WO2006035831A1 - Ｌ－アルギニン、ｌ－オルニチンまたはｌ－シトルリンの製造法 - Google Patents

Ｌ－アルギニン、ｌ－オルニチンまたはｌ－シトルリンの製造法 Download PDF

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WO2006035831A1
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Masato Ikeda
Tetsuo Nakano
Satoshi Mitsuhashi
Mikiro Hayashi
Kenji Tanaka
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KH Neochem Co Ltd
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02008—Acetylglutamate kinase (2.7.2.8)

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing L-arginine, L-orthine or L-citrulline.
  • L-arginine is synthesized from L-glutamic acid through an eight-step reaction.
  • L-Orthine and L-citrulline are intermediates in the L-arginine biosynthetic pathway.
  • the biosynthesis of L-arginine, L-orthine and L-citrulline is regulated in the same way as other amino acids.
  • arginine 'repressor causes transcription of an operon (hereinafter abbreviated as arginine' operon) composed of a gene that encodes an enzyme involved in L-arginine biosynthesis. It is suppressed (see Patent Document 1).
  • arginine' operon an operon composed of a gene that encodes an enzyme involved in L-arginine biosynthesis. It is suppressed (see Patent Document 1).
  • N-acetyl glutamate kinase EC: 2.7.2.8, hereinafter referred to as ArgB
  • ArgB N-acetyl glutamate kinase
  • L-arginine, L-orthine or L-citrulline is also produced using microorganisms in the same manner as other amino acids.
  • research is being conducted to improve the productivity of these amino acids using methods such as mutation and DNA recombination.
  • Corynebata teratumumum with a DNA fragment containing a gene involved in arginine biosynthesis, and further carrying out mutation treatment, Corynebataterum dalatumumum K65 (FERM BP-1115) is reported to have been acquired (see Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 1 Corvnebacterium elutamicum
  • inhibition of arginine biosynthesis enzymes has been lifted, and feedback inhibition by L-arginine has been desensitized
  • Corynebataterium dartamicam see Non-Patent Document 3 having increased membrane permeability of L-arginine has been obtained using a mutation method.
  • Patent Document 1 JP 2002-51790 A
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 63-79597
  • Non-patent literature 1 Agricultural Biological Chemistry, 1979, 43rd, p.105-111
  • Non-patent literature 2 Journal of Bacteriology, 1966, 91st, p.617
  • Non-Patent Document 3 Agricultural Biological Chemistry, 1972, Vol. 36, p.1675-1684 Disclosure of Invention
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing L-arginine, L-orthine or L-citrulline.
  • the present invention relates to the following (1) to (18).
  • N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence in which one or more amino acids in the 20th to 38th amino acid sequences are substituted, or
  • N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is also replaced with one or more amino acids in the 20th to 38th amino acid sequences, and in the 1st to 19th or 39th to 294th amino acid sequences.
  • An amino acid sequence in which one or more amino acids of are deleted, substituted or added is also replaced with one or more amino acids in the 20th to 38th amino acid sequences, and in the 1st to 19th or 39th to 294th amino acid sequences.
  • N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is also substituted with one or more amino acids in the 26th to 31st amino acid sequences, and the 1st to 25th or 32nd to 294th amino acids Amino acid sequence in which one or more amino acids in the sequence have been deleted, substituted or added
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence other than the 31st amino acid have been deleted, substituted or added, or
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 has an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence other than the 26th and 31st amino acids have been deleted, substituted or added, and N— Polypeptides having acetyl glutamate kinase activity.
  • DNA encoding a polypeptide in which the amino acid residue corresponding to the 26th amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid other than L-alanine (i) DNA encoding a polypeptide in which the amino acid residue corresponding to the 31st amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid other than L-methionine, or
  • amino acid residue corresponding to the 26th amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid other than L-alanine, and the amino acid corresponding to the 31st amino acid residue DNA encoding a polypeptide whose residues are amino acids other than L-methionine
  • amino acid residue corresponding to the 26th amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is L-parin, L leucine or L-isoleucine, and the 31st amino acid
  • the DNA of (7) above, wherein the amino acid residue corresponding to the residue is L-no-phosphorus.
  • nucleotide sequence in which the region corresponding to the 76th to 78th region from the 5 ′ end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is guanine thymidine thymidine, cytosine thymidine-guanine, or adenine thymidine cytosine; Having DNA,
  • the region corresponding to the 76th to 78th region from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is guanine thymidine thymidine, cytosine thymidine-guanine, or adenine-thymidine-cytosine; DNA having a nucleotide sequence in which the region corresponding to the 91st to 93rd region is guanthymidine guanine
  • microorganism according to any one of (11) to (15) above, wherein the microorganism belongs to the genus Corynepacteria.
  • the microorganism of any one of the above (11) to (17) is cultured in a medium, and L-arginine, L-orthine or L citrulline is produced and accumulated in the culture.
  • a method for producing L-arginine, L-orthine or L-citrulline which comprises collecting arginine, L-ortin and L-citrulline.
  • the present invention can provide an efficient method for producing L-arginine, L-ortin, or L-citrulline.
  • polypeptide of the present invention also has the N-terminal strength of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted in the 20th to 38th amino acid sequences and having N-acetylglutamate kinase activity (hereinafter referred to as ArgB activity) can be mentioned. .
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the ArgB amino acid sequence of Corynebacterium dartamicam ATCC13032 strain and is encoded by DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is registered as NCgll342 in DDBJ / GenBank / EMBL!
  • the region consisting of the 20th to 38th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the ArgB amino acid sequence and three-dimensional structure [Escherichia coli] [St ructure, 10, 329-342, (2002)] and the homology between the amino acid sequence and the ArgB amino acid sequence of Corynebacterium glutamicum, this region is presumed to form an ex helix.
  • the site at which an amino acid is substituted may be any site as long as it is in the 20th to 38th amino acid sequences of the N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the 31st part is preferred.
  • the number of amino acids to be substituted is particularly determined if the polypeptide having the amino acid sequence after substitution has ArgB activity, and preferably has reduced ArgB activity or reduced feedback inhibition by L-arginine. Although not limited, it is preferably 1 to: L0, more preferably 1 to 5, and further preferably 1 or 2.
  • the fact that the polypeptide has ArgB activity that is reduced or eliminated feedback inhibition by L-arginine indicates that the ArgB activity in the presence of L-arginine has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It can be confirmed that the polypeptide has a higher activity than ArgB in the presence of L-arginine.
  • the concentration of L arginine is preferably 5 mmol / l or more, more preferably 10 mmol / l or more.
  • the ArgB activity of a polypeptide is, for example, by converting pyruvic acid generated by reaction with phosphoenolpyruvate-pyruvate kinase system using ATP and N-acetyl-L-glutamic acid as a substrate as 2,4-dinitrophenol hydrazone. Colorimetric method [Meth. EnzymoL, 17, 251-255 (1970)], ATP and N-acetyl-L-glutamic acid are reacted with hydroxylamine, and the resulting acetyl-glutamic acid 5-phosphate is determined as hydroxamic acid. It can be measured by a method such as a measuring method [Meth. EnzymoL, 17, 269-272 (1970)].
  • the amino acid to be substituted is particularly limited if the polypeptide having the amino acid sequence after substitution has ArgB activity, and preferably has ArgB activity reduced or canceled by feedback inhibition by L-arginine. It does not matter whether it is a natural type or a non-natural type.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-parin, L-cystine, etc.
  • amino acids that can be substituted with each other are shown below. Amino acids contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A Leucine, Isoleucine, Norleucine, Norin, Norpaline, Alanine, 2-Aminobutanoic acid, Methionine, 0-Methylserine, t-Butylglycine, t-Butylalanine, Cyclohexinolealanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-dianaminobutanoic acid, 2,3-dianaminopropionic acid
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • the N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is either the 26th or 31st amino acid sequence, or is an amino acid sequence in which both amino acids are substituted. And a polypeptide having ArgB activity.
  • one or more amino acids may be deleted, substituted or added to the amino acid sequence other than the substituted site as long as it has ArgB activity.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5.
  • the amino acid to be substituted is the same as the amino acid that can be substituted in the 20th to 38th amino acid sequence from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Deletion, substitution or attachment is a deletion, substitution or substitution of one or more amino acids in the same sequence. Means addition, and deletion, substitution or addition may occur simultaneously.
  • polypeptide of the present invention has at least 60% or more, usually 80% or more, particularly 95% or more homology with the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. And prefer to be.
  • the homology of amino acid sequences and nucleotide sequences is determined by the algorithm BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] by Karlin and Altschul, FASTA [Methods EnzymoL, 183, 63 (1990)].
  • BLAST Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)
  • FASTA Method of Altschul
  • programs called BLASTN and BLASTX have been developed [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] o
  • a more specific example of the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention is represented by SEQ ID NO: 3 substituted with the 26th alanine force parin from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • N-terminal force of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is also represented by SEQ ID NO: 11 in which the 26th alanine and 31st methionine are each replaced by parin. Amino acid sequences and the like.
  • Examples of the DNA of the present invention include DNA encoding the polypeptide of the present invention, and specific examples include polypeptides having the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, and 11. Examples thereof include DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, and 12, respectively.
  • the DNA of the present invention is hybridized under stringent conditions with a DNA having a base sequence complementary to the base sequence of the DNA encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. ,And
  • amino acid residue corresponding to the 26th amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid other than L-alanine, and the amino acid corresponding to the 31st amino acid residue DNA encoding a polypeptide whose residue is an amino acid other than L-methionine,
  • amino acid residue corresponding to the 26th amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is L-parin, L leucine or L-isoleucine, and the 31st amino acid residue DNA encoding a polypeptide whose amino acid residue corresponding to the group is L-noline,
  • nucleotide sequence in which the region corresponding to the 76th to 78th region from the 5 ′ end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is guanine thymidine thymidine, cytosine thymidine-guanine, or adenine thymidine-cytosine; Having DNA,
  • (ix) corresponds to the 76th to 78th region from the 5 'end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 DNA having a base sequence in which the region is guanine thymidine thymidine, cytosine thymidine-guanine, or adenine-thymidine-cytosine, and the region corresponding to the 91st to 93rd regions is guanine thymidine guanine.
  • the DNA capable of hybridizing under stringent conditions is a base sequence of DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 or 11, more preferably Using a part or all of the DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12 as a probe, a single-hybridization method, plaque ′ This means DNA obtained by using the hybridization method or Southern hybridization method.
  • noisy Hybridization is a Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition,
  • DNA Cloning DNA having at least 75% homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12 when calculated using the above BLAST, FASTA, etc.
  • a DNA having a homology of 80% or more is preferable, and a DNA having a homology of 95% or more is more preferable.
  • the microorganism of the present invention may be any microorganism having the DNA of the present invention.
  • Strength The transcriptional repressing activity of the arginine 'operon of the arginine' repressor (ArgR) is reduced. Or prefer to be a lost microorganism.
  • the type of the microorganism of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include coryneform bacteria.
  • Coryneform bacteria include the genus Corvnebacterium and Brevibaterium.
  • microorganisms belonging to the genus (Brevibacterium) or the genus Microbacterium.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Corynebaterum include Corvnebactenum glutamicum, Coryneno-quarium-// Cet-Dun-Fifum (Orvnebactenum acetoacidophilum), Coryneno-cteratum acetoglu tamicum), Corvnebacterium callunae, Corvnebacterium herculis J, Corvnebacterium herculis J, Corvnebacterium lilium, Cornenocterium mela Corrosnebacterium thermoaminogenes, etc.
  • Corvnebacterium glutamicum ATCC 14020 (old genus Brevibacterium d ivaricatum), Corvnebacterium glutamicum ATCC13869 (old genus Brevibacterium lacto fermentum) You can give thermoaminogenes ATCC9244.
  • Microorganisms belonging to the genus Brevibateratum include Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium roseum, Can be mentioned, such as Brevibacterium saccharolyticum AT Cl40t, Brevipactenum immariophi lum ATCCl4068, Brevibacterium roseum AT ClClj825, Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240 etc. can be mentioned.
  • microbatterium 'ammonia filam As a microorganism belonging to the genus Microbataterum, microbatterium 'ammonia filam
  • Microbacterium ammoniaphilum and the like, and specifically, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354 and the like can be mentioned.
  • the arginine 'operon transcriptional repression activity of ArgR of the microorganism of the present invention is only required to be lower than that of the parent strain, but it is preferably 50% or less, more preferably 10% or less. It is most preferable that the activity which is more preferably 5% or less is zero, that is, the activity is lost.
  • the parent strain is a microorganism that has the ability to produce L-arginine, L-orthine or L-citrulline, ArgB is feedback-inhibited by L-arginine, and transcription of arginine 'operon is suppressed by ArgR. If it exists, it may be a wild strain, or the wild strain may be a breeding strain artificially bred. Moreover, if it has these properties, the host microorganism used when introducing the DNA of the present invention described below can also be used as a parent strain!
  • a wild strain refers to a microorganism that belongs to the same taxonomic species as the microorganism of the present invention and has the phenotype that appears most frequently in nature.
  • a wild strain can be exemplified by Corynebataterum dartamicam ATCC13032 strain.
  • the microorganism of the present invention is obtained by treating a parent strain with a sudden mutagen such as N-methyl-N'-tro-trosoguanidine, and treating the resulting strain with arginine analog, which is an arginine analog.
  • a sudden mutagen such as N-methyl-N'-tro-trosoguanidine
  • arginine analog which is an arginine analog.
  • the DNA of the present invention is DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: It can be obtained by preparing from a DNA encoding a polypeptide having a high homology with the base sequence represented by No. 2 and having a base sequence and having ArgB activity.
  • the high homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is to have at least 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more.
  • Microbial power having DNA Power that can be obtained by preparation Perceptive Biosystems 8905 type DNA synthesizer can be used for chemical synthesis.
  • microorganisms having these DNAs include microorganisms belonging to the genus Corynebataterium.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Corynebataterum include Corynebataterum 'Dartamicam, Corynebacteracetosidophilum, Corvnebacterium efficiens, Corynecterum crenatum, etc.
  • the power e column [The column is Corvnebacterium glutamicum ATC 13032, orvnebactenum glutamicum K65 (FERM BP-1115), Corvnebacterium acetoacidophilum AT C C ⁇ 3870, Corvnebacterium efficiens JCM 44549 Corvnebacterium glutamicum ATCC13032 having a DNA having a salted salmon sequence represented by 2 is preferably used.
  • a microorganism having a DNA having a base sequence and encoding a polypeptide having ArgB activity is cultured by a known method [for example, Mol. Microbiol, 20, 833 (199 6)].
