WO2006049215A1 - 自己免疫疾患を治療するための併用薬 - Google Patents

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Shuzo Tagashira
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Definitions

  • the present invention relates to a combination drug for preventing and Z or treating autoimmune diseases.
  • a living body usually does not show an immune response to its own constituents (self-antigen) and maintains immunological homeostasis.
  • homeostasis is called innate tolerance. This tolerance state can be breached, producing antibodies and lymphocytes that react with self-antigens.
  • autoimmunity Such a phenomenon is called autoimmunity, and the disease that triggers it is called autoimmune disease.
  • Autoimmune diseases include systemic autoimmune diseases and organ-specific autoimmune diseases. Typical examples include systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis, and the latter include multiple sclerosis, myasthenia gravis, autoimmune hemoptymic anemia, and Hashimoto's thyroiditis.
  • Rheumatoid arthritis is one of the autoimmune diseases and is a systemic inflammatory disease whose main cause is multiple arthritis and at the same time causes multiple organ damage. It is chronic with repeated remissions and exacerbations. If it progresses and is left untreated, it will cause joint destruction and deformation. It is a disease that presents motor dysfunction and can sometimes be life-threatening.
  • current medicine cannot completely cure or prevent rheumatoid arthritis. Therefore, the current treatment goal is to diagnose early, start aggressive treatment early and prevent rheumatic inflammation as quickly as possible to the maximum to prevent the appearance of irreversible changes. It is to improve the patient's physical, mental, and social quality of life (QOL) by preventing the progress.
  • QOL quality of life
  • NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
  • DMARDs disease modifying anti-rheumatic drugs
  • corticosteroids corticosteroids
  • NSAIDs are the first drugs used in patients with rheumatoid arthritis, and the analgesic effect is quickly obtained. Anti-inflammatory effects appear after 1 to 2 weeks. Although NSAIDs have the effect of reducing the degree of inflammation, they have no effect to prevent the progression of rheumatic inflammation or to prevent joint destruction. In addition, many side effects of NSAIDs cannot be separated from their pharmacological actions (cyclooxygenase-1 inhibitory activity).
  • DMARDs is a general term for drugs intended to induce remission by sedating rheumatic inflammation by correcting immune abnormalities in rheumatoid arthritis. DMARDs are generally slow-acting, but once the effects are manifested, the effects last for a long time. DMARDs are combined with fast-acting NSAIDs and corticosteroids at the beginning of administration when analgesic effects are lacking. On the other hand, it is known that serious side effects such as myelosuppression, nephritis, and interstitial pneumonia appear rarely, and that there are individual differences in the optimal dose. In addition, conventional DMARDs are often tolerated by continued administration (escape phenomenon), and the effect diminishes in 2 to 3 years, leading to discontinuation of administration in many cases.
  • Corticosteroids quickly and reliably suppress rheumatic inflammation and, despite a short period of time, significantly improve the quality of life of patients with rheumatoid arthritis. Withdrawal syndrome), inability to prevent the progression of joint destruction, and the occurrence of infectious diseases, adrenal dysfunction, gastrointestinal disorders, and the appearance of serious side effects such as osteoporosis.
  • autoimmune diseases particularly rheumatoid arthritis It has been known. Typical examples include T lymphocytes, macrophage cells, osteoclasts (which are involved in joint destruction), fibroblasts (which are involved in joint rigidity), and the like.
  • GS Firestein et al. "RHEUMATOID ARTHRITIS”; OXFORD UNIVERSIT Y PRESS, 2000)
  • DMARDs are used, and when the effect disappears (escape phenomenon), it is changed to the next D MARDs.
  • Multiple drug combinations of DMARDs are also implemented in parallel.
  • preventive agent and Z or therapeutic agent is more effective than preventive agent and Z or therapeutic agent. Is desired.
  • CaM kinase II is tryptophan hydroxylase (a neurotransmitter, serotonin biosynthetic compound) in the rat brain.
  • This enzyme was discovered in 1980 as a new type of calmodulin-dependent phosphorylase that activates the rate-limiting enzyme.
  • This enzyme is known to be activated by a complex of Ca 2+ and calmodulin that is increased intracellularly by extracellular stimulation. As recent research progresses, this enzyme is It has been shown to play an important role in regulation and regulation of various cell functions.
  • This enzyme is 1) abundant in the brain, 2) soluble and granule-bound, 3) broad substrate specificity, 4) organ-specific isoform, 5) autophosphorylation It has distinctive features such as controlling the activity by.
  • the enzyme is involved in neurotransmitter biosynthesis, neurotransmitter release, long-term potentiation, which is considered to be the basic principle of memory, and memory, particularly spatial memory, in the cerebral nervous system.
  • CaMKII ⁇ , j8, ⁇ ⁇ and ⁇ are known as CaMKII isoforms (subtypes), and ⁇ is further known as ⁇ ⁇ , ⁇ ⁇ and.
  • CaMKIIa, ⁇ and j8, isoforms are localized in the brain.
  • CaMKII inhibitors for example, the following are known.
  • Non-Patent Document 2 1- [1-Oxo-11- (5,6-dihydro-3-iminobenzo [h] cinolin-2 (3H) -yl) undecyl] -4- (2-pyrimidinyl) -piperazine (Non-Patent Document 2)
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 11 152298
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No.98Z33491
  • Patent Document 3 Patent No. 3237608 Specification
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication No. 4-80035
  • Non-Patent Document 2 J. Med. Chem., 2002, 45, p.563-566
  • Non-Patent Document 3 Akio Tagashira, "Inflammation 'Regeneration", Vol.21, No.4, p.472 (2001)
  • Tokubori Reference 4 F. NishikaKU, Annals of the Rheumatic Diseases, vol.60 supplemen t 1, p.l59 (2001)
  • Non-Patent Document 5 F. Nishikaku, “Annals of the Rheumatic Diseases", vol. Ri 1 supplement 1, p.194 (2002)
  • An object of the present invention is to provide an excellent combination drug for preventing and Z or treating autoimmune diseases. It is another object of the present invention to provide a screening method useful for searching for and obtaining candidate substances that are active ingredients of the concomitant drug. Means for solving the problem
  • CaMKII inhibitors are useful as autoimmune disease preventive and Z or therapeutic agents
  • CaMKII inhibitors such as KN-93 act suppressively.
  • KN-93 which is known as a CaMKII inhibitor, should be useful in animal models of autoimmune diseases.
  • Compound (I) and KN-93 have the following actions (a) to (c) against various factors that vary depending on CaMKII phosphate.
  • CaMKII sequence-specific siRNA suppresses cell proliferation of synovial cells (Example 16). That is, by suppressing the expression or inhibiting the activity of CaMKII ⁇ , the abnormal growth of synovial cells is suppressed, and thus the pathological condition of the joint in diseases such as rheumatoid arthritis (suppression of chronic inflammation, suppression of joint destruction, The progression to joint deformation can be achieved).
  • the inventors of the present invention focused on I ⁇ and cyclin D1, and as a result of intensive studies, they obtained the findings of (5) above. From these findings, CaMKII inhibitors such as Compound (I) It is thought to suppress the degradation of ⁇ and to suppress the activity of lymphocytes. Moreover, CaMKII inhibitors such as compound (I) inhibit CaMKII in fibroblasts, thereby suppressing Akt phosphorylation and thereby suppressing the expression of downstream cyclin D1. It is thought that arrest occurs, i.e. cell proliferation is suppressed.
  • the inventors of the present invention when compound (I), which is a CaMKII inhibitor, is used in combination with various disease-modifying antirheumatic drugs (DMARDs), it is possible to predict from autoimmune diseases based on their individual effects. It has been found that it has a significantly superior preventive effect and Z or therapeutic effect that can not be achieved, that is, the combined use of CaMKII inhibitors and DMARDs shows significant utility in the prevention and Z or treatment of autoimmune diseases (Example 17). ⁇ twenty three). In particular, the combination therapy of CaMKII inhibitors and DMARDs shows an excellent joint destruction inhibitory effect against the suppression of joint destruction, which has been difficult to achieve with conventional monotherapy of anti-rheumatic drugs. (Example 20).
  • the present invention is as follows.
  • a prophylactic agent and Z or therapeutic agent for an autoimmune disease comprising a CaMKII inhibitor and a disease-modifying antirheumatic drug.
  • D represents a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, a mercapto group, a nitro group, a cyano group, a force group, an amino group that may be substituted, a hydroxylamino group that may be substituted, or a substituent that may be substituted.
  • R 6 represents an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, an optionally substituted V, an alkynyl group, an optionally substituted, an aryl group or an optionally substituted heterocyclic group.
  • R 7 represents an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group.
  • (E represents a single bond or an alkylene group.
  • R 1 is bonded to a nitrogen atom bonded to a bond in which a broken line represents a single bond together with a solid line
  • R 3 and R 4 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, a mercapto group, a nitro group, a cyano group, Carboxy group, optionally substituted amino group, optionally substituted hydroxylamino group, optionally substituted rubamoyl group, optionally substituted sulfamoyl group, sulfo group, NH group protecting group, R 5 , -OR 5 , -CO R 6 , SR 7 ,-(CO) SR 7
  • R 43 and R 44 are as follows (1) or (2).
  • R 32 has 1 to 3 carbon atoms.
  • R 35 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or — (CH 3).
  • R 36 (m is as defined above.
  • R 36 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms).
  • R 38 (m is as defined above.
  • R 37 and R 38 are
  • a 5- to 7-membered saturated nitrogen-containing heterocyclic group (a 5- to 7-membered saturated nitrogen-containing heterocyclic group is an alkyl group, an amino group, a hydroxyl group, an alkoxy group, or an oxo group. And may be substituted with 1 or 2 substituents optionally selected from the group).
  • G represents an optionally substituted aryl group or an optionally substituted heterocyclic group.
  • R 8 and R 9 each independently represents a hydrogen atom, an optionally substituted lower alkoxy group, or an optionally substituted lower alkyl group, and R 8 and R 9 are bonded together.
  • an optionally substituted hydrocarbon ring, an optionally substituted 1,3 dioxane ring or an optionally substituted 1,3 dioxolane ring may be formed.
  • D is a hydrogen atom, nitro group, cyano group, carboxy group, amino group which may be substituted, hydroxylamino group which may be substituted, rubamoyl group which may be substituted, R 5 or mono CO
  • R 6 which is R 6 (wherein R 5 and R 6 have the same meanings as in the term [6]) or
  • D is a hydrogen atom, a carboxy group, —R 5 or —CO R 6 (where R 5 and R 6 are the terms [6]
  • R 3 and R 4 are each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, an optionally substituted amino group, an optionally substituted hydroxylamino group, an optionally substituted alkoxy group, or optionally substituted.
  • R 44 (R 43 and R 44 have the same meanings as defined in item [6]), or The prophylactic agent according to Item [10], wherein any two of R 2 , R 3 and R 4 are bonded together to form an optionally substituted heterocyclic ring together with the nitrogen atom, and Medical treatment.
  • G may be substituted phenyl, optionally substituted naphthyl, optionally substituted furyl, optionally substituted chael, optionally substituted indolyl, optionally substituted Isothiazolyl, optionally substituted benzochel, optionally substituted isobenzofuryl, optionally substituted pyrrolyl, optionally substituted benzofuryl, optionally substituted imidazolyl, optionally substituted Pyrazolyl, optionally substituted isoxazolyl, optionally substituted isothiazolyl, optionally substituted thiazolyl, optionally substituted oxazolyl, optionally substituted benzimidazolyl, optionally substituted benzothiazolyl, substituted Benzoxazolyl, optionally substituted pyridyl, optionally substituted pyrazinyl, optionally substituted pyrimidyl, substituted Optionally substituted pyridazil, optionally substituted triazyl, optionally substituted
  • CaMKII inhibitor power The prophylactic agent and Z or therapeutic agent according to item [6], which is an isoxazole derivative represented by Formula A1 or Formula A2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • G 1 represents a fuel, a bi-fuel 4-yl, a 3-benzoyl, 4-benzoyl, 1H-indole-2-yl, 1H-indole-3-yl.
  • dioxin 6-yl 1-benzofuran 1- , 1-benzofuran-6-yl, quinolyl, isoquinolyl, phenylpyridyl, phenylpyrimidinyl, phenylpyridazil or vinylabil (in these, phenyl, biphenyl 4-yl, 3 benzoylphenol) , 4 Benzylphenol, 1H-indole-2-yl, 1H-indole-3-yl, 1-methyl-1H-indole-2-yl, 1-methyl 1H-indole-3yl, 2, 3 Dihydro
  • R 23 and R 24 independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a force representing methoxy or ethoxy, or together, methylene.
  • Formula: C (NR 25 R 26 ) NR 27 R 28 is as follows (1), (2) or (3).
  • (1) 5 Oyohi 26 are shown in the following (a) or (b), R 27 and R 28 are as in the following (c) or (d).
  • a 5- to 7-membered saturated nitrogen-containing heterocyclic group is a group consisting of an alkyl group, an amino group, a hydroxyl group, an alkoxy group, and an oxo group. And optionally substituted with 1 or 2 substituents.
  • R 35 is as defined above.
  • R 35 is as defined above.
  • R 37 and R 38 are as defined above.
  • R 26 and R 27 together, together with two nitrogen atoms and carbon atoms, are 5- to 7-membered saturated nitrogen-containing heterocyclic group (wherein the 5- to 7-membered saturated nitrogen-containing heterocyclic group is alkyl And may be substituted with one or two substituents arbitrarily selected from the group consisting of a group, an amino group, a hydroxyl group, an alkoxy group, and an oxo group.
  • R 25 and R 28 independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, acetyl or -(CH) — OR 36 (m has the same meaning as above. R has the same meaning as in item [6].)
  • R 41 and R 42 are as follows (a 1 ) or (b 1 ), and R 43 and R 44 are as follows (c 1 ) or (d 1 ).
  • R 35 is as defined above.
  • R 35 is as defined above.
  • R 38 is
  • a 5- to 7-membered saturated nitrogen-containing heterocyclic group is composed of an alkyl group, an amino group, a hydroxyl group, an alkoxy group, and an oxo group. Which may be substituted with one or two substituents arbitrarily selected from the group.
  • R 35 is as defined above.
  • R 35 is as defined above.
  • R 38 is
  • a 5- to 7-membered saturated nitrogen-containing heterocyclic group is composed of an alkyl group, an amino group, a hydroxyl group, an alkoxy group, and an oxo group. 1 or 2 substituents optionally selected from the group may be substituted).
  • (l 1 )! ⁇ 45 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or acetyl.
  • R 48 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or acetyl.
  • R 46 and R 47 are as follows (a 2 ) or (b 2 ).
  • R 35 is as defined above.
  • R 35 is as defined above.
  • R 38 is
  • a 5- to 7-membered saturated nitrogen-containing heterocyclic group is composed of an alkyl group, an amino group, a hydroxyl group, an alkoxy group, and an oxo group. Which may be substituted with one or two substituents arbitrarily selected from the group.
  • (2 1 ⁇ 5 and R 46 together with a nitrogen atom are a 5- to 7-membered saturated nitrogen-containing heterocyclic group (where a 5- to 7-membered saturated nitrogen-containing heterocyclic group is an alkyl group, an amino group, A group force consisting of a hydroxyl group, an alkoxy group, and an oxo group, which may be optionally substituted with 1 or 2 substituents.
  • R 47 and R 48 independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, acetyl, or — (CH 2) — OR 36 (m and R 36 are as defined above). ]
  • G 2 is 2 Fluoro 2-1-4, 2, 1 Fluoro 2-1-4
  • R 49 represents methyl.
  • R 5Q is a hydrogen atom
  • R 51 and R 52 are the following (a 3), is as (b 3) or (c 3), R 53 and R 54 are the following (because, (or (f 3 )
  • Piperazine which may be substituted at the 4-position, piperidine which may be substituted at the 4-position with an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, 4-hydroxypiperidine, or 1 or 2 alkyl having 1 to 3 carbon atoms Piperidine substituted at the 4-position with an amino group (in these, pyrrolidine, azepane, monoreforin, thiazoline, piperidin 2-one, piperidine 4-one, thiamorpholine, carbon number Piperazine which may be substituted at the 4-position with an alkyl group of 1 to 3, piperidine which may be substituted at the 4-position with an alkoxy group of 1 to 3 carbon atoms, 4-hydroxypiperidine, and 1 or 2 Carbon number A piperidine substituted at the 4-position with a V-amino group may be substituted with 1 to 3 alkyl groups and may be substituted with 1 or 2 methyl groups. (d 3 ) independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • (e 3 ) — represents a hydrogen atom, and the other represents one (CH 3) 2 —COCH (n is as defined above).
  • (f 3 ) Introducing nitrogen atom together with pyrrolidine, azepane, morpholine, thiazoline, piperidin-2-one, piperidin-4-one, thiamorpholine, alkyl group with 1 to 3 carbon atoms May be substituted with piperazine, an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, and may be substituted at the 4-position with piperidine, 4-hydroxypiperidine, or 1 or 2 alkyl groups with 1 to 3 carbon atoms.
  • Piperidine substituted at the 4-position with an amino group (including pyrrolidine, azepane, monoleolin, thiazoline, piperidin 2-one, piperidine 4-one, thiamorpholine, carbon number 1) Piperazine which may be substituted at the 4-position with an alkyl group of ⁇ 3, piperidine which may be substituted at the 4-position with an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, 4-hydroxypiperidine, and 1 or 2 Carbon number
  • a piperidine substituted at the 4-position with an amino group which may be substituted with 1 to 3 alkyl groups may be substituted with 1 or 2 methyl groups.
  • R bb is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, acetyl or — (CH 2) — OR bb (m is
  • R 56 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. Represents). ;) Represents a group represented by
  • R 57 and R 58 are as follows (a 4 ), (b 4 ) or (c 4 ), and R 59 and R 6 ° are as follows: (D 4 ), (e 4 ) or (f 4 ).
  • (a 4 ) independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • (b 4 ) — represents a hydrogen atom, and the other represents one (CH 3) 2 —COCH (n is as defined above).
  • (e 4 ) — represents a hydrogen atom, and the other represents one (CH 3) 2 —COCH (n is as defined above).
  • Piperidine substituted with an alkyl group but substituted at the 4-position with an amino group (including pyrrolidine, azepane, monorephorin, thiazoline, piperidin 2-one, piperidine 4-one, thiamorpholine, Piperazine optionally substituted at the 4-position with an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, piperidine optionally substituted at the 4-position with an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, 4-hydroxypiperidine, and 1 or
  • a piperidine substituted at the 4-position with an amino group which may be substituted with two alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms may be substituted with 1 or 2 methyl groups.
  • R 63 and R 64 both represent a hydrogen atom.
  • R 61 and R 62 are as follows (a 5 ), (b 5 ) or (c 5 ).
  • (a 5 ) independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • a force representing a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or R 66 and R 67 together with a nitrogen atom together with pyrrolidine, piperidine, morpholine or N-methylbiperazine in these, pyrrolidine, Peridine, morpholine and N-methylbiperazine may be substituted with 1 or 2 methyls).
  • R 68 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, 2 hydroxyethyl or 3 hydroxypropyl).
  • G 2 is 2 fluorobiphenyl 4 or 2, -fluoro biphenyl 4 -yl, R 5Q is a hydrogen atom or methyl, and R 63 and R 64 are both hydrogen atoms.
  • R 61 and R 62 are the following (a 6 ) or (b 6 ), the prophylactic agent and the Z or therapeutic agent according to item [15]:
  • Leflunomide methotrexate, D-pesilamine, bucillamine, salazosulfaviridin, actactite, oral benzarit, cyclophosphamide, chlorambucil, mizoribine, azathioprine, auranofin, gold sodium thiomaleate, gold thiosulfate, gold thiodalco , Cyclosporine, hydroxychloroquine, black mouth quince, tacrolimus, etanenocept, infliximab, anakinra, keliximab, adalimumab, rituximab, and human anti-I L-6R antibody.
  • prophylactic agent and the Z or therapeutic agent according to item [18] which is a disease-modifying antirheumatic drug, casotrexate, salazosulfaviridine, or leflunomide.
  • Rheumatoid arthritis systemic lupus erythematosus, discoid lupus erythematosus, polymyositis, scleroderma, mixed connective tissue disease, Hashimoto's disease, primary myxedema, thyrotoxicosis, pernicious anemia, Goo d-pasture syndrome, acute progressive thread Globe nephritis, myasthenia gravis, pemphigus vulgaris, bullous pemphigoid, insulin resistant diabetes, juvenile diabetes, type I diabetes, Addison's disease, atrophic gastritis, male infertility, premature menopause, lens Uveitis ,, multiple sclerosis, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, chronic active hepatitis, autoimmune hematologic disease, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia, seizure Hemoglobinuria, idiopathic thro
  • An agent for enhancing autoimmune disease prevention and Z or therapeutic effect by a disease-modifying antirheumatic drug comprising a CaMKII inhibitor as an active ingredient.
  • the potentiator according to item [23] which is a substance having a CaMKII inhibitory potency at a concentration of 10 ⁇ and a CaMKII inhibitory potency of ⁇ 0%.
  • the second pharmaceutical composition comprises a disease-modifying anti-rheumatic drug
  • the first The pharmaceutical composition comprises a CaMKII inhibitor.
  • the second pharmaceutical composition comprises a disease-modifying antirheumatic drug
  • the first pharmaceutical composition comprises a CaMKII inhibitor.
  • composition according to any one of items [28] to [31], wherein the autoimmune disease is rheumatoid arthritis [33]
  • a commercial package comprising the following (1) and (2):
  • a pharmaceutical composition containing a CaMKII inhibitor (1) A pharmaceutical composition containing a CaMKII inhibitor
  • the pharmaceutical composition is used in combination with a disease-modifying antirheumatic drug to prevent autoimmune diseases and
  • a pharmaceutical composition containing a CaMKII inhibitor (1) A pharmaceutical composition containing a CaMKII inhibitor
  • composition described in that the pharmaceutical composition can or should be used for use in the prevention of autoimmune diseases and the effect of Z or treatment by a disease-modifying antirheumatic drug Described items.
  • CaMKII inhibitor is a 3-[(lS) -l- (2-fluorobiphenyl-4-yl) ethyl] -5- ⁇ [amino (morpholin-4-yl) methylene] amino ⁇
  • An autoimmune disease prevention and Z or treatment kit comprising in a package a first composition comprising a CaMKII inhibitor and a second composition comprising a disease modifying anti-rheumatic drug.
  • a method for preventing and / or treating an autoimmune disease comprising administering a CaMKH inhibitor in combination with a disease-modifying antirheumatic drug.
  • a method for enhancing autoimmune disease prevention and Z or therapeutic effect by a disease-modifying antirheumatic drug comprising administering a CaMKII inhibitor.
  • Disease-modifying anti-rheumatic drugs can prevent autoimmune disease and Z or An effective amount of CaMKII inhibitor was administered to enhance the therapeutic effect.
  • a method for the prevention and Z or treatment of autoimmune diseases comprising administering.
  • a screening method for an autoimmune disease preventive and Z or therapeutic agent used in combination with a disease-modifying antirheumatic drug comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • a prophylactic and Z or therapeutic agent for autoimmune diseases comprising a disease-modifying antirheumatic drug for use in combination with a CaMKII inhibitor.
  • prophylactic agent and Z or therapeutic agent according to item [48], wherein the side effect is one or more selected from liver disorder, renal disorder and gastrointestinal dysfunction.
  • a first pharmaceutical composition for achieving an autoimmune disease prevention and Z or therapeutic effect in a mammal suffering from an autoimmune disease used together with a second medicinal thread composition, the effect comprising Exceeding the total of autoimmune disease prevention and Z or therapeutic effects achieved by separately administering the first and second pharmaceutical compositions, the second pharmaceutical composition comprising a CaMK ⁇ inhibitor, the first pharmaceutical composition
  • the composition comprises a disease-modifying antirheumatic drug.
  • a pharmaceutical composition containing a disease-modifying antirheumatic drug, and the pharmaceutical composition can or should be used for autoimmune disease prevention and Z or therapeutic use in combination with a Ca ⁇ inhibitor
  • composition containing a disease-modifying anti-rheumatic drug, and the pharmaceutical composition can or should be used for the prevention of autoimmune disease and enhancement of Z or therapeutic effect of Ca ⁇ inhibitor
  • a method for enhancing autoimmune disease prevention and Z or treatment effect by a CaMKII inhibitor comprising administering a disease-modifying antirheumatic drug.
  • CaMKII inhibitor is 3-[(IS) -1- (2-fluorobiphenyl-4-yl) ethyl] -5- ⁇ [amino (morpholin-4-yl) methylene] amino ⁇ isoxazole Or a prophylactic agent and Z or therapeutic agent, enhancer, composition, commercial package, kit, use, or method according to any one of Items [22] to [59], which is a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the disease-modifying antirheumatic drug is one or more drugs that are also selected from the following: [2
  • Leflunomide methotrexate, D-pesilamine, bucillamine, salazosulfaviridin, actactite, oral benzarit, cyclophosphamide, chlorambucil, mizoribine, azathioprine, auranofin, gold sodium thiomaleate, gold thiosulfate, gold thiodalco , Cyclosporine, hydroxychloroquine, black mouth quince, tacrolimus, etanenocept, infliximab, anakinra, keliximab, adalimumab, rituximab, and human anti-I L-6R antibody.
  • Rheumatoid arthritis systemic lupus erythematosus, discoid lupus erythematosus, polymyositis, scleroderma, mixed connective tissue disease, Hashimoto's disease, primary myxedema, thyrotoxicosis, pernicious anemia, Goo d-pasture syndrome, acute progressive thread Globe nephritis, myasthenia gravis, pemphigus vulgaris, bullous pemphigoid, insulin resistant diabetes, juvenile diabetes, type I diabetes, Addison's disease, atrophic gastritis, male infertility, premature menopause, lens Uveitis, multiple sclerosis, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, chronic active hepatitis, autoimmune blood disease, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia, paroxysmal hemoglobinuria Disease, idiopathic thrombocytopenic pur
  • a medicament comprising a combination of a CaMKII inhibitor and a disease-modifying antirheumatic drug.
  • the CaMKII inhibitor of the present invention has an excellent joint destruction-inhibiting effect (especially, joint destruction in mammals suffering from autoimmune diseases) by combination therapy with disease-modifying anti-rheumatic drugs (DMA RDs).
  • DMA RDs disease-modifying anti-rheumatic drugs
  • a joint destruction inhibitor comprising a CaMKII inhibitor and a disease-modifying antirheumatic drug.
  • a joint destruction inhibitor containing a CaMKII inhibitor for use in combination with a disease-modifying antirheumatic drug is provided.
