WO2006040448A1 - Amorces universelles et leur utilisation pour la detection et l'identification de vegetaux dans des melanges complexes - Google Patents

Amorces universelles et leur utilisation pour la detection et l'identification de vegetaux dans des melanges complexes Download PDF

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WO2006040448A1
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Pierre Taberlet
Ludovic Gielly
Christian Philippe Miquel
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Definitions

  • the present invention relates to oligonucleotides and their use as universal primers for the detection and identification of plant species, especially in complex or degraded substrates.
  • the methods of genetic fingerprinting are thus based on the analysis of the complete genome.
  • the purpose of these methods is to provide a specific genetic fingerprint for each individual (identification of the individual and not of the species). However, although this is not the initial goal, they may also allow some identification of the species. All these methods require obtaining good quality DNA (not degraded), and without mixing with exogenous DNA (from other organisms). As a result, it is impossible to use these approaches for the identification of plants in degraded or complex substrates.
  • the AFLP and DArT methods can be mentioned.
  • AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
  • population genetics and genetic mapping Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Van de Lee T, Homes M, Frijters A, Pot J Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995)
  • AFLP a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Research, 23, 4407-4414, US Patent 6,045,994
  • It is based on digestion / ligation I 1 genomic DNA, followed by two successive amplification using PCR primers specific to simplify the genome to make it analyzable by electrophoresis.
  • the DArT "Diversity Array Technology" method is based on a very similar approach (digestion / ligation then amplification), but differs by the analysis method (hybridization) (Jaccoud D, Peng K, Feinstein D, Kilian A (2001) Nucleic Acids Research, 29, e25; US Patent No. 6,713,258). It is also impossible to use this approach on degraded and complex substrates.
  • the intron of the trnL gene (UAA) is very variable, but also has conserved parts related to the fact that it can constitute secondary structures (Simon D, Fewer D, Friedl T, Bhattacharya D (2003) Phylogeny and self-splicing ability of the plastid tRNA-leu group intron Journal of Molecular Evolution, 57, 710-720).
  • these primers c and d amplify regions that are too long to be used on degraded substrates.
  • the present invention provides novel oligonucleotides and their use as universal primers for the detection and identification of plant species.
  • the oligonucleotides of the present invention make it possible to amplify a very short but also very variable region of the intron of the trnL gene (UAA) of chloroplast DNA.
  • a first advantage of the present invention is that the oligonucleotides and methods of the present invention allow the detection and identification of plants in complex or degraded substrates such as transformed substrates (by heat, lyophilization, etc.) because the amplified region is both short and highly variable.
  • Another advantage of the present invention is that the amplified region is not only highly variable between plant species but also has highly conserved flanking regions allowing the amplification of the region of interest in different plant species using universal primers. .
  • the intron of the trnL gene is one of the few chloroplast sequences for which several thousand sequences are available in databases such as GenBank (http: //www.ncbi .nlm.nih.gov).
  • GenBank http: //www.ncbi .nlm.nih.gov.
  • the analysis of the amplified variable region using the universal primers therefore makes it possible to identify the corresponding plant species by referring to the sequences available in the databases.
  • Methods for identifying plants in complex or degraded substrates are of great interest. Examples include applications in the food industry where, for example, compliance with the traceability criteria requires the development of new methods of analysis to identify the detailed composition of plant species of food preparations.
  • a first object of the present invention is a pair of oligonucleotides in which the first oligonucleotide hybridizes to the sequence of SEQ ID No. 68 and the second oligonucleotide hybridizes to the sequence of SEQ ID No. 69 in stringency conditions sufficient for the selective amplification of a variable region of the intron of the tobacco trnL chloroplast gene whose sequence is shown in SEQ ID No. 3.
  • Another object of the present invention is a pair of oligonucleotides in which first oligonucleotide hybridizes to the sequence of SEQ ID No. 68 and the second oligonucleotide hybridizes to the sequence of SEQ ID No. 69 under conditions sufficient stringency for the selective amplification of a variable region of the intron of the trnL chloroplast gene plants whose sequence is represented in SEQ ID Nos. 24-67.
  • hybridization is carried out at 55 ° C in amplification buffer comprising 2mM MgCl 2.
  • the first oligonucleotide is selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 1, 4-15 and the second oligonucleotide is selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 2, 16-23.
  • the invention also relates to oligonucleotides whose sequence is selected from the group consisting of SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID Nos. 4-15 and SEQ ID Nos. 16-23.
  • the invention also relates to polynucleotides whose sequence is selected from the group comprising SEQ ID Nos. 24-67.
  • the pairs of oligonucleotides, oligonucleotides and polynucleotides according to the invention are immobilized on a solid support.
  • Another object of the present invention is a method of amplifying a variable region of the chloroplast DNA of plants comprising the following steps: a) a sample comprising plant genomic DNA is available; b) a variable region of the chloroplast DNA is amplified with a pair of oligonucleotides according to the invention or with at least one oligonucleotide according to the invention.
  • variable region of the chloroplast DNA amplified in step b) is a polynucleotide whose sequence is chosen from the group comprising SEQ ID Nos. 24-67.
  • the method for amplifying a variable region of the chloroplast DNA of the plants according to the invention comprises a step of extraction of the chloroplast DNA before the amplification step b).
  • variable region of the chloroplast DNA is amplified by a polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the invention also relates to a method for detecting a plant species in a sample comprising the following steps: a) a sample suspected of containing a plant species is available; b) an amplification reaction is carried out with a pair of oligonucleotides according to the invention, or with at least one oligonucleotide according to the invention; c) detecting the obtaining of an amplification product attesting to the presence of a plant species in the sample.
  • the amplification product is a polynucleotide whose sequence is chosen from the group comprising SEQ ID Nos. 24-67.
  • the method for detecting a plant species in a sample according to the invention comprises a step of extracting the DNA before the amplification step b).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the invention also relates to a method for identifying a plant species in a sample comprising the following steps: a) a sample suspected of containing a plant species is available; b) an amplification reaction is carried out with a pair of oligonucleotides according to the invention, or with at least one oligonucleotide according to the invention; c) the amplification product obtained is analyzed to identify the plant species contained in the sample.
  • the amplification product is a polynucleotide whose sequence is chosen from the group comprising SEQ ID Nos. 24-67.
  • step c) the sequence of the amplification product is determined to identify the plant species contained in the sample. In another embodiment, in step c), the amplification product is hybridized with at least one reference plant sequence to identify the plant species contained in the sample.
  • the reference sequence is chosen from the group comprising SEQ ID Nos. 3 and 24-67.
  • step c) the electrophoretic amplification product is analyzed to identify the plant species contained in the sample.
  • variable region of the intron gene of the chloroplast trnL gene of plants corresponding to positions 49425 to 49466 of tobacco chloroplast DNA for the detection and identification of plant species.
  • the variable region of the intron gene of the plant chloroplast trnL gene is a polynucleotide whose sequence is selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 24-67.
  • the present invention relates to polynucleotides derived from two highly conserved regions of plant chloroplast DNA. These polynucleotides derived from regions whose sequence is highly conserved throughout the plant kingdom, particularly angiosperms and gymnosperms, can be used as universal primers for the amplification or sequencing of plant chloroplast DNA. Furthermore, it has been found that, particularly advantageously, the conserved regions from which the polynucleotides of the present invention are derived flank a region of both short and highly variable chloroplast DNA. The variability of this region between plant species can therefore be used to distinguish and identify plant species.
  • polynucleotide a single strand nucleotide chain or its complementary nucleotide chain or a double-stranded may be of DNA or RNA type.
  • the polynucleotides of the invention are of the DNA type, in particular of double-stranded DNA.
  • polynucleotide also refers to modified oligonucleotides and polynucleotides.
  • the modified polynucleotides may contain modified nucleotides.
  • these modified polynucleotides are polynucleotides conjugated to binding reagents (biotin for example) or to labeled reagents (fluorescent markers for example).
  • binding reagents or labeled reagents conjugated to polynucleotides facilitate the purification or detection of these polynucleotides.
  • oligonucleotide is understood to mean a polynucleotide consisting of a short nucleotide sequence, the number of which varies from one to several tens, but generally less than 100 bases.
  • polynucleotide therefore also refers to oligonucleotides.
  • primer is meant a short sequence of oligonucleotides which, hybridized with a nucleic acid template, allows a polymerase to initiate the synthesis of a new strand of the DNA.
  • the strand produced from the primer is complementary to the strand used as a template.
