WO2006029774A1 - Herstellung eines von willbrand faktor-präparates mit hoher spezifischer aktivität - Google Patents

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WO2006029774A1
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hydroxyapatite
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Michael Kretschmar
Wolfgang Möller
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Biotest AG
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)

Definitions

  • the invention relates to a method for producing a Willbrand factor preparation with increased specific VWF activity, wherein hydroxyapatite is used as the chromatography medium.
  • Von Willebrand Factor is a glycoprotein that is synthesized in endothelial cells and megakaryocytes. The molecular weight of the monomer is about 225,000 Da. By forming disulfide bridges, dimers are formed in the cell, which in turn associate to oligomers of up to 40 dimeric subunits also via disulfide linkages. The concentration of von Willebrand Factor (VWF) released into the plasma is 5 - 10 mg / 1.
  • the VWF In primary hemostasis, the VWF has the task of mediating the adhesion of platelets to injured subendothelium and, under conditions of high shear, such as in the arterial system, to assist platelet aggregation. As a function in secondary hemostasis, VWF binds factor VIII, an important cofactor in blood clotting, in a non-covalent complex. Factor VIII is thereby stabilized and protected against premature degradation.
  • VWS Von Willebrand syndrome
  • the specific VWF activity is 100-200 U per mg VWF antigen.
  • the specific VWF activity drops drastically during the first work-up steps in the production of VWF preparations. Structurally, this loss of specific activity correlates with proteolytic degradation reactions, which lead to a decrease in the proportion of high molecular weight VWF molecules (multimers) and to an increase in the proportion of low molecular weight VWF molecules (dimers / tetramers).
  • VWF solutions with a low specific VWF activity contain a higher proportion of less desirable low molecular weight VWF oligomers than VWF solutions with a high specific VWF activity.
  • Desirable would be a method by which therapeutically effective preparations with a specific activity of> 100 U per mg of VWF antigen from a source with a specific activity of ⁇ 100 U per mg of VWF antigen can be produced.
  • WO 98/38219 describes a process for the recovery of VWF 1 in which VWF is bound to a cation exchanger at a low salt concentration and recovered by fractional elution VWF with high specific activity.
  • WO 96/10584 describes a method for obtaining high-purity recombinant VWF by means of combined anion exchange / heparin affinity chromatography and EP 0 705 846 describes the separation of high and low molecular weight fractions of recombinant VWF by means of heparin affinity chromatography.
  • the present invention relates to a process for the separation of VWF with high specific activity of VWF with low specific activity, comprising a chromatography with hydroxyapatite as a chromatography matrix.
  • a high specific VWF activity for example, a value of> 120 U per mg of VWF antigen and a low specific VWF activity, for example, a value of ⁇ 70 U per mg of VWF antigen called.
  • highly active or low-active fractions can be defined differently.
  • Another aspect of the invention is a process for preparing a composition having high specific VWF activity, which comprises purifying a VWF-containing composition by hydroxylapatite chromatography.
  • the invention also relates to a process for increasing the specific VWF activity of a VWF-containing composition, which comprises subjecting the VWF-containing composition to hydroxylapatite chromatography.
  • Hydroxylapatite is a form of calcium phosphate with the composition Ca 5 (PO 4 ) 3 OH or Cai 0 (PO 4 ) 6 OH 2 , which can be used as a stationary phase for the chromatography of proteins, nucleic acids and other macromolecules.
  • a ceramic form obtainable by sintering may also be used. Hydroxylapatite can be obtained, for example, from Rad (Munich, Germany). Their ceramic hydroxyapatite is provided in two forms (Type 1 and Type 2).
  • Type 1 material has a higher binding capacity for smaller molecules, eg small proteins, due to larger surfaces.
  • the type 2 material has larger pores in the particles, which allows penetration and thus better binding of large molecules, such as DNA or large proteins.
  • the materials preferably have the following properties:
  • Crystalline or ceramic hydroxyapatite is freely available. Methods for their preparation are known in the art. In the context of the present invention, the use of ceramic hydroxyapatite is preferred.
  • Hydroxylapatite especially in its ceramic-stabilized form, is extremely well suited to carry out processes on an industrial scale. Due to its separation properties, hydroxyapatite offers better resolution than the ion exchange chromatography media described many times. In the hydroxyapatite purification process neither calcium nor amino acids have to be added to the buffers.
  • the process can be carried out in the form of a column chromatography or in a batch process; the performance of column chromatography is preferred.
  • the method includes that
  • step (c) subsequently eluting VWF with high specific VWF activity at higher salt concentration.
  • step (a) a solution containing VWF high and low specific VWF activity is contacted with the hydroxyapatite matrix.
  • the total concentration of sodium and / or potassium phosphate in this solution is usually 0 to 200 mM, preferably 1 to 100 mM, more preferably 1 to 50 mM, most preferably 10 to 30 mM.
  • the hydroxyapatite matrix is washed with a medium salt buffer.
  • the total concentration of sodium and / or potassium phosphate in this wash buffer is usually 100 to 300 mM, preferably 200 to 300 mM, more preferably 200 to 270 mM, most preferably 210 to 250 mM.
  • This VWF is washed out with low specific VWF activity. The higher the pH of the buffer, the lower the salt concentration can be selected.
  • VWF high specific VWF activity can be eluted with a higher salt concentration buffer.
  • the elution buffer usually contains 200 to 500 mM, preferably 250 to 500 mM, more preferably 300 to 400 mM sodium and / or potassium phosphate.
  • the selected salt concentrations By shifting the salt concentrations, yield and purity can be changed.
  • the chosen pH value influences the optimal salt concentration for the wash buffer. The lower the pH, the stronger the binding of VWF to the hydroxyapatite matrix. Accordingly, the selected salt concentrations may be higher at low pH, but lower at higher pHs.
  • the hydroxyapatite chromatography is carried out at a pH of from 5 to 7, preferably from 5.5 to 6.8, more preferably from 6.0 to 6.8, most preferably from 6.2 to 6.5.
  • running, washing and elution buffers, as well as the protein solution to be applied have the same pH.
  • variants are also practicable in which these solutions have different pH values.
  • poorly active VWF molecules can be eluted from hydroxylapatite columns with buffers containing a mean salt concentration.
  • buffers containing 200 to 270 mM sodium or potassium phosphate preferably 220 to 250 mM
  • Sodium phosphate included.
  • buffers containing 180 to 260 mM, preferably 210 to 250 mM, sodium or potassium phosphate would be suitable.
  • the highly active VWF molecules can be eluted with a high salt buffer, for example 250 to 500 mM sodium or potassium phosphate, preferably 300 to 400 mM sodium or potassium phosphate.
  • the binding hydroxyapatite chromatography of the present invention can be combined with other purification techniques. It has proven to be particularly advantageous first to carry out a "continuous chromatography" with hydroxylapatite for depletion of the main impurities. Subsequently, the flow-through fraction is applied to a hydroxylapatite column as described above. VWF molecules are bound and VWF high specific VWF activity is selectively eluted.
  • a continuous chromatography with hydroxylapatite is carried out, wherein VWF does not bind to the hydroxyapatite matrix, and then rechromatograph the flow-through fraction under binding conditions and the VWF fraction eluted with VWF high specific VWF activity.
  • through-flow chromatography comprises (i) contacting a composition containing VWF and one or more contaminating proteins with a hydroxyapatite matrix such that at least one contaminating protein becomes bound to the hydroxyapatite matrix while VWF is substantially not bound to the hydroxyapatite matrix, and optionally subsequently (ii) unbound VWF is separated from the hydroxyapatite matrix.
  • VWF is in the run and at least one contaminating protein, e.g. As fibronectin and / or fibrinogen is bound to the hydroxyapatite.
  • Run-through chromatography is performed at a pH of 6.5 to 8.5, preferably 6.8 to 8.5, more preferably 6.8 to 7.5, most preferably 7.0 to 7.5.
  • running, washing and elution buffers, as well as the protein solution to be applied have the same pH.
  • variants are also practicable in which these solutions have different pH values.
  • the VWF-containing composition which is contacted with the hydroxyapatite matrix by continuous chromatography preferably contains sodium phosphate and / or potassium phosphate.
  • the total concentration of sodium phosphate and / or potassium phosphate in the solution is, for example, 0 to 100 mM, preferably 10 to 50 mM, most preferably 20 to 40 mM, ie a buffer solution having the stated concentrations can be used as the running buffer.
  • VWF preparations can be obtained which contain only small amounts of fibrinogen and fibronectin.
  • the concentration of fibrinogen antigen in the flow-through fraction is lower than 25 ⁇ g / ml, preferably lower than 15 ⁇ g / ml, more preferably lower than 10 ⁇ g / ml, most preferably at most 5 ⁇ g / ml.