  • An enhancer of joint destruction effect by a disease-modifying antirheumatic drug comprising a CaMKII inhibitor as an active ingredient.
  • kits for use in suppressing joint destruction comprising a first composition containing a CaMKII inhibitor and a second composition containing a disease-modifying antirheumatic drug in a package.
  • a method for inhibiting joint destruction comprising administering a CaMKn inhibitor in combination with a disease-modifying antirheumatic drug.
  • a method for enhancing an effect of suppressing joint destruction by a disease-modifying antirheumatic drug comprising administering a CaMKII inhibitor.
  • preventive agent and Z or therapeutic agent for autoimmune disease is set as “joint destruction inhibitor”, and “preventive and Z or therapeutic effect of autoimmune disease” is set as “ In the ⁇ Inhibition of destruction '', ⁇ Prevention of autoimmune disease and Z or treatment '' is ⁇ Use of joint destruction suppression '', ⁇ Prevention of autoimmune disease and Z or treatment '' is ⁇ Inhibition of joint destruction '', ⁇ Autoimmunity
  • An embodiment in which “disease prevention and Z or treatment method” is rewritten as “joint destruction suppression method” is also included in the embodiment of the present invention.
  • the CaMKII inhibitor of the present invention is useful as a prophylactic agent and Z or therapeutic agent for autoimmune diseases even when administered alone. Therefore, the following can also be mentioned as an aspect of the present invention.
  • Preventive agent and Z or therapeutic agent for autoimmune disease is an inhibitor of chronic inflammation, an inhibitor of joint destruction, an inhibitor of progression to joint deformity, or an improvement of physical function in patients with rheumatoid arthritis
  • [B4] The screening method according to any one of [B1] to [B3], comprising a step of selecting a substance having a CaMKII inhibition rate of 30% or more at a concentration of 10 ⁇ M.
  • [B5] The screening method according to any one of [B1] to [B3], comprising a step of selecting a substance having a CaMKII inhibition rate of 60% or more at a concentration of 10 ⁇ M.
  • a prophylactic agent and Z or therapeutic agent for an autoimmune disease comprising a substance having a CaMKII inhibitory action as an active ingredient.
  • [B11] The preventive agent for autoimmune disease according to any one of [B6] to [B9] for suppressing chronic inflammation, suppressing joint destruction, suppressing progression to joint deformation, or improving physical function in patients with rheumatoid arthritis And Z or therapeutic agent.
  • a CaMKII inhibitor comprising the isoxazole derivative represented by the formula 1 according to item [6] or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • D is a hydrogen atom, a nitro group, a cyano group, a carboxy group, an optionally substituted amino group, an optionally substituted hydroxylamino group, an optionally substituted rubamoyl group, R 5 or —CO R 6 where R 5 and R 6 are as defined in [B12].
  • [B15] D is a hydrogen atom, a carboxy group, —R 5 or —CO R 6 (wherein R 5 and R 6 are [
  • Ri, R 2 , R 3 and R 4 forces are each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, an optionally substituted amino group, an optionally substituted hydroxylamino group, or an optionally substituted group.
  • a good alkoxy group, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted cycloalkyl group, an optionally substituted cycloalkenyl represents an optionally substituted aryl group, an optionally substituted heterocyclic group or an acyl group.
  • Force Formula: NR 3 R 4 Force Formula: N C (NH) NR 43 R 44 (R 43 and R 44 are in [B12]
  • R 3 and R 4 are each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, an optionally substituted amino group, an optionally substituted hydroxylamino group, an optionally substituted alkoxy group, or an optionally substituted alkyl.
  • N C (NH
  • NR 43 R 44 (R 43 and R 44 have the same meaning as in [B12].)
  • G may be substituted phenyl, optionally substituted naphthyl, optionally substituted furyl, optionally substituted chael, optionally substituted indolyl, substituted Isothiazolyl, optionally substituted benzochel, optionally substituted isobenzozofuryl, optionally substituted pyrrolyl, optionally substituted benzofuryl, optionally substituted imidazolyl, substituted Optionally substituted pyrazolyl, optionally substituted isoxazolyl, optionally substituted isothiazolyl, optionally substituted thiazolyl, optionally substituted oxazolyl, optionally substituted benzimidazolyl, optionally substituted Nzothiazolyl, optionally substituted benzoxazolyl, optionally substituted pyridyl, optionally substituted pyradyl, optionally substituted pyrimidinyl Optionally substituted pyridazil, optionally substituted triazy
  • G 2 is a 2-fluoro-bilulu 4-yl or 2, -fluoro-biphenyl
  • R 5Q is a hydrogen atom or methyl
  • R 63 and R 64 are both hydrogen atoms
  • R 61 and R 62 forces are as follows (a 6 ) or (b 6 ):
  • a prophylactic agent and acupuncture or therapeutic agent for autoimmune diseases comprising a substance having an action of inhibiting the degradation of ⁇ as an active ingredient.
  • a prophylactic agent and acupuncture or therapeutic agent for an autoimmune disease comprising a substance having an inhibitory effect on the enhanced expression of cyclin D1 as an active ingredient.
  • a prophylactic agent and Z or therapeutic agent for an autoimmune disease comprising a substance having an Akt phosphorylation inhibitory activity as an active ingredient.
  • a substance having CaMKII inhibitory activity A polynucleotide having at least 15 bases continuous in the base sequence of the CaMKII gene and Z or a polynucleotide complementary to the polynucleotide, [B7] [B11] The preventive agent and Z or therapeutic agent of autoimmune disease in any one of these.
  • a substance having a CaMKII inhibitory activity [0125] The prophylactic agent and Z or therapeutic agent for autoimmune diseases according to any one of [B7] and [B11], which is an siRNA against the CaMKII gene.
  • siRNA force The autoimmune disease according to [B29], which is an siRNA represented by the following sequence: Preventive and Z or therapeutic agents for the disease:
  • Antisense strand 5'-GAC AUA UCC GAG CCU CAC GdTdT-3 '
  • a method for preventing and / or treating an autoimmune disease in a mammal comprising administering a substance having a CaMKII inhibitory action to the mammal in an amount effective for the prevention and Z or treatment of the autoimmune disease.
  • examples of the embodiment of the present invention include the following.
  • a screening method for a prophylactic agent and Z or therapeutic agent for an autoimmune disease comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • Preferred embodiments of the present invention include the following.
  • CaMKII is CaMKII ⁇ or CaMKII ⁇ [ ⁇ 6] — [Bl 1] !, any one of the preventive and Z or therapeutic agents for autoimmune diseases.
  • [B49] An agent for improving abnormal immunity, comprising the CaMKII inhibitor according to any one of [B24] as an active ingredient.
  • [B50] [B12] —A CaMKII inhibitor according to any one of [B24] as an active ingredient, an inhibitor of chronic inflammation, an inhibitor of joint destruction, an inhibitor of progression to joint deformation, or the body in rheumatoid arthritis patients Function improver.
  • Autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, discoid lupus erythematosus, polymyositis, scleroderma, mixed connective tissue disease, Hashimoto's thyroiditis, primary myxedema, thyrotoxicosis, pernicious anemia , Good-pasture syndrome, acute progressive glomerulonephritis, myasthenia gravis, pemphigus vulgaris, bullous pemphigoid, insulin resistant diabetes, juvenile diabetes, Addison's disease, atrophic gastritis, male infertility, premature Onset menopause, lens uveitis, switching vasculitis, multiple sclerosis, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, chronic active hepatitis, autoimmune hemolytic anemia, paroxysmal hemoglobinuria
  • an excellent drug for preventing and Z or treating autoimmune diseases in particular, concomitant drugs can be provided. Furthermore, according to the present invention, it is possible to provide a screening method useful for searching for and obtaining candidate substances that are active ingredients of the prophylactic, therapeutic, or concomitant drugs.
  • Examples of the aryl group include aryl groups having 6 to 14 carbon atoms, and specific examples include phenol, 1-naphthyl, 2-naphthyl, phenanthryl, anthryl and the like. Preferred examples include phenyl, 1 naphthyl, and 2-naphthyl.
  • heterocyclic group examples include 1 to 3 5- to 7-membered saturated or unsaturated heterocyclic groups containing 1 to 6 nitrogen atoms, oxygen atoms and Z or sulfur atoms. Can be mentioned.
  • saturated heterocyclic group examples include tetrahydrofuryl, pyrrolidinyl, vilazolidyl, imidazolidyl and the like, 5- to 5-membered saturated heterocyclic groups, piperidyl, morpholinyl, thiamorpholinyl, piperazi- 1- to 3-ring 6-membered saturated heterocyclic groups such as hexahydro-pyrimidyl, and 1- to 3-ring 7-membered saturated heterocyclic groups such as azepanyl.
  • the unsaturated heterocyclic group include furyl, chenyl, indolyl, isothiazolyl, benzocenyl, isobenzofuranyl, pyrrolyl, benzofuryl, imidazolyl, 4, 5 dihydro-1H imidazolyl, pyrazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, thiazo 1 to 3 5-membered unsaturated heterocyclic groups such as ril, oxazolyl, benzimidazolyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, carbazolyl, pyridyl, pyrazyl, pyrimidyl, 1, 4, 5, 6-tetrahydro -Pyrimidyl, 3, 6 dihydro-2H— [1, 3, 5] oxaziazinyl, pyridazyl, triazinyl, quinolyl, isoquinolyl, quinazolyl, quinoxalinyl
  • halogen atom nitro group, cyano group, azido group, mercapto group, optionally substituted amino group, optionally substituted hydroxylamino group, optionally substituted lower alkoxyamino group, hydroxyl group, acyl Group, acyloxy group, carboxyl group, optionally substituted rubamoyl group, optionally substituted rubamoyloxy group, sulfo group, optionally substituted sulfamoyl group
  • R 1Q represents a full group or a monocyclic heterocyclic group.
  • the phenyl group or monocyclic heterocyclic group may be, for example, a halogen atom, a lower alkyl group, a lower haloalkyl group, a cyano group, a nitro group, an azido group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower haloalkoxy group, or a substituted group.
  • Group power such as an amino group, an optionally substituted ruberamoyl group, a carboxy group, a lower alkyl group, a carbonyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a lower alkylthio group, a lower alkylsulfur group and a lower alkylsulfol group 1 Alternatively, it may be substituted with a plurality of groups.
  • Each group in this group is, for example, a halogen atom, a nitro group, a cyano group, a mercapto group, an oxo group, a thixo group, an amino group that may be substituted, a hydroxyl group, an acyl group, an acyloxy group, a carboxyl group, or a substituted group.
  • Lower cycloalkyl group is, for example, a neurogen atom, lower alkyl group It may be substituted with one or more groups arbitrarily selected from the group such as a kill group, a lower haloalkyl group, an optionally substituted amino group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group and a lower haloalkoxy group. ),
  • Lower alkoxy group, lower alkoxy carbo group and lower alkyl thio group are, for example, halogen atom, lower cycloalkyl group, monocyclic heterocyclic group, phenol Group, cyano group, -tox group, hydroxyl group, lower alkoxy group, lower haloalkoxy group, amino group which may be substituted, rubamoyl group which may be substituted, carboxy group, lower alkylcarbonyl group, lower alkoxycarbo 1 may be substituted with one or more groups arbitrarily selected from the group such as -l group, lower alkylthio group, lower alkylsulfinyl group and lower alkylsulfonyl group. Alternatively, it may be substituted with a plurality of groups. [0072] d): alkell group
  • a alkenyl group includes, for example, a nitrogen atom, a nitro group, a cyano group, a mercapto group, an oxo group, a thixo group, an optionally substituted amino group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower haloalkoxy group, a lower alkoxycarbo- group.
  • Alkyl groups include, for example, a nitrogen atom, a nitro group, a cyano group, a mercapto group, an oxo group, a thixo group, an amino group which may be substituted, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower haloalkoxy group, a lower alkoxycarbo- group.
  • Anolekeninore xy group Anolekeninore xycanoleboninole group, Anolekeninorecanoleboninole group, alkalkanoloxy group, alkoxyloxy group, alkoxyloxycarbonyl group
  • Each group in this group includes, for example, a halogen atom, an oxo group, an optionally substituted amino group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower haloalkoxy group, an acyl group, an acyloxy group, a lower alkylthio group, a carboxy group, It may be substituted with one or a plurality of groups arbitrarily selected from the group such as an optionally substituted ruberamoyl group, a lower alkoxy group, a sulfonyl group and a phenyl group.
  • each group in this group includes, for example, a halogen atom, a nitro group, a cyano group, a mercapto group, an oxo group, a thixo group, a lower alkyl group, a lower haloalkyl group, an optionally substituted amino group, a hydroxyl group, and a lower alkoxy group.
  • a halogen atom a nitro group, a cyano group, a mercapto group, an oxo group, a thixo group, a lower alkyl group, a lower haloalkyl group, an optionally substituted amino group, a hydroxyl group, and a lower alkoxy group.
  • substituent of the substituted aryl group and the substituted heterocyclic group include methyl, 2-methyl mono 1-propyl, hexyl, 2-methyl 2-propyl, 2-propyl, phenyl, trifluoromethyl.
  • preferred substituents include methyl, 2-methylmono 1-propyl, hexyl, 2-methyl-2-propyl, 2-propyl, phenyl, trifluoromethyl, 2, 2, 2 —Trifluoroethyl, hydroxymethyl, hydroxyethyl, methoxymethyl, cyclopropylmethoxymethyl, acetomethyl, N, N dimethylcarbamoyloxymethyl, methanesulfonyloxymethyl, N, N dimethylsulfamoyloxymethyl, 2- (1-pyrrolidyl) ethoxymethyl, 2-methoxyethyl, carboxymethyl, methoxycarbonylmethyl, rubamoylmethyl, amidinomethyl, methylthiomethyl, cyanomethyl, aminomethyl, aminoethyl, N-acetylaminomethyl, fluoro, chloro , Bromo, Nitro, Shea Roxy, Ami-containing N, N Dimethylami-containing methoxy
  • Preferred examples of the number of substituents in the aryl group and heterocyclic group include 1, 2 or 3.
  • the aryl group and the heterocyclic group are preferably unsubstituted.
  • alkyl group examples include straight-chain or branched alkyl groups having 1 to 10 carbon atoms, and specifically include methyl, ethyl, propyl, 1-methylethyl, butyl, 1-methylolpropynole, 2- Methyl-1-propyl, 1,1-dimethylethyl, pentinole, 1,1-dimethylpropyl, 2,2 dimethylpropyl, 1-methylbutyl, 3-methylbutyl, hexyl, 2-methylpentyl, 3,3 dimethylbutyl, heptyl, 1 Examples include ethyl pentyl, 5-methylhexyl, octyl, 1,5 dimethylhexyl, 2-ethylhexyl, nonyl, and decyl. Examples of lower alkyl groups include alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • Examples of the substituent in the substituted alkyl group include any groups included in the following groups a) and d), and these may be optionally substituted by one or more.
  • halogen atom nitro group, cyano group, mercapto group, oxo group, thixo group, amino group which may be substituted, hydroxylamino group which may be substituted, lower alkoxyamino group which may be substituted, hydroxyl group , Acyl group, acyloxy group, carboxy group, optionally substituted rubamoyl group, optionally substituted rubamoyloxy group, sulfo group, optionally substituted sulfamoyl group
  • each group in this group includes, for example, a halogen atom, a nitro group, a cyano group, a mercapto group, an oxo group, a thixo group, a lower alkyl group, a lower haloalkyl group, an optionally substituted amino group, a hydroxyl group, and a lower alkoxy group.
  • a halogen atom a nitro group, a cyano group, a mercapto group, an oxo group, a thixo group, a lower alkyl group, a lower haloalkyl group, an optionally substituted amino group, a hydroxyl group, and a lower alkoxy group.
  • alkoxy group alkoxy carbo group, alkoxy (thiocarbo) group, al Kirthio group, (alkylthio) thiocarbol group, (alkylthio) carbol group, alkylcarbol group, alkylthioyl group, alkylsulfuryl group, alkylsulfol group, alkylcarboxoxy group, alkylthioylthio Xyl group, alkylsulphoninole
  • Each group in this group is, for example, a halogen atom, a nitro group, a cyano group, a mercapto group, an oxo group, a thixo group, an amino group that may be substituted, a hydroxyl group, an acyl group, an acyloxy group, a carboxyl group, or a substituted group.
  • Lower cycloalkyl group (The lower cycloalkyl group is arbitrarily selected from the group consisting of, for example, a neurogen atom, a lower alkyl group, a lower haloalkyl group, an optionally substituted amino group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group and a lower haloalkoxy group. And may be substituted with one or more groups
  • Lower alkoxy group, lower alkoxy carbo group and lower alkyl thio group are, for example, halogen atom, lower cycloalkyl group, monocyclic heterocyclic group, phenol Group, cyano group, -tox group, hydroxyl group, lower alkoxy group, lower haloalkoxy group, amino group which may be substituted, rubamoyl group which may be substituted, carboxy group, lower alkylcarbonyl group, lower alkoxycarbo 1 may be substituted with one or more groups arbitrarily selected from the group such as -l group, lower alkylthio group, lower alkylsulfinyl group and lower alkylsulfonyl group. Alternatively, it may be substituted with a plurality of groups. d): -R 10 , -OR 10 , -SR 10 , -OCH R 10 , —SCH R
  • substituted alkyl group examples include trifluoromethyl, 2-troethyl, 2-cyanopropyl, 4-mercaptobutyl, 3-oxobutyl, 2-piberidinoethyl, 2-hydroxyxetyl, 3-methoxypropyl, ethoxycarbonylmethyl, and cyclopropylmethyl.
  • Examples include til, 3-pyridylmethyl, 4-pyridylmethyl, 2-quinolylmethyl, 3-quinolylmethyl, 3-chenylpropyl, hydroxymethyl, hydroxyethyl, aminomethyl, aminoethyl, carboxymethyl, ethoxycarbmethyl, and rubamoylmethyl.
  • the lower haloalkyl group refers to a lower alkyl substituted with 1 to 5 halogen atoms.
  • the alkoxy group refers to an oxy group to which an alkyl group is bonded. Specific examples include methoxy, ethoxy, propoxy, 2-propoxy, butoxy, 1,1-dimethylethoxy, pentoxy, hexoxy and the like. Examples of the substituent of the substituted alkoxy group include the same substituents as the substituent of the substituted alkyl group. Specific examples of the substituted alkoxy group include cyclopropyl methoxy, trifluoromethoxy, 2-pyrrolidinoethoxy, benzyloxy, 2-pyridylmethoxy and the like.
  • the haloalkoxy group means an alkoxy group substituted with 1 to 5 halogen atoms.
  • alkoxycarbo group refers to a carbocycle group to which an alkoxy group is bonded. Specific examples include methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propoxycanoleboninole, 2-propoxycarbonyl and the like. Examples of the substituent in the substituted alkoxycarbonyl group include the same substituents as in the substituted alkyl group.
  • alkenyl group examples include a linear or branched alkenyl group having 2 to 3 carbon atoms and having 1 to 3 double bonds. Specifically, ethyl, 1-probe, 2-propenyl, 1-methylethenyl, 1-butenyl, 2 butenyl, 3 butenyl, 2 methyl-2 propenyl, 1-pentenyl, 2 pentenyl, 4 pentenyl, 3—Methinole 1 2 Butenore, 1 1 Hexeninore, 2—Hexeninore, 1 1 Hepteninore, 2—Heptenore, 1 Octenyl, 2 Octenyl, 1, 3—Octadenyl, 2 Nonenyl, 1, 3 Nonagel, 2 -Decenyl etc. are mentioned.
  • Preferred alkenyl groups include, for example, ethyl, 1-probe, and 1-buture groups.
  • the lower alkenyl group examples include those having 2 to 6 carbon atoms and
  • Examples of the substituent of the substituted alkenyl group include a norogen atom, a nitro group, a cyan group, and a methyl group.
  • Lucapto group, oxo group, thixo group, substituted amino group, hydroxyl group, lower alkoxy group, lower haloalkoxy group, lower alkoxycarbonyl group, lower alkylthio group, acyl group, acyloxy group, carboxy group, substituted good force Rubamoiru group, R 1Q, - OR 1Q, - SR 1Q, - OCH R 1Q, - (. wherein, the R 1Q the same meaning as defined above) SCH R 1Q like include
  • the alkoxy group means an oxy group to which an alkenyl group is bonded.
  • alkynyl group examples include linear or branched alkenyl groups having 1 to 3 triple bonds and 2 to C carbon atoms: L0. Specifically, Etul, 1 Probule, 2-Propinyl, 1-Butynyl, 2 Butynyl, 3 Butynyl, 1 Pentynyl, 2 Pentynyl, 4 Pentyl, 1-octyl, 6-Methyl-1 , 2 decals, etc.
  • Preferable alkyl groups include, for example, 1-probule, 1-butulyl group and the like.
  • Examples of the lower alkyl group include alkynyl groups having 2 to 6 carbon atoms.
  • Examples of the substituent of the substituted alkynyl group include a neurogen atom, a nitro group, a cyano group, a mercapto group, an oxo group, a thixo group, a substituted amino group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower haloalkoxy group, an acyl group.
  • R 1Q is as defined above.
  • the alkyloxy group means an oxy group to which an alkyl group is bonded.
  • Examples of the cycloalkyl group include cycloalkyl groups having 3 to 10 carbon atoms, and specific examples include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, and the like.
  • Examples of the lower cycloalkyl group include a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms.
  • a cycloalkyloxy group refers to an oxy group to which a cycloalkyl group is bonded.
  • Examples of the cycloalkenyl group include those having 3 to 10 carbon atoms, specifically, cyclohexenyl and the like.
  • Examples of the lower cycloalkenyl group include a cycloalkenyl group having 3 to 6 carbon atoms.
  • the cycloalkoxy group is a cycloalkenyl group. -An oxy group to which a ru group is bonded.
  • Examples of the substituent for the substituted cycloalkyl group and the substituted cycloalkenyl group include a nitrogen atom, a nitro group, a cyano group, a mercapto group, an oxo group, a thixo group, a lower alkyl group, a lower haloalkyl group, and a substituted amino group.
  • acyl group examples include, for example, Formula 1 Z—R 11 (wherein Z represents one CO, one CS—, one SO or SO, R 11 represents an optionally substituted alkyl group, substituted May be done
  • a group or a substituted group represents a heterocyclic group.
  • the acyl group include formyl, acetyl, propanol, 2-propanol, pivalol, norelinole, pivalol, trifluoroacetyl, benzoyl, naphthoyl, nicotinol, methanesulfonyl, trifluoromethanesulfonyl, and p-toluenesulfonyl.
  • a preferred isyl group includes an acetyl group.
  • an acyl group is an oxy group to which an acyl group is bonded.
  • Examples of the substituent in the substituent ruberamoyl group include an alkyl group which may be substituted with an aryl group or a heterocyclic group, an aryl group, a heterocyclic group, and the like. May be replaced independently.
  • Specific examples of the substituting rubermoyl group include ethylcarbamoyl, dimethylcarbamoyl, phenylcarbamoyl, 2-pyridylcarbamoyl, benzylcarbamoyl, (3-pyridylmethyl) force rumomoyl and the like.
  • Examples of the substituent in the substituted sulfamoyl group include an alkyl group, aryl group, and bicyclic group, and a plurality of the same or different ones may be independently substituted.
  • Specific examples of the substituted sulfamoyl group include ethylsulfamoyl, dimethylsulfamoyl, phenylsulfamoyl, 2-pyridylsulfamoyl and the like.
  • substituent in the substituted amino group examples include an acyl group, an alkyl group and the like, and a plurality of the same or different ones may be independently substituted.
  • Specific examples of the substituted amino group include acetamide, propionamide, butyramide, 2-butylamide, methylamino, 2-methyl-1-propylamino, and jetylamino.
  • the substituent in the substituted hydroxylamino group may be substituted with either a nitrogen atom or an oxygen atom, and the same substituents as in the substituted amino group may be mentioned.
  • halogen atom examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • alkylene group examples include linear or branched alkylene groups having 1 to 10 carbon atoms. Specifically, methylene, ethylene, trimethylene, tetramethylene, pentamethylene, hexamethylene, heptamethylene, otatamethylene, nonamethylene, decamethylene, methylmethylene, ethylmethylene, dimethylmethylene, 1,1-dimethylethylene, 1,2-dimethyl Ethylene, 1-methyltrimethylene, 2-methyltrimethylene, 1,1-dimethyltrimethylene, 1,2 dimethyltrimethylene, 1,3 dimethyltrimethylene, 2,2 dimethyltrimethylene, 1-ethyltrimethylene, Examples include 2-ethyltrimethylene, 1,1-jetyltrimethylene, 1,2-jetyltrimethylene, 1,3-jetyltrimethylene, 2,2-jetyltrimethylene, and the like.
  • Examples of the lower alkylene group include straight-chain or branched alkylene groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • protecting group for NH various commonly used protecting groups are possible.
  • Examples include strong rubamate-type protecting groups, amide-type protecting groups such as acetyl and benzoyl, benzyl, nitro, p-toluenesulfol, and methanesulfol.
  • the heterocycle in the optionally substituted heterocycle formed by combining any two of R 3 and R 4 together with the nitrogen atom includes, for example, 1 to 6 nitrogen atoms. 5- to 7-membered monocyclic or bicyclic saturated heterocyclic ring or unsaturated heterocyclic ring containing a child, oxygen atom and Z or sulfur atom (including at least one nitrogen atom).
  • pyrrolidine imidazolidine, 4,5 dihydro-1H-imidazole, piperidine, piperidin-4-one, piperazine, morpholine, thiamorpholine, 1, 4, 5, 6-tetrahydropyrimidine, Oxahydro-pyrimidine, 3, 6 dihydro-2H— [1, 3, 5] oxazi
  • substituent in the substituted heterocyclic ring include the same substituents as in the substituted heterocyclic group.
  • Examples of the optionally substituted hydrocarbon ring formed by combining R 8 and R 9 together with the carbon atom include an optionally substituted cycloalkane ring having 3 to 8 carbon atoms or a substituted hydrocarbon ring.
  • C3-C8 cycloalkene ring C3-C8 cycloalkene ring.
  • Specific examples of the strong cycloalkane ring or cycloalkene ring include cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane, cyclohexane, cycloheptane, cyclopropene, cyclobutene, cyclopentene, cyclohexene, cycloheptene, and the like.
  • Examples of the substituent in the substituted hydrocarbon ring include the same substituents as those in the substituted cycloalkyl group.
  • a compound in which the isoxazole derivative of formula 1 has a polar functional group in the isoxazole ring can be administered for a long period of time with improved pharmacokinetics and fewer side effects.
