WO2006032216A2 - Peptidos y derivados tipo apl de la hsp60 y composiciones farmacéuticas - Google Patents

Peptidos y derivados tipo apl de la hsp60 y composiciones farmacéuticas Download PDF

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Gabriel Ramón PADRÓN PALOMARES
Nelia López Marín
Norailys Lorenzo Perez
Ariana BARBERÁ BETANCOURT
Ariadna Hernández García
Vivian Morera Cordova
Carelia Cosme Díaz
Nelson J. MERINO GARCÍA
Ariel Vázquez Bonachea
José Suárez Alba
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Definitions

  • the present invention relates to peptides of the human thermal stress protein of 60 kDa (in English 60 kDa heat shock protein, abbreviated Hsp ⁇ Oh) and derivatives thereof of the altered peptide ligand type (in English Altered Peptide Ligands, abbreviated APL).
  • the invention relates to pharmaceutical compositions comprising such peptides for the treatment of Rheumatoid Arthritis (RA).
  • RA is an autoimmune disease of unknown etiology that affects approximately 1% of the world's population. It is a syndrome characterized by chronic inflammation of the joints, although systemic manifestations can be observed. This disease begins with the inflammation of the synovial membrane and often leads to erosive destruction of the adjacent cartilage and bone, resulting in moderate physical disability of 80% of patients and early mortality (Moctezuma, JF (2002) Joint manifestations of rheumatoid arthritis, Mexican Journal of Rheumatology 17: 211-219). It can occur at any age, without distinctions of races or ethnic groups, but the maximum incidence of its onset occurs between 25 and 55 years of age.
  • the cause of AR is unknown. It is known that it is a disease of multifactorial etiology, which involves the presence of genetic, environmental, immunological and hormonal factors. There are certain genes, which have a role in the immune system, associated with a tendency to develop RA. At the same time, some people with RA do not have these genes and others have them and never develop the disease. This has suggested that the genetic background of each person is important but not decisive.
  • microbial antigens with a structure similar to their own antigens can trigger a cross response with their own tissue antigens producing an alteration in tolerance mechanisms and perpetuating an autoimmune response.
  • the transition stage of lymphocytes between tolerance and immunity / autoimmunity is regulated at different levels.
  • Two important parameters in this transition are the maturation state of the antigen presenting cells (in English Antigen Presenting CeIIs, abbreviated APC) and the levels of own antigens that are detected by the immune system (Ohashi, PS (2002) Making and breaking tolerance. Current Opinion in Immmunology 14: 744-759).
  • the pathogenesis of RA is characterized by the concerted action of different types of cells that trigger the progressive destruction of cartilage and bone.
  • inflammatory cytokines such as: TNF ⁇ , IL-1, IL-6, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 and IFN ⁇
  • anti-inflammatories such as IL- 4, IL-11, IL-13 and antagonists of IL-1 or TNF ⁇ .
  • this balance moves in favor of inflammatory cytokines (Arend, WP. (2001) Cytokine imbalance in the pathogenesis of rheumatoid arthritis: The role of interleukin-1 receptor antagonist. Semin Arthritis Rheum 30 (2): 1 -6)
  • LFA1, ICAM-1 endothelial cells
  • TNF ⁇ and IL-1 stimulate the proliferation of the synovial membrane that leads to the formation of pannus, can induce the differentiation of B lymphocytes to antibody producing cells, which potentially also participate in joint destruction. They also inhibit the production of anti-inflammatory cytokines (IL-4 and IL-14) produced by Th2 cells and stimulate hepatocytes to release IL-6.
  • IL-4 and IL-14 anti-inflammatory cytokines
  • IL-6 in turn favors the production of phase proteins. acute, which participate enhancing the immune response (Forre, O. (2000) New possibilities of treatment in AR. Scand J Rheumatol 29 (2) 73-84).
  • Ia Hsp60 a protein that belongs to the family of Hsp, which are highly immunogenic proteins with an exceptional degree of evolutionary conservation.
  • the immune response against foreign Hsp is an important defense mechanism against bacterial infections. Antibodies against these proteins may be abundant in normal subjects and in patients with autoimmune diseases and may cross-react with their own antigens (Chen, W. (1999) Human 60-kDa Heat-Shock Protein: A Danger Signal to the Innate Immune System. J lmmunol. 162: 3212-3219).
  • the Hsp65 of Mt is homologous to the Hsp60 of mammals. It is suggested that Hsp60 can be recognized as an autoantigen in patients with RA. Comparing patients with osteoarthritis and patients with RA, the latter have an increase in the proliferative response of B lymphocytes in synovial fluid to mycobacterial Hsp65. The intensity of the response correlates with synovial inflammation. This response is not specific for RA compared to other inflammatory diseases (Life, P. (1993) Responses to Gram negative enteric bacterial antigens by synovial T cells from patiens with juvenile chronic arthritis: recognition of heat shock protein hsp60. J Rheumatol. 20: 1388-1396).
  • a possible danger signal for the immune system constitutes Hsp, which are released from the dying cells, and which can induce an inflammatory response and initiate the maturation of APC. Being intracellular proteins, they are not highly expressed in the cell membrane, nor are they secreted, so they are attractive candidates for molecules that constitute danger signals (Van den Berg, WB. (1998): Joint inflammation and cartilage destruction may occur uncoupled Springer Semin Immunopathol. 20: 149-164).
  • patent application W09610039 the use of a Mt Hsp60 peptide is proposed for the diagnosis and treatment of autoimmune arthritis.
  • patent application WO9711966 it is proposed to use peptides from non-conserved regions of human Hsp60, which do not coincide with bacterial Hsp60, which could induce tolerance in the T cells of patients with RA.
  • Patent application WO0143691 proposes the use of pharmaceutical preparations composed of peptides of the Hsp ⁇ Oh and variants thereof in the prevention of inflammatory diseases specifically for various autoimmune diseases including RA.
  • US6180103 the use of an Hsp60 peptide named p277 and its analogues is proposed for the diagnosis and prevention of type I diabetes.
  • the US5993803 patent protects the use of the Hsp60 protein, the p277 peptide and a group of peptides derived from said protein to reduce the severity of the immune response during organ transplantation. Recently it has been considered that atherosclerosis has a series of characteristics similar to autoimmune processes.
  • WO0072023 a method is proposed for the treatment and diagnosis of atherosclerosis and coronary diseases using a preparation containing the Hsp60 protein.
  • patent application WO02057795 a new method for the diagnosis and treatment of osteoporosis is protected using proteins of the Hsp family and pathogen proteins such as viruses and bacteria.
  • Oral tolerization has been proposed as a method of creating peripheral tolerance against certain antigens. This can be induced by active suppression mechanisms or by anergy or clonal deletion, depending on the dose and frequency of the administration of the antigen.
  • the method can induce regulatory T cells that are specifically activated with the antigen, but that exert their action independently (active suppression). In order for the regulatory action to occur, it is not necessary to administer the supposedly pathogenic antigen, but another one capable of inducing active suppression in the inflammatory focus, inhibiting the activity of pathogenic effector cells.
  • Type II collagen abbreviated IIC is the autoantigen that has been most used in this regard.
  • a peptide of Hsp70 a protein belonging to the family of Hsp
  • Another variant that has been suggested to induce tolerance is through APL peptides, based on the fact that T cells are activated if CD 4 + T lymphocytes specific to a particular peptide antigen recognize the antigen presented by competent APCs.
  • TcR short T cell receptor
  • the APLs are analogs of immunogenic peptides with one or several substitutions in the essential contact positions with the TcR or with the major incompatibility complex (in English Major Histocompatibility Complex, abbreviated MHC), which interfere with or modify the cascade of events necessary for Ia Complete activation of T cells.
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • APLs with properties similar to the immunogenic peptide (agonists) can be designed, whose effects include increasing the response of T cells to specific antigens. This effect is advantageous in pathological conditions such as neoplastic and infectious diseases.
  • Peptides with antagonistic properties to the immunogenic peptide can also be designed that could be beneficial in the control of autoimmune diseases since they can block the T cell response by acting as TcR antagonists (M De Magistris (1992) Antigen analog-major complex histocompatibility complexes act as antagonist of the T cell receptor. Cell 68: 625- 634), partial agonists or inducing a population of regulatory T cells that mediate active suppression (Evavold, BD (1991) Separation of IL-4 production from Th cell proliferation by an altered T cell ligand. Science 252: 1308-1310).
  • TcR antagonists M De Magistris (1992) Antigen analog-major complex histocompatibility complexes act as antagonist of the T cell receptor. Cell 68: 625- 634
  • partial agonists or inducing a population of regulatory T cells that mediate active suppression (Evavold, BD (1991) Separation of IL-4 production from Th cell proliferation by an altered T cell ligand
  • APL type peptides derived from epitope were used, covering amino acids 83 to 93 of the MBP (myelin basic protein, abbreviated MPB).
  • MPB myelin basic protein
  • One of these trials included 142 patients with multiple sclerosis, and was suspended because 9% of the patients developed hypersensitivity (Ludwig Kapposi (2000) Induction of a non-encephalitogenic type 2 T helper-cell autoimmune response in multiple sclerosis after administration of an altered peptide ligand in a placebo controlled, randomized phase Il trial. Nat ⁇ re Medicine 10: 1176-1182).
  • the main challenge in the treatment of autoimmune diseases is the development of therapeutic strategies that can delegate pathogenic T cells with specificity, without affecting other unrelated T cells. Therefore, the therapeutic search must find a safe, specific and effective way to turn off an advanced autoimmune process.
  • the present invention in contrast to the prior art, proposes the use of Hsp ⁇ Oh peptides and derivatives thereof of the APL type, which specifically induce molecular inhibitory mechanisms of the AR course.
  • the present investment solves the aforementioned problem, providing peptides of the human 60 kDa thermal stress protein that constitute epitopes for T cells, to induce peripheral tolerance mechanisms, in particular anergy inducing mechanisms or mediated by regulatory T cell clones in patients with RA and presenting the sequences:
  • SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 2) 1 2 3 4 5 6 7 8 is replaced in position 1 by L 1 I 1 V 1 M 1 Y 1 W 1 F, or A position 2 by A 1 D 1 E 1 F 1 G 1 H 1 I 1 K 1 L 1 M 1 N 1 Q 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W, or Y position 3 by A 1 F 1 I 1 K 1 L 1 M 1 P 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W 1 or Y position 4 by L 1 I 1 V 1 M 1 Y 1 W 1 F, or A position 5 by A 1 D 1 E 1 F 1 G 1 H 1 LK 1 L 1 M 1 N 1 Q 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W, or Y position 6 by A 1 D 1 E 1 F 1 G 1 H 1 I 1 K 1 L 1 M 1 N 1 Q 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W 1 or Y position 7 by A 1 F 1 I 1 K 1 L 1 M 1 P 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W 1 or
  • the APL type derived peptides have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 8, SEQ. ID. NO: 9, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11, SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 19, SEQ. ID. NO: 20 and SEQ. ID. NO: 21.
  • the peptides of the present invention can be produced by routine methods of peptide synthesis. Each composition that has a specific peptide can be tested for the level and quality of the immune response that induces in experiments such as those described in the examples that will be presented later.
  • the invention also includes pharmaceutical compositions comprising one or more of the above-listed peptides and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • the administration of pharmaceutical preparations to patients should be in correspondence with the HLA class II molecules expressed by the patient in question.
  • compositions will depend on the cytokine pattern induced by said preparations in the "ex vivo" assays.
  • Pharmaceutical preparations containing APL peptides inducing a regulatory response will be administered intradermally or subcutaneously.
  • Pharmaceutical preparations containing the original inducing peptides of a TH1 response may be administered orally.
  • the amounts present in the pharmaceutical compositions of the present invention are those that produce the effective immune response in the host.
  • the effective amount is the amount that when administered results in the induction of molecular mechanisms that significantly decrease the inflammatory signs characteristic of RA and stop the histopathological joint damage characteristic of the course of this disease.
  • the amount of the pharmaceutical composition administered to the host may vary depending on several factors that include: the peptides used, ACR score (in English, American College of Rheumatology, abbreviated ACR), HLA type II, time of diagnosis of the disease, age , sex, general health, as well as the level of immune response in general.
  • the present invention also relates to a method of treatment of RA, which comprises administering to a patient effective amounts of the peptides or pharmaceutical compositions referred to above.
  • Figure 1 Evaluation of the clinical signs of Arthritis in rats treated with peptides F19-6 and F19-7 intradermally, in the AIA model.
  • Figure 2 Modulation of the levels of TNF ⁇ induced by peptides F19-6 and F19-5 7 in mononuclear cells of rats of the AIA model on day 15 after the disease was induced.
  • Figure 3 Modulation of the levels of IL-10 induced by peptides F19-6 and F19-7 in mononuclear cells of rats of the AIA model on day 15 after 10 induced the disease.
  • Figure 4 Optical microscopy of a section of the joint belonging to an untreated sick animal.
  • Figure 5 Optical microscopy of a section of the joint belonging to an animal treated with the F19-7 peptide intradermally.
  • Figure 7 Modulation of the levels of IL-10 by peptides F19-6 and F19-7 in 5 mononuclear cells of rats of the animal model of collagen-induced arthritis, on day 21 after and induced the disease.
  • Figure 8 Modulation of TNF ⁇ levels by peptides F19-6 and F19-7 in mononuclear cells of patients with RA. 0
  • Figure 9 Modulation of TNF ⁇ levels by peptides E18-3 and E18-12 in mononuclear cells of patients with RA.
  • Figure 10 Modulation of IL-10 levels by peptides E18-3 and E18-12 in mononuclear cells of patients with RA.
  • Figure 11 Modulation of IL-10 levels induced by peptides E18-3 and E18-12 and their APLs in mononuclear cells of patients with RA.
  • Figure 12 Modulation of TNF ⁇ levels induced by peptides E18-3 and E18-12 and their APLs in mononuclear cells of patients with RA.
  • Figure 13 Relationship of IL-10 and TNF ⁇ levels, induced by peptides E18-3 and E18-12 and their APLs.