  • the concentration of fibronectin antigen in the flow-through fraction is usually lower than 250 ⁇ g / ml, preferably lower than 150 ⁇ g / ml, more preferably lower than 100 ⁇ g / ml, most preferably at most 50 ⁇ g / ml.
  • the concentration of fibrinogen antigen and fibronectin antigen can be determined by methods known per se.
  • the concentration of fibrinogen in the flow-through fraction is preferably less than 10%, more preferably less than 5%, even more preferably less than 2.5% of the concentration of fibrinogen in the application solution (before flow chromatography).
  • the concentration of fibronectin in the flow-through fraction is preferably less than 10%, more preferably less than 5%, even more preferably less than 2.5%, of the concentration of fibronectin in the coating solution (before flow chromatography).
  • the yield of continuous chromatography (based on the mass balance) is generally higher than 50%, preferably higher than 60%, most preferably higher than 75%.
  • phosphate ions For the elution of VWF in binding chromatography, phosphate is a specific agent.
  • VWF-containing solutions in particular VWF-containing plasma fractions, can generally be used as starting materials.
  • VWF can be used at pH values of preferably 6.0 to 6.8, particularly preferably 6.2 to 6.5, at a low salt concentration of 0 - 100 mM potassium or sodium phosphate, preferably at 10-50 mM bound to a hydroxylapatite column.
  • fluoroapatite can be used as the chromatography matrix.
  • Fluoroapatite is made by reacting hydroxyapatite with a fluoride-containing substance.
  • the company Bio-Rad (Munich, Germany) produces e.g. ceramic fluoroapatite by a 90% reaction of ceramic hydroxyapatite with a fluorine reagent.
  • Fluoropatite is much more stable compared to hydroxyapatite under acidic pH conditions. Therefore, fluoroapatite is commonly used to perform chromatographies at lower pH than technically useful for hydroxyapatite.
  • the process of the invention may further comprise one or more of the following steps:
  • the process steps (1) to (5) are preferably carried out before the hydroxylapatite chromatography. However, it is also possible to carry out fewer than the 5 method steps. The order of the steps is not mandatory. Steps (6) to (11) may be performed if desired. In particular, the affinity chromatography is not necessary, since a high purity can already be achieved by the hydroxylapatite chromatography.
  • a pre-purified plasma fraction can be used as a starting material for the processes of the present invention.
  • This may be a further purified cryoprecipitate solution.
  • the cryoprecipitate solution can be precipitated, for example, with aluminum hydroxide and / or further purified by chromatography.
  • the cryoprecipitate solution z. B. be precipitated with aluminum hydroxide and then further purified by anion exchange chromatography.
  • the cryoprecipitate solution be subjected to virus inactivation.
  • Preferred method for virus inactivation is a solvent / detergent treatment as described in U.S. Patent No. 4,540,573.
  • the starting material used may also be a protein solution containing recombinant VWF (rVWF) from cell culture supernatants.
  • rVWF recombinant VWF
  • the term "rVWF” includes both VWF with the wild-type sequence and variants with an amino acid sequence altered from wild-type VWF, wherein one or more amino acids may be substituted, deleted and / or added.
  • the variants usually have VWF activity.
  • a pH precipitation for the separation of fibronectin can be carried out before the hydroxylapatite chromatography.
  • the pH precipitation for the separation of fibronectin from a plasma fraction includes, for example, that
  • the term "plasma fraction" in this context refers to a composition obtained from plasma and containing various plasma proteins.
  • the plasma fraction used as the starting composition in step (i) is a liquid composition.
  • the liquid composition is a solution or suspension, most preferably the composition is a solution.
  • the plasma fraction is dissolved cryoprecipitate. This dissolved cryoprecipitate can be pre-purified by various methods. Examples are aluminum hydroxide treatment, solvent / detergent treatment and / or anion exchange chromatography.
  • the concentration of sodium chloride or potassium chloride in the plasma fraction is preferably 50 to 250 mM, more preferably 100 to 200 mM, most preferably 120 to 150 mM.
  • the plasma fraction may contain, for example, the following buffer substances: citrate ions, acetate ions, phosphate ions and / or amino acids.
  • the concentration of fibronectin in the plasma fraction subjected to step (i) is typically at least 0.05 g / L, preferably at least 0.1 g / L, more preferably at least 0.25 g / L, most preferably at least 0.5 g / l.
  • the concentration of fibronectin in the plasma fraction may be, for example, 0.1 to 5 g / l, preferably 0.1 to 2 g / l.
  • the pH of the plasma fraction is adjusted below pH 5.4.
  • the pH is adjusted below pH 5.3, more preferably below pH 5.2.
  • the adjusted pH is thus preferably in a range of pH 4.5 to below 5.4, preferably in a range of pH 4.7 to 5.3, more preferably in a range of pH 4.8 to 5.2, more preferably in a range of pH 4.9 to 5.1.
  • the adjustment of the pH is achieved by adding an acidic component.
  • the acid component various acids can be used, for example hydrochloric acid, phosphoric acid or acetic acid.
  • the acidic component is usually added over a period of time, for example, dropwise. Thus, gradually a pH value in the above defined range is set ("titrated").
  • the plasma fraction is preferably kept in motion or mixed, for example by stirring. It is still preferably, after adjusting the pH, the plasma fraction is further mixed (eg by stirring) for a certain period of time, generally for at least 10 minutes, preferably for at least 20 minutes, most preferably for a period of 30 to 90 minutes. In this period, sticky aggregates are formed, which receive a significant amount of fibronectin. It is therefore provided according to a preferred embodiment that a suitable stirrer, for example an anchor or paddle stirrer is used, on whose stirring blade the precipitate adheres. The precipitated fibronectin can thus be easily removed from the solution.
  • a suitable stirrer for example an anchor or paddle stirrer is used, on whose stirring blade the precipitate adheres. The precipitated fibronectin can thus be easily removed from the solution.
  • the pH precipitation for the separation of fibronectin can be carried out in a wide temperature range, for example from about 1 ° C to about 37 0 C.
  • Preferred temperature ranges are 4 to 35 0 C, more preferably 10 to 30 0 C, most preferably Procedure carried out at 20 to 25 ° C.
  • the concentration of fibronectin in the plasma fraction can be reduced by at least 50%.
  • the concentration of fibronectin in the plasma fraction is reduced by 70 to 99%, more preferably by 80 to 99%, most preferably by 90 to 98% or by 95 to 98%.
  • the loss of VWF in the precipitation step is at most 50%, preferably at most 40%, more preferably at most 30%, even more preferably at most 20%, most preferably at most 10%.
  • VWF-containing composition obtainable by a method according to the invention as described in the present application.
  • it is a substantially pure VWF preparation.
  • substantially pure means that the composition is substantially free of other proteins, in particular that no fibronectin and no fibrinogen is detectable.
  • the VWF preparation of the invention may have a specific activity of at least 75 U / mg protein, preferably having a specific activity of at least 85 U / mg protein, more preferably at least 100 U / mg protein, most preferably at least 120 U / mg protein ,
  • the inventive method thus specific activities of> 100 E per mg of protein can be achieved.
  • the VWF activity can be determined as described in the examples.
  • the specific activity (E / mg protein) can be increased by at least 100%, preferably by at least 150%, most preferably by at least 175%.
  • the composition of the invention preferably has a specific VWF activity of at least 50 U / mg VWF antigen, more preferably at least 75 U / mg VWF antigen, more preferably at least 100 U / mg VWF antigen, even more preferably at least 120 U / mg VWF antigen, more preferably at least 125 U / mg VWF antigen, most preferably at least 150 U / mg VWF antigen.
  • the specific VWF activity E / mg VWF antigen
  • the specific VWF activity can be increased by at least 20%, preferably by at least 35%, most preferably by at least 50%.
  • Another aspect of the invention is the use of hydroxyapatite to produce a VWF preparation with high specific VWF activity.
  • the invention further relates to the use of hydroxyapatite for the separation of VWF high specific VWF activity of VWF low specific VWF activity.
  • the invention further relates to the use of hydroxyapatite for increasing the specific VWF activity of a composition containing VWF.
  • the preferred embodiments of the use according to the invention correspond to those of the process according to the invention and the composition according to the invention.
  • Another aspect of the invention is the use of the VWF preparation according to the invention, VWF composition or the VWF preparation for the treatment of von Willebrand syndrome.
  • the invention also relates to the use for the manufacture of a medicament for the treatment of von Willebrand syndrome.
  • Example 1 Increase of the specific VWF activity of a prepurified VWF-containing plasma fraction by means of hydroxylapatite chromatography on a laboratory scale
  • the VWF-containing protein solution was subjected to the following pre-purification steps: A cryoprecipitate solution was subjected to aluminum hydroxide precipitation. Subsequently, virus inactivation was carried out by means of S / D treatment. In the subsequent anion exchange chromatography, a VWF-containing wash fraction is obtained, which is contaminated mainly with fibrinogen and fibronectin.