  • Pharmaceutically acceptable salts of the isoxazole derivative of Formula 1 include acid addition salts and base addition salts.
  • the acid addition salt include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydrofluoride, nitrate, and phosphate, citrate, oxalate, acetate, and formate. , Propionate, benzoate, trifluoroacetate, fumarate, maleate, tartrate, aspartate, glutamate, methanesulfonate, benzenesulfonate, camphor monosulfonate Acid salts.
  • Base addition salts include inorganic base salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, and ammonium salt, triethyl ammonium salt, triethanol ammonium salt, pyridinium salt, And organic base salts such as diisopropyl ammonium salt.
  • the CaMKII inhibitor in the present invention includes the specific compounds exemplified herein (for example, isoxazole derivatives of formula 1, compound (I), compound (lb), compound (Ic), compound (II Etc.) and all stereoisomers, optically active substances, tautomers, prodrugs, derivatives and the like.
  • the present invention also includes solvates such as hydrates and crystal forms of all embodiments.
  • the isoxazole derivative of formula 1 can be produced, for example, by the method described in Patent Document 3.
  • the autoimmune disease preventive agent and Z or therapeutic agent of the present invention and the screening method for the Ca ⁇ inhibitor of the present invention will be described in detail.
  • an “autoimmune disease” is an antibody that reacts with the components that make up the tissue of its own.
  • a lymphocyte is a disease in which tissue damage is caused by the continuous production of lymphocytes in the body.
  • organ-specific autoimmune diseases and organ-nonspecific autoimmune diseases (systemic autoimmune diseases).
  • Organ-specific autoimmune disease Hashimoto's disease, primary myxedema, thyroid poisoning, pernicious anemia, Good-pasture syndrome, acute progressive glomerulonephritis, myasthenia gravis, pemphigus vulgaris , Bullous pemphigoid, insulin resistant diabetes, juvenile diabetes, type I diabetes, Addison's disease, atrophic gastritis, male infertility, premature menopause, phakogenic uveitis, multiple sclerosis, ulcerative Colitis, primary biliary cirrhosis, chronic active hepatitis, autoimmune hematologic disease (eg, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia), paroxysmal hemoglobinuria, idiopathic thrombocytopenia Purpura, interstitial pulmonary fibrosis, and sidalen syndrome.
  • autoimmune hematologic disease eg, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia), par
  • Non-organ-specific autoimmune disease (systemic autoimmune disease): rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, discoid lupus erythematosus, polymyositis, scleroderma and mixed connective tissue disease
  • the present invention arbitrarily targets these “autoimmune diseases”.
  • rheumatoid arthritis and multiple sclerosis can be exemplified. More preferably, rheumatoid arthritis can be exemplified.
  • the preventive agent and Z or therapeutic agent, enhancer, composition, commercial package, kit, use, or method of the present invention can optionally be directed to mammals suffering from these autoimmune diseases, more preferably It is possible to target patients suffering from autoimmune diseases.
  • the "autoimmune disease preventive agent and Z or therapeutic agent" of the present invention is selected from the actions shown in the following (1) and (2) against the various autoimmune diseases 1 Or it has multiple actions.
  • Preventive action action to suppress its onset (onset suppression action) and action to delay its onset (onset delay action)
  • Therapeutic action action to reduce or improve the symptoms after onset (symptom alleviation action, symptom improvement action), action to suppress the progression of the disease state (progression inhibition action), action to inhibit the progression of the disease state (progression inhibition action) ), Or an action to cure the disease (curative action)
  • the “autoimmune disease preventive agent and Z or therapeutic agent” of the present invention includes an autoimmune disease preventive agent (an autoimmune disease preventive agent includes an autoimmune disease onset inhibitor and an autoimmune disease onset delay agent, etc.
  • Autoimmune disease therapeutic agents autoimmune disease therapeutic agents include autoimmune disease symptom relieving agents, autoimmune disease symptom improving agents, autoimmune disease progression inhibitors, and autoimmune disease progression inhibitors
  • agents that have both prophylactic and therapeutic effects on autoimmune diseases can be rephrased as a prophylactic effect, and the therapeutic effect as a therapeutic effect.
  • CaMKII inhibitory action broadly means an action of inhibiting the functional expression of CaMKI I without questioning the mechanism of action.
  • the action of inhibiting the functional expression of CaMKII includes the action of inhibiting the synthesis of CaMKII protein (including CaMKII gene expression) and secretion, and the action of inhibiting the activation (phosphorylation) of the expressed CaMKII.
  • an action of inactivating activated CaMKII (dephosphorylation) and an action of inhibiting activated CaMKII enzyme activity are included.
  • such inhibition of functional expression of CaMKII is sometimes simply referred to as CaMKII inhibitory action or CaMKII inhibition.
  • the "CaMKII inhibitor (a substance having a CaMKII inhibitory action)" of the present invention may be any substance having at least one of the above-mentioned inhibitory actions, and its form and properties are different. There is no question.
  • the “CaMKII inhibitor” of the present invention is not particularly limited as long as it has an inhibitory action on CaMKII derived from mammals other than humans and other species, as long as it has an inhibitory action on human CaMKII. Not.
  • the CaMKII inhibitor of the present invention includes proteins, peptides, low molecular weight compounds and the like.
  • a low molecular compound having a CaMKII inhibitory action is obtained by carrying out the screening method of the present invention described later on a low molecular compound library (for example, a low molecular compound library such as CamBridge Research Laboratories). can do.
  • the CaMKII inhibitor of the present invention is an anti-CaMKII antibody
  • the antibody is specific to CaMKII. Any antibody can be used as long as it can be recognized, and such an antibody can be prepared by a known method using CaM protein.
  • the anti-CaMKII antibody of the present invention includes a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, and an antibody having the above-described antigen-binding property such as a fragment produced by a Fab fragment or Fab expression library. Some are included.
  • Examples of the CaMKII inhibitor of the present invention include a polynucleotide having at least 15 bases continuous in the base sequence of the CaMKII gene and Z or a polynucleotide complementary to the polynucleotide.
  • the CaMKII gene may be any isoform such as ⁇ , ⁇ , ⁇ ′, ⁇ , ⁇ , preferably CaMKII ⁇ gene or CaMKII ⁇ gene, more preferably CaMKII ⁇ gene. it can.
  • the gene sequences registered in GenBank with the following Accession No. can be used. Human CaMKII a Accession No. AF145710
  • GenBank also registers gene sequences of various mutants in each isoform of the CaMKII gene, and these sequence information can also be used.
  • the complementary polynucleotide (complementary strand, reverse strand) is the full-length sequence of a polynucleotide consisting of the base sequence of CaMKII gene, or at least 15 consecutive bases in length.
  • a polynucleotide having a base sequence complementary to its partial sequence having a base sequence (for convenience, these are also referred to as “positive strands”) based on base pair relationships such as A: T and G: C Means.
  • the strong complementary strand is not limited to forming a completely complementary sequence with the base sequence of the target positive strand, but is complementary enough to allow hybridization with the target positive strand under stringent conditions. It may have the following.
  • Nucleic acid melting temperature Tm
  • post-hybridization washing conditions conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned. It is preferable that the complementary strand maintain a hybridized state with the target positive strand even when washed under strong conditions.
  • the stricter hybridization conditions are about ⁇ 0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C '', and the stricter hybridization conditions are about ⁇ 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C ''.
  • a complementary strand has at least 90%, preferably 95% homology with a strand composed of a base sequence that is completely complementary to the base sequence of the target positive strand. It is possible to exemplify a chain having a base sequence ability.
  • the polynucleotide on the positive strand side also has a nucleotide sequence ability that is more complementary to the nucleotide sequence of the complementary strand than just the nucleotide sequence of the CaMKII gene or a partial sequence thereof. Can be included.
  • the normal polynucleotide and the complementary strand may be used as a disease marker in a single-stranded form, or may be used as a disease marker in a double-stranded form.
  • the CaMKII inhibitor of the present invention includes, as an embodiment of a polynucleotide having at least 15 bases continuous in the base sequence of the CaMKII gene and Z or a polynucleotide complementary to the polynucleotide, against the CaMKII gene.
  • siRNA small interfering RNA
  • siRNA is a general term for double-stranded RNA of 21 to 23 bases used for RNAi (RNA interference).
  • RNAi is a phenomenon in which double-stranded RNA introduced into a cell suppresses the expression (protein synthesis) of a gene having the same sequence, and this method destroys the target gene (mRNA). In recent years, it has attracted attention as an effective method for analyzing the function of genes in order to suppress their expression.
  • siRNAs against the CaMKII gene can be obtained by known methods based on the base sequence information (GenBank, etc.) relating to the CaMKII gene (which can be any isoform such as ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ , and ⁇ ). Can be designed and prepared.
  • siRNA design methods include Chal k et al., Improved and automated prediction of effective siRNA, Biochem Biophys Res Commun. 2004; 319 (1): 264-74, or Reynolds et al., "Rational siRNA desig n for RNA interference ", Nature Biotechnology 2004; 22, 326-330.
  • siRNA design programs available on the Internet can be used to design an appropriate siRNA.
  • siRNA sequence nnder, nttp http: //www.sinc.suny sb.edu/Stu/shilin/rnai.html, etc. can be used to design an appropriate siRNA.
  • it can be confirmed by the test method as exemplified in Example 16 whether or not it actually has an action of suppressing CaMKII gene expression.
  • the CaMKII inhibitor described above is useful as an autoimmune disease preventive agent and Z or therapeutic agent, particularly as an autoimmune disease preventive agent and Z or therapeutic agent used in combination with DMARDs. Further, the CaMKII inhibitor can be obtained by the screening method of the present invention described below without being particularly limited to the substances specifically listed above.
  • the autoimmune disease preventive agent and Z or therapeutic agent targeted by the present invention particularly the autoimmune disease preventive agent and Z or therapeutic agent used in combination with D MARDs,
  • the effective amount of the CaMKII inhibitor may be any compounded amount of a CaMKII inhibitory substance that causes the autoimmune disease preventive agent and the Z or therapeutic agent containing the CaMKII inhibitor to exhibit a CaMKII inhibitory effect as a result.
  • the autoimmune disease preventive agent and Z or therapeutic agent contain pharmaceutically acceptable carriers and various additives in addition to CaMKII inhibitory substances! / You can ask me.
  • CaMKII inhibitors are used as a concomitant agent for the prevention and Z or treatment of autoimmune diseases in combination with DMARDs, and for the prevention and Z or treatment effects of autoimmune diseases with disease-modifying antirheumatic drugs. It is considered useful as an enhancer.
  • the screening method of the present invention has been developed based on such findings.
  • searching for a CaMKII inhibitor from the test substance (i) an autoimmune disease preventive and Z It is also intended to obtain an active ingredient of a therapeutic agent, or (ii) a concomitant agent for the prevention or Z or treatment of autoimmune diseases in combination with DMARDs.
  • the “CaMKII inhibitor” targeted by the screening method of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that can inhibit CaMKII function expression (function exertion, action) as a result. is not.
  • the CaMKII inhibitory action includes 1) an action that inhibits the activated CaMKII enzyme activity, 2) an action that inhibits the CaMKII activity, 3) an inactivation (deactivation) of the activated CaMKII enzyme. 4) an action that inhibits the expression or secretion of CaMKII.
  • CaMKII inhibitors should have at least one of the most potent CaMKII inhibitory actions.
  • Candidate substances that can be CaMKII inhibitors include nucleic acids, peptides, proteins, and organic compounds.
  • the screening method of the present invention can be carried out on a substance that can be a candidate substance or a sample containing the substance (collectively referred to as “test substance”). Furthermore, as a sample (test substance) containing a candidate substance, a cell extract, an expression product of a gene library, a microorganism culture supernatant, a bacterial cell component, and the like can be used.
  • the "CaMKII inhibitor” of the present invention may have any structure as long as it is pharmaceutically acceptable, and is not limited to the following. Preferred specific examples thereof include the following. Can do.
  • the screening method of the present invention comprises the above-described CaMKII inhibitors among the powerful test substances. It is carried out by searching for substances having at least one of the above CaMKII inhibitory actions using harmful action as an index.
  • the test substance thus selected and acquired is useful as an active ingredient of an autoimmune disease preventive agent and Z or therapeutic agent, and is also useful as an active ingredient of an autoimmune disease preventive agent and Z or therapeutic agent used in combination with DMARDs. It is.
  • a screening method for a CaMKII inhibitor comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • a method for screening a substance having an inhibitory effect on CaMKII production comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • a screening method for a substance having an inhibitory effect on CaMKII gene expression comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • a method for screening a substance having an activity of inhibiting the activation of CaMKII comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • test substance concentrations include, but are not limited to, 100 M, 10 M, 1 M, 0.1 ⁇ , 0.01 ⁇ , 0.001 ⁇ , and intermediate concentrations ⁇ , 3 / ⁇ ⁇ , ⁇ , 0.5 ⁇ , 0.3 ⁇ , 0.2 ⁇ , etc.).
  • the criteria for determining “having CaMKII inhibitory activity” are not limited to these, but the inhibitory potency of CaMKII compared to the control can be exemplified as follows.
  • Test substance concentration at 10 ⁇ ! / CaMKII inhibition rate is 30% or more;
  • CaMKII inhibition rate is 60% or more at test substance concentration of 1 ⁇ ;
  • CaMKII inhibition rate is 40% or more at test substance concentration 0.1 ⁇ ;
  • CaMKII inhibition rate is 60% or more at test substance concentration of 0.1 ⁇ .
  • Preferable judgment criteria include, for example, (1), (2), (3), (4) or (5) among the above criteria. More preferably, (1), (3) or (4) is mentioned. More preferably , (3) or (4).
  • the CaMKII used in the above screening method may be any isoform such as ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ , preferably CaMKIIy or CaMKII ⁇ , and more preferably. Mention may be made of CaMKII y.
  • the screening method for CaMKII inhibitors in the present invention is not limited to the above-described embodiment, and can be appropriately designed based on the common general technical knowledge of those skilled in the art.
  • Candidate substances that have also been selected as the test substance by the CaMKII inhibitor screening method described above are further used in, for example, pharmacological tests using pathological model animals that mimic various human autoimmune diseases ( More effective autoimmune disease preventives and Z or therapeutic agents (especially suitable for combined use with DM ARDs) Alternatively, it can be obtained as an active ingredient of a therapeutic agent.
  • a candidate substance selected by the screening method of the present invention is useful as a therapeutic agent for an autoimmune disease, particularly whether it is effective for chronic inflammation such as rheumatism, is a pathological condition of rheumatoid arthritis.
  • Model animals eg, collagen-induced arthritis [Trentham DE. Townes AS. Ang AH: Autoimunity to typell collagens: An experimental model of arthritis J Exp Med 146: 857-868,1977], antigen-induced arthritis, or adjuvant 3 ⁇ 4 Lead ⁇ 3 ⁇ 4 Arthritis [Pearson CM: Development of arthritis, periarthritis and penotitis in rats given adjuvant. Proc Soc Expe Biolo Med 91: 95-101, 1956] It can be evaluated by conducting a test.
  • Rat adjuvant arthritis is an experimental arthritis in which T lymphocytes are involved in the onset mechanism and progresses mainly in cartilage and bone changes and fibrosis of the joint.
  • Basic research on chronic inflammation and pharmacological research on therapeutic drugs It is widely used as a disease model in Japan.
  • the pathology of adjuvant arthritis is usually (1) non-specific primary inflammatory phase in which only the injected foot swells (peak: 4 to 5 days later), (2) induction of increased activated lymphocytes in regional lymph nodes Stage (period: 5-9 days), (3) exacerbation period of adjuvant arthritis in which polyarthritis develops (peak: 15-17 days) ), And (4) It progresses like a natural healing period (period after 25 days) in which inflammation is subdued, leaving joint deformation and destruction.
  • Non-specific primary inflammation caused by adjuvant sensitization is also involved in the progression of the disease on the foot side of the injection, whereas the disease state progresses on the non-injection foot side due to the involvement of T lymphocytes.
  • the indexes for drug efficacy evaluation are (1) the volume of each left and right hind limb, (2) the change in the amount of edema obtained by measuring the volume of each hind limb before and after drug administration, and calculating the volume difference before and after administration. (3) Morphological evaluation of bone by soft X-ray and (4) Pathological evaluation by tissue section are generally used.
  • the selected candidate substance is subjected to a medicinal effect test using a disease model animal (eg, EA E onset induction mouse) of multiple sclerosis, whereby the candidate substance is subjected to multiple sclerosis.
  • a disease model animal eg, EA E onset induction mouse
  • the inhibitory effect can be evaluated.
  • Substances selected and obtained in this way can be produced industrially by chemical synthesis, biological synthesis (fermentation), or genetic manipulation based on the structural analysis results. It is out.
  • the CaMKII inhibitor selected using the screening method of the present invention as described above is an active ingredient of the autoimmune disease preventive and Z or therapeutic agents as described above, particularly as a concomitant drug with DMAR Ds.
  • Specific examples of the autoimmune disease include various diseases described in Chapter I of the present specification, and CaMKII inhibitors specifically targeted by the present invention include rheumatoid arthritis and multiple occurrences. It can be effectively used for systemic sclerosis and systemic lupus erythematosus, preferably rheumatoid arthritis, and multiple sclerosis, more preferably rheumatoid arthritis.
  • the present invention provides an autoimmune disease preventive agent and Z or therapeutic agent used in combination with D MARDs, which contains a CaMKII inhibitor obtained by the screening method described above. is there. Further, the present invention includes other embodiments such as concomitant agents, enhancers, kits, uses, methods, etc. Other embodiments will be described in detail in the section (III) below.
  • the concomitant agent for prevention and Z or treatment of autoimmune disease in the present invention is a preparation comprising at least one CaMKII inhibitor and at least one disease-modifying antirheumatic drug (DMARDs).
  • DMARDs disease-modifying antirheumatic drug
  • These are pharmaceuticals obtained by combining the two alone or after mixing with a pharmacologically acceptable carrier or excipient as appropriate, and can be used orally or parenterally.
  • an active ingredient CaM ⁇ inhibitor and DMARDs for example, (1) according to a known pharmaceutical production method, together with excipients that can be suitably pharmaceutically acceptable if desired, etc.
  • the present invention includes a combination mode for prevention and Z or treatment of an autoimmune disease, and includes the following modes, although not limited thereto.
  • a DMARDs preventive and Z or therapeutic effect enhancer comprising a CaMKII inhibitor as an active ingredient; (4) a kit comprising a first composition comprising a CaMKII inhibitor and a second composition comprising a disease modifying anti-rheumatic drug;
  • the prophylactic agent can be paraphrased as “preventive pharmaceutical composition”, the therapeutic agent as “therapeutic pharmaceutical composition”, and the enhancer as “enhancing pharmaceutical composition”.
  • an embodiment of the present invention includes a method for preventing and Z or treating an autoimmune disease characterized by administering a CaMKH inhibitor in combination with a disease-modifying antirheumatic drug.
  • a method for enhancing self-immune disease prevention and Z or therapeutic effect by a disease-modifying antirheumatic drug, including administration of a CaMKII inhibitor is also included as an embodiment of the present invention.
  • the CaMKII inhibitor is a protein such as a low molecular weight compound, a peptide or an antibody
  • it can be prepared in the form of a commonly used pharmaceutical composition (pharmaceutical preparation) for these substances.
  • a commonly used pharmaceutical composition pharmaceutical preparation
  • it can be administered orally or parenterally.
  • administration forms and administration methods are mentioned.
  • Typical administration forms include solid preparations such as tablets, pills, powders, powders, granules and capsules, and liquids such as solutions, suspensions, emulsions, syrups and elixirs. And the like. These various forms can be administered orally according to the route of administration, as well as nasal, transdermal, rectal (suppository), sublingual, vaginal, and injection (transvenous, transarterial, It can be classified into parenteral administration agents such as transmuscular, subcutaneous and intradermal) and infusions.
  • parenteral administration agents such as transmuscular, subcutaneous and intradermal
  • oral administration agents for example, tablets, pills, powders, powders, granules, capsules, solutions, suspensions, emulsions, syrups, etc.
  • vaginal agents for example, It can take the form of tablets, pills, capsules and the like.
  • transdermal agents for example, in addition to liquids such as lotions, semi-solid forms such as creams and ointments can be used.
  • the injection may take the form of, for example, a solution, a suspension, or an emulsion, and specifically, aseptically treated water, water, propylene glycol solution, buffered solution, 0.4% strength by weight physiological saline. Water etc. can be illustrated. Furthermore, the injection can be stored in a liquid form after it has been frozen or lyophilized. The freeze-dried preparation prepared by the latter freeze-drying process is used by re-dissolving it by adding distilled water for injection at the time of use.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition is prepared by blending a CaMKII inhibitor and a pharmaceutically acceptable carrier by a conventional method performed in the art.
  • pharmaceutically acceptable carriers include excipients, diluents, fillers, extenders, binders, disintegrants, wetting agents, lubricants, and dispersants.
  • additives usually used in the field can be blended.
  • stabilizers, bactericides, buffers, thickeners, pH adjusters, emulsifiers, suspending agents, preservatives, perfumes It can be appropriately selected from among colorants, tonicity modifiers, chelating agents, surfactants and the like.
  • the CaMKII inhibitor is the isoxazole derivative represented by the formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • a preparation containing the CaMKII inhibitor for example, JP-A-11-240873, WO 98 / 47880, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-186077, and the like.
  • a preparation containing compound (I) can also be produced, for example, by the method described in WO 02Z092094 pamphlet (corresponding EP patent: EP 1374871 A1).
  • a preparation containing the above CaMKII inhibitor can be used in combination with a preparation containing DMARDs.
  • a preparation containing DMARDs added to the above preparation can also be used.
  • both can be mixed according to a doctor's prescription and a pharmaceutical can be manufactured.
  • CaMKII inhibitors and DMARDs may be simultaneously or separately by different routes, or at different intervals, for example, on the same day, or for several days to weeks, or even months. Can be administered.
  • the dosage and frequency of administration of the CaMKII inhibitor in these pharmaceutical compositions are the dosage form, It is determined by taking into account the patient's illness and severity, age, weight, general health, sex, diet, administration time, excretion rate, drug combination, and other factors.
  • the individual daily dose for the combination of CaMKII inhibitors and DMARDs is about 1Z50, the minimum recommended clinical dose compared to the actual situation when they are administered alone (recommended clinical dose). This is the range below the maximum recommended clinical dose.
  • the dosage of a CaMKII inhibitor is usually in the range of about 0.0001 to about 100 mg of active ingredient per day for an adult, preferably in the range of about 0.001 to about 300 mg, more preferably about 0.
  • the range of 1 to about 300 mg can be administered once or in several divided doses per day.
  • oral administration Preferably, oral administration.
  • these doses can be reduced as appropriate while observing the combined effect with DMARDs used in combination.
  • the daily dose for an adult is preferably about 20 to about 300 mg, more preferably about 30 to about 300 mg. More preferably, the range of about 40 to about 240 mg, particularly preferably about 80 to about 240 mg can be orally administered once or several times a day.
  • the administration frequency is preferably once a day. More specifically, it is possible to orally administer if80 mg once a day, 120 mg once a day, and ⁇ or 240 mg once a day. In addition, these doses can be reduced as appropriate while observing the combined effect with the combined DMARDs.
  • DMARDs Disease-modifying anti-rheumatic drugs used in combination with CaMKII inhibitors include drugs that ameliorate rheumatoid inflammation by correcting immune abnormalities in rheumatoid arthritis and induce remission. It is done. Specifically, the following drugs can be mentioned.
  • D-peicillamine D- penicillamine: Nature, 151, 107 (1943)
  • Salazosulfapyridine Br Med J. 1980 Feb 16; 280 (6212): 442-4; also called sulfasalazine
  • Tacrolimus (Fcro 506, EP 184162)
  • Adalimumab (adalimumab, D2E7: Ann Rheum Dis. 1999 Nov; 58 Suppl 1: 170-2)
  • Rituximab (IDEC-102: Blood 1994 Jan; 83 (2): 435-45, Blood 1997 Sep; 9
  • DMARDs leflunomide, methotrexate and salazosulfapyridine are preferable. More preferred is methotrexate.
  • side effects are often a problem with the use of these DMARDs.
  • the side effect include liver disorder, kidney disorder, gastrointestinal disorder, blood disorder, and bone marrow disorder. More specifically, for example, when methotrexate or leflunomide is selected as DMARDs, autoimmune diseases with liver damage, blood damage, or bone marrow damage (for example, In patients with rheumatoid arthritis, methotrexate or leflunomide is difficult to take due to side effects. Even if these symptoms are not present at the start of administration, these side effects may occur while the administration is continued, making it difficult to continue administration of these DMARDs (methotrexate or leflunomide), and the dose must be reduced. Or increasing the amount of DMARDs becomes difficult.
  • CaMKII inhibitors of the present invention have no or few of these side effects, and therefore cannot be sufficiently treated with DMARDs such as methotrexate or leflunomide. It is especially effective for patients with autoimmune diseases.
  • DMARDs such as methotrexate or leflunomide.
  • the combined use of CaMKII inhibitors and DMARDs can complement each other's actions, so that sufficient self-immune disease prevention and Z or therapeutic effects can be obtained due to the above side effects.
  • DMARDs and the CaMKII inhibitor of the present invention for patients with autoimmune diseases that cannot be treated with DMARDs, the effectiveness of DMARDs can be reduced in the form of DMARDs (prophylaxis and Z or treatment). Effect). Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a comprehensively excellent autoimmune disease preventive agent and Z or therapeutic agent with low side effects and high efficacy.
  • DMARDs are proteins such as low molecular weight compounds, peptides or antibodies
  • they can be prepared in the form of commonly used pharmaceutical compositions (pharmaceutical preparations) for these substances, depending on the form. And can be administered orally or parenterally.
  • pharmaceutical compositions pharmaceutical preparations
  • parenterally In general, the following administration forms and administration methods are exemplified.
  • Representative administration forms include solid preparations such as tablets, pills, powders, powders, granules and capsules, and liquids such as solutions, suspensions, emulsions, syrups and elixirs. And the like. These various forms can be administered orally according to the route of administration, as well as nasal, transdermal, rectal (suppository), sublingual, vaginal, and injection (transvenous, transarterial, It can be classified into parenteral administration agents such as transmuscular, subcutaneous and intradermal) and infusions.
  • parenteral administration agents such as transmuscular, subcutaneous and intradermal
  • oral administration agents for example, tablets, pills, powders, powders, granules, capsules, solutions, suspensions, emulsions, syrups, etc.
  • transdermal agents can take the form of semi-solids such as creams and ointments.
