WO2006040163A1 - Monoklonaler antikörper gegen frizzled-rezeptoren - Google Patents

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monoclonal antibody
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Hans-Jörg BÜHRING
Brigitte Hojak
Ingrid Albert
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody or fragment thereof which binds specifically or / and selectively to human receptors of the Frizzled (FZD) family. Furthermore, it relates to a hybridoma cell which produces the antibody according to the invention.
  • Another object of the present invention is a method for the detection and / or isolation of receptors of the FZD family or homologues or fragments thereof in a biological sample and a method for Iden ⁇ tification or / and isolation of biological material, the receptors of the FZD family or homologs or fragments thereof. Furthermore, the invention relates to
  • the antibody according to the invention or fragments thereof for the specific and / or selective detection and / or isolation of receptors of the FZD plant, a composition comprising the monoclonal antibody according to the invention or fragments thereof and a kit containing the monoclonal antibody according to the invention or fragments thereof.
  • Frizzled (FZD) receptors are 7-transmembrane-type proteins that have a sequence motif with seven ⁇ -helical domains anchored in the membrane. This motif is typical of the so-called G protein-coupled receptors (GPCRs). Some authors therefore include the Frizzled receptors also to the superfamily of GPCRs; see. for example, Malbon CC (2004), "Frizzleds: new members of the superfamily of G-protein-coupled receptors", Front Biosci., Vol. 9, pages 1048 to 1058. The Frizzled receptors also have a cysteine-rich domain (CRD) at its amino-terminal end.
  • CCD cysteine-rich domain
  • Frizzled receptors are important components of the so-called Wnt (Wingless-Type) signal chain, which is conserved in both vertebrate and invertebrate animals.
  • the most important ligands of the Frizzled receptors are the Wnt proteins, which induce intracellular events via binding to the extracellular part of the Frizzled receptor.
  • members of a further class of cell surface receptors from the family of LDL-receptor-related proteins (LRP) are involved in the uptake and transmission of Wnt signals.
  • the intracellular signal transmission can essentially take place via two different ways.
  • Ligands of Wnt5A Class stimulates signal transduction via the pertussis toxin-sensitive group of heterotrimeric G proteins on the increase in intracellular Ca 2+ concentration and on the RhoA / c-jun-N-terminal kinase signaling pathway (so-called Wnt-Ca 2+ - Path) .
  • Wnt-Ca 2+ - Path RhoA / c-jun-N-terminal kinase signaling pathway
  • signal transmission takes place via another important intracellular signaling protein, ⁇ -catenin (so-called Wnt / ⁇ -catenin pathway).
  • ß-catenin is a transcriptional activator.
  • ⁇ -catenin In the absence of a Wnt signal, part of the intracellular ⁇ -catenin is bound to the cytosolic tail of the so-called cadherin protein, and a further part of the cytosolic ⁇ -catenin is located in a complex of the proteins Axin, APC (FIG. Adenomatous polyposis coli) and GSK-3 ⁇ (glycogen syntase kinase 3).
  • Axin proteins Axin
  • APC FOG. Adenomatous polyposis coli
  • GSK-3 ⁇ glycose kinase 3
  • ⁇ -catenin is phosphorylated by GSK-3ß and thus triggers its own ubiquitinylation and thus degradation in proteasomes. Accordingly, ⁇ -catenin is unstable in the absence of Wnt and can not exercise its function as a transcriptional activator.
  • Frizzled receptors In addition to Wnt, another ligand for Frizzled receptors, named Norrin, has recently been found; see. Niehrs C. (2004), “Norrin and Frizzled: A New Vein for the Eye", Develop- mental Cell, Vol. 6, pages 1 to 20.
  • Frizzled receptors play an important role in the differentiation and organogenesis of embryonic tissues, in oogenesis and cotyledonous development as well as in the self-renewal of stem cells. Consequently, a large number of working groups from the field of basic research is busy with the closer characterization of these receptors.
  • Frizzled receptors also appear to play an important role in a variety of diseases. Thus, these receptors play a key role in carcinogenesis; see. Holcombe RF et al. (2002), “Expression of Wint ligands and Frizzled reeptors in colonic mueosa and in colon Carcinoma", J. Clin. Pathol., Vol. 55 (4), pages 220 to 226, and Karim R. et al ), "The significance of the Wnt pathway in the pathology of human cankers", Pathology 36 (2), pages 120 to 128. It has also been linked to the so-called Norrie disease, an X-linked recessive disorder characterized by degenerative changes in the retina; see. Xu et al.
  • Frizzled receptors are involved in the clinical picture of rheumatoid arthritis; see. Sen et al. (2001), "Blockade of Wnt-5A / frizzled 5 signaling inhibits rheumatoid synoviocyte activation", Arthritis Rheum., Vol. 44 (4), pages 772 to 781.
  • Sen et al. 2001
  • Frizzled 9 is expressed in neural precursor cells in the developing neural tube ", Dev. Genes Evol., Vol. 211 (8-9), pages 453 to 457), or against human FZD-I and FZD-2 (Holcombe RF et al., Supra) "
  • polyclonal antibodies are not available indefinitely and can not be reproduced identically after consumption. Furthermore, polyclonal antibodies are naturally a mixture of different antibodies which are each directed against different antigenic structures of the respective epitope. Consequently, it is not possible by means of polyclonal antibodies to repeatedly identify the same antigenic structure reproducibly.
  • polyclonal antibodies have very high cross-reactivities with other non-interesting proteins, which greatly limits their use in the immunoblot or in immunoprecipitation and makes a diagnostic or therapeutic use of this mixture impossible.
  • the object of the present invention is therefore to provide a monoclonal antibody which binds specifically or / and selectively to human receptors of the Frizzled family.
  • specific or / and selective binding to human FZD receptors means that the monoclonal antibody was concretely established against a human FZD receptor, but not against a variant of another species, such as, for example, the mouse, which is then only cross-reactive with the human variant would be.
  • a fragment thereof may also be used.
  • a fragment is meant any portion of the antibody which retains the antigen-binding function of the antibody.
  • Such fragments are, for example, F ab , F (ab , ) 2 , F v and other fragments, such as, for example, CDR (complementary-determining region, hypervariable region) fragments
  • CDR complementary-determining region, hypervariable region
  • a further subject of the present invention therefore also relates to a monoclonal antibody or a fragment thereof which binds to a same antigen, such as an antibody which is produced by the hybridoma cells which have been cultivated in the DSMZ under the numbers DSM ACC2668, DSM ACC2669 and DSM ACC 2667 were deposited under the Budapest Treaty.
  • the present invention also relates to the antibodies specifically deposited with the DSMZ.
  • the monoclonal antibody deposited with No. DSM ACC 2667 has the mouse IgG1 isotype which selectively recognizes human FZD-4, but not other Frizzled family receptors, e.g. FZD-I, -5, -6, -7, -9 or -10.
  • the monoclonal antibody designated by No. DSM ACC 2669 has the mouse IgG1 isotype and selectively recognizes human FZD-7, but not other Frizzled family receptors, such as FZD-I, -4, -5, -6, -9 or -10.
  • the monoclonal antibody number DSM ACC 2668 has the murine IgM isotype and selectively recognizes FZD-9 and FDZ-6, but not other Frizzled family receptors, such as FZD-I, -4, -5, -7 or -10.