  • the protein solution is subjected to a precipitation step by titration to pH 5.2, in which a large part of the fibronectin and fibrinogen has been removed. Subsequently, an ultrafiltration and diafiltration was carried out, wherein the protein solution was concentrated approximately 7-fold and diafiltered against the running buffer of the following chromatography.
  • the protein solution thus obtained contained approximately 930 ⁇ g / ml VWF antigen, 270 ⁇ g / ml fibrinogen antigen and 2400 ⁇ g / ml fibronectin antigen.
  • the protein solution was applied to a hydroxylapatite column equilibrated in 10 mM Na phosphate pH 7.0 (CHT type 1, Bio-Rad, Kunststoff, Germany).
  • the flow through fraction contained about 560 ⁇ g / ml VWF antigen, 5 ⁇ g / ml fibrinogen antigen and 50 ⁇ g / ml fibronectin antigen.
  • the mass balance gives a step yield of 78% for VWF antigen and 73% VWF activity.
  • Such a prepurified protein solution was titrated to pH 6.0 for further purification according to the invention. Subsequently, the solution was applied to a hydroxylapatite column (CHT type 1, Bio-Rad, Kunststoff, Germany), which had been equilibrated in running buffer (20 mM Na phosphate pH 6.0). The VWF was bound quantitatively. A first elution was carried out with 45% of elution buffer B (400 mM Na phosphate pH 6.0), the second with 100% B.
  • the protein solution applied contained 540 ⁇ g / ml VWF antigen, 4 ⁇ g / ml fibrinogen and 48 ⁇ g / ml fibronectin.
  • the activity of VWF in this solution was 46 U / ml.
  • the first elution fraction contained 38 ⁇ g / ml VWF antigen, 2 ⁇ g / ml fibronectin antigen and had a VWF activity of 0.7 U / ml.
  • the fibrinogen antigen concentration was below the detection limit of 1 ⁇ g / ml.
  • the value fraction (2nd elution fraction) had a VWF antigen concentration of 173 ⁇ g / ml, a VWF activity of 23 U / ml. Neither fibrinogen antigen nor fibronectin antigen could be detected.
  • the residual activity of factor VIII was also below the detection limit.
  • the specific VWF activities could be increased from 85 U / mg VWF antigen to 133 U / mg VWF antigen.
  • the specific VWF activity value of the first elution fraction of 18 U / mg VWF antigen demonstrates that especially low-activity WVF molecules are separated.
  • the yield of VWF activity is 84%, that of VWF antigen is 51%.
  • Table 2 Increase of the specific VWF activity of a prepurified VWF-containing plasma fraction by means of hydroxylapatite chromatography on a laboratory scale
  • the concentration of VWF antigen was test reagents determined by the STA Compact ® of the company Diagnostica Stago (Roche Diagnostics, Mannheim) and its (STA LIA vWF).
  • the VWF activity was determined as ristocetin cofactor activity on platelet agglutination with the BCT ® analyzers benefits (Behring Coagulation Timer, Dade Behring Schwalbach).
  • the ristocetin cofactor assay determines the binding ability of VWF to the platelet receptor glycoprotein Ib / IX under the influence of the antibiotic ristocetin.
  • Example 2 Increase of the specific VWF activity of a prepurified VWF-containing plasma fraction by means of hydroxylapatite chromatography on a pilot plant scale
  • the starting solution was prepared according to Example 1 until the first chromatography.
  • the protein solution thus obtained contained approximately 1.43 mg / ml VWF antigen at a total protein concentration of 3.79 mg / ml.
  • the specific activity was 36.4 U / mg protein.
  • columns with a diameter of 10 cm were used.
  • the protein solution was applied to a hydroxylapatite column equilibrated in 10 mM Na phosphate pH 7.0 (CHT type 1, Bio-Rad, Kunststoff, Germany) with 1.0 l gel bed volume.
  • the flow-through fraction (value fraction 1) contained about 0.67 mg / ml VWF antigen at a total protein concentration of 0.86 mg / ml.
  • the specific activity was 68.7 U / mg protein and the specific VWF activity was 96.5 U / mg VWF antigen.
  • Such a prepurified protein solution was titrated to pH 6.5 for further purification and separation of less active VWF molecules. Subsequently, the solution was applied to a hydroxylapatite column (CHT type 2, Bio-Rad, Kunststoff, Germany) with a gel bed volume of 1.5 l, which had been equilibrated in the running buffer (20 mM Na phosphate pH 6.5). The VWF was bound quantitatively. A first elution for the separation of less active VWF molecules was carried out with 220 mM Na phosphate pH 6.5.
  • the value fraction 2 with a protein concentration of 0.20 mg / ml and a VWF antigen content of 0.13 mg / ml was subsequently eluted with 300 mM Na phosphate pH 6.5.
  • the specific VWF activity of 87.5 U / mg VWF antigen could be increased to 171 U / mg VWF antigen.
  • the specific activity was increased to 107 U / mg protein. Impurities such as fibronectin, fibrinogen or factor VIII were below the detection limit.
  • the change in the specific VWF activities during the purification process shows that during the first chromatography this parameter is not positively influenced.
  • the second chromatographic step according to the invention is outstandingly suitable for increasing the specific VWF activity, which corresponds to a separation of less active VWF molecules.
  • Table 3 Increasing the specific VWF activity of a prepurified VWF-containing plasma fraction by means of hydroxylapatite chromatography on a pilot plant scale
  • VWF antigen and VWF activity were determined as indicated in Example 1.
  • A absorption at 280 nm
  • ⁇ absorption coefficient (here theoretical absorption coefficient 0.75 cm 2 / mg)
  • c protein concentration in mg / ml
  • d layer thickness in cm.
  • Example 3 Increase of the specific VWF activity of a prepurified VWF-containing plasma fraction by means of fluoroapatite chromatography
  • the starting solution was prepared according to Example 1 until the second chromatography.
  • the protein solution contained a specific activity of 64.8 U / mg and a specific VWF activity of 95.1 mg / ml at a protein concentration of 0.83 mg / ml.
  • the solution was applied to a fluoroapatite column (CFT type 1, Bio-Rad, Kunststoff, Germany) with a gel bed volume of 13.2 ml, which had been equilibrated in the running buffer (20 mM Na phosphate pH 6.0). Part of the VWF was tied.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines von Willbrand Faktor-Präparates mit hoher spezifischer VWF-Aktivität, wobei Hydroxylapatit als Chromatographie-Medium verwendet wird.

Description

Herstellung eines von Willbrand Faktor-Präparates mit hoher spezifischer Aktivität
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines von Willbrand Faktor-Präparates mit gesteigerter spezifischer VWF-Aktivität, wobei Hydroxylapatit als Chromatographie- Medium verwendet wird.
Der von Willebrand Faktor ist ein Glykoprotein, das in Endothelzellen und Megakaryozyten synthetisiert wird. Das Molekulargewicht des Monomers beträgt ca. 225 000 Da. Durch Ausbildung von Disulfidbrücken werden in der Zelle Dimere ausgebildet, die wiederum zu Oligomeren aus bis zu 40 dimeren Untereinheiten ebenfalls über Disulfidverknüpfungen assoziieren. Die Konzentration des in das Plasma abgegebenen von Willebrand Faktors (VWF) beträgt 5 - 10 mg/1.
In der primären Hämostase hat der VWF die Aufgabe, die Adhäsion von Thrombozyten an verletztes Subendothel zu vermitteln und unter Bedingungen hoher Scherkräfte, wie im arteriellen System, die Thrombozytenaggregation zu unterstützen. Als Funktion in der sekundären Hämostase bindet VWF Faktor VIII, einen wichtigen Cofaktor bei der Blutgerinnung, in einem nicht kovalenten Komplex. Faktor VIII wird dadurch stabilisiert und vor vorzeitigem Abbau geschützt.