  • Figure 14 Evaluation of the clinical signs of Arthritis in rats treated with peptides E18-12 and E18-12APL1 intradermally, in the AIA model.
  • Example 1 Hsp ⁇ Oh peptides presented by human HLA.
  • Hsp ⁇ Oh peptides reported as human T cell epitopes were selected by the two programs used: SYFPEITHI (Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic. 1999. Immunogenetics 50: 213-219 SYFPEITHI: datábase for MHC ligands and peptide motifs. (Access via: http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)) and ProPred (Singh, H. And Raghava.GPS 2001. ProPred: Prediction of HLA-DR binding sites Bioinformatics, 17 (12): 1236-37). The sequence corresponding to these peptides is shown in Table 1.
  • Example 2 Hsp ⁇ Oh peptide for epitope of Lewis rats.
  • Example 3 Design of the APL with modifications in the amino acids involved in the binding to the MHC.
  • position 1 is replaced by: A 1 F 1 I 1 L 1 M 1 V 1 W, or Y position 2 is replaced by: A 1 D 1 E 1 F 1 G 1 H 1 I 1 K 1 L 1 M 1 N 1 Q 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W 1 or Y position 3 is replaced by: A 1 K 1 V 1 R 1 T 1 I 1 P 1 L 1 N 1 S 1 G 1 Y, or M position 4 is replaced by: A 1 D 1 E 1 F 1 G 1 H 1 I 1 K 1 L 1 M 1 N 1 Q 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W 1 or Y position 5 is replaced by: A 1 D 1 E 1 F 1 G 1 H 1 I 1 K 1 L 1 M 1 N 1 Q 1 R 1 S 1 T 1 V, or Y position 6 is replaced by: A 1 D 1 E 1 F 1 G 1 H 1 I 1 K 1 L 1 M 1 N 1 P 1 Q 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W 1 or Y position 7 is replaced by: A 1 D 1 E 1 F 1 G 1 H 1 I 1 K 1 L 1 M 1
  • position 1 is replaced by: L 1 I 1 V 1 M 1 Y 1 W 1 F, or A position 2 is replaced by: A 1 D 1 E 1 F 1 G 1 H 1 I 1 K 1 L 1 M 1 N 1 Q 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W 1 or Y position 3 is replaced by: A 1 F 1 I 1 K 1 L 1 M 1 P 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W, or Y position 4 is replaced by: L 1 I 1 V 1 M 1 Y 1 W 1 F 1 or A position 5 is replaced by: A 1 D 1 E 1 F 1 G 1 H 1 I 1 K 1 L 1 M 1 N 1 Q 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W 1 or Y position 6 is replaced by: A 1 D 1 E 1 F 1 G 1 H 1 I 1 K 1 L 1 M 1 N 1 Q 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W 1 or Y position 7 is replaced by: A 1 F 1 I 1 K 1 L 1 M 1 P 1 R 1 S 1 T 1 V 1 W 1 or Y position 8 is replaced by:
  • the F19-6 peptide has been substituted in positions 1 and 2 indicated below by the amino acids specified:
  • Example 4 Induction of arthritis by adjuvant and collagen in Lewis rats.
  • soviet female Lewis rats were used (hapiotype RT1.BI MHC) supplied by the National Center for Laboratory Animal Production (CENPALAB, Cuba). The rats were randomly selected, weighing approximately 101-120 g and 5-8 weeks of age.
  • One of the agents inducing the disease used was Mt (H37Ra, Difco, England) in Freund's incomplete adjuvant (AIF) (Sigma, USA).
  • the other agent that induces arthritis was the bovine type II collagen in AIF.
  • Example 5 Evaluation of clinical signs. The degree of inflammation associated with the development of the arthritis presented by each rat was evaluated with the following average prepared for this purpose:
  • the peptides were synthesized by the Fmoc / tBu strategy in syringes.
  • the Fmoc-AM-MBHA resin (0.54 mmoL / g) was used and the synthesis protocol was followed with mechanical agitation. After treatment with TFA, the peptide was lyophilized and characterized by HPLC and mass spectrometry.
  • Example 7 Intradermal administration of the peptides.
  • the animals were separated into four groups of 12 rats each.
  • the disease was induced in three groups of animals (Group I-Group III), of which two were treated with the peptides and one remained as control of the induction of the disease.
  • the two groups of animals that were treated with the peptides were administered 200 ⁇ g of peptide per rat in a volume of 100 ⁇ L of PBS, on days 12, 17 and 22 after induced disease with Mt. Animals separated in Four groups were treated as follows:
  • Example 8 Isolation of messenger ribonucleic acid (mRNA).
  • the mRNA was isolated following the protocol recommended by the manufacturer.
  • Example 9 Reverse transcription of ribonucleic acid.
  • the Gene Amp RNA PCR Kit system was used to obtain the complementary DNA
  • thermocycler Minicycler, MJ Research, USA
  • Example 10 Polymerase chain reaction.
  • the polymerase chain reaction (abbreviated CPR) was performed for the cytokines: TNF ⁇ and IL-10 and the constitutive gene coding for the enzyme GAP-DH (in English glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, abbreviated GAP-DH).
  • each primer 5 ⁇ l_ of the template DNA, 0.25 ⁇ l_ of the Thermostable DNA Polymerase (Taq-Pol) (Perkin-Elmmer, USA) were used in the buffer recommended by the manufacturers (KCI 50Mm, Tris-HCI 1OmM, pH 9.0, 0.1% Triton X-100 and MgCI 2 1.5 mM) in a final volume of 25 ⁇ l_.
  • thermocycler Minicycler, MJ Research, USA
  • a first cycle of 3 minutes at 94 0 C (denaturation temperature), 1 minute at 94 0 C, 1 minute 58 0 C (hybridization temperature) and 1 minute at 72 0 C (elongation temperature) then 35 cycles of: 1 minute at 94 0 C, 1 minute at 58 0 C and 1 minute at 72 0 C each .
  • a 3 minute extension step at 72 0 C a 3 minute extension step at 72 0 C.
  • Example 11 Analysis of CPR products by electrophoresis in agarose gels.
  • the result of the CPR products was checked by agarose gel electrophoresis.
  • the images of the electrophoretic runs were captured and analyzed with the Molecular Analyst (BioRad) program.
  • the results were expressed as relative levels of mRNA for each cytokine.
  • Example 12 Statistical analysis of the relative levels of mRNA for each cytokine.
  • IL-10 is involved in the induction of peripheral tolerance through a response mediated by T cells. It is known that it directly regulates T cells by inhibiting the production of IL-2, IL-5 and TNF ⁇ .
  • Figure 3 shows the semi-quantitative measurement of the expression levels of IL-10 in the different treatment groups, on the 15th day after the induction of the disease.
  • Gl corresponds to the animals treated with the F19-6 peptide
  • GII represents the group of rats treated with the F19-7 peptide
  • GIII represents the group of untreated diseased animals
  • GIV includes the healthy animals.
  • the treatment of the animals with the peptides induces an increase in the relative expression levels of IL-10.
  • No statistically significant differences were obtained between the two groups of animals treated with the peptides, there being significant differences between these two groups and the animals that constituted the positive and negative controls of the assay. From these results we can infer that the peptides act by inducing a change in the functional phenotype of the T cells involved in the pathogenesis of the disease, increasing the levels of production of anti-inflammatory cytokines as is the case of IL-10 and decreasing the production levels of proinflammatory cytokines such as TNF ⁇ .
  • Example 13 H ⁇ stopathological analysis.
  • the plates corresponding to the joints were analyzed by the group of
  • the joints were fixed in 10% neutral formalin buffer and decalcified.
  • the tissues were dehydrated in a gradient of alcohol, embedded in paraffin and cut into sections of 5 ⁇ m. Subsequently, the samples were mounted on slides and stained with a hematoxylin-eosin mixture and observed in an optical microscope.
  • Figure 4A corresponds to the articulation of an untreated group III animal. In this, the presence of the pannus that invades the entire intra-articular space can be observed, extending towards the cartilage where the erosion of this is evidenced, as well as the invasion towards the bone marrow.
  • Figure 4B shows an enlargement of the region that corresponds to the bone marrow where the pannus that is a granulation tissue rich in phagocytic cells is more clearly observed.
  • Example 14 In vitro evaluation of the cytokine pattern against peptides F19-6 and F19-7, using rat mononuclear cells where Arthritis was induced with type II collagen.
  • Mononuclear cells isolated from the spleen were cultured in 1.5 mL of RPMI 1640 in 24-well plates (Costar, USA). The assay was performed in triplicate, and a total of 3x10 6 cells / well were cultured for 24 hours with the peptides
  • Cells grown without the peptides were used as a negative control of the assay.
  • the mRNA was isolated, the reverse transcription reaction of the nucleic acid and the CPR was performed in the same manner as described in the previous examples.
  • the analyzes of the PCR products were carried out by electrophoresis in agarose gels as described in example 12. To determine the differences in the cytokine pattern according to the relative levels of mRNA for each of the samples, statistical tests were used described in example13.
  • Figure 6 shows the TNF ⁇ levels of cells grown without peptide and stimulated with peptides F19-6 and F19-7 in vitro corresponding to the 21st day after the induction of the disease
  • letter A represents the levels of TNF ⁇ In cultured cells without peptide
  • letter B represents the values of this cytokine when cells are stimulated with peptides F19-6
  • letter C corresponds to levels of TNF ⁇ when cells are stimulated with peptides F19-7.
  • CII represents the group of animals, where Arthritis was induced with collagen type Il and Control represents the group of healthy animals.
  • Figure 7 shows the IL-10 levels of cells grown without peptide and stimulated with peptides F19-6 and F19-7 in vitro corresponding to the 21st day after the induction of the disease
  • letter A represents the levels of IL-10 in cultured cells without peptide
  • letter B represents the values of this cytokine when cells are stimulated with peptides F19-6
  • letter C corresponds to levels of IL-10 when cells are stimulated with F19-7 peptides.
  • CII represents the group of animals, where the AR was induced with collagen type Il and Control represents the group of healthy animals.
  • F19-6 and F19-7 peptides in vitro decrease TNF ⁇ levels, in the case of IL-10 levels only F19-7 Io peptide increases significantly.
  • F19-7 peptide is capable of modulating the cytokine pattern towards a regulatory phenotype in the animal model where Arthritis is induced with collagen. Therefore we can affirm that the immunomodulatory action of this peptide derived from Hsp ⁇ Oh in vitro can be extended to animal models of Arthritis, where the inducing agent that participates in the development of the disease is not Mt or related autoantigens.
  • Example 15 Measurement of cytokines in patients with RA against peptides F19-6 and F19-7. Using blood from patients with RA, cytokine measurement assays were performed: TNF ⁇ , IFN ⁇ and IL-10. In these trials, the potential of the Hsp ⁇ Oh peptides was evaluated to increase or decrease the different cytokines involved in the pathogenesis of the disease. 10 mL of blood was taken from each patient, which was diluted ⁇ A in 1X PBS. 5 mL of this dilution was added to 3 mL of Ficoll-Paque (Amershan) in 15 mL centrifuge tubes, which were centrifuged for 30 min. at 1200 rpm.
  • Ficoll-Paque Amershan
  • the ring corresponding to the mononuclear cells was removed. Subsequently the cells were washed twice with 15 mL of 1X PBS and after each wash they were centrifuged at 900 rpm. Finally, the precipitate was resuspended in RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum and supplemented with penicillin (100U / mL), streptomycin (100 ⁇ g / mL), 25 mM / L HEPES and 2mM L-glutamine (all acquired from Gibco BRL) .
  • the mononuclear cells obtained were seeded in number of 10 6 cells / well in 24-well plates (Costar) in a volume of 800 ⁇ L. Subsequently, the Hsp ⁇ Oh peptides were added in a concentration range from 0.5 ⁇ g / mL to 100 ⁇ g / mL, with the optimum concentration for modulating cytokine levels being specified for each peptide.
  • Phytohemagglutinin (PHA) 1% was used as a positive control of cell stimulation, while RPMI 1640 was only used as a control of basal cell growth.
  • FIG. 8 shows the levels of TNF ⁇ modulated by peptides F19-6 and F19-7 in mononuclear cells of patients with RA.
  • the letter C represents cells grown in vitro without peptides; while F19-6 correspond to cells stimulated in vitro with peptide F19-6 and F19-7 represents cells stimulated in vitro with peptide F19- 7.
  • Example 16 Cytokine measurement in patients with RA against peptides E18-12 and E18-3. Using blood from patients with RA, cytokine measurement assays were performed: TNF ⁇ , IFN ⁇ and IL-10. In these tests, the potential of the Hsp ⁇ Oh peptides was evaluated to increase or decrease the different cytokines involved in the pathogenesis of the disease. 10 mL of blood was taken from each patient, which was diluted Vi in 1X PBS. 5 mL of this dilution was added to 3 mL of Ficoll-Paque (Amershan) in 15 mL centrifuge tubes, which were centrifuged for 30 min. at 1200 rpm.
  • Ficoll-Paque Amershan
  • the ring corresponding to the mononuclear cells was removed. Subsequently the cells were washed twice with 15 mL of 1X PBS and after each wash they were centrifuged at 900 rpm. Finally, the precipitate was resuspended in RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum and supplemented with penicillin (100U / mL), streptomycin (100 ⁇ g / mL), 25 mM / L HEPES and 2mM L-glutamine (all acquired from Gibco BRL ). The mononuclear cells obtained were seeded in number of 10 6 cells / well in 24-well plates (Costar) in a volume of 800 ⁇ L.
  • Hsp ⁇ Oh peptides were added in a concentration range from 0.5 ⁇ g / mL to 100 ⁇ g / mL, with the optimum concentration for modulating cytokine levels being specified for each peptide.
  • Phytohemagglutinin (PHA) 1% was used as a positive control of cell stimulation, while RPMI 1640 was only used as a control of basal cell growth.
