 OVAをコードする DNA配列を含むプラスミドを铸型とし，プライマーとして oligo-1 (配列番号 10)と oligo2 (配列番号 11)を用いて PCR法を行なった。増幅した約 1100 bpの PCR産物を pCR-Bl unt vector (Invitrogen)に導入し、 vector- 1とした。 oligo- 3 (配歹 Ij番号 12)と oligo- 4 (配列番号 13)をァニールし、得られた約 100 bpの遺伝子断片を pCR-Blunt vectorに導入し、 vector- 2とした。 vector- 2を Spe Iで消化し、得られた約 130 bpの遺伝子断片を、 Nhe Iで消化した vector- 1に導入し、 vector- 3とした。 vector- 3を BamH I/Spe Iで消化したときに得られる約 1250 bpの遺伝子断片（OVA-KDEL)を、遺伝子発現用べクターに導入し、発現させた。 KDEL配列付加 OVAアミノ酸配列を配列番号 14に示す。

[0065] 結果を図 10に示す。 OVAの C末端に KDEL (配列番号 3)を付カ卩したものを DC2.4細胞に取り込ませた場合と、 OVAを取り込ませた場合を比較すると、基質 (OVA-KDEL )のポリュビキチンィ匕が顕著に促進されることが確認された。

[0066] また、 OVAのカルボキシル末端に（Lys-Asp- Glu-Leu) (配列番号 3)を付カ卩して DC2 .4細胞に取り込ませ、 OT-Iマウス CD8+T細胞を用いた上記抗原提示レベル評価系により、 OVAと OVA- KDELの抗原提示レベルを観察した。 OVAよりも OVA- KDELの方が、明らかに抗原提示が強く認められた (データ示さず)。

[0067] 上記結果から、 OVAと OVA-KDELを比較すると、 OVA- KDELの方がポリュビキチン化をより受けやすぐかつ、より効率よく抗原提示されることがわ力つた。すなわち、ポリュビキチンィ匕の受けやすさと抗原提示されやすさとの間に相関関係があることが明らかになった。このことから、抗原タンパク質のポリュビキチン化測定結果から、該抗原タンパク質によるクロスプレゼンテーションの強さを予測可能ということができる。

[0068] OVAを外部抗原とした場合は、上記のとおり、 OT-Iマウス細胞を用いた抗原提示ァッセィの構築が可能である。しかし、一般には、特定の抗原に対する特異的 TCR発現動物は存在せず、 OVAのような抗原提示アツセィの構築は不可能である。したがつて、ある抗原の抗原提示されやすさを知る必要がある場合において、抗原タンパク質の榭状細胞への取り込みと抗原タンパク質のポリュビキチン化測定によって抗原提示されやすさを推測することは非常に有用といえる。 [0069] [実施例 8] Hspによるポリュビキチン化促進

ブタ由来 HSP90 (10 /z g/ml)存在下または非存在下で、 DC2.4細胞と OVA(0,50,250 μ g/ml)を RPMI1640/10%FCSで 37°C6時間インキュベートした。抗原と HSPを洗浄後、 OT-I CD8+T細胞をカ卩えて 37°Cでー晚培養し、上清に含まれる IL-2量を ELISA法で測定した。その結果、 OVA単独とインキュベートした場合よりも、より強い抗原提示が認められた（図 lla)。また、 Hsp90濃度依存的に抗原提示能力が高くなつた（図 lib)

[0070] 次に、 DC2.4細胞を OVAと lactacystin (LC)存在下または非存在下に一定時間インキュペートし、細胞に取り込まれた OVAを測定した。また、 Hsp90存在下または非存在下において、細胞に取り込まれた OVAを同様に測定した。 Hsp90存在下では、 DC 2.4細胞は、 Hsp90非存在下の場合よりも、より効率よく OVAを細胞内に取り込むことが認められた（図 12)。

[0071] DC2.4細胞と GST- OVAを、 Hsp90存在下あるいは非存在下にインキュベートし、細胞を回収し、抽出液を作製した。 SDS- PAGE後、 anti-polyubiquitin抗体でウェスタンブロットを行った。 Hsp90存在下では、 Hsp90非存在下のときと比較して、 DC2.4細胞に取り込まれた OVAがより強いポリュビキチンィ匕を受けることが示された（図 10)。

[0072] 上記結果から、 OVA単独でインキュベートした場合と Hsp90存在下で OVAをインキュペートした場合とを比較すると、後者の場合に、細胞による OVA取り込み量が増加し、ポリュビキチンィ匕を受ける量も増加することが明らかにされた。この知見から、ある抗原タンパク質の抗原提示測定を行うかわりに、抗原タンパク質の榭状細胞への取り込み及び抗原タンパク質のポリュビキチンィ匕を測定することで代替可能であると結論できる。

産業上の利用可能性

[0073] 本発明によって、一般的に適用可能な、抗原提示されやすい抗原タンパク質の選択方法が提供された。癌免疫治療において癌治療用ワクチンとすべき癌特異的タンノク質の選別は、その後の治療効果を左右する重要な過程である。抗原提示されやすい抗原タンパク質を事前に選択できれば、癌免疫治療において、より適切な治療の提供を可能にできると考えられる。癌治療用ワクチン候補である多くの癌特異的タンパク質の中から、患者個人レベルで最も適切なタンパク質を選択する道が開け、いわゆるテーラーメード的な治療が可能となりうる。すなわち本発明の方法は、より適切な癌特異的タンパク質の選別により、癌免疫療法の治療効果向上をもたらし得ると考えられる。

Claims

請求の範囲

[1] 単離された榭状細胞にタンパク質を接触させる工程の後、少なくとも下記の ω力も ( c)の、ずれか一つ以上の工程を含む、榭状細胞にお!、て抗原提示されやす!、タンパク質の選択方法。

ω該榭状細胞に取り込まれたタンパク質の量を測定する工程

[2] 単離された榭状細胞にタンパク質を接触させる工程と、下記の（a)から (c)に記載したタンパク質の量のうち少なくともいずれか一つ以上を測定する工程と、当該工程の測定値に基づ、てタンパク質を取り込んだ榭状細胞を選択する工程と、該選択するェ程にぉ、て選択された榭状細胞を回収する工程とを含む、 CTL誘導能の高ヽ榭状細胞の製造方法。

(a)該榭状細胞に取り込まれたタンパク質の量

(b)榭状細胞中のポリュビキチンィ匕されたタンパク質の量

[3] タンパク質を標識して用いることを特徴とする、請求項 1または請求項 2に記載の方法

[4] 榭状細胞中のポリュビキチンィ匕されたタンパク質量を測定する工程において、抗ュビキチン抗体を用いることを特徴とする、請求項 1から請求項 3のいずれかに記載の方法。

[5] 請求項 1、請求項 3、請求項 4のいずれかに記載の方法を含む癌抗原ワクチン資格検定方法。