Das von Willebrand Syndrom (VWS) ist eine Bluterkrankheit, die durch quantitative oder qualitative Veränderung des VWF hervorgerufen wird. Häufig werden für die Behandlung von schweren Formen des VWS plasmatische Faktor Vlll-Präparate eingesetzt, die einen relativ hohen Anteil an VWF enthalten. Blutungen können damit zwar gestillt werden, gleichzeitig steigt aber, besonders bei häufiger oder längerer Anwendung, das Thromboserisiko. Dies ist auf eine Überdosierung von Faktor VIII zurückzuführen. Wesentlich günstiger im Sinne der Patientensicherheit ist die Therapie von VWS-Kranken mit hochreinen, Faktor Vlll-armen / -freien VWF-Konzentraten. Häufiges Problem bei der Herstellung eines VWF-Präparates ist der Verlust an spezifischer VWF-Aktivität. Gemäß der o.g. Definition beträgt bei einer VWF-Konzentration von 5 - 10 μg/ml im Blut und einer definierten Aktivität von durchschnittlich 1 E/ml die spezifische VWF-Aktivität 100 - 200 E pro mg VWF-Antigen. In der Regel sinkt die spezifische VWF- Aktivität während der ersten Aufarbeitungsschritte bei der Herstellung von VWF-Präparaten drastisch. Strukturell korreliert dieser Verlust an spezifischer Aktivität mit proteolytischen Abbaureaktionen, die zur Erniedrigung des Anteils an hochmolekularen VWF-Molekülen (Multimeren) und zur Erhöhung des Anteils an niedermolekularen VWF-Molekülen (Dimeren / Tetrameren) führen. Für ein therapeutisches Präparat ist es erstrebenswert, die während der Aufarbeitung von Plasmafraktionen entstehenden weniger aktiven niedermolekularen VWF-Oligomere zu entfernen. VWF-Lösungen mit einer niedrigen spezifischen VWF- Aktivität enthalten einen höheren Anteil an weniger erwünschten niedermolekularen VWF- Oligomeren, als VWF-Lösungen mit einer hohen spezifischen VWF-Aktivität. Wünschens¬ wert wäre ein Verfahren, mit dem therapeutisch wirksame Präparate mit einer spezifischen Aktivität von > 100 E pro mg VWF-Antigen aus einer Quelle mit einer spezifischen Aktivität von < 100 E pro mg VWF-Antigen hergestellt werden kann.
In der Literatur werden verschiedene Verfahren beschrieben, die auf eine Erhöhung der spezifischen VWF-Aktivität zielen:
WO 98/38219 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von VWF1 bei dem VWF bei einer niedrigen Salzkonzentration an einen Kationenaustauscher gebunden wird und durch fraktionierte Elution VWF mit hoher spezifischer Aktivität gewonnen wird.
Die WO 96/10584 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem rekombinanten VWF mittels kombinierter Anionenaustausch-/Heparin-Affinitätschromatographie und die EP 0 705 846 die Trennung von hoch- und niedermolekularen Fraktionen von rekombinantem VWF mittels Heparin-Affinitätschromatographie.
Die bisher beschriebenen Verfahren sind mit Nachteilen hinsichtlich Wirtschaftlichkeit und Reinigungseffektivität behaftet. Bei der Verwendung einer Heparin-Affinitäts- chromatographie zur Erhöhung der spezifischen VWF-Aktivität wurde beispielsweise die Aktivität einer vorgereinigten Proteinlösung, die rekombinanten VWF enthält, von 4,3 E pro mg VWF-Antigen auf 7,3 E/mg erhöht. Die finale spezifische VWF-Aktivität des rekombinanten Proteins ist niedrig. Die Kosten für eine Affinitätschromatographie sind vergleichsweise hoch. Bessere Ergebnisse wurden durch Anwendung einer Kationenaus- tauschchromatographie erzielt. Bei einer Reinigung mittels eines rekombinanten Antikörpers wurde in Kombination mit vorgeschalteter Anionenaustausch- und Immunaffinitätschromatographie eine spezifische VWF-Aktivität von 30,4 E/mg erzielt. Am Beispiel der Reinigung eines plasmatischen VWF durch die Kombination Anionenaustausch- und Kationenaustauschchromatographie wurde eine erzielte Reinheit von 65 E pro mg Protein erreicht. Auf die Steigerung der spezifischen VWF-Aktivität (Aktivität pro VWF- Antigenmenge) wurde nicht eingegangen.
Es besteht ein Bedürfnis nach einem wirtschaftlichen Verfahren, mit dem wenig aktive VWF-Moleküle aus einer Proteinfraktion abgereichert werden können, um so die spezifische Aktivität zu erhöhen. Dabei soll eine spezifische VWF-Aktivität erreicht werden, die der im Plasma gesunder Menschen entspricht. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch einen chromatographischen Separationsschritt unter Verwendung von Hydroxylapatit gelöst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von VWF mit hoher spezifischer Aktivität von VWF mit niedriger spezifischer Aktivität, umfassend eine Chromatographie mit Hydroxylapatit als Chromatographie-Matrix. Als hohe spezifische VWF-Aktivität wird beispielsweise ein Wert von >120 E pro mg VWF-Antigen und als niedrige spezifische VWF-Aktivität beispielsweise ein Wert von < 70 E pro mg VWF-Antigen bezeichnet. Abhängig von der Qualität des Ausgangsmateriales können hochaktive bzw. niedrigaktive Fraktionen anders definiert werden. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung mit hoher spezifischer VWF-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass man eine VWF enthaltende Zusammensetzung durch Hydroxylapatit-Chromatographie aufreinigt. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Erhöhung der spezifischen VWF-Aktivität einer VWF enthaltenden Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass man die VWF enthaltende Zusammensetzung einer Hydroxylapatit-Chromatographie unterwirft.
Hydroxylapatit ist eine Form von Calciumphosphat mit der Zusammensetzung Ca5(PO4)3OH bzw. Cai0(PO4)6OH2, die als stationäre Phase für die Chromatographie von Proteinen, Nukleinsäuren und anderen Makromolekülen eingesetzt werden kann. Neben der kristallinen Form von Hydroxylapatit kann auch eine keramische Form verwendet werden, welche durch Sintern erhältlich ist. Hydroxylapatit kann beispielsweise von der Firma Bio- Rad (München, Deutschland) bezogen werden. Deren keramisches Hydroxylapatit wird in zwei Formen (Typ 1 und Typ 2) zur Verfügung gestellt. Typ 1 -Material hat aufgrund größerer Oberflächen eine höhere Bindungskapazität für kleinere Moleküle, z.B. kleine Proteine. Dagegen weist das Typ 2-Material größere Poren in den Partikeln auf, die ein Eindringen und damit eine bessere Bindung von großen Molekülen, z.B. DNA oder großen Proteinen, ermöglicht. Die Materialien weisen vorzugsweise folgende Eigenschaften auf:
Tabelle 1
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*CHT=Ceramic Hydroxy Apatite
Kristallines oder keramisches Hydroxylapatit ist frei verfügbar. Verfahren zu ihrer Herstellung sind im Stand der Technik bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von keramischem Hydroxylapatit bevorzugt.
Hydroxylapatit, insbesondere in seiner keramikstabilisierten Form ist außerordentlich gut geeignet, um Prozesse im Industriemaßstab durchzuführen. Aufgrund seiner Trenneigenschaften bietet Hydroxylapatit eine bessere Auflösung als die vielfach beschriebenen lonenaustauschchromatographiemedien. Bei dem Hydroxylapatit- Reinigungsverfahren müssen den Puffern weder Calcium noch Aminosäuren zugesetzt werden.
Das Verfahren kann in Form einer Säulenchromatographie oder im Batch-Verfahren durchgeführt werden; die Durchführung einer Säulenchromatographie ist bevorzugt.
Üblicherweise umfasst das Verfahren, dass
(a) VWF an die Hydroxylapatit-Matrix gebunden wird,
(b) VWF mit niedriger spezifischer VWF-Aktivität bei mittlerer Salzkonzentration herausgewaschen wird; und
(c) anschließend VWF mit hoher spezifischer VWF-Aktivität bei höherer Salzkonzentration eluiert wird. In Schritt (a) wird eine Lösung, die VWF hoher und niedriger spezifischer VWF-Aktivität enthält, mit der Hydroxylapatit-Matrix in Kontakt gebracht. Die Gesamtkonzentration an Natrium- und/oder Kaliumphosphat in dieser Lösung ist üblicherweise 0 bis 200 mM, vorzugsweise 1 bis 100 mM, bevorzugter 1 bis 50 mM, am bevorzugtesten 10 bis 30 mM.
In dem Waschschritt (b) wird die Hydroxylapatit-Matrix mit einem Puffer mittlerer Salzkonzentration gewaschen. Die Gesamtkonzentration an Natrium- und/oder Kaliumphosphat in diesem Waschpuffer ist in der Regel 100 bis 300 mM, vorzugsweise 200 bis 300 mM, bevorzugter 200 bis 270 mM, am bevorzugtesten 210 bis 250 mM. Dabei wird VWF mit niedriger spezifischer VWF-Aktivität herausgewaschen. Je höher der pH-Wert des Puffers, desto niedriger kann die Salzkonzentration gewählt werden.
In Schritt (c) kann VWF hoher spezifischer VWF-Aktivität mit einem Puffer höherer Salzkonzentration eluiert werden. Der Elutionspuffer enthält in der Regel 200 bis 500 mM, vorzugsweise 250 bis 500 mM, bevorzugter 300 bis 400 mM Natrium- und/oder Kaliumphosphat.