  • the polynucleotides of the present invention can be immobilized on a solid support.
  • Solid supports are known that are suitable for the immobilization of polynucleotides or oligonucleotides, in particular for the manufacture of DNA chips.
  • DNA chips There are many varieties of DNA chips, which are distinguished by the type of medium used, the nature, density and mode of attachment or synthesis of nucleotide sequences on the support, and reading conditions. These techniques are known to those skilled in the art.
  • Solid supports are also understood to mean microsphere-type supports such as FLEXMAP TM products from LUMINEX® and LiquidChip TM products from QIAGEN®.
  • the polynucleotides of the present invention are isolated or purified from their natural environment.
  • the polynucleotides of the present invention may be prepared by standard molecular biology techniques as described by Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989) or by chemical synthesis.
  • Plant species means any living organism belonging to the plant kingdom.
  • the invention also relates to a pair of oligonucleotides in which the first oligonucleotide hybridizes to a first highly conserved region of the chloroplast DNA and the second oligonucleotide hybridizes to a second highly conserved region of the chloroplast DNA under conditions sufficient stringency for selective amplification of a variable region of the intron of the plant chloroplast gene.
  • the sequence of the first conserved region corresponds to the sequence of primer g (SEQ ID No.1) and its sequence complementary (SEQ ID No. 68).
  • the sequence of the second conserved region corresponds to the sequence of primer h (SEQ ID No. 2) and its complementary sequence (SEQ ID No. 69).
  • the oligonucleotide pairs of the present invention allow selective amplification of the variable region of the intron of the tobacco trnL chloroplast gene whose sequence is shown in SEQ ID No 3.
  • sequences of the oligonucleotide pairs of the present invention are selected such that the first oligonucleotide hybridizes to SEQ ID No. 68 and the second oligonucleotide hybridizes to SEQ ID No. 69 under sufficient stringency conditions. to allow selective amplification of the variable region of the intron of the plant chloroplast gene.
  • the person skilled in the art knows the DNA amplification reactions and the stringency conditions allowing selective amplification, and in particular the conditions of hybridization temperature and composition of the hybridization buffer.
  • primers g SEQ ID No. 1
  • h SEQ ID No. 2
  • sequence variations are instead introduced at the 5 'end of the oligonucleotides so as not to compromise the amplification reaction.
  • additional nucleotides can be introduced at the 5 'end of the oligonucleotides.
  • hybridizing is meant according to the invention sequences which hybridize with the reference sequence at a level above the background noise significantly.
  • the level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of hybridizing selectively and the reference sequences is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of the interaction of the other DNA sequences generating the signal. background noise.
  • Stringent hybridization conditions allowing selective hybridization are well known to those skilled in the art.
  • the hybridization and washing temperature is at least 5 ° C below the Tm of the reference sequence at a given pH and for a given ionic strength.
  • the hybridization temperature is at least 30 ° C. for a polynucleotide of 15 to 50 nucleotides and at least 60 ° C.
  • the hybridization is carried out in the following buffer: 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA.
  • the washes are, for example, carried out successively at low stringency in a 2X SSC buffer, 0.1% SDS, medium-stringency in a 0.5 ⁇ SSC buffer, 01% SDS and with high stringency in a 0.1 ⁇ SSC buffer. , 1% SDS.
  • Hybridization can of course be carried out according to other usual methods well known to those skilled in the art (see in particular Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989).
  • polynucleotides hybridizing selectively to a reference polynucleotide retain the function of the reference sequence.
  • the function of polynucleotides is the amplification of a variable region of chloroplast DNA.
  • stringency is meant the rigor of the operating conditions (in particular the temperature and the ionic strength) in which a molecular hybridization takes place.
  • amplification is meant any enzymatic amplification in vitro of a defined sequence of DNA.
  • the positioning of the primers (short sequences of specifically chosen oligonucleotides) opposite their complementary sequences on the DNA strands and their attachment to the target is the second phase of the method
  • the extension phase involves an enzyme, I 1 DNA polymerase, which synthesizes, from the primers, the complementary strand to that used matrix. Repetition of this cycle leads to exponential amplification of the DNA fragment.
  • the invention also relates to a method for amplifying a variable region of the chloroplast DNA of plants using the polynucleotides, oligonucleotides and / or pairs of oligonucleotides according to the invention.
  • DNA sequence amplification methods are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • the polymerase chain reaction (PCR) may be mentioned, but any type of amplification reaction may be used in the processes according to the invention.
  • sequences of the polynucleotides according to the present invention are highly conserved throughout the plant kingdom, these polynucleotides can be used for the detection of plant species.
  • detection is meant the determination of the presence of a plant species in a sample but also the measurement and quantification of a plant species in a sample.
  • detection is meant the determination of the presence of a plant species in a sample but also the measurement and quantification of a plant species in a sample.
  • sample in an analytical procedure means the substance to be measured.
  • the sample usually comprises an organic substance suspected of containing a plant species.
  • the methods of the present invention allow the analysis of samples consisting of decomposing or degraded material by heating, lyophilization, freezing or any other treatment resulting in degradation of the DNA.
  • the methods of the present invention thus allow the detection of plant species in processed foods for example.
  • Another application of the methods of the present invention is the detection of plant species in substrates derived from frozen soils (permafrost) or in fossilized remains.
  • the sample may be processed prior to carrying out the amplification reaction using the polynucleotides of the invention.
  • it may be a DNA extraction step according to routine techniques well known to those skilled in the art.
  • extraction is meant the operation of extracting a substance from a medium using a solvent for example or by any other physicochemical method.
  • the invention also relates to the use of the variable region of the intron gene of the chloroplast gene trnL of plants corresponding to positions 49425 to 49466 of tobacco chloroplast DNA for the detection and identification of plant species.
  • SEQ ID No. 1 Primer g.
  • SEQ ID No. 2 Primer h.
  • SEQ ID No. 3 Amplified variable sequence of Nicotiana tabacum.
  • SEQ ID No. 4-15 Variations of primer g.
  • SEQ ID No. 16-23 Variants of primer h.
  • SEQ ID NO: 24-67 Amplified variable sequence of different plant species.
  • SEQ ID No. 68 Sequence of the region complementary to primer g.
  • SEQID No. 69 Sequence of the region complementary to primer h.
  • Figure 1 Location of the study area and universal primers on the tobacco chloroplast DNA sequence (Shinozaki K, Ohme M, Tanaka M, Wakasugi T, Hayashida N, Matsubayashi T, Zaita N, Chunwongse J, Obokata J, Yamaguchi-Sinozaki K, Ohto C, Torazawa K, Ment B, Sugita M, Deno H, Kamogashira T, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H (1986) The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome Plant Molecular Biology Reporter, 4, 110-147); c and d represent the primers defined by Taberlet et al.
  • Figure 2 Examples of amplifications obtained with primers g and h, from DNA extracts from degraded substrates. 1, cooked potato; 2, cooked dough; 3 and 4, soup in lyophilized sachet; 5, negative control of extraction (amplification reaction from extraction without subtrate); 6, negative amplification control (amplification reaction without DNA extract); 7, positive control (Cyclamen DNA); M, molecular weight marker. It is interesting to note that the fragment corresponding to the baked potato (79 bp) is shorter than that corresponding to cooked dough and therefore to wheat (92 bp).
  • Figure 3 Experiment comparing the effectiveness of primers c-d (lanes 1-4) and g-h (lanes 5-8) for the amplification of DNA extracted from degraded substrate (breadcrumbs).
  • M molecular weight marker. 1 and 5, DNA extracted from breadcrumbs. 2 and 6, extraction control. 3 and 7, amplification control.4 and 8, positive control.
  • Figure 4 shows, in schematic form, the general approach that could be applied to identify plants using certain embodiments of the invention.
  • the first step is to extract the DNA from the substrate.
  • the second step is the amplification of the extract using the PCR (Polymerase Chain Reaction) method.
  • the analysis of the amplification product is the third step.
  • Four alternative solutions are presented.
  • the first possibility of analysis concerns only simple substrates (only one plant species present) and consists of directly sequencing the amplification product with conventional methods.
  • the second and third possibilities are reserved for complex substrates containing a mixture of plants.
  • the analysis is either carried out after cloning the amplification product and then sequencing several clones (see Table 4 for an example of a result), or after hybridization on a support with the potential target sequences (method not illustrated, which involves prior knowledge species likely to be present).