  • the chromosomal DNA of the microorganism is isolated and purified according to, for example, the method of Saito et al. [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)].
  • the DNA base sequence (base sequence represented by SEQ ID NO: 2) encoding ArgB of Corynebacterium glutamicum registered as NCgll342 in DDBJ / GenBank / EMBL, or the base of the region containing the base sequence
  • a primer is prepared based on the isolated chromosomal DNA, and PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] is performed to prepare a DNA fragment containing DNA encoding ArgB.
  • Examples of the primer include DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 13 to 18 designed based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 30.
  • a clone containing DNA encoding ArgB can also be obtained from the obtained DNA library by the method, plaque hybridization method, Southern hybridization method, or the like.
  • a DNA synthesized based on the base sequence of the DNA examples thereof include DNA fragments obtained by PCR or the like using DNA primers synthesized based on the known DNA base sequence encoding ArgB.
  • DNA primers synthesized based on the known DNA base sequence encoding ArgB For example, PCR using the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the DNA having the base sequence ability represented by SEQ ID NOs: 13 to 18 as a primer and the chromosomal DNA of a microorganism belonging to Corynebata d'artamicam The amplified DNA fragment can be exemplified.
  • DNA fragment containing DNA encoding ArgB obtained by Koguchi-1 'hybridization method, plaque' hybridization method, Southern noble hybridization method, etc. After digestion with an appropriate restriction enzyme or the like, it is incorporated into a vector by a conventional method, and a dideoxy method [ proc . Natl. Acad. Sci] using a commonly used nucleotide sequence analysis method such as ABI377 DNA Sequencer (Perkin Elmer). USA, 74, 5463 (19 77)], the base sequence of the DNA fragment is determined.
  • a primer is prepared, and chromosomal DNA is used as a saddle, and PCR is performed by PCR (PCR Protocols, Academic Press (1990)). DNA fragments having NA can be obtained.
  • the target DNA fragment can also be prepared by chemical synthesis using an 8905 type DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems.
  • Examples of the DNA encoding ArgB obtained as described above include a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 2 DNA encoding a polypeptide having a base sequence and high ArgB activity that is highly homologous to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the DNA of the present invention can be obtained by introducing a site-specific mutation by a method using PCR or the like.
  • DNA of the present invention is incorporated into a vector such as a plasmid vector by a conventional method to prepare the recombinant DNA of the present invention.
  • the vector is not particularly limited as long as it is a vector that can be introduced into a microorganism into which the DNA of the present invention (hereinafter referred to as a host microorganism) is introduced.
  • a host microorganism a vector that can be introduced into a microorganism into which the DNA of the present invention
  • pHSG299 Gene, 61, 63-74 (1987)
  • pBTrp2 pBTacl
  • pBTac2 all manufactured by Boehringer Mannheim
  • pHelixl manufactured by Roche's Diagno Status
  • pKK233-2 manufactured by Amersham's Pharmacia 'Biotech
  • pSE280 manufactured by Invitrogen
  • pGEMEX- ⁇ Promega
  • p QE-8 Qiagen
  • pET-3 Novagen
  • pKYPIO JP 58-110600
  • pK ⁇ 200 Agric.
  • the recombinant DNA of the present invention is transformed into the host microorganism. This is preferable because it can be integrated into a chromosome.
  • the host microorganism As the host microorganism, the microorganisms listed above can be used.
  • the vector that cannot replicate autonomously in the host microorganism is not particularly limited. However, if the vector has a gene involved in resistance to antibiotics, the recombinant DNA of the present invention is placed on the chromosome of the host microorganism by homologous recombination. Since it is easy to select an integrated microorganism, it is preferable to use a vector having a DNA ( ⁇ S) encoding a lepanschlase (EC: 2.4.1.10) derived from Bacillus subtilis.
  • the DNA encoding ArgB originally present on the chromosome of the host microorganism is preferable because a microorganism in which the DNA of the present invention is substituted can be easily selected.
  • An example of such a vector is the plasmid PESB30 shown in Example 1.
  • the recombinant DNA of the present invention is introduced into a host microorganism.
  • the introduction of a mutation that reduces or eliminates the ArgR activity of the microorganism of the present invention may be performed before the introduction of the DNA of the present invention into the host microorganism, or the DNA of the present invention is introduced into the host microorganism. You can do it later.
  • DNA selected from ArgR can be obtained by selecting from microorganisms with improved L-arginine productivity. Further, it may be obtained by performing base substitution, deletion or addition.
  • the site for base substitution, deletion, addition or the like is not limited as long as it is a site that can reduce or lose the activity of ArgR, but it is not limited in the binding region of L arginine to ArgR or A region including a binding region is preferable because the activity can be efficiently reduced or lost.
  • binding region of L-anoreginin examples include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19, which is the nucleotide sequence of DNA encoding ArgR of Corynebataterum dartamicam ATCC 13032 The 45th to 240th regions can be raised. Also in DNA encoding ArgR of other microorganisms, the L-argin binding region is in or near the region corresponding to the region.
  • the number of bases to be substituted, deleted or added is not limited as long as it is a number that can reduce or lose the activity of ArgR!
  • any method can be used as long as the recombinant DNA of the present invention can be introduced into the host microorganism.
  • electroporation method Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541 (1999)
  • protoplast method J. BacterioL, 159, 306 (1984)
  • the like can be mentioned.
  • the introduction of the DNA of the present invention into a host microorganism by the above-described method introduces the DNA of the present invention into the growth rate in a medium containing arginino and idroxamate. Is compared between the microorganism and the host microorganism, and the growth rate of the microorganism can be confirmed by the improvement in comparison with the host microorganism. It is also possible to prepare a plasmid or chromosome from the microorganism by a conventional method and check the nucleotide sequence for confirmation.
  • the decrease or loss of ArgR activity of the microorganism indicates that the expression of arginine 'operon in the microorganism and the host microorganism is expressed by the Northern Hybridization Method (Molecular 1 Cloning 3rd Edition). ) Etc. to confirm.
  • the probe used in the Northern hybridization method include DNA having part or all of the base sequence of the gene constituting the arginine 'operon.
  • the DNA library described above is used to select DNA encoding ArgB. V, DNA that can be raised.
  • the microorganism of the present invention may be any microorganism as long as it has the DNA of the present invention and ArgR activity is reduced or lost, but the microorganism of the present invention is used for the production of L-ornitine.
  • the activity of or-tin rubamoyltransferase (EC: 2.1.3.3, hereinafter referred to as ArgF)
  • ArgF an enzyme on the biosynthetic pathway of L-arginine
  • Strains whose ArgF activity is reduced or lost compared to the parent strain can be obtained by abrupt mutagenesis, as in the case of introducing mutations into ArgB and ArgR, and site mutations are introduced into ArgB and ArgR. It may be obtained by performing substitution, deletion or addition of a base on DNA encoding ArgF using a method similar to the above method.
  • the DNA encoding ArgF is known, and for example, the base sequence information described in DDBJ / GenBank / EMBL can be used.
  • Examples of the DNA encoding ArgF include a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 31.
  • ArgG arginyl-succinate synthase
  • V, U is preferably a microorganism whose activity is reduced or lost compared to the parent strain.
  • Strains with reduced or lost ArgG activity compared to the parent strain may be obtained by mutation treatment, as in the case of introducing mutations into ArgB and ArgR, or by introducing site mutations into ArgB and ArgR.
  • a similar method may be used to obtain ArgG-encoding DNA by base substitution, deletion or addition.
  • the DNA encoding ArgG is known, and for example, the base sequence information described in DDBJ / GenBank / EMBL can be used. Examples of DNA encoding ArgG include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 32.
  • the method of cultivating the microorganism of the present invention in a medium may be a normal method used for culturing microorganisms! /, Or may be a deviation method! /.
  • any of a natural medium and a synthetic medium may be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the microorganism of the present invention. Also good.
  • glucose, fructose, sucrose, maltose, molasses containing them, starch or carbohydrates such as starch hydrolyzate, acetic acid, lactic acid, succinic acid are acceptable as long as the microorganism of the present invention can assimilate.
  • Organic acids such as ethanol, alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium carbonate, and other ammonium or organic acid salts. Nitrogen compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, and digested products thereof can be used.
  • potassium dihydrogen phosphate dipotassium hydrogen phosphate
  • magnesium phosphate magnesium sulfate
  • sodium chloride salt ferrous sulfate
  • manganese sulfate copper sulfate, calcium carbonate, etc.
  • trace nutrient sources such as piotin, thiamine, nicotinamide, and nicotinic acid can be provided as necessary. These micronutrient sources can be substituted with meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid and the like.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture and deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 20 to 42 ° C, more preferably 30 to 40 ° C.
  • the pH of the medium is preferably in the range of 5 to 9 and is maintained near neutral.
  • the pH of the medium is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkali solution, urea, calcium carbonate, ammonia, a pH buffer solution, or the like.
  • an inducer suitable for the promoter is used as a medium if necessary. You may add it.
  • recombinant DNA recombination with a promoter
  • isopropyl mono- ⁇ -D thiogalatatopyranoside or the like can be added to the medium.
  • indole acrylic acid or the like is added to the medium. You can add it.
  • the culture period is usually 1 to 6 days, and L-arginine, L-orthine or L-citrulline is produced and accumulates in the culture.
  • the precipitates such as the cells of the culture are removed, and the L arginine accumulated in the culture is obtained by using a known method such as activated carbon treatment or ion exchange resin treatment.
  • L-ortin or L-citrulline can be recovered.
  • the resultant was treated with pESB303 ⁇ 4-BamHI (Takara Shuzo), subjected to agarose gel electrophoresis, and extracted and purified using GENECLE AN Kit (BIO 101). Both ends of the obtained DNA fragment were blunted using a DNA branding kit (DNA Blunting Kit, manufactured by Takara Shuzo) according to the attached protocol.
  • the blunted DNA fragment was treated with phenol 'Kuroguchi form, subjected to ethanol precipitation and concentrated, then reacted in the presence of Taq polymerase (Roche Diagnosis) and dTTP at 70 ° C for 2 hours, Plasmid PESB30-T was prepared by adding one base of thymine to the 3 ′ end.
  • the 451 to 1332 base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 30 is a region encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which is ArgB of Corynebacterium dartamicum. It is.
  • the base sequence of this region is shown as SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 obtained by replacing the 77th cytosine of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 with thymidine (the 26th alanine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is changed to valine).
  • a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the 68th to 89th nucleotide sequences of the substituted amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15)
  • DNA consisting of the 65th to 87th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 (DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16) was synthesized using a DNA synthesizer.
  • PCR was carried out using both purified products in a saddle type, a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 and a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 as a primer set.
  • the obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis and then extracted and purified using GENECLEAN Kit to obtain a DNA fragment of about l.Okb.
  • the base sequence of the DNA fragment was determined using a sequencer, and it was confirmed that the DNA fragment had the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • DNA (encoding the sequence in which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced by the 31st methyloin Sparin) DNA (the DNA also having the base sequence ability represented by SEQ ID NO: 17) and the DNA comprising the 79-99th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 (the base sequence card represented by SEQ ID NO: 18) DNA) was synthesized using a DNA synthesizer.
  • a combination of DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 and DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, and DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 18 A DNA fragment of about l.Okb was obtained in the same manner as in (2) except that each combination of DNAs consisting of the nucleotide sequences represented by (1) was used as a primer set.
  • the DNA fragments obtained in (2) and (3) above and having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 4 and 10 were each at 72 ° C for 10 minutes in the presence of Taq polymerase (Boehringer Mannheim) and dATP. After treatment, 1 base of adenine was added to the 3 ′ end of each DNA fragment.
  • Plasmid pESB30-T and a DNA fragment having an adenine residue added to a DNA fragment having a DNA sequence having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 were mixed, and Ligation Kit Ver.l ( Using Takara Shuzo Co., Ltd.), a ligase reaction was performed. Escherichia coHDH5att (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed by a conventional method using the reaction product.
  • LB agar medium containing 10 ⁇ g / ml of kanamycin [10 g of Batatotrypton (Difco), 5 g of yeast extract (Difco), 10 g of sodium chloride sodium salt, 16 g of Batatoagar (Difco)
  • the product was cultured on a medium containing 1 L of water and adjusted to pH 7.0], and a transformant was selected.
  • the transformed strain was cultured overnight in LB medium containing 20 g / ml kanamycin, and a plasmid was prepared from the obtained culture solution by the alkaline SDS method (Molecular Cloning 3rd edition).
  • each plasmid contained DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 in pESB30_T. It was confirmed that it was purchased.
  • plasmid having a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 is named pEargB26
  • a plasmid having a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 is designated as pEargB31. Named.
  • a DNA fragment of about l.Okb was obtained in the same manner as in the above (2) except that each combination with DNA having a sufficient base sequence ability was used as a primer set and pEargB31 was made into a cage type. When the base sequence of the DNA fragment was determined using a sequencer, the DNA fragment had the base sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 is assembled into PESB30-T using the same method as in (4) above, except that the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 is used.
  • the embedded plasmid pEargB2631 was obtained.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 12 is a DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and is the 26th alanine and 31st amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. DNA encoding the amino acid sequence in which the second methionine is replaced with palin.
  • the levanciuclase encoded by ⁇ converts sucrose into a suicide substrate, so that microorganisms having sacB cannot grow in a medium containing sucrose.
  • either DNA is deleted together with ⁇ S. It can also grow even in a medium containing sucrose.
  • the DNA of the present invention is replaced with the DNA encoding ArgB that originally existed on the chromosome of the host microorganism. Microorganisms can be obtained.
  • a chromosomal DNA is prepared from the colony thus obtained, the chromosomal DNA is used as a cage, and the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 PCR was carried out using Pfo turbo DNA polymerase (manufactured by Stratagene) and the attached buffer, and the base sequence of the PCR product was determined using a sequencer.
  • ArgB-encoding DNA on the intermediate chromosome of the strain into which pEargB31 has been introduced is substituted with DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, and the strain is obtained as B31 strain. Named.
  • B2631 strain a strain in which DNA encoding ArgB on the chromosomal chromosome of the strain into which pEargB2631 has been introduced is substituted with DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 is obtained, and the strain is referred to as B2631 strain. Named.