  • the phenotypes of hematopoietic, mesenchymal and neuronal stem / progenitor cell populations can be analyzed for their FZD expression.
  • HSC hematopoietic, mesenchymal and neuronal stem / progenitor cell populations
  • the inventors have already investigated a large number of different cell types, such as tumor cells of various types, including leukemia cells, primary cells and cultured primary cells. It was surprisingly found that a wide variety of cells show a characteristic FZD expression spectrum, so that the antibodies according to the invention can therefore be used to isolate these cells from a heterogeneous cell mixture.
  • FZD-4-positive cells such as neuronal progenitor cells
  • the invention relates to a monoclonal antibody or a fragment thereof described above, to which or to which a marker and / or a therapeutic agent is coupled.
  • a marker means any compound by means of which a localization and identification of the antibodies and thus of the FZD receptors in vitro or in vivo or also in situ is possible.
  • color indicators such as dyes having fluorescent, phosphorescent or chemiluminescent properties, AMPPD, CSPD, radioactive indicators such as 32 P, 35 S, 125 I, 131 I, 14 C, 3 H, non-radioactive indicators, such as Biotin or digoxigenin, alkaline phosphatase or horseradish peroxidase.
  • non-radioactive indicators such as Biotin or digoxigenin, alkaline phosphatase or horseradish peroxidase.
  • the detection of such labeled antibodies is then carried out by imaging techniques known in the art, such as autoradiography, blotting, hybridization or microscopy techniques.
  • a therapeutic agent is any drug in question, which induces a specific reaction in the body, such as, for example, a drug or a toxin.
  • an active substance can be targeted in the vicinity of an FZD receptor and, for example, act directly on the cell expressing this receptor. This avoids that such an active ingredient gets into areas of an organism or organ in which an effect is not desired.
  • a further subject of the present invention relates to a hybridoma cell which produces the antibody (s) described above.
  • a hybridoma cell which produces the antibody (s) described above.
  • Another object of the present invention relates to a method for the detection and / or isolation of human receptors of the FZD family or homologues or fragments thereof in a biological sample, comprising the following steps: (1) providing the biological sample; (2) contacting the biological sample with an antibody; (3) determining whether specific or / and selective binding to the antibody has occurred, and (4.1) correlation of a positive detection in step (3) with the detection of a receptor from the FZD family, or / and (4.2 ) Isolation of the antigen in a positive determination in step (3), being used as Antikör ⁇ by the antibody described above or the fragment thereof.
  • step (1), (2), (3) and (4.1) are carried out.
  • step (4.2) is carried out additionally after or instead of (4.1)
  • the antigen for example the receptor itself
  • step (4.2) is carried out additionally after or instead of (4.1)
  • the antigen for example the receptor itself
  • step (4.2) is carried out additionally after or instead of (4.1)
  • the antigen for example the receptor itself
  • step (4.2) is carried out additionally after or instead of (4.1)
  • the antigen for example the receptor itself
  • Hitherto unknown homologs of the human FZD receptors can also be found with this method, which according to the invention means components with extremely similar structures to those of the respective FZD receptors, which hitherto may not have been described.
  • this method can be used to recover large amounts of FZD receptors for subsequent crystallization and structural clarification.
  • the basis for the development of specific substances interacting with FZD receptors drug design
  • the biological sample can be cells, cell cultures, cell fragments, tissue, protein concentrates or other solutions or suspensions containing biological material, or to be examined for the presence of biological material.
  • the process can be carried out in a suitable buffer system in which, for example, tris, good or phosphate buffers are used.
  • the bringing into contact or the incubation in step (2) takes place optionally with shaking, in accordance with generally known biochemical techniques.
  • the determination in step (3) is carried out by methods generally known in the art, such as immunoblotting, immunoprecipitation or other immune techniques.
  • the human variants of the FZD receptors can also be further characterized in terms of their hitherto largely unknown biochemical mode of functioning in the context of basic research.
  • the receptors or fragments thereof can be crystallized, for example, and clarified in their three-dimensional structure.
  • active substances which selectively bind to the FZD receptors using the method of "rational drug design.”
  • the method according to the invention provides a method which is a first step for a better ⁇ res understanding of FZD receptors as well as for the development of a targeted agent.
  • a further subject matter of the present invention relates to a method for the identification of biological material with regard to the presence or / and the expression of receptors of the FZD family or homologues or fragments thereof and, if appropriate, for the isolation of such a material which has the following steps : (1) providing the biological material as; (2) contacting the biological material with an antibody; (3) determining whether specific o- / / and selective binding to the antibody has taken place, and (4.1) correlating a positive determination in step (3) with the identification of the presence or expression of receptors of the FZD family or homologs or fragments thereof in or on the biological material, and optionally (4.2) Isolation of the binding partner in a positive determination in step (3), wherein the antibody described above or the fragment thereof is used as the antibody.
  • This method is modified from the method described above such that biological material, for example, cells such as stem cells, cell fragments, etc., can be identified and isolated in terms of their phenotype with respect to FZD expression.
  • biological material for example, cells such as stem cells, cell fragments, etc.
  • the subject of the present invention is also the use of the antibody according to the invention for the specific and / or selective detection or / and isolation of receptors of the FZD family, preferably for the analysis of carcinogenesis or / and the differentiation and organogenesis of embryonic tissues or / and oogenesis and cotyledon development or / and self-renewal of stem cells.
  • a further subject matter relates to a composition, preferably a pharmaceutical composition which comprises the antibody according to the invention or fragments thereof, as well as preferably a pharmaceutically acceptable carrier and optionally further additives.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art and are described, for example, in the paper by Kibbe A. (2000), Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press Compound or composition necessary for a therapeutic Use is advantageous, including salts, binders, but also other active ingredients.
  • Another subject relates to a kit comprising the monoclonal antibody according to the invention or fragments thereof.
  • the provision of the antibody of the invention in such a kit, optionally together with other reagents, buffers and instructions on how to use the antibody, has the advantage that the application is significantly simplified and, for example, in clinics or large laboratories, in which z.T. Even semi-skilled staff works, safety is created.
  • Fig. 1 FACS histograms for the reactivity of the antibodies CH3A4A7 (A), W3D2B10 (B) and W3C4E11 (C).
  • the HEK 293 cells thus transfected were separated by gel electrophoresis and the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane. Subsequently, Western blots were carried out with antisera containing polyclonal antibodies against FZD-4, -7 and -9 (Acris Antibody GmbH, 32120 Hiddenhausen, Germany). It was shown that all transfectants are extruding the desired FZD constructs (data not shown).
  • the cells were labeled with an anti-Flag antibody and a PE-conjugated anti-mouse antibody and the EGFP and Flag-positive cells were sorted in a FACS sorter over several rounds until a transfectant was generated which was strongly positive for EGFP and Flag. After three to four sorting cycles, a stable transfectant could generally be produced. immunization
  • transfectants obtained as described above were used to immunize Balb / c mice (i.p.). After four immunizations at 14-day intervals, fusion of spleen cells with the SP2 / 0 myeloma line was performed.