  • the injection may take the form of, for example, a solution, a suspension, or an emulsion, and specifically, aseptically treated water, water, a propylene glycol solution, a buffered solution, and 0.4% strength by weight physiological saline. Water etc. can be illustrated.
  • the injection can be stored in a liquid form after it has been frozen or lyophilized.
  • the freeze-dried preparation prepared by the latter freeze-drying process is used by re-dissolving it by adding distilled water for injection at the time of use.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition is prepared by blending DMARDs and a pharmaceutically acceptable carrier by an ordinary method practiced in the art.
  • pharmaceutically acceptable carriers include excipients, diluents, fillers, extenders, binders, disintegrants, wetting agents, lubricants, and dispersants. Further, additives usually used in this field can be blended.
  • stabilizers, bactericides, buffers, thickeners, pH adjusters, milking agents, suspending agents, preservatives, perfumes , Colorants, tonicity modifiers, chelating agents, surfactants, and the like can be appropriately selected and used.
  • the pharmaceutical composition having such a form can be administered by an appropriate administration route according to the target disease, target organ and the like.
  • it may be administered orally, or it may be administered locally, directly to the force of administration intravenously, artery, subcutaneously, intracutaneously or intramuscularly, or to the tissue itself in which a lesion is observed, or transdermally or rectally administered. is there.
  • the dosage and number of administrations of DMARDs in these pharmaceutical compositions include the dosage form, the degree of the patient's disease and condition, the patient's age, weight, general health, sex, diet, time of administration, It is determined in consideration of the excretion rate, combination of drugs, and other factors.
  • individual daily doses for the combination of DMARDs and CaMKII inhibitors are about the minimum recommended clinical dose compared to the actual situation (recommended clinical dose) when they are administered alone. The range is from 1Z50 to the maximum recommended clinical dose.
  • the dosage of DMARDs is usually in the range of about 0.0001 to about 4000 mg, preferably in the range of about 0.001 to about 3000 mg, more preferably about 0 as the amount of active ingredient per day for an adult.
  • the range of 1 to about 300 mg can be administered once or in several divided doses per day.
  • administration Klu can be administered once a week or divided into 2 to 3 times per week.
  • Specific clinical dosages and usage of individual DMARDs include, for example: In the case of lefnorenimide, 5-30 mg, preferably 10-20 mg, can be administered once a day. Methotrexate can be administered 5-30 mg, preferably 6-25 mg per week, in a single dose or in 2-3 doses. With salazosulfapyridine, 0.5-4 g, preferably 1-3 g per day can be administered once a day or divided into 2-3 times. Any agent is preferably administered orally. These doses can be reduced as appropriate while observing the combined effect with the CaMKII inhibitor used in combination.
  • the concomitant drug of the present invention can be further used in combination with a nonsteroidal anti-inflammatory drug, a corticosteroid, or the like.
  • a nonsteroidal anti-inflammatory drug include salicylic acid (aspirin, etc.), anthral (mefenamic acid, flufenamic acid, etc.), indoleacetic acid (indomethacin, sulindac, acemetacin, etc.), phenol acetic acid.
  • corticosteroid drugs include dexamethasone, hydrocortisone, cortisone, prednisone, methylprednisolone, betamethasone, triamcinolone, triamcinoloneaceto-do, beclomethasone, fluocinolone, fluocinoloneacetonide, halobredon, etc. Can be mentioned. These compounds may be in the form of a salt such as a sodium salt which may be esterified or a solvate such as a hydrate.
  • the "therapeutic effect" of the present invention refers to a therapeutic action against an autoimmune disease.
  • therapeutic effects on autoimmune diseases include, for example, the action of reducing or improving the symptoms after onset (symptom alleviation action, symptom improvement action), the action of suppressing the progression of the disease state (progression inhibitory action) ), An action that suppresses the progression of the disease state (progression inhibitory action), or an action that cures the disease (healing action).
  • the "therapeutic effect" of the present invention is the effect of suppressing chronic inflammation, the effect of inhibiting joint destruction, the effect of inhibiting progression to joint deformation, and the body in rheumatoid arthritis patients. It is possible to judge the effect by using the improvement effect of the function as an index. wear.
  • “Improvement of physical function” in patients with rheumatoid arthritis refers to improvement of joint symptoms such as joint pain caused by chronic inflammation of the synovium, swelling, and suppression of joint destruction and deformation. Means improvement.
  • the daily life movement ability can be evaluated using, for example, clothes attachment / detachment's posture, standing, eating, walking, hygiene, extension, grip strength and activity as an index. Specifically, it can be evaluated using, for example, HAQ (Health Assessment Questionnaire) (Fries JF, et al., Arthritis Rheumatism, 23, p.137-145, 1980).
  • the joint destruction suppressing effect can be evaluated and the therapeutic effect can be judged.
  • Larsen score or Sharp score can be used (Acta Radiologica Diagnosis 18: 481-4 91,1977; J Rheumatol 22 (10): 1974-1975, 1995; Bailliere's Clinical Rheumatology: 1 0 (3 ): 435-453, 1996).
  • Evaluation index such as the proportion of patients who satisfy ACR standard 20% improvement, the proportion of patients who satisfy ACR standard 50% improvement, the proportion of patients who satisfy ACR standard 70% improvement, or joint destruction suppression effect (X-ray)
  • the CaMKII inhibitor of the present invention was compared by comparing the therapeutic effect of the CaMKII inhibitor or DMARDs alone administration group (or both groups) with that of the combination administration group using an index arbitrarily selected from It is possible to evaluate the combined effect of using DMARDs with DMARDs.
  • autoimmune disease patients to whom a sufficient amount of disease-modifying antirheumatic drugs (DMARDs) that can sufficiently prevent and / or treat autoimmune diseases due to side effects cannot be administered are not limited to the following. For example, there are patients described below.
  • the maximum dose of the DMARDs usually used (hereinafter referred to as the “maximum recommended clinical dose”) has already been administered, a sufficient effect has been obtained for preventing and / or treating autoimmune diseases. , Na, patient;
  • the "sufficient therapeutic effect” can be evaluated by an index selected from the various evaluation indexes described above, and may vary depending on various factors such as a patient's disease and its disease state. For example, rheumatoid arthritis In the case of, the above-mentioned "Standard by the American College of Rheumatology: 20% improvement” or “Standard by the American College of Rheumatology: 50% improvement” can be exemplified as specific standards.
  • the second pharmaceutical composition comprises a disease-modifying anti-rheumatic drug
  • the first pharmaceutical The composition comprises a CaMKII inhibitor
  • the second pharmaceutical composition comprises a disease modifying antirheumatic drug
  • the first pharmaceutical composition comprises a CaMKII inhibitor.
  • the effective dose of the first pharmaceutical composition (dose of active ingredient) is the same between group B and dull.
  • the effective dose of the second pharmaceutical composition (dose of the active ingredient) shall be equal to Group C.
  • Group P non-drug group (or placebo group)
  • Group A Group 1 of the first pharmaceutical composition alone
  • Group B Second pharmaceutical composition alone administration group
  • Group C Combined administration group of the first pharmaceutical composition and the second pharmaceutical composition
  • the effect of the index E of group! 3 , A, B, and C on the specific therapeutic effect index is E (P), E (A),
  • the term “exceeding the total therapeutic effect” in “Aspect 1” means that the effect in the group is the sum of the effect in group A and the effect in group B. That is, E (C)> E (A) + E (B).
  • “exceeding therapeutic effect” in “Aspect 2” means that the effect in Group C exceeds the effect in Group A and exceeds the effect in Group B, that is, “E ( C)> E (A) and E (C)> E (B) ”.
  • Indicator E may be a quantitative indicator or a qualitative indicator. Quantitative indicators include, for example, the proportion of patients that satisfy the above-mentioned 20% improvement in the ACR standard and the proportion of patients that satisfy the 50% improvement in the ACR standard. The qualitative indicators include, for example, the X-ray image described above. Inhibition of hand and ankle destruction by evaluation (evaluation by score).
  • KN-93 N- (2- [N- [4-crocincinnamyl] -N-methylaminomethyl] phenol) -N- (2-hydroxysityl) -4-methoxybenzenesulfonamide — Can be synthesized according to the method described in 293730)
  • test substance was dissolved in DMSO and diluted to various concentrations with CaMKII reaction buffer (50 mM Tris-HC1: pH 7.5, 10 mM MgCl 2, ImM Dithiothreitol (DTT)) (all Nakalai Tesque).
  • CaMKII reaction buffer 50 mM Tris-HC1: pH 7.5, 10 mM MgCl 2, ImM Dithiothreitol (DTT)
  • Table 1 shows the CaMKII inhibitory activity of each test substance. It is clear that each test substance has an action of inhibiting the activity of CaMKII at a concentration of 1 / z M or 10 M or more.
  • the CaMKII y gene consists of two primers (5'—TC GGA TCC AGC ATG GCC ACC ACC GCC ACC TG—3 SEQ ID NO: 4), 5′-TA GAA. TTC ACA CTG CAG CGG TGC GGC AGG self-row number 5]) and cultured cell Jurket T cell-derived cDNA prepared according to a conventional method were prepared by PCR using a rod-shaped cDNA.
  • the prepared CaMKII ⁇ gene was excised with BamHI and EcoRI and introduced into pFastBacl MCS of trans fer vector. Based on this vector, an expression virus was prepared and amplified.
  • the expressed CaMKII ⁇ was purified according to a method described in the literature (Biochemical & Biophysical Research Communications. 173 (2): 578-84, 1990). That is, the expression cells were disrupted by ultrasonication, and prepared from the cell-soluble fraction obtained by centrifugation by a single purification with an ammonium sulfate fraction having a final concentration of 60% and calmodulin sepharose (Amasham Biosciences). Confirmation of the expression was carried out using y-specific anti-CaMKII antibody, scl541 (SantaCruz ) And western blotting.
  • the CaMKII ⁇ inhibitory activity of the test substance was measured in the same manner as in Example 1 except that human CaMKII ⁇ prepared by the above procedure was used instead of the rat-derived CaMKIIa.
  • Table 2 shows the CaMKII inhibitory activity of each test substance. It has been clarified that KN-93 has an effect of inhibiting the activity of CaMKII at a concentration of 1 M or higher and compound (I) at a concentration of 10 M or higher.
  • EL-4 cells (a mouse T lymphocyte cell line) were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM: GIBCO) containing 10% pup serum and used for the experiment. Cells were seeded in a 96-well plate at a rate of 5 ⁇ 10 4 cells / well, added with DMEM medium containing the test compound and DMEM medium containing PMA and A23187 as stimulants, and cultured for 20 hours. The final concentrations of the test compound and stimulant were adjusted so that Compound (I) was 1-30 ⁇ , ⁇ -93 was 1-10 ⁇ M, PMA power was 5 ng / ml, and A23187 was 250 ng / ml.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the amount of IL-2 in the supernatant was quantified by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method.
  • the quantification method was performed according to the instruction manual of the kit (MOUSE IL-2 Immunoassay; R & D Systems).
  • J774A.1 cells (mouse macrophage cell line) were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM: GIBCO) containing 10% offspring serum and used for experiments. Cells were seeded in a 96-well plate at a rate of 5 ⁇ 10 4 cells / well, DMEM medium containing a test compound and DMEM medium containing LPS as a stimulant were added, and cultured for 24 hours. The final concentrations of the test compound and stimulant were adjusted so that Compound (I) was 1-30 ⁇ , KN-93 was 1-3 ⁇ M, and LPS was 1 ⁇ g / ml.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • IL-6 in the supernatant was quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • L929 cells (mouse fibroblast cell line) were cultured in MEM Earl medium (E-MEM: GIBCO) containing 10% offspring serum and used for experiments. The cells were suspended in serum-free E-MEM, and the cells were seeded in a 96-well plate at a rate of 2 ⁇ 10 4 cells / well and cultured for 72 hours. E-MEM medium containing the test compound was added for 1 hour after incubation, and E-MEM medium containing Recombinant human FGF basic (bFGF) as a stimulant was added and cultured for 20 hours. Each well was supplemented with 5-bromo 2′-deoxyuridin (Brd-U) solution and further cultured at 37 ° C. for 4 hours.
  • E-MEM MEM Earl medium
  • Brd-U 5-bromo 2′-deoxyuridin
  • SW982 cells human synovial cell line; obtained from ATCC
  • FCS manufactured by SIGMA
  • DMEM medium manufactured by GIBCO
  • SW982 was seeded at 4 ⁇ 10 4 Zwell in a 96-well flat bottom plate without serum.
  • the drug was added at the same time as the seeding of cells and cultured at 200 ⁇ 1 / well.
  • 20 ⁇ l of alamar blue (R) (BIOSOURCE) was added to each well, further cultured for 6 hours, and the absorbance of each well was measured with a microplate reader. Absorbance was measured at two wavelengths, 570 nm and 600 nm.
  • CaMKII inhibitors Compound (I) and KN-93 inhibited human synovial cell SW982 proliferation in a dose-dependent manner.
  • Affected paws of mice with collagen arthritis were collected and 37 ° C in the presence of Dispase (joint brewing) and collagenase SI (Nitta Gelatin) in a-MEM medium (GIBCO) containing 10% pup serum. After treatment for 5-6 hours, the monodispersed cell suspension was recovered. This was washed by centrifugation and resuspension and subjected to experiments. Cells were seeded in a 96-well plate at a rate of 2 ⁇ 10 4 cells / well, added with a-MEM medium containing the test compound, and cultured for 9 days. After culture, staining was performed using a TRAP staining kit (Sigma), and the number of osteoclasts per well was counted under a microscope. TRAP staining was performed according to the instruction manual of the kit.
  • the adjuvant-induced arthritis model is a typical chronic inflammation model induced in rats and is widely used for pharmacological evaluation of anti-inflammatory agents and anti-rheumatic agents. Therefore, using this model, the effects of Compound (I) and Compound (II) were examined in a treatment test or onset prevention test.
  • the treatment study in order to examine the effect of drug administration on the suppression of edema, the difference in hindlimb volume before and after the administration period was calculated and the change in edema volume was examined.
  • the hindlimb volume was measured over time during the administration period to examine the effect of the drug over a long period of time.
  • hind limb volume or edema volume is used as an index for drug efficacy evaluation, but since edema volume is an increase from normal hind limb volume not sensitized with adjuvant, both indexes should be used almost synonymously. It is out.
  • a liquid paraffin suspension (lmg / 200 ⁇ 1) of Mycobacterium butyricum (adjuvant) was injected subcutaneously into the right hind footpad of SD or Lewis rats (both male and 6 weeks old) to induce arthritis.
  • a 0.5% methylcellulose suspension of Compound (I) or Compound (II) prepared to give a dose of 1 ml per 100 g body weight was administered once a day from the 17th day after adjuvant injection. Orally administered for days.
  • an indomethacin suspension prepared in the same manner was administered.
  • the volume of the left and right hind limbs was measured by the water displacement method immediately before administration and 5 hours after the last administration, and the difference between the value immediately before administration and the value 5 hours after the last administration was calculated as the change in edema volume.
  • the same day of administration of adjuvant was administered once a day for 21 consecutive days.
  • the volume of the left and right hind limbs was measured every other day by the water replacement method.
  • the anti-rheumatic drug D-pe-silamine suspension was similarly administered as a control.
  • FIG. 6 shows the change in the amount of edema in the left hind limb after oral administration once a day for 5 days.
  • Figure 7 shows the changes in the amount of edema in the left and right hind limbs when compound (II) (10-50 mg / kg) was orally administered once a day for 5 days.
  • FIG. 8 shows the volume of the left and right hind limbs when compound (I) (2.5-80 mg / kg) was orally administered for 21 days from the day of adjuvant injection.
  • FIG. 9 shows the amount of edema when Compound (II) (50 mg / kg) was orally administered for 21 days from the day of adjuvant injection.
  • Compound (II) 50 mg / kg
  • the results for the positive control indomethacin (0.5 mg / kg), D-pesilamine (50 mg / kg) and the control group are also shown in each figure.
  • the efficacy of compound (I) was evaluated using collagen arthritis mice, an animal model of rheumatoid arthritis.
  • Collagen arthritis was induced according to a conventional method. That is, under ether anesthesia, 0.1 ml of emulsion was injected into the ridge of a mouse (DBAZlJ, male, Charles River Japan) for the first immunization.
  • Emmarzion was prepared by mixing equal amounts of Ushi type II collagen solution (2mg / ml; collagen workshop) and Freund's complete adjuvant (Difco). Three weeks later, 0.1 ml of the same composition was injected into the ridge of the ridge and boosted to induce arthritis. The degree of arthritis was displayed as a score according to the following criteria.
  • Compound (I) and the positive control prednisolone are suspended in a 0.5% methylcellulose solution, 0.1 ml per 10 g body weight of mice was orally administered. Only 0.5% methylcellulose solution was orally administered to the control group. Administration was started at the same time as the first immunization, and once a day for 35 days.
  • mice in the control group developed arthritis, which was also severe.
  • mice administered with Compound (I) suppressed the onset in a dose-dependent manner, and the degree of arthritis was also slight.
  • mice with experimental allergic encephalomyelitis an animal model of multiple sclerosis
  • KN-93 was suspended in a 0.5% methylcellulose solution (0.1 mg / ml), and 0.1 ml was subcutaneously administered per 10 g of mouse body weight. In the control group, only 0.5% methylcellulose solution was administered subcutaneously. Administration began on the 7th day after sensitization and was carried out once a day for 24 days.
  • mice developed severe experimental allergic encephalomyelitis, and 7 out of 10 died of nerve paralysis during the study period. Meanwhile, KN-93 (lmg / kg) mice also developed the symptom that the death was much lighter than the control group.
  • the degree was expressed as a score (pathological score) according to the following criteria.
  • Compound (I) was suspended in a 0.5% methylcellulose solution, and 8 mg / ml (80 mg / kg administration group), 4 mg / ml (40 mg / kg administration group) and 2 mg / ml (20 mg / kg administration group) And 0.1 ml per 10 g body weight of mice was orally administered.
  • prednisolone group as a positive control, prednisolone was suspended in 0.5% methylcellulose solution to prepare a 0.3 mg / ml administration solution, and 0.1 ml was orally administered per 10 g body weight of a mouse. Only 0.5% methylcellulose solution was administered subcutaneously to the control group. Administration began on the day of sensitization and was performed once a day for 40 days. In the Normal group, neither PLP sensitization nor test substance administration was performed.
  • Compound (I) which is a CaMKII inhibitor, is a pathological condition of experimental allergic encephalomyelitis that is not accompanied by a strong suppression of weight gain during long-term administration seen in the group treated with prednisolone, a typical steroid. It has been shown to suppress severity in a dose-dependent manner.
  • Control group 9 9/9 4/9
  • Tissue sections of arthritis affected areas of CIA mice were prepared, and the expression of CaMKII protein in the inflamed area was examined by immunostaining.
  • CIA was triggered by conventional methods. That is, under ether anesthesia, 0.1 ml of emulsion was injected into the ridge of a mouse (DBA / 1J, male, Japanese Charles River 1) for initial immunization. Emulsion was prepared by mixing equal amounts of Ushi type II collagen solution (2 mg / ml; collagen workshop) and Freund's complete adjuvant (Difco). Three weeks later, 0.1 ml of the same composition was injected into the ridge of the ridge for additional immunization. After 4 weeks of rearing, the hind limbs of mice with arthritis were collected and fixed in 4% paraformaldehyde. A histopathological specimen was prepared from the fixed hind limb and used for immunostaining.
  • Immunostaining was performed using the Beclastine (R) ABC-PO (Rusagi IgG) kit (Vector), using rabbit anti-CaMKII polyclonal antibody (M-17 6; Santa Cruz Biotechnology) as a primary antibody at a 50-fold dilution, and a moist chamber. Ichiuchi- ⁇ reaction I let you. Others were performed according to the instruction manual of the kit.
  • EL-4 cells mouse mouse lymphocyte cell line
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • PMA final 125 ng / ml
  • A23187 final 1 ⁇ g / ml ml
  • total volume 500 ⁇ 1 After incubation for 15 or 30 minutes after stimulation, add 1 ml of ice cold Stop Solution (l X PBS ⁇ ImM Na VO, 5 mM EDTA) to stop the reaction.
  • TNE buffer 50 mM Tris—HC1, 1% NP—40, 20 mM EDTA, 100 ⁇ g / ml PMSF, 30 ⁇ 1 / ml Aprotinin ⁇ ImM Na VO, 5 mM NaF ⁇ 12 mM ⁇ -glycerolpho
  • L929 cells (mouse fibroblast cell line) were cultured in MEM Earl medium (E-MEM: GIBCO) containing 10% offspring serum and used for experiments. The cells were suspended in serum-free E-MEM and cultured for 72 hours. Incubate for 1 hour after adding E-MEM medium containing test compound. E-MEM medium containing binant human FGF basic (bFGF) was added and further cultured. Cells were lysed with RIPA buffer to obtain total cell lysate. After SDS-PAGE, the protein was converted to PVDF mem brane, and 7 cycliniHi bodies were used for InAkt antibody (both Santa Cruz) and western blotting was performed.
  • E-MEM MEM Earl medium
  • bFGF binant human FGF basic
  • Compound (I) and KN-93 suppressed the enhanced expression of cytalin D1, and also suppressed the phosphorylation of Akt.
  • THP human monocytic cell line
  • RPMI1640 medium containing 10% FCS (SI GMA)
  • FCS SIGMA
  • IFN- ⁇ Nacalai Tester
  • RPMI1640 medium containing 10% FCS (SIGMA) was added to the unstimulated group. Thereafter, the cells were collected over time, a cell lysate was prepared with RIPA Buffer, and the protein amount was determined using a protein amount measurement kit (Bio-Rad Dc Protein Assay: BIO RAD). SDS-PAGE was performed by adding 50 g of cell lysate to 8-16% gradient gel (Asahi Techno Glass).
  • Example 16 Action of siRNA needles in human synovial cells
  • siRNA specific to the CaMKII sequence was designed and prepared, and the effects of CaMKII sequence-specific siRNA were examined using SW982 cells, a human synovial cell line. did.
  • CaMKII sequence-specific siRNA Based on the nucleotide sequence information of the CaMKII y gene (GenBank Accession No ⁇ 0704 4), three specific siRNA sequences shown in Table 4 are set as CaMKII sequence-specific siRNA. SiRNA formed with this strand was purchased from Nippon Bioservice Co., Ltd. (three types of siRNA are hereinafter referred to as CaMKII ⁇ siRNA (A), (B) and (C)).
  • siRNA name Sequence SEQ ID NO Position
  • DHARMACON Scramble II Duplex
  • SW982 cells obtained from ATCC were cultured in FCS (SIGMA) -containing DMEM medium (GIBCO) and subjected to experiments. This cell was added to a 24 well plate with lxlO 5 cell / well, and after 24 hours, CaM KII y siRNA 3 ⁇ l (60 pmol) and Gene ilencer (t ⁇ ene Therapy systems, Inc) 10.5 ⁇ 1 was added to each well.
  • siRNA introduction efficiency was measured with a flow cytometer for Fluorescein Labeled Luciferase GL2 Duplex incorporated into the cells.
  • the intracellular CaMKII amount was recovered 3 days after the introduction of siRNA, and after preparing the cell lysate with RIPA Buffer, the protein amount was measured using a protein amount measurement kit (Bio-Rad Dc Protein Assay: BIO RAD).
  • SDS-PAGE was performed by adding 50 g to 8-16% gradient gel (Asahi Techno Glass). After transfer to PVDF membrane, react with blocking agent (ECL Blocking agent: Amersham) for 1 hour, and then dilute the primary antibody anti-CaMKII ⁇ antibody (Santa Cruz) 500 times with blocking agent. The reaction was performed at room temperature for 1 hour. After washing the membrane, a secondary antibody horseradishi peroxidase-labeled anti-goat IgG antibody (Amersham) diluted 2000 times with a blocking agent was reacted for 40 minutes. Thereafter, the membrane was washed, and the protein blotted on the membrane was detected using ECL Plus (Ame rsham).
  • ECL Blocking agent Amersham
  • Cell proliferation was measured using Alamar Blue® uptake as an index. That is, cells were cultured for 3 days after introduction of siRNA, replaced with DMEM medium without serum, and cultured for another 24 hours. Thereafter, Alamar Blue (R) was added to each well, and after 1 hour, the fluorescence intensity was measured with a fluorometer (excitation: 544 nm, wavelength: 590 nm).
  • FIG. 21 shows the results of examining the effects of the three types of siRNAs using the expression level of CaMKII ⁇ .
  • the expression of CaMKII ⁇ was suppressed by introducing siRNA of the force ( ⁇ ) sequence in which CaMKII ⁇ expression was observed.
  • suppression of proliferation was observed only in the cells into which (i) sequence siRNA was introduced (FIG. 24).
  • CaMKII inhibitor compound (I) or KN-93 almost completely suppresses cell growth of human synovial cell SW982 (Example 6), and CaMKII ⁇ SW982 introduced with CaMKII ⁇ siRNA (A), a siRNA that suppresses expression, suppresses cell proliferation (in this example), so that expression of CaMKII ⁇ is involved in SW982 cell proliferation. It became clear that was deeply involved. This means that by suppressing the expression of CaMKII y or inhibiting its activity, the abnormal growth of synovial cells is suppressed, thus improving the pathological condition of the joint in diseases such as rheumatoid arthritis (suppression of chronic inflammation, joint destruction). Suppression, progression suppression to joint deformation, etc.).
  • the adjuvant-induced arthritis model is a typical chronic inflammation model induced in rats and is widely used for pharmacological evaluation of anti-inflammatory agents and anti-rheumatic agents. Therefore, using this model, the CaMKII inhibitor 3-[(lS) -l- (2-fluorobiphenyl-4-yl) ethyl] -5- ⁇ [amino (morpholine-4-yl) We examined the combined effect of [methylene] amino ⁇ isoxazole (compound (I)) and DMARDs (Leflunomide and Salazosulfaviridine).
  • a liquid paraffin suspension (lmg / 200 ⁇ 1) of Mycobacterium butyricum (adjuvant) was injected subcutaneously into the right hind footpad of a Lewis rat (male, 6 weeks old) to induce arthritis.
  • Compound (I) (10 mg / kg) and DMARDs (leflunomide (5 mg / kg) or salazosulfaviridine (400 mg / kg)) prepared to give a dose of 0.5 ml per 100 g body weight kg)) 0.5% methylcellulose suspension was administered orally once or daily for 5 consecutive days.
  • the volume of the left hind limb was measured by the water displacement method immediately before administration and 5 hours after the last administration, and the difference was calculated to determine the change in edema volume.