  • DNA consisting of the 43rd to 62nd base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 (the base sequence of DNA encoding ArgR of Corynebacterium dartamicam) (the base represented by SEQ ID NO: 20) DNA having a sequence ability)
  • DNA consisting of a complementary sequence of the nucleotide sequence 1421 to 1440 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 (DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 21), SEQ ID NO: 19
  • a DNA DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 22
  • SEQ ID NO: 19 which also has a complementary sequence capacity of the base sequence obtained by adding a tag sequence to the 539th to 559th base sequences of the represented base sequence
  • a DNA synthesizer use a DNA synthesizer for DNA consisting of a base sequence obtained by adding a tag sequence to the 941st to 961st base sequences of the represented base sequence (DNA consisting of the base sequence represented by
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 is a base sequence including the base sequence of DNA encoding Corynebacterium dartamicam ArgR.
  • the prepared chromosomal DNA is of a saddle type, a combination of a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 and a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21
  • a combination of DNA, which is also powerful, and DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23 is used as a primer set, and two types of PCR are performed using Pfo turbo DNA polymerase (Stratagene) and the attached buffer. Went. Two PCR products of about 0.5 kb obtained by the PCR were each subjected to agarose gel electrophoresis, extracted and purified using GENECLEAN Kit (manufactured by BIO 101).
  • both purified products are in a saddle type, and a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21 as a primer set, Pfo turbo DNA polymerase (Strata PCR was performed using Gene) and the attached nother.
  • the obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, then extracted and purified using GENECLEAN Kit (manufactured by BIO 101), and the 560th to 940th positions of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 encoding ArgR.
  • GENECLEAN Kit manufactured by BIO 101
  • the DNA encoding ArgR on the chromosome of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 is the 560-940th nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 by the same method as in (1) except that plasmid pEde and argR are used.
  • a strain in which the region was replaced with deleted DNA was obtained. The obtained strain was named R strain.
  • the DNA encoding ArgB on the chromosome is represented by SEQ ID NO: 4, 10 or 12 in the same manner as in (1) above except that the R strain is used as the host and pEargB26, pEargB31 and pEargB2631 are used as the plasmid.
  • ArgR-encoding DNA on the chromosome is substituted with DNA from which the 560th to 940th region of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 has been deleted. did.
  • the respective strains were named RB26 strain, RB31 strain and RB2631 strain.
  • B26 strain, B31 strain, B2631 strain, R strain, RB26 strain, RB31 strain and RB263 1 strain obtained in Example 2 were mixed with BY agar medium (7 g meat extract, 10 g peptone, 3 g sodium chloride, 5 g yeast strain). Kiss, 15 g of Batatoguar in 1 L of water and adjusted to pH 7.2) and cultured at 30 ° C. for 24 hours.
  • the cells grown on the BY agar medium were seeded with seed medium (25 g sucrose, 20 g corn steep liquor, 20 g peptone, 10 g yeast extract, 0.5 g magnesium sulfate heptahydrate, 2 g Potassium dihydrogen phosphate, 3g urea, 8g ammonium sulfate, lg sodium chloride, 20mg nicotinic acid, 10mg iron sulfate heptahydrate, 10mg calcium pantothenate, lmg zinc sulfate 7 Hydrate, lmg copper sulfate pentahydrate, lmg thiamine hydrochloride, 100 ⁇ g piotin in 1 L of water, adjusted to pH 7.2 with sodium hydroxide aqueous solution, and 10 g of calcium carbonate ) Inoculated into a test tube containing 6 ml, and cultured for 24 hours with shaking at 32 ° C.
  • seed medium 25 g sucrose
  • the obtained seed culture solution was added to the main culture medium (60 g glucose, 5 g corn steep liquor, 30 g ammonium sulfate, 8 g potassium chloride, 2 g urea, 0.5 g diphosphate).
  • the main culture medium 60 g glucose, 5 g corn steep liquor, 30 g ammonium sulfate, 8 g potassium chloride, 2 g urea, 0.5 g diphosphate.
  • Potassium hydrogen 0.5g dipotassium hydrogen phosphate, lg magnesium sulfate heptahydrate, lg salt sodium salt, 20mg iron sulfate heptahydrate, 20mg nicotinic acid, 20mg j8-alanine, 10 mg (Mindium sulfate pentahydrate, lOmg thiamine hydrochloride, 200 ⁇ g of piotin in 1 L of water, adjusted to PH 7.7 with sodium hydroxide aqueous solution, and then added with 30 g of calcium carbonate) The inoculated baffled flask was inoculated and cultured for 48 hours with shaking at 32 ° C.
  • the cells were removed from the culture by centrifugation, and the accumulated amounts of L-arginine, L-ortin and L-citrulline in the supernatant were quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The results are shown in Table 1.
  • a tag sequence is added to the 21st to 43rd nucleotide sequences of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31.
  • a DNA (DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 25) having a high strength was synthesized using a DNA synthesizer.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 31 is a base sequence including the base sequence of DNA encoding ArgF of Corynebacterium dartamicam.
  • the chromosomal DNA is made into a saddle type, DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24 and DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25 are each used as a primer set, and Pfo turbo DNA polymerase (Stratagene) And the attached buffer.
  • the approximately 1.4 kb DNA fragment obtained by PCR was treated with EamHI (Takara Shuzo), agarose gel electrophoresis, extracted and purified using GENECLEAN Kit (BIO 101).
  • the obtained DNA fragment was mixed with pUC119 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) cleaved with EamHI and ligase reaction was performed using Ligation Kit Ver. L (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed according to the method described in Molecular 'Crowing 3rd Edition'.
  • the strain was cultured on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin, and a transformant was selected.
  • the transformed strain was cultured overnight in LB medium containing 50 g / ml ampicillin, and a plasmid was prepared from the obtained culture solution according to the method described in the alkaline SDS method (Molecular 'Cloning 3rd Edition). . After the plasmid was cleaved with tel, a ligation kit Ver.
  • This plasmid is a saddle-shaped DNA and has the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 24.
  • PCR was carried out using Pfo turbo DNA polymerase (manufactured by Stratagene) and the attached buffer using the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by column number 25 as a primer set to obtain a DNA fragment of about 1. Okb.
  • the DNA fragment was reacted at 72 ° C for 10 minutes in the presence of Taq DNA polymerase (Boehringer Mannheim) and dATP, and 1 base of adenine was added to the 3 'end.
  • a ligase reaction was performed using the DNA fragment prepared with PESB30-T and adenine prepared in Example 1 and Ligation Kit Ver.l (Takara Shuzo).
  • the resulting plasmid was named pEargF.
  • Example 2 (1) Except that B26, B31, R, RB26, RB31, and ATCC13032 were used as hosts and pEargF was used as a plasmid, the same procedure as in Example 2 (1) was performed.
  • the above-mentioned DNA internal force encoding ArgF obtained strains substituted with DNA lacking 369 base pairs in the DNA, and named FB26 strain, FB31 strain, FR strain, FRB26 strain, FR B31 strain and F strain, respectively. .
  • Example FB26 strain, FB31 strain, FR strain, FRB26 strain, FRB31 strain, F strain and ATCC13032 strain prepared in Example 4 Incubate for 24 hours on agar medium at 30 ° C. Each strain is seeded with 25 g glucose, 0.5 g potassium dihydrogen phosphate, 1.5 g dipotassium hydrogen phosphate, 0.5 g magnesium sulfate, 20 g peptone.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 in which the 76th to 78th region of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is replaced with ctg (the 26th alanine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced by leucine.
  • a DNA having a base sequence ability complementary to the 68th to 89th base sequences of the substituted amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (DNA having the base sequence ability represented by SEQ ID NO: 26)
  • a DNA consisting of the 65th to 87th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 was synthesized using a DNA synthesizer.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 (encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 in which the 26th alanine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine) DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence (DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28) and DNA consisting of the 65th to 87th nucleotide sequences of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 (sequence DNA having the nucleotide sequence represented by number 29) was synthesized using a DNA synthesizer.
  • Example 1 (2) The same operation as in Example 1 (2), except that DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 26 and 27 was used instead of DNA having the nucleotide sequence ability represented by SEQ ID NOs: 15 and 16 The DNA fragment of about l.Okb having the DNA represented by SEQ ID NO: 6 and having the base sequence was obtained. Further, in Example 1 (2), the same procedure was used except that the DNA having the nucleotide sequence ability represented by SEQ ID NOs: 28 and 29 was used in place of the DNA having the nucleotide sequence ability represented by SEQ ID NOs: 15 and 16. On the other hand, a DNA fragment of about l.Okb having a DNA represented by SEQ ID NO: 8 and having a base sequence was obtained.
  • Example 1 in place of the DNA fragment having the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10, the DNA has the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 8
  • the same operation was performed except that a DNA fragment having DNA was used, and a plasmid in which the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 8 was incorporated into plasmid pESB30-T was obtained.
  • the respective plasmids were named pEargB26L and pEargB26I.
  • Example 2 (1) Except for using the R strain as the host and pEargB26L and pEargB26I as the plasmid, the same operation as in Example 2 (1) was carried out.
  • DNA encoding ArgB on the chromosome is represented by SEQ ID NO: 6.
  • a strain in which the DNA having the base sequence was substituted and a strain in which the DNA encoding ArgB on the chromosome was substituted with the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 were obtained.
  • Each strain was named RB26L strain and RB26I strain.
  • both the RB26L strain having the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and the RB26I strain having the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 are sequenced.
  • L-arginine, L-orthine and L-citrulline were produced in the same manner as RB26 having DNA having the base sequence represented by No. 4.
  • the production of these amino acids by RB26L and RB261 was higher than that by RB26.
  • a primer was synthesized based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32 including the nucleotide sequence of DNA encoding ArgG of Corynebataterum dartamicum, and the chromosomal DNA of Corynebataterum dartatumum strain ATCC13032 was obtained. PCR is performed as a saddle type to construct a plasmid containing a DNA fragment from which about 400 base pairs have been deleted in DNA encoding ArgG.
  • a DNA fragment in which about 400 base pairs are deleted from the DNA encoding the plasmid force ArgG is prepared, and 1 base of adenine is added to the 3 'end of the DNA fragment.
  • a plasmid obtained by performing a ligase reaction using the pESB30-T prepared in Example 1, a DNA fragment with adenine attached, and a ligation kit Ver.l (Takara Shuzo) is designated as pEargG.
  • Example 2 (1) The same procedures as in Example 2 (1) were carried out except that B26 strain, B31 strain, R strain, RB26 strain, RB31 strain, and ATCC13032 strain were used as the host, and pEargG was used as the plasmid.
  • strains of DNA that encode ArgG on the chromosome were prepared by substituting DNA with approximately 400 base pairs deleted from the DNA, and GB26 strain, GB31 strain, GR strain, G RB26, GRB31 and G shares.
  • GB26 strain, GB31 strain, GR strain, GRB26 strain, GRB31 strain and G strain and ATCC13032 strain were cultured on BY agar medium at 30 ° C for 24 hours.
  • 0.5 g potassium dihydrogen phosphate, 1.5 g dipotassium hydrogen phosphate, 0.5 g magnesium sulfate, 20 g peptone, 3 g urea, 50 g piotin, 0.3 g L-arginine in 1 liter of water Inoculate a test tube containing 6 ml of calcium carbonate) and incubate for 24 hours with shaking at 32 ° C.
  • the main culture medium 100 g glucose, 30 g ammonium sulfate, 0.6 g magnesium sulfate, 0.5 g potassium dihydrogen phosphate, 0.25 g L arginine, 16 mg.
  • modified N-acetylglutamate kinases and DNA encoding them can be obtained, and by using a microorganism having the DNA, L-arginine, L-orthine or L-citrulline can be obtained. Can be produced efficiently.