  • Immunization can also be carried out with the human neuroblastoma cell line CHP-126 (DSMZ No. ACC 304) to detect antibodies to human FZD-4, and to the human retinoblastoma cell line (WERI-RB-I (DSMZ No. Acc 90) in order to obtain antibodies against human FZD-7 or FZD-9 or FZD-6, these cells show a high expression of the respective FZD receptors, using in each case 10 7 cells.
  • CHP-126 DSMZ No. ACC 304
  • WERI-RB-I DSMZ No. Acc 90
  • Hybridoma supernatants which reacted with the transfectant or previously with the CHP-126 or WERI-RB-1 cells but not with the wild type or control cells were selected and the corresponding hybridomas were cloned. Positive clones were selected.
  • the different cell types are tumor cell lines (*), primary cells (+), cultured primary cells (°), leukemia cells (O) Information about the individual cell types can be found on the Internet at http://www.dsmz.de. The content of the descriptions of the listed cell types is incorporated herein by reference.
  • NPC stands for neural progenitor cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • BM for bone marrow
  • CD34 + KM for CD34-positive CM cells (stem cells)
  • PB peripheral blood cells
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • FIG. Panel (A) shows the response profile of the antibody CH3A4A7 in the form of FACS histograms or FACS prints to HEK-293 wild-type cells (HEK-293) versus the transfectants (HEK-293 / FZD-4) to neuro ⁇ nal progenitor cells (NPC), against mobilized periphe ⁇ ren blood (mPB), compared to bone marrow cells (BM) and mesenchymal stem cells (MSC).
  • NPC neuro ⁇ nal progenitor cells
  • mPB mobilized periphe ⁇ ren blood
  • BM bone marrow cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • Partial image (B) shows the corresponding histograms for the W3D2B10 antibody
  • partial image (C) shows the corresponding histograms for the W3C4EII antibody.
  • the FACS analyzes were carried out according to standard methods, as described, for example, in DE 102 42 337 A1, the content of which is the subject of the present application by reference.
  • the monoclonal antibody secreted by the clone CH3A4A7 specifically and selectively recognizes only those transfectants which have been transfected with the FZD-4 construct [FIG. IA (HEK-293 / FZD4) and data not shown].
  • the antibodies of the invention are therefore highly selective and specific.
  • the use of the antibodies according to the invention is carried out according to customary practice, for example in Western blot, immunoprecipitation or other immunological methods.
  • the antibodies are used in customary buffers, such as Tris or HEPES buffers, in the desired concentration, which can easily be determined by, for example, titration experiments.
  • Further information on the use of the antibodies according to the invention can be found in standard works of molecular biology, such as the paper by Ed Harlow and David Lane (1998), "Using Antibody: A Laboratory Manual", ColD Spring Harbor Laboratory Press , the content of which is incorporated by reference into the present application.
  • the inventors have prepared monoclonal antibodies which recognize highly specific and highly selective human variants of the FZD receptors.
  • the antibodies provided are extremely valuable tools that can be used both in basic research as well as in diagnostics and pharmaceuticals.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper oder Fragment davon, der bzw. das spezifisch oder/und selektiv an humane Rezeptoren der Frizzled(FZD)-Familie bindet. Ferner betrifft sie eine Hybridomzelle, die den erfindungsgemässen Antikörper produziert. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion oder/und Isolierung von Rezeptoren der FZD-Familie oder Homologen oder Fragmenten davon in einer biologischen Probe sowie ein Verfahren zur Identifizierung oder/und Isolierung von biologischem Material, das Rezeptoren der FZD-Familie oder Homologe oder Fragmente davon aufweist bzw. exprimiert. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemässen Antikörpers oder Fragmenten davon zur spezifischen oder/und selektiven Detektion oder/und Isolierung von Rezeptoren der FZD-Familie, eine Zusammensetzung, die den erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper oder Fragmente davon aufweist sowie ein Kit, das den erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper oder Fragmente hiervon aufweist.

Description

Monoklonaler Antikörper gegen Frizzled-Rezeptoren
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikör¬ per oder Fragment davon, der bzw. das spezifisch oder/und se¬ lektiv an humane Rezeptoren der Frizzled(FZD)-Familie bindet. Ferner betrifft sie eine Hybridomzelle, die den erfindungsgemä¬ ßen Antikörper produziert. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion oder/und Isolierung von Rezeptoren der FZD-Familie oder Homologen oder Fragmenten davon in einer biologischen Probe sowie ein Verfahren zur Iden¬ tifizierung oder/und Isolierung von biologischem Material, das Rezeptoren der FZD-Familie oder Homologe oder Fragmente davon aufweist bzw. exprimiert. Ferner betrifft die Erfindung die
Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragmenten davon zur spezifischen oder/und selektiven Detektion oder/und Isolierung von Rezeptoren der FZD-Fainilie, eine Zusammenset¬ zung, die den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder Fragmente davon aufweist sowie ein Kit, das den erfindungsgemä¬ ßen monoklonalen Antikörper oder Fragmente hiervon aufweist.
Frizzled(FZD)-Rezeptoren sind Proteine vom 7-Transmembrantyp, die ein Sequenzmotiv mit sieben α-helikalen Domänen aufweisen, über die eine Verankerung in der Membran erfolgt. Dieses Motiv ist typisch für die sog. G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Manche Autoren zählen deshalb die Frizzled-Rezeptoren auch zur Superfamilie der GPCRs; vgl. bspw. Malbon C. C. (2004), „Frizzleds: new members of the superfamily of G- protein-coupled reσeptors" , Front. Biosci., Vol. 9, Seiten 1048 bis 1058. Die Frizzled-Rezeptoren weisen ferner eine cystein- reiche Domäne (CRD) an ihrem aminoterminalen Ende auf.
Frizzled-Rezeptoren sind wichtige Komponenten der sog. Wnt(Wingless-Type)-Signalkette, die sowohl bei Wirbeltieren als auch wirbellosen Tieren konserviert ist. Die wichtigsten Ligan¬ den der Frizzled-Rezeptoren sind die Wnt-Proteine, die über die Bindung an den extrazellulären Teil des Frizzled-Rezeptors intrazelluläre Ereignisse induzieren. An der Aufnahme und Wei¬ terleitung von Wnt-Signalen sind neben den FZD-Rezeptoren Mit¬ glieder einer weiteren Klasse von Zeiloberflächenrezeptoren aus der Familie der LDL-Rezeptor-verwandten Proteine (LDL-receptor- related proteins, LRP) beteiligt.