  • the cells were cultured for 24 hours and subsequently the supernatant of each well, diluted V, was taken, and the concentration of the cytokines was determined through the specific kits for each of them Quantikine ® (R&D Systems) according to the manufacturers recommendations .
  • Figure 9 shows the levels of TNF ⁇ modulated by peptides E18-3 and E18-12 in mononuclear cells of patients with RA.
  • the patients represented by P4, P5 and P16 express the DR 0306 molecule
  • the patients identified as P7, P8 and P12 express the DR 0303 molecule
  • the P9 patient has a DR 0506 genotype
  • the P10 patient has a DR 0204 genotype.
  • the letter C represents cells cultured in vitro without peptides
  • E18-3 corresponds to cells stimulated in vitro with peptide E18-3
  • E18-12 represents cells stimulated in vitro with peptide E18- 12.
  • a therapeutic variant of the original peptides: E18-12 or E18-3 could be the administration of these by oral route, in such a way that they induce antigenic tolerization mechanisms, which will contribute significantly to the decrease of the inflammation.
  • Example 17 Cytokine measurement in patients with RA versus APL-derived peptides.
  • MGPKGRTVIIEQSLGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 8) MGPKGRTVIIEQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 9)
  • MGPKLRTVIILQSMGSPKVTK SEQ. ID. NO: 13
  • SIDLKDKLKNIGAKLVQDVANNTNEEA SEQ. ID. NO: 14
  • SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNTNEEA SEQ. ID. NO: 18
  • SIDLKDKYKNIGAKLVQAVANNTNEEA SEQ. ID. NO: 19
  • the mononuclear cells obtained were seeded in number of 10 6 cells / well in 24-well plates (Costar) in a volume of 800 ⁇ L.
  • the cells were stimulated with the peptides [E18-3, E18-12, E18-3APL1 (SEQ. ID. NO: 18), E18-3APL2 (SEQ. ID. NO: 21), E18-12APL1 (SEQ. ID. NO: 5), E18-12APL3 (SEQ. ID. NO: 12)], at a concentration of 40 ⁇ g / mL and in triplicate.
  • RPMI 1640 was only used as a control of basal cell growth.
  • Cells were cultured for 24 hours and later supernatants of each well were taken, diluted ⁇ A and the concentration of cytokines were determined by specific kits for each Quantikine ® (R & D Systems) as recommended by the Manufacturers
  • Figure 11 shows the levels of IL-10 induced by the original peptides (E18-12 and E18-3) and the panel of APL type peptides: E18-3APL1 (SEQ. ID. NO: 18); E18-3APL2 (SEQ. ID. NO: 21); E18-12APL1 (SEQ. ID. NO: 5); E18-12APL3 (SEQ. ID. NO: 12).
  • the letters indicate statistically significant differences (only the statistical significance between the different peptides and the control cells of each patient is referred to individually).
  • the cells of patients P4 and P6 were not stimulated with peptides E18-3APL2 and E18-12APL3.
  • the E18-3APL1 peptide significantly increases IL-10 levels with respect to unstimulated cells.
  • the increase induced by this peptide in some of the patients, such as P2 and P4 was up to 9 times the amount produced by the unstimulated cells and in patients such as P1, P3 and P5 up to 5 times higher.
  • Similar results were generally obtained with the E18-12APL1, showing a significant increase in the levels of IL-10 in patients P1, P4 and P6.
  • neither the original peptides nor the E18-3APL2 and E18-12APL3 peptides induced an increase in IL-10 levels compared to the cells that represent the negative control.
  • the levels of TNF ⁇ induced by the different peptides in the same group of patients are represented.
  • the letters indicate statistically significant differences (only the statistical significance between the different peptides and the control cells of each patient is referred to individually).
  • the cells of patients P4 and P6 were not stimulated with peptides E18-3APL2 and E18-12APL3.
  • all patients do not respond with the same intensity to the stimulation with the different peptides, although it should be noted that the response was quite homogeneous.
  • the peptide that most increased the production of TNF ⁇ was E18-12APL1, especially in patients P4 and P5, while in patients P1, P2 and P3 showed a slight increase with respect to the negative control.
  • the peptide E18-3APL1 had a similar behavior in most of the patients.
  • the cells of patients P2, P4 and P5 were the ones that most evidenced the increase in TNF ⁇ levels, although their increase was less marked. Similar results were obtained in this test with the original peptides as in previous evaluations. The previous results indicate that no peptide or its APL induces a decrease in the expression of TNF ⁇ in the mononuclear cells of the patients. These results could be contradictory, since the same APLs that increase the production of IL-10 promote an increase in TNF ⁇ levels.
  • Figure 13 shows the relationship of the levels of IL-10 and TNF ⁇ induced by the peptides and their APLs.
  • the letters indicate statistically significant differences (only the statistical significance between the different peptides and the control cells of each patient is referred to individually).
  • the cells of patients P4 and P6 were not stimulated with peptides E18-3APL2 and E18-12APL3. It is evident that the increase in IL-10 with respect to that of TNF ⁇ was considerably higher, since in four of the six patients, cells stimulated with E18-3APL1 showed an index greater than 1, which indicates that IL-10 levels exceeded those of TNF ⁇ .
  • the levels of IL-10 were considerably higher in cells stimulated with the E18-3APL1 peptide with respect to the cells that constituted the negative control, showing statistically significant differences.
  • E18-12APL1 the differences in comparison to the negative control were not so remarkable. So it can be ensured that although E18-3APL1 increases TNF ⁇ levels, the predominant net effect is the increase in IL-10 levels, which translates into a polarization of the response in favor of immunosuppressive cytokines .
  • the present invention has as a fundamental advantage the use of pharmaceutical preparations containing immunomodulatory peptides of the human Hsp60 stress protein, corresponding to T-cell epitopes or APL-like variants of these peptides, which can be used effectively in the treatment of patients with RA, inducing a specific immune response aimed at silencing the clones of autoreactive T cells involved in the immunopathogenic mechanisms of this disease.
  • the treatment that we propose in this invention is affordable and can be extended to a large number of patients and can also be used in combination with current therapies for this disease.
  • Example 18 Evaluation of the therapeutic effect of APL-derived peptides, in an animal model where arthritis is induced with Me.
  • the animals were separated into twelve groups of eight rats each.
  • the disease was induced in eleven groups of animals (Group I-Group Xl), of which ten were treated with the peptides and one remained as control of the induction of the disease.
  • the groups of animals that were treated with the peptides were administered 50 ⁇ g of peptide per rat in a volume of 100 ⁇ L of PBS, on days 12, 14, 16,18, 20, 22, 24 and 26 after induced The disease with Mt
  • the animals separated into twelve groups were treated as follows:> group I: the peptide E18-12 was administered (SEQ. ID. NO: 1)
  • group X the peptide corresponding to: SEQ was administered. ID. NO: 17 > group XI: no peptide was administered (control of the induction of the disease)
  • Group XII the disease was not induced or peptide was administered (negative control).
  • Figure 14 shows the graph of the evolution of the disease in four groups of animals belonging to this biomodel.
  • the groups shown are: group I (animals treated with E18-12), group Il (animals treated with E18-12APL1, SEQ. ID. NO: 5), group Xl (control of induction of Ia disease) and group XII (healthy animals).
  • group I animals treated with E18-12
  • group Il animals treated with E18-12APL1, SEQ. ID. NO: 5
  • group Xl control of induction of Ia disease
  • group XII healthy animals.
  • different letters indicate significant differences (p ⁇ 0.001) (refers to the statistical significance between all groups on the specific days of measurement).
  • the animals of groups I, Il and Xl began to show the clinical signs of RA.
  • Many animals also presented extra-articular manifestations such as nodules in the ears, in the tail and in the extremities.

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Abstract

Péptidos de la proteína humana de estrés térmico de 60 kDa que constituyen epitopes para células T, así como péptidos derivados de ellos, los cuales están modificados en los sitios de contacto con la molécula MHC, útiles para inducir mecanismos de tolerancia periférica, en particular mecanismos inductores de anergia o mediados por clones de células T regulatorias en pacientes con Artritis Reumatoide. La invención también refiere composiciones farmacéuticas que comprenden tales péptidos para tratamiento de la Artritis Reumatoide.

Description

PEPTIDOS Y DERIVADOS TIPO APL DE LA HSP60 Y COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS.
Campo de Ia técnica La presente invención se relaciona con péptidos de Ia proteína de stress térmico humana de 60 kDa (en inglés 60 kDa heat shock protein, abreviado HspβOh) y derivados de estos del tipo de péptido ligando alterado (en inglés Altered Peptide Ligands, abreviado APL). Además, Ia invención se relaciona con las composiciones farmacéuticas que comprenden tales péptidos para el tratamiento de Ia Artritis Reumatoide (AR).
Estado de Ia técnica Anterior
La AR es una enfermedad autoinmune de etiología desconocida que afecta aproximadamente al 1% de Ia población mundial. Es un síndrome caracterizado por una inflamación crónica de las articulaciones, aunque se pueden observar manifestaciones sistémicas. Esta enfermedad comienza con Ia inflamación de Ia membrana sinovial y con frecuencia conlleva a Ia destrucción erosiva del cartílago adyacente y el hueso, resultando en Ia incapacidad física moderada del 80% de los pacientes y una temprana mortalidad (Moctezuma, J. F. (2002) Manifestaciones articulares de Ia artritis reumatoide. Revista Mexicana de Reumatología 17:211- 219). Puede presentarse a cualquier edad, sin distinciones de razas o grupos étnicos, pero Ia incidencia máxima de su inicio ocurre entre los 25 y 55 años de edad. Entre las personas con AR, las mujeres superan a los hombres en una proporción de tres a uno (Emery, P. (2002) Early referral recommendation for newly diagnosed rheumatoid arthritis: evidence based development of a clinical guide. Ann Rheum Dis. 61:290-297).
La causa de Ia AR es desconocida. Se conoce que es una enfermedad de etiología multifactorial, que involucra Ia presencia de factores genéticos, ambientales, inmunológicos y hormonales. Existen ciertos genes, que tienen un papel en el sistema inmune, asociados con una tendencia a desarrollar Ia AR. Al mismo tiempo, algunas personas con AR no tienen estos genes y otras personas los tienen y nunca desarrollan Ia enfermedad. Esto ha sugerido que el fondo genético de cada persona es importante pero no es determinante. En los modelos de patogénesis de enfermedades autoinmunes, los antígenos microbianos con estructura similar a antígenos propios pueden desencadenar una respuesta cruzada con los antígenos tisulares propios produciendo una alteración en los mecanismos de tolerancia y perpetuando una respuesta autoinmune. En sentido general, el daño y Ia necrosis local en un tejido producida por un agente infeccioso podrían descubrir los epítopes crípticos de autoantígenos, pudiendo activar células T autoreactivas (Albert, LJ. (1999) Mechanisms of Disease: Molecular Mimicry and autoimmunity. N Engl J Med 341 :2068-2074)
El estadio de transición de los linfocitos entre tolerancia e inmunidad/ autoinmunidad es regulada a diferentes niveles. Dos parámetros importantes en esta transición son el estado de maduración de las células presentadoras de antígenos (en inglés Antigen Presenting CeIIs, abreviado APC) y los niveles de antígenos propios que son detectados por el sistema inmune (Ohashi, P. S. (2002) Making y breaking tolerance. Current Opinión in Immmunology 14:744-759). Una de las hipótesis actuales que trata de explicar el desarrollo de las enfermedades autoinmunes, plantea que las APC en ausencia de señales del sistema inmune innato o de señales de peligro, permanecen relativamente inmaduras e inducen tolerancia en las células T autoreactivas al presentarle péptidos propios (Steiman, R.M. (2000) The induction of tolerance by dendritic cells that have captured apoptotic cells. J Exp Med. 191 :411-416). La inducción de tolerancia periférica es también dependiente de Ia concentración de antígeno propio (Kurts, C. (1999) CD8 T cell ignorance or tolerance to islet antigens depends on antigen dose. PNAS 96:12703-12707). Un incremento en Ia presentación de antígenos propios debido a aumentos en sus niveles de expresión, permite que las células T autoreactivas ignorantes Io detecten. Si se incrementan los niveles de antígenos propios en ausencia de eventos que promuevan Ia maduración de APC, Ia tolerancia a estos antígenos es mantenida, si por el contrario ocurre en presencia de señales proinflamatorias u otros eventos que promuevan Ia maduración de las APC, se rompe Ia tolerancia por activación de las células T ignorantes y se desarrollan enfermedades autoinmunes (Janeway, CA. (2002) Innate immune recognition. Annu Rev Immunol. 20:197-216). Entre los agentes infecciosos que han sido objeto de mayor estudio como causa de AR tenemos el virus de Epstein Bar, los retrovirus, el virus causante de Ia hepatitis C, el Mycobacterium tuberculosis (abreviado Mí) y el Helicobacter pylorí, entre otros. La patogénesis de Ia AR se caracteriza por Ia acción concertada de diferentes tipos de células que desencadenan Ia destrucción progresiva del cartílago y el hueso. En situaciones normales existe un equilibrio entre las citocinas inflamatorias como: el TNFα, IL-1 , IL-6, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 y el IFNγ, y las anti-inflamatorias como IL-4, IL-11, IL-13 y antagonistas de IL-1 o TNFα. En Ia AR sin embargo este equilibrio se mueve a favor de las citocinas inflamatorias (Arend, WP. (2001) Cytokine imbalance in the pathogenesis of rheumatoid arthritis: The role of interleukin-1 receptor antagonist. Semin Arthritis Rheum 30(2): 1 -6)
Probablemente el reconocimiento de un antígeno exógeno o autoantígeno sea el detonante de una serie de eventos que culminan con Ia destrucción articular en pacientes con AR. Este fenómeno desencadena Ia activación de los linfocitos T CD4 + Io que conjuntamente con Ia estimulación de diferentes citocinas, induce a su diferenciación a células Th 1 con Ia consecuente liberación de citocinas proinflamatorias (IL-2 e INFγ) (Simón, AJ. (2001) Terapia biológica en artritis reumatoide. Revista de Investigación Clínica 53(5):452-459). Muchos investigadores coinciden que Ia inflamación crónica de las articulaciones es inducida por estas células T activadas que infiltran Ia membrana sinovial. La acción de estas citocinas sobre los macrófagos provoca Ia producción de cantidades elevadas de TNFα y de IL-1. Estos a su vez ejercen una serie de acciones en el ámbito local y sistémico tales como regular Ia expresión de las moléculas de adhesión en las células endoteliales (LFA1 , ICAM-1), las que favorecen el reclutamiento de otras células al sitio de Ia inflamación. Además estimulan a los macrófagos, fibroblastos, condrocitos y osteoclastos a Ia liberación de otros mediadores de Ia inflamación, como Ia IL-15 y Ia IL-8. El TNFα y Ia IL-1 estimulan Ia proliferación de Ia membrana sinovial que conlleva a Ia formación del pannus, pueden inducir Ia diferenciación de linfocitos B a células productoras de anticuerpos, que potencialmente también participan en Ia destrucción articular. Además inhiben Ia producción de citocinas anti-inflamatorias (IL-4 e IL-14) producidas por las células Th2 y estimulan a los hepatocitos para liberar IL-6. La IL-6 a su vez favorece Ia producción de las proteínas de Ia fase aguda, las cuales participan potenciando Ia respuesta inmune (Forre, O. (2000) New posibilities of treatment in AR. Scand J Rheumatol 29(2)73-84). Dentro de los autoantígenos involucrados en Ia patogénesis de Ia AR se encuentra Ia Hsp60, proteína que pertenece a Ia familia de las Hsp, las cuales son proteínas altamente inmunogénicas con un excepcional grado de conservación evolutiva. La respuesta inmune contra las Hsp extrañas es un mecanismo de defensa importante contra las infecciones bacterianas. Los anticuerpos contra estas proteínas pueden ser abundantes en sujetos normales y en pacientes con enfermedades autoinmunes y pueden reaccionar en forma cruzada con los antígenos propios (Chen, W. (1999) Human 60-kDa Heat-Shock Protein: A Danger Signal to the Innate Immune System. J lmmunol. 162:3212-3219).