  • FIGS. 25 and 26 changes in the amount of edema when compound (I) and leflunomide or salazosulfaviridine are administered together as representative examples of DMARDs are shown in FIGS. 25 and 26.
  • FIG. 25 and 26 changes in the results of the compound (I) single administration group, DMAR Ds single administration group, and control group are also shown in each figure.
  • the daily power to which adjuvant was injected was also determined by DMARDs (methotrexate (0.060 mg / kg or 0.045 mg / kg; 0.5% methylcellulose suspension)).
  • Administration was started and orally administered once a day for 21 consecutive days. From day 10 after sensitization, Compound (I) (10 mg / kg) was administered orally once or daily for 12 consecutive days. The volume of the left hind limb was measured every other day by the water displacement method. As a control, only 0.5% methylcellulose containing no test compound was administered in the same manner as described above.
  • Figure 1 shows the left hind limb volume when methotrexate (0.060mg / kg, 0.045mg / kg) is administered from the day of adjuvant injection as a representative example of DMARDs, and compound (I) (10mg / kg) is administered on the 10th day.
  • Figures 27 and 29 show the incidence of the left hind limb in Figures 28 and 30, respectively.
  • the results of the compound (I) single administration group, DMARDs single administration group, and control group are also shown in each figure.
  • Example 19 Combined effect of adjuvant on adjuvant-induced bursalitis In the same manner as in Example 17, the combined effect on rat adjuvant-induced arthritis was examined. (experimental method)
  • methylcellulose of methotrexate as a representative example of Compound (I) and DMARDs prepared to give a dose of 0.5 ml per 100 g of body weight from the day when arthritis was induced by the same method as Example 17 and adjuvant was injected Suspensions were administered orally once or daily for 17 consecutive days alone or in combination.
  • the volume of the left hind limb was measured by the water displacement method immediately before and after the last administration. The area under the curve of the plotted curve) was determined. It is also possible to measure joint destruction of the left hind limb (non-injected paw) and right hind limb (injected paw) with X-rays, and use this as an evaluation index to evaluate the combined effect.
  • Figure 38 shows the right hind limb joint destruction score for single and combined administration at each dose (compound (I) at 20,40 or 80 mg / kg per day, methotrexate at 0 • 06 mg / kg per day). Shown together.
  • the control group Fig. 39
  • the methotrexate single administration group (0.06 mg / kg; Fig. 40)
  • the compound (I) single administration group 40 mg / kg; Fig. 41
  • a soft X-ray photograph of the right hind limb of arthritic rats was obtained. An example is shown.
  • Figure 43 summarizes the left hind limb joint destruction scores for single and combined administration at each dose.
  • the control group Fig. 44
  • the methotrexate single administration group (0.06 mg / kg; Fig. 45)
  • the compound (I) single administration group 40 mg / kg; Fig. 46
  • Figure 47 soft x-rays of arthritic rat left hind limbs are shown with representative examples of individuals showing average scores in each group. It was.
  • the compound (I) single administration group showed a dose-dependent joint destruction inhibitory effect on the left and right hind limbs.
  • Compound (I) when administered in combination with methotrexate (0.06 mg / kg), remarkably enhanced the effect of methotrexate on joint destruction in the right and left hind limbs in a dose-dependent manner.
  • the compound (I) (80 mg / kg) + methotrexate (0.06 mg / kg) combined administration group completely suppressed the joint destruction of the left hind limb and showed a very high combined effect.
  • the combined use effect can be confirmed by conducting a combined administration test of Compound (I) and DMARDs other than methotrexate in the same manner as in the Examples described above.
  • EL-4 cells (a mouse T lymphocyte cell line) were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM: GIBCO) containing 10% pup serum and used for the experiment. Cells were seeded in a 96-well plate at a rate of 5 ⁇ 10 4 cells / well, DMEM medium containing the test compound and DMEM medium containing PMA and A23187 as stimulants were added and cultured for 3 days.
  • the test compound was compound (I) and methotrexate each single agent or in combination.
  • the compound (I) and methotrexate were added in a 10: 1 dilution ratio at the time of combination.
  • the final concentration of stimulant was adjusted so that PMA was 25 nM and A23 187 was 250 ng / mL. After incubation, the plate was centrifuged, and the supernatant was collected with a micropipette. The amount of IL-2 in the supernatant was quantified by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. The quantification method was performed according to the instruction manual of the kit (MOUSE IL-2 Immunoassay; R & D Systems).
  • Combination Index calculation method The Combination Index (CI) was calculated by the following method.
  • each D was determined using formula (F4).
  • compound (I) is orally administered once a day in addition to methotrexate to patients with rheumatoid arthritis who are ineffective or considered to be ineffective when treated with methotrexate.
  • the dose of methotrexate should be the same as the previous treatment or selected according to the patient's condition in the range of 6 mg-25 mg per week.
  • the dose of Compound (I) is placebo, 80 mg / day and 240 mg / day (approximately 100 cases in each group).
  • the duration of treatment is 48 weeks, but excludes those who have not met the effective criteria at week 24 (more than 20% improvement in any of the number of painful joints, dilated joints or erythema) Suppose the specified effective standard is reached).
  • VAS visual analog scale
  • 100 mm is an index evaluated by the evaluator by displaying the evaluation on a line from 0 to 100 mm, and expressed as an integer from 0 to 100 .
  • the length of the line segment may be other than 100 mm (for example, 200 mm).
  • Gscale is scored in the range from 0 to 100.
  • compound (I) is orally administered once a day in addition to methotrexate to patients with rheumatoid arthritis who are ineffective or considered to be ineffective when treated with methotrexate.
  • the dose of methotrexate should be the same as the previous treatment or selected according to the patient's condition in the range of 10 mg-25 mg per week.
  • the administration period is 48 weeks, and the first 24 weeks are placebo, 120 mg / day, 240 mg / day (approximately 100 patients in each group, total approximately 300 patients) administered in a double-blind manner. To do. For the next 24 weeks, 240 mg / day will be administered to all subjects in an open-label (open study).
  • compound (I) was compared with the placebo, 120 mg / day and 240 mg / day groups by comparing the proportion of patients who met the “Rheumatology Association criteria (ACR criteria): 20% improvement”. Efficacy of combined administration with methotrexate (I compound (I) can enhance the effect of methotrexate on the treatment of rheumatoid arthritis)
  • compound (I) is orally administered to patients with rheumatoid arthritis who have not been effective or considered to be ineffective in the history of treatment with methotrexate.
  • the dose of methotrexate should be the same as the previous treatment or selected according to the patient's condition in the range of 6 mg-25 mg per week.
  • the dose of Compound (I) is placebo, 80 mg / day and 240 mg / day (approximately 100 cases in each group).
  • the treatment period is 48 weeks, but excludes those who have not met the effective criteria at week 24 (an improvement of 20% or more was observed in either the number of pain joints, the number of dilated joints, or the red sediment value) Suppose the specified effective standard is reached).
  • the joint destruction inhibitory effect is evaluated by evaluating the progress of joint destruction of the hands and feet by X-ray images. By comparing this effect between the placebo, 80 mg / day and 240 mg / day groups, the efficacy of combined administration of compound (I) and methotrexate (compound (I) enhanced the effect of methotrexate on the treatment of rheumatoid arthritis. Can be evaluated.
  • compound (I) is orally administered to patients with rheumatoid arthritis who have not been effective or considered to be ineffective in the history of treatment with methotrexate.
  • the dose of methotrexate should be the same as the previous treatment or selected according to the patient's condition in the range of 10 mg-25 mg per week.
  • the administration period is 48 weeks, and the first 24 weeks are placebo, 120 mg / day, 240 mg / day (approximately 100 patients in each group, total approximately 300 patients) in a double-blind manner.
  • 240 mg / day will be administered to all subjects in an open-label (open study).
  • the effect of joint destruction suppression is evaluated by evaluating the degree of joint destruction of the hands and feet by X-ray images.
  • the efficacy of the combined use of compound (I) and methotrexate (the combined effect of methotrexate on rheumatoid arthritis) Can be evaluated.
  • the dose in rats was 5 mg / kg (orally administered once a day). Is known to correspond to a human dose of 14.2 to 18.8 mgZ (oral once daily). Therefore, 10-80 mg / kg, which is the daily dose of Compound (I) to rats in the above Examples, is considered to correspond to about 28 to about 300 mgZ of human daily dose.
  • an excellent concomitant drug for preventing and Z or treating an autoimmune disease can be provided. Further, according to the present invention, a candidate that is an active ingredient of the concomitant drug Screening methods useful for searching and obtaining quality can be provided.
  • FIG. 1 is a graph showing IL-2 production when mouse T lymphocyte cell line EL-4 cells were stimulated with Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and Calcium lonophore A23187. Results are expressed as mean and standard deviation of 6 uels for each group. The results of the compound (I) addition group (1-30 ⁇ ), the ⁇ -93 addition group (1-10 ⁇ ) and the control group are shown.
  • PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate
  • FIG. 2 is a graph showing IL-6 production when mouse macrophage cell line J774A.1 cells were stimulated with lipopolysaccharide (LPS). Results are expressed as the mean and standard deviation of 6 uels for each group. The results of the compound (I) addition group (1-30 ⁇ ), the ⁇ -93 addition group (1-3 ⁇ ), and the control group are shown.
  • FIG. 3 is a graph showing cell proliferation when mouse fibroblast cell line L929 cells are stimulated with Recombinant human FGF basic (bFGF).
  • Bromodexuridine (Brd-U) uptake was measured as an absorbance at a wavelength of 450 nm as an index of cell proliferation. The results are shown as an average of 6 ul and standard deviation for each group.
  • the ⁇ indicates the results of the compound (I) addition group (0.3-10 ⁇ ).
  • the country shows the results of the 93-93 addition group (1-30 ⁇ ).
  • ⁇ indicates the result of the unstimulated control group. ⁇ indicates the result of the stimulus control group.
  • FIG. 4 is a graph showing the proliferation of SW982 cells, which are cells derived from human synovium. Results for each group
  • FIG. 5 is a graph showing the number of osteoclasts formed when cells derived from the affected area of collagen arthritis mouse arthritis are cultured. Results are expressed as the mean and standard deviation of 6 uels for each group.
  • FIG. 6 A graph showing changes in the amount of edema on the left hind limb in adjuvant-induced arthritis in rats. Results are shown as the mean and standard deviation of 10 cases in each group. The results of the compound (I) administration group (2.5-80 mg / kg), the indomethacin administration group (0.5 mg / kg) and the control group are shown.
  • FIG. 7 A graph showing changes in the amount of edema in the left and right hind limbs in adjuvant-induced arthritis in rats.
  • Compound (II) administration group (10-50 mg / kg) (mean value and standard deviation of 7 patients in each group)
  • the results of the control group (average value and standard deviation of 8 cases) are shown.
  • FIG. 8 A graph showing changes in volume of left and right hindlimbs over time in adjuvant-induced arthritis in rats.
  • ⁇ indicates the result of the compound (I) (2.5 mg / kg) administration group.
  • the country shows the results of the compound (I) (5 mg / kg) administration group.
  • the mouth shows the results of the compound (I) (10 mg / kg) administration group.
  • the symbol ⁇ shows the result of the compound (I) (20 mg / kg) administration group.
  • ⁇ indicates the results of the compound (I) (40 mg / kg) administration group.
  • ⁇ shows the results of the compound (I) (80 mg / kg) administration group.
  • ⁇ shows the results of the indomethacin (0.5 mg / kg) administration group.
  • X represents the result of the test compound non-administered group (control group). + Indicates the result of the normal control group. Each group is shown as an average of 10 cases.
  • Statistical analysis was performed using AUC values.
  • the compound (I) (20 mg / kg) administration group was significant in the right hind limb volume (p 0.01) and left hind limb volume (p 0.05), compound (I) (40 mg / kg).
  • Administration group and compound (I) (80 mg / kg) administration group was significant in both right and left hindlimb volumes (P 0.01).
  • the indomethacin (0.5 mg / kg) administration group was significant (p ⁇ 0.01) in both right and left hindlimb volumes.
  • FIG. 9 is a graph showing the time course of left and right hind limb edema in adjuvant-induced arthritis in rats.
  • ⁇ indicates the result of the compound (II) (50 mg / kg) administration group.
  • Circles indicate the results of the test compound non-administered group (control group). The average value of 10-12 patients in each group is shown.
  • FIG. 10 is a graph showing the incidence of arthritis when compound (I) is tested using a collagen arthritis mouse which is an animal model of rheumatoid arthritis. Circles indicate the results of the compound (I) (5 mg / kg) administration group. ⁇ indicates the results of the compound (I) (10 mg / kg) administration group. The mouth shows the results of the compound (I) (20 mg / kg) administration group. The symbol ⁇ shows the results of the compound (I) (40 mg / kg) administration group. The country shows the results of the compound (I) (80 mg / kg) administration group. X represents the result of the prednisolone (3 mg / kg) administration group. ⁇ indicates the result of the test compound non-administered group (control group).
  • FIG. 11 is a graph showing an arthritis score when compound (I) is tested using a collagen arthritis mouse which is an animal model of rheumatoid arthritis. Circles indicate the results of the compound (I) (5 mg / kg) administration group.

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Abstract

自己免疫疾患を予防および／または治療するための併用薬を提供する。 より具体的には、CaMKII阻害剤および疾患修飾性抗リウマチ薬を含有する、自己免疫疾患の予防および／または治療のための併用薬；当該併用のための医薬組成物、商業パッケージ、およびキット等；CaMKII阻害剤を有効成分として含有する、疾患修飾性抗リウマチ薬の自己免疫疾患予防および／または治療効果の増強剤；併用に適したCaMKII阻害剤のスクリーニング方法等を提供する。

Description

明 細 書
自己免疫疾患を治療するための併用薬
技術分野
[oooi] 本発明は、自己免疫疾患を予防および Zまたは治療するための併用薬に関する。
背景技術
[0002] 生体は通常， 自己の構成成分 (自己抗原)に対しては免疫応答を示さず，免疫学的 恒常性が保たれている。このような恒常性は自然免疫寛容と呼ばれている。この寛容 状態が破れて， 自己抗原と反応する抗体やリンパ球が生じてくることがある。このよう な現象を自己免疫と呼び，それが引金となって起こってくる病気を自己免疫疾患と呼 んで 、る。自己免疫疾患には全身性自己免疫疾患と臓器特異的自己免疫疾患があ る。代表的なものとして前者は全身性エリテマトーデス、関節リウマチが挙げられ、後 者は多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性喀血性貧血、橋本氏甲状腺炎など が挙げられる。全身性の自己免疫疾患は，古くは結合組織の増生を特徴とする膠原 病という範疇に入れられていた。しかし近年，それらの成因が研究されてきて，少なく とも部分的には自己免疫が関与していると考えられるようになってきたが，なお不明 な点も多い。一方，臓器特異的自己免疫疾患では， 自己抗体の病因的役割がはつ きりしている場合が多い。これまでの研究から，臓器特異的自己免疫疾患は，抗原刺 激を受けた Tリンパ球によって引き起こされるものと推定されるに至っている。自己抗 体の産生機序については，さまざまな考えが出されている。第 1は特定の自己抗体の 産生にあず力る遺伝子の関与説である。第 2は，通常血中に微量にしか存在しない 抗原がなんらかの原因で多量に放出されること，な 、し抗原がなんらかの原因で修 飾されること〖こよるとするものである。第 3は，抗体産生にあずカゝるリンパ球側に異常 があり，寛容状態力も逸脱してしまうことによるとするものである。おそらく，これらが重 複して自己抗体が産生されてくると考えられて 、る。
[0003] 関節リウマチ (rheumatoid arthritis)は自己免疫疾患の一つで、多発性関節炎を主 徴とし、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患であり、寛解と増悪を 繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊と変形を来し、やがて 運動機能障害を呈し、ときには生命をも脅かす可能性もある疾患である。しかしなが ら現在の医学では関節リウマチを完全に治癒させることも予防することもできないとさ れている。従って、現時点での治療目標は早期に診断し、早期から積極的治療を開 始し、リウマチ性炎症を可及的速やかにかつ最大限に抑制して、非可逆的変化の出 現を防止、ないしはその進展を阻止することにより、患者の身体的、精神的、社会的 な生活の質 (QOL)の向上を図ることである。
[0004] 関節リウマチの治療に使用されている主な薬物は、非ステロイド系抗炎症薬 (以下、 「NSAIDs」と記載する）、疾患修飾性抗リウマチ薬（disease modifying anti-rheumatic drugs：以下、「DMARDs」と記載することもある）及び副腎皮質ステロイド薬である。