  • a last possibility of analysis is to characterize the electrophoretic amplification products (either denaturing or non-denaturing SSCP type). This latter possibility can be used either for simple substrates (only one plant species present) or for substrates containing a mixture.
  • PCR conditions used for electrophoretic detection are as follows: a) Amplification conditions for detection with a fluorochrome labeled primer g:
  • Table 1 shows the sequences of the universal primers used to amplify the variable region of chloroplast DNA for identifying the plants after extraction and amplification from degraded substrates.
  • the positions of the 3 'base on the tobacco reference sequence are shown in the table (Shinozaki K, Ohme M, Tanaka M, Wakasugi T,
  • Table 2 shows the variations in the area amplified by primers g and h for different plant species used in food composition (see also Table 3). These sequences have either been imported from
  • GenBank public database of DNA sequence
  • Table 2 represents the alignment of sequences showing firstly the area on which the universal primers have been defined, and secondly the variability of the amplified region. Nucleotides underlined in the regions corresponding to the primers indicate mismatches with the universal primers g and h. For the amplified region, the underlines indicate identical sequences.
  • JCJUCAAI CC 1 jr ATCCTATTATTTTATTATTATTTTACGAAAC cocoa AGCCAA TAAACAAAGGTTCAGCAAGCGAGAAT GAGACTCAAT AATAAAAAAAG GG
  • Cicer arietinum AAGTTCAGAAAGTTAAAATCAAAAAA GAGACTCAAT AGCCAA G GG
  • the amplified region shows not only a variation in size between the different species, but also a variation of sequences. It is interesting to note that the level of variability makes it possible to identify the vast majority of species consumed. However, closely related species may in some cases not be discernible. This is the case in our example between wheat and rye, and between cabbage and turnip.
  • Table 3 represents the common names and origins of the food sequences in Table 2.
  • LECA sequences produced by the inventors.
  • the DNA of several complex and / or transformed substrates was extracted using a conventional extraction kit and following the manufacturer's instructions (Dneasy Plant Mini kit, Qiagen).
  • the substrates tested were: (i) Cane sugar (ii) Baked potato (iii) Cooked paste (iv) Freeze-dried bagged soup
  • DNA was extracted from 50 mg dry weight. The final volume of the DNA extract was recovered in 200 ⁇ l.
  • Amplification was performed using primers g and h (Table 1), and the following amplification conditions: (i) final volume: 25 ⁇ l (ii) MgCl 2 : 2 mM (iii) dNTP: 0.2 mM each (iv) Primers: 1 ⁇ M each
  • Figure 2 illustrates an amplification result.
  • the amplification products were then sequenced by direct sequencing on ABI 3100 automated capillary sequencer.
  • the sequences obtained for cane sugar, baked potato, and cooked dough are identical to the sugar cane sequences respectively (Saccharum officinarum), potato (Solanum tuberosum), and wheat (Triticum aestivum).
  • the sequence obtained by direct sequencing for freeze-dried bag soup is not legible, which indicates that it is a mixture. So we cloned the PCR product from the soup into a lyophilized bag to separate the different molecules.
  • Table 4 shows the results of the cloning of the amplification product obtained from the lyophilized bag soup (23 clones sequences). The results obtained correspond to the composition indicated on the sachet.
  • L 1 genomic DNA was extracted from 100 mg of bread using an extraction kit (DNeasy Plant Mini Kit, Qiagen) and following the supplier's instructions. The final volume of the DNA extract was recovered in 100 ⁇ l.
  • the amplification was carried out using on the one hand the primers g and h, and on the other hand the primers c and d (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non -coding regions of chloroplast DNA, Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109).
  • the following amplification conditions were applied: final volume: 25 ⁇ l
  • Denaturation 30 s at 95 ° C.
  • Hybridization 30 s at 55 ° C.
  • elongation 60 s at 72 ° C.
  • Figure 3 shows the results obtained. No amplification product appears with primers c and d, while an amplification product is obtained with primers g and h.

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Abstract

Polynucléotides et amorces flanquant une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux pour la détection et l'identification d'espèces végétales. Procédés de détection et d'identification d'espèces végétales dans des mélanges complexes ou dégradés.

Description

Amorces universelles et leur utilisation pour la détection et l'identification de végétaux dans des mélanges complexes
La présente invention concerne des oligonucléotides et leur utilisation comme amorces universelles pour la détection et l'identification d'espèces végétales notamment dans des substrats complexes ou dégradés.
On connaît différentes méthodes permettant l'identification de végétaux basées sur l'analyse du génome, mais aucune ne permet pour l'instant de travailler sur des substrats dégradés et/ou complexes.
Les méthodes d'empreintes génétiques sont ainsi basées sur l'analyse du génome complet. L'objectif de ces méthodes est de fournir une empreinte génétique propre à chaque individu (identification de l'individu et non de l'espèce). Cependant, bien que ce ne soit pas l'objectif initial, elles peuvent aussi permettre dans une certaine mesure l'identification de l'espèce. Toutes ces méthodes nécessitent l'obtention d'ADN de bonne qualité (non dégradé), et sans mélange avec des ADN exogènes (provenant d'autres organismes). De ce fait, il est impossible d'utiliser ces approches pour l'identification de végétaux dans des substrats dégradés ou complexes.
A titre d'exemple de méthode d'empreinte génétique, on peut citer les méthodes AFLP et DArT.
La méthode AFLP "Amplified Fragment Length Polymorphism" est actuellement très utilisée à la fois en génétique des populations et en cartographie génétique (Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Homes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23, 4407-4414 ; US Patent 6,045,994). Elle est basée sur une digestion/ligation de I1ADN génomique, suivie de deux amplifications successives utilisant des amorces PCR particulières de manière à simplifier le génome pour le rendre analysable par électrophorèse. Elle nécessite de l'ADN de très bonne qualité, et en quantité suffisante (plusieurs centaines de nanogrammes d'ADN en général). Il est absolument impossible d'utiliser cette approche de manière pertinente pour l'analyse de substrats dégradés et complexes. La méthode DArT "Diversity Array Technology" est basée sur une approche très similaire (digestion/ligation puis amplification), mais en diffère par la méthode d'analyse (hybridation) (Jaccoud D, Peng K, Feinstein D, Kilian A (2001 ) Diversity arrays: a solid state technology for séquence information independent genotyping. Nucleic Acids Research, 29, e25 ; US patent n° 6,713,258). Il est également impossible d'utiliser cette approche sur des substrats dégradés et complexes.