La Hsp65 de Mt es homologa a Ia Hsp60 de los mamíferos. Se sugiere que Ia Hsp60 pueda ser reconocida como autoantígeno en pacientes con AR. Comparando pacientes con osteoartritis y pacientes con AR, estos últimos tienen un aumento de Ia respuesta proliferativa de linfocitos B en el líquido sinovial a Ia Hsp65 micobacteriana. La intensidad de Ia respuesta se correlaciona con Ia inflamación sinovial. Esta respuesta no es específica para AR comparada con otras enfermedades inflamatorias (Life, P. (1993) Responses to Gram negative enteric bacterial antigens by synovial T cells from patiens with juvenile chronic arthritis: recognition of heat shock protein hsp60. J Rheumatol. 20: 1388-1396).
Una posible señal de peligro para el sistema inmune Io constituyen las Hsp, que son liberadas de las células que mueren, y que pueden inducir una respuesta inflamatoria e iniciar Ia maduración de las APC. Al ser proteínas intracelulares, no son altamente expresadas en Ia membrana celular, ni son secretadas, por Io que son candidatos atractivos para moléculas que constituyen señales de peligro (Van den Berg, WB. (1998): Joint inflammation and cartilage destruction may occur uncoupled. Springer Semin Immunopathol. 20:149-164).
Varias preparaciones han sido propuestas utilizando Ia Hsp60 o péptidos derivados de ellas para el tratamiento de algunas patologías autoinmunes. Por ejemplo en Ia patente EPO262710 se propone el uso de varios péptidos de Ia Hsp60 de Mf para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades autoinmunes, especialmente de condiciones artríticas. Esta invención esta basada en el hecho de que infecciones previas con varias bacterias pueden iniciar el desarrollo de enfermedades autoinmunes, en personas genéticamente susceptibles, por ejemplo: pacientes con AR pueden mostrar una alta reactividad con antígenos microbianos. Estos mismos inventores en Ia patente EPO322990 proponen el uso de otros péptidos también de Ia Hsp60 de Mt con el mismo propósito de Ia patente anterior. En Ia solicitud de patente W09610039 se proponen el uso de un péptido de Ia Hsp60 de Mt para el diagnóstico y tratamiento de Ia artritis autoinmune. En Ia solicitud de patente WO9711966, se propone el uso de péptidos de regiones no conservadas de Ia Hsp60 humana, que no coincidan con las Hsp60 de bacterias, que pudieran inducir tolerancia en las células T de pacientes con AR. La solicitud de patente WO0143691 propone el uso de preparaciones farmacéuticas compuestas por péptidos de Ia HspβOh y variantes de estos en Ia prevención de enfermedades inflamatorias específicamente para diversas enfermedades autoinmunes entre ellas Ia AR. En Ia patente US6180103 se propone el uso de un péptido de Ia Hsp60 nombrado p277 y análogos de este para el diagnóstico y prevención de Ia diabetes tipo I.
La patente US5993803 protege el uso de Ia proteína Hsp60, el péptido p277 y un grupo de péptidos derivados de dicha proteína para reducir Ia severidad de Ia respuesta inmune durante el transplante de órganos. Recientemente se ha considerado que Ia ateroesclerosis presenta una serie de características similares a los procesos autoinmunes. En Ia solicitud de patente WO0072023 se plantea un método para el tratamiento y diagnóstico de Ia ateroesclerosis y enfermedades coronarias empleando una preparación que contiene Ia proteína Hsp60. En Ia solicitud de patente WO02057795 se protege un nuevo método para el diagnóstico y tratamiento de Ia osteoporosis usando proteínas de Ia familia de Hsp y proteínas de patógenos como: virus y bacterias.
En Ia actualidad no existe cura para Ia AR. Los métodos actuales de tratamiento se centran en aliviar el dolor, reducir Ia inflamación, retrasar los daños en las articulaciones y mejorar las funciones y el bienestar de los pacientes. Recientemente se han elaborado medicamentos inmunomoduladores que bloquean citocinas que participan en el inicio y el mantenimiento de Ia respuesta inflamatoria en AR, con el propósito de que su utilización detenga o retarde Ia progresión de Ia enfermedad. Para este tipo de terapia se disponen de 2 tipos de medicamentos: los que inhiben o bloquean Ia acción del Factor de Necrosis Tumoral-α (en inglés Tumor Necrosis Factor, abreviado TNFα) y los que inhiben o bloquean Ia acción de Ia interleucina 1 (IL-1).
Si bien los resultados son promisorios con Ia terapia anti-TNFα y anti-IL-1 , el porcentaje de infecciones es alto. Muchos de los pacientes tratados con estos fármacos desarrollan al menos un cuadro infeccioso grave, que en algunos casos es fatal y que puede incluir otras enfermedades autoinmunes, neoplasias, etc. Además de ser medicamentos muy caros (Breshinan, B. (1998) Treatment of rheumatoid artritis with recombinant human anti-interleukin-1 antagonist. Arthrítis Reum. 41 :2196-2204).
La tolerización oral ha sido propuesta como método de crear tolerancia periférica frente a ciertos antígenos. Esta puede ser inducida por mecanismos de supresión activa o por anergia o deleción clonal, dependiendo de las dosis y Ia frecuencia de Ia administración del antígeno. El método puede inducir células T reguladoras que se activan de forma específica con el antígeno, pero que ejercen su acción independientemente (supresión activa). Para que se produzca Ia acción reguladora, no es necesario administrar el antígeno supuestamente patogénico, sino otro cualquiera capaz de inducir Ia supresión activa en el foco inflamatorio, inhibiendo Ia actividad de las células efectoras patogénicas. El colágeno tipo Il (abreviado CII) es el autoantígeno que más se ha empleado en este sentido. Los resultados de los estudios realizados en pacientes con AR, utilizando CII de pollo y colágeno de tipo bovino han dado resultados contradictorios (Trentham, D.E. (1993) Effects of oral administration of typell collagen in rheumatoid arthritis. Science 261 :1727-1730; Sieper, J. (1996) Oral type Il collagen treatment ¡n early rheumatoid arthritis: a double-blind, placebo-controlled, randomize trial. Arthritis Rheum. 39:41-51).
En Ia patente US6153200 se propone el uso de un péptido de Ia Hsp70, proteína perteneciente a Ia familia de Hsp, para inducir tolerancia por vía oral en pacientes con AR. Otra variante que se ha sugerido para inducir tolerancia es a través de los péptidos APL, basado en el hecho de que las células T son activadas si los linfocitos T CD4 + específicos de un determinado antígeno peptídico reconocen el antígeno presentado por APC competentes. No obstante, si las mismas células T se encuentran primero con una forma diferente del antígeno en el que los residuos que contactan con el receptor de células T (en inglés T cell receptor, abreviado TcR) están ligeramente alterados, puede resultar en una activación parcial o incluso inactivación de las células T. Estos antígenos son los denominados APLs. Los APLs son análogos de péptidos inmunogénicos con una o varias sustituciones en las posiciones esenciales de contacto con el TcR o con el complejo mayor de incompatibilidad (en inglés Major Histocompatibility Complex, abreviado MHC), que interfieren o modifican Ia cascada de eventos necesarios para Ia completa activación de las células T. Conceptualmente pueden diseñarse APLs con propiedades similares al péptido inmunogénico (agonistas) entre cuyos efectos se encuentra incrementar Ia respuesta de células T hacia antígenos específicos. Este efecto es ventajoso en condiciones patológicas como enfermedades neoplásicas e infecciosas. También pueden diseñarse péptidos con propiedades antagónicas al péptido inmunogénico que podrían resultar beneficiosos en el control de enfermedades autoinmunes ya que pueden bloquear Ia respuesta de células T actuando como antagonistas del TcR (M De Magistris (1992) Antigen analog-major complex histocompatibility complexes act as antagonist of the T cell receptor. Cell 68:625- 634), agonistas parciales o induciendo una población de células T reguladoras que median Ia supresión activa (Evavold, B. D. (1991) Separation of IL-4 production from Th cell proliferation by an altered T cell ligand. Science 252:1308-1310). La capacidad de manipular experimentalmente las propiedades intrínsecas de ligandos peptídicos conocidos permite alterar apropiadamente Ia naturaleza, el curso y Ia potencia de Ia respuesta celular inmune.
Hasta el momento se han desarrollado para el tratamiento de enfermedades autoinmunes dos ensayos clínicos en humanos empleando péptidos del tipo APL. En ambos ensayos se emplearon péptidos APL derivados del epitope que abarca los aminoácidos del 83 al 93 de Ia MBP (del inglés myelin basic protein, abreviado MPB). Uno de estos ensayos incluyó 142 pacientes con esclerosis múltiple, y fue suspendido porque el 9 % de los pacientes desarrollaron hipersensibilidad (Ludwig Kapposi (2000) Induction of a non-encephalitogenic type 2 T helper-cell autoimmune response in múltiple sclerosis after administration of an altered peptide ligand in a placebocontrolled, randomized phase Il trial. Natυre Medicine 10:1176-1182).
El otro ensayo incluyó 25 pacientes y se detuvo antes de tiempo, porque en tres pacientes se observó una exacerbación de Ia enfermedad (Bibiana Bielekova (2000) Encephalitogenic potential of the myelin basic protein peptide (amino acids 83-99) in múltiple sclerosis: Results of a phase Il clinical trial with an altered peptide ligand. Nature Medicine 6:1167-1175). La autora principal de este trabajo hace un análisis de los posibles factores que determinaron estos resultados negativos, y plantea que los cambios realizados en los sitios APL pueden originar nuevos motivos de unión al HLA (como ocurrió en el caso del APL unido al alelo DRB1*0404 presente en el paciente I), además el complejo APL-HLA puede estimular células T no delecionadas en Ia selección negativa que pueden ser cross-activada por el autoantígeno nativo. En este ensayo se usaron concentraciones altas del APL en las preparaciones farmacéuticas, las cuales pueden estimular células T con alta afinidad por el autoautoantígeno e inducir una respuesta de células T heteroclítica. (Bibiana Bielekova y Roland Martin (2001) Antigen-specific immunomodulation via altered peptide ligando. J Mol Med. 79:552-556).
Para Ia realización de estos dos ensayos clínicos, los autores no analizaron previamente Ia respuesta in vito de Ia células T de los pacientes frente a los APL, tampoco tuvieron en cuenta los tipos de moléculas HLA que expresan los pacientes tratados.
El desafío principal en el tratamiento de las enfermedades autoinmunes es el desarrollo de estrategias terapéuticas que puedan delecionar células T patogénicas con especificidad, sin afectar a otras células T no relacionadas. Por Io tanto, Ia búsqueda terapéutica debe encontrar el modo seguro, específico y eficaz de apagar un proceso autoinmune avanzado.
La presente invención, en contraste al estado de Ia técnica anterior, propone el uso de péptidos de Ia HspβOh y derivados de estos del tipo APL, los cuales inducen de forma específica mecanismos moleculares inhibitorios del curso de Ia AR.