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Abstract

　本発明によれば、（i）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２０～３８番目のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、または（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第２０～３８番目のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換され、かつ第１～１９番目または３９～２９４番目のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＮ－アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドが提供される。

Description

L -アルギニン、 L -オル二チンまたは L -シトルリンの製造法 技術分野
[0001] 本発明は、 L—アルギニン、 L—オル-チンまたは Lーシトルリンの製造法に関する 背景技術
[0002] 微生物において、 L—アルギニンは L—グルタミン酸から 8段階の反応を経て生合 成される。 L—オル-チンおよび Lーシトルリンは、 L—アルギニンの生合成経路上の 中間体である。 L—アルギニン、 L—オル-チンおよび L—シトルリンの生合成も、他 のアミノ酸と同様に調節を受けて 、る。
例えば、コリネ型細菌では、アルギニン'リプレッサー（以下、 ArgRという）によって、 L—アルギニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子力 構成されるオペロン (以下、アルギニン'オペロンと略す)の転写が抑制されている（特許文献 1参照)。ま た、コリネ型細菌では、 L—グルタミン酸力 L—アルギニンに至る生合成経路上の第 2番目の酵素である N—ァセチルグルタミン酸キナーゼ（EC:2.7.2.8、以下、 ArgBと略 すこともある）が L—アルギニンによるフィードバック阻害を受けることが知られている（ 非特許文献 2参照)。
[0003] L—アルギニン、 L—オル-チンまたは Lーシトルリンも他のアミノ酸と同様に微生物 を用いて生産される。そして、他のアミノ酸の場合と同様に、突然変異や DNA組換え 等の手法を用いてこれらのアミノ酸の生産性を向上させる研究が行なわれて 、る。 例えば、アルギニンの生合成に関与する遺伝子を含む DNA断片でコリネバタテリ ゥム ·ダルタミカムを形質転換し、さらに突然変異処理を施すことにより、アルギニンの 生産性の向上したコリネバタテリゥム ·ダルタミカム K65 (FERM BP-1115)株が取得さ れたことが報告されて 、る (特許文献 2参照)。
[0004] また、アルギニン生合成系酵素の抑制が解除されたコリネバタテリゥム 'ダルタミカム
(Corvnebacterium elutamicum) (非特許文献 1参照）、アルギニン生合成系酵素の抑 制が解除され、さらに L—アルギニンによるフィードバック阻害が脱感作されており、 かつ L—アルギニンの膜透過性の増大したコリネバタテリゥム 'ダルタミカム (非特許 文献 3参照)等が突然変異法を用いて取得されて 、る。
[0005] また、 ArgRをコードする DNAを破壊したコリネ型細菌（特許文献 1参照）力 SDNA糸且 換え法を用いて取得されて 、る。
し力し、これまでに、 ArgBと ArgRをコードする DNAの両方に変異が導入された株に お!、て、 ArgBまたは ArgRをコードする DNAにどのような変異を導入すれば L—アル
Figure imgf000003_0001
、ての報告はな 、。
特許文献 1 :特開 2002— 51790号公報
特許文献 2：特開昭 63 - 79597号公報
非特許文献 1 : Agricultural Biological Chemistry, 1979年，第 43卷， p.105- 111 非特許文献 2 Journal of Bacteriology, 1966年，第 91卷， p.617
非特許文献 3 : Agricultural Biological Chemistry, 1972年，第 36卷， p.1675-1684 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、効率のよい L—アルギニン、 L—オル-チンまたは Lーシトルリン の製造法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は以下の（1)〜（18)に関する。
(1) ( 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 20〜38番目のアミノ酸配 列中の 1以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、または
(ii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 20〜38番目のアミノ酸配列中 の 1以上のアミノ酸が置換され、かつ第 1〜19番目または 39〜294番目のアミノ酸配 列中の 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
を有し、かつ N—ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
(2) (i)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 26〜31番目のアミノ酸配 列中の 1以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、または
(ii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 26〜31番目のアミノ酸配列中 の 1以上のアミノ酸が置換され、かつ第 1〜25番目または第 32〜294番目のアミノ酸 配列中の 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
を有し、かつ N—ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
(3) (i)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 26または 31番目のァミノ 酸が置換されたアミノ酸配列、
(ii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 26および 31番目のアミノ酸が 置換されたアミノ酸配列、または
(iii)上記 (i)または (ii)のアミノ酸配列にぉ 、て、置換された部位以外の 1以上のアミ ノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
を有し、かつ N—ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
(4) (i)配列番号 3、 5、 7、 9および 11で表されるアミノ酸配列力 選ばれるアミノ酸 配列、
(ii)配列番号 3、 5および 7で表されるアミノ酸配列力 選ばれるアミノ酸配列にぉ 、て 、それぞれの配列の第 26番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列中の 1以上のアミノ酸が 欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、
(iii)配列番号 9で表されるアミノ酸配列において、第 31番目のアミノ酸以外のァミノ 酸配列中の 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
(iv)配列番号 11で表されるアミノ酸配列において、第 26および 31番目のアミノ酸以 外のアミノ酸配列中の 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列 を有し、かつ N—ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
(5) 上記（1)〜（4)の!、ずれか 1つのポリペプチドをコードする DNA。
(6) 配列番号 4、 6、 8、 10および 12で表される塩基配列力も選ばれる塩基配列を 有する DNA。
(7) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAの塩 基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズ し、かつ
(i)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 26番目のアミノ酸残基に相応 するアミノ酸残基が Lーァラニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコードする DNA (ii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 31番目のアミノ酸残基に相応 するアミノ酸残基が L メチォニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコードする DN A、または
(iii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 26番目のアミノ酸残基に相応 するアミノ酸残基が Lーァラニン以外のアミノ酸であり、かつ第 31番目のアミノ酸残基 に相応するアミノ酸残基が L メチォニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコード する DNA
であり、かつ N ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードす る DNA。
(8) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 26番目のアミノ酸残基に相 応するアミノ酸残基が L—パリン、 L ロイシンまたは L—イソロイシンであり、第 31番 目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基が L ノ《リンである、上記（7)の DNA。
(9) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAの塩 基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズ し、かつ
(i)配列番号 2で表される塩基配列の 5 '末端から第 76〜78番目の領域に相応する 領域がグァニン チミジン チミジン、シトシン チミジンーグァニン、もしくはアデ- ン チミジン シトシンである塩基配列を有する DNA、
(ii)配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端力も第 91〜93番目の領域に相応する 領域がグァニン チミジンーグァニンである塩基配列を有する DNA、または
(iii)配列番号 2で表される塩基配列の 5 '末端から第 76〜78番目の領域に相応する 領域がグァニン チミジン チミジン、シトシン チミジンーグァニン、もしくはアデ- ン—チミジン—シトシンであり、かつ第 91〜93番目の領域に相応する領域がグァ- ン チミジン グァニンである塩基配列を有する DNA
であり、かつ N ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードす る DNA。
(10) 上記（5)〜（9)のいずれ力 1つの DNAをベクターに組み込んで得られる組換 え体 DNA。 (11) 上記（10)の組換え体 DNAを導入して得られる微生物。
(12) 上記（5)〜（9)のいずれ力 1つの DNAを有する微生物。
(13) アルギニン'リプレッサーのアルギニン ·オペロンの転写抑制活性が低下また は喪失して 、ることを特徴とする上記（ 11)または（ 12)の微生物。
(14) オル-チン力ルバモイルトランスフェラーゼ活性が低下または喪失して 、るこ とを特徴とする上記（11)〜（13)のいずれか 1つの微生物。
(15) アルギ-ノコハク酸シンターゼ活性が低下または喪失していることを特徴とす る上記（11)〜（14)の!、ずれか 1つの微生物。
(16) 微生物がコリネパクテリゥム属に属する微生物である、上記（11)〜（15)のい ずれか 1つの微生物。
(17) 微生物がコリネバタテリゥム 'ダルタミカムに属する微生物である、上記（11)〜 (16)の微生物。
(18) 上記（11)〜（17)のいずれか 1つの微生物を培地に培養し、培養物中に L— アルギニン、 L—オル-チンまたは L シトルリンを生成、蓄積させ、該培養物から L アルギニン、 L オル-チンまたは L シトルリンを採取することを特徴とする L ァ ルギニン、 L -オル-チンまたは L -シトルリンの製造法。
発明の効果
[0008] 本発明により、効率のよい L アルギニン、 L オル-チンまたは L シトルリンの製 造法を提供することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明のポリペプチドとしては、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第
20〜38番目のアミノ酸配列で 1以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有し、か つ N ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性 (以下、 ArgB活性と 、う）を有するポリぺプ チドをあげることができる。
配列番号 1で表されるアミノ酸配列は、コリネバクテリウム'ダルタミカム ATCC13032 株の ArgBのアミノ酸配列であり、配列番号 2で表される塩基配列を有する DNAにより コードされる。なお、配列番号 2で表される塩基配列を有する DNAは、 DDBJ/GenBa nk/EMBLに NCgll342として登録されて!、る。 [0010] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 20〜38番目のアミノ酸配列から なる領域は、ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli)の ArgBのアミノ酸配列と立体構造〔St ructure, 10, 329-342, (2002)〕との関係および該アミノ酸配列とコリネバクテリウム'グ ルタミカムの ArgBのアミノ酸配列との相同性から ex 一へリックスを形成すると推測され る領域である。
[0011] アミノ酸が置換される部位は、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力 第 2 0〜38番目のアミノ酸配列中であればいずれの部位であってもよいが、第 26〜31番 目の部位であることが好ま 、。
置換されるアミノ酸の数は、置換後のアミノ酸配列を有するポリペプチドが ArgB活 性を有しており、好ましくは L アルギニンによるフィードバック阻害の低減または解 除された ArgB活性を有していれば特に限定されるものではないが、好ましくは 1〜： L0 個、より好ましくは 1〜5個、さらに好ましくは 1または 2個である。
[0012] ポリペプチドが L—アルギニンによるフィードバック阻害の低減または解除された Ar gB活性を有していることは、 L—アルギニンの存在下での ArgB活性力 配列番号 1で 表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの L アルギニンの存在下での ArgB活性 より高いことをもって確認することができる。 L アルギニンの濃度は 5mmol/l以上であ ることが好ましぐ 10mmol/l以上であることがさらに好ましい。
[0013] ポリペプチドの ArgB活性は、たとえば、 ATPおよび N ァセチル— L グルタミン酸 を基質としたホスホェノールピルビン酸- pyruvate kinase系との反応で生成するピル ビン酸を、 2,4-ジニトロフエ-ルヒドラゾンとして比色定量する方法〔Meth. EnzymoL, 1 7, 251-255 (1970)〕、 ATPおよび N ァセチルー L—グルタミン酸をヒドロキシルァミン とともに反応させ、生成するァセチルグルタミン酸 5—リン酸をヒドロキサム酸として定 量する方法〔Meth. EnzymoL , 17, 269-272 (1970)〕等の方法により測定することがで きる。
[0014] 置換されるアミノ酸は、置換後のアミノ酸配列を有するポリペプチドが ArgB活性を有 しており、好ましくは L アルギニンによるフィードバック阻害の低減または解除された ArgB活性を有していれば特に限定されるものではなぐ天然型と非天然型とを問わ ない。 天然型アミノ酸としては、 L—ァラニン、 L—ァスパラギン、 L—ァスパラギン酸、 L- グルタミン、 L—グルタミン酸、グリシン、 L—ヒスチジン、 L—イソロイシン、 L—ロイシン 、 L—リジン、 L—アルギニン、 L—メチォニン、 L—フエ二ルァラニン、 L—プロリン、 L —セリン、 L—スレオニン、 L—トリプトファン、 L—チロシン、 L—パリン、 L—システィン などがあげられる。
[0015] 以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互 に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2-アミノブ タン酸、メチォニン、 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-ブチルァラニン、シクロへ キシノレァラニン
B群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、グルタミン
D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2,4-ジァミノブタン酸、 2,3-ジァミノプロピオ ン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン
G群：フエ-ルァラニン、チロシン
本発明のポリペプチドとしては、例えば、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末 端力も第 26または 31番目の 、ずれか一方、ある 、は両方のアミノ酸が置換されたァ ミノ酸配列を有し、かつ ArgB活性を有するポリペプチドをあげることができる。
[0016] 本発明のポリペプチドでは、置換された部位以外のアミノ酸配列にぉ 、ては、 ArgB 活性を有している限り、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。 欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、 1個から数十個、 好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個である。
置換されるアミノ酸は、上記の配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 20 〜38番目のアミノ酸配列中で置換することが可能なアミノ酸と同様である。
[0017] 欠失、置換または付カ卩は、同一配列での 1または複数のアミノ酸の欠失、置換また は付加を意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよい。
本発明のポリペプチドが ArgB活性を有するためには、配列番号 1で表されるァミノ 酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも 60%以上、通常は 80%以上、特に 95% 以上の相同性を有して 、ることが好ま 、。