[0005] NSAIDsは関節リウマチ患者に最初に使用される薬物であり、鎮痛効果は速やかに 得られる力 抗炎症作用は 1〜2週間後に発現する。 NSAIDsには炎症の程度を軽減 させる作用はあっても、リウマチ性炎症の進行を阻止する作用、関節破壊を防止する 作用はない。また、 NSAIDsの副作用はその薬理作用（cyclooxygenase-1阻害活性） とは切り離せないものが多ぐ消化管障害等はしばしば治療の妨げともなる。
[0006] DMARDsは、関節リウマチの免疫異常を是正することによりリウマチ性炎症を鎮静 化させて、寛解導入を目的とする薬物の総称である。 DMARDsは一般に遅効性であ るが、効果が発現すると長期間に亘つて効果が持続する。 DMARDsには鎮痛効果が なぐ投与開始時は速効性の NSAIDsや副腎皮質ステロイド薬を併用する。一方、問 題点として、まれに骨髄抑制、腎炎、間質性肺炎などの重篤な副作用が出現すること や至適用量に個人差があることなどが知られている。さらに、従来の DMARDsは投与 を持続することにより耐性を示すことが多く（エスケープ現象）、その効果は 2〜3年で 減弱し、投与中止に至る例が少なくない。
[0007] 副腎皮質ステロイド薬はリウマチ性炎症を迅速かつ確実に抑制し、短期間ではある ものの、関節リウマチ患者の QOLを著しく改善するが、長期連用による効果の減弱、 離脱困難 (反跳現象、離脱症候群)、関節破壊の進行阻止不能、さらに感染症の誘 発、副腎機能不全、消化管障害、骨粗鬆症などの重篤な副作用の出現などの弊害 も多い。
[0008] 自己免疫疾患、特に関節リウマチの病態形成には様々な細胞が関与していること が知られている。代表的なものとしては、 Tリンパ球、マクロファージ細胞、破骨細胞（ 関節の破壊に関与して 、る）、線維芽細胞（関節強直に関与して 、る）などが挙げら れる。（G. S. Firestein et al., "RHEUMATOID ARTHRITIS"; OXFORD UNIVERSIT Y PRESS, 2000)
[0009] 難治性の関節リウマチに対しては、 DMARDsの併用療法 (例えば、レフルノミドとメソ トレキサートの併用療法)も検討されているが、それに対する難治性または薬剤抵抗 性の関節リウマチ患者も見られている。また、複数の非ステロイド系抗炎症薬、 DMAR Dsおよび副腎皮質ステロイド薬を患者の状態と共に変更していく治療する方法が従 来から検討されており、例えば、ピラミッド方式の他、 Sawtooth方式、 Step-down bridg e方式が試されている。
1.ピラミッド方式
最初に、非ステロイド抗炎症薬を使用し、効果がなくなった時点で、 DMARDsや副 腎皮質ステロイド薬を追加して 、く方式である。
2. ¾awtootn方式
最初から、 DMARDsを使用し、効果がなくなった (エスケープ現象）時点で、次の D MARDsへと変更して ヽく方式である。 DMARDsの多剤併用も平行して実施される。
3. Step-down bridge方式
最初から、副腎皮質ステロイド薬、 DMARDsを多剤併用し、炎症を抑制できた段階 で、強力な DMARDsから徐々に中止していく方式である。
しかし、これらの方式を用いても、自己免疫疾患、特に関節リウマチに対しては、十 分効果的な予防剤および Zまたは治療剤がなぐより優れた自己免疫疾患の予防剤 および Zまたは治療剤が望まれて 、る。
[0010] カルシウム/カルモジュリン依存性リン酸化酵素 II (CaMキナーゼ II：本明細書におい て「CaMKII」と略記する）は、ラット脳においてトリプトファンヒドロキシラーゼ (神経伝達 物質の一つであるセロトニン生合成の律速酵素）を活性化する新 U、タイプのカルモ ジュリン依存性リン酸化酵素として 1980年に発見された酵素である。本酵素は、細胞 外刺激により細胞内に増加した Ca2+とカルモジュリンの複合体により活性ィ匕されること が知られている。最近の研究の進展に伴い、本酵素が記憶などの高次神経機能の 制御や種々の細胞機能の調節に重要な役割を果たしていることが明らかにされてき ている。本酵素は、 1)脳に多量に存在する、 2)可溶型と顆粒結合型がある、 3)基質 特異性が広い、 4)臓器特異性ァイソフォームが存在する、 5)自己リン酸化によって 活性を制御する、などの際立った特長を備えている。特に当該酵素は、脳神経系に おいて、神経伝達物質の生合成、神経伝達物質の放出、記憶の基本原理と考えら れている長期増強作用、記憶、特に空間記憶に関与していることが示唆されている。 現在までに、 CaMKIIのァイソフォーム（サブタイプ）として、 CaMKII α、 j8、 β γお よび δが知られており、 γはさらに γ Α、 γ Βおよび が知られている。これらのうち 、 CaMKII a、 βおよび j8，のァイソフォームは、脳に局在化している。
しかし、 CaMKIIの発現もしくは活性を調節することにより、自己免疫疾患の予防お よび Zまたは治療が達成できるとの報告は全く知られていな力つた。まして、 CaMKII 阻害剤と DMARDsとを、自己免疫疾患の予防および Zまたは治療の目的で併用する ことに関しては、全く知られていな力つた。
[0011] 具体的な CaMKII阻害剤の例としては、例えば、以下のものが知られている。
• KN-93 N- (2- [N- [4-クロ口シンナミル]- N-メチルアミノメチル]フエ-ル)- N- (2-ヒドロ キシェチル) -4-メトキシベンゼンスルホンアミド （特開平 6— 293730、非特許文献 1 )
[0012] [化 1]
Figure imgf000005_0001
• 1- [1-ォキソ - 11- (5,6-ジヒドロ- 3-ィミノべンゾ [h]シノリン- 2(3H)-ィル)ゥンデシル]- 4- (2-ピリミジニル)-ピぺラジン (非特許文献 2)
[0013] [化 2]
Figure imgf000005_0002
'配列 Lys- Lys- X- Leu- Arg- Arg- Gin- Glu- Ala- Phe- Asp- Ala- Tyr (式中、 Xは Alaま たは Lysである。）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド (特許文献 1)
•配列 Lys- Lys- Ala- Leu- His- Arg- Gin- Glu- Ala- Va卜 Asp- Cys- Leu (KKALHRQE AVDCL)で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（特許文献 2、特表 2001-509808 ；抗不整脈用途が示唆されて！ヽる）
[0014] し力しながら、これら具体的な CaMKII阻害剤に関し、自己免疫疾患に対する作用 は知られていなかった。
[0015] 一方、下記式 laで表される 3-[(lS)-l-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-5- {[ ァミノ (モルフォリン- 4-ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾール (以下、「化合物 (I)」とも称 する）に関して、代表的な関節リウマチのモデル動物であるアジュバント関節炎ラット およびコラーゲン関節炎マウスに対して抗関節炎作用があることが報告されている（ 例えば、特許文献 3および非特許文献 3〜5参照)。
式 la:
[0016] [化 3]
Figure imgf000006_0001
[0017] また、下記式 2で表される 4-[1-(2-フルォロビフエニル -4-ィル)ェチル ]-2- (メチルァ ミノ)チアゾール (以下、「ィ匕合物 (Π)」とも称する）に関して、アジュバント関節炎ラット における抗関節炎作用、およびマウス III型アレルギー反応試験における浮腫抑制作 用が報告されている (例えば、特許文献 4参照)。
式 2 :
[0018] [化 4]
Figure imgf000006_0002
[0019] し力し、化合物（I)、化合物（Π)の CaMKIIに対する作用は、これまで全く知られて!/、 なかった。また、これら化合物と DMARDsとの併用効果は、これまで全く知られていな かった。
[0020] 特許文献 1 :特開平 11 152298号公報
特許文献 2 :国際公開第 98Z33491号パンフレット
特許文献 3：特許第 3237608号明細書
特許文献 4：特公平 4 - 80035号公報
非特許文献 l : Biochem Biophys Res Commun 1991; 181(3):p.968- 75
非特許文献 2 : J. Med. Chem., 2002, 45, p.563- 566
非特許文献 3 :田頭秋三、 「炎症'再生」、 Vol.21、 No.4、 p.472 (2001)
特干文献 4 : F. NishikaKU、 Annals of the Rheumatic Diseases 、 vol.60 supplemen t 1, p.l59 (2001)
非特許文献 5 : F. Nishikaku、 "Annals of the Rheumatic Diseases", vol.り 1 supplement 1, p.194 (2002)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0021] 本発明の目的は、自己免疫疾患を予防および Zまたは治療するための優れた併 用薬を提供することである。さらに本発明は、当該併用薬の有効成分となる候補物質 を探索し取得するために有用なスクリーニング方法を提供することをも目的とする。 課題を解決するための手段
[0022] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、以下 Iおよび IIの 驚くべき知見を得た。
I. CaMKII阻害剤が自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤として有用であるこ と
(1)化合物 (1)、化合物 (Π)およびこれらの誘導体力 CaMKII阻害作用を示すこと。 ( 実施例 2)
(2)自己免疫疾患、特に関節リウマチの病態形成に関与する種々の細胞 (Tリンパ球 、マクロファージ細胞、破骨細胞、線維芽細胞、滑膜細胞など）に対して、化合物 (I)
、 KN-93等の CaMKII阻害剤が抑制的に作用すること。（実施例 3〜7) (3) CaMKII阻害剤として公知である KN-93等が自己免疫疾患の動物モデルで有用 性を示すこと。（実施例 10)
(4)自己免疫疾患の動物モデルにおいて、罹患部では CaMKII産生細胞の比率が 亢進して
いること、すなわち CaMKIIが自己免疫疾患の病態形成に関与していること。（実施例 12)
(5) CaMKIIによるリン酸ィ匕によって変動する各種因子に対し、化合物（I)および KN-9 3が以下 (a)- (c)の作用を有すること。
(a)化合物（I)および KN- 93が I κ Β αの分解を抑制すること。（実施例 13)
(b)化合物（I)および KN-93が、 bFGFによるサイクリン D1の発現増強を抑制すること。 (実施例 14)
(c)化合物（I)および KN-93が、 Aktのリン酸ィ匕を抑制すること。（実施例 14)
(6)単球系細胞において、炎症性刺激により CaMKIIの発現が誘導されること、すな わち CaMKIIが自己免疫疾患の病態形成に関与していること。（実施例 15)
(7) CaMKII配列特異的 siRNAにより、滑膜細胞の細胞増殖が抑制されること (実施例 16)。すなわち、 CaMKII γの発現を抑制、または活性を阻害することにより、滑膜細 胞の異常増殖が抑制され、よって関節リウマチ等の疾患における関節の病態改善（ 慢性炎症の抑制、関節破壊の抑制、関節変形への進行抑制など）が達成されうるこ と。
(8)関節リウマチの動物モデルにおいて、化合物 (I)が優れた関節破壊抑制効果を 示すこと。（実施例 20および 21)
CaMKIIに関連して変動する因子は、 I κ B α、細胞質ホスホリパーゼ Α2 (cPLA2)、 細胞周期因子サイクリン Dl、細胞表面レセプター CD44、 EGFレセプター、 Statlなど 多数知られている（J. Biol. Chem. 276, 36008-36013; J. Biol. Chem. 276, 39653-39 660; Exp. Cell Res. 240, 218-227; Biochem. J. 357, 843—850; J. Biol. Chem. 274, 1 6168-16173; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5971—5976)。
本発明者らは、これらのうち I κ Β αおよびサイクリン D1に着目し、鋭意検討を行った 結果、前記（5)の知見を得た。これら知見より、化合物（I)などの CaMKII阻害剤は、 I κ αの分解を抑制し、 Τリンパ球の活性ィ匕を抑制すると考えられる。また、化合物 (I )などの CaMKII阻害剤によって、線維芽細胞において CaMKIIが阻害されることにより Aktのリン酸ィ匕が抑制され、それを介し下流のサイクリン D1の発現が抑制され細胞周 期の停止が起こる、すなわち細胞増殖が抑制されると考えられる。
[0024] 本発明者らは、上記の知見より、これら化合物（化合物（I)、 KN-93など）は CaMKII 阻害作用を介して自己免疫疾患の病態改善効果を発揮することを見出すとともに、 C aMKIIの発現もしくは活性を阻害する物質が、自己免疫疾患の予防剤および Zまた は治療剤として有効に利用できるとの確信を得た。
[0025] II. CaMKII阻害剤と DMARDsを併用することにより、自己免疫疾患の予防および Zま たは治療において優れた併用効果が達成されること
本発明者らは、 CaMKII阻害剤である化合物 (I)を、種々の疾患修飾性抗リウマチ 薬 (DMARDs)と併用したところ、自己免疫疾患に対して、それぞれ単独の効果から は予測することができない顕著に優れた予防効果および Zまたは治療効果を有する こと、即ち CaMKII阻害剤と DMARDsとの併用は自己免疫疾患の予防および Zまたは 治療において顕著な有用性を示すことを見出した (実施例 17〜23)。とりわけ、従来 、既知の抗リウマチ薬の単独療法では充分な効果が得られにくかった関節破壊の抑 制に対して、 CaMKII阻害剤と DMARDsとの併用療法が優れた関節破壊抑制効果を 示すことを見出した (実施例 20)。
本発明によれば、 CaMKII阻害剤または DMARDsのいずれか一方のみによる治療 では達成できな!、優れた自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果を達成するこ とが可能である。また、 CaMKII阻害剤または DMARDsのいずれか一方のみによる治 療では副作用が問題となる場合に、それぞれの投与量を低減して併用することにより 副作用を軽減した形で、優れた自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果を達成 することも可會である。
本発明は以上 Iおよび IIの知見に基づき完成したものである。
[0026] 即ち、本発明は以下の通りである。
[ l] CaMKII阻害剤および疾患修飾性抗リウマチ薬を含有する自己免疫疾患の予防 剤および Zまたは治療剤。 [2]疾患修飾性抗リウマチ薬と併用するための、 CaMKII阻害剤を含有する自己免疫 疾患の予防剤および Zまたは治療剤。
[3]疾患修飾性抗リウマチ薬の投与と同時に、分離して、または続けて投与される項 [2]記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[4]副作用によって、十分な自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果が得られる 量の疾患修飾性抗リウマチ薬が投与できない自己免疫疾患に罹患した哺乳動物に 対し、疾患修飾性抗リウマチ薬の投与と同時に、分離して、または続けて投与される ための CaMKII阻害剤を含有する自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤。
[5]副作用が肝障害、腎障害および胃腸障害力 選ばれる 1または複数である項 [4 ]記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[0027] [6] CaMKII阻害剤が、式 1で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容 される塩である項 [1]〜 [5]の ヽずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤。
式 1 :
[0028] [化 5]
Figure imgf000010_0001
[式中、 Dは水素原子、ハロゲン原子、水酸基、メルカプト基、ニトロ基、シァノ基、力 ルポキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換 されてもよい力ルバモイル基、置換されてもよいスルファモイル基、スルホ基、—R5、 -OR5, -CO R6、— SR7、 - (CO) SR7、 - (CS) OR7または— CS R7 (式中、 R5は
2 2
置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいァルケ-ル基、置換されてもよいァ ルキ-ル基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいシクロアルケ-ル 基、置換されてもよいァリール基、置換されてもよい複素環基またはァシル基を表す
。 R6は置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいァルケ-ル基、置換されてもよ V、アルキニル基、置換されてもょ 、ァリール基または置換されてもょ 、複素環基を表 す。 R7は置換されてもよいアルキル基または置換されてもよいァリール基を表す。）を 表す。 Aおよび Bは、一方が、式：
[化 6]
Figure imgf000011_0001
(Eは単結合またはアルキレン基を表す。
2つの破線は、一方が実線と共に 2重結合を意味し、他方が実線と共に単結合を意 味する。 R1は破線が実線と共に単結合を表す結合に結合する窒素原子に結合する R3および R4は、各々独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、メルカプ ト基、ニトロ基、シァノ基、カルボキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよい ヒドロキシルァミノ基、置換されてもよい力ルバモイル基、置換されてもよいスルファモ ィル基、スルホ基、 NH基の保護基、 R5、 -OR5, -CO R6、 一 SR7、 - (CO) SR7
2
、 - (CS) OR7または— CS R7 (式中、 R5、 R6および R7は前記と同義である。）を表す
2
。また、
Figure imgf000011_0002
R2、 R3および R4は、このうちの任意の 2つが結合して一緒になつて、窒素 原子と共に、置換されてもよい複素環を形成してもよい。また、式： NR 4は、式： -N = C (NH ) NR43R44で表される基を表してもよい。
2
R43および R44は、以下の（1)または（2)の通りである。
(1)独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、一（CH ) -COCH (nは 1〜3
2 n 3 の整数を表す。）、 - (CH ) -CO R32 (nは前記と同義である。 R32は炭素数 1〜3の
2 n 2
アルキル基を表す。）、 - (CH ) — CONR33R34 (nは前記と同義である。 R33および R3
2 n
4は独立して水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す。）、 (CH ) -OR35
2 m
(mは 2または 3を表す。 R35は水素原子、炭素数 1〜3のアルキル基または—（CH )
2 m
— OR36 (mは前記と同義である。 R36は水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を 表す。 )を表す。 ) , - (CH ) -NR37R38 (mは前記と同義である。 R37および R38は独
2 m
立して水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す力、または R37および R38は一 緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、ピぺリジン、ァゼパン、モルホリンまたは N— メチルビペラジン（これらにおいて、ピロリジン、ピぺリジン、ァゼパン、モルホリンおよ び N—メチルビペラジンは、 1または 2個のメチルで置換されてもよい。）を表す。）、フ ェ -ル、ピリジル、ピリミジ -ル、ピリダジ -ル、ピラジュル、テトラゾリル、ベンジル、ピ リジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジ -ルメチル、ピラジュルメチル、テトラゾリル メチル、水酸基、炭素数 1〜3のアルコキシ基または— NR39R4Q(R39および R4Qは、独 立して水素原子、炭素数 1〜3のアルキル基、フエニルまたはピリジルを表す。）を表 す。
(2)一緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基 (5〜7員飽和含窒 素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、ォキソ基力 なる群か ら任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよい。）を表す。 )
で表される基を表す。
Aおよび Bは、他方が、式： J G
(式中、 Gは置換されてもよいァリール基、もしくは置換されてもよい複素環基を表す 。 Jは一 C (R8R9)—または一 C ( = CR8R9)—を表す。 R8および R9は、各々独立して、 水素原子、置換されてもよい低級アルコキシ基、または置換されてもよい低級アルキ ル基を表す。また、 R8および R9が結合して一緒になつて、炭素原子と共に、置換され てもよい炭化水素環、置換されてもよい 1, 3 ジォキサン環または置換されてもよい 1, 3 ジォキソラン環を形成してもよい。）
で表される基を表す。 ]
[7] Eが単結合または低級アルキレン基である項 [6]記載の予防剤および Zまたは 治療剤。
[8] Dが水素原子、ニトロ基、シァノ基、カルボキシ基、置換されてもよいアミノ基、置 換されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換されてもよい力ルバモイル基、 R5または一 CO R6 (式中、 R5および R6は項 [6]における意義と同義である。）である項 [6]または
2
項 [7]の 、ずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[9]Dが水素原子、カルボキシ基、—R5または— CO R6 (式中、 R5および R6は項 [6]
2
における意義と同義である。 )である項 [8]記載の予防剤および Zまたは治療剤。
Figure imgf000012_0001
R3および R4が、各々独立して、水素原子、水酸基、置換されてもよいァ ミノ基、置換されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、置換さ れてもよいアルキル基、置換されてもよいァルケ-ル基、置換されてもよいアルキ- ル基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいシクロアルケ-ル基、置 換されてもよいァリール基、置換されてもよい複素環基またはァシル基を表す力、式： — NR3R4が、式： N = C (NH ) NR43R44(R43および R44は、項 [6]における意義と同
2
義である。）で表される基を表すか、または、
Figure imgf000013_0001
R3および R4のうちの任意の 2つ が結合して一緒になつて、窒素原子と共に、置換されてもよい複素環を形成する項 [ 6]〜 [9]の 、ずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤。
Figure imgf000013_0002
R3および R4が、各々独立して、水素原子、水酸基、置換されてもよいァ ミノ基、置換されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、置換さ れてもよいアルキル基、置換されてもよいァルケ-ル基、置換されてもよいアルキ- ル基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいァリール基、置換されて もよい複素環基またはァシル基を表す力、式： NR3R4力 式： N = C (NH ) NR43
2
R44 (R43および R44は、項 [6]における意義と同義である。）で表される基を表すか、ま たは、
Figure imgf000013_0003
R2、 R3および R4のうちの任意の 2つが結合して一緒になつて、窒素原子と 共に、置換されてもよい複素環を形成する項 [10]記載の予防剤および Zまたは治 療剤。
[ 12] Gが置換されてもよいフエ-ル、置換されてもよいナフチル、置換されてもよいフ リル、置換されてもよいチェ-ル、置換されてもよいインドリル、置換されてもよいイソ チアゾリル、置換されてもよいべンゾチェ-ル、置換されてもよいイソベンゾフラ -ル、 置換されてもよいピロリル、置換されてもよいべンゾフリル、置換されてもよいイミダゾリ ル、置換されてもよいピラゾリル、置換されてもよいイソキサゾリル、置換されてもよい イソチアゾリル、置換されてもよいチアゾリル、置換されてもよいォキサゾリル、置換さ れてもよいべンズイミダゾリル、置換されてもよいべンゾチアゾリル、置換されてもよい ベンズォキサゾリル、置換されてもよいピリジル、置換されてもよいピラジニル、置換さ れてもよいピリミジ -ル、置換されてもよいピリダジ -ル、置換されてもよいトリアジ-ル 、置換されてもよいキノリル、置換されてもよいイソキノリル、置換されてもよいキナゾリ -ル、置換されてもよいキノキサリニル、置換されてもよい 2, 3 ジヒドローべンゾ [1, 4]ジォキシュルまたは置換されてもょ 、カルバゾリルである項 [6]〜 [ 11 ]の!、ずれ か記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[0031] [13]CaMKII阻害剤力 式 A1または式 A2で表されるイソキサゾール誘導体またはそ の薬学上許容される塩である項 [6]記載の予防剤および Zまたは治療剤。
式 A1 :
[0032] [化 7]
Figure imgf000014_0001
[式中、 G1は、フエ-ル、ビフエ-ルー 4—ィル、 3—ベンゾィルフエ-ル、 4—ベンゾィ ルフエ-ル、 1H—インドール— 2—ィル、 1H—インドール— 3—ィル、 1—メチル 1 H—インドール一 2—ィル、 1—メチル 1H—インドール一 3—ィル、 2, 3 ジヒドロ —ベンゾ [1, 4]ジォキシン一 6—ィル、 1—ベンゾフラン一 5—ィル、 1—ベンゾフラン —6—ィル、キノリル、イソキノリル、フエニルピリジル、フエニルピリミジニル、フエニル ピリダジ -ルまたはフエ-ルビラジュル（これらにおいて、フエ-ル、ビフエ-ルー 4— ィル、 3 ベンゾィルフエ-ル、 4 ベンゾィルフエ-ル、 1H—インドール— 2—ィル、 1H—インドール— 3—ィル、 1—メチル—1H—インドール— 2—ィル、 1—メチル 1 H—インドールー 3 ィル、 2, 3 ジヒドローべンゾ [1, 4]ジォキシンー6 ィル、 1 —ベンゾフラン一 5—ィル、 1—ベンゾフラン一 6—ィル、キノリル、イソキノリル、フエ二 ルピリジル、フエニルピリミジニル、フエ二ルビリダジニルおよびフエ二ルピラジニルは 、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ァセチル、シァ入—CO
2 9 29は炭素数1〜
3のアルキル基を表す。）および— CONR3°R31 (R3°および R31は、独立して水素原子 または炭素数 1〜3のアルキル基を表す。 )力 なる群力 任意に選ばれる 1または 2 個の基で置換されてもよい。）を表す。
R23および R24は、独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、メトキシまたはエト キシを表す力、または一緒になつてメチレンを表す。
式： =C (NR25R26) NR27R28は、以下の（1)、（2)または（3)の通りである。 (1) 5ぉょひ 26は、以下の（a)または (b)の通りであり、 R27および R28は、以下の（c) または（d)の通りである。 (a)独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、一（CH ) -COCH (nは項 [
2 n 3
6]における意義と同義である。 ) , - (CH ) -CO R32 (nおよび R32は項 [6]における
2 n 2
意義と同義である。）、—（CH ) — CONR33R34(n、 R33および R34は項 [6]における意
2 n
義と同義である。 ) , - (CH ) — OR35 (mおよび R35は項 [6]における意義と同義であ
2 m
る。）、—（CH ) — NR37R38 (m、 R37および R38は項 [6]における意義と同義である。 )
2 m
、フエ-ル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジ -ル、ピラジ -ル、テトラゾリル、ベンジル 、ピリジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジ -ルメチル、ピラジュルメチル、テトラゾ リルメチル、水酸基、炭素数 1〜3のアルコキシ基または— NR39R4Q (R39および R4Qは 項 [6]における意義と同義である。）を表す。
(b)一緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基 (5〜7員飽和含 窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、ォキソ基からなる群 から任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよい。 )を表す。
(c)独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、一（CH ) — COCH (nは前記
2 n 3 と同義である。 ) , - (CH ) -CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。 ) , - (CH )
2 n 2 2
— CONR33R34(n、 R33および R34は前記と同義である。 ) , - (CH ) — OR35 (mおよ n 2 m
び R35は前記と同義である。 ) , - (CH ) -NR37R38 (m, R37および R38は前記と同義
2 m
である。 )、フエ-ル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジ -ル、ピラジュル、テトラゾリル、 ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジ -ルメチル、ピリダジ -ルメチル、ピラジュルメチル 、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数 1〜3のアルコキシ基または— NR39R4Q (R39およ び R4Qは前記と同義である。）を表す。
(d)—緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基 (ここで、 5〜7員 飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、ォキソ基か らなる群から任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよい。 )を表す。 (2)R26および R27は、一緒になつて 2つの窒素原子、炭素原子と共に、 5〜7員飽和 含窒素複素環基 (ここで、 5〜7員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水 酸基、アルコキシ基、ォキソ基力 なる群から任意に選ばれる 1または 2個の置換基 で置換されてもよい)を表す。
R25および R28は、独立して水素原子、炭素数 1〜3のアルキル基、ァセチルまたは - (CH ) — OR36 (mは前記と同義である。 R ま項 [6]における意義と同義である。 )
2 m
を表す。
(3)式： =C (NR25R26) NR27R28が、式： = C (NR41R42) N = C (NH ) NR43R44を表す。
2
R41および R42は、以下の（a1)または (b1)の通りであり、 R43および R44は、以下の（c1) または（d1)の通りである。
(a1)独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、—（CH ) -COCH (nは前
2 n 3 記と同義である。）、一（CH ) -CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。）、一（C
2 n 2
H ) — CONR33R34 (n、 R33および R34は前記と同義である。）、 - (CH ) — OR35 (m
2 n 2 m
および R35は前記と同義である。 ) , - (CH ) -NR37R38 (m, R37および R38は前記と
2 m
同義である。）、フエ-ル、ピリジル、ピリミジ -ル、ピリダジ -ル、ピラジュル、テトラゾリ ル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジ -ルメチル、ピリダジ -ルメチル、ピラジュルメ チル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数 1〜3のアルコキシ基または— NR39R4Q (R39 および R4Qは前記と同義である。）を表す。
(b1)一緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基 (5〜7員飽和含 窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、ォキソ基からなる群 から任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよい。 )を表す。
(c1)独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、—（CH ) — COCH (nは前
2 n 3 記と同義である。）、一（CH ) —CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。）、一（C
2 n 2
H ) — CONR33R34 (n、 R33および R34は前記と同義である。）、 - (CH ) — OR35 (m
2 n 2 m
および R35は前記と同義である。 ) , - (CH ) -NR37R38 (m, R37および R38は前記と
2 m
同義である。）、フエ-ル、ピリジル、ピリミジ -ル、ピリダジ -ル、ピラジュル、テトラゾリ ル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジ -ルメチル、ピリダジ -ルメチル、ピラジュルメ チル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数 1〜3のアルコキシ基または— NR39R4Q (R39 および R4Qは前記と同義である。）を表す。
(d1)一緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基 (5〜7員飽和含 窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、ォキソ基からなる群 から任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよい。）を表す。 ]
式 A2 : [化 8]
Figure imgf000017_0001
[式中、
Figure imgf000017_0002
R23および R24は前記と同義である。
式：— N (R45) C (NR46R47) =NR48は、以下の（I1)または（21)の通りである。
(l1)!^45は、炭素数 1〜3のアルキル基またはァセチルを表す。 R48は、水素原子、炭 素数 1〜 3のアルキル基またはァセチルを表す。
R46および R47は、以下の（a2)または (b2)の通りである。
(a2)独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、—（CH ) -COCH (nは前
2 n 3 記と同義である。）、一（CH ) -CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。）、一（C
2 n 2
H ) — CONR33R34 (n、 R33および R34は前記と同義である。）、 - (CH ) — OR35 (m
2 n 2 m
および R35は前記と同義である。 ) , - (CH ) -NR37R38 (m, R37および R38は前記と
2 m