Die intrazelluläre Signalweiterleitung kann im Wesentlichen über zwei unterschiedliche Wege erfolgen. Liganden der Wnt5A- Klasse stimulieren die Signaltransduktion über die Pertussis- Toxin-sensitive Gruppe der heterotrimären G-Proteine über den Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration sowie über die RhoA/c-jun-N-terminale Kinase-Signalkastrade (sog. Wnt-Ca2+- Weg) . Bei Liganden der Wntl-Klasse dagegen erfolgt die Signal¬ weiterleitung über ein weiteres wichtiges intrazelluläres Sig¬ nalprotein, ß-Catenin (sog. Wnt/ß-Catenin-Weg) . ß-Catenin ist ein Transkriptionsaktivator. In Abwesenheit eines Wnt-Signales ist ein Teil des intrazellulären ß-Catenins an den cytosoli- schen Schwanz des sog. Cadherin-Proteins gebunden und ein wei¬ terer Teil des cytosolischen ß-Catenins befindet sich in einem Komplex aus den Proteinen Axin, APC (Adenomatous Polyposis coli) und GSK-3ß (Glycogen-Syntase Kinase 3). In diesem sog. Degradationskomplex wird ß-Catenin durch GSK-3ß phosphoryliert und triggert damit seine eigene Ubiquitinylierung und damit Degradierung in Proteasomen. ß-Catenin ist demnach in Abwesen¬ heit von Wnt instabil und kann seine Funktion als Transkripti¬ onsaktivator nicht ausüben. In Abwesenheit von Wnt sind deshalb verschiedene Wnt-regulierte Gene inaktiviert, was durch ein Corepressorprotein mit der Bezeichnung Groucho sichergestellt wird, das zusammen mit den transkriptionsregulierenden Protei¬ nen LEF-I/TCF an die DNA im Promotorbereich dieser Gene gebun¬ den ist.
Bei der Bindung von Wnt an den Frizzled-Rezeptor und seinen Rezeptor LRP kommt es über einen bislang unbekannten Mechanis¬ mus zur Aktivierung des intrazellulären Proteins Dishevelled. Aktiviertes Dishevelled induziert über einen ebenfalls bislang unbekannten Mechanismus die Inaktivierung von GSK-3ß in dem Degradationskomplex. Daraus resultierend wird die Phosphorylie- rung und Degradation von ß-Catenin inhibiert. ß-Catenin ist dann stabil und akkumuliert im Cytoplasma und im Nucleus. Im Nucleus bindet ß-Catenin an LEF-1/TCF (Lymphoid Enhancer Fac- tor-l/T cell-specific Factor), setzt den Faktor Groucho frei und stimuliert somit die Transkription von Wnt-regulierten Genen. Ein Überblick über die Wnt-Signalkette findet sich bspw. in Huelsken J. und Behrens J. (2002), „The Wnt signalling pathway", J. Cell Sei., Vol. 115, Seiten 3977 bis 3978.
Neben Wnt wurde kürzlich ein weiterer Ligand für Frizzled- Rezeptoren gefunden, der den Namen Norrin trägt; vgl. Niehrs C. (2004), „Norrin and Frizzled: A New Vein for the Eye", Develop- mental Cell, Vol. 6, Seiten 1 bis 20.
Frizzled-Rezeptoren spielen eine wichtige Rolle in der Diffe¬ renzierung und Organogenese embryonaler Gewebe, bei der Oogene¬ se und Keimblattentwicklung sowie bei der Selbsterneuerung von Stammzellen. Folglich ist eine Vielzahl von Arbeitsgruppen aus dem Bereich der Grundlagenforschung mit der näheren Charakteri¬ sierung dieser Rezeptoren beschäftigt.
Frizzled-Rezeptoren scheinen jedoch auch bei einer Vielzahl von Krankheiten eine wichtige Rolle zu spielen. So kommt diesen Rezeptoren eine Schlüsselfunktion bei der Karzinogenese zu; vgl. Holcombe R. F. et al. (2002), „Expression of Wnt ligands and Frizzled reeeptors in colonic mueosa and in colon Carci¬ noma", J. Clin. Pathol. Vol. 55(4), Seiten 220 bis 226, sowie Karim R. et al. (2004), „The significance of the Wnt pathway in the pathology of human Cancers", Pathology 36(2), Seiten 120 bis 128. Ferner wurde ein Zusammenhang mit der sog. Norrie-Krankheit festgestellt, einer X-chromosomal-rezessiven Erkrankung, die durch degenerative Veränderungen in der Netzhaut gekennzeichnet ist; vgl. Xu et al. (2004), „Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled4, a high-affinity ligand-receptor pair", Cell, Vol. 116(6), Seiten 883 bis 895; eine Involvierung von Frizzled-Rezeptoren in das Krankheitsbild der familiären exsudativen Vitreoretinopathie, einer progre¬ dienten Netzhauterkrankung; vgl. Robitaille et al. (2002), „Mutant frizzled-4 disrupts retinal angiogenesis in familial exudative vitreoretinopathy", Nat. Genet., Vol. 32(2), Seiten 326 bis 330.
Ferner sind Frizzled-Rezeptoren an dem Krankheitsbild der rheu¬ matoiden Arthritis beteiligt; vgl. Sen et al. (2001), „Blockade of Wnt-5A/frizzled 5 signaling inhibits rheumatoid synoviocyte activation", Arthritis Rheum. , Vol. 44(4), Seiten 772 bis 781. Darüber hinaus findet man in der Literatur Frizzled-Rezeptoren im Zusammenhang mit einer Vielzahl von weiteren Krankheitsbil¬ dern beschrieben.
Vor diesem Hintergrund besteht sowohl für die Forschung als auch die Diagnostik und Pharmazeutik großer Bedarf an Antikör¬ pern, mittels denen selektiv Frizzled-Rezeptoren erkannt bzw. identifiziert werden können.
Im Stand der Technik sind umfangreich polyklonale Antikörper gegen verschiedene Frizzled-Rezeptoren beschrieben, wie bspw. gegen humanes FZD-5 (Sen et al. , a.a.O.), gegen Maus-FZD-9 (Van Raay et al. (2001), „Frizzled 9 is expressed in neural precur- sor cells in the developing neural tube" , Dev. Genes Evol., Vol. 211(8-9), Seiten 453 bis 457), oder gegen humanes FZD-I und FZD-2 (Holcombe R. F. et al., a.a.O.)«
Der Nachteil derartiger polyklonaler Antikörper liegt darin, dass diese nicht unbegrenzt zur Verfügung stehen und nach dem Verbrauch nicht mehr identisch nachproduziert werden können. Ferner handelt es sich bei polyklonalen Antikörpern naturgemäß um ein Gemisch von unterschiedlichen Antikörpern, die jeweils gegen verschiedene antigene Strukturen des jeweiligen Epitops gerichtet sind. Folglich ist es mittels polyklonaler Antikörper nicht möglich, reproduzierbar immer wieder die gleiche antigene Struktur zu identifizieren.
Ein weiterer Nachteil von polyklonalen Antikörpern liegt darin, dass diese zum Teil sehr hohe Kreuzreaktivitäten mit weiteren nicht-interessierenden Proteinen zeigen, was deren Einsatz im Immunoblot oder auch in der Immunpräzipitation stark ein¬ schränkt und eine diagnostische oder therapeutische Verwendung dieses Gemisches unmöglich macht.