Explicación de Ia invención
La presente inversión resuelve el problema antes mencionado, proporcionando péptidos de Ia proteína humana de estrés térmico de 60 kDa que constituyen epitopes para células T, para inducir mecanismos de tolerancia periférica, en particular mecanismos inductores de anergia o mediados por clones de células T regulatorias en pacientes con AR y que presentan las secuencias:
E18-12 MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 1)
E18-3 SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG (SEQ. ID. NO: 2)
F19-6 IIDPTKWRTALLDAA (SEQ. ID. NO: 3) En Ia solicitud de patente WO9711966, se propone el uso de péptidos de Ia Hsp60 humana y de Mt basado en el hecho de que pudieran inducir tolerancia en las células T y prevenir Ia AR. Estos autores al administrar estos péptidos en ratones, donde Ia Artritis se indujo con pristano, logran una cierta mejoría de Ia enfermedad. A diferencia de esta solicitud, nosotros hemos demostrado que nuestros péptidos desencadenan mecanismos de supresión activa, inductores de tolerancia periférica de forma muy eficiente, al comprobarse un aumento significativo de IL-10 en dos modelos animales de Artritis, así como en los ensayos "ex vivo" empleando células mononucleares de pacientes. Es conocido que Ia respuesta fundamental de células T en el modelo de artritis inducida por adyuvante (abreviado AIA), está dirigida contra Ia Hsp60. Nosotros comprobamos en este modelo que nuestros péptidos derivados de Ia HspβOh ejercieron una protección terapéutica muy marcada, produciendo un aumento de Ia IL-10 y una disminución del TNFα. Este mismo efecto terapéutico ejercido por estos péptidos, también Io comprobamos en el modelo animal de artritis inducida por colágeno (abreviado AIC), donde Ia repuesta mayoritaria es contra el colágeno tipo II.
Estos hechos indican que las capacidades terapéuticas de nuestros péptidos son independientes del agente inductor y pueden mediar mecanismos de supresión activa en el sitio de Ia inflamación, que pudiera extenderse a otros autoantígenos presentes en Ia articulación y que progresivamente contribuyen al proceso inmunopatogénico que tiene lugar en curso de Ia AR. Estos resultados refuerzan las posibilidades terapéuticas del uso de nuestras preparaciones para el tratamiento de Ia AR en pacientes. Estos péptidos son en particular útiles según Ia presente invención, para el diseño de variantes derivadas tipo APL de los péptidos E18-12 (SEQ. ID. NO: 1) y E18-3 (SEQ. ID. NO: 2), modificados en los sitios de contacto con Ia molécula MHC humana y el derivado tipo APL del péptido F19-6 (SEQ. ID. NO: 3), modificado en los sitios de contacto con Ia molécula MHC de rata. Las secuencias de aminoácidos respectivas son:
MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 1)
1 2 34 56 7 Se sustituye en Ia posición 1 por: A1F1I1L1M1V1W, ó Y posición 2 por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 3 por: A1K1V1R1T1I1P1L1N1S1G1Y, ó M posición 4 por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 5 por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1 ó Y posición 6 por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1P1Q1R1S1T1V1W, ó Y posición 7 por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V, ó Y
SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 2) 1 2 3 4 5 6 7 8 se sustituye en Ia posición 1 por L1I1V1M1Y1W1F, ó A posición 2 por A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W, ó Y posición 3 por A1F1I1K1L1M1P1R1S1T1V1W1 ó Y posición 4 por L1I1V1M1Y1W1F, ó A posición 5 por A1D1E1F1G1H1LK1L1M1N1Q1R1S1T1V1W, ó Y posición 6 por A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 7 por A1F1I1K1L1M1P1R1S1T1V1W1 ó Y posición 8 por A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W, ó Y
IIDPTKWRTALLDAA (F19-6) (SEQ. ID. NO: 3)
1 2 posición 1 se sustituye por H. posición 2 se sustituye por E. En una realización particular, los péptidos derivados tipo APL tienen una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste de SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 8, SEQ. ID. NO: 9, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11 , SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 19, SEQ. ID. NO: 20 y SEQ. ID. NO: 21.
Los péptidos de Ia presente invención pueden ser producidos por los métodos rutinarios de síntesis de péptidos. Cada composición que posea un péptido especifico puede ser testado por el nivel y Ia calidad de Ia respuesta inmune que induce en experimentos como los que se describen en los ejemplos que se presentarán posteriormente.
Todas las secuencias descritas encima y en los ejemplos son útiles en sí y también pueden ser usadas como una base para el diseño y Ia síntesis de derivados con propiedades mejoradas.
La invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los péptidos anteriormente enumerados y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable o excipiente. La administración de las preparaciones farmacéuticas a los pacientes, deberá estar en correspondencia con las moléculas HLA clase Il que exprese el paciente en cuestión.
La vía de administración de las composiciones farmacéuticas, dependerá del patrón de citocinas que inducen dichas preparaciones en los ensayos "ex vivo". Las preparaciones farmacéuticas conteniendo péptidos APL inductores de una respuesta reguladora serán administradas por vía intradérmica o subcutánea. Las preparaciones farmacéuticas conteniendo los péptidos originales inductores de una respuesta TH1 podrán ser administrados por vía oral.
Las cantidades presentes en las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención son las que producen Ia respuesta inmune efectiva en el hospedero. La cantidad efectiva es Ia cantidad que al ser administrada resulta en Ia inducción de mecanismos moleculares que disminuyen significativamente los signos inflamatorios característicos de Ia AR y detienen los daños articulares histopatológicos característicos del curso de esta enfermedad. Además Ia cantidad de Ia composición farmacéutica administrada al hospedero puede variar en dependencia de varios factores que incluyen: los péptidos empleados, puntaje ACR (en inglés, American College of Rheumatology, abreviado ACR), HLA tipo II, tiempo de diagnosticada Ia enfermedad, edad, sexo, salud general, así como el nivel de respuesta inmunológica en general. La presente invención además relaciona un método de tratamiento de Ia AR, el cual comprende Ia administración a un paciente de cantidades efectivas de los péptidos o las composiciones farmacéuticas referidas anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
En parte, los resultados se muestran gráficamente en las siguientes figuras: Figura 1: Evaluación de los signos clínicos de Ia Artritis en las ratas tratadas con los péptidos F19-6 y F19-7 por vía intradérmica, en el modelo de AIA.
Figura 2: Modulación de los niveles de TNFα inducido por los péptidos F19-6 y F19- 5 7 en células mononucleares de ratas del modelo AIA en el día 15 después de inducida Ia enfermedad.
Figura 3: Modulación de los niveles de IL-10 inducido por los péptidos F19-6 y F19- 7 en células mononucleares de ratas del modelo AIA en el día 15 después de 10 inducida Ia enfermedad.
Figura 4: Microscopía óptica de una sección de Ia articulación perteneciente a un animal enfermo no tratado. El: espacio intrarticular, EC: erosión del cartílago, P: pannus. Tinción: hematoxilina-eosina. 15.
Figura 5: Microscopía óptica de una sección de Ia articulación perteneciente a un animal tratado con el péptido F19-7 por vía intradérmica. El: espacio intrarticular. Tinción: hematoxilina-eosina.
0 Figura 6: Modulación de los niveles de TNFα inducido por los péptidos F19-6 y F19- 7 en células mononucleares de ratas del modelo animal de AIC, en el día 21 después de inducida Ia enfermedad.
Figura 7: Modulación de los niveles de IL-10 por los péptidos F19-6 y F19-7 en 5 células mononucleares de ratas del modelo animal de artritis inducida con colágeno, en el día 21 después e inducida Ia enfermedad.
Figura 8: Modulación de los niveles de TNFα por los péptidos F19-6 y F19-7 en células mononucleares de pacientes con AR. 0
Figura 9: Modulación de los niveles de TNFα por los péptidos E18-3 y E18-12 en células mononucleares de pacientes con AR. Figura 10: Modulación de los niveles de IL-10 por los péptidos E18-3 y E18-12 en células mononucleares de pacientes con AR.
Figura 11 : Modulación de los niveles de IL-10 inducido por los péptidos E18-3 y E18-12 y sus APL en células mononucleares de pacientes con AR.
Figura 12: Modulación de los niveles de TNFα inducido por los péptidos E18-3 y E18-12 y sus APL en células mononucleares de pacientes con AR.
Figura 13: Relación de los niveles de IL-10 y TNFα, inducido por los péptidos E18-3 y E18-12 y sus APLs.
Figura 14: Evaluación de los signos clínicos de Ia Artritis en las ratas tratadas con los péptidos E18-12 y E18-12APL1 por vía intradérmica, en el modelo de AIA.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos
Ejemplo 1 : Péptidos de Ia HspβOh presentados por HLA humano.
Se seleccionaron aquellos péptidos de Ia HspβOh, reportados como epítopes de células T humanas por los dos programas empleados: SYFPEITHI (Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic. 1999. Immunogenetics 50:213-219. SYFPEITHI: datábase for MHC ligands and peptide motifs. (access via: http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)) y ProPred (Singh,H. and Raghava.G.P.S. 2001. ProPred: Prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics, 17(12): 1236-37). La secuencia correspondiente a estos péptidos se muestra en Ia Tabla 1.
Tabla 1. Secuencia de los péptidos de Ia HspβOh presentados por HLA humano
Péptidos Posición en Ia Secuencia aminoacídica secuencia
E18-12 55-75 MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK
(SEQ. ID. NO: 1)
E18-3 83-110 SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG
(SEQ. ID. NO: 2) f
Ejemplo 2: Péptido de Ia HspβOh para epítope de ratas Lewis.
A partir de Ia secuencia de HspβOh se selecciono un péptido que se une a Ia molécula de MHC-Il de rata RT1.BI de acuerdo al motivo de secuencia descrito en Ia base de datos SYFPElTHI (Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic. 1999. Immunogenetics 50:213-219. SYFPEITHI: datábase for MHC ligands and peptide motifs. (access via : http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)).
Se hizo un programa que analiza todos los péptidos de 9 aminoácidos para buscar aquellos que cumplen con el motivo. Se incluyeron también las variantes en las que en una de las posiciones no está incluido ninguno de los residuos descritos como de anclaje o preferenciales.
La secuencia correspondiente a uno de estos péptidos (F19-6) se muestra en Ia Tabla 2.
Tabla 2. Secuencia del péptido de Ia HspβOh seleccionado para ratas
Péptido Posición en Ia Secuencia aminoacídica secuencia
F19-6 518-533 IIDPTKWRTALLDAA
(SEQ. ID. NO: 3)
Ejemplo 3: Diseño de los APL con modificaciones en los aminoácidos involucrados en Ia unión al MHC.
Partiendo de los péptidos seleccionados en los ejemplos 1 y 2, se modificaron las posiciones involucradas en Ia unión al MHC específico (posiciones 1 , 3, 4, 6, 8 o 9) tratando de aumentar Ia afinidad del mismo por Ia molécula de HLA. Se buscó que en cada una de estas posiciones estuvieran los residuos óptimos ya sean residuos de anclaje si el péptido seleccionado fue por métodos que usan motivos de unión
(SYFPEITHI) o residuos capaces de aumentar Ia puntuación del péptido como ligando del MHC si Ia selección del péptido se hizo usando otro tipo de algoritmo
(ProPred).
Como resultado de estos análisis el péptido E18-12, ha sido sustituido en las posiciones del 1 al 7 señaladas a continuación por cada uno de los aminoácidos que se especifican: MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (E18-12)
1 2 34 56 7 posición 1 se sustituye por: A1F1I1L1M1V1W, ó Y posición 2 se sustituye por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 3 se sustituye por: A1K1V1R1T1I1P1L1N1S1G1Y, ó M posición 4 se sustituye por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 5 se sustituye por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V, ó Y posición 6 se sustituye por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1P1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 7 se sustituye por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1 ó Y El péptido E18-3, ha sido sustituido en las posiciones del 1 al 8 señaladas a continuación por cada uno de los aminoácidos que se especifican:
SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA (E18-3)
1 2 3 4 5 6 7 8 posición 1 se sustituye por: L1I1V1M1Y1W1F, ó A posición 2 se sustituye por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 3 se sustituye por: A1F1I1K1L1M1P1R1S1T1V1W, ó Y posición 4 se sustituye por: L1I1V1M1Y1W1F1 ó A posición 5 se sustituye por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 6 se sustituye por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 7 se sustituye por: A1F1I1K1L1M1P1R1S1T1V1W1 ó Y posición 8 se sustituye por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W, ó Y
El péptido F19-6, ha sido sustituido en las posiciones 1 y 2 señaladas a continuación por los aminoácidos que se especifican:
IIDPTKWRTALLDAA (F19-6) 1 2 posición 1 se sustituye por H. posición 2 se sustituye por E.
Estas dos sustituciones dieron origen al péptido F19-7: IIDPTHWRTELLDAA (F19-7) (SEQ. ID. NO: 4)
Ejemplo 4: Inducción de Ia Artritis por adyuvante y colágeno en ratas Lewis.
En el experimento se emplearon ratas Lewis hembras ¡sogénicas (hapiotipo RT1.BI MHC) suministradas por el Centro Nacional para Ia Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, Cuba). Las ratas fueron seleccionadas aleatoriamente, con un peso aproximado de 101-120 g y de 5-8 semanas de edad. Uno de los agentes inductores de Ia enfermedad empleado fue el Mt (H37Ra, Difco, Inglaterra) en adyuvante incompleto de Freund (AIF) (Sigma, EEUU). El otro agente inductor de Ia Artritis fue el colágeno tipo Il bovino en AIF.
En este ejemplo se emplearon dos agentes inductores diferentes para desarrollar en las ratas Ia Artritis, mediada esta por una respuesta inmune contra dos autoantígenos diferentes. Es bien conocido que en el modelo de Artritis donde se emplea como inductor el Mt, Ia respuesta fundamental de células T es contra Ia Hsp60 (Anderton, SM (1995) Activation of T cells recognizing self 60-kD heat shock protein can protect against experimental artritis. J. Exp. Med. 181: 943-952). En el modelo donde se emplea el colágeno como inductor se desarrolla una marcada respuesta de anticuerpos y clones de células T contra este autoantígeno (M Griffiths (1988) Immunogenetics of collagen-induced artritis in rats. Inten. Rev. Immunology 4: 1-15). Nuestro objetivo fundamental al desarrollar estos dos Modelos, fue evaluar en ambos nuestros candidatos peptídicos, con el propósito de demostrar si el efecto protector de los péptidos era independiente o no del autoantígeno empleado como agente inductor de Ia Artritis en las ratas.
Ejemplo 5: Evaluación de los signos clínicos. El grado de inflamación asociado con el desarrollo de Ia artritis que presentaba cada rata, se evaluó con el siguiente average confeccionado para este fin:
0 punto: pata normal.