[0018] 本発明にお!/、て、アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによる アルゴリズム BLAST〔Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)〕や FASTA [Methods EnzymoL, 183, 63 (1990)〕を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLAST に基づいて、 BLASTNや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている〔J. Mol. Biol ., 215, 403(1990)] o BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合に は、パラメータは例えば Score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTに基づい て BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えば score = 50 、 wordlength=3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プ ログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公 知で teる (http://www.ncDi.nlm.nih.gov.)。
[0019] 本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより具体的な例としては、配列番号 1で表さ れるアミノ酸配列の N末端から第 26番目のァラニン力パリンに置換された配列番号 3 で表されるアミノ酸配列、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 26番目 のァラニンがロイシンに置換された配列番号 5で表されるアミノ酸配列、配列番号 1で 表されるアミノ酸配列の N末端から第 26番目のァラニン力イソロイシンに置換された 配列番号 7で表されるアミノ酸配列、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 第 31番目のメチォニン力パリンに置換された配列番号 9で表されるアミノ酸配列、配 列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 26番目のァラニンおよび第 31番目 のメチォニンがそれぞれパリンに置換された配列番号 11で表されるアミノ酸配列等 があげられる。
[0020] 本発明の DNAとしては、本発明のポリペプチドをコードする DNAがあげられ、具 体例として、配列番号 3、 5、 7、 9および 11で表されるアミノ酸配列を有するポリぺプ チドをそれぞれコードする配列番号 4、 6、 8、 10および 12で表される塩基配列を有 する DNAをあげることができる。 また、本発明の DNAとしては、配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するポリぺプ チドをコードする DNAの塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェン トな条件下でハイブリダィズし、かつ
(i)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 26番目のアミノ酸残基に相応 するアミノ酸残基が Lーァラニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコードする DNA
(ii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 31番目のアミノ酸残基に相応 するアミノ酸残基が L メチォニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコードする DN A、
(iii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 26番目のアミノ酸残基に相応 するアミノ酸残基が Lーァラニン以外のアミノ酸であり、かつ第 31番目のアミノ酸残基 に相応するアミノ酸残基が L メチォニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコード する DNA、
(iv)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 26番目のアミノ酸残基に相応 するアミノ酸残基が L パリン、 L一口イシンまたは L イソロイシンであるポリペプチド をコードする DNA、
(v)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 31番目のアミノ酸残基に相応 するアミノ酸残基が L パリンであるポリペプチドをコードする DNA、
(vi)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 26番目のアミノ酸残基に相応 するアミノ酸残基が L—パリン、 L ロイシンまたは L—イソロイシンであり、かつ第 31 番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸残基が Lーノ リンであるポリペプチドをコード する DNA、
(vii)配列番号 2で表される塩基配列の 5 '末端から第 76〜78番目の領域に相応す る領域がグァニン チミジン チミジン、シトシン チミジンーグァニン、もしくはアデ ニン チミジンーシトシンである塩基配列を有する DNA、
(viii)配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端から第 91〜93番目の領域に相応す る領域がグァニン チミジンーグァニンである塩基配列を有する DNA、または
(ix)配列番号 2で表される塩基配列の 5 '末端から第 76〜78番目の領域に相応する 領域がグァニン チミジン チミジン、シトシン チミジンーグァニン、もしくはアデ- ン—チミジン—シトシンであり、かつ第 91〜93番目の領域に相応する領域がグァ- ン チミジン グァニンである塩基配列を有する DNA
であり、かつ N ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードす る DNAをあげることができる。
[0021] ストリンジェントな条件下でハイブリダィズ可能な DNAとは、配列番号 1、 3、 5、 7、 9 または 11で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAの塩基配列 、より好ましくは配列番号 2、 4、 6、 8、 10または 12で表される塩基配列と相補的な塩 基配列からなる DNAの一部、または全部をプローブとして、コ口-一'ハイブリダィゼ ーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンハイブリダィゼーショ ン法等を用いることにより得られる DNAを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラ ーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0.7〜1.0mol/lの塩化ナトリウム存 在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0.1〜2倍濃度の SSC溶液（1倍濃度 の SSC溶液の組成は、 150mmol/l塩化ナトリウム、 15mmol/lクェン酸ナトリウムよりなる )を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAをあげること ができる。
[0022] ノヽイブリダィゼーシヨンは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (以下、モレキュラ^ ~ ·クロー-ング第 3 版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987—1997) (以下、カレント 'プロトコ一ルズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジーと略す）、 DNA Cloni ng 1: し ore Techniques, A Practical Approacn, Second Edition, Oxford University (1 995) (以下、 DNAクローユングと略す)等に記載されている方法に準じて行うことがで きる。ハイブリダィズ可能な DNAとしては、上記 BLASTや FASTA等を用いて計算した ときに、配列番号 2、 4、 6、 8、 10または 12で表される塩基配列と少なくとも 75%以上 の相同性を有する DNA、好ましくは 80%以上の相同性を有する DNA、さらに好まし くは 95%以上の相同性を有する DNAをあげることができる。
[0023] 本発明の微生物としては、本発明の DNAを有する微生物であればいずれでもよい 力 アルギニン'リプレッサー（ArgR)のアルギニン'オペロンの転写抑制活性が低下 または喪失して 、る微生物であることが好ま 、。
本発明の微生物の種類は特に限定されないが、例えばコリネ型細菌をあげることが できる。
[0024] コリネ型細菌としては、コリネバタテリゥム (Corvnebacterium)属、ブレビバタテリゥム
(Brevibacterium)属、またはミクロバタテリゥム (Microbacterium)属に属する微生物を あげることができる。
コリネバタテリゥム属に属する微生物としては、コリネパクテリゥム ·グルタミカム (Corv nebactenum glutamicum)、 コリネノヽクァリウム ·—/セト—ズン フィフム (し orvnebactenum acetoacidophilum)、コリネノ クテリゥム ·Τセトグノレタミカム (Corvnebacterium acetoglu tamicum)、コリネノ クテリゥム ·カノレナェ（Corvnebacterium callunae)、コリネノ クテリウ ム.ノヽーキユリス（Corvnebacterium herculis J、コリネノ クテリゥム *リリウム（Corvnebact erium lilium)、コリネノ クテリゥム ·メラセコラ（Corvnebacterium melassecola)、コリ不ノ ク" 7"リウム ·サ ~~モゾミノグネス (Corvnebacterium thermoaminogenes)等をあ ること 力 eさ、具体的に ί 、 Corvnebacterium glutamicum ATし Cl«j032、 Corvnebacterium g lutamicum ATCC13060、 Corvnebacterium glutamicum ATCC 13826 (旧鹿種 Brevibac terium flavum)、 Corvnebacterium glutamicum ATCC 14020 (旧属種 Brevibacterium d ivaricatum)、 Corvnebacterium glutamicum ATCC13869 (旧属種 Brevibacterium lacto fermentum)ゝ Corvnebacterium acetoacidophilum ATCC13870、 Corvnebacterium ace toglutamicum ATCC15806、 Corvnebacterium callunae ATCC15991、 Corvnebacteriu m herculis ATCC13868、 Corvnebacterium lilium ATCC15990、 Corvnebacterium mel assecola ATCC17965、 Corvnebacterium thermoaminogenes ATCC9244等をあげるこ とがでさる。
[0025] ブレビバタテリゥム属に属する微生物としては、ブレビバタテリゥム 'サッカロリティカ ム (Brevibacterium saccharolyticum)、ブレビノ クテリゥム.イマリ才フィラム (Brevibact erium immariophilum)、ブレビノ クァリゥム ·ロセゥム (Brevibacterium roseum)、ブレビ パクテリゥム ·チォゲ二タリス（Brevibacterium thiogenitalis)等をあげることができ、具 体的【こ fま、 Brevibacterium saccharolyticum ATし Cl40t>り、 Brevipactenum immariophi lum ATCCl4068、 Brevibacterium roseum ATし Cl«j825、 Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240等をあげることができる。
[0026] ミクロバタテリゥム属に属する微生物としては、ミクロバタテリゥム 'アンモニアフィラム
(Microbacterium ammoniaphilum)等をあけること力でき、具体的には、 Microbacteriu m ammoniaphilum ATCC15354等をあげることができる。
本発明の微生物の ArgRのアルギニン'オペロン転写抑制活性は、親株の活性と比 ベて低下していればよいが、 50%以下であることが好ましぐ 10%以下であることが より好ましぐ 5%以下であることがさらに好ましぐ活性がゼロ、すなわち喪失している ことが最も好ましい。
[0027] 親株は、 L—アルギニン、 L—オル-チンまたは Lーシトルリンを生成する能力を有 し、 ArgBが L アルギニンによりフィードバック阻害を受け、かつアルギニン'オペロン の転写が ArgRにより抑制される微生物であれば、野生株であってもよいし、該野生株 力も人工的に育種された育種株であってもよい。また、これらの性質を有していれば 、以下に述べる本発明の DNAを導入する際に用いられる宿主微生物も、親株として 用!/、ることができる。
[0028] 本発明において、野生株とは、本発明の微生物と分類学上同じ種に属する微生物 であって、かつ自然界で最も高頻度に出現する表現型を有する微生物を!、う。 例えば、本発明の微生物がコリネバタテリゥム 'ダルタミカムに属する微生物である 場合、野生株としては、コリネバタテリゥム'ダルタミカム ATCC13032株をあげることが できる。
[0029] 本発明の微生物は、親株を、 N-メチル -N'--トロ- トロソグァ二ジン等の突然変 異誘発物質を用いて処理し、得られた株をアルギニンアナログであるアルギニンノヽィ ドロキサメートを含有する培地を用いて培養した際に親株と比べて生育速度が速い 株を選択し、さらに通常の微生物の培地を用 Vヽて培養した際に親株と比べて L ァ ルギニンの生産性が向上した微生物の中から選択して得てもよいが、より簡便には、 本発明の DNAを導入する方法を用いて得ることができる。
[0030] 以下、本発明の微生物の取得法として本発明の DNAを導入して得る方法につい て説明する。
本発明の DNAは、配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA、または配列番 号 2で表される塩基配列と相同性の高 、塩基配列を有し、かつ ArgB活性を有するポ リペプチドをコードする DNAから調製して得ることができる。
[0031] 配列番号 2で表される塩基配列との高い相同性とは、少なくとも 75%以上、好ましく は 80%以上、さらに好ましくは 95%以上の相同性を有することである。
配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA、または配列番号 2で表される塩基 配列と相同性の高 、塩基配列を有し、かつ ArgB活性を有するポリペプチドをコード する DNAは、これらの DNAを有する微生物力 調製して得ることができる力 パー セプティブ ·バイオシステムズ社製 8905型 DNA合成装置等を用 、て化学合成しても 得ることができる。
[0032] これらの DNAを有する微生物としては、例えば、コリネバタテリゥム属に属する微生 物をあげることができる。
コリネバタテリゥム属に属する微生物としては、コリネバタテリゥム 'ダルタミカム、コリ ネバクテリゥム ·ァセトァシドフィラム、コリネバタテリゥム ·エフイシエンス (Corvnebacteri urn efficiens)、コリネノ クテリゥム ·クレナタム (Corvnebacterium crenatum)等をあけ ^ こと力 eさ、 [列 は、 Corvnebacterium glutamicum ATCし 13032、し orvnebactenum gl utamicum K65(FERM BP- 1115)、 Corvnebacterium acetoacidophilum ATし C丄《3870、 Corvnebacterium efficiens JCM 44549等をあげることができる力 配列番号 2で表さ れる塩某配列を有する DNAを有する Corvnebacterium glutamicum ATCC13032が好 ましく用いられる。
[0033] 上記配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA、または配列番号 2で表される 塩基配列と相同性の高！ヽ塩基配列を有し、かつ ArgB活性を有するポリペプチドをコ ードする DNAを有する微生物を公知の方法〔例えば、 Mol. Microbiol, 20, 833 (199 6)〕により培養する。
培養後、例えば斎藤らの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)〕に準じて該 微生物の染色体 DNAを単離精製する。
[0034] DDBJ/GenBank/EMBLに NCgll342として登録されているコリネバクテリウム'グルタ ミカムの ArgBをコードする DNAの塩基配列（配列番号 2で表される塩基配列）または 該塩基配列を含む領域の塩基配列 (例えば、配列番号 30で表される塩基配列）に 基づいてプライマーを調製し、単離精製した染色体 DNAを铸型として、 PCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]を行い、 ArgBをコードする DNAを含む DNA断片 を調製する。
[0035] プライマーとしては、例えば、配列番号 30で表される塩基配列に基づ 、て設計した 配列番号 13〜18で表される塩基配列からなる DNAをあげることができる。
また、単離精製した染色体 DNAを用いて、モレキュラー 'クローユング第 3版、カレ ント.プロトコールズ ·イン.モレキュラー.バイオロジー等に記載された方法に準じて D
NAライブラリーを作製し、モレキユラ一'クロー-ング第 3版、カレント 'プロトコールズ 'イン'モレキュラー 'バイオロジー、 DNAクローユング等の実験書に記載されている コ口-一.ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法、サザンハイ ブリダィゼーシヨン法等により、得られた DNAライブラリーから ArgBをコードする DN Aを含むクローンを取得することもできる。
[0036] ハイブリダィゼーシヨンに用いるプローブとしては、公知のコリネバクテリウム'グルタ ミカムの ArgBをコードする DNAまたはその一部、該 DNAの塩基配列をもとに合成し た DNAなどの他、公知の ArgBをコードする DNAの塩基配列をもとに合成した DNA プライマーを用いて PCRなどにより取得した DNA断片などをあげることができる。 例えば、配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA、または配列番号 13〜18 で表される塩基配列力もなる DNAをプライマーとしてコリネバタテリゥム'ダルタミカム に属する微生物の染色体 DNAを铸型に PCRを行 ヽ、増幅した DNA断片などを例 示することができる。