Durch Verschiebung der Salzkonzentrationen können Ausbeute und Reinheit verändert werden. Je höher die Saizkonzentration im Waschpuffer ist, desto aktiver ist die erhaltene Wertfraktion. Die Ausbeute erniedrigt sich dadurch allerdings. Weiterhin beeinflusst der gewählte pH-Wert die optimale Salzkonzentration für den Waschpuffer. Je niedriger der pH- Wert ist, desto stärker ist die Bindung von VWF an die Hydroxylapatit-Matrix. Entsprechend können die gewählten Salzkonzentrationen bei niedrigen pH-Werten höher sein, bei höheren pH-Werten hingegen niedriger.
Die Hydroxylapatit-Chromatographie wird bei einem pH-Wert von 5 bis 7, vorzugsweise von 5,5 bis 6,8, bevorzugter von 6,0 bis 6,8, am bevorzugtesten von 6,2 bis 6,5 durchgeführt. Üblicherweise haben Lauf-, Wasch- und Elutionspuffer, sowie die aufzutragende Proteinlösung den gleichen pH-Wert. Es sind aber auch Varianten praktikabel, bei denen diese Lösungen unterschiedliche pH-Werte aufweisen.
Je nach pH-Wert-Bedingungen und Ausbeute-Bestrebungen können wenig aktive VWF- Moleküle von Hydroxylapatit-Säulen mit Puffern eluiert werden, die eine mittlere Salzkonzentration enthalten. Bei pH 6,0 können beispielsweise Puffer verwendet werden, die 200 bis 270 mM Natrium- oder Kaliumphosphat, bevorzugt 220 bis 250 mM Natriumphosphat enthalten. Bei pH 6,5 wären beispielsweise Puffer geeignet, die 180 bis 260 mM, bevorzugt 210 bis 250 mM Natrium- oder Kaliumphosphat enthalten. Nach der Abtrennung der wenig aktiven VWF-Moleküle können die hochaktiven VWF-Moleküle mit einem Hochsalzpuffer, beispielsweise 250 bis 500 mM Natrium- oder Kaliumphosphat, bevorzugt 300 bis 400 mM Natrium- oder Kaliumphosphat eluiert werden.
Die erfindungsgemäße bindende Hydroxylapatit-Chromatographie kann mit anderen Reinigungstechniken kombiniert werden. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, zunächst eine "Durchlaufchromatographie" mit Hydroxylapatit zur Abreicherung der Hauptverunreinigungen durchzuführen. Anschließend wird die Durchlauffraktion auf eine Hydroxylapatit-Säule aufgetragen, wie oben beschrieben. VWF-Moleküle werden gebunden und VWF hoher spezifischer VWF-Aktivität wird selektiv eluiert.
In einer besonderen Ausführungsform wird daher zunächst eine Durchlaufchromatographie mit Hydroxylapatit durchgeführt, wobei VWF nicht an die Hydroxylapatit-Matrix bindet, und anschließend die Durchlauffraktion unter bindenden Bedingungen rechromatographiert und die VWF-Fraktion mit VWF hoher spezifischer VWF-Aktivität eluiert.
Eine "Durchlaufchromatographie" im Sinne dieser Anmeldung umfasst, dass (i) eine Zusammensetzung, die VWF und ein oder mehrere verunreinigende Proteine enthält, mit einer Hydroxylapatit-Matrix in Kontakt gebracht wird, so dass wenigstens ein verunreinigendes Protein an die Hydroxylapatit-Matrix gebunden wird, während VWF im wesentlichen nicht an die Hydroxylapatit-Matrix gebunden wird, und gegebenenfalls anschließend (ii) ungebundenes VWF von der Hydroxylapatit-Matrix getrennt wird. Im Fall einer Säulenchromatographie befindet sich VWF im Durchlauf und wenigstens ein verunreinigendes Protein, z. B. Fibronektin und/oder Fibrinogen, wird an das Hydroxylapatit gebunden.
Die Durchlaufchromatographie wird bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise von 6,8 bis 8,5, bevorzugter von 6,8 bis 7,5, am bevorzugtesten von 7,0 bis 7,5 durchgeführt. Üblicherweise haben Lauf-, Wasch- und Elutionspuffer, sowie die aufzutragende Proteinlösung den gleichen pH-Wert. Es sind aber auch Varianten praktikabel, bei denen diese Lösungen unterschiedlichen pH-Werte aufweisen. Die VWF enthaltende Zusammensetzung, die bei der Durchlaufchromatographie mit der Hydroxylapatitmatrix in Kontakt gebracht wird, enthält vorzugsweise Natriumphosphat und/oder Kaliumphosphat. Die Gesamtkonzentration an Natriumphosphat und/oder Kaliumphosphat in der Lösung ist beispielsweise 0 bis 100 mM, vorzugsweise 10 bis 50 mM, am bevorzugtesten 20 bis 40 mM, d. h. als Laufpuffer kann eine Pufferlösung mit den genannten Konzentrationen eingesetzt werden.
Durch den vorgeschalteten Schritt der Durchlaufchromatographie können VWF- Präparationen erhalten werden, die nur geringe Mengen an Fibrinogen und Fibronektin enthalten. In der Regel ist die Konzentration an Fibrinogen-Antigen in der Durchlauffraktion niedriger als 25 μg/ml, bevorzugt niedriger als 15 μg/ml, bevorzugter niedriger als 10 μg/ml, am bevorzugtesten höchstens 5 μg/ml. Die Konzentration an Fibronektin-Antigen in der Durchlauffraktion ist üblicherweise niedriger als 250 μg/ml, bevorzugt niedriger als 150 μg/ml, bevorzugter niedriger als 100 μg/ml, am bevorzugtesten höchstens 50 μg/ml. Die Konzentration an Fibrinogen-Antigen und Fibronektin-Antigen kann durch an sich bekannte Verfahren bestimmt werden.
Durch den vorgeschalteten Schritt der Durchlaufchromatographie kann eine erhebliche Abreicherung der verunreinigenden Proteine Fibrinogen und Fibronektin erzielt werden. So ist die Konzentration an Fibrinogen in der Durchlauffraktion vorzugsweise niedriger als 10%, bevorzugter niedriger als 5%, noch bevorzugter niedriger als 2,5% der Konzentration an Fibrinogen in der Auftragslösung (vor Durchlaufchromatographie). Die Konzentration an Fibronektin in der Durchlauffraktion ist vorzugsweise niedriger als 10%, bevorzugter niedriger als 5%, noch bevorzugter niedriger als 2,5% der Konzentration an Fibronektin in der Auftragslösung (vor Durchlaufchromatographie).
Die Ausbeute der Durchlaufchromatographie (bezogen auf die Massenbilanz) ist in der Regel höher als 50%, bevorzugt höher als 60%, am bevorzugtesten höher als 75%. Für die Durchlaufchromatographie ist es sinnvoll, aber nicht notwendig, Phosphationen als Puffersubstanz zu verwenden. Für die Elution von VWF bei der bindenden Chromatographie ist Phosphat ein spezifisches Agens.
Als Ausgangsmaterialien können allgemein VWF-haltige Lösungen, im Besonderen VWF- haltige Plasmafraktionen eingesetzt werden. VWF kann bei pH-Werten von vorzugsweise 6,0 bis 6,8, besonders bevorzugt 6,2 bis 6,5, bei einer niedrigen Salzkonzentration von 0 - 100 mM Kalium- oder Natriumphosphat, bevorzugt bei 10 - 50 mM an eine Hydroxylapatit- Säule gebunden werden.