Es besteht deshalb verstärkter Bedarf an der Bereitstellung von monoklonalen Antikörpern, die gegen Frizzled-Rezeptoren, insbe¬ sondere gegen die humanen Varianten, gerichtet sind. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Herstellung derartiger monoklona¬ ler Antikörper besonders schwierig ist, da Frizzled-Rezeptoren im Tierreich hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz und damit ihrer dreidimensionalen Struktur sehr stark konserviert sind. Es wird deshalb angenommen, dass es nahezu unmöglich ist, mo¬ noklonale Antikörper herzustellen, über die eine speziesspezi¬ fische Abgrenzung der Frizzled-Rezeptoren möglich ist. Die Firma R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA, bietet mo¬ noklonale Antikörper gegen die Maus-Variante von Frizzled-1 (Klon 162531), -3 (Klon 169310), -4 (Klon 145901) und -7 (Klon 151143) an. Der Hersteller wirbt damit, dass mit diesen Anti¬ körpern auch die jeweiligen humanen Varianten der Frizzled- Rezeptoren detektiert werden könnten. Dabei hat sich in der Fachwelt jedoch gezeigt, wie dies von den Erfindern auch veri¬ fiziert wurde, dass eine zufriedenstellende Detektion der huma¬ nen Varianten mittels dieser Antikörper nicht möglich ist. Vielmehr erfolgt die Bindung dieser Antikörper an humane Rezep¬ toren der Frizzled-Familie auf unspezifische und unselektive Art und Weise, so dass lediglich eine gewisse Kreuzreaktivität mit den humanen Varianten verbunden mit einer hohen Affinität gegenüber weiteren nicht gewünschten Strukturen festzustellen ist. Der Einsatz dieser monoklonalen Antikörper zur selektiven oder/und spezifischen Identifizierung von humanen Frizzled- Rezeptoren ist deshalb nicht möglich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, einen mo¬ noklonalen Antikörper bereitzustellen, der spezifisch oder/und selektiv an humane Rezeptoren der Frizzled-Familie bindet.
Den Erfindern ist es nun zum ersten Mal gelungen, diese Aufgabe zu lösen. Vorliegend wird ein solcher monoklonaler Antikörper bereitgestellt. Konkret konnten die Erfinder drei monoklonale Antikörper herstellen, die hochspezifisch und selektiv an die humanen Varianten von FZD-4, -7 und -9 bzw. -6 binden. Diese Antikörper werden von Hybridomzellen produziert, die in Kultur bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, unter den Num¬ mern DSM ACC2668 (FZD-9 und -6), DSM ACC2669 (FZD-7) und DSM ACC 2667 (FZD-4) nach dem Budapester Vertrag am 15. Juli 2004 hinterlegt wurden.
Diese monoklonalen Antikörper haben überraschende und nicht vorhersehbare Eigenschaften. So binden diese hochselektiv und spezifisch an die humanen Varianten der Frizzled-Rezeptoren, zeigen folglich lediglich äußerst geringe Kreuzreaktivitäten mit den Varianten anderer Spezies. Dies war auf Grund der hohen Konservierung der Frizzled-Rezeptoren im Tierreich nicht zu erwarten. Es wurde vielmehr bislang angenommen, dass auf Grund der strukturellen Ähnlichkeiten der Frizzled-Rezeptoren ver¬ stärkt Kreuzreaktivitäten mit Varianten anderer Spezies unver¬ meidbar sind.
Erfindungsgemäß bedeutet eine spezifische oder/und selektive Bindung an humane FZD-Rezeptoren, dass der monoklonale Antikör¬ per konkret gegen einen humanen FZD-Rezeptor etabliert wurde, nicht aber gegenüber einer Variante einer anderen Spezies, wie bspw. der Maus, der dann lediglich kreuzreaktiv mit der humanen Variante wäre.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann statt des erfindungs¬ gemäßen Antikörpers auch ein Fragment desselben verwendet wer¬ den. Unter einem solchen Fragment wird dabei jeder Abschnitt des Antikörpers verstanden, der die Antigenbindungsfunktion des Antikörpers beibehält. Solche Fragmente sind bspw. Fab, F(ab,)2, Fv und andere Fragmente, wie z.B. CDR(„complementary determi- ning region", hypervariable Region)-Fragmente. Die genannten Fragmente weisen ebenfalls die Bindungsspezifität des Antikör¬ pers auf und können auch bspw. mit bekannten Verfahren als rekombinante Proteine hergestellt werden. Die besondere Leistung der Erfinder liegt darin, dass nun mit den hinterlegten Antikörpern nicht nur ein hochselektives Tool zur Verwendung in Forschung und Medizin bereitgestellt wird, sondern dass mittels dieser Antikörper auch weitere monoklonale Antikörper erzeugt werden können, die an das gleiche Antigen binden. Die Erfinder haben dadurch, dass diese unerwarteterwei¬ se hochselektive Antikörper gegen die humane Variante der FZD- Antikörper herstellen konnte, eine wichtige Hürde genommen und so den Weg für die Entwicklung vergleichbarer monoklonaler Antikörper geebnet. So ist es nämlich möglich, das Antigen, das von den hinterlegten Antikörpern erkannt wird, zu isolieren und zur Immunisierung bspw. von Mäusen zu verwenden. Die sich daran anschließende Herstellung von monoklonalen Antikörpern ist im Stand der Technik grundsätzlich beschrieben; vgl. Köhler G. und Milstein C. (1975), „Continuous cultures of fused cells secre- ting antibody of predefined specificity" , Nature, Vol. 256(5517), Seiten 495 bis 497. Danach werden den Tieren nach der Immunisierung mit dem isolierten Antigen die Antikörper produzierenden Zellen entnommen und mit einer immortalisierten Zelllinie fusioniert. Aus den resultierenden Hybridomzelllinien wird eine solche ausgewählt, die Antikörper, und dies in einer unbegrenzten Menge, gegen das Antigen produziert, das für die Immunisierung eingesetzt wurde.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft deshalb auch einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon, der bzw. das an ein gleiches Antigen bindet, wie ein Antikörper, der von den Hybridomzellen produziert wird, die in Kulturen bei der DSMZ unter den Nummern DSM ACC2668, DSM ACC2669 und DSM ACC 2667 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt wurden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die konkret bei der DSMZ hinterlegten Antikörper.
Der mit der Nr. DSM ACC 2667 hinterlegte monoklonale Antikörper weist den Isotyp Maus IgGl auf, der selektiv humanes FZD-4 erkennt, nicht jedoch andere Rezeptoren der Frizzled-Familie, bspw. FZD-I, -5, -6, -7, -9 oder -10. Der mit der Nr. DSM ACC 2669 bezeichnete monoklonale Antikörper weist den Isotyp Maus IgGl auf und erkennt selektiv humanes FZD-7 , nicht jedoch ande¬ re Rezeptoren der Frizzled-Familie, wie FZD-I, -4, -5, -6, -9 oder -10. Der monoklonale Antikörper mit der Nr. DSM ACC 2668 weist den Isotyp Maus IgM auf und erkennt selektiv FZD-9 und FDZ-6, nicht jedoch andere Rezeptoren aus der Frizzled-Familie, wie bspw. FZD-I, -4, -5, -7 oder -10.
Mit den erfindungsgemäßen Antikörpern können die Phänotypen von hämatopoetischen, mesenchymalen und neuronalen Stamm-/Progeni¬ torzellpopulationen (HSC, MSC, NPC) hinsichtlich ihrer FZD- Expression analysiert werden. So haben die Erfinder bereits eine Vielzahl von verschiedenen Zelltypen untersucht, wie Tu¬ morzellen verschiedenster Art, einschließlich Leukämiezellen, Primärzellen und kultivierte PrimärZeilen. Dabei wurde überra¬ schenderweise festgestellt, dass verschiedenste Zellen ein charakteristisches FZD-Expressionsspektrum zeigen, so dass die erfindungsgemäßen Antikörper deshalb zur Isolierung dieser Zellen aus einem heterogenen Zellgemisch verwendet werden kön¬ nen. So lassen sich bspw. mit dem hinterlegten monoklonalen Antikörper gegen FZD-4 auf vorteilhafte Art und Weise FZD-4- positive Zellen, wie neuronale Progenitorzellen erkennen und isolieren. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden. Erfindung betrifft einen vorstehend beschriebenen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment hiervon, an den bzw. an das ein Marker oder/und ein therapeutischer Wirkstoff gekoppelt ist.