1 punto: Ligero, pero definitivo enrojecimiento del tobillo o muñeca, o aparentemente enrojecimiento e inflamación limitado a un dedo individual, independientemente del número de dedos afectados.
2 puntos: Moderado enrojecimiento e inflamación del tobillo y Ia muñeca.
3 puntos: Severo enrojecimiento e inflamación de toda Ia pata incluyendo los dedos.
4 puntos: Inflamación máxima y deformidad de Ia pata involucrando múltiples articulaciones. Se evaluaron las cuatro patas por separado y según el puntaje elaborado, cada pata podía recibir hasta 4 puntos. Por Io tanto cada rata podía recibir un máximo de 16 puntos.
La evaluación visual se realizó después de Ia inducción de Ia enfermedad cada cinco días. La evaluación clínica de los signos de Ia Artritis demostró que había diferencias estadísticas significativas entre los animales correspondientes al grupo control sano (grupo IV), donde no se indujo Ia enfermedad, y los animales correspondientes al grupo control enfermo (grupo III), donde se indujo Ia enfermedad pero no fueron tratados con los péptidos, como se muestra en Ia Figura 1.
Ejemplo 6: Síntesis de péptidos.
Los péptidos fueron sintetizados por Ia estrategia Fmoc/tBu en jeringuillas. Se utilizó Ia resina Fmoc-AM-MBHA (0,54 mmoL/g) y se siguió el protocolo de síntesis con agitación mecánica. Después del tratamiento con TFA, el péptido se liofilizó y se caracterizó por HPLC y espectrometría de masa.
Ejemplo 7: Administración intradérmica de los péptidos.
Los animales fueron separados en cuatro grupos de 12 ratas cada uno. La enfermedad se indujo en tres grupos de animales (Grupo I- Grupo III), de los cuales dos fueron tratados con los péptidos y uno quedó como control de Ia inducción de Ia enfermedad. A los dos grupos de animales que fueron tratados con los péptidos, se les administró 200 μg de péptido por rata en un volumen de 100 μL de PBS, los días 12, 17 y 22 después de inducida Ia enfermedad con Mt. Los animales separados en cuatro grupos fueron tratados de Ia siguiente forma:
> grupo I: se Ie administró el péptido F19-6
> grupo II: se Ie administró el péptido F 19-7
> grupo III: no se Ie administró péptido (control de Ia inducción de Ia enfermedad)
> grupo IV: no se Ie indujo Ia enfermedad ni se Ie administró péptido (control negativo)
Los días 15, 21 , 28 y 35 después de Ia inducción se sacrificaron tres animales por grupo, se les extrajo el bazo y se les tomó muestra de las articulaciones para el análisis histopatológico.
Como se muestra en Ia Figura 1 los signos asociados con el desarrollo de Ia Artritis comenzaron a manifestarse paulatinamente. En los animales del grupo III, correspondiente al grupo control del desarrollo de Ia enfermedad, a partir del día 10, después de inducida Ia misma, se hizo evidente el desarrollo de un proceso inflamatorio que se inició con un enrojecimiento ligero de las articulaciones traseras / y que se fue extendiendo al resto de las articulaciones llegando a hacerse severo en algunas de las ratas.
En esta misma figura se evidencia que Ia administración del péptido F19-6 correspondiente al epítope original de Ia HspβOh y de su variante APL F19-7, indujeron una reducción significativa de los signos clínicos de Ia Artritis en los animales tratados con ambos péptidos. Se obtuvo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos tratados con los péptidos F19-6 y F19-7 y el grupo tomado como control positivo de Ia enfermedad (P< 0.05).
Los resultados obtenidos a partir de este ensayo permiten corroborar que los péptidos F19-6 y F19-7 ejercen un efecto protector en los animales tratados, ya que fue posible observar una remisión casi completa de Ia enfermedad en los mismos.
Ejemplo 8: Aislamiento de ácido ribonucleico mensajero (ARNm).
Las células mononuclares aisladas del bazo de las ratas, fueron incubadas aproximadamente durante 20 horas. Pasado este tiempo se desechó el sobrenadante de cultivo y se adicionó 1mL del reactivo: TRI REAGENT ™ (SIGMA,
EEUU) por pocilio y se dejó durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente se procedió al aislamiento del ARNm siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.
Ejemplo 9: Transcripción reversa de ácido ribonucleico.
Para obtener el ADN complementario se utilizó el sistema Gene Amp RNA PCR Kit
(Perkin- Elmmer, EEUU). Se tomó 1 μg de ARNm correspondiente a cada una de las muestras y se siguió el protocolo que recomienda el fabricante. La reacción se incubó en un termociclador (Minicycler, MJ Research, EEUU), según el siguiente esquema: un primer ciclo de 1 hora a 420C, seguidamente 5 minutos a
950C y 5 minutos a 40C.
Ejemplo 10: Reacción en cadena de Ia polimerasa. La reacción en cadena de Ia polimerasa (abreviado RCP) se realizó para las citocinas: TNFα y IL-10 y el gen constitutivo que codifica para Ia enzima GAP-DH (en inglés glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, abreviado GAP-DH). Para cada reacción se utilizaron 10 pmol de cada cebador, 5 μl_ del ADN molde, 0.25 μl_ de Ia ADN Polimerasa Termoestable (Taq-Pol) (Perkin- Elmmer, EEUU) en el tampón recomendado por los fabricantes (KCI 50Mm, Tris-HCI 1OmM, pH 9.0, Tritón X-100 al 0.1% y MgCI21.5 mM) en un volumen final de 25 μl_. La reacción para el GAP-DH se incubó en un termociclador (Minicycler, MJ Research, EE.UU) según el siguiente programa: un primer ciclo de 3 minutos a 940C (temperatura de desnaturalización), 1 minuto a 940C, 1 minuto 580C (temperatura de hibridización) y 1 minuto a 720C (temperatura de elongación), seguidamente 35 ciclos de: 1 minuto a 940C, 1 minuto a 580C y 1 minuto a 720C cada uno. Por último un paso de extensión de 3 minutos a 720C.
Para las citocinas se siguió el esquema anterior variando solamente Ia temperatura de hibridización. Para Ia IL-10, 540C y para el TNFα 640C.
Ejemplo 11: Análisis de los productos de Ia RCP por electroforesis en geles de agarosa.
El resultado de los productos de RCP se comprobó mediante una electroforesis en gel de agarosa. Las imágenes de las corridas electroforéticas fueron captadas y analizadas con el programa Molecular Analyst (BioRad). Los resultados fueron expresados como niveles relativos de ARNm para cada citocina.
Ejemplo 12: Análisis estadístico de los niveles relativos de ARNm para cada citocina.
Para determinar las diferencias en el patrón de citocinas (según los niveles relativos de ARNm para cada una de ellas) entre los grupos de animales tratados, se emplearon las pruebas de Kruskal-Wallis y de Student-Newman-Keuls. (Paquete estadístico Sigma Stat v 2 1997, GraphPad Software, Inc).
Los análisis estadísticos demostraron que en el día 15 después de inducida Ia enfermedad, los péptidos disminuyen significativamente los niveles de TNFα en comparación con el grupo control de Ia enfermedad. Estos resultados se muestran en Ia Figura 2, donde Gl corresponde a los animales tratados con el péptido F19-6, GII representa el grupo de ratas tratadas con el péptido F19-7, GIII representa el grupo enfermo no tratado y GIV incluye los animales sanos. Se comprobó claramente que el tratamiento con los péptidos 00008
provocó una disminución en ios niveles relativos de esta citocina responsable en gran medida de inducir el proceso inflamatorio en los animales. Se encontró diferencia estadísticamente significativa para el caso de Ia citocina TNFα entre los grupos tratados con los péptidos y en el grupo empleado como control positivo de Ia enfermedad. No se evidenció diferencia significativa entre los diferentes grupos tratados con los péptidos ni entre estos y el grupo tomado como control negativo de Ia enfermedad. Este resultado indica que Ia administración de las dos variantes peptídicas causó una disminución en los niveles del TNFα, prácticamente hasta los niveles en que se encuentra esta citocina en los animales sanos. Con el propósito de determinar si los péptidos empleados en este ensayo, podían estimular Ia producción de citocinas anti-inflamatorias como Ia IL-10, fueron evaluados los niveles relativos de ARNm correspondientes a esta citocina. La IL-10 se encuentra involucrada en Ia inducción de tolerancia periférica a través de una respuesta mediada por células T. Se conoce que regula directamente las células T por inhibir Ia producción de IL-2, IL-5 y TNFα.
La Figura 3 muestra Ia medición semi-cuantitativa de los niveles de expresión de Ia IL-10 en los diferentes grupos de tratamiento, en el día 15 posterior a Ia inducción de Ia enfermedad. En esta figura Gl corresponde a los animales tratados con el péptido F19-6, GII representa el grupo de ratas tratadas con el péptido F19-7, GIII representa el grupo de animales enfermos no tratados y GIV incluye los animales sanos.
Como se puede observar, el tratamiento de los animales con los péptidos induce un incremento en los niveles de expresión relativos de Ia IL-10. No se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de animales tratados con los péptidos, existiendo diferencias significativas entre estos dos grupos y los animales que constituyeron los controles positivo y negativo del ensayo. A partir de estos resultados podemos inferir que los péptidos actúan induciendo un cambio en el fenotipo funcional de las células T involucradas en Ia patogénesis de Ia enfermedad, incrementando los niveles de producción de citocinas antinflamatorias como es el caso de Ia IL-10 y disminuyendo los niveles de producción de las citocinas proinflamatorias como el TNFα. Ejemplo 13: Análisis Hϊstopatológico.
Con el objetivo de corroborar los signos clínicos observados en los animales de este biomodelo y analizar Ia capacidad de ambos péptidos de revertir o disminuir el proceso destructivo generado por el Mt, se realizó el análisis histopatológico de las articulaciones de los animales de cada grupo.
Las láminas correspondientes a las articulaciones fueron analizadas por el grupo de
Patología del Bioterio del CIGB.
Las articulaciones fueron fijadas en buffer neutro de formalina al 10% y descalcificadas. Los tejidos fueron deshidratados en un gradiente de alcohol, embebidos en parafina y cortados en secciones de 5μm. Posteriormente las muestras fueron montadas en portaobjetos y teñidos con una mezcla de hematoxilina-eosina y observadas en un microscopio óptico.
Los resultados de los análisis histopatológicos se muestran en Ia tabla 3.
Tabla 3. Resumen del análisis histopatológico de las articulaciones de los animales de los grupos I-grupo IV.
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En Ia Tabla 3 Ia P: representa el pannus; EC: erosión del cartílago articular; IM: invasión de Ia médula ósea; HO: hiperplasia de los osteoclastos; G: reacción granulomatosa; PMN: polimorfonucleares. En los animales del grupo III incluyendo los sacrificados el día 15, se evidenció Ia presencia del pannus que conllevó a Ia erosión del cartílago y Ia invasión de Ia médula ósea. Además, se observa Ia reacción granulomatosa típica de Ia inducción con Mt y con frecuencia Ia hiperplasia de los osteoclastos, que son células gigantes que tienen un gran poder destructivo de Ia sustancia ósea. Estos resultados histopatológicos reproducen los signos característicos de las modificaciones articulares que ocurre en los pacientes con AR, Io cual demuestra que hemos desarrollado un modelo animal adecuado para evaluar los candidatos farmacológicos que disponemos. La Figura 4A corresponde a Ia articulación de un animal del grupo III no tratado. En esta puede observarse Ia presencia del pannus que invade todo el espacio intrarticular, extendiéndose hacia el cartílago donde se evidencia Ia erosión de este, así como Ia invasión hacia Ia médula ósea. En Ia Figura 4B se muestra una ampliación de Ia región que corresponde a Ia médula ósea donde se observa con mayor nitidez el pannus que es un tejido de granulación rico en células fagocíticas. En el tratamiento con el péptido F19-7 por vía intradérmica (grupo II) como se muestra en Ia Figura 5, el animal sacrificado el día 15 no presenta alteraciones histológicas, solo Ia presencia de polimorfonucleares y abundante tejido de cicatrización. En contraste con el resto de los animales del grupo III, que se caracterizaron por presentar signos histopatológicos severos. Como se muestra en Ia Tabla 3, los grupos de animales tratados con los péptidos F19-6 y F19-7, prácticamente no mostraron afectaciones histológicas durante el curso del primer ensayo. Se evidenció una mayor protección al desarrollo de Ia Artritis en los animales tratados con el péptido F19-7. La mitad de las ratas involucradas en este grupo de tratamiento (6 ratas) no presentaron ninguna manifestación histopatológica, en correspondencia con el grupo de animales tratados con el F19-6, donde solo dos ratas no presentaron daño histopatológico. En los grupos tratados con los péptidos F19-6 y F19-7 no se observó Ia presencia de pannus los días 15 y 21 después de inducida Ia Artritis, esto indica que Ia administración de estas variantes peptídicas indujo un retardo en Ia aparición de los eventos celulares propios de Ia reacción inflamatoria implicada en el desarrollo de Ia Artritis. Resultó significativo que de los animales tratados con Ia variante peptídica F19-7 sacrificados el día 35 después de inducida Ia Artritis, solo una rata evidenció las afectaciones histológicas características del desarrollo de Ia enfermedad. Estos resultados indican que el tratamiento de los animales con este péptido indujo en ellos, además de un retardo en Ia manifestación clínica de Ia enfermedad, una remisión prácticamente total de los signos histopatológicos de Ia Artritis, poniendo de manifiesto una superioridad terapéutica del APL F19-7 con respecto al péptido que contiene al epítope original F19-6.
Ejemplo 14. Evaluación in vitro del patrón de citocinas frente a los péptidos F19-6 y F19-7, empleando células mononucleares de ratas donde Ia Artritis se indujo con colágeno tipo II.
En este ensayo se emplearon ratas enfermas donde Ia Artritis se indujo usando colágeno tipo Il de origen bovino en AIF. Se extrajo el bazo de cada rata analizada y se aislaron las células mononucleares.