D'autres méthodes sont basées sur l'amplification et le séquençage. D'un point de vue théorique, le séquençage d'une région homologue suffisamment longue (plusieurs centaines de paires de bases) possède le potentiel pour permettre l'identification de l'espèce chez les végétaux. Une telle région doit être encadrée par des zones très conservées autorisant la conception d'amorces universelles pour l'amplification. L1ADN nucléaire n'est pas très approprié, car son accès est très difficile voire impossible dans le cas de substrats dégradés Cependant, en ce qui concerne I1ADN nucléaire, les ITS (Internai Transcripted Spacer de I1ADN ribosomique) ont été utilisés pour la détection et l'identification de végétaux. Des amorces universelles ont été décrites chez les champignons et se sont avérées fonctionner également chez les végétaux (White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA gènes for phylogenetics In: PCR protocols, a guide to methods and applications (eds. Innis MA, Gelfand DH, Sninski JJ, White TJ), pp. 315-322. Académie Press, San Diego, California). De ce fait, cette région de quelques centaines de paires de bases a été utilisée pour effectuer des phylogénies entre espèces proches chez les végétaux (Baldwin BG (1992) Phylogenetic utility of the internai transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: an example from the Compositae. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1 , 3-16 ; Gielly L, Yuan Y-M, Kϋpfer P, Taberlet P (1996) Phylogenetic use of noncoding régions in the genus Gentiana L.: chloroplast trnL (UAA) intron versus nuclear ribosomal internai transcribed spacer séquences. Molecular Phylogenetics and Evolution, 6, 460-466) et pour identifier les espèces (voir par exemple Linder C, Moore L, Jackson R (2000) A universal molecular method for identifying underground plant parts to species. Molecular Ecology, 9, 1549-1559 ou le site web de la société "Bioprofiles": http://www.bioprofiles.co.uk/). Cependant, cette région possède des inconvénients. Premièrement, elle est trop longue pour être utilisée dans le cas de substrats très dégradés, de plus il s'agit de séquences nucléaires certes répétées, mais de manière moindre que celles présentes dans I1ADN chloroplastique. Deuxièmement, les amorces peuvent amplifier plusieurs types de séquence au sein d'une même espèce. Enfin, les amorces ne sont pas réellement universelles et il peut être difficile d'obtenir une amplification chez certaines espèces. En revanche, les ADN mitochondrial et chloroplastique sont présents de manière hautement répétées dans chaque cellule (plusieurs centaines de copies). Il en résulte qu'ils représentent une cible pour l'amplification beaucoup plus accessible dans le cas de substrats dégradés. L1ADN mitochondrial est cependant trop peu variable chez les végétaux. Ainsi , plusieurs articles décrivent des amorces universelles ciblant différentes régions de I1ADN chloroplastique (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding régions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109 ; Démesure B, Sodzi N, Petit RJ (1995) A set of universal primers for amplification of polymorphic non- coding régions of mitochodrial and chloroplast DNA in plants. Molecular Ecology, 4, 129-131 ; Dumolin-Lapègue S, Pemonge M-H, Petit RJ (1996) An enlarged set of consensus primers for the study of organelle DNA in plants. Molecular Ecology, 5, 393-397 ; et Hamilton MB (1999) Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic régions with intraspecific variation. Molecular Ecology, 8, 521- 523). Certaines d'entre elles ont été largement utilisées pour amplifier et séquencer des régions variables de I1ADN chloroplastique. Il s'agit principalement des amorces c et d (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991 ) Universal primers for amplification of three non-coding régions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109) qui amplifient Pintron du gène de l'ARN de transfert pour la Leucine, codon UAA (trnL UAA). Actuellement, plusieurs milliers de séquences de cet intron sont disponibles dans les bases de données publiques (GenBank). L'intron du gène trnL (UAA) est très variable, mais possède aussi des parties conservées lié au fait qu'il peut constituer des structures secondaires (Simon D, Fewer D, Friedl T, Bhattacharya D (2003) Phylogeny and self-splicing ability of the plastid tRNA-Leu group ! intron. Journal of Molecular Evolution, 57, 710-720). Cependant, ces amorces c et d amplifient des régions trop longues pour être utilisées sur des substrats dégradés.
Une autre solution pour l'identification spécifique a été proposée par Bobowski et al. (Bobowski B, HoIe D, WoIf P, Bryant L (1999) Identification of roots of woody species using polymerase chain reaction (PCR) and restricted fragment length polymorphism (RFLP) analysis. Molecular Ecology, 8, 485-491 ) : amplification du gène rbcL à l'aide d'amorces universelles, et caractérisation du produit d'amplification par digestion enzymatique suivi d'une migration sur gel (le produit pourrait être également caractérisé par séquençage direct).
Cependant, toutes ces amorces amplifient des régions trop longues pour être utilisées sur des substrats dégradés. C'est la raison pour laquelle d'autres amorces ont été définies par Poinar et al. (Poinar HN, Hofreiter M, Spaulding WG, Martin PS, Stankiewicz BA, Bland H, Evershed RP, Possnert G, Pââbo S (1998) Molecular coproscopy: Dung and diet of the extinct ground sloth Nothrotheriops shastensis. Science, 281 , 402-406) afin d'amplifier des fragments plus courts, compatibles avec l'analyse de restes "fossiles" (coprolithes d'un paresseux disparu dans ce cas). Ces auteurs ont conçu des amorces dans le gène chloroplastique rbcL. Les fragments amplifiés permettent tout juste d'identifier la famille, et ces amorces ne sont pas vraiment universelles. Malgré cela, en l'absence d'alternative, Willerslev et al. (Willerslev E, Hansen AJ, Binladen J, Brand TB, Gilbert MTP, Shapiro B, Bunce M, Wiuf C, Gilichinsky DA, Cooper A (2003) Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sédiments. Science, 300, 791-795) ont utilisé les amorces de Poinar et al. (Poinar HN, Hofreiter M, Spaulding WG, Martin PS, Stankiewicz BA, Bland H, Evershed RP, Possnert G, Pâabo S (1998) Molecular coproscopy: Dung and diet of the extinct ground sloth Nothrotheriops shastensis. Science, 281 , 402-406) dans leur analyse de I1ADN extrait du permafrost (sol gelé). Leur objectif était de caractériser les ADN végétaux encore présents dans des sols. Là aussi, seules les familles ont pu être identifiées.
Pour résumer, soit les systèmes proposés pour l'instant se basent sur des séquences trop longues pour être efficaces dans l'analyse de substrats dégradés, soit le niveau de variabilité des fragments courts n'est pas assez élevé pour être vraiment utile dans l'identification des végétaux. Les régions à la fois suffisamment courtes et suffisamment variables sont rares et aucune n'a été caractérisée.
Pour remédier aux inconvénients de l'état de la technique, la présente invention propose de nouveaux oligonucléotides et leur utilisation comme amorces universelles pour la détection et l'identification d'espèces végétales. Les oligonucléotides de la présente invention permettent d'amplifier une région très courte mais également très variable de l'intron du gène trnL (UAA) de l'ADN chloroplastique.
Un premier avantage de la présente invention est que les oligonucléotides et les méthodes de la présente invention permettent la détection et l'identification des végétaux dans des substrats complexes ou dégradés tels que des substrats transformés (par la chaleur, la lyophilisation, etc.) car la région amplifiée est à la fois courte et très variable.
Un autre avantage de la présente invention est que la région amplifiée est non seulement très variable entre espèces végétales mais possède également des régions flanquantes très conservées permettant l'amplification de la région d'intérêt dans différentes espèces végétales à l'aide d'amorces universelles.
Un autre avantage de la présente invention est que l'intron du gène trnL (UAA) est l'une des rares séquences chloroplastiques pour laquelle plusieurs milliers de séquences sont disponibles dans les bases de données telles que GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). L'analyse de la région variable amplifiée à l'aide des amorces universelles permet donc d'identifier l'espèce végétale correspondante en se référant aux séquences disponibles dans les bases de données. Des méthodes permettant l'identification de végétaux dans des substrats complexes ou dégradés présentent un grand intérêt. On citera par exemple les applications dans l'industrie agroalimentaire où, par exemple, le respect des critères de traçabilité impose le développement de nouvelles méthodes d'analyses permettant d'identifier la composition détaillée en espèces végétales de préparations alimentaires.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Un premier objet de la présente invention est une paire d'oligonucléotides dans laquelle le premier oligonucléotide s'hybride à Ia séquence de la SEQ ID No. 68 et le deuxième oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 69 dans des conditions de stringence suffisantes pour l'amplification sélective d'une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL du tabac dont la séquence est représentée à la SEQ ID No. 3.
Un autre objet de la présente invention est une paire d'oligonucléotides dans laquelle premier oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 68 et le deuxième oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 69 dans des conditions de stringence suffisantes pour l'amplification sélective d'une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux dont la séquence est représentée aux SEQ ID Nos. 24-67.
Typiquement, l'hybridation s'effectue à 55°C dans un tampon d'amplification comprenant du MgC^ 2mM. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le premier oligonucléotide est choisi dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 1 , 4-15 et le deuxième oligonucléotide est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 2, 16-23.
L'invention concerne aussi des oligonucléotides dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant la SEQ ID No. 1 , la SEQ ID No. 2, les SEQ ID Nos. 4-15 et les SEQ ID Nos. 16-23.
L'invention concerne aussi des polynucléotides dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 24-67.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les paires d'oligonucléotides, les oligonucléotides et les polynucléotides selon l'invention sont immobilisés sur un support solide.
Un autre objet de la présente invention est un procédé d'amplification d'une région variable de l'ADN chloroplastique des végétaux comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon comprenant de l'ADN génomique végétal ; b) on amplifie une région variable de l'ADN chloroplastique avec une paire d'oligonucléotides selon l'invention ou avec au moins un oligonucléotide selon l'invention.
Dans un mode de réalisation particulier, la région variable de l'ADN chloroplastique amplifiée à l'étape b) est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 24-67. Dans un autre mode de réalisation particulier, le procédé d'amplification d'une région variable de l'ADN chloroplastique des végétaux selon l'invention comprend une étape d'extraction de l'ADN chloroplastique avant l'étape d'amplification b).
De préférence, on amplifie la région variable de l'ADN chloroplastique par une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR).