Erfindungsgemäß wird unter einem Marker eine jegliche Verbin¬ dung verstanden, mittels der eine Lokalisierung und Identifi¬ zierung der Antikörper und damit der FZD-Rezeptoren in vitro oder in vivo oder auch in situ möglich ist. Hierzu zählen Farb¬ indikatoren, wie Farbstoffe, mit fluoreszierenden, phosphores¬ zierenden oder chemilumineszierenden Eigenschaften, AMPPD, CSPD, radioaktive Indikatoren, wie 32P, 35S, 125I, 131I, 14C, 3H, nicht radioaktive Indikatoren, wie Biotin oder Digoxigenin, alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase. Der Nach¬ weis solcher markierter Antikörper erfolgt dann über im Stand der Technik bekannte bildgebende Verfahren, wie Autoradiogra- phie, Blotting-, Hybridisierungs- oder Mikroskopietechniken.
Als therapeutischer Wirkstoff kommt ein jeder Wirkstoff in Frage, der im Organismus eine spezifische Reaktion induziert, wie bspw. ein Arzneimittel oder auch ein Toxin. Auf diese Art und Weise kann ein Wirkstoff zielgerichtet in die Nähe eines FZD-Rezeptors gebracht werden und bspw. direkt auf die diesen Rezeptor exprimierende Zelle wirken. Damit wird vermieden, dass ein solcher Wirkstoff in Bereiche eines Organismus bzw. Organs gelangt, in denen eine Wirkung nicht erwünscht ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Hybridomzelle, die den bzw. die vorstehend erläuterten Antikörper produziert. Mithilfe dieser Hybridomzelle kann, wenn diese in Kultur genom¬ men wird, ein entsprechender Antikörper, der von dieser produ¬ ziert wird, in unbegrenzter Menge erhalten und zur Verfügung gestellt werden. Im Rahmen von wissenschaftlichen oder diagnos¬ tischen Anwendungen ist damit eine Reproduzierbarkeit der Er¬ gebnisse gewährleistet. Dies ist Voraussetzung für die Zulas¬ sung als Arzneimittel.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion oder/und Isolierung von humanen Rezep¬ toren der FZD-Familie oder Homologen oder Fragmenten davon in einer biologischen Probe, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung der biologischen Probe; (2) In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit einem Antikörper; (3) Feststellung, ob eine spezifische oder/und selektive Bindung an den Antikör¬ per stattgefunden hat, und (4.1) Korrelation einer positiven Feststellung in Schritt (3) mit der Detektion eines Rezeptors aus der FZD-Familie, oder/und (4.2) Isolierung des Antigens bei einer positiven Feststellung in Schritt (3), wobei als Antikör¬ per der vorstehend beschriebene Antikörper oder das Fragment davon verwendet wird.
Mit diesem Verfahren lassen sich humane Rezeptoren der FZD- Familie zielgerichtet nachweisen. Hierzu werden die Schritte (1), (2), (3) und (4.1) durchgeführt. Bei einer zusätzlichen Durchführung von Schritt (4.2) nach oder anstelle von (4.1) kann jedoch auch das Antigen, bspw. der Rezeptor selbst, iso¬ liert werden und zur oben angesprochenen Herstellung weiterer vergleichbarer monoklonaler Antikörper verwendet werden. Mit diesem Verfahren lassen sich auch bislang unbekannte Homo¬ loge der humanen FZD-Rezeptoren auffinden, worunter erfindungs¬ gemäß Komponenten mit äußerst ähnlichen Strukturen wie denen der jeweiligen FZD-Rezeptoren verstanden werden, die bislang u.U. nicht beschrieben wurden.
Ferner können mit diesem Verfahren große Mengen an FZD- Rezeptoren für eine anschließende Kristallisierung und Struk¬ turaufklärung gewonnen werden. Darüber hinaus besteht die Mög¬ lichkeit, die FZD-Rezeptoren mit ihren natürlichen Liganden oder anderen mit diesen wechselwirkenden Faktoren oder Molekü¬ len in großen Mengen zu isolieren, eine Co-Kristallisierung der Komplexe durchzuführen, um so Daten über die dreidimensionale Struktur dieser Komplexe zu erhalten. Damit wird beispielsweise die Grundlage für die Entwicklung von spezifischen mit FZD- Rezeptoren wechselwirkenden Substanzen (drug design) geschaf¬ fen, die die korrekte dreidimensionale Gestalt haben.
Bei der biologischen Probe kann es sich um Zellen, Zellkultu¬ ren, Zellfragmente, Gewebe, Proteinkonzentrate oder sonstige Lösungen oder Suspensionen handeln, die biologisches Material enthalten, oder aber die auf das Vorhandensein von biologischem Material untersucht werden sollen.
Das Verfahren kann in einem geeigneten Puffersystem durchge¬ führt werden, bei dem bspw. Tris-, Good- oder Phosphatpuffer eingesetzt werden. Das In-Kontakt-bringen bzw. die Inkubation in Schritt (2) erfolgt dabei ggf. unter Schütteln, nach allge¬ mein bekannten biochemischen Techniken. Die Feststellung in Schritt (3) erfolgt über im Stand der Tech¬ nik allgemein bekannte Verfahren wie Immunblot, Immunpräzipita- tion oder sonstige Immuntechniken.
Mithilfe eines solchen Verfahrens können auch im Rahmen der Grundlagenforschung die humanen Varianten der FZD-Rezeptoren hinsichtlich ihrer bislang weitgehend unbekannten biochemischen Funktionsweise näher charakterisiert werden. So können die Rezeptoren oder Fragmente hiervon nach der Isolierung bspw. kristallisiert und in ihrer dreidimensionalen Struktur aufge¬ klärt werden. In diesem Zusammenhang lassen sich dann auch bspw. mit der Methode des „rational drug design" Wirkstoffe gezielt konstruieren, die selektiv an die FZD-Rezeptoren bin¬ den. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird demnach eine Methode bereitgestellt, die einen ersten Schritt für ein besse¬ res Verständnis der FZD-Rezeptoren als auch für die Entwicklung eines zielgerichteten Wirkstoffes darstellt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von biologischem Material hin¬ sichtlich des Vorhandenseins oder/und der Expression von Rezep¬ toren der FZD-Familie oder Homologen oder Fragmenten davon und ggf. zur Isolierung eines solchen Materials, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung des biologischen Materi¬ als; (2) In-Kontakt-bringen des biologischen Materials mit einem Antikörper; (3) Feststellung, ob eine spezifische o- der/und selektive Bindung an den Antikörper stattgefunden hat, und (4.1) Korrelation einer positiven Feststellung in Schritt (3) mit der Identifizierung des Vorhandenseins oder der Expres¬ sion von Rezeptoren der FZD-Familie oder Homologen oder Frag¬ menten davon in bzw. auf dem biologischen Material, und ggf. (4.2) Isolierung des Bindepartners bei einer positiven Fest¬ stellung in Schritt (3) , wobei als Antikörper der vorstehend beschriebene Antikörper oder das Fragment davon verwendet wird.