Las células mononucleares aisladas del bazo fueron cultivadas en 1.5 mL de RPMI 1640 en placas de 24 pocilios (Costar, EEUU). El ensayo se realizó por triplicado, y un total de 3x106 células/pocilio fueron cultivadas durante 24 horas con los péptidos
F19-6 y F19-7 a una concentración de 5μg/mL e incubadas a 370C, en atmósfera húmeda de CO2 al 5%. Las células cultivadas sin los péptidos fueron utilizadas como control negativo del ensayo.
Posteriormente se aisló el ARNm, se realizó Ia reacción de trascripción reversa del ácido nucleico y Ia RCP de Ia misma manera como se describe en los ejemplos anteriores. Los análisis de los productos de RCP se efectuaron por electroforesis en geles de agarosa como se describe en el ejemplo 12. Para determinar las diferencias en el patrón de citocinas según los niveles relativos de ARNm para cada una de las muestras, se emplearon las pruebas estadísticas que se describen en el ejemplo13. En Ia Figura 6 se muestran los niveles de TNFα de las células cultivadas sin péptido y estimuladas con los péptidos F19-6 y F19-7 in vitro correspondientes al día 21 posterior a Ia inducción de Ia enfermedad, Ia letra A representa los niveles de TNFα en las células cultivadas sin péptido, Ia letra B representa los valores de esta citocina cuando las células son estimuladas con el péptidos F19-6 y Ia letra C corresponde a los niveles de TNFα cuando las células son estimuladas con el péptidos F19-7. En esta figura CII representa el grupo de animales, donde Ia Artritis se indujo con colágeno tipo Il y Control representa el grupo de animales sanos. En Ia Figura 7 se muestran los niveles de IL-10 de las células cultivadas sin péptido y estimuladas con los péptidos F19-6 y F19-7 in vitro correspondientes al día 21 posterior a Ia inducción de Ia enfermedad, Ia letra A representa los niveles de IL-10 en las células cultivadas sin péptido, Ia letra B representa los valores de esta citocina cuando las células son estimuladas con el péptidos F19-6 y Ia letra C corresponde a los niveles de IL-10 cuando las células son estimuladas con el péptidos F19-7. En esta figura CII representa el grupo de animales, donde Ia AR se indujo con colágeno tipo Il y Control representa el grupo de animales sanos.
Como se observa en estas dos figuras los péptidos F19-6 y F19-7 in vitro disminuyen los niveles de TNFα, en el caso de los niveles de IL-10 solo el péptido F19-7 Io incrementa significativamente. Estos resultados indican que el péptido F19-7 es capaz de modular el patrón de citocinas hacia un fenotipo regulador en el modelo animal donde Ia Artritis se induce con colágeno. Por tanto podemos afirmar que Ia acción inmunomoduladora de este péptido derivado de Ia HspβOh in vitro se puede extender a modelos animales de Artritis, donde el agente inductor que participa en el desarrollo de Ia enfermedad no es Mt o autoantígenos relacionados.
Dichos resultados sugieren que el péptido F19-7 puede inducir tolerancia para antígenos no relacionados estructuralmente por Io que pudiera mediar in vivo una supresión activa en el sitio de Ia inflamación.
Con estos resultados podemos sugerir que el péptido F19-7 induce en los animales una protección frente a Ia artritis inducida por Mt o colágeno tipo II, Ia cual está mediada por células T reguladoras que producen IL-10. Este efecto pudiera extenderse a otros autoantígenos presentes en Ia articulación y que progresivamente contribuyen al proceso inmunopatogénico que tiene lugar en curso de Ia AR.
Ejemplo 15: Medición de citocinas en pacientes con AR frente a los péptidos F19-6 y F19-7. Utilizando sangre de pacientes con AR se realizaron ensayos de medición de las citocinas: TNFα, IFNγ e IL-10. En estos ensayos se evaluaron Ia potencialidad de los péptidos de Ia HspβOh para aumentar o disminuir las diferentes citocinas involucradas en Ia patogénesis de Ia enfermedad. Se partió de 10 mL de sangre de cada paciente, que se diluyo ΛA en PBS 1X. Se añadieron 5 mL de esta dilución a 3 mL de Ficoll-Paque (Amershan) en tubos de centrifugación de 15 mL, los cuales se centrifugaron durante 30 min. a 1200 rpm. Se extrajo el anillo correspondiente a las células mononucleares. Posteriormente las células se lavaron dos veces con 15 mL de PBS 1X y después de cada lavado se centrifugaron a 900 rpm. Finalmente el precipitado fue resuspendido en medio RPMI 1640 conteniendo 10% de suero fetal bovino y suplementado con penicilina (100U/mL), estreptomicina (100μg/mL), HEPES 25 mM/L y L-glutamina 2mM (todos adquiridos de Gibco BRL).
Las células mononucleares obtenidas se sembraron en número de 106 células /pocilio en placas de 24 pocilios (Costar) en un volumen de 800 μL. Posteriormente se añadieron los péptidos de Ia HspβOh en un rango de concentración desde 0.5 μg/mL hasta 100 μg/mL, precisándose para cada péptido Ia concentración óptima para modular los niveles de citocinas. La Fitohemaglutinina (PHA) al 1% fue usada como control positivo de estimulación celular, mientras que el RPMI 1640 solo fue empleado como control del crecimiento celular basal. Las células fueron cultivadas durante 24 horas y posteriormente se tomó el sobrenadante de cada pocilio, diluido Vi, y se determinó Ia concentración de las citocinas a través los kits específicos para cada una de ellas Quantikine® (R&D Systems) según las recomendaciones de los fabricantes. En Ia Figura 8, se representan los niveles de TNFα modulados por los péptidos F19- 6 y F19-7 en células mononucleares de pacientes con AR. En esta figura, Ia letra C" representa las células cultivadas in vitro sin péptidos; mientras que F19-6 corresponden a las células estimuladas in vitro con el péptido F19-6 y F19-7 representa las células estimuladas in vitro con el péptido F19-7. En Ia figura cuando existe diferencia estadística significativa entre los niveles de las citocinas producidos por las células estimuladas con el péptido con respecto a las células no estimuladas, se Ie asigna una letra diferente en las barras que corresponde a los niveles de Ia citocina en cuestión. Como se observa en Ia Figura 8, en los pacientes representados como P19 y P21, los niveles de TNFα disminuyen significativamente frente a los péptidos F19-6 y F19-7 en comparación con las células que no se enfrentaron a los péptidos, aunque en el paciente P19 Ia disminución en los niveles de esta citocina es más significativo con el péptido F19-7. En el paciente representado como P13, los niveles de TNFα aumentan frente al péptido F19-6, sin embargo los niveles de esta citocina disminuyen significativamente, cuando las células mononucleares de este paciente se enfrentan al péptido F19-7. Estos resultados evidencian que el péptido F19-7, aunque fue diseñado para ser presentado por Ia molécula MHC de rata, pueden disminuir los niveles de esta citocina, responsable en gran medida del proceso inflamatorio característico de Ia AR, por Io que este péptido representa un candidato terapéutico potencial para el tratamiento de esta enfermedad.
Ejemplo 16: Medición de citocinas en pacientes con AR frente a los péptidos E18-12 y E18-3. Utilizando sangre de pacientes con AR se realizaron ensayos de medición de las citocinas: TNFα, IFNγ e IL-10. En estos ensayos se evaluaron Ia potencialidad de los péptidos de Ia HspβOh para aumentar o disminuir las diferentes citocinas involucradas en Ia patogénesis de Ia enfermedad. Se partió de 10 mL de sangre de cada paciente, que se diluyo Vi en PBS 1X. Se añadieron 5 mL de esta dilución a 3 mLde Ficoll-Paque (Amershan) en tubos de centrifugación de 15 mL, los cuales se centrifugaron durante 30 min. a 1200 rpm. Se extrajo el anillo correspondiente a las células mononucleares. Posteriormente las células se lavaron dos veces con 15 mL de PBS 1X y después de cada lavado se centrifugaron a 900 rpm. Finalmente el precipitado fue resuspendido en medio RPMI 1640 conteniendo 10% de suero fetal bovino y suplementado con penicilina (100U/mL), estreptomicina (100 μg/mL), HEPES 25 mM/L y L-glutamina 2mM (todos adquiridos de Gibco BRL). Las células mononucleares obtenidas se sembraron en número de 106 células /pocilio en placas de 24 pocilios (Costar) en un volumen de 800 μL. Posteriormente se añadieron los péptidos de Ia HspβOh en un rango de concentración desde 0.5 μg/mL hasta 100 μg/mL, precisándose para cada péptido Ia concentración óptima para modular los niveles de citocinas. La Fitohemaglutinina (PHA) al 1% fue usada como control positivo de estimulación celular, mientras que el RPMI 1640 solo fue empleado como control del crecimiento celular basal.
Las células fueron cultivadas durante 24 horas y posteriormente se tomo el sobrenadante de cada pocilio, diluido Ví, y se determinó Ia concentración de las citocinas a través los kits específicos para cada una de ellas Quantikine® (R&D Systems) según las recomendaciones de los fabricantes.
En Ia Figura 9, se representan los niveles de TNFα modulados por los péptidos E18- 3 y E18-12 en células mononucleares de pacientes con AR. Los pacientes representados por P4, P5 y P16 expresan Ia molécula DR 0306, los pacientes identificados como P7, P8 y P12 expresan Ia molécula DR 0303, mientras que el paciente P9 presenta un genotipo DR 0506 y el paciente P10 tiene un genotipo DR 0204. En esta figura, Ia letra C" representa las células cultivadas in vitro sin péptidos; mientras que E18-3 corresponden a las células estimuladas in vitro con el péptido E18-3 y E18-12 representa las células estimuladas in vitro con el péptido E18-12. En Ia figura cuando existe diferencia estadística significativa entre los niveles de las citocinas producidos por las células estimuladas con el péptido con respecto a las células no estimuladas, se Ie asigna una letra diferente en las barras que corresponde a los niveles de Ia citocina en cuestión. Como se observa en Ia Figura 9, Ia inducción de Ia síntesis de TNFα en las células mononucleares de los pacientes, estimuladas con los péptidos E18-12 y E18-3 depende de las moléculas HLA tipo Il que expresen estos pacientes. En los pacientes P4, P5 y P6 que presentan un genotipo DR 0306, se observó un aumento estadísticamente significativo en Ia concentración de TNFα en comparación con las células no estimuladas con péptidos.
Este mismo efecto se produce en los pacientes P9 de genotipo DR 0506 y el paciente P10 DR 0204. En los pacientes P7, P8 y P12 los cuales presentan un genotipo DR 0303, no se observó ninguna diferencia en los niveles de TNFα, cuando las células mononucleares de estos son estimuladas con nuestros péptidos. La modulación de los niveles de IL-10 por los péptidos E18-3 y E18-12 se representan en Ia Figura 9, donde Ia letra C representa las células cultivadas in vitro sin péptidos; mientras que E18-3 corresponden a las células estimuladas in vitro con el péptido E18-3 y E18-12 representa las células estimuladas in vitro con el péptido E18-12.
En el caso de Ia IL-10, como se observa en Ia Figura 10, hay una disminución significativa de esta citocina en los pacientes P9 y P10, en el resto de los pacientes no hubo cambios significativos. De estas observaciones podemos inferir que los péptidos E18-12 y E18-3 inducen un fenotipo TH 1 en células mononucleares periféricas.
Una variante terapéutica de los péptidos originales: E18-12 o E18-3 pudiera ser Ia administración de estos por vía oral, de forma tal que indujeran mecanismos de tolerización antigénica, que contribuyeran significativamente a Ia disminución de Ia inflamación.
Ejemplo 17: Medición de citocinas en pacientes con AR frente a los péptidos derivados tipo APL.
A partir de los resultados anteriores nos propusimos modificar estos péptidos correspondientes a epitopes originales de célula T, a través de herramientas de Bioinformática, en los sitios de contacto con Ia molécula HLA, de forma tal que estos péptidos modificados de tipo APL fueran capaces de cambiar el patrón de citocinas a fenotipo regulador. Utilizando sangre de pacientes con AR se realizaron ensayos de medición de las citocinas: TNFα e IL-10. En estos ensayos se evaluó Ia potencialidad de los péptidos derivados tipo APL de Ia HspβOh, de aumentar o disminuir las diferentes citocinas involucradas en Ia patogénesis de Ia enfermedad. Los péptidos APL evaluados en estos ensayos fueron los siguientes:
MGPKGRTVIILQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 5)
MGPKGRTVIIMQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 6)
MGPKGRTVIIAQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 7)
MGPKGRTVIIEQSLGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 8) MGPKGRTVIIEQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 9)
MGPKGRTVIILQSLGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 10)
MGPKGRTVIILQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 11)
MGPKLRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 12)
MGPKLRTVIILQSMGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 13) SIDLKDKLKNIGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 14)
SIDLKDKYKNIGAKLSQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 15)
SIDLKDKLKNIGAKLSQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 16)
SIDLKDKYKNAGAKLVQDVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 17)
SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 18) SIDLKDKYKNIGAKLVQAVANNTNEEA (SEQ. ID. NO: 19)
SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNANEEA (SEQ. ID. NO: 20)
SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNANEEA (SEQ. ID. NO: 21)
Se partió de 10 mL de sangre de cada paciente, que se diluyó 34 en PBS 1X. Se añadieron 5 mL de esta dilución a 3 mL de Ficoll-Paque (Amershan) en tubos de centrifugación de 15 mL, los cuales se centrifugaron durante 30 min a 1200 rpm. Se extrajo el anillo correspondiente a las células mononucleares. Posteriormente las células se lavaron dos veces con 15 mL de PBS 1X y después de cada lavado se centrifugaron a 900 rpm. Finalmente el precipitado fue resuspendido en medio RPMI
1640 conteniendo 10% de suero fetal bovino y suplementado con penicilina (100U/mL), estreptomicina (100μg/mL), HEPES 25 mM/L y L-glutamina 2mM (todos adquiridos de Gibco BRL).