L'invention concerne aussi un procédé de détection d'une espèce végétale dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon suspecté de contenir une espèce végétale ; b) on effectue une réaction d'amplification avec une paire d'oligonucléotides selon l'invention, ou avec au moins un oligonucléotide selon l'invention ; c) on détecte l'obtention d'un produit d'amplification attestant de la présence d'une espèce végétale dans l'échantillon. Dans un mode de réalisation particulier, le produit d'amplification est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 24-67.
Dans un autre mode de réalisation, le procédé de détection d'une espèce végétale dans un échantillon selon l'invention comprend une étape d'extraction de l'ADN avant l'étape d'amplification b).
De préférence, on effectue une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR).
L'invention se rapporte aussi à un procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon suspecté de contenir une espèce végétale ; b) on effectue une réaction d'amplification avec une paire d'oligonucléotides selon l'invention, ou avec au moins un oligonucléotide selon l'invention ; c) on analyse le produit d'amplification obtenu pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon.
Dans un mode de réalisation particulier, le produit d'amplification est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 24-67.
Dans un mode de réalisation, à l'étape c), on détermine la séquence du produit d'amplification pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon. Dans un autre mode de réalisation, à l'étape c), on hybride le produit d'amplification avec au moins une séquence végétale de référence pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon.
De préférence, la séquence de référence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 3 et 24-67.
Dans un autre mode de réalisation, à l'étape c), on analyse le produit d'amplification par électrophorèse pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon.
L'invention se rapporte aussi à l'utilisation de la région variable du gène de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux correspondant aux positions 49425 à 49466 de l'ADN chloroplastique du tabac pour la détection et l'identification d'espèces végétales. Dans un mode de réalisation particulier, la région variable du gène de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 24-67.
La présente invention concerne des polynucléotides dérivés de deux régions très conservées de l'ADN chloroplastique des végétaux. Ces polynucléotides dérivés de régions dont la séquence est très conservée dans tout le règne végétal, en particulier chez les angiospermes et les gymnospermes, peuvent être utilisés comme amorces universelles pour l'amplification ou le séquençage de l'ADN de chloroplaste des végétaux. En outre, on a trouvé que, de façon particulièrement avantageuse, les régions conservées dont sont dérivés les polynucléotides de la présente invention flanquent une région à la fois courte et très variable de l'ADN chloroplastique. La variablité de cette région entre espèces végétales peut donc être utilisée pour distinguer et identifier les espèces végétales. Selon la présente invention, on entend par "polynucléotide " une chaîne nucléotidique simple brin ou son complémentaire ou une chaîne nucléotidique ' double brin pouvant être de type ADN ou ARN. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les oligonucléotides et les polynucléotides modifiés. Typiquement, les polynucléotides modifiés peuvent contenir des nucléotides modifiés. Alternativement, ces polynucléotides modifiés sont des polynucléotides conjugués à des réactifs de liaison (biotine par exemple) ou à des réactifs marqués (marqueurs fluorescents par exemple). Classiquement, les réactifs de liaison ou les réactifs marqués conjugués aux polynucléotides facilitent la purification ou la détection de ces polynucléotides.
Selon l'invention, on entend par « oligonucléotide » un polynucléotide constitué d'une courte séquence de nucléotides, dont le nombre varie d'une à quelques dizaines, mais généralement inférieur à 100 bases. Le terme « polynucléotide » désigne donc aussi les oligonucléotides.
On entend par « amorce » une courte séquence d'oligonucléotides qui, hybridée avec une matrice d'acide nucléique, permet à une polymérase d'entamer la synthèse d'un nouveau brin de l'ADN. Le brin produit à partir de l'amorce est complémentaire au brin utilisé comme matrice.
Avantageusement, les polynucléotides de la présente invention peuvent être immobilisés sur un support solide. On connaît les support solides adaptés à l'immobilisation de polynucléotides ou d'oligonucléotides notamment pour la fabrication des puces à ADN. Il existe de nombreuses variétés de puces à ADN, qui se distinguent par le type de support utilisé, la nature, la densité et le mode de fixation ou de synthèse des séquences nucléotidiques sur le support, et les conditions de lecture. Ces techniques sont connues de l'homme du métier. On entend également par support solide des supports de type microsphères tels que les produits FLEXMAP™ de la société LUMINEX® et les produits LiquidChip™ de la société QIAGEN®.
De manière générale, les polynucléotides de la présente invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. ( Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989) ou par synthèse chimique.
On entend par « espèce végétale » tout organisme vivant faisant partie du règne végétal.
L'invention concerne également une paire d'oligonucléotides dans laquelle le premier oligonucléotide s'hybride à une première région très conservée de l'ADN chloroplastique et le deuxième oligonucléotide s'hybride à une deuxième région très conservée de l'ADN chloroplastique dans des conditions de stringence suffisantes pour l'amplification sélective d'une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux. La séquence de la première région conservée correspond à la séquence de l'amorce g (SEQ ID No.1 ) et de sa séquence complémentaire (SEQ ID No. 68). La séquence de la deuxième région conservée correspond à la séquence de l'amorce h (SEQ ID No.2) et de sa séquence complémentaire (SEQ ID No. 69).
Chez le tabac qui peut être utilisé comme espèce végétale de référence les paires d'oligonucléotides de la présente invention permettent l'amplification sélective de la région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL du tabac dont la séquence est représentée à la SEQ ID No. 3.
Les séquences des paires d'oligonucléotides de la présente invention sont choisies de telle façon que le premier oligonucléotide s'hybride à la SEQ ID No. 68 et le deuxième oligonucléotide s'hybride à la SEQ ID No. 69 dans des conditions de stringence suffisantes pour permettre l'amplification sélective de la région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux.
L'homme du métier connaît les réactions d'amplification d'ADN et les conditions de stringence permettant une amplification sélective et notamment les conditions température d'hybridation et de composition du tampon d'hybridation.
L'homme du métier pourra donc facilement définir différentes variantes des amorces g (SEQ ID No. 1 ) et h (SEQ ID No. 2) en utilisant des techniques de routine. Ces variantes s'hybrident aux séquences de référence et permettent l'amplification sélective de la région variable d'intérêt de l'ADN chloroplastique. Certaines variantes possibles de l'amorce g sont représentées aux SEQ ID Nos. 4- 15 et certaines variantes possibles de l'amorce h sont représentées aux SEQ ID Nos. 16-23. Habituellement, les variations de séquence sont plutôt introduites à l'extrémité 5' des oligonucléotides pour ne pas compromettre la réaction d'amplification. Classiquement on peut par exemple introduire des nucléotides supplémentaires à l'extrémité 5' des oligonucléotides.
Par "s'hybrider", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier. En général la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 3O0C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 6O0C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant: 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 μg/ml denatured salmon sperm DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0,1 %SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01 %SDS et à forte stringence dans un tampon 0,1 X SSC, 0,1 %SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989).
De préférence, les polynucléotides s'hybridant de manière sélective à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence. Dans la présente invention, la fonction des polynucléotides est l'amplification d'une région variable de l'ADN chloroplastique.
Par « stringence » on entend la rigueur des conditions opératoires (notamment la température et la force ionique) dans lesquelles se déroule une hybridation moléculaire.
Par « amplification » on entend toute amplification enzymatique in vitro d'une séquence définie d'ADN.
Habituellement, l'amplification comporte des cycles successifs
(généralement de 20 à 40) d'amplification, eux-mêmes composés de trois phases : après une étape de dénaturation (séparation des deux brins de la double hélice) de
I1ADN, le positionnement des amorces (courtes séquences d'oligonucléotides spécifiquement choisies) en face de leurs séquences complémentaires, sur les brins d'ADN, et leur fixation sur ces cibles constitue la deuxième phase du procédé
(hybridation). La phase d'extension fait intervenir une enzyme, I1ADN polymérase, qui synthétise, à partir des amorces, le brin complémentaire de celui ayant servi de matrice. La répétition de ce cycle conduit à l'amplification exponentielle du fragment d'ADN.
L'invention concerne aussi un procédé d'amplification d'une région variable de l'ADN chloroplastique des végétaux à l'aide des polynucléotides, des oligonucléotides et/ou des paires d'oligonucléotides selon l'invention.
Les procédés d'amplification de séquence d'ADN sont bien connues de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. On citera la réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) mais tout type de réaction d'amplification peut être utilisée dans les procédés selon l'invention.
Etant donné que les séquences des polynucléotides selon la présente invention sont fortement conservées dans tout le règne végétal, ces polynucléotides peuvent être utilisés pour la détection d'espèces végétales.