Dieses Verfahren ist gegenüber dem vorstehend beschriebenen Verfahren derart modifiziert, dass biologisches Material, bspw. Zellen wie Stammzellen, Zellfragmente etc., hinsichtlich ihres Phänotyps in Bezug auf die FZD-Expression identifiziert und isoliert werden kann.
Vor diesem Hintergrund ist Gegenstand der vorliegenden Erfin¬ dung auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers zur spezifischen oder/und selektiven Detektion oder/und Isolierung von Rezeptoren der FZD-Familie, vorzugsweise zur Analyse der Karzinogenese oder/und der Differenzierung und Organogenese embryonaler Gewebe oder/und der Oogenese und Keimblattentwick- lung oder/und der Selbsterneuerung von Stammzellen.
Ein weiterer Gegenstand betrifft eine Zusammensetzung, vorzugs¬ weise eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den erfindungs¬ gemäßen Antikörper oder Fragmente davon aufweist, sowie vor¬ zugsweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ggf. weitere Zusätze.
Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik allgemein bekannt und werden bspw. in der Abhandlung von Kibbe A. (2000), „Handbook of Pharmaceutical Excipients", Third Edi¬ tion, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press, beschrieben. Zusätze umfassen erfindungsgemäß jedwede Verbindung oder Zusammensetzung, die für eine therapeutische Verwendung vorteilhaft ist, worunter Salze, Bindemittel, aber auch weitere Wirkstoffe fallen.
Ein anderer Gegenstand betrifft ein Kit, das den erfindungsge¬ mäßen monoklonalen Antikörper oder Fragmente davon aufweist.
Die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Antikörpers in einem solchen Kit, ggf. zusammen mit weiteren Reagenzien, Puffern und einer Anleitung, wie der Antikörper zu verwenden ist, hat den Vorteil, dass die Anwendung deutlich vereinfacht wird und bspw. in Kliniken oder Großlabors, in denen z.T. auch angelerntes Personal arbeitet, Sicherheit geschaffen wird.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nach¬ stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbei¬ spielen näher erläutert, die rein beispielhaften Charakter haben und die Tragweite der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken. Darin wird auf die beiliegende Figur Bezug genommen, in der zu sehen ist:
Fig. 1 FACS-Histogramme zur Reaktivität der Antikörper CH3A4A7 (A), W3D2B10 (B) und W3C4E11 (C). Ausführunqsbeispiel
Herstellung von Transfektanten
Es wurden cDNAs hergestellt, die für FZD-4, -7 und -9 kodieren. Diese wurden in den Klonierungsvektor plRES-EGFP (Becton and Diσkinson Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) nach den Anga¬ ben des Herstellers kloniert. Am N-terminalen Ende wurde ein Flag-TAG inseriert, um die Membranständigkeit der FZD- Rezeptoren nachzuweisen. Mit diesen plRES-EGFP-Konstrukten wurden HEK-293-Zellen (DSMZ Nr. ACC 305) transfiziert.
Die so transfizierten HEK-293-Zellen wurden gelelektropho- retisch aufgetrennt, die Proteine auf eine Nitrozellulosememb¬ ran transferiert. Anschließend wurden Westernblots mit Antise- ren enthaltend polyklonale Antikörper gegen FZD-4, -7 und -9 durchgeführt (Acris Antibody GmbH, 32120 Hiddenhausen, Deutsch¬ land) . Dabei zeigte sich, dass sämtliche Transfektanten die gewünschten FZD-Konstrukte extrimieren (Daten nicht gezeigt) .
Eine Woche nach der Transfektion wurden die Zellen mit einem anti-Flag-Antikörper und einem PE-konjugierten anti-Maus- Antikörper markiert und die EGFP- und Flag-positiven Zellen in einem FACS-Sortiergerät über mehrere Runden sortiert, bis eine Transfektante generiert wurde, die stark positiv für EGFP und Flag war. Nach drei bis vier Sortierzyklen konnte in der Regel eine stabile Transfektante hergestellt werden. Immunisierung
Die wie zuvor beschrieben gewonnenen Transfektanten wurden zur Immunisierung von Balb/c-Mäusen (i.p.) verwendet. Nach vier Immunisierungen im Abstand von 14 Tagen erfolgte die Fusion von Milzzellen mit der Myelomlinie SP2/0.
Eine Immunisierung kann auch mit der humanen Neuroblastom- Zelllinie CHP-126 (DSMZ Nr. ACC 304) erfolgen, um Antikörper gegen humanes FZD-4, und mit der humanen Retinoblastom- Zelllinie (WERI-RB-I (DSMZ Nr. Acc 90), um Antikörper gegen humanes FZD-7 oder FZD-9 bzw. FZD-6 zu erhalten. Diese Zellen zeigen eine hohe Expression der jeweiligen FZD-Rezeptoren. Eingesetzt werden jeweils 107 Zellen.
Hybridomüberstände, die mit der Transfektante bzw. zuvor mit den CHP-126- oder WERI-RB-1-Zellen, nicht jedoch mit den Wild¬ typ- oder Kontrollzellen reagierten, wurden ausgewählt und die entsprechenden Hybridome kloniert. Positive Klone wurden selek¬ tiert.
Auf diese Art und Weise wurden vier Klone erhalten. Diese wur¬ den mit CH3A4A7, der monoklonale Antikörper gegen FZD-4 sezer- niert, W3D2B10, der monoklonale Antikörper gegen FZD-7 sezer- niert, und W3C4E11 bezeichnet, der monoklonale Antikörper gegen FZD-9 bzw. FZD-6 sezerniert. Die Antikörper weisen folgende Isotypen auf: CH3A4A7 und W3D2B10 jeweils Maus IgGl, W3CH411 Maus IgM. Untersuchung der Reaktivität der Antikörper auf definierten Stammzellpopulationen
Die wie zuvor beschrieben gewonnenen Antikörper wurden hin¬ sichtlich ihrer Reaktivität auf definierten Stammzellpopulatio¬ nen getestet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt.
Figure imgf000021_0001
Tab. 1: Reaktivität der erfindungsgemäßen Antikörper mit ver¬ schiedenen Zeiltypen. Bei den verschiedenen Zelltypen handelt es sich um Tumorzelllinien (*), Primärzellen (+) , kultivierte Primärzellen (°), Leukämiezellen (O) Informationen über die einzelnen Zelltypen sind im Internet unter http://www.dsmz.de zu finden. Der Inhalt der Beschreibun¬ gen der gelisteten Zelltypen ist durch Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung. Hierbei steht NPC für neuronale Progenitorzellen, MSC für mesenchymale Stammzellen, KM für Knochenmark, CD34+KM für CD34-positive KM-Zellen (Stammzellen), PB für periphere Blutzellen und HUVEC für „human umbilical vein endothelial cells" .
Dabei zeigte sich, dass eine Vielzahl von Tumorzellen FZD- Rezeptoren exprimieren und diese Zellen mit den bereitgestell¬ ten Antikörpern spezifisch selektiert und ggf. isoliert werden können.