In einer besonderen Ausführungsform kann anstelle von reinem Hydroxylapatit als Chromatographiematrix Fluoroapatit verwendet werden. Fluoroapatit wird durch Umsetzung von Hydroxylapatit mit einer fluoridhaltigen Substanz, hergestellt. Die Firma Bio-Rad (München, Deutschland) erzeugt z.B. keramisches Fluoroapatit durch eine 90%-ige Umsetzung von keramischem Hydroxylapatit mit einem Fluorinreagenz. Fluoropatit ist im Vergleich zu Hydroxylapatit unter sauren pH-Wertbedingungen deutlich stabiler. Deshalb wird Fluoroapatit üblicherweise eingesetzt, um Chromatographien bei niedrigerem pH durchzuführen, als für Hydroxylapatit technisch sinnvoll. Für eine Aufreinigung von hochaktiven VWF-Molekülen mit Fluoroapatit kann die Chromatographie ähnlich zu dem für Hydroxylapatit vorgeschlagenen Verfahren durchgeführt werden. Salzkonzentrationen müssen dem gewählten pH-Wert (>= 5,0) angepasst werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin einen oder mehrere der folgenden Schritte umfassen:
(1 ) Schockgefrieren bei einer Temperatur von unter -300C und Auftauen nahe 00C (Kryopräzipitation)
(2) Ethanolfällung oder Adsorption an Aluminiumhydroxid
(3) Virusinaktivierung der VWF enthaltenden Zusammensetzung durch Solvens/Detergens-Behandlung
(4) Anionenaustauchchromatographie
(5) Fällung von Fibronektin durch Einstellung eines pH-Werts von unter pH 5,4
(6) Affinitätschromatographie
(7) Diafiltration oder Ultrafiltration
(8) Umpuffem durch Dialyse oder Gelfiltration
(9) Sterilfiltration
(10) Lyophilisierung
(11) Virusinaktivierung durch Hitzebehandlung (z.B. ca. 30 min bei ca. 100°C)
Die Verfahrensschritte (1) bis (5) werden vorzugsweise vor der Hydroxylapatit- Chromatographie durchgeführt. Es können aber auch weniger als die 5 Verfahrensschritte durchgeführt werden. Die Reihenfolge der Schritte ist nicht zwingend. Die Schritte (6) bis (11 ) können durchgeführt werden, falls gewünscht. Insbesondere die Affinitätschromatographie ist aber nicht notwendig, da bereits durch die Hydroxylapatitchromatographie eine hohe Reinheit erreicht werden kann.
Als Ausgangsmaterial für die Verfahren der vorliegenden Erfindung kann somit eine vorgereinigte Plasmafraktion verwendet werden. Hierbei kann es sich um eine weiter aufgereinigte Kryopräzipitat-Lösung handeln. Die Kryopräzipitat-Lösung kann beispielsweise mit Aluminiumhydroxid gefällt werden und/oder chromatographisch weiter aufgereinigt werden. So kann die Kryopräzipitat-Lösung z. B. mit Aluminiumhydroxid gefällt werden und anschließend mittels Anionenaustauschchromatographie weiter aufgereinigt werden. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass die Kryopräzipitat-Lösung einer Virusinaktivierung unterworfen wird. Bevorzugtes Verfahren zur Virusinaktivierung ist eine Solvens/Detergens- Behandlung, wie sie im US-Patent Nr. 4,540,573 beschrieben ist.
Als Ausgangsmaterial kann ebenso eine Proteinlösung enthaltend rekombinanten VWF (rVWF) aus Zellkulturüberständen verwendet werden. Der Ausdruck "rVWF" umfasst sowohl VWF mit der Wildtypsequenz als auch Varianten mit einer gegenüber Wildtyp-VWF veränderten Aminosäuresequenz, wobei ein oder mehrere Aminosäuren subsituiert, deletiert und/oder hinzugefügt sein können. Die Varianten weisen in der Regel VWF- Aktivität auf. Verfahren zur Herstellung geeigneter Expressionsvektoren, zur Einschleusung der Vektoren in die Wirtszellen und zur Kultivierung der Wirtszellen sind dem Fachmann an sich bekannt (Fischer et al. Structural analysis of recombinant von Willebrand factor: identification of hetero and homo-dimers. FEBS Lett 1994; 351 :345-348. Fischer et al. Structural analysis of recombinant von Willebrand factor produced at industrial scale fermentation of transformed CHO cells co-expressing recombinant furin. FEBS Lett 1995; 375:259-262).
Insbesondere bei Verwendung von Plasmafraktionen kann vor der Hydroxylapatit¬ chromatographie eine pH-Fällung zur Abtrennung von Fibronektin durchgeführt werden. Die pH-Fällung zur Abtrennung von Fibronektin aus einer Plasmafraktion umfasst beispielsweise, dass man
(i) den pH-Wert der Plasmafraktion auf unter pH 5,4 einstellt, so dass sich ein Niederschlag bildet und
(ii) den gebildeten Niederschlag abtrennt. Der Ausdruck "Plasmafraktion" bezeichnet in diesem Zusammenhang eine Zusammensetzung, die aus Plasma erhalten wurde und verschiedene Plasmaproteine enthält. Die Plasmafraktion, die als Ausgangszusammensetzung in Schritt (i) eingesetzt wird, ist eine flüssige Zusammensetzung. Vorzugsweise ist die flüssige Zusammensetzung eine Lösung oder eine Suspension, am bevorzugtesten ist die Zusammensetzung eine Lösung. In einer besonderen Ausführungsform ist die Plasmafraktion gelöstes Kryopräzipitat. Dieses gelöste Kryopräzipitat kann durch verschiedene Verfahren vorgereinigt sein. Beispiele sind Aluminiumhydroxid-Behandlung, Solvens-/Detergens- Behandlung und/oder Anionenaustauschchromatographie. Die Konzentration an Natriumchlorid oder Kaliumchlorid in der Plasmafraktion ist vorzugsweise 50 bis 250 mM, bevorzugter 100 bis 200 mM, am bevorzugtesten 120 bis 150 mM. Die Plasmafraktion kann beispielsweise folgende Puffersubstanzen enthalten: Citrationen, Acetationen, Phosphationen und/oder Aminosäuren.
Die Konzentration an Fibronektin in der Plasmafraktion, die Schritt (i) unterworfen wird, ist in der Regel mindestens 0,05 g/l, vorzugsweise wenigstens 0,1 g/l, noch bevorzugter wenigstens 0,25 g/l, am bevorzugtesten wenigstens 0,5 g/l. Die Konzentration an Fibronektin in der Plasmafraktion kann beispielsweise 0,1 bis 5 g/l, vorzugsweise 0,1 bis 2 g/l sein.
Zur Abtrennung von Fibronektin aus der Plasmafraktion wird der pH-Wert der Plasmafraktion auf unter pH 5,4 eingestellt. Dabei bildet sich ein Niederschlag, der Fibronektin enthält. Vorzugsweise wird der pH-Wert auf unter pH 5,3 eingestellt, noch bevorzugter auf unter pH 5,2. Der eingestellte pH-Wert liegt somit vorzugsweise in einem Bereich von pH 4,5 bis unter 5,4, bevorzugt in einem Bereich von pH 4,7 bis 5,3, bevorzugter in einem Bereich von pH 4,8 bis 5,2, noch bevorzugter in einem Bereich von pH 4,9 bis 5,1. In der Regel wird das Einstellen des pH-Werts durch Zugabe einer sauren Komponente erreicht. Als saure Komponente können verschiedene Säuren eingesetzt werden, beispielsweise Salzsäure, Phosphorsäure oder Essigsäure. Die saure Komponente wird üblicherweise über einen bestimmten Zeitraum zugegeben, beispielsweise tropfenweise. Somit wird nach und nach ein pH-Wert im oben näher definierten Bereich eingestellt ("titriert").
Während und nach dem Einstellen des pH-Werts wird die Plasmafraktion vorzugsweise in Bewegung gehalten oder durchmischt, beispielsweise durch Rühren. Es ist weiterhin bevorzugt, dass nach Einstellen des pH-Werts die Plasmafraktion für einen bestimmten Zeitraum weiter durchmischt wird (z.B. durch Rühren), im allgemeinen für wenigstens 10 Minuten, vorzugsweise für wenigstens 20 Minuten, am bevorzugtesten für einen Zeitraum von 30 bis 90 Minuten. In diesem Zeitraum bilden sich klebrige Aggregate, die zu einem erheblichen Anteil Fibronektin erhalten. Daher ist es gemäß einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, dass ein geeigneter Rührer, z.B. ein Anker- oder Paddelrührer eingesetzt wird, an dessen Rührblatt sich der Niederschlag anheftet. Das präzipitierte Fibronektin kann somit leicht der Lösung entzogen werden.
Die pH-Fällung zur Abtrennung von Fibronektin kann in einem breiten Temperaturspektrum durchgeführt werden, z.B. von ca. 1 °C bis ca. 370C. Bevorzugte Temperaturbereiche sind 4 bis 350C, bevorzugter 10 bis 300C, am bevorzugtesten wird das Verfahren bei 20 bis 25°C durchgeführt.
Durch die pH-Fällung zur Abtrennung von Fibronektin aus Plasmafraktionen kann die Konzentration an Fibronektin in der Plasmafraktion um wenigstens 50% verringert werden. Vorzugsweise wird die Konzentration an Fibronektin in der Plasmafraktion um 70 bis 99%, bevorzugter um 80 bis 99%, am bevorzugtesten um 90 bis 98% oder um 95 bis 98% verringert. In einer besonderen Ausführungsform liegt der Verlust an VWF in dem Fällungsschritt bei höchstens 50%, bevorzugt bei höchstens 40%, bevorzugter bei höchstens 30%, noch bevorzugter bei höchstens 20%, am bevorzugtesten bei höchstens 10%.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine VWF enthaltende Zusammensetzung erhältlich durch ein erfindungsgemäßes Verfahren, wie es in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist. Vorzugsweise handelt es sich um eine im wesentlichen reine VWF-Präparation. "Im wesentlichen rein" bedeutet, dass die Zusammensetzung im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist, insbesondere dass kein Fibronektin und kein Fibrinogen nachweisbar ist.