[0037] コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法、サザンノヽ イブリダィゼーシヨン法等により取得した ArgBをコードする DNAを有する DNA断片 をそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み 、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば ABI377DNAシークェンサ一（パーキン •エルマ一社製）等を用いたジデォキシ法〔proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (19 77)]により、該 DNA断片の塩基配列を決定する。
[0038] さらに、決定された塩基配列に基づ!/、たプライマーを調製し、染色体 DNAを铸型 として、 PCR法〔PCR Protocols, Academic Press (1990)〕により、 ArgBをコードする D NAを有する DNA断片を取得することができる。
また、決定された DNA断片の塩基配列に基づいて、パーセプティブ'バイオシステ ムズ社製 8905型 DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とする DNA 断片を調製することもできる。
[0039] 上記のようにして得られる ArgBをコードする DNAとしては、例えば、配列番号 2で 表される塩基配列を有する DNAをあげることができる。
配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA、または配列番号 2で表される塩基 配列と相同性の高 、塩基配列を有し、かつ ArgB活性を有するポリペプチドをコード する DNAに、必要に応じてモレキユラ一'クロー-ング第 3版、カレント.プロトコール ズ'イン'モレキュラー 'バイオロジー、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Resear ch, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特 異的変異導入法、例えば、 PCRを用いる方法等により部位特異的変異を導入するこ とにより本発明の DNAを取得することができる。
[0040] このようにして得られた本発明の DNAをプラスミドベクター等のベクターに常法を 用いて組み込み、本発明の組換え体 DNAを調製する。
ベクターとしては、本発明の DNAを導入する微生物（以下、宿主微生物という）に 導入可能なベクターであれば特に限定されるものではなぐ例えば、 pHSG299 [Gene , 61, 63-74 (1987)〕、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもベーリンガーマンハイム社 製）、 pHelixl (ロシュ'ダイァグノステイタス社製）、 pKK233-2 (アマシャム'フアルマシ ァ 'バイオテク社製）、 pSE280 (インビトロジェン社製）、 pGEMEX-Ι (プロメガ社製）、 p QE-8 (キアゲン社製）、 pET-3 (ノバジェン社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600号）、 pK ΥΡ200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、 pLSAl〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1 989)〕、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、 pBluescriptll SK(+)、 pBluescript II KS (-) (ストラタジーン社製）、 pTrS30 〔ェシエリヒア'コリ JM109/pTrS30( FERM BP- 5407)より調製〕、 pTrS32 〔ェシエリヒア'コリ JM109/pTrS32(FERM BP- 540 8)より調製〕、 pPAC31 (国際公開 98/12343号パンフレット)、 pUC19 [Gene, 33, 103 (1 985)〕、 pSTV28(宝酒造社製)、 pUC118 (宝酒造社製）、 pPAl (特開昭 63- 233798号） 、 pCG116、 pCGl (特開平 6- 277082号)、 pCS299P (国際公開 00/63388号パンフレット） 等があげられる力 宿主微生物中では自立複製できないベクターを用いると本発明 の組換え体 DNAを宿主微生物の染色体に組み込むことができるので好ましい。
[0041] 宿主微生物としては、上記であげた微生物を用いることができる。
宿主微生物中で自立複製できないベクターは、特に限定されないが、抗生物質に 対する耐性に関与する遺伝子を有するベクターであれば、相同組換えにより宿主微 生物の染色体上に本発明の組換え体 DNAが組み込まれた微生物を容易に選択で きるので好ましぐさらにバチルス 'サブチリス（Bacillus subtilis)に由来するレパンシュ 一クラーゼ（EC:2.4.1.10)をコードする DNA (^S)を有するベクターであれば、宿主 微生物の染色体上に元来存在している ArgBをコードする DNAが本発明の DNAに 置換された微生物を容易に選択できるので好ましい。このようなベクターとしては、例 えば、実施例 1で示すプラスミド PESB30等をあげることができる。
[0042] 本発明の組換え体 DNAを宿主微生物に導入する。
本発明の微生物の ArgRの活性を低下または喪失させる変異の導入は、この宿主 微生物への本発明の DNAの導入操作の前に行なってもよいし、宿主微生物に本発 明の DNAを導入した後に行なってもよ 、。
ArgRの活性を低下または喪失させるには、 ArgRの活性を低下または喪失させる微 生物を N-メチル -N'--トロ- トロソグァ二ジン等の突然変異誘発物質で処理し、 突然変異処理前と比べて L アルギニンの生産性が向上した微生物の中から選択し て得てもょ 、し、 ArgBをコードする DNAに部位特異的変異を導入する方法と同様の 方法を用いて ArgRをコードする DNAに塩基の置換、欠失または付加等を行なって 得てもよい。
[0043] 塩基の置換、欠失または付加等を行なう部位は、 ArgRの活性を低下または喪失す ることができる部位であれば限定されな 、が、 ArgRへの L アルギニンの結合領域中 または該結合領域を含む領域であれば、該活性を効率よく低下または喪失させるこ とができるので好ましい。
Lーァノレギニンの結合領域としては、例えば、コリネバタテリゥム'ダルタミカム ATCC 13032の ArgRをコードする DNAの塩基配列である配列番号 19で表される塩基配列 においては、第 45〜240番目の領域をあげることができる。他の微生物の ArgRをコ ードする DNAにおいても、該領域に相応する領域中またはその近傍が L アルギ- ンの結合領域である。
[0044] 置換、欠失または付加等を行なう塩基の数は、 ArgRの活性を低下または喪失する ことができる数であれば限定されな!、。
宿主微生物への本発明の DNAの導入は、本発明の組換え体 DNAを宿主微生物 に導入することのできる方法であれば、 、ずれの方法を用いてもよ 、。
例えば、電気穿孔法〔Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541 (1999)〕やプロトプラスト法 [J. BacterioL, 159, 306 (1984)〕等をあげることができる。
[0045] 野生型の ArgBは L アルギニンによりフィードバック阻害されるので、該フィードバ ック阻害が低減または解除されて ヽな 、微生物は、アルギニンアナログであるアルギ ニンハイドロキサメートを含有する培地中では、該フィードバック阻害が低減または解 除された微生物と比べて生育速度が遅い。また、 ArgRの活性が低下または喪失して いない微生物は、 L—アルギニンの蓄積によりアルギニン'オペロンの転写が抑制さ れ、 ArgB発現量が低くなり、アルギニンノ、イドロキサメートを含有する培地中では、さ らに生育速度が遅い。
[0046] したがって、上記方法により、本発明の DNAを宿主微生物に導入して得た微生物 に本発明の DNAが導入されて 、ることは、アルギニンノ、イドロキサメートを含有する 培地中での生育速度を、該微生物と宿主微生物とで比較し、該微生物の生育速度 力 宿主微生物と比べて向上していることをもって確認することができる。また、該微 生物からプラスミドまたは染色体を常法により調製し、塩基配列を調べて確認すること ちでさる。
[0047] 該微生物の ArgRの活性が低下または喪失していることは、該微生物および宿主微 生物におけるアルギニン'オペロンの発現をノーザンハイブリダィゼーシヨン法（モレ キユラ一'クロー-ング第 3版)等を用いて比較することにより確認することができる。ノ ーザンハイブリダィゼーシヨン法に用いるプローブは、アルギニン'オペロンを構成す る遺伝子の塩基配列の一部または全部を有する DNAをあげることができる。例えば 、上記で述べた、 ArgBをコードする DNAを DNAライブラリ一力 選択するために用 V、られる DNAがあげられる。
[0048] また、宿主微生物としてアルギニン'オペロンにレポーター遺伝子を組み込んだ微 生物を用いて、該レポーター遺伝子の発現量を宿主微生物と比較して確認すること ちでさる。
本発明の微生物は、本発明の DNAを有し、 ArgRの活性が低下または喪失した微 生物であればいずれの微生物であってもよいが、本発明の微生物を L オル二チン の製造に用いる場合は、 L—アルギニンの生合成経路上の酵素であるオル-チン力 ルバモイルトランスフェラーゼ（EC:2.1.3.3、以下、 ArgFという）の活性が親株と比べて 低下または喪失して 、る微生物であることが好ま 、。 ArgF活性が親株と比べて低 下または喪失した株は、 ArgBおよび ArgRへ変異を導入する場合と同様に、突然変 異処理により得てもょ 、し、 ArgBや ArgRに部位突然変異を導入する方法と同様な方 法を用いて ArgFをコードする DNAに塩基の置換、欠失または付加等を行って得ても よい。なお、 ArgFをコードする DNAは公知であり、例えば DDBJ/GenBank/EMBLに 記載の塩基配列情報を用いることができる。 ArgFをコードする DNAとしては例えば、 配列番号 31で表される塩基配列を有する DNAをあげることができる。
[0049] また、本発明の微生物を L—シトルリンの製造に用いる場合は、 L—アルギニンの生 合成経路上の酵素であるアルギ-ノコハク酸シンターゼ（EC:6.3.4.5、以下、 ArgGと
V、う）の活性が親株と比べて低下または喪失して 、る微生物であることが好ま 、。 A rgG活性が親株と比べて低下または喪失した株は、 ArgBおよび ArgRへ変異を導入 する場合と同様に、突然変異処理により得てもよいし、 ArgBや ArgRに部位突然変異 を導入する方法と同様な方法を用いて ArgGをコードする DNAに塩基の置換、欠失 または付加等を行って得てもよい。なお、 ArgGをコードする DNAは公知であり、例え ば DDBJ/GenBank/EMBLに記載の塩基配列情報を用いることができる。 ArgGをコー ドする DNAとしては例えば、配列番号 32で表される塩基配列を有する DNAをあげ ることがでさる。
[0050] 本発明の微生物を培地に培養し、培養物中に L アルギニン、 L オル-チンまた は L シトルリンを生成、蓄積させ、 L アルギニン、 L オル-チンまたは L シトル リンを採取することにより、 L アルギニン、 L オル-チンまたは L シトルリンを製 造することができる。
本発明の微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方 法であれば!/、ずれの方法でもよ!/、。
[0051] 培地としては、本発明の微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有 し、微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを 用いてもよい。
炭素源としては、本発明の微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラ クトース、スクロース、マルトース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン 加水分解物等の炭水化物、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸、エタノール、プロパノ ール等のアルコール類等を用いることができる。
[0052] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、炭酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカ一、カゼイン加水分 解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いるこ とがでさる。
無機塩としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸マグネシウム、 硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシ ゥム等を用いることができる。
[0053] その他、必要に応じて、ピオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄 養源をカ卩えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーンスティ 一プリカ一、カザミノ酸等で代用することもできる。
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は 20 〜42°Cが好ましぐ 30〜40°Cがさらに好ましい。培地の pHは 5〜9の範囲で、中性 付近に維持することが好ましい。培地の pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アル カリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、 pH緩衝液等を用いて行う。
[0054] 本発明の微生物の作製に用いた本発明の組換え体 DNAが、誘導性のプロモータ 一を有している場合は、必要に応じて、該プロモーターに適したインデューサーを培 地に添カ卩してもよい。例えば、組換え体 DNAとして、 プロモーターを有する組換え 体 DNAを用いた場合は、イソプロピル一 β—D チォガラタトピラノシド等を培地に 添カ卩してもよぐ imプロモーターを有する組換え体 DNAを用いた場合はインドール アクリル酸等を培地に添加してもよ 、。
[0055] 培養期間は通常 1〜6日間であり、培養物中に L—アルギニン、 L—オル-チンまた は Lーシトルリンが生成、蓄積する。
培養終了後、培養物力ゝら菌体などの沈殿物を除去し、活性炭処理、イオン交換榭 脂処理などの公知の方法を併用することにより、培養物中に蓄積した L アルギニン
、 L オル-チンまたは Lーシトルリンを回収することができる。
[0056] 以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは ない。
実施例 1
[0057] ArgBアミノ酸置換用プラスミドの造成
(1)相同組換え用ベクターの調製
カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を有するプラスミド PHSG299 [Gene, 6 1, 63 (1987)〕を E^Iで処理し、切断部位に Bacillus subtilisに由来するレバンシユーク ラーゼ遺伝子 2 ^を含む 2.6キロベースペア（以下、 kbと略す）の DNA断片〔Mol. Mi crobiol, 6, 1195 (1992)〕を連結し、プラスミド pESB30を得た。
[0058] pESB30¾-BamHI (宝酒造社製）で処理し、ァガロース ·ゲル電気泳動し、 GENECLE AN Kit(BIO 101社製)を用いて抽出、精製した。得られた DNA断片の両末端を DN Aブランティングキット（DNA Blunting Kit,宝酒造社製）を用い、添付のプロトコール に従って平滑化した。平滑化した DNA断片をフエノール'クロ口ホルムで処理し、こ れをエタノール沈殿に供して濃縮した後、 Taqポリメラーゼ（Roche Diagnosis社製）お よび dTTP存在下で 70°C、 2時間反応させ、 3'末端にチミンを 1塩基付加して、プラス ミド PESB30- Tを調製した。
(2)第 26番目のァラニンがパリンに置換された ArgBをコードする DNAの調製 配列番号 30で表される塩基配列の第 19〜38番目の塩基配列を有する DNA (配 列番号 13で表される塩基配列からなる DNA)および配列番号 30の第 1027〜104 7番目の塩基配列に相補的な配列を有する DNA (配列番号 14で表される塩基配列 カゝらなる DNA)を DNA合成機を用いて合成した。
[0059] なお、配列番号 30で表される塩基配列の第 451〜1332番目の塩基配列は、コリ ネバクテリゥム ·ダルタミカムの ArgBである配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する ポリペプチドをコードする領域である。該領域の塩基配列を配列番号 2として示す。 また、配列番号 2で表される塩基配列の 77番目のシトシンをチミジンに置換した配 列番号 4で表される塩基配列（配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 26番目のァラニ ンがバリンに置換された、配列番号 3で表されるアミノ酸配列をコードする）の 68〜89 番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる DNA (配列番号 15で表される塩基配 列からなる DNA)、および配列番号 4で表される塩基配列の 65〜87番目の塩基配 列からなる DNA (配列番号 16で表される塩基配列カゝらなる DNA)を DNA合成機を 用いて合成した。
[0060] 斎藤らの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)〕に準じてコリネバタテリゥム
'ダルタミカム ATCC13032株の染色体 DNAを調製し、該染色体 DNAを铸型とし、配 列番号 13で表される塩基配列力 なる DNAと配列番号 15で表される塩基配列から なる DNAとの組み合わせ、および配列番号 14で表される塩基配列からなる DNAと 配列番号 16で表される塩基配列力もなる DNAの組み合わせをそれぞれプライマー セットとし、 Pfo turbo DNAポリメラーゼ（ストラタジーン社製）および添付のバッファー を用いて 2種類の PCRを行った。該 PCRにより得られた 2つの約 0.5kbの PCR産物を それぞれァガロース 'ゲル電気泳動し、 GENECLEAN Kit (BIO 101社製）を用いて抽 出、精製した。
[0061] さらに、両精製物を铸型とし、配列番号 13で表される塩基配列力もなる DNAと配 列番号 14で表される塩基配列からなる DNAをプライマーセットとして PCRを行った。 得られた PCR産物をァガロース ·ゲル電気泳動した後、 GENECLEAN Kitを用いて抽 出、精製し、約 l.Okbの DNA断片を得た。該 DNA断片の塩基配列をシークェンサ一 を用いて決定し、該 DNA断片は配列番号 4で表される塩基配列を有して 、ることを 確認した。