Die dazugehörigen FACS-Ausdrucke sind auszugsweise in der Fig. 1 dargestellt. Die Teilabbildung (A) zeigt das Reaktionsprofil des Antikörpers CH3A4A7 in der Form von FACS-Histogrammen bzw. FACS-Ausdrucken gegenüber HEK-293-Wildtypzellen (HEK-293), gegenüber den Transfektanten (HEK-293/FZD-4) , gegenüber neuro¬ nalen Progenitorzellen (NPC) , gegenüber mobilisiertem periphe¬ ren Blut (mPB), gegenüber Knochenmarkszellen (BM) und gegenüber mesenchymalen Stammzellen (MSC). Gleichermaßen wurde unter Verwendung eines Anti-Flag-Antikörpers (a-Flag) verifiziert, dass das jeweilige Frizzled-Protein in der Membran exprimiert wird. In Teilabbildung (B) sind die entsprechenden Histogramme für den W3D2B10-Antikörper, und in der Teilabbildung (C) die entsprechenden Histogramme für den W3C4Ell-Antikörper darge¬ stellt. Die FACS-Analysen wurden gemäß Standardverfahren durch¬ geführt, wie dies bspw. in der DE 102 42 337 Al beschrieben ist, deren Inhalt durch Bezugnahme Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist. Dabei wurde insbesondere festgestellt, dass der monoklonale Antikörper, der von dem Klon CH3A4A7 sezerniert wird, hochspe¬ zifisch und selektiv nur solche Transfektanten erkennt, die mit dem FZD-4-Konstrukt transfiziert wurden [Fig. IA (HEK-293/FZD4) und Daten nicht gezeigt] . Entsprechendes gilt hinsichtlich FZD- 7 für den Antikörper, der von dem Klon W3D2B10 sezerniert wird. Letzterer erkennt hochspezifisch und selektiv nur solche HEK- 293-Transfektanten, die mit dem FZD-7-Konstrukt transfiziert wurden [Fig. IB (HEK-293/FDZ7) und Daten nicht gezeigt]. Ferner erkennt der monoklonale Antikörper, der von dem Klon W3C4E11 sezerniert wird, hochspezifisch und selektiv nur solche HEK- 293-Transfektanten, die mit dem FZD-9-Konstrukt transfiziert wurden [Fig. IC (HEK-293/FZD9) und Daten nicht gezeigt).
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind deshalb hochselektiv und spezifisch.
Verwendung der Antikörper
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper erfolgt gemäß üblicher Praxis bspw. im Westernblot, der Immunpräzipitation oder anderen immunologischen Verfahren. Dazu werden die Anti¬ körper in üblichen Puffern, wie z.B. Tris- oder HEPES-Puffern, in gewünschter Konzentration eingesetzt, die durch bspw. Titra¬ tionsexperimente leicht bestimmt werden kann. Nähere Informati¬ onen über die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper fin¬ den sich in Standardwerken der Molekularbiologie, wie bspw. der Abhandlung von Ed Harlow und David Lane (1998), „Using Antibo¬ dies: A Laboratory Manual", CoId Spring Harbor Laboratory Press, deren Inhalt durch Inbezugnahme Bestandteil der vorlie¬ genden Anmeldung ist. Die Erfinder haben erstmals monoklonale Antikörper bereitge¬ stellt, die hochspezifisch und hochselektiv humane Varianten der FZD-Rezeptoren erkennen. Bei den bereitgestellten Antikör¬ pern handelt es sich um äußerst wertvolle Tools, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Diagnostik und Pharma- zeutik verwendet werden können.

Claims

Patentansprüche
1. Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon, dadurch gekennzeichnet, dass dieser bzw. dieses spezifisch oder/und selektiv an humane Rezeptoren der Frizzled(FZD)- Familie bindet.
2. Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dieser bzw. dieses an ein gleiches Antigen bindet, wie ein Antikörper, der von den Hybridomzellen produziert wird, die in Kulturen bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter den Nummern DSM ACC2668, DSM ACC2669 und DSM ACC 2667 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt wurden.
3. Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper von der Hybridomzelle produziert wird, die in Kultur W3C4E11 bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegt wur¬ de.
4. Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper von der Hybridomzelle produziert wird, die in Kultur W3D2B10 bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2669 hinterlegt wur¬ de.
5. Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper von der Hybridomzelle produziert wird, die in Kultur CH3A4A7 bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC 2667 hinterlegt wur¬ de.
6. Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass an die¬ sen bzw. dieses ein Marker oder/und ein therapeutischer Wirkstoff gekoppelt ist.
7. Hybridomzelle, dadurch gekennzeichnet, dass diese den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 produziert.
8. Verfahren zur Detektion oder/und Isolierung von humanen Rezeptoren der FZD-Familie oder Homologen oder Fragmenten davon in einer biologischen Probe, das folgende Schritte aufweist:
( 1 ) Bereitstellung der biologischen Probe;
( 2 ) In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit einem Antikörper;
( 3 ) Feststellung, ob eine spezifische oder/und selekti¬ ve Bindung an den Antikörper stattgefunden hat, und
( 4 • 1 ) Korrelation einer positiven Feststellung in Schritt (3) mit der Detektion eines Rezeptors aus der FZD- Familie, oder/und
(4.2) Isolierung des Antigens bei einer positiven Fest¬ stellung in Schritt (3) ,
dadurch gekennzeichnet, dass als Antikörper der Antikörper oder das Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 6 verwendet wird.
9. Verfahren zur Identifizierung von biologischem Material hinsichtlich des Vorhandenseins oder/und der Expression von Rezeptoren der FZD-Familie oder Homologen oder Frag¬ menten davon und ggf. Isolierung eines solchen Materials, das folgende Schritte aufweist:
(1) Bereitstellung des biologischen Materials;
(2) In-Kontakt-bringen des biologischen Materials mit einem Antikörper;
(3) Feststellung, ob eine spezifische oder/und selekti¬ ve Bindung an den Antikörper stattgefunden hat, und
(4.1) Korrelation einer positiven Feststellung in Schritt (3) mit der Identifizierung des Vorhandenseins o- der/und der Expression von Rezeptoren der FZD- Familie oder Homologen oder Fragmenten davon in bzw. auf dem biologischen Material, und ggf.
(4.2) Isolierung des Bindepartners bei einer positiven Feststellung in Schritt (3),
dadurch gekennzeichnet, dass als Antikörper der Antikörper oder das Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 6 verwendet wird.
10. Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur spezifischen oder/und selektiven Detektion oder/und Isolierung von Rezeptoren der FZD-Familie.
11. Verwendung nach Anspruch 10 zur Analyse der Karzinogenese oder/und der Differenzierung und Organogenese embryonaler Gewebe oder/und der Oogenese und Keimblattentwicklung o- der/und der Selbsterneuerung von Staitimzellen.
12. Zusammensetzung, die den monoklonalen Antikörper oder Fragmente davon nach einem der Ansprüche 1 bis 6 aufweist.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass diese eine pharmazeutische Zusammensetzung ist und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger sowie ggf. weiter Zusätze aufweist.
14. Kit, das den monoklonalen Antikörper oder Fragmente davon nach einem der Ansprüche 1 bis 6 aufweist.
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