On entend par « détection » la détermination de la présence d'une espèce végétale dans un échantillon mais aussi la mesure et la quantification d'une espèce végétale dans un échantillon. A l'aide des polynucléotides de la présente invention il est maintenant possible d'amplifier une région très variable de l'ADN de chloroplaste. La séquence de cette région diffère d'une espèce végétale à l'autre de telle sorte que chaque séquence est spécifique d'une espèce ou d'un petit nombre d'espèces très proches. Une fois que la région variable a été amplifiée, sa séquence est analysée pour identifier l'espèce végétale. L'analyse peut être effectuée par différentes méthodes bien connues de l'homme du métier. Il peut s'agir d'un séquencage complet ou partiel suivi d'une comparaison avec des séquences connues. Alternativement, il peut s'agir de la détermination du degré d'homologie avec des séquences connues (séquences de référence) en faisant appel à des techniques d'hybridation par exemple. Une autre possibilité est l'analyse par électrophorèse puis la comparaison avec des séquences de référence. Les procédés selon la présente invention permettent donc de déterminer l'identité d'une espèce végétale présente dans un échantillon. On entend par « échantillon » dans une procédure d'analyse, la substance à mesurer. Dans la présente invention, l'échantillon comprend habituellement une substance organique suspectée de contenir une espèce végétale. De façon avantageuse, les procédés de la présente invention permettent l'analyse d'échantillons constitués de matière en décomposition ou dégradée par chauffage, lyophilisation, congélation ou par tout autre traitement entraînant une dégradation de l'ADN. Les procédés de la présente invention permettent ainsi la détection d'espèces végétales dans des aliments transformés par exemple. Une autre application des procédés de la présente invention est la détection d'espèces végétales dans des substrats issus de sols gelés (permafrost) ou dans des restes fossilisés.
L'échantillon peut subir un traitement avant d'effectuer la réaction d'amplification à l'aide des polynucléotides de l'invention. Typiquement, il peut s'agir d'une étape d'extraction de l'ADN selon des techniques de routine bien connues de l'homme du métier. On entend par « extraction » l'opération consistant à extraire une substance d'un milieu à l'aide d'un solvant par exemple ou par toute autre méthode physico-chimique.
L'invention concerne aussi l'utilisation de la région variable du gène de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux correspondant aux positions 49425 à 49466 de l'ADN chloroplastique du tabac pour la détection et l'identification d'espèces végétales.
A partir de la séquence de référence du tabac (Shinozaki K, Ohme M, Tanaka M, Wakasugi T, Hayashida N, Matsubayashi T, Zaita N, Chunwongse J, Obokata J, Yamaguchi-Sinozaki K, Ohto C, Torazawa K, Ment B, Sugita M, Deno H, Kamogashira T, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H (1986) The complète nucleotide séquence of the tobacco chloroplast génome. Plant Molecular Biology Reporter, 4, 110-147) et des positions de la région variable sur cette séquence de référence, l'homme du métier peut identifier les séquences correspondantes chez d'autres espèces végétales à l'aide de techniques de routine.
DESCRIPTION DU LISTAGE DE SEQUENCES
SEQ ID No. 1 : Amorce g.
SEQ ID No. 2 : Amorce h.
SEQ ID No. 3 : Séquence variable amplifiée de Nicotiana tabacum.
SEQ ID No. 4-15 : Variantes de l'amorce g.
SEQ ID No. 16-23 : Variantes de l'amorce h. SEQ ID No. 24-67 : Séquence variable amplifiée de différentes espèces végétales.
SEQ ID No. 68 : Séquence de la région complémentaire à l'amorce g.
SEQID No. 69 : Séquence de la région complémentaire à l'amorce h.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Localisation de la zone étudiée et des amorces universelles sur la séquence de l'ADN chloroplastique de tabac (Shinozaki K, Ohme M, Tanaka M, Wakasugi T, Hayashida N, Matsubayashi T, Zaita N, Chunwongse J, Obokata J, Yamaguchi-Sinozaki K, Ohto C, Torazawa K, Ment B, Sugita M, Deno H, Kamogashira T, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H (1986) The complète nucleotide séquence of the tobacco chloroplast génome. Plant Molecular Biology Reporter, 4, 110-147) ; c et d représentent les amorces définies par Taberlet et al. (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991 ) Universal primers for amplification of three non-coding régions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109), g et h représentent les amorces universelles définies dans le cadre de cette demande de brevet.
Figure 2 : Exemples d'amplifications obtenues avec les amorces g et h, à partir d'extraits d'ADN provenant de substrats dégradés. 1 , pomme de terre cuite; 2, pâte cuite; 3 et 4, potage en sachet lyophilisé; 5, contrôle négatif de l'extraction (réaction d'amplification à partir d'une extraction sans subtrat); 6, contrôle négatif d'amplification (réaction d'amplification sans extrait d'ADN); 7, contrôle positif (ADN de Cyclamen); M, marqueur de poids moléculaire. Il est intéressant de noter que le fragment correspondant à la pomme de terre cuite (79 pb) est plus court que celui correspondant à la pâte cuite et donc au blé (92 pb).
Figure 3 : Expérimentation comparant l'efficacité des amorces c-d (pistes 1-4) et g- h (pistes 5-8) pour l'amplification d'ADN extrait de substrat dégradé (mie de pain). M, marqueur de poids moléculaire. 1 et 5, ADN extrait de mie de pain. 2 et 6, contrôle d'extraction. 3 et 7, contrôle d'amplification.4 et 8, contrôle positif.
Figure 4 : La Figure 4 présente, sous forme schématique, la démarche générale qui pourrait être appliquée pour identifier des végétaux en utilisant certains modes de réalisation de l'invention. La première étape consiste à extraire l'ADN à partir du substrat. La seconde étape est l'amplification de l'extrait à l'aide de la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction). L'analyse du produit d'amplication constitue la troisième étape. Quatre solutions alternatives se présentent. La première possibilité d'analyse ne concerne que les substrats simples (une seule espèce végétale présente) et consiste à séquencer directement le produit d'amplification avec les méthodes classiques. Les deuxièmes et troisièmes possibilités sont réservées pour les substrats complexes contenant un mélange de végétaux. L'analyse est soit effectuée après clonage du produit d'amplification puis séquençage de plusieurs clones (voir Tableau 4 pour un exemple de résultat), soit après hybridation sur un support avec les séquences cibles potentielles (méthode non illustrée, qui implique la connaissance préalable des espèces susceptibles d'être présentes). Une dernière possibilité d'analyse consiste à caractériser les produits d'amplification par électrophorèse (soit dénaturante, soit non dénaturante de type SSCP). Cette dernière possibilité peut aussi bien être utilisée pour des substrats simples (une seule espèce végétale présente) ou pour des substrats contenant un mélange.
En ce qui concerne l'analyse par séquençage direct, les conditions PCR utilisées pour la détection par électrophorèse sont les suivantes :
EXEMPLES
1) Séquençage direct
En ce qui concerne l'analyse par séquençage direct, les conditions PCR utilisées pour la détection par électrophorèse sont les suivantes : a) Conditions d'amplification pour détection avec amorce g marquée par un fluorochome :
(i) volume final : 25μl
(ii) MgCI2: 2 mM (iii) dNTP : 0,2 mM chacun
(iv) Amorces : 1 μM chacune
(v) Taq polymérase (Amplitaq GoId, Perkin Elmer) : 1 unité
(vi) BSA : 0,2 μl par tube
(vii) Volume d'extrait d'ADN utilisé : 2,5 μl (viii) Dénaturation initiale de 10 mn à 950C
(ix) Nombre de cycles : 35 (à ajuster en fonction de l'extrait)
(x) Dénaturation : 30 s à 950C, Hybridation : 30 s à 55°C, pas d'étape d'élongation
Ces conditions visent à réduire l'artefact "+A" qui gène l'interprétation des résultats.