同義である。）、フエ-ル、ピリジル、ピリミジ -ル、ピリダジ -ル、ピラジュル、テトラゾリ ル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジ -ルメチル、ピリダジ -ルメチル、ピラジュルメ チル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数 1〜3のアルコキシ基または— NR39R4Q (R39 および R4Qは前記と同義である。）を表す。
(b2)一緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基 (5〜7員飽和含 窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、ォキソ基からなる群 から任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよい。 )を表す。
(2 1^5および R46は、一緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基（ ここで、 5〜7員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ 基、ォキソ基力 なる群力 任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよ い。）を表す。
R47および R48は、独立して水素原子、炭素数 1〜3のアルキル基、ァセチルまたは - (CH ) — OR36 (mおよび R36は前記と同義である。）を表す。 ]
2 m
[ 14] CaMKII阻害剤力 式 A3で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許 容される塩である項 [6]記載の予防剤および Zまたは治療剤。 式 A3 :
[化 9]
Figure imgf000018_0001
[式中、 G2は、 2 フルォロ一ビフエ-ル一 4—ィル、 2，一フルォロ一ビフエ-ル一 4
—ィルまたは 3—ベンゾィルフエニルを表す。 R49は、メチルを表す。 R5Qは、水素原子
、メチル、メトキシまたはエトキシを表す。
式： =C (NR51R52) NR53R54は、（12)、（22)または（32)の通りである。
(12)R51および R52は、以下の（a3)、（b3)または（c3)の通りであり、 R53および R54は、以 下の（め、（ または (f3)の通りである。
( 独立して水素原子または炭素数 1〜4のアルキル基を表す。
(b3)—方が水素原子を表し、他方が一（CH ) — COCH (nは項 [6]における意義
2 n 3
と同義である。 ) , - (CH ) -CO R32 (nおよび R32は項 [6]における意義と同義であ
2 n 2
る。）、—（CH ) — CONR33R34 (n、 R33および R34は項 [6]における意義と同義である
2 n
。；)、―（CH ) -OR35 (mおよび R35は項 [6]における意義と同義である。 )または—（
2 m
CH ) — NR37R38 (m、 R37および R38は項 [6]における意義と同義である。 )を表す。
2 m
(c3)—緒になつて窒素原子と共に、ピロリジン、ァゼパン、モルホリン、チアゾリン、 ピぺリジン— 2—オン、ピぺリジン— 4—オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキ ル基で 4位が置換されてもょ 、ピペラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換 されてもよいピぺリジン、 4ーヒドロキシピペリジン、または 1もしくは 2個の炭素数 1〜3 のアルキル基で置換されてもょ 、ァミノ基で 4位が置換されたピペリジン (これらにお いて、ピロリジン、ァゼパン、モノレホリン、チアゾリン、ピぺリジン 2—オン、ピぺリジン 4 オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキル基で 4位が置換されてもよいピ ペラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換されてもよいピぺリジン、 4ーヒド 口キシピペリジン、および 1または 2個の炭素数 1〜3のアルキル基で置換されてもよ Vヽァミノ基で 4位が置換されたピペリジンは、 1または 2個のメチルで置換されてもょ ヽ 。 )を表す。 (d3)独立して水素原子または炭素数 1〜4のアルキル基を表す。
(e3)—方が水素原子を表し、他方が一（CH ) -COCH (nは前記と同義である。
2 n 3
) , - (CH ) -CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。）、 - (CH ) — CONR33R3
2 n 2 2 n
4 (n、 R33および R34は前記と同義である。 ) , - (CH ) — OR35 (mおよび R35は前記と
2 m
同義である。）または—（CH ) — NR37R38 (m、 R37および R38は前記と同義である。 )
2 m
を表す。
(f3)—緒になつて窒素原子と共に、ピロリジン、ァゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピ ペリジン— 2—オン、ピぺリジン— 4—オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキル 基で 4位が置換されてもょ 、ピペラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換さ れてもよぃピペリジン、 4ーヒドロキシピペリジン、または 1もしくは 2個の炭素数 1〜3の アルキル基で置換されてもょ 、ァミノ基で 4位が置換されたピペリジン (これらにぉ ヽ て、ピロリジン、ァゼパン、モノレホリン、チアゾリン、ピぺリジン 2—オン、ピぺリジン 4 オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキル基で 4位が置換されてもよいピぺ ラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換されてもよいピぺリジン、 4ーヒドロ キシピペリジン、および 1または 2個の炭素数 1〜3のアルキル基で置換されてもよい ァミノ基で 4位が置換されたピペリジンは、 1または 2個のメチルで置換されてもよい。 ) を表す。
(22)式： =C (NR51R52) NR53R54が、式：
[化 10]
Figure imgf000019_0001
(式中、 Rbbは、炭素数 1〜3のアルキル基、ァセチルまたは—（CH ) — ORbb(mは
2 m
前記と同義である。 R56は水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す。）を表す 。；)で表される基を表す。
(32)式： =C (NR51R52) NR53R54が、式： = C (NR57R58) N = C (NH ) NR59R6°を表す
2
R57および R58は、以下の（a4)、（b4)または (c4)の通りであり、 R59および R6°は、以下 の（d4)、（e4)または (f4)の通りである。
(a4)独立して水素原子または炭素数 1〜4のアルキル基を表す。
(b4)—方が水素原子を表し、他方が一（CH ) -COCH (nは前記と同義である。
2 n 3
) , - (CH ) -CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。）、 - (CH ) — CONR33R3
2 n 2 2 n
4 (n、 R33および R34は前記と同義である。 ) , - (CH ) — OR35 (mおよび R35は前記と
2 m
同義である。）または—（CH ) — NR37R38 (m、 R37および R38は前記と同義である。 )
2 m
を表す。
(c4)一緒になつて窒素原子と共に、ピロリジン、ァゼパン、モルホリン、チアゾリン、 ピぺリジン— 2—オン、ピぺリジン— 4—オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキ ル基で 4位が置換されてもょ 、ピペラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換 されてもよいピぺリジン、 4ーヒドロキシピペリジン、または 1もしくは 2個の炭素数 1〜3 のアルキル基で置換されてもょ 、ァミノ基で 4位が置換されたピペリジン (これらにお いて、ピロリジン、ァゼパン、モノレホリン、チアゾリン、ピぺリジン 2—オン、ピぺリジン 4 オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキル基で 4位が置換されてもよいピ ペラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換されてもよいピぺリジン、 4ーヒド 口キシピペリジン、および 1または 2個の炭素数 1〜3のアルキル基で置換されてもよ Vヽァミノ基で 4位が置換されたピペリジンは、 1または 2個のメチルで置換されてもょ ヽ 。 )を表す。
(め独立して水素原子または炭素数 1〜4のアルキル基を表す。
(e4)—方が水素原子を表し、他方が一（CH ) -COCH (nは前記と同義である。
2 n 3
) , - (CH ) -CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。）、 - (CH ) — CONR33R3
2 n 2 2 n
4 (n、 R33および R34は前記と同義である。 ) , - (CH ) — OR35 (mおよび R35は前記と
2 m
同義である。）または—（CH ) — NR37R38 (m、 R37および R38は前記と同義である。 )
2 m
を表す。
(f4)一緒になつて窒素原子と共に、ピロリジン、ァゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピ ペリジン— 2—オン、ピぺリジン— 4—オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキル 基で 4位が置換されてもょ 、ピペラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換さ れてもよぃピペリジン、 4ーヒドロキシピペリジン、または 1もしくは 2個の炭素数 1〜3の アルキル基で置換されてもょ 、ァミノ基で 4位が置換されたピペリジン (これらにぉ ヽ て、ピロリジン、ァゼパン、モノレホリン、チアゾリン、ピぺリジン 2—オン、ピぺリジン 4 オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキル基で 4位が置換されてもよいピぺ ラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換されてもよいピぺリジン、 4ーヒドロ キシピペリジン、および 1または 2個の炭素数 1〜3のアルキル基で置換されてもよい ァミノ基で 4位が置換されたピペリジンは、 1または 2個のメチルで置換されてもよい。 ) を表す。]
[ 15] CaMKII阻害剤力 式 A4で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許 容される塩である項 [6]記載の予防剤および Zまたは治療剤。
式 A4 :
[化 11]
Figure imgf000021_0001
[式中、 G2、 R49および R5Qは、項 [14]における意義と同義である。
式： =C (NR61R62) NR63R64は、以下の（13)、（23)または（33)の通りである。
(13)R63および R64は、共に水素原子を表す。
R61および R62は、以下の（a5)、（b5)または (c5)の通りである。
(a5)独立して水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す。
(b5)—方が水素原子を表し、他方が—（CH ) -CO R32 (nおよび R32は項 [6]にお
2 n 2
ける意義と同義である。 ) , - (CH ) — OR65 (mは 2または 3を表す。 R65は、水素原
2 m
子、炭素数 1〜3のアルキル基、 2 ヒドロキシェチルまたは 3 ヒドロキシプロピルを 表す。）または—（CH ) — NR66R67 (mは前記と同義である。 R66および R67は、独立し
2 m
て水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す力、または R66および R67は一緒 になって窒素原子と共に、ピロリジン、ピぺリジン、モルホリンまたは N—メチルビペラ ジン（これらにおいて、ピロリジン、ピぺリジン、モルホリンおよび N—メチルビペラジン は、 1または 2個のメチルで置換されてもよい。）を表す。）を表す。
(c5)—緒になつて窒素原子と共に、ピロリジン、ピぺリジン、モルホリンまたは N—メ チルピペラジン（これらにおいて、ピロリジン、ピぺリジン、モルホリンおよび N ピぺラジンは、 1または 2個のメチルで置換されてもよい。）を表す。
(23)式： =C (NR61R62) NR63R64が、式：
[0037] [化 12]
Figure imgf000022_0001
(R68は、炭素数 1〜3のアルキル基、 2 ヒドロキシェチルまたは 3 ヒドロキシプロピ ルを表す。）で表される基を表す。
(33)R61および R62は、一緒になつて窒素原子と共に、モルホリンを表し、 R63および R64 は、一緒になつて、アミノーモルホリン一 4—ィル一メチレンを表す。 ]
[ 16 ] G2が 2 フルォロ ビフエ-ル 4 ィルまたは 2， -フルォロ ビフエ-ル - 4 ーィルであり、 R5Qが水素原子またはメチルであり、 R63および R64が共に水素原子であ り、 R61および R62が、以下の（a6)または (b6)の通りである、項 [15]記載の予防剤およ び Zまたは治療剤：
(a6)独立して水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す；
(b6)—緒になつて窒素原子と共に、モルホリン (モルホリンは、 1または 2個のメチル で置換されてもよい。）を表す。
[0038] [17]CaMKII阻害剤力 3- [(IS)- 1- (2-フルォロビフエ-ル- 4-ィル)ェチル ]- 5- {[アミ ノ (モルフォリン- 4-ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾールまたはその薬学上許容される 塩である項 [1]〜 [5]の 、ずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[0039] [18]疾患修飾性抗リウマチ薬が、下記力も選ばれる 1または複数の薬剤である項 [1 ]〜 [ 17]の 、ずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤：
レフルノミド、メソトレキサート、 D—ぺ-シラミン、ブシラミン、サラゾスルフアビリジン 、ァクタリット、口ベンザリット、シクロフォスフアミド、クロラムブシル、ミゾリビン、ァザチ ォプリン、オーラノフィン、金チオマレイン酸ナトリウム、金チォ硫酸、金チォダルコ一 ス、シクロスポリン、ヒドロキシクロロキン、クロ口キン、タクロリムス、エタネノレセプト、イン フリキシマブ、アナキンラ、ケリキシマブ、ァダリムマブ、リツキシマブ、およびヒト型抗 I L- 6R抗体。
[19]疾患修飾性抗リウマチ薬カ^ソトレキサート、サラゾスルフアビリジンまたはレフ ルノミドである項 [ 18]記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[20]自己免疫疾患が、下記力 選ばれるいずれかの疾患である項 [1]〜 [19]のい ずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤：
関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強 皮症、混合結合組織病、橋本病、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、 Goo d-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性 類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、 I型糖尿病、アジソン病、萎縮 性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、、多発性硬化症、潰 瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性血液性疾患、自 己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症、発作性血色素尿症、突発性血小板 減少性紫斑病、間質性肺腺維症およびシエーダレン症候群。
[21]自己免疫疾患が関節リウマチである項 [20]記載の予防剤および Zまたは治療 剤。
[0040] [22]CaMKII阻害剤を有効成分として含有する、疾患修飾性抗リウマチ薬による自己 免疫疾患予防および Zまたは治療効果の増強剤。
[0041] [23]CaMKII阻害剤力 下記の工程 (a)、（b)および (c)を含むスクリーニング方法により 選択された物質である項 [22]記載の増強剤：
(a)被験物質と CaMKII酵素および基質とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた CaMKII酵素による基質のリン酸ィ匕レベルを測定し、該リン 酸ィ匕レベルを、被験物質を接触させな！/、対照酵素の上記リン酸ィ匕レベルと比較する 工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づいて、 CaMKIIの活性を阻害する被験物質を選択する 工程。
[24] CaMKII阻害剤力 10 μ Μの濃度における CaMKIIの阻害率力 ¾0%以上である物 質である項 [23]記載の増強剤。
[0042] [25] CaMKII阻害剤力 3- [(IS)- 1- (2-フルォロビフエ-ル- 4-ィル)ェチル ]- 5- {[アミ ノ (モルフォリン- 4-ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾールまたはその薬学上許容される 塩である、項 [22]記載の増強剤。
[26]疾患修飾性抗リウマチ薬カ^ソトレキサート、サラゾスルフアビリジンまたはレフ ルノミドである項 [22]〜 [25]の 、ずれか記載の増強剤。
[27]自己免疫疾患が関節リウマチである項 [22]〜 [26]のいずれか記載の増強剤
[28]第 2医薬糸且成物と共に用いて自己免疫疾患に罹患した哺乳動物において自己 免疫疾患予防および Zまたは治療効果を達成するための第 1医薬組成物であって、 該効果は該第 1及び第 2医薬組成物を別々に投与することによって達成される自己 免疫疾患予防および Zまたは治療効果の合計を上回り、該第 2医薬組成物は疾患 修飾性抗リウマチ薬を含み、該第 1医薬組成物は CaMKII阻害剤を含む組成物。
[29]第 2医薬糸且成物と共に用いて自己免疫疾患に罹患した哺乳動物において自己 免疫疾患予防および Zまたは治療効果を達成するための第 1医薬組成物であって、 該効果は該第 1及び第 2医薬組成物を別々に投与することによって達成される自己 免疫疾患予防および Zまたは治療効果を上回り、該第 2医薬組成物は疾患修飾性 抗リウマチ薬を含み、該第 1医薬組成物は CaMKII阻害剤を含む組成物。
[30] CaMKII阻害剤力 3- [(IS)- 1- (2-フルォロビフエ-ル- 4-ィル)ェチル ]- 5- {[アミ ノ (モルフォリン- 4-ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾールまたはその薬学上許容される 塩である、項 [28]または [29]の!、ずれか記載の組成物。
[31]疾患修飾性抗リウマチ薬カ^ソトレキサート、サラゾスルフアビリジンまたはレフ ルノミドである項 [28]〜 [30]の 、ずれか記載の組成物。
[32]自己免疫疾患が関節リウマチである項 [28]〜 [31]のいずれか記載の組成物 [33]以下の（1)および（2)を含む商業パッケージ：
(1) CaMKII阻害剤を含有する医薬組成物；
(2)当該医薬組成物を疾患修飾性抗リウマチ薬と併用して自己免疫疾患予防および
Zまたは治療用途に使用することができるまたは使用すべきであることを記載した、 該医薬組成物に関する記載物。 [34]以下の（ 1)および (2)を含む商業パッケージ：
(1) CaMKII阻害剤を含有する医薬組成物；
(2)当該医薬組成物を、疾患修飾性抗リウマチ薬による自己免疫疾患予防および Z または治療効果を増強する用途に使用することができるまたは使用すべきであること を記載した、該医薬組成物に関する記載物。
[35] CaMKII阻害剤が、 3-[(lS)-l-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-5- { [アミ ノ (モルフォリン- 4-ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾールまたはその薬学上許容される 塩である、項 [33]または [34]記載の商業パッケージ。
[36]疾患修飾性抗リウマチ薬カ^ソトレキサート、サラゾスルフアビリジンまたはレフ ルノミドである項 [33]〜 [35]の 、ずれか記載の商業パッケージ。
[37]自己免疫疾患が関節リウマチである項 [33]〜 [36]のいずれか記載の商業パ ッケーン。
[38]CaMKII阻害剤を含む第 1の組成物、および疾患修飾性抗リウマチ薬を含む第 2の組成物をパッケージ内に含有する、自己免疫疾患予防および Zまたは治療用の やット。
[39]自己免疫疾患の予防および Zまたは治療用医薬組成物を製造するための、 Ca ΜΚΠ阻害剤および疾患修飾性抗リウマチ薬の使用。
[40]疾患修飾性抗リウマチ薬と併用することを特徴とする自己免疫疾患の予防剤お よび/または治療剤の製造のための CaMKII阻害剤の使用。
[41]疾患修飾性抗リウマチ薬による自己免疫疾患の予防および Zまたは治療効果 増強用医薬組成物を製造するための、 CaMKII阻害剤の使用。
[42]CaMKH阻害剤を疾患修飾性抗リウマチ薬と併用して投与することを特徴とする 自己免疫疾患の予防および Zまたは治療方法。
[43] CaMKII阻害剤を投与することを含む、疾患修飾性抗リウマチ薬による自己免疫 疾患予防および Zまたは治療効果の増強方法。
[44]疾患修飾性抗リウマチ薬によって十分な予防および Zまたは治療効果が得ら れない自己免疫疾患に罹患した哺乳動物に対して、疾患修飾性抗リウマチ薬の自 己免疫疾患予防および Zまたは治療効果の増強に有効な量の CaMKII阻害剤を投 与することを含む自己免疫疾患の予防および Zまたは治療方法。
[0045] また、本発明の態様として、以下のものも挙げることができる。
[45] 下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む、疾患修飾性抗リウマチ薬による自己免疫 疾患予防および Zまたは治療効果増強剤のスクリーニング方法：
(a)被験物質と CaMKII酵素および基質とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた CaMKII酵素による基質のリン酸ィ匕レベルを測定し、該リン 酸ィ匕レベルを、被験物質を接触させな！/、対照酵素の上記リン酸ィ匕レベルと比較する 工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づいて、 CaMKIIの活性を阻害する被験物質を選択する 工程。
[46] 下記の工程 (a)、（b)および (c)を含むことを特徴とする、疾患修飾性抗リウマチ 薬と併用される自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤のスクリーニング方法：
(a)被験物質と CaMKII酵素および基質とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた CaMKII酵素による基質のリン酸ィ匕レベルを測定し、該リン 酸ィ匕レベルを、被験物質を接触させな！/、対照酵素の上記リン酸ィ匕レベルと比較する 工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づいて、 CaMKIIの活性を阻害する被験物質を選択する 工程。
[0046] また、本発明の態様として、以下のものも挙げることができる。
[47]CaMKII阻害剤と併用するための、疾患修飾性抗リウマチ薬を含有する自己免 疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤。
[48]副作用によって、十分な自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果が得られ る量の CaMKII阻害剤が投与できない自己免疫疾患に罹患した哺乳動物に対し、 Ca ΜΚΠ阻害剤の投与と同時に、分離して、または続けて投与されるための疾患修飾性 抗リウマチ薬を含有する自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤。
[49]副作用が肝障害、腎障害および胃腸障害力 選ばれる 1または複数である項 [ 48]記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[50]疾患修飾性抗リウマチ薬を有効成分として含有する、 CaMKII阻害剤による自己 免疫疾患予防および Zまたは治療効果の増強剤。
[51]第 2医薬糸且成物と共に用いて自己免疫疾患に罹患した哺乳動物において自己 免疫疾患予防および Zまたは治療効果を達成するための第 1医薬組成物であって、 該効果は該第 1及び第 2医薬組成物を別々に投与することによって達成される自己 免疫疾患予防および Zまたは治療効果の合計を上回り、該第 2医薬組成物は CaMK Π阻害剤を含み、該第 1医薬組成物は疾患修飾性抗リウマチ薬を含む組成物。
[52]第 2医薬糸且成物と共に用いて自己免疫疾患に罹患した哺乳動物において自己 免疫疾患予防および Zまたは治療効果を達成するための第 1医薬組成物であって、 該効果は該第 1及び第 2医薬組成物を別々に投与することによって達成される自己 免疫疾患予防および Zまたは治療効果を上回り、該第 2医薬組成物は CaMKII阻害 剤を含み、該第 1医薬組成物は疾患修飾性抗リウマチ薬を含む組成物。
[53]疾患修飾性抗リウマチ薬を含有する医薬組成物、および当該医薬組成物を Ca ΜΚΠ阻害剤と併用して自己免疫疾患予防および Zまたは治療用途に使用すること ができるまたは使用すべきであることを記載した該医薬組成物に関する記載物を含 む、商業パッケージ。
[54]疾患修飾性抗リウマチ薬を含有する医薬組成物、および当該医薬組成物を Ca ΜΚΠ阻害剤の自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果増強の用途に使用するこ とができるまたは使用すべきであることを記載した該医薬組成物に関する記載物を含 む、商業パッケージ。
[55]CaMKII阻害剤と併用することを特徴とする自己免疫疾患の予防剤および Zま たは治療剤の製造のための疾患修飾性抗リウマチ薬の使用。
[56] CaMKII阻害剤による自己免疫疾患の予防および Zまたは治療効果増強用医 薬組成物を製造するための、疾患修飾性抗リウマチ薬の使用。
[57]疾患修飾性抗リウマチ薬を投与することを含む、 CaMKII阻害剤による自己免疫 疾患予防および Zまたは治療効果の増強方法。
[58] CaMKII阻害剤によって十分な予防および Zまたは治療効果が得られない自己 免疫疾患に罹患した哺乳動物に対して、 CaMKII阻害剤の自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果の増強に有効な量の疾患修飾性抗リウマチ薬を投与することを含 む自己免疫疾患の予防および Zまたは治療方法。
[59]CaMKII阻害剤が項 [6]記載の式 1で表されるイソキサゾール誘導体またはその 薬学上許容される塩である、項 [22]〜 [58]の 、ずれか記載の予防剤および Zまた は治療剤、増強剤、組成物、商業パッケージ、キット、使用、または方法。
[60]CaMKII阻害剤が 3- [(IS)- 1- (2-フルォロビフエ-ル- 4-ィル)ェチル ]- 5- { [アミノ（ モルフォリン- 4-ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾールまたはその薬学上許容される塩 である、項 [22]〜 [59]のいずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤、増強剤、 組成物、商業パッケージ、キット、使用、または方法。
[61 ] 3- [(1S)-1- (2-フルォロビフエ-ル- 4-ィル)ェチル ]-5- { [アミノ (モルフォリン- 4-ィ ル)メチレン]アミノ}イソキサゾールまたはその薬学上許容される塩の投与量力 3-[(1 S)-l-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-5- { [アミノ (モルフォリン- 4-ィル)メチレ ン]アミノ}イソキサゾールのフリー体に換算して 1日当たり約 40〜約 240mg/人であ る項 [60]記載の予防剤および Zまたは治療剤、増強剤、組成物、商業パッケージ、 キット、使用、または方法。
[62]3-[(lS)-l-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-5- { [アミノ (モルフォリン- 4-ィ ル)メチレン]アミノ}イソキサゾールまたはその薬学上許容される塩の投与量力 3-[(1 S)-l-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-5- { [アミノ (モルフォリン- 4-ィル)メチレ ン]アミノ}イソキサゾールのフリー体に換算して 1日当たり約 140〜約 240mg/人で ある項 [60]記載の予防剤および Zまたは治療剤、増強剤、組成物、商業パッケージ 、キット、使用、または方法。
[63]疾患修飾性抗リウマチ薬が、下記力も選ばれる 1または複数の薬剤である項 [2
2]〜 [62]のいずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤、増強剤、組成物、商業 ノ ッケージ、キット、使用、または方法：
レフルノミド、メソトレキサート、 D—ぺ-シラミン、ブシラミン、サラゾスルフアビリジン 、ァクタリット、口ベンザリット、シクロフォスフアミド、クロラムブシル、ミゾリビン、ァザチ ォプリン、オーラノフィン、金チオマレイン酸ナトリウム、金チォ硫酸、金チォダルコ一 ス、シクロスポリン、ヒドロキシクロロキン、クロ口キン、タクロリムス、エタネノレセプト、イン フリキシマブ、アナキンラ、ケリキシマブ、ァダリムマブ、リツキシマブ、およびヒト型抗 I L- 6R抗体。
[64]疾患修飾性抗リウマチ薬カ^ソトレキサート、サラゾスルフアビリジンまたはレフ ルノミドである、項 [63]記載の予防剤および Zまたは治療剤、増強剤、組成物、商業 ノ ッケージ、キット、使用、または方法。
[65]メソトレキサートの投与量が 1週間当たり約 5〜約 30mgZ人である項 [64]記載 の予防剤および/または治療剤；増強剤；医薬組成物；組成物；商業パッケージ；キ ット;使用；または方法。
[66]サラゾスルファピリジンの投与量が 1日当たり約 0. 5〜約 4gZ人である項 [64] 記載の予防剤および/または治療剤；増強剤；医薬組成物；組成物；商業パッケージ ；キット;使用；または方法。
[67]レフルノミドの投与量が 1日当たり約 5〜約 30mgZ人である項 [64]記載の予 防剤および Zまたは治療剤；増強剤；医薬組成物；組成物；商業パッケージ；キット； 使用；または方法。
[68]自己免疫疾患が、下記力 選ばれるいずれかの疾患である項 [22]〜 [67]の いずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤、増強剤、組成物、商業パッケージ、 キット、使用、または方法：
関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強 皮症、混合結合組織病、橋本病、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、 Goo d-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性 類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、 I型糖尿病、アジソン病、萎縮 性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、多発性硬化症、潰瘍 性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性血液性疾患、自己 免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症、発作性血色素尿症、突発性血小板減 少性紫斑病、間質性肺腺維症およびシヱーダレン症候群。
[69]自己免疫疾患が関節リウマチである、項 [68]記載の予防剤および Zまたは治 療剤、増強剤、組成物、商業パッケージ、キット、使用、または方法。
さらに、本発明の態様として、以下のものも挙げることができる。
[70] CaMKII阻害剤と疾患修飾性抗リウマチ薬とを組み合わせてなる自己免疫疾患 の予防剤および Zまたは治療剤。
[71]CaMKII阻害剤と疾患修飾性抗リウマチ薬とを組み合わせてなる医薬。
また、前記のように、本発明の CaMKII阻害剤は、疾患修飾性抗リウマチ薬 (DMA RDs)との併用療法により優れた関節破壊抑制効果 (特に、自己免疫疾患に罹患した 哺乳動物における関節破壊抑制効果)を示すことから、本発明の態様として、以下の ちのち挙げることがでさる。
[72]CaMKII阻害剤および疾患修飾性抗リウマチ薬を含有する関節破壊抑制剤。
[73]疾患修飾性抗リウマチ薬と併用するための、 CaMKII阻害剤を含有する関節破 壊抑制剤。
[74]疾患修飾性抗リウマチ薬の投与と同時に、分離して、または続けて投与される 項 [73]記載の関節破壊抑制剤。
[75]CaMKII阻害剤を有効成分として含有する、疾患修飾性抗リウマチ薬による関節 破壊効果の増強剤。
[76]CaMKII阻害剤を含む第 1の組成物、および疾患修飾性抗リウマチ薬を含む第 2の組成物をパッケージ内に含有する、関節破壊抑制用途のキット。
[77]関節破壊抑制用医薬組成物を製造するための、 CaMKII阻害剤および疾患修 飾性抗リウマチ薬の使用。
[78]疾患修飾性抗リウマチ薬と併用することを特徴とする関節破壊抑制剤の製造の ための CaMKII阻害剤の使用。
[79]疾患修飾性抗リウマチ薬による関節破壊抑制効果増強用医薬組成物を製造す るための、 CaMKII阻害剤の使用。
[80]CaMKn阻害剤を疾患修飾性抗リウマチ薬と併用して投与することを特徴とする 関節破壊抑制方法。
[81]CaMKII阻害剤を投与することを含む、疾患修飾性抗リウマチ薬による関節破壊 抑制効果の増強方法。
[82]疾患修飾性抗リウマチ薬によって十分な予防および Zまたは治療効果が得ら れない自己免疫疾患に罹患した哺乳動物に対して、疾患修飾性抗リウマチ薬の関 節破壊抑制効果の増強に有効な量の CaMKII阻害剤を投与することを含む関節破壊 抑制方法。
さらに、前記項 [1]〜[71]において、「自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治 療剤」を「関節破壊抑制剤」に、「自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果」を「関 節破壊抑制効果」に、「自己免疫疾患予防および Zまたは治療用途」を「関節破壊抑 制用途」に、「自己免疫疾患予防および Zまたは治療用」を「関節破壊抑制用」に、「 自己免疫疾患予防および Zまたは治療方法」を「関節破壊抑制方法」に、それぞれ 書き換えた態様も、本発明の態様に含まれる。
また、前記の記載、および実施例 1— 16で示されるように、本発明の CaMKII阻害剤 は、単独投与においても自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤として有用で ある。従って、本発明の態様として、以下のものも挙げることができる。
[B1] 下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治 療剤のスクリーニング方法：
(a)被験物質と CaMKII酵素および基質とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた CaMKII酵素による基質のリン酸ィ匕レベルを測定し、該リン 酸ィ匕レベルを、被験物質を接触させな！/、対照酵素の上記リン酸ィ匕レベルと比較する 工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づいて、 CaMKIIの活性を阻害する被験物質を選択する 工程。
[B2] 自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤が、免疫の異常亢進改善剤で ある [B 1 ]記載のスクリーニング方法。