Die erfindungsgemäße VWF-Präparation kann eine spezifische Aktivität von wenigstens 75 E/mg Protein aufweisen, vorzugsweise hat sie eine spezifische Aktivität von wenigstens 85 E/mg Protein, bevorzugter von wenigstens 100 E/mg Protein, am bevorzugtesten von wenigstens 120 E/mg Protein. Durch das erfindungsgemäße Verfahren können somit spezifische Aktivitäten von >100 E pro mg Protein erzielt werden. Die VWF-Aktivität kann bestimmt werden wie in den Beispielen beschrieben. Durch die erfindungsgemäße Hydroxylapatit-Chromatographie kann die spezifische Aktivität (E/mg Protein) um wenigstens 100%, bevorzugt um wenigstens 150%, am bevorzugtesten um wenigstens 175% erhöht werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung hat vorzugsweise eine spezifische VWF-Aktivität von wenigstens 50 E/mg VWF-Antigen, bevorzugter von wenigstens 75 E/mg VWF-Antigen, noch bevorzugter von wenigstens 100 E/mg VWF-Antigen, noch bevorzugter von wenigstens 120 E/mg VWF-Antigen, noch bevorzugter von wenigstens 125 E/mg VWF- Antigen, am bevorzugtesten von wenigstens 150 E/mg VWF-Antigen. Durch die erfindungsgemäße Hydroxylapatit-Chromatographie kann die spezifische VWF-Aktivität (E/mg VWF-Antigen) um wenigstens 20%, bevorzugt um wenigstens 35%, am bevorzugtesten um wenigstens 50% erhöht werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Hydroxylapatit zur Herstellung eines VWF-Präparats mit hoher spezifischer VWF-Aktivität. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Hydroxylapatit zur Trennung von VWF hoher spezifischer VWF- Aktivität von VWF niedriger spezifischer VWF-Aktivität. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Hydroxylapatit zur Erhöhung der spezifischen VWF-Aktivität einer VWF enthaltenden Zusammensetzung. Die bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung entsprechen denen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Zusammensetzung.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen VWF- Präparation, VWF-Zusammensetzung oder des VWF-Präparats zur Behandlung des von Willebrand-Syndroms. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung des von Willebrand-Syndroms.
Die verschiedenen in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Ausführungsformen können miteinander kombiniert werden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher. Beispiel 1: Erhöhung der spezifischen VWF-Aktivität einer vorgereinigten VWF-haltigen Plasmafraktion mittels Hydroxylapatit-Chromatographie im Labormaßstab
Die VWF-haltige Proteinlösung durchlief folgende Vorreinigungsstufen: Eine Kryopräzipitat- Lösung wurde einer Aluminiumhydroxid-Fällung unterzogen. Anschließend wurde eine Virusinaktivierung mittels S/D-Behandlung durchgeführt. Bei der anschließenden Anionenaustauschchromatographie fällt eine VWF-haltige Waschfraktion an, die vor allem mit Fibrinogen und Fibronektin verunreinigt ist. Die Proteinlösung wird durch Titration auf pH 5.2 einem Fällungsschritt unterzogen, bei dem ein großer Teil des Fibronektins und Fibrinogens entfernt wurde. Anschließend wurde eine Ultra- und Diafiltration durchgeführt, wobei die Proteinlösung ca. 7-fach ankonzentriert und gegen den Laufpuffer der folgenden Chromatographie diafiltriert wurde. Die so erhaltene Proteinlösung enthielt ca. 930 μg/ml VWF-Antigen, 270 μg/ml Fibrinogen-Antigen und 2400 μg/ml Fibronektin-Antigen. Die Proteinlösung wurde auf eine in 1O mM Na-Phosphat pH 7,0 equilibrierte Hydroxylapatit- Säule (CHT Typ 1 , Bio-Rad, München, Deutschland) aufgetragen. Die Durchlauffraktion enthielt ca. 560 μg/ml VWF-Antigen, 5 μg/ml Fibrinogen-Antigen und 50 μg/ml Fibronektin- Antigen. Die Massenbilanz ergibt eine Schrittausbeute von 78% für VWF-Antigen und 73% VWF-Aktivität.
Eine so vorgereinigte Proteinlösung wurde zur weiteren erfindungsgemäßen Aufreinigung auf pH 6,0 titriert. Anschließend wurde die Lösung auf eine Hydroxylapatit-Säule (CHT Typ 1 , Bio-Rad, München, Deutschland) aufgetragen, die im Laufpuffer (20 mM Na-Phosphat pH 6,0) equilibriert worden war. Der VWF wurde quantitativ gebunden. Eine erste Elution wurde mit 45% des Elutionspuffers B (400 mM Na-Phosphat pH 6,0) durchgeführt, die zweite mit 100% B. Die aufgetragene Proteinlösung enthielt 540 μg/ml VWF-Antigen, 4 μg/ml Fibrinogen und 48 μg/ml Fibronektin. Die Aktivität des VWF in dieser Lösung betrug 46 E/ml. Die erste Elutionsfraktion enthielt 38 μg/ml VWF-Antigen, 2 μg/ml Fibronektin- Antigen und hatte eine VWF-Aktivität von 0,7 E/ml. Die Fibrinogen-Antigen-Konzentration lag unterhalb des Detektionslimits von 1 μg/ml. Die Wertfraktion (2. Elutionsfraktion) wies eine VWF-Antigen-Konzentration von 173 μg/ml, eine VWF-Aktivität von 23 E/ml auf. Weder Fibrinogen-Antigen, noch Fibronektin-Antigen konnte detektiert werde. Die Restaktivität von Faktor VIII lag ebenfalls unterhalb des Detektionslimits. Die spezifischen VWF-Aktivitäten konnten von 85 E / mg VWF-Antigen auf 133 E / mg VWF-Antigen gesteigert werden. Der spezifische VWF-Aktivitätswert der ersten Elutionsfraktion von 18 E / mg VWF-Antigen, belegt, dass speziell wenig aktive WVF-Moleküle abgetrennt werden. Die Ausbeute an VWF-Aktivität liegt bei 84%, die an VWF-Antigen bei 51 %.
Tabelle 2: Erhöhung der spezifischen VWF-Aktivität einer vorgereinigten VWF-haltigen Plasmafraktion mittels Hydroxylapatit-Chromatographie im Labormaßstab
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Die Konzentration an VWF-Antigen wurde mit Hilfe des STA® Compact der Firma Diagnostica Stago (Roche Diagnostics, Mannheim) und deren Test-Reagenzien (STA LIA vWF) bestimmt.
Die VWF-Aktivität wurde als Ristocetin-Cofaktor-Aktivität über Plättchenagglutination mit dem BCT®-Analyser (Behring Coagulation Timer, Dade Behring, Schwalbach) bestimmt. Der Ristocetin-Cofaktor-Assay ermittelt die Bindungsfähigkeit von VWF an den Plättchenrezeptor Glycoprotein Ib/IX unter dem Einfluss des Antibiotikums Ristocetin.
Beispiel 2: Erhöhung der spezifischen VWF-Aktivität einer vorgereinigten VWF-haltigen Plasmafraktion mittels Hydroxylapatit-Chromatographie im Technikumsmaßstab
Die Ausgangslösung wurde entsprechend Beispiel 1 bis zur ersten Chromatographie präpariert. Die so erhaltene Proteinlösung enthielt ca. 1 ,43 mg/ml VWF-Antigen bei einer Proteingesamtkonzentration von 3,79 mg/ml. Die Spezifische Aktivität betrug 36,4 E / mg Protein. Für die chromatographische Reinigung wurden Säulen mit einem Durchmesser von 10 cm verwendet. Die Proteinlösung wurde in einem ersten chromatographischen Reinigungsschritt auf eine in 10 mM Na-Phosphat pH 7,0 equilibrierte Hydroxylapatit-Säule (CHT Typ 1 , Bio-Rad, München, Deutschland) mit 1 ,0 I Gelbettvolumen aufgetragen. Die Durchlauffraktion (Wertfraktion 1 ) enthielt ca. 0,67 mg/ml VWF-Antigen bei einer Proteingesamtkonzentration von 0,86 mg/ml. Die Spezifische Aktivität betrug 68,7 E / mg Protein und die Spezifische VWF-Aktivität 96,5 E / mg VWF-Antigen. Eine so vorgereinigte Proteinlösung wurde zur weiteren Aufreinigung und zur Abtrennung von wenig aktiven VWF-Molekülen auf pH 6,5 titriert. Anschließend wurde die Lösung auf eine Hydroxylapatit-Säule (CHT Typ 2, Bio-Rad, München, Deutschland) mit einem Gelbettvolumen von 1 ,5 I aufgetragen, die im Laufpuffer (20 mM Na-Phosphat pH 6,5) equilibriert worden war. Der VWF wurde quantitativ gebunden. Eine erste Elution zur Abtrennung von wenig aktiven VWF-Molekülen wurde mit 220 mM Na-Phosphat pH 6,5 durchgeführt. Die Wertfraktion 2 mit einer Proteinkonzentration von 0,20 mg/ml und einem Gehalt an VWF-Antigen von 0,13 mg/ml wurde im Anschluss mit 300 mM Na-Phosphat pH 6,5 eluiert. Durch diesen chromatographischen Schritt konnte die spezifische VWF-Aktivität von 87,5 E / mg VWF-Antigen auf 171 E / mg VWF-Antigen erhöht werden. Die spezifische Aktivität wurde dabei auf 107 E / mg Protein gesteigert. Verunreinigungen wie Fibronektin, Fibrinogen oder Faktor VIII lagen unterhalb des Detektionslimits.