b) Conditions d'amplification pour détection avec amorce h marquée par un fluorochome :
(i) volume final : 25μl
(ii) MgCI2: 2 mM (iii) dNTP : 0,2 mM chacun
(iv) Amorces : 1 μM chacune
(v) Taq polymérase (Amplitaq GoId, Perkin Elmer) : 1 unité
(vi) BSA : 0,2 μl par tube
(vii) Volume d'extrait d'ADN utilisé : 2,5 μl (viii) Dénaturation initiale de 10 mn à 95°C
(ix) Nombre de cycles : 35 (à ajuster en fonction de l'extrait)
(x) Dénaturation : 30 s à 95°C, Hybridation : 30 s à 55°C, Elongation : 60 s à 72°C
(xi) Elongation finale: 90 minutes à 72°C Ces conditions visent à favoriser l'artefact "+A" pour faciliter l'interprétation des résultats. 2) Amorces universelles
Le tableau 1 représente les séquences des amorces universelles utilisées pour amplifier la région variable de l'ADN chloroplastique permettant d'identifier les végétaux après extraction et amplification à partir de substrats dégradés. Les positions de la base 3' sur la séquence de référence du tabac sont indiquées dans le tableau (Shinozaki K, Ohme M, Tanaka M, Wakasugi T,
Hayashida N, Matsubayashi T, Zaita N, Chunwongse J, Obokata J, Yamaguchi-
Sinozaki K, Ohto C, Torazawa K, Ment B, Sugita M, Deno H, Kamogashira T,
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Tableau 1
Figure imgf000016_0001
L'alignement de ces deux régions flanquantes montre (Tableaux 1 et 2) qu'il est possible de définir des amorces qui sont universelles chez les végétaux supérieurs (Angiospermes et Gymnospermes). Après avoir aligné plusieurs centaines de séquences d'introns du trnL (UAA), les quelques variations de séquences observées au niveau de la zone où nous avons défini les amorces démontrent que les amorces sont réellement universelles (voir Tableau 2). En effet, la différence observée avec la séquence de l'amorce implique au plus un seul mésappariement n'affectant en aucun cas les trois dernières bases du côté 3' de l'amorce. De ce fait, on peut prédire avec certitude que les amorces g et h sont universelles.
3) Variabilité de la région amplifiée
Le Tableau 2 montre les variations de la zone amplifiée par les amorces g et h pour différentes espèces végétales entrant dans la composition des aliments (voir aussi le Tableau 3). Ces séquences ont soit été importées de
GenBank (base de données publique de séquence d'ADN) soit été effectuées dans notre laboratoire. Deux régions très conservées encadrent une partie très variable d'une longueur d'environ 20 à 100 paires de bases (Figure 1). Une telle région représente donc la cible idéale pour une identification des végétaux à partir de substrats dégradés (dans ces conditions, il est souvent difficile d'obtenir des produits d'amplification pour des fragments d'une longueur supérieure à 120 paires de bases). Nous n'avons pas trouvé d'autres régions répondant à ces critères. II semble donc que le système que nous proposons soit unique.
Le tableau 2 représente l'alignement de séquences montrant d'une part la zone sur laquelle ont été définies les amorces universelles, et d'autre part la variabilité de la région amplifée. Les nucléotides soulignées dans les régions correspondant aux amorces indiquent les mésappariements avec les amorces universelles g et h. Concernant la région amplifiée, les soulignements indiquent des séquences identiques.
Tableau 2
séquence de la séquence de Ia
Nom région région scientifique séquence de la région amplifiée correspondant à correspondant à l'amorce g l'amorce h
GATAGGTGCA
Theobroa (JCJUCAAI CC 1 (jr ATCCTATTATTTTATTATTTTACGAAAC cacao AGCCAA TAAACAAAGGTTCAGCAAGCGAGAAT GAGACTCAAT AATAAAAAAAG GG
GATAGGTGCA
Beta vulgaris GGGCAATCCTG CTCCTTTTTTCAAAAGAAAAAAAATAA AGCCAA GGATTCCGAAAACAAGAATAAAAAAA GAGACTCAAA
AAG GG
Castanea GGGCAATCCTG ATCCTATTTTACGAAAACAAATAAGGG GATAGGTGCA sativa AGCCAA TTCAGAAGAAAGCGAGAATAAAAAAA GAGACTCAAT
AG GG
ATCCGGTTTTCTGAAAACAAACAAGGA GATAGGTGCA
Cannabis GGGCAATCCTG
TTCAGAAAGCAATAATAAAAAAGAAT GAGACTCAAT sativa AGCCAA AG GG
ATCCTGCTTTCGGAAAACAAACAAAAA GATAGGTGCA
GGGCAATCCTG
Cicer arietinum AAGTTCAGAAAGTTAAAATCAAAAAA GAGACTCAAT AGCCAA G GG
Saccharum GGGCAATCCTG ATCCCCTTTTTTGAAAAAACAAGTGGT GATAGGTGCA officinarutn AGCCAA GAGACTCAAT
TCTCAAACTAGAACCCAAAGGAAAAG GG
GATAGGTGCA
Asparagus GGGCAATCCTG ATCTTTATGTTTAGAAAAACAAGGGTT GAGACTCAAT officinalis AGCCAA TTAATTTAAAAACTAGAAGAAAAAGG GG
GATAGGTGCA
Triticum GGGCAATCCTG ATCCGTGTTTTGAGAAAACAAGGGGTT GAGACTCAAT aestivum AGCCAA CTCGAACTAGAATACAAAGGAAAAG GG
Figure imgf000018_0001
dATAGGTGCA
GGGCAATCCTG ATCACGTTTTCCGAAAACAAACAAAGG
Arctium lappa uAGACTCGAT AGCCAA TTCAGAAAGCGAAAATAAAAAAG
GG
GGGCAATCCTG ATCACGTTTTCCGAAAACAAACAACGG GATAGGTGCA
Lactuca sativa uAGACTCGAT
AGCCAA TTCAGAAAGCGAAAATCAAAAAG GG
ÏATAGGTGCA
Helianthus GGGCAATCCTG ATCACGTTTTCCGAAAACAAACAAAGG GAGACTCGAT annuus AGCCAA TTCAGAAAGCGAAAATAAAAAAG GG
GATAGGTGCA
GGGCAATCCTG ATCCGGTTTTCTGAAAAC AAACAAGGG
Ficus carica GAGACTCAAT
AGCCAA TTCAGAAGGCGATAATAAAAAAG GG
GATAGGTGCA
Humulus GGGCAATCCTG ATCCGGTTTTCTGAAAACAAACAAGGA GAGACTCAAT lupidus AGCCAA TTCAGAAAGCAATAATAAAGGG GG
GATAGGTGCA
GGGCAATCCTGATCCGTGTTTTGAGAGGGGGGTTCTCG
Avena sativa GAGACTCAAT AGCCAA AACTAGAATACAAAGGAAAAG GG
GATAGGTGCA
Nasturtium G GGC GCAATCCTG ATCCTTGTTTACGCAAACAAACCGGAG GAGACTCAAT officinale AGCCAA TTTAGAAAGCGAGAAAAAAGG GG
GATAGGTGCA
Armoracia GGGCAATCCTG ATCCTTG TTTACGCGAACAAACCTGAG GAGACTCAAT rusticana AGCCAA TTTAGAAAGCGAGATAAAAGG GG
GATAGGTGCA
Hordeum GGGCAATCCTGATCCGTGTTTTGAGAAGGGATTCTCGA GAGACTCAAT vulgare AGCCAA ACTAGAATACAAAGGAAAAG GG
GATAGGTGCA
Anthriscus GGGCAATCCTG ATCCTATTTTTTCCAAAAACAAACAAA GAGACTCAAT cerefolium AGCCAA GGCCCAGAAGGTGAAAAAAG GG
GATAGGTGCA
Allium cepa GGGCAATCCTG ATCTTTCTTTTTTGAAAAACAAGGGTTT GAGACTCAAT AGCCAA AAAAAAGAGAATAAAAAAG GG
GATAGGTGCA
Allium porum GGGCAATCCTG ATCTTTATTTTTTGAAAAACAAGGGTT GAGACTCAAT AGCCAA TAAAAAAGAGAATAAAAAAG GG
Carum GGGCAATCCTG ATCCTATTTTCCAAAAACAAACAAAGG GATAGGTGCA petroselinum AGCCAA CCCAGAAGGTGAAAAAAG GAGACTCAAT GG
Solanum uGGCAATCCTG ATCCTGTTTTCTGAAAACAAACAAAGG GATAGGTGCA tuberosum AGCCAA TTCAGAAAAAAAG GAGACTCAAT GG
Solanum GATAGGTGCA
GGGCAATCCTG ATCCTGTTTTCTGAAAACAAACCAAGG lycopersicum GAGACTCAAT AGCCAA TTCAGAAAAAAAG GG
Solanum GATAGGTGCA
GGGCAATCCTG ATCCTGTTTTCTCAAAACAAACAAAGG melongena GAGACTCAAT AGCCAA TTCAGAAAAAAAG GG
Raphanus GATAGGTGCA
GGGCAATCCTG ATCCTGAGTTACGCGAACAAACCAGA sativus GAGACTCAAT AGCCAA GTTTAGAAAGCGG GG
Figure imgf000020_0001
La région amplifiée montre non seulement une variation de taille entre les différentes espèces, mais aussi une variation de séquences. Il est intéressant de remarquer que le niveau de variabilité permet d'identifier la grande majorité des espèces consommées. Cependant, les espèces proches peuvent dans certains cas ne pas être discernables. C'est le cas dans notre exemple entre le blé et le seigle, et entre le chou et le navet.