(3)第 31番目のメチォニン力パリンに置換された ArgBをコードする DNAの調製 配列番号 2で表される塩基配列の 91番目のアデニンをグァニンに置換した配列番 号 10で表される塩基配列（配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 31番目のメチォ二 ンカ Sパリンに置換された配列をコード)の 83〜102番目の塩基配列に相補的な塩基 配列からなる DNA (配列番号 17で表される塩基配列力もなる DNA)および配列番 号 10で表される塩基配列の 79〜99番目の塩基配列からなる DNA (配列番号 18で 表される塩基配列カゝらなる DNA)を DNA合成機を用いて合成した。
[0062] 配列番号 13で表される塩基配列からなる DNAと配列番号 17で表される塩基配列 を有する DNAとの組み合わせ、および配列番号 14で表される塩基配列を有する D NAと配列番号 18で表される塩基配列からなる DNAの組み合わせをそれぞれプラ イマ一セットとして用いる以外は（2)と同様の操作を行ない、約 l.Okbの DNA断片を 取得した。
得られた DNA断片の塩基配列をシークェンサ一を用いて決定したところ、該 DNA 断片は、配列番号 10で表される塩基配列を有して ヽることを確認した。
(4) ArgBの一アミノ酸置換用プラスミドの造成
上記（2)および（3)で得られた、配列番号 4および 10で表される塩基配列を有する DNA断片を、それぞれ Taq polymerase (ベーリンガーマンハイム社製）および dATP 存在下で 72°C、 10分間処理し、それぞれの DNA断片の 3'末端にアデニンを 1塩基 付加した。
[0063] プラスミド pESB30-T、および配列番号 4または 10で表される塩基配列を有する DN Aを有する DNA断片にアデニン残基を付加した DNA断片をそれぞれ混合し、ライ ゲーシヨンキット Ver.l (宝酒造社製)を用い、リガーゼ反応を行った。反応産物を用い 、常法により Escherichia coH DH5 a tt (東洋紡社製)を形質転換した。該菌株を、 20 μ g/mlのカナマイシンを含む LB寒天培地〔10gのバタトトリプトン (ディフコ社製）、 5g の酵母エキス (ディフコ社製）、 10gの塩ィ匕ナトリウム、 16gのバタトァガー（ディフコ社製 )を水 1Lに含み、 pH7.0に調整された培地〕上で培養し、形質転換株を選択した。該 形質転換株を 20 g/mlのカナマイシンを含む LB培地を用いて終夜培養し、得られた 培養液からアルカリ SDS法 (モレキュラー ·クロー-ング第 3版）によりプラスミドを調製 した。該プラスミドの塩基配列をシークェンサ一を用いて決定し、それぞれのプラスミ ドに、 pESB30_Tに配列番号 4または 10で表される塩基配列を有する DNAがそれぞ れ揷入されて 、ることを確認した。
[0064] これらのプラスミドのうち配列番号 4で表される塩基配列を有する DNAを有するプ ラスミドを pEargB26と命名し、配列番号 10で表される塩基配列を有する DNAを有す るプラスミドを pEargB31と命名した。
(5) ArgBの二アミノ酸置換用プラスミドの造成
配列番号 13で表される塩基配列からなる DNAと配列番号 15で表される塩基配列 力もなる DNAとの組み合わせ、および配列番号 14で表される塩基配列力もなる DN Aと配列番号 16で表される塩基配列力もなる DNAとの組み合わせをそれぞれプライ マーセットとして用い、 pEargB31を铸型とする以外は、上記（2)と同様な操作を行な い、約 l.Okbの DNA断片を得た。該 DNA断片の塩基配列をシークェンサ一を用い て決定したところ、該 DNA断片は、配列番号 12で表される塩基配列を有していた。
[0065] 配列番号 12で表される塩基配列を有する DNAを用いる以外は、上記 (4)と同様 の方法を用いて、 PESB30-Tに配列番号 12で表される塩基配列を有する DNAが組 み込まれたプラスミド pEargB2631を得た。
なお、配列番号 12で表される DNAは、配列番号 11で表されるアミノ酸配列をコー ドする DNAであって、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の第 26番目のァラニンおよ び第 31番目のメチォニンがそれぞれパリンに置換されたアミノ酸配列をコードする D NAである。
実施例 2
[0066] 染色体 ArgBへのアミノ酸置換の導入
(1)野生株の染色体上の ArgBへのアミノ酸置換の導入
実施例 1で調製したプラスミド pEargB26、 pEargB31および pEargB2631をそれぞれ用 い、レストらの方法〔Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541 (1999)〕に準じて電気穿孔法 によりコリネバタテリゥム.ダルタミカム ATCC13032株を形質転換し、カナマイシン耐性 株を選択した。カナマイシン耐性株の中の 1株カゝら染色体を調製し、サザンハイプリ ダイゼーシヨン法 (モレキュラー 'クロー-ング第 3版）により調べた結果、それぞれの 株の染色体に pEargB26、 pEargB31および pEargB2631が Campbellタイプの相同組換 えにより組み込まれていることが確認された。このような株では、染色体上に元来存 在している ArgBをコードする DNAと本発明の DNAが染色体上に近接して存在して おり、その間で 2回目の相同組換えが起こりやすくなつている。
[0067] ^がコードするレバンシユークラ一ゼはショ糖を自殺基質に転換するので、 sacB を有する微生物はショ糖を含有する培地において生育できない。しかし、元来染色 体上に存在している ArgBをコードする DNAと本発明の DNAとの間で 2回目の相同 組換えが起こった株では、いずれかの DNAが^ Sとともに欠失するので、ショ糖を含 有する培地にぉ 、ても生育することができる。元来染色体上に存在して 、る ArgBをコ ードする DNAが欠失した場合は、本発明の DNAが、宿主微生物の染色体上に元 来存在していた ArgBをコードする DNAと置換された微生物を取得することができる。
[0068] このことを利用して、上記形質転^ を Sue寒天培地〔100gのショ糖、 7gの肉エキス 、 10gのペプトン、 3gの塩化ナトリウム、 5gの酵母エキス（ディフコ社製）、および 15gの バタトァガー（ディフコ社製）を水 1Lに含み pH7.2に調整した培地〕上に塗布し、 30°C で 1日間培養して生育するコロニーを選択した。
このようにして得られたコロニーより染色体 DNAを調製し、該染色体 DNAを铸型と し、配列番号 13で表される塩基配列からなる DNAと配列番号 14で表される塩基配 列からなる DNAをプライマーセットとし、 Pfo turbo DNAポリメラーゼ（ストラタジーン社 製）と添付のバッファーを用いて PCRを行い、 PCR産物の塩基配列をシークェンサ 一を用いて決定した。
[0069] このようにして pEargB26を導入した株の中力 染色体上の ArgBをコードする DNA が配列番号 4で表される塩基配列を有する DNAにより置換されている株を取得し、 該株を B26株と命名した。
同様に、 pEargB31を導入した株の中力 染色体上の ArgBをコードする DNAが配 列番号 10で表される塩基配列を有する DNAにより置換されて 、る株を取得し、該株 を B31株と命名した。
[0070] また、 pEargB2631を導入した株の中力 染色体上の ArgBをコードする DNAが配列 番号 12で表される塩基配列を有する DNAにより置換されている株を取得し、該株を B2631株と命名した。
(2) ArgR内部配列欠失用プラスミドの造成 コリネバタテリゥム.ダルタミカム ATCC13032株の染色体 DNAを、斎藤らの方法〔Bi ochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)〕により調製した。
[0071] 配列番号 19で表される塩基配列（コリネバクテリゥム ·ダルタミカムの ArgRをコード する DNAの塩基配列）の第 43〜62番目の塩基配列からなる DNA (配列番号 20で 表される塩基配列力もなる DNA)、配列番号 19で表される塩基配列の第 1421〜14 40番目の塩基配列の相補配列からなる DNA (配列番号 21で表される塩基配列から なる DNA)、配列番号 19で表される塩基配列の第 539〜559番目の塩基配列にタ グ配列を付加してなる塩基配列の相補配列力もなる DNA (配列番号 22で表される 塩基配列からなる DNA)および配列番号 19で表される塩基配列の第 941〜961番 目の塩基配列にタグ配列を付加してなる塩基配列からなる DNA (配列番号 23で表 される塩基配列カゝらなる DNA)を DNA合成機を用いて合成した。
[0072] なお、配列番号 19で表される塩基配列はコリネバクテリウム'ダルタミカム ArgRをコ ードする DNAの塩基配列を含む塩基配列である。 調製した染色体 DNAを铸型と し、配列番号 20で表される塩基配列からなる DNAと配列番号 22で表される塩基配 列からなる DNAとの組み合わせ、および配列番号 21で表される塩基配列力もなる D NAと配列番号 23で表される塩基配列からなる DNAとの組み合わせをそれぞれプラ イマ一セットとし、 Pfo turbo DNAポリメラーゼ（ストラタジーン社製）および添付のバッ ファーを用いて 2種類の PCRを行った。該 PCRにより得られた 2つの約 0.5kbの PCR 産物をそれぞれァガロース ·ゲル電気泳動し、 GENECLEAN Kit (BIO 101社製）を用 いて抽出、精製した。
[0073] さらに、両精製物を铸型とし、配列番号 20で表される塩基配列力 なる DNAと配 列番号 21で表される塩基配列からなる DNAをプライマーセットとし、 Pfo turbo DNA ポリメラーゼ (ストラタジーン社製)および添付のノ ッファーを用いて PCRを行った。得 られた PCR産物をァガロース ·ゲル電気泳動した後、 GENECLEAN Kit (BIO 101社 製)を用いて抽出、精製し、 ArgRをコードする配列番号 19で表される塩基配列の第 5 60〜940番目の領域が欠失した、約 l.Okbの DNA断片を取得した。
[0074] この断片を実施例 1記載の方法に準じてプラスミド pESB30-Tに組み込んでプラスミ ド pEdd-argRを得た。 (3) ArgR内部配列欠失株の造成
プラスミド pEdeト argRを用いる以外は上記（1)と同様の方法により、コリネバクテリウ ムグルタミカム株 ATCC13032株の染色体上の ArgRをコードする DNAが配列番号 1 9で表される塩基配列の第 560〜940番目の領域が欠失した DNAで置換された株 を取得した。得られた株を R株と命名した。
(4) ArgR内部配列欠失株の染色体上の ArgBへのアミノ酸置換の導入
宿主として R株を用い、プラスミドとして pEargB26、 pEargB31および pEargB2631を用 いる以外は、上記（1)と同様の方法により、染色体上の ArgBをコードする DNAが、 配列番号 4、 10または 12で表される塩基配列を有する DNAで置換され、かつ染色 体上の ArgRをコードする DNAが配列番号 19で表される塩基配列の第 560〜940 番目の領域が欠失した DNAで置換された株を取得した。それぞれの株を RB26株、 R B31株および RB2631株と命名した。
実施例 3
[0075] ArgBアミノ酸置^ ¾による L—アルギニン、 L—オル-チンおよび L—シトルリン生産 試験
実施例 2で取得した B26株、 B31株、 B2631株、 R株、 RB26株、 RB31株および RB263 1株を BY寒天培地（7gの肉エキス、 10gのペプトン、 3gの塩化ナトリウム、 5gの酵母ェ キス、 15gのバタトァガーを水 1Lに含み pH7.2に調整した培地）で 30°C、 24時間培養し た。
[0076] BY寒天培地上に生育した菌体をそれぞれ種培地（25gのショ糖、 20gのコーンスティ 一プリカ一、 20gのペプトン、 10gの酵母エキス、 0.5gの硫酸マグネシウム 7水和物、 2g のリン酸二水素カリウム、 3gの尿素、 8gの硫酸アンモ-ゥム、 lgの塩化ナトリウム、 20m gのニコチン酸、 10mgの硫酸鉄 7水和物、 10mgのパントテン酸カルシウム、 lmgの硫酸 亜鉛 7水和物、 lmgの硫酸銅 5水和物、 lmgのチアミン塩酸塩、 100 μ gのピオチンを 水 1Lに含み水酸ィ匕ナトリウム水溶液により pH7.2に調整後、炭酸カルシウムを 10gカロ えた培地) 6mlを含む試験管に植菌し、 32°Cで振盪しながら 24時間培養した。
[0077] 得られた種培養液 2mLを、それぞれ本培養培地（60gのグルコース、 5gのコーンステ ィープリカ一、 30gの硫酸アンモ-ゥム、 8gの塩化カリウム、 2gの尿素、 0.5gのリン酸二 水素カリウム、 0.5gのリン酸水素二カリウム、 lgの硫酸マグネシウム 7水和物、 lgの塩 ィ匕ナトリウム、 20mgの硫酸鉄 7水和物、 20mgのニコチン酸、 20mgの j8—ァラニン、 10 mgの硫酸マンガン 5水和物、 lOmgのチアミン塩酸塩、 200 μ gのピオチンを水 1Lに含 み、水酸ィ匕ナトリウム水溶液により PH7.7に調整後、炭酸カルシウムを 30g加えた培地) 20mLを含むバッフルつきフラスコに植菌し、 32°Cで振盪しながら 48時間培養した。
[0078] コリネバクテリウム'ダルタミカム ATCC13032株を用いて同様の操作を行い、これを コントロールとした。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中の L アルギニン、 L オル-チ ンおよび L シトルリンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（HPLC)により定量した 。結果を第 1表に示す。
[0079] [表 1] 第 1表
-アルギニ ：ン L-オル二チン L -シトルリン
株 OD660nmし
(g/l) (g/l) (g/l)
ATCC 13032 48 0.0 0.0 0.0
B26 44 0.0 0.0 0.0
B31 46 0.0 0.0 0.0
B2631 45 0.0 0.0 0.0
R 45 0.0 0.0 0.0
RB26 43 3.0 0.2 1.0
RB31 46 2.0 0.1 0.8
B2631 38 4.5 0.3 2.0
[0080] 第 1表に示すとおり、 ATCC13032株 (コントロール)、 B26株、 B31株、 B2631株および R株では L アルギニン、 L オル-チンおよび L シトルリンの生産は認められなか つた。これに対して、 RB26株、 RB31株および RB2631株では、 L アルギニン、 L ォ ル-チンおよび Lーシトルリンの生産が認められた。
実施例 4
[0081] ArgBにアミノ酸置換を有する L オル-チン生産株の造成
( 1) ArgF内部配列欠失用プラスミド造成用の DNA造成
配列番号 31で表される塩基配列の第 21〜43番目の塩基配列にタグ配列を付カロ した塩基配列力 なる DNA (配列番号 24で表される塩基配列からなる DNA)および 配列番号 31で表される塩基配列の第 1366〜1385番目の塩基配列にタグ配列を 付加した塩基配列の相補配列力もなる DNA (配列番号 25で表される塩基配列から なる DNA)を DNA合成機を用いて合成した。
[0082] 配列番号 31で表される塩基配列は、コリネバクテリウム'ダルタミカムの ArgFをコー ドする DNAの塩基配列を含む塩基配列である。
(2) ArgF内部配列欠失用プラスミドの造成 1
斎藤らの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)〕に準じてコリネバタテリゥム •グルタミカム ATCC13032株の染色体 DNAを調製した。
[0083] 該染色体 DNAを铸型とし、配列番号 24で表される塩基配列力 なる DNAと配列 番号 25で表される塩基配列からなる DNAをそれぞれプライマーセットとし、 Pfo turbo DNAポリメラーゼ (ストラタジーン社製）および添付のバッファーを用い PCRを行った 。 PCRにより得られた約 1.4kbの DNA断片を、 EamHI (宝酒造社製)で処理し、ァガ ロース'ゲル電気泳動し、 GENECLEAN Kit(BIO 101社製)を用いて抽出、精製した。 得られた DNA断片と、あら力じめ EamHI〖こよって切断した pUC119(宝酒造社製)とを 混合し、ライゲーシヨンキット Ver. l (宝酒造社製)を用い、リガーゼ反応を行った。
[0084] 該反応産物を用い、モレキュラー 'クローユング第 3版記載の方法に準じてェシエリ ヒア 'コリ DH5 a株 (東洋紡社製)を形質転換した。該菌株を、 50 μ g/mlのアンピシリン を含む LB寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を 50 g/ml のアンピシリンを含む LB培地を用い終夜培養し、得られた培養液からアルカリ SDS法 (モレキュラー 'クロー-ング第 3版)記載の方法に準じてプラスミドを調製した。該プラ スミドを telにより切断した後、ライゲーシヨンキット Ver. l (宝酒造社製)を用いリガ一 ゼ反応を行って自己環状化させ、ェシエリヒア'コリ DH5ひ株を形質転換し、得られた 形質転換体力もプラスミドを調製した。該プラスミドの構造を制限酵素を用いて調べ たところ、該プラスミドは、 ArgFをコードする DNAにおいて 369塩基対が欠失した D NA断片を含むことを確認した。
(3) ArgF内部配列欠失用プラスミドの造成 2
このプラスミドを铸型とし、配列番号 24で表される塩基配列力もなる DNAおよび配 列番号 25で表される塩基配列からなる DNAをプライマーセットとし、 Pfo turbo DNA ポリメラーゼ (ストラタジーン社製）および添付のバッファーを用いて PCRを行い、約 1. Okbの DNA断片を得た。該 DNA断片を Taq DNA polymerase (ベーリンガーマンハイ ム社製)および dATP存在下で 72°C、 10分間反応させ、 3'末端にアデニンを 1塩基付 加した。実施例 1で調製した PESB30- Tおよびアデニンを付カ卩した DNA断片およびラ ィゲーシヨンキット Ver.l (宝酒造社製)を用い、リガーゼ反応を行った。得られたブラ スミドを pEargFと命名した。
(4)ArgBにアミノ酸置換を有する ArgF内部配列欠失株の造成
宿主として B26株、 B31株、 R株、 RB26株、 RB31株、および ATCC13032株を用い、 プラスミドとして pEargFを用いる以外は実施例 2 (1)と同様の操作を行 、、それぞれの 株について、染色体上の ArgFをコードする DNA内力 該 DNA内の 369塩基対が欠 失した DNAに置換された株を得、それぞれ FB26株、 FB31株、 FR株、 FRB26株、 FR B31株および F株と命名した。
実施例 5
ArgBにアミノ酸置換を有する ArgF内部配列欠失株による L-オル-チン生産試験 実施例 4で調製した FB26株、 FB31株、 FR株、 FRB26株、 FRB31株および F株ならび に ATCC13032株を、 BY寒天培地で 30°Cで 24時間培養し、各菌株をそれぞれ種培地 (25gのグルコース、 0.5gのリン酸二水素カリウム、 1.5gのリン酸水素二カリウム、 0.5gの 硫酸マグネシウム、 20gのペプトン、 3gの尿素、 50 gのピオチン、 0.3gの L アルギ- ンを水 1Lに含み、炭酸カルシウムを 10g加えた培地） 6mlを含む試験管に植菌し、 32 °Cで振盪しながら 24時間培養した。得られた種培養液 2mLを、それぞれ本培養培地 ( 100gのグルコース、 30gの硫酸アンモ-ゥム、 0.6gの硫酸マグネシウム、 0.5gのリン酸 二水素カリウム、 0.25gの L アルギニン、 16mgの硫酸鉄 7水和物、 16mgの硫酸マン ガン 5水和物、 4.9mgの硫酸亜鉛 7水和物、 4.9mgの硫酸銅 5水和物、 16mgの塩化力 ルシゥム、 16mgの j8—ァラニン、 8mgのチアミン塩酸塩、 180 /z gのピオチン、 16gのコ ーンスティープリカ一を水 930mLに含み水酸ィ匕ナトリウム水溶液により pH7.2に調整 後、炭酸カルシウムを 30g加えた培地） 20mLを含むバッフルつきフラスコに植菌し、 3 2°Cで振盪しながら 48時間培養した。 [0086] 遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中の L オル-チンの蓄積量を高 速液体クロマトグラフィー（HPLC)により定量した。結果を第 2表に示す。