Las células mononucleares obtenidas se sembraron en número de 106 células/pocilio en placas de 24 pocilios (Costar) en un volumen de 800 μL. Las células se estimularon con los péptidos [E18-3, E18-12, E18-3APL1 (SEQ. ID. NO: 18), E18-3APL2 (SEQ. ID. NO: 21), E18-12APL1 (SEQ. ID. NO: 5), E18-12APL3 (SEQ. ID. NO: 12)], a una concentración de 40 μg/mL y por triplicado. El RPMI 1640 solo fue empleado como control del crecimiento celular basal. Las células fueron cultivadas durante 24 horas y posteriormente se tomó el sobrenadante de cada pocilio, diluido ΛA y se determinó Ia concentración de las citocinas a través de los kits específicos para cada una de ellas Quantikine® (R&D Systems) según las recomendaciones de los fabricantes.
En Ia figura 11 se muestran los niveles de IL-10 inducido por los péptidos originales (E18-12 y E18-3) y el panel de péptidos tipo APLs: E18-3APL1 (SEQ. ID. NO: 18); E18-3APL2 (SEQ. ID. NO: 21); E18-12APL1 (SEQ. ID. NO: 5); E18-12APL3 (SEQ. ID. NO: 12). En esta figura, las letras indican diferencias estadísticamente significativas (solo se refiere Ia significación estadística entre los diferentes péptidos y las células control de cada paciente individualmente). Además, las células de los pacientes P4 y P6 no se estimularon con los péptidos E18-3APL2 y E18-12APL3. Resulta evidente que, en todos los pacientes, el péptido E18-3APL1 incrementa muy significativamente los niveles de IL-10 con respecto a las células no estimuladas. El incremento inducido por este péptido en algunos de los pacientes, como P2 y P4, fue de hasta 9 veces Ia cantidad producida por las células sin estimular y en pacientes como P1, P3 y P5 de hasta 5 veces superior. También con el E18- 12APL1 se obtuvieron de forma general similares resultados, evidenciándose un incremento significativo en los niveles de IL-10 en los pacientes P1 , P4 y P6. Por otro lado ni los péptidos originales ni los péptidos E18-3APL2 y E18-12APL3 indujeron un incremento en los niveles de IL-10 en comparación con las células que representan el control negativo. En Ia figura 12, se representan los niveles de TNFα inducido por los diferentes péptidos en el mismo grupo de pacientes. En esta figura, las letras indican diferencias estadísticamente significativas (solo se refiere Ia significación estadística entre los diferentes péptidos y las células control de cada paciente individualmente). Además, las células de los pacientes P4 y P6 no se estimularon con los péptidos E18-3APL2 y E18-12APL3. Como puede apreciarse, todos los pacientes no responden con Ia misma intensidad al estímulo con los diferentes péptidos, aunque se debe destacar que Ia respuesta fue bastante homogénea. Por otra parte el péptido que más incrementó Ia producción de TNFα fue el E18-12APL1, sobre todo en los pacientes P4 y P5, mientras que en los pacientes P1, P2 y P3 mostró un ligero aumento con respecto al control negativo. También el péptido E18-3APL1 tuvo un comportamiento similar en Ia mayoría de los pacientes. En el caso del péptido E18-3APL1 las células de los pacientes P2, P4 y P5, fueron en las que más se evidenció el aumento de los niveles de TNFα, aunque su incremento fue menos marcado. En este ensayo con los péptidos originales se obtuvieron similares resultados que en evaluaciones anteriores. Los resultados anteriores indican que ningún péptido ni sus APL inducen una disminución en Ia expresión del TNFα en las células mononucleares de los pacientes. Estos resultados podrían resultar contradictorios, puesto que los mismos APLs que aumentan Ia producción de IL-10 promueven un incremento en los niveles de TNFα. En Ia figura 13 se muestra Ia relación de los niveles de IL-10 y TNFα inducidos por los péptidos y sus APLs. En esta figura, las letras indican diferencias estadísticamente significativas (solo se refiere Ia significación estadística entre los diferentes péptidos y las células control de cada paciente individualmente). Además, las células de los pacientes P4 y P6 no se estimularon con los péptidos E18-3APL2 y E18-12APL3. Resulta evidente el hecho de que fue considerablemente superior el incremento de Ia IL-10 con respecto al del TNFα, pues en cuatro de los seis pacientes, las células estimuladas con el E18-3APL1 mostraron un índice mayor que 1 , Io que indica que los niveles de IL-10 sobrepasaron a los de TNFα. Además, en todos los pacientes los niveles de IL-10 fueron considerablemente superiores en las células estimuladas con el péptido E18-3APL1 con respecto a las células que constituían el control negativo, mostrando diferencias estadísticamente significativas. En el caso del E18-12APL1 las diferencias en comparación al control negativo no resultaron tan notables. De manera que se puede asegurar que si bien el E18-3APL1 incrementa los niveles de TNFα, el efecto neto predominante es el incremento en los niveles de IL-10, Io que se traduce en una polarización de Ia respuesta a favor de las citocinas inmunosupresoras.
Los resultados del estudio son extremadamente promisorios, pues apuntan al hecho de que estos dos APL al ser administrados a los pacientes podrían inducir una subpoblación de células T reguladoras secretoras de IL-10, que medien una supresión activa a nivel sistémico. Otra conclusión parcial a Ia que podemos arribar mediante el análisis de estos resultados, es que estos APL presentan un comportamiento prácticamente homogéneo en todos los pacientes estudiados, independientemente del genotipo que posean. Lo expuesto anteriormente es 00008
sumamente alentador, pues permitiría que Ia administración de estos APL tuviera el mismo efecto en todos los pacientes, a pesar de las diferencias existentes con respecto al tipo de moléculas HLA-II que posean.
A partir de nuestros resultados experimentales, Ia presente invención tiene como ventaja fundamental el uso de preparaciones farmacéuticas conteniendo péptidos inmunomoduladores de Ia proteína de estrés Hsp60 humana, correspondientes a epitopes de células T o variantes tipo APL de estos péptidos, que pueden ser utilizados eficazmente en el tratamiento de pacientes con AR, induciendo una respuesta inmune especifica dirigida a silenciar los clones de células T autoreactivos involucrados en los mecanismos inmunopatogénicos de esta enfermedad.
El tratamiento que proponemos en esta invención es asequible y puede extenderse a un gran número de pacientes y además puede ser empleado en combinación con las terapias actuales para esta enfermedad.
Ejemplo 18: Evaluación del efecto terapéutico de los péptidos derivados tipo APL, en un modelo animal donde Ia artritis se induce con Mí.
Los animales fueron separados en doce grupos de ocho ratas cada uno. La enfermedad se indujo en once grupos de animales (Grupo I- Grupo Xl), de los cuales diez fueron tratados con los péptidos y uno quedó como control de Ia inducción de Ia enfermedad. A los grupos de animales que fueron tratados con los péptidos, se les administró 50 μg de péptido por rata en un volumen de 100 μL de PBS, los días 12, 14, 16,18, 20, 22, 24 y 26 después de inducida Ia enfermedad con Mt Los animales separados en doce grupos fueron tratados de Ia siguiente forma: > grupo I: se Ie administró el péptido E18-12 (SEQ. ID. NO: 1)
> grupo II: se Ie administró el péptido correspondiente a: SEQ. ID. NO: 5
> grupo III: se Ie administró el péptido correspondiente a: SEQ. ID. NO: 8
> grupo IV: se Ie administró el péptido correspondiente a: SEQ. ID. NO: 12
> grupo V: se Ie administró el péptido correspondiente a: SEQ. ID. NO: 13 > grupo Vl: se Ie administró el péptido E18-3 (SEQ. ID. NO: 2)
> grupo VII: se Ie administró el péptido correspondiente a: SEQ. ID. NO: 14
> grupo VIH: se Ie administró el péptido correspondiente a: SEQ. ID. NO: 15
> grupo IX: se Ie administró el péptido correspondiente a: SEQ. ID. NO: 16
> grupo X: se Ie administró el péptido correspondiente a: SEQ. ID. NO: 17 > grupo XI: no se Ie administró péptido (control de Ia inducción de Ia enfermedad)
> grupo XII: no se Ie indujo Ia enfermedad ni se Ie administró péptido (control negativo).
Los días 21 y 35 después de Ia inducción se sacrificaron varios animales por grupo, se les extrajo el bazo y se les tomó muestra de las articulaciones para el análisis histopatológico.
En los grupos de animales tratados con los péptidos derivados tipo APL, fue significativa una mejoría clínica en comparación con el grupo de animales no tratados y con los grupos tratados con los péptidos E18-12 y E18-3. Estos resultados fueron corroborados por los análisis histopatológicos y medición de citocinas, evidenciándose en todos los casos una superioridad de los péptidos derivados tipo APL sobre los péptidos originales.
En Ia figura 14 se muestra el gráfico de evolución de Ia enfermedad en cuatro grupo de animales pertenecientes a este biomodelo. En este caso los grupos que se muestran son: grupo I (animales tratados con el E18-12), grupo Il (animales tratados con el E18-12APL1, SEQ. ID. NO: 5), grupo Xl (control de Ia inducción de Ia enfermedad) y grupo XII (animales sanos). En este gráfico, letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.001) (se refiere a Ia significación estadística entre todos los grupos en los días específicos de medición). Como se puede apreciar en este gráfico, a partir del día 12 después de inducida Ia enfermedad los animales de los grupos I, Il y Xl comenzaron a manifestar los signos clínicos propios de Ia AR. Muchos animales presentaron también manifestaciones extra-articulares como nodulos en las orejas, en Ia cola y en las extremidades. Las manifestaciones más severas de Ia AR se apreciaron alrededor del día 20 para los tres grupos de animales enfermos. En el caso de los animales tratados con el E18-12, en el día 21 no se pudieron apreciar diferencias significativas con respecto al grupo control de Ia inducción de Ia enfermedad. Sin embargo, alrededor del día 35 después de haber inducido Ia enfermedad los signos clínicos en los animales de este grupo fueron significativamente inferiores a los del grupo Xl (p<0.001). Estos resultados indican que el efecto protector del péptido E18-12 se pone de manifiesto alrededor del día 35. En este sentido, sería recomendable administrar el péptido en estadios más tempranos de Ia enfermedad para mejorar los resultados en el día 21. Sin embargo, en el caso de los animales del grupo Il los signos clínicos de inflamación fueron evidentemente menores en comparación con los de los grupos I y XI (p<0.001), Io cual indica que este péptido ejerce un potente efecto protector en los animales donde se indujo Ia enfermedad.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Péptidos de Ia proteína humana de estrés térmico de 60 kDa que constituyen epitopes para células T, para inducir mecanismos de tolerancia periférica, en particular mecanismos inductores de anergia o mediados por clones de células T regulatorias en pacientes con AR caracterizados porque presentan las secuencias:
E18-12 MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK (SEQ. ID. NO: 1)
E18-3 SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG (SEQ. ID. NO: 2) F19-6 11 DPTKWRTALLDAA (SEQ. ID. NO: 3)
2. Péptidos de acuerdo a Ia reivindicación 1 , los cuales se caracterizan por ser péptidos derivados tipo APL del péptido E18-12 (SEQ. ID. NO: 1), modificados en los sitios de contacto con Ia molécula MHC humana, donde Ia secuencia de amino ácidos:
MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK
1 2 34 56 7 se sustituye en Ia posición 1 por: A1F1I, L1M1V1W, ó Y posición 2 por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W, ó Y posición 3 por: A,K,V,R,T,I,P,L,N,S,G,Y, ó M posición 4 por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 5 por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V, ó Y posición 6 por: A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1P1Q1R1S1T1V1W, ó Y posición 7 por: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, ó Y
3. Péptidos derivados tipo APL de acuerdo a Ia reivindicación 2, los cuales tienen una secuencia aminoacidica seleccionada del grupo que consiste de SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 8, SEQ. ID. NO: 9, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11 , SEQ. ID. NO: 12 y SEQ. ID. NO: 13.
4. Péptidos de acuerdo a Ia reivindicación 1 , los cuales se caracterizan por ser péptidos derivados tipo APL del péptido E18-3 (SEQ. ID. NO: 2), modificados en los sitios de contacto con Ia molécula MHC humana, donde Ia secuencia de amino ácidos:
SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA
1 2 3 4 5 6 7 8 se sustituye en Ia posición 1 por L1I1V1M1Y1W1F, ó A posición 2 por A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 3 por A1F1I1K1L1M1P1R7S1T1V1W, ó Y posición 4 por L1I1V1M1Y1W1F1 ó A posición 5 por A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 6 por A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y posición 7 por A1F1I1K1L1M1P1R1S1T1V1W1 ó Y posición 8 por A1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1Q1R1S1T1V1W1 ó Y
5. Péptidos derivados tipo APL de acuerdo a Ia reivindicación 4, los cuales tienen una secuencia aminoacidica seleccionada del grupo que consiste de SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 19, SEQ. ID. NO: 20 y SEQ. ID. NO: 21.
6. Péptido de acuerdo a Ia reivindicación 1, el cual se caracteriza por ser un peptido derivado tipo APL del péptido F19-6 (SEQ. ID. NO: 3), modificado en los sitios de contacto con Ia molécula MHC de rata, donde Ia secuencia de amino ácidos:
IIDPTKWRTALLDAA (F19-6) 1 2 posición 1 se sustituye por H. posición 2 se sustituye por E. dando origen al péptido F19-7: (SEQ. ID. NO: 4).
7. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende uno o más de los péptidos de las reivindicaciones de Ia 1 a Ia 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable o excipiente.
8. Composición farmacéutica de acuerdo a Ia reivindicación 7 caracterizada porque se emplea para el tratamiento de Ia AR.
9. Un método de tratamiento de Ia AR, el cual comprende Ia administración a un paciente de cantidades efectivas de los péptidos de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones de Ia 1 a Ia 6 o una composición farmacéutica de acuerdo a Ia reivindicación 7.
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