Le tableau 3 représente les noms communs et origines des séquences des aliments du tableau 2. LECA = séquences réalisées par les inventeurs.
Tableau 3
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
4) Exemples d'applications à des substrats dégradés
Nous avons réalisé plusieurs expérimentations qui démontrent clairement la validité de l'approche proposée dans la présente demande.
L'ADN de plusieurs substrats complexes et/ou transformés a été extrait en utilisant un kit d'extraction classique et en suivant les instructions du fabriquant (Dneasy Plant Mini kit, Qiagen) . Les substrats testés sont les suivants : (i) Sucre de canne (ii) Pomme de terre cuite (iii) Pâte cuite (iv) Potage en sachet lyophilisé
Pour les aliments solides, l'ADN a été extrait à partir de 50 mg de poids sec. Le volume final de l'extrait d'ADN a été récupéré dans 200 μl.
L'amplification a été réalisée en utilisant les amorces g et h (Tableau 1 ), et les conditions d'amplification suivantes : (i) volume final : 25μl (ii) MgCI2: 2 mM (iii) dNTP : 0,2 mM chacun (iv) Amorces : 1 μM chacune
(v) Taq polymérase (Amplitaq GoId, Perkin Elmer) : 1 unité (vi) BSA : 0,2 μl par tube
(vii) Volume d'extrait d'ADN utilisé : 2,5 μl (1/80 de l'extrait) (viii) Dénaturation initiale de 10 mn à 95°C (ix) Nombre de cycles : 35 (sauf pour le sucre de canne : 50) (x) Dénaturation : 30 s à 95°C, Hybridation : 30 s à 55°C, Elongation : 60 s à 72°C
La Figure 2 illustre un résultat d'amplification. Les produits d'amplification ont ensuite été séquences par séquençage direct sur séquenceur automatique capillaire ABI 3100. Les séquences obtenues pour le sucre de canne, la pomme de terre cuite, et la pâte cuite sont identiques respectivement aux séquences de la canne à sucre (Saccharum officinarum), de la pomme de terre (Solanum tuberosum), et du blé (Triticum aestivum). En revanche, la séquence obtenue par séquençage direct pour le potage en sachet lyophilisé n'est pas lisible, ce qui indique qu'il s'agit d'un mélange. Nous avons donc clone le produit PCR du potage en sachet lyophilisé afin de séparer les différentes molécules. Sur 23 clones séquences, nous avons obtenu 19 clones contenant la séquence du poireau, trois clones contenant la séquence de la pomme de terre, et un seul clone contenant la séquence de l'oignon. Le tableau 4 montre les résultats du clonage du produit d'amplification obtenu à partir du potage en sachet lyophilisé (23 clones séquences). Les résultats obtenus correspondent à la composition indiquée sur le sachet.
Tableau 4
Figure imgf000024_0001
5) Exemple comparatif sur substrat dégradé avec les amorces g, h et c, d
L'objectif de cette expérimentation était de comparer la présente invention avec l'approche publiée en 1991 (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991 ) Universal primers for amplification of three non-coding régions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109).
L1ADN génomique a été extrait à partir de 100 mg de mie de pain en utilisant un kit d'extraction (Dneasy Plant Mini kit, Qiagen) et en suivant les instructions du fournisseur. Le volume final de l'extrait d'ADN a été récupéré dans 100 μl.
L'amplification a été réalisée en utilisant d'une part les amorces g et h, et d'autre part les amorces c et d (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding régions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109). Les conditions d'amplifications suivantes ont été appliquées : volume final : 25μl
MgCI2: 2 mM dNTP : 0,2 mM chacun
Amorces : 1 μM chacune
Taq polymérase (Amplitaq GoId, Perkin Elmer) : 1 unité
BSA : 0,2 μl par tube
Volume d'extrait d'ADN utilisé : 2,5 μl (1/80 de l'extrait)
Dénaturation initiale de 10 mn à 95°C Nombre de cycles : 25
Dénaturation : 30 s à 950C, Hybridation : 30 s à 55°C, Elongation : 60 s à 720C
La Figure 3 présente les résultats obtenus. Aucun produit d'amplification n'apparaît avec les amorces c et d, alors qu'un produit d'amplification est obtenu avec les amorces g et h.

Claims

REVENDICATIONS
1) Paire d'oligonucléotides caractérisée en ce que le premier oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 68 et le deuxième oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 69 dans des conditions de stringence suffisantes pour l'amplification sélective d'une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL du tabac dont la séquence est représentée à la SEQ ID No. 3.
2) Paire d'oligonucléotides caractérisée en ce que le premier oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 68 et le deuxième oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 69 dans des conditions de stringence suffisantes pour l'amplification sélective d'une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux dont la séquence est représentée aux SEQ ID Nos. 24-67.
3) Paire d'oligonucléotides selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'hybridation s'effectue à 55°C dans un tampon d'amplification comprenant du MgCI22mM.
4) Paire d'oligonucléotides selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le premier oligonucléotide est choisi dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 1 , 4-15 et le deuxième oligonucléotide est choisi dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 2, 16-23.
5) Oligonucléotide caractérisé en ce que sa séquence est choisie dans le groupe comprenant la SEQ ID No. 1 , la SEQ ID No. 2, les SEQ ID Nos. 4-15 et les SEQ ID Nos. 16-23.
6) Polynucléotide caractérisé en ce que sa séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 24-67.
7) Paire d'oligonucléotides selon l'une des revendications 1-4, oligonucléotide selon la revendication 5 ou polynucléotide selon la revendication 6 caractérisés en ce qu'ils sont immobilisés sur un support solide.
8) Procédé d'amplification d'une région variable de l'ADN chloroplastique des végétaux caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon comprenant de l'ADN génomique végétal ; b) on amplifie une région variable de l'ADN chloroplastique avec une paire d'oligonucléotides selon l'une des revendications 1-4 et 7, ou avec au moins un oligonucléotide selon la revendication 5.
9) Procédé d'amplification d'une région variable de I1ADN chloroplastique des végétaux selon la revendication 8 caractérisé en ce que à l'étape b) la région variable de l'ADN chloroplastique amplifiée est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 24-67.
10)Procédé de détection d'une espèce végétale dans un échantillon caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon suspecté de contenir une espèce végétale ; b) on effectue une réaction d'amplification avec une paire d'oligonucléotides selon l'une des revendications 1-4 et 7, ou avec au moins un oligonucléotide selon la revendication 5 ; c) on détecte l'obtention d'un produit d'amplification attestant de la présence d'une espèce végétale dans l'échantillon.
11)Procédé de détection d'une espèce végétale dans un échantillon selon la revendication 10 caractérisé en ce que à l'étape c) le produit d'amplification est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 24-67.
12)Procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon suspecté de contenir une espèce végétale ; b) on effectue une réaction d'amplification avec une paire d'oligonucléotides selon l'une des revendications 1-4 et 7, ou avec au moins un oligonucléotide selon la revendication 5 ; c) on analyse le produit d'amplification obtenu pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon.
13)Procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon selon la revendication 12 dans lequel à l'étape c) le produit d'amplification est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 24-67.
14)Procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon selon la revendication 12 ou 13 dans lequel à l'étape c) on détermine la séquence du produit d'amplification pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon.
15)Procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon selon la revendication 12 ou 13 dans lequel à l'étape c) on hybride le produit d'amplification avec au moins une séquence végétale de référence pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon.
16) Procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon selon la revendication 15 dans lequel la séquence de référence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 3 et 24-67.
17)Procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon selon la revendication 12 ou 13 dans lequel à l'étape c) on analyse le produit d'amplification par électrophorèse pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon.
18) Utilisation de la région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux correspondant aux positions 49425 à 49466 de I1ADN chloroplastique du tabac pour la détection et l'identification d'espèces végétales.
19) Utilisation selon la revendication 18 dans laquelle la région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 24-67.
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