[0087] [表 2] 第 2表
オル二チン
株 OD660nmし-
(g/l)
ATCC1 3032 49 0.0
F 22 5.0
FB26 22 5.3
FB31 21 5.2
FR 22 5.3
FRB26 21 6.2
FRB31 20 6.0
[0088] 第 2表力も明らかなように、配列番号 4で表される塩基配列を有する DNAを有し、 かつ ArgFおよび ArgR内に欠失を有する FRB26株および配列番号 10で表される塩基 配列を有する DNAを有し、かつ ArgFおよび ArgR内に欠失を有する FRB31株による L オル-チンの生産量は他の株による L オル-チンの生産量と比べて明らかに高 かった。
実施例 6
[0089] ArgBの第 26番目のァラニンがロイシンまたはイソロイシンに置換した ArgR内部配列 欠失株の造成
(l)ArgBの一アミノ酸置換用プラスミドの造成
配列番号 2で表される塩基配列の第 76〜78番目の領域を ctgに置換した配列番号 6で表される塩基配列（配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 26番目のァラニンがロイ シンに置換された、配列番号 5で表されるアミノ酸配列をコード）の 68〜89番目の塩 基配列に相補的な塩基配列力 なる DNA (配列番号 26で表される塩基配列力 な る DNA)、および配列番号 6で表される塩基配列の 65〜87番目の塩基配列からなる DNA (配列番号 27で表される塩基配列カゝらなる DNA)を DNA合成機を用いて合 成した。
[0090] 同様に、配列番号 2で表される塩基配列の第 76〜78番目の領域を ateに置換した 配列番号 8で表される塩基配列（配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 26番目のァラ ニンがイソロイシンに置換された、配列番号 7で表されるアミノ酸配列をコード）の 68 〜89番目の塩基配列に相補的な塩基配列力もなる DNA (配列番号 28で表される 塩基配列からなる DNA)、および配列番号 8で表される塩基配列の 65〜87番目の 塩基配列からなる DNA (配列番号 29で表される塩基配列力 なる DNA)を DNA合 成機を用いて合成した。
[0091] 実施例 1の（2)において、配列番号 15および 16で表される塩基配列力もなる DNA のかわりに配列番号 26および 27で表される塩基配列からなる DNAを用いる以外は 同様の操作を行な!ヽ、配列番号 6で表され塩基配列を有する DNAを有する約 l.Okb の DNA断片を取得した。また、実施例 1の（2)において、配列番号 15および 16で表 される塩基配列力もなる DNAのかわりに配列番号 28および 29で表される塩基配列 力 なる DNAを用いる以外は同様の操作を行な 、、配列番号 8で表され塩基配列を 有する DNAを有する約 l.Okbの DNA断片を取得した。
[0092] 実施例 1の（4)にお 、て、配列番号 4または 10で表される塩基配列を有する DNA を有する DNA断片のかわりに、配列番号 6または 8で表される塩基配列を有する DN Aを有する DNA断片を用いる以外は同様の操作を行ない、プラスミド pESB30-Tに、 配列番号 6または 8で表される塩基配列を有する DNAが組み込まれたプラスミドを取 得した。それぞれのプラスミドを pEargB26Lおよび pEargB26Iと命名した。
(2) ArgR内部配列欠失株への ArgB—アミノ酸置換の導入
宿主として R株を用い、プラスミドとして pEargB26Lおよび pEargB26Iを用いる以外は 、実施例 2 (1)と同様の操作を行ない、 R株において染色体上の ArgBをコードする D NAが配列番号 6で表される塩基配列を有する DNAに置換された株および染色体 上の ArgBをコードする DNAが配列番号 8で表される塩基配列を有する DNAに置換 された株をそれぞれ取得した。それぞれの株を、 RB26L株、 RB26I株と命名した。
(3) ArgBアミノ酸置換および ArgR内部配列欠失株による L—アルギニン、 L—オル- チンおよび L シトルリン生産試験
RB26株、 RB26L株および RB26I株を用いる以外は、実施例 3と同様の方法でこれら の株の L アルギニン、 L オル-チンおよび L シトルリンの生産性を調べた。 [0093] 結果を第 3表に示す。
[0094] [表 3] 第 3表
アルギ:ニン L-オル二チン L-シトルリン
株 OD660nmし-
(g/l) (g/l) (g/l)
ATCC 13032 48 0.0 0.0 0.0
RB26 43 3.0 0.2 1.0
RB26し 41 3.3 0.3 1.2
RB26I 41 4.1 0.4 1.8
[0095] 第 3表力も明らかなように、配列番号 6で表される塩基配列を有する DNAを有する RB26L株および配列番号 8で表される塩基配列を有する DNAを有する RB26I株のい ずれも配列番号 4で表される塩基配列を有する DNAを有する RB26と同様に、 Lーァ ルギニン、 L—オル-チンおよび Lーシトルリンを生産した。なお、 RB26L株および RB 261株によるこれらのアミノ酸の生産量は、 RB26株による生産量より高力つた。
実施例 7
[0096] ArgBアミノ酸置換および ArgG内部配列欠失株による L シトルリン生産
コリネバタテリゥム.ダルタミカムの ArgGをコードする DNAの塩基配列を含む配列番 号 32で表される塩基配列をもとにプライマーを合成し、コリネバタテリゥム'ダルタミ力 ム ATCC13032株の染色体 DNAを铸型として PCRを行 、、 ArgGをコードする DNA において約 400塩基対が欠失した DNA断片を含むプラスミドを構築する。
[0097] 該プラスミド力 ArgGをコードする DNAにお!/、て約 400塩基対が欠失した DNA断 片を調製し、該 DNA断片の 3'末端にアデニンを 1塩基付加する。実施例 1で調製し た pESB30- T、アデニンを付カ卩した DNA断片およびライゲーシヨンキット Ver.l (宝酒 造社製)を用いてリガーゼ反応を行って得られるプラスミドを pEargGとする。
以上の方法は実施例 4記載の方法に準じて行なうことができる。
[0098] 宿主として B26株、 B31株、 R株、 RB26株、 RB31株、および ATCC13032株を用い、 プラスミドとして pEargGを用いる以外は実施例 2 (1)と同様の操作を行 ヽ、それぞれ の株について、染色体上の ArgGをコードする DNA内力 該 DNA内の約 400塩基 対が欠失した DNAに置換された株を調製し、それぞれ GB26株、 GB31株、 GR株、 G RB26株、 GRB31株および G株とする。
[0099] GB26株、 GB31株、 GR株、 GRB26株、 GRB31株および G株ならびに ATCC13032株 を、 BY寒天培地で 30°Cで 24時間培養し、各菌株をそれぞれ種培地（25gのダルコ一 ス、 0.5gのリン酸二水素カリウム、 1.5gのリン酸水素二カリウム、 0.5gの硫酸マグネシゥ ム、 20gのペプトン、 3gの尿素、 50 gのピオチン、 0.3gの L—アルギニンを水 1Lに含 み、炭酸カルシウムを 10g加えた培地) 6mlを含む試験管に植菌し、 32°Cで振盪しな がら 24時間培養する。培養により得られる種培養液 2mLを、それぞれ本培養培地 (10 0gのグルコース、 30gの硫酸アンモ-ゥム、 0.6gの硫酸マグネシウム、 0.5gのリン酸二 水素カリウム、 0.25gの L アルギニン、 16mgの硫酸鉄 7水和物、 16mgの硫酸マンガン 5水和物、 4.9mgの硫酸亜鉛 7水和物、 4.9mgの硫酸銅 5水和物、 16mgの塩化カルシ ゥム、 16mgの j8—ァラニン、 8mgのチアミン塩酸塩、 180 /z gのピオチン、 16gのコーン スティープリカ一を水 930mLに含み水酸ィ匕ナトリウム水溶液により pH7.2に調整後、 炭酸カルシウムを 30gカ卩えた培地） 20mLを含むバッフルつきフラスコに植菌し、 32°C で振盪しながら 48時間培養する。
[0100] 遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中の Lーシトルリンの蓄積量を高速 液体クロマトグラフィー（HPLC)により定量する。
産業上の利用可能性
[0101] 本発明によれば、改変された N ァセチルグルタミン酸キナーゼおよびそれらをコ ードする DNAが得られ、該 DNAを有する微生物を用いることにより、 L—アルギニン 、 L オル-チンまたは L シトルリンを効率的に生産することができる。
配列表フリ —テキスト
[0102] 配列番号 13 - -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 14- -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 15 - -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 16 - -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 17- -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 18 - -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 20- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 21- -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 22- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 23- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 24- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 25- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 26- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 27- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 28- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 29- -人工配列の説明 ：合成 DNA

Claims

請求の範囲
[1] (i)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 20〜38番目のアミノ酸配列中 の 1以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、または
(ii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 20〜38番目のアミノ酸配列中 の 1以上のアミノ酸が置換され、かつ第 1〜19番目または 39〜294番目のアミノ酸配 列中の 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
を有し、かつ N—ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
[2] (i)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 26〜31番目のアミノ酸配列中 の 1以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、または
(ii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 26〜31番目のアミノ酸配列中 の 1以上のアミノ酸が置換され、かつ第 1〜25番目または第 32〜294番目のアミノ酸 配列中の 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
を有し、かつ N—ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
[3] (i)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 26または 31番目のアミノ酸が 置換されたアミノ酸配列、
(ii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端力も第 26および 31番目のアミノ酸が 置換されたアミノ酸配列、または
(iii)上記 (i)または (ii)のアミノ酸配列にぉ 、て、置換された部位以外の 1以上のアミ ノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
を有し、かつ N—ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
[4] (i)配列番号 3、 5、 7、 9および 11で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列、
(ii)配列番号 3、 5および 7で表されるアミノ酸配列力 選ばれるアミノ酸配列にぉ 、て 、それぞれの配列の第 26番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列中の 1以上のアミノ酸が 欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、
(iii)配列番号 9で表されるアミノ酸配列において、第 31番目のアミノ酸以外のァミノ 酸配列中の 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
(iv)配列番号 11で表されるアミノ酸配列において、第 26および 31番目のアミノ酸以 外のアミノ酸配列中の 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列 を有し、かつ N ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
[5] 請求項 1〜4のいずれ力 1項に記載のポリペプチドをコードする DNA。
[6] 配列番号 4、 6、 8、 10および 12で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有する
DNA0
[7] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAの塩基配 列と相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ
(i)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 26番目のアミノ酸残基に相応 するアミノ酸残基が Lーァラニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコードする DNA
(ii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 31番目のアミノ酸残基に相応 するアミノ酸残基が L メチォニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコードする DN A、または
(iii)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 26番目のアミノ酸残基に相応 するアミノ酸残基が Lーァラニン以外のアミノ酸であり、かつ第 31番目のアミノ酸残基 に相応するアミノ酸残基が L メチォニン以外のアミノ酸であるポリペプチドをコード する DNA
であり、かつ N ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードす る DNA。
[8] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 26番目のアミノ酸残基に相応する アミノ酸残基が L—パリン、 L ロイシンまたは L—イソロイシンであり、第 31番目のァ ミノ酸残基に相応するアミノ酸残基カ^ーバリンである、請求項 7記載の DNA。
[9] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAの塩基配 列と相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつ
(i)配列番号 2で表される塩基配列の 5 '末端から第 76〜78番目の領域に相応する 領域がグァニン チミジン チミジン、シトシン チミジンーグァニン、もしくはアデ- ン チミジン シトシンである塩基配列を有する DNA、 (ii)配列番号 2で表される塩基配列の 5'末端力も第 91〜93番目の領域に相応する 領域がグァニン チミジンーグァニンである塩基配列を有する DNA、または
(iii)配列番号 2で表される塩基配列の 5 '末端から第 76〜78番目の領域に相応する 領域がグァニン チミジン チミジン、シトシン チミジンーグァニン、もしくはアデ- ン—チミジン—シトシンであり、かつ第 91〜93番目の領域に相応する領域がグァ- ン チミジン グァニンである塩基配列を有する DNA
であり、かつ N ァセチルグルタミン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードす る DNA。
[10] 請求項 5〜9の 、ずれか 1項に記載の DNAをベクターに組み込んで得られる組換え 体 DNA。
[11] 請求項 10記載の組換え体 DNAを導入して得られる微生物。
[12] 請求項 5〜9の 、ずれか 1項に記載の DNAを有する微生物。
[13] アルギニン 'リブレッサーのアルギニン'オペロンの転写抑制活性が低下または喪失 して 、ることを特徴とする請求項 11または 12記載の微生物。
[14] オル-チン力ルバモイルトランスフェラーゼ活性が低下または喪失して ヽることを特 徴とする請求項 11〜13のいずれか 1項に記載の微生物。
[15] アルギ-ノコハク酸シンターゼ活性が低下または喪失して 、ることを特徴とする請求 項 11〜 14のいずれ力 1項に記載の微生物。
[16] 微生物がコリネバタテリゥム属に属する微生物である、請求項 11〜15のいずれか 1 項に記載の微生物。
[17] 微生物がコリネバタテリゥム 'ダルタミカムに属する微生物である、請求項 11〜16の いずれか 1項に記載の微生物。
[18] 請求項 11〜17のいずれ力 1項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中に Lーァ ルギニン、 L—オル-チンまたは Lーシトルリンを生成、蓄積させ、該培養物から L— アルギニン、 L -オル-チンまたは L -シトルリンを採取することを特徴とする L -アル ギニン、 L -オル-チンまたは L -シトルリンの製造法。
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