Die Veränderung der Spezifischen VWF-Aktivitäten während des Reinigungsprozesses (siehe Tabelle 3) zeigt, dass während der ersten Chromatographie dieser Parameter nicht positiv beeinflusst wird. Der erfindungsgemäße zweite Chromatographische Schritt ist dagegen hervorragend geeignet, die Spezifische VWF-Aktivität zu steigern, was einer Abtrennung von wenig aktiven VWF-Molekülen entspricht.
Tabelle 3: Erhöhung der spezifischen VWF-Aktivität einer vorgereinigten VWF-haltigen Plasmafraktion mittels Hydroxylapatit-Chromatographie im Technikumsmaßstab
Figure imgf000016_0001
VWF-Antigen und VWF-Aktivität wurden bestimmt wie in Beispiel 1 angegeben. Die Proteinbestimmung wurde nach dem Lambert-Beerschen Gesetz (A=ε-c-d) durchgeführt, wobei
A=Absorption bei 280 nm ε=Absorptionskoeffizient (hier theoretischer Absorptionskoeffizient 0,75 cm2/mg) c=Proteinkonzentration in mg/ml d=Schichtdicke in cm.
Beispiel 3: Erhöhung der spezifischen VWF-Aktivität einer vorgereinigten VWF-haltigen Plasmafraktion mittels Fluoroapatit-Chromatographie
Die Ausgangslösung wurde entsprechend Beispiel 1 bis zur zweiten Chromatographie präpariert. Die Proteinlösung enthielt bei einer Proteinkonzentration von 0,83 mg/ml eine spezifische Aktivität von 64,8 E/mg und eine spezifische VWF-Aktivität von 95,1 mg/ml. Durch Zugabe von HCl wurde die Proteinlösung auf einen pH-Wert von 6,0 titriert. Anschließend wurde die Lösung auf eine Fluoroapatit-Säule (CFT Typ 1 , Bio-Rad, München, Deutschland) mit einem Gelbettvolumen von 13,2 ml aufgetragen, die im Laufpuffer (20 mM Na-Phosphat pH 6,0) equilibriert worden war. Ein Teil des VWF wurde gebunden. Eine Abtrennung von wenig aktiven VWF-Molekülen wurde durch eine erste Elution mit einem Puffer erzielt, der 241 mM Na-Phosphat pH 6,0 enthielt (Wertfraktion 1 ). Die Wertfraktion 2 mit einer Protei nkonzentration von 0,12 mg/ml und einem Gehalt an VWF-Antigen von 0,06 mg/ml wurde im Anschluss mit 400 mM Na-Phosphat pH 6,0 eluiert. Durch diesen chromatographischen Schritt konnte die spezifische VWF-Aktivität auf 152 E / mg VWF-Antigen erhöht werden. Die spezifische Aktivität wurde dabei auf 77 E / mg Protein gesteigert. Aufgrund der schwächeren Bindung von VWF bei den gewählten pH- Bedingungen findet keine komplette Bindung des VWF statt, so dass sich ein Teil in der Durchlauffraktion befindet. Tabelle 4: Erhöhung der spezifischen VWF-Aktivität einer vorgereinigten VWF-haltigen Plasmafraktion mittels Fluoroapatit-Chromatographie
Figure imgf000018_0001
Ergänzende Literaturstellen
Folgende Literaturstellen zu verschiedenen Analytikmethoden werden ergänzend genannt:
VWF-Aktivität:
Veyradier A, Fressinaud E, Meyer D (1998): Laboratory diagnosis of von Willebrand disease. Int J Lab Res 28 (4): 201-210.
VWF-Antigen:
Budde U, et al. (1984): Acquired von Willebrand's disease in the myeloproliferative Syndrome. Blood 64 (5): 981-985.
Newman DJ, Henneberry H, Price CP (1992): Particle enhanced light scattering immunoassay. Ann Clin Biochem 29 (Pt1 ): 22-42.
Fibronektin-Antigen:
Sandberg L1 et al. (1985): Plasma fibronectin levels in acute and recovering malnourished children. Clin Physiol Biochem. 3(5):257-264.
Colli A, et al. (1986): Diagnostic accuracy of fibronectin in the differential diagnosis of ascites. Cancer.: 58(11 ):2489-2493.
Fibrinogen-Antigen:
Ernst E, Resch KL (1993): Fibrinogen as a cardiovascular risk factor: a meta-analysis and review of the literature. Ann Intern Med.: 118(12):956-963.
Jelic-Ivanovic Z, Pevcevic N (1990): Fibrinogen determination by five methods in patients receiving Streptokinase therapy. Clin Chem.: 36(4):698-699.

Claims

Ansprüche:
1. Verfahren zur Trennung von VWF mit hoher Aktivität von VWF mit niedriger Aktivität, umfassend eine Chromatographie mit Hydroxylapatit als Chromatographie-Matrix.
2. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung mit hoher spezifischer VWF- Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass man eine VWF enthaltende Zusammensetzung durch Hydroxylapatit-Chromatographie aufreinigt.
3. Verfahren zur Erhöhung der spezifischen VWF-Aktivität einer VWF enthaltenden Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass man die VWF enthaltende Zusammensetzung einer Hydroxylapatit-Chromatographie unterwirft.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass VWF an die Hydroxylapatit-Säulenmatrix gebunden wird, VWF mit niedriger spezifischer Aktivität herausgewaschen wird und anschließend VWF mit hoher spezifischer Aktivität bei höherer Salzkonzentration eluiert wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Chromatographie bei einem pH-Wert zwischen 5 und 7, vorzugsweise zwischen 5,5 und 6,8 durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Laufpuffer eine Natrium- bzw. Kaliumphosphat-haltige Lösung verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Waschpuffer 100-300 rriM, vorzugsweise 200-300 rriM, und der Elutionspuffer 200-500 mM, vorzugsweise 300-400 mM Natrium- oder Kaliumphosphat enthält.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst eine Durchlaufchromatographie mit Hydroxylapatit durchgeführt wird, die Durchlauffraktion unter bindenden Bedingungen rechromatographiert und das Zielprotein als hochreine VWF-Fraktion eluiert wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man keramisches Hydroxylapatit verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das keramische Hydroxylapatit vom Typ I bzw. Typ Il ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial eine vorgereinigte Plasmafraktion verwendet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial eine weiter aufgereinigte Kryopräzipitat-Lösung verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial eine mit Aluminiumhydroxid gefällte Kryopräzipitat-Lösung verwendet wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial eine chromatographisch vorgereinigte Aluminiumhydroxid-gefällte Kryopräzipitat-Lösung verwendet wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Hydroxylapatit-Chromatographie eine pH-Fällung zur Abtrennung von Fibronektin durchgeführt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmateriai eine Proteinlösung mit rekombinant hergestelltem VWF verwendet wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Hydroxylapatit Fluoridionen enthält.
18. Verwendung von Hydroxylapatit zur Trennung von VWF-Molekülen hoher Aktivität von VWF-Molekülen niedriger Aktivität.
19. Verwendung von Hydroxylapatit zur Herstellung eines VWF-Präparats mit hoher spezifischer VWF-Aktivität.
20. Verwendung von Hydroxylapatit zur Erhöhung der spezifischen VWF-Aktivität einer VWF enthaltenden Zusammensetzung.
21. VWF enthaltende Zusammensetzung erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
22. VWF enthaltende Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine spezifische Aktivität von wenigstens 120 E/mg Protein aufweist.
23. Zusammensetzung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiterhin eine spezifische VWF-Aktivität von wenigstens 120 E/mg VWF-Antigen aufweist.
24. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 bis 23 zur Behandlung des von Willebrand-Syndroms.
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