[B3] 自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤が、関節リウマチ患者におけ る慢性炎症の抑制剤、関節破壊の抑制剤、関節変形への進行抑制剤、または身体 機能の改善剤である [B 1 ]記載のスクリ一ユング方法。
[B4] 10 μ Μの濃度における CaMKIIの阻害率が 30%以上である物質を選択するェ 程を含む [B1]〜 [B3]の 、ずれか記載のスクリーニング方法。
[B5] 10 μ Μの濃度における CaMKIIの阻害率が 60%以上である物質を選択するェ 程を含む [B1]〜 [B3]の 、ずれか記載のスクリーニング方法。
[B6] [B1]〜 [B5]の 、ずれか記載のスクリーニング方法を用いて選択される物質 を有効成分として含む自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤。
[0051] [B7] CaMKII阻害作用を有する物質を有効成分として含む自己免疫疾患の予防 剤および Zまたは治療剤。
[B8] CaMKII阻害作用を有する物質力 10 Mの濃度における CaMKIIの阻害率が 30%以上である物質である [B7]記載の自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療 剤。
[B9] CaMKII阻害作用を有する物質力 10 Mの濃度における CaMKIIの阻害率が 60%以上である物質である [B7]記載の自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療 剤。
[B10] 関節リウマチの予防剤および Zまたは治療剤である [B6]〜 [B9]の 、ずれ か記載の自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤。
[B11] 関節リウマチ患者における慢性炎症の抑制、関節破壊の抑制、関節変形へ の進行抑制、または身体機能の改善のための [B6]〜[B9]のいずれか記載の自己 免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤。
[0052] [B12] 項 [6]記載の式 1で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容さ れる塩を有効成分とする CaMKII阻害剤。
[0053] [B13] Eが単結合または低級アルキレン基である [B12]記載の CaMKII阻害剤。
[B14] Dが水素原子、ニトロ基、シァノ基、カルボキシ基、置換されてもよいアミノ基 、置換されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換されてもよい力ルバモイル基、 R5また は— CO R6 (式中、 R5および R6は [B12]における意義と同義である。）である [B12]
2
または [B13]の!、ずれか記載の CaMKII阻害剤。
[B15] Dが水素原子、カルボキシ基、—R5または— CO R6 (式中、 R5および R6は [
2
B12]における意義と同義である。）である [B14]記載の CaMKII阻害剤。
[0054] [B16] Ri、R2、R3および R4力 各々独立して、水素原子、水酸基、置換されてもよ ぃァミノ基、置換されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、 置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいァルケ-ル基、置換されてもよいァ ルキ-ル基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいシクロアルケ-ル 基、置換されてもよいァリール基、置換されてもよい複素環基またはァシル基を表す 力 式： NR3R4力 式： N = C (NH ) NR43R44 (R43および R44は、 [B12]における
2
意義と同義である。）で表される基を表すか、または、
Figure imgf000033_0001
R3および R4のうちの任 意の 2つが結合して一緒になつて、窒素原子と共に、置換されてもよい複素環を形成 する [B12]〜 [B15]の!、ずれか記載の CaMKII阻害剤。
[B17]
Figure imgf000033_0002
R3および R4が、各々独立して、水素原子、水酸基、置換されてもよ ぃァミノ基、置換されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、 置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいァルケ-ル基、置換されてもよいァ ルキニル基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいァリール基、置換 されてもよい複素環基またはァシル基を表すか、式： NR 4力 式： N = C (NH
2
) NR43R44(R43および R44は、 [B12]における意義と同義である。）で表される基を表す 力
Figure imgf000033_0003
R3および R4のうちの任意の 2つが結合して一緒になつて、窒素 原子と共に、置換されてもよい複素環を形成する [B16]記載の CaMKII阻害剤。
[0055] [B18] Gが置換されてもよいフエ-ル、置換されてもよいナフチル、置換されてもよ いフリル、置換されてもよいチェ-ル、置換されてもよいインドリル、置換されてもよい イソチアゾリル、置換されてもよいべンゾチェ-ル、置換されてもよいイソべンゾフラ- ル、置換されてもよいピロリル、置換されてもよいべンゾフリル、置換されてもよいイミ ダゾリル、置換されてもよいピラゾリル、置換されてもよいイソキサゾリル、置換されても よいイソチアゾリル、置換されてもよいチアゾリル、置換されてもよいォキサゾリル、置 換されてもよいべンズイミダゾリル、置換されてもよいべンゾチアゾリル、置換されても よいべンズォキサゾリル、置換されてもよいピリジル、置換されてもよいピラジュル、置 換されてもよいピリミジニル、置換されてもよいピリダジ -ル、置換されてもよいトリアジ -ル、置換されてもよいキノリル、置換されてもよいイソキノリル、置換されてもよいキ ナゾリ-ル、置換されてもよいキノキサリニル、置換されてもよい 2, 3 ジヒドローベン ゾ [ 1 , 4]ジォキシュルまたは置換されてもょ 、カルバゾリルである [B 12]〜 [B 17]の V、ずれか記載の CaMKII阻害剤。
[0056] [B19] 項 [13]記載の式 A1または式 A2で表されるイソキサゾール誘導体またはそ の薬学上許容される塩を有効成分とする [B 12]記載の CaMKII阻害剤。
[0057] [B20] 項 [14]記載の式 A3で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許 容される塩を有効成分とする [B12]記載の CaMKII阻害剤。
[0058] [B21] 項 [15]記載の式 A4で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許 容される塩を有効成分とする [B12]記載の CaMKII阻害剤。
[0059] [B22] G2が 2 フルオロービフエ-ルー 4—ィルまたは 2，—フルオロービフエ-ル
4ーィルであり、 R5Qが水素原子またはメチルであり、 R63および R64が共に水素原子 であり、 R61および R62力 以下の（a6)または (b6)の通りである、 [B21]記載の CaMKII 阻害剤：
(a6)独立して水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す；
(b6)—緒になつて窒素原子と共に、モルホリン (モルホリンは、 1または 2個のメチル で置換されてもよい。）を表す。
[0060] [B23] 3- [(1S)-1- (2-フルォロビフ -ル- 4-ィル)ェチル ]-5- { [アミノ (モルフォリン- 4
-ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾールまたはその薬学上許容される塩を有効成分とし て含む CaMKII阻害剤。
[B24] 4-[1-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-2- (メチルァミノ)チアゾールま たはその薬学上許容される塩を有効成分として含む CaMKII阻害剤。
[B25] Ι κ Β αの分解抑制作用を有する物質を有効成分として含む自己免疫疾患 の予防剤および Ζまたは治療剤。
[Β26] サイクリン D1の発現増強に対する抑制作用を有する物質を有効成分として 含む自己免疫疾患の予防剤および Ζまたは治療剤。
[Β27] Aktのリン酸化抑制作用を有する物質を有効成分として含む自己免疫疾患 の予防剤および Zまたは治療剤。
[0061] [B28] CaMKII阻害作用を有する物質力 CaMKII遺伝子の塩基配列において連 続する少なくとも 15塩基を有するポリヌクレオチドおよび Zまたは該ポリヌクレオチドに 相補的なポリヌクレオチドである、 [B7] [B11]のいずれか記載の自己免疫疾患の 予防剤および Zまたは治療剤。
[B29] CaMKII阻害作用を有する物質力 CaMKII遺伝子に対する siRNAである [B 7] [B11]のいずれか記載の自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤。
[B30] siRNA力 以下の配列で表される siRNAである、 [B29]に記載の自己免疫疾 患の予防剤および Zまたは治療剤：
センス鎖： 5'- CGU GAG GCU CGG AUA UGU CdTdT- 3'
アンチセンス鎖： 5'- GAC AUA UCC GAG CCU CAC GdTdT- 3'
[B31] CaMKII阻害作用を有する物質が抗 CaMKII抗体である、 [B7]— [B11]の いずれか記載の自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤。
[0062] [B32] 哺乳動物体内における CaMKIIの発現もしくは活性を、自己免疫疾患の予 防および Zまたは治療に有効な程度阻害することを含む、該哺乳動物の自己免疫 疾患の予防および Zまたは治療方法。
[B33] CaMKII阻害作用を有する物質を、自己免疫疾患の予防および Zまたは治 療に有効な量哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物の自己免疫疾患の予防 および Zまたは治療方法。
[B34] 自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤の製造のための、 CaMKII阻 害作用を有する物質の使用。
[0063] また、本発明の態様として、以下のものも挙げることができる。
[B35] 下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む自己免疫疾患の予防剤および Zまたは 治療剤のスクリーニング方法：
(a)被験物質と CaMKII発現細胞を接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた CaMKII発現細胞内の CaMKII蛋白量を測定し、該蛋白量 を、被験物質を接触させない対照細胞内の上記蛋白量と比較する工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づいて、 CaMKIIの産生を阻害する被験物質を選択する 工程。
[B36] 下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む自己免疫疾患の予防剤および Zまたは 治療剤のスクリーニング方法：
(a)被験物質と CaMKII発現細胞を接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた CaMKII発現細胞内の CaMKII遺伝子発現量を測定し、該 遺伝子発現量を、被験物質を接触させな!/、対照細胞内の上記遺伝子発現量と比較 する工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づいて、 CaMKIIの遺伝子発現を阻害する被験物質を選 択する工程。
[B37] 下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む自己免疫疾患の予防剤および Zまたは 治療剤のスクリーニング方法：
(a)被験物質と脱リン酸化 CaMKII酵素を接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた CaMKII酵素のリン酸ィ匕レベルを測定し、該リン酸化レベル を、被験物質を接触させな!/ヽ対照酵素リン酸化レベルと比較する工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づいて、 CaMKIIの活性化を阻害する被験物質を選択す る工程。
[0064] 本発明の好ましい態様として、以下のものも挙げることができる。
[B38] CaMKIIが CaMKII yまたは CaMKII δである [Bl] - [B5]の!、ずれか記載の スクリーニング方法。
[B39] CaMKIIが CaMKII γである [Bl]— [B5]のいずれか記載のスクリーニング方 法。
[B40] CaMKIIが CaMKII γまたは CaMKII δである [Β6]— [Bl 1]の!、ずれか記載 の自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤。
[B41] CaMKIIが CaMKII γである [Β6]— [B11]のいずれか記載の自己免疫疾患 の予防剤および Ζまたは治療剤。
[Β42] CaMKIIが CaMKII γまたは CaMKII δである [Β32]または [Β33]記載の予 防および Ζまたは治療方法。
[Β43] CaMKIIが CaMKII γである [Β32]または [Β33]記載の予防および Ζまたは 治療方法。
[Β44] CaMKIIが CaMKII γまたは CaMKII δである [Β34]記載の使用。
[Β45] CaMKIIが CaMKII γである [Β34]記載の使用。
[0065] また、本発明の別の態様として、以下のものも挙げることができる。
[Β46] [B1] [Β5]または [Β35]— [Β39]のいずれか記載のスクリーニング方法 を用いて選択される物質 (但し、以下の（ 1)および (2)を除く）を有効成分として含む 自己免疫疾患の予防剤および Ζまたは治療剤：
(1) [Β12]記載の式 1で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容され る塩；
(2) 4-[1-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-2- (メチルァミノ)チアゾールまたは その薬学上許容される塩。
[B47] CaMKII阻害作用を有する物質 (但し、以下の（1)および (2)を除く）を有効 成分として含む自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤：
(1) [B12]記載の式 1で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容され る塩；
(2) 4-[1-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-2- (メチルァミノ)チアゾールまたは その薬学上許容される塩。
[B48] 関節リウマチの予防剤および Zまたは治療剤である [B47]記載の自己免疫 疾患の予防剤および Zまたは治療剤。
[B49] [B12]— [B24]のいずれか記載の CaMKII阻害剤を有効成分として含む、 免疫の異常亢進改善剤。
[B50] [B12]— [B24]のいずれか記載の CaMKII阻害剤を有効成分として含む、 関節リウマチ患者における慢性炎症の抑制剤、関節破壊の抑制剤、関節変形への 進行抑制剤、または身体機能の改善剤。
[B51] 自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマト 一デス、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、 甲状腺中毒症、悪性貧血、 Good-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋 無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病 、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交 換性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎 、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、また はシエーダレン症候群である [B2]記載のスクリーニング方法。
[B52] 自己免疫疾患が、関節リウマチまたは多発性硬化症である [B2]記載のスク リーニング方法。 発明の効果
本発明により、自己免疫疾患を予防および Zまたは治療するための優れた薬剤、 特に併用薬を提供することができる。さらに本発明により、当該予防薬、治療薬、また は併用薬の有効成分となる候補物質を探索し取得するために有用なスクリーニング 方法を提供することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0067] 以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
なお、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド等の略号による表示は、 IUPAC、 IUB の規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」 ( 特許庁編)及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
[0068] ァリール基としては、例えば炭素数 6〜14のァリール基が挙げられ、具体的には、 フエ-ル、 1—ナフチル、 2—ナフチル、フエナントリル、アントリル等が挙げられる。好 ましくは、フエニル、 1 ナフチル、 2—ナフチルが挙げられる。
[0069] 複素環基としては、例えば 1〜6個の窒素原子、酸素原子および Zまたは硫黄原子 を含有する 1〜3環の 5〜7員環の飽和複素環基または不飽和複素環基が挙げられ る。
力かる飽和複素環基としては、具体的にはテトラヒドロフリル、ピロリジニル、ビラゾリ ジ -ル、イミダゾリジ-ル等の 1〜3環の 5員環飽和複素環基、ピペリジル、モルホリニ ル、チアモルホリニル、ピペラジ -ル、へキサヒドロ—ピリミジ -ル等の 1〜3環の 6員 環飽和複素環基、ァゼパニル等の 1〜3環の 7員環飽和複素環基等が挙げられる。 力かる不飽和複素環基としては、具体的にはフリル、チェニル、インドリル、イソチア ゾリル、ベンゾチェニル、イソベンゾフラニル、ピロリル、ベンゾフリル、イミダゾリル、 4 , 5 ジヒドロー 1H イミダゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾ リル、ォキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズォキサゾリル、カル バゾリル等の 1〜3環の 5員環不飽和複素環基、ピリジル、ピラジュル、ピリミジ -ル、 1, 4, 5, 6—テトラヒドローピリミジ -ル、 3, 6 ジヒドロー 2H—[1, 3, 5]ォキサジァ ジニル、ピリダジ -ル、トリアジニル、キノリル、イソキノリル、キナゾリ-ル、キノキサリニ ル、クロメ-ル、 2, 3 ジヒドローべンゾ [1, 4]ジォキサ-ル等の 1〜3環の 6員環不 飽和複素環基、 4, 5, 6, 7—テトラヒドロー 1H— [1, 3]ジァゼピ-ル等の 1〜3環の 7員環不飽和複素環基等が挙げられる。 [0070] 置換ァリール基および置換複素環基における置換基としては、例えば下記の a)か ら g)の各群に含まれる任意の基が挙げられ、これらが任意に 1または複数個置換し てよい。
a)： ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、アジド基、メルカプト基、置換されてもよい アミノ基、置換されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換されてもよい低級アルコキシアミ ノ基、水酸基、ァシル基、ァシルォキシ基、カルボキシル基、置換されてもよい力ルバ モイル基、置換されてもよい力ルバモイルォキシ基、スルホ基、置換されてもよいスル ファモイル基
b)： — R10、 -OR10, 一 CO R10、 一 SO R10、— SR10、— OCH R10、— SCH R10、
2 3 2 2 C ( = NOH)R10
[式中、 R1Qは、フ -ル基または単環の複素環基を表す。フ ニル基または単環の 複素環基は、例えばハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、シァノ基 、ニトロ基、アジド基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、置換され てもよぃァミノ基、置換されてもよい力ルバモイル基、カルボキシ基、低級アルキル力 ルボニル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルス ルフィエル基および低級アルキルスルホ -ル基等の群力 任意に選ばれる 1または 複数の基で置換されてもよい。 ]
[0071] c) : アルキル基、アルコキシ基、アルコキシカルボ-ル基、アルコキシ（チォカルボ -ル）基、アルキルチオ基、（アルキルチオ）チォカルボ-ル基、（アルキルチオ）カル ボ-ル基、アルキルカルボ-ル基、アルキルチオイル基、アルキルスルフィエル基、 アルキルスルホ-ル基、アルキルカルボ-ルォキシ基、アルキルチオイルォキシ基、 アルキルスルホ -ルォキシ基
[この群の各基は、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、メルカプト基、ォキソ基 、チォキソ基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、ァシル基、ァシルォキシ基、カルボ キシ基、置換されてもよい力ルバモイル基、置換されてもよい力ルバモイルォキシ基、 スルホ基、置換されてもよいスルファモイル基、 R1()、 -OR10, -SR10, -OCH R10
2
、 -SCH R10 (式中、 R10は前記と同義である。）、
2
低級シクロアルキル基 (低級シクロアルキル基は、例えばノヽロゲン原子、低級アル キル基、低級ハロアルキル基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基 および低級ハロアルコキシ基等の群から任意に選ばれる 1または複数の基で置換さ れてもよい。）、
低級アルコキシ基、低級アルコキシカルボ-ル基および低級アルキルチオ基 (低級 アルコキシ基、低級アルコキシカルボ-ル基および低級アルキルチオ基は、例えば ハロゲン原子、低級シクロアルキル基、単環の複素環基、フエ-ル基、シァノ基、 -ト 口基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、置換されてもよいアミノ基 、置換されてもよい力ルバモイル基、カルボキシ基、低級アルキルカルボニル基、低 級アルコキシカルボ-ル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基およ び低級アルキルスルホニル基等の群から任意に選ばれる 1または複数の基で置換さ れてもよい。）等の群から任意に選ばれる 1または複数の基で置換されてもよい。 ] [0072] d)： ァルケ-ル基
[ァルケ-ル基は、例えばノヽロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、メルカプト基、ォキソ基 、チォキソ基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアル コキシ基、低級アルコキシカルボ-ル基、低級アルキルチオ基、ァシル基、ァシルォ キシ基、カルボキシ基、置換されてもよい力ルバモイル基、— R1()、 -OR10, -SR10, — OCH R1Qおよび— SCH R1Q (式中、 R1Qは前記と同義である。）等の群から任意に
2 2
選ばれる 1または複数の基で置換されてもよい。 ]
[0073] e)： アルキニル基
[アルキ-ル基は、例えばノヽロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、メルカプト基、ォキソ基 、チォキソ基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアル コキシ基、低級アルコキシカルボ-ル基、低級アルキルチオ基、ァシル基、ァシルォ キシ基、カルボキシ基、置換されてもよい力ルバモイル基、— R1()、 -OR10, -SR10, -OCH R1()および— SCH R1(> (式中、 R1(>は前記と同義である。）等の群から任意に
2 2
選ばれる 1または複数の基で置換されてもよい。 ]
f)： ァノレケニノレ才キシ基、ァノレケニノレ才キシカノレボニノレ基、ァノレケニノレカノレボニノレ 基、ァルケ-ルカルポ-ルォキシ基、アルキ-ルォキシ基、アルキ-ルォキシカルボ ニル基 [この群の各基は、例えばハロゲン原子、ォキソ基、置換されてもよいアミノ基、水酸 基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、ァシル基、ァシルォキシ基、低級ァ ルキルチオ基、カルボキシ基、置換されてもよい力ルバモイル基、低級アルコキシ力 ルポニル基およびフ ニル基等の群から任意に選ばれる 1または複数の基で置換さ れてちよい。 ]
[0074] g)： 低級シクロアルキル基、低級シクロアルキルォキシ基、低級シクロアルキルカル ボニル基、低級シクロアルキルカルボ-ルォキシ基、低級シクロアルキルォキシカル ボ-ル基、低級シクロアルケ-ル基、低級シクロアルケ-ルォキシ基、低級シクロア ルケ-ルカルポ-ル基、低級シクロアルケ-ルカルポ-ルォキシ基、低級シクロアル ケ-ルォキシカルボ-ル基
[この群の各基は、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、メルカプト基、ォキソ基 、チォキソ基、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、置換されてもよいアミノ基、水 酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、ァシル基、ァシルォキシ基、低級 アルキルチオ基、カルボキシ基、置換されてもよい力ルバモイル基および低級アルコ キシカルボニル基等の群から任意に選ばれる 1または複数の基で置換されてもょ 、。 ]
[0075] 置換ァリール基および置換複素環基の置換基としては、具体的にはメチル、 2—メ チル一 1—プロピル、へキシル、 2—メチル 2—プロピル、 2—プロピル、フエニル、ト リフルォロメチル、 2, 2, 2—トリフルォロェチル、 1, 1, 2, 2, 2—ペンタフルォロェチ ル、 6, 6, 6—トリフルォ口へキシル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシェチル、メトキシメチ ル、へキシルォキシメチル、シクロプロピルメトキシメチル、ァセトキシメチル、 N, N— ジメチルカルバモイルォキシメチル、メタンスルホニルォキシメチル、 N, N ジメチル スルファモイルォキシメチル、 2—（1 ピロリジニル）エトキシメチル、 2—メトキシェチ ル、カルボキシメチル、メトキシカルボニルメチル、力ルバモイルメチル、アミジノメチ ル、メチルチオメチル、シァノメチル、アミノメチル、アミノエチル、 N ァセチルアミノメ チノレ、ェテニノレ、 2—プロぺニノレ、ェチニノレ、 2—プロピニノレ、 2—メトキシカノレボニノレ ェテュル、フルォロ、クロ口、ブロモ、ニトロ、シァ入ヒドロキシ、アミ入 N, N ジメチ ノレアミノ、メルカプト、スノレホ、カノレボキシ、アミジノ、メトキシ、シクロプロピルメトキシ、 2 一（1 ピロリジニル）エトキシ、メトキシカルボニルメトキシ、 2—ァセトキシェトキシ、 2 ーヒドロキシエトキシ、 2—メトキシエトキシ、 4, 4, 5, 5, 5 ペンタフルォロペントキシ 、 2 メタンスルフィニルエトキシ、フエノキシ、ベンジルォキシ、 4ーメトキシベンジル ォキシ、メトキシカルボニルォキシ、 1 ピロリジニル、 3 ヒドロキシ 1 ピロリジニ ル、ァセチルァミノ、 N ァセチルー N—メチルァミノ、 N メタンスルホニルァミノ、 N メタンスルホ二ルー N メチルアミ入メトキシカルボニル、 2—メチルー 2—プロピ ルォキシカルボニル、 2, 2, 2—トリフルォロエトキシカルボニル、力ルバモイル、 N, N ジメチルカルバモイル、 2 チアゾリジニル、 2 ォキサゾリジニル、 5—テトラゾリ ル、メタンスルフィエル、スルファモイル、 N, N ジメチルスルファモイル、ァセチル、 ベンゾィル、ピバロィル、トリフルォロアセチル、ホルミル、エチレンジォキシメチル、ィ ミ入メトキシィミノ等が挙げられる。
力かる置換基において好ましい置換基としては、具体的にはメチル、 2—メチル一 1 —プロピル、へキシル、 2—メチル—2—プロピル、 2—プロピル、フエニル、トリフルォ ロメチル、 2, 2, 2—トリフルォロェチル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシェチル、メトキシ メチル、シクロプロピルメトキシメチル、ァセトキシメチル、 N, N ジメチルカルバモイ ルォキシメチル、メタンスルホニルォキシメチル、 N, N ジメチルスルファモイルォキ シメチル、 2- (1—ピロリジ -ル）エトキシメチル、 2—メトキシェチル、カルボキシメチ ル、メトキシカルボニルメチル、力ルバモイルメチル、アミジノメチル、メチルチオメチ ル、シァノメチル、アミノメチル、アミノエチル、 N ァセチルアミノメチル、フルォロ、ク ロロ、ブロモ、ニトロ、シァ入ヒドロキシ、アミ入 N, N ジメチルアミ入メトキシ、 2— ( 1 ピロリジニル）エトキシ、メトキシカルボニルメトキシ、 2—ァセトキシェトキシ、 2—ヒ ドロキシエトキシ、 2—メトキシエトキシ、 2—メタンスルフィニルエトキシ、 1 ピロリジニ ル、 3 ヒドロキシ一 1—ピロリジ -ル、ァセチルアミ入 N ァセチル一 N—メチルアミ ノ、 N メタンスルホニルアミ入 N メタンスルホ二ルー N メチルアミ入メトキシカル ボニル、 2—メチルー 2—プロピルォキシカルボニル、 2, 2, 2—トリフルォロエトキシ カルボ-ル、力ルバモイル、 N, N ジメチルカルバモイル、メタンスルフィエル、ァセ チル、ベンゾィル、ビバロイル、トリフルォロアセチル等が挙げられる。
ァリール基および複素環基における好ましい置換基数は、 1、 2または 3が挙げられ る。また、ァリール基および複素環基は、無置換であっても好ましい。
[0077] アルキル基としては、例えば直鎖または分枝した炭素数 1〜10のアルキル基が挙 げられ、具体的には、メチル、ェチル、プロピル、 1ーメチルェチル、ブチル、 1ーメチ ノレプロピノレ、 2—メチルー 1 プロピル、 1, 1ージメチルェチル、ペンチノレ、 1, 1ージ メチルプロピル、 2, 2 ジメチルプロピル、 1ーメチルブチル、 3—メチルブチル、へキ シル、 2—メチルペンチル、 3, 3 ジメチルブチル、ヘプチル、 1ーェチルペンチル、 5—メチルへキシル、ォクチル、 1, 5 ジメチルへキシル、 2 ェチルへキシル、ノニ ル、デシル等が挙げられる。低級アルキル基としては、炭素数 1〜6のアルキル基が 挙げられる。
[0078] 置換アルキル基における置換基としては、例えば下記の a)力 d)の各群に含まれ る任意の基が挙げられ、これらが任意に 1または複数個置換してよい。
a)： ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、メルカプト基、ォキソ基、チォキソ基、置換さ れてよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換されてもよい低級アル コキシァミノ基、水酸基、ァシル基、ァシルォキシ基、カルボキシ基、置換されてもよ い力ルバモイル基、置換されてもよい力ルバモイルォキシ基、スルホ基、置換されても よいスルファモイル基
b)： 低級シクロアルキル基、低級シクロアルキルォキシ基、低級シクロアルキルカル ボニル基、低級シクロアルキルカルボ-ルォキシ基、低級シクロアルキルォキシカル ボ-ル基、低級シクロアルケ-ル基、低級シクロアルケ-ルォキシ基、低級シクロア ルケ-ルカルポ-ル基、低級シクロアルケ-ルカルポ-ルォキシ基、低級シクロアル ケ-ルォキシカルボ-ル基
[この群の各基は、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、メルカプト基、ォキソ基 、チォキソ基、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、置換されてもよいアミノ基、水 酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、ァシル基、ァシルォキシ基、低級 アルキルチオ基、カルボキシ基、置換されてもよい力ルバモイル基および低級アルコ キシカルボニル基等の群から任意に選ばれる 1または複数の基で置換されてもょ 、。 ]
[0079] c) : アルコキシ基、アルコキシカルボ-ル基、アルコキシ（チォカルボ-ル）基、アル キルチオ基、（アルキルチオ）チォカルボ-ル基、（アルキルチオ）カルボ-ル基、ァ ルキルカルボ-ル基、アルキルチオイル基、アルキルスルフィエル基、アルキルスル ホ-ル基、アルキルカルボ-ルォキシ基、アルキルチオイルォキシ基、アルキルスル ホニノレ才キシ基
[この群の各基は、例えばハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、メルカプト基、ォキソ基 、チォキソ基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、ァシル基、ァシルォキシ基、カルボ キシ基、置換されてもよい力ルバモイル基、置換されてもよい力ルバモイルォキシ基、 スルホ基、置換されてもよぃスルファモイル基、 R1(>、 -OR10, -SR10, -OCH R10
2
、— SCH R10 (式中、 R10は前記と同義である。）、
2
低級シクロアルキル基 (低級シクロアルキル基は、例えばノヽロゲン原子、低級アル キル基、低級ハロアルキル基、置換されてもよいアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基 および低級ハロアルコキシ基等の群から任意に選ばれる 1または複数の基で置換さ れてもよい。）、
低級アルコキシ基、低級アルコキシカルボ-ル基および低級アルキルチオ基 (低級 アルコキシ基、低級アルコキシカルボ-ル基および低級アルキルチオ基は、例えば ハロゲン原子、低級シクロアルキル基、単環の複素環基、フエ-ル基、シァノ基、 -ト 口基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、置換されてもよいアミノ基 、置換されてもよい力ルバモイル基、カルボキシ基、低級アルキルカルボニル基、低 級アルコキシカルボ-ル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基およ び低級アルキルスルホニル基等の群から任意に選ばれる 1または複数の基で置換さ れてもよい。）等の群から任意に選ばれる 1または複数の基で置換されてもよい。 ] d)： -R10, -OR10, -SR10, -OCH R10,—SCH R10 (式中、 R10は前記と同義で
2 2
ある。）
置換アルキル基としては、具体的にはトリフルォロメチル、 2 -トロェチル、 2 シ ァノプロピル、 4 メルカプトブチル、 3—ォキソブチル、 2 ピベリジノエチル、 2 ヒ ドロキシェチル、 3—メトキシプロピル、エトキシカルボニルメチル、シクロプロピルメチ ル、シクロへキシルメチル、 6—シクロへキシノレへキシノレ、 3—シクロへキセニルブチ ル、 2—フエ-ルブチル、ベンジル、 2—ナフチルメチル、フエネチル、 2—ピリジルメ チル、 3 ピリジルメチル、 4 ピリジルメチル、 2 キノリルメチル、 3 キノリルメチル 、 3—チェニルプロピル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシェチル、アミノメチル、アミノエチ ル、カルボキシメチル、エトキシカルボ-ルメチル、力ルバモイルメチル等が挙げられ る。
なお、低級ハロアルキル基とは、 1〜5個のハロゲン原子が置換した低級アルキル をいう o
[0081] アルコキシ基とは、アルキル基が結合したォキシ基を 、う。具体的には、メトキシ、ェ トキシ、プロポキシ、 2—プロポキシ、ブトキシ、 1, 1ージメチルエトキシ、ペントキシ、 へキソキシ等が挙げられる。置換アルコキシ基の置換基は、置換アルキル基の置換 基と同じものが挙げられる。置換アルコキシ基としては、具体的には、シクロプロピル メトキシ、トリフルォロメトキシ、 2—ピロリジノエトキシ、ベンジルォキシ、 2—ピリジルメ トキシ等が挙げられる。
なお、ハロアルコキシ基とは、 1〜5個のハロゲン原子で置換されたアルコキシ基を いう。
アルコキシカルボ-ル基とは、アルコキシ基が結合したカルボ-ル基をいう。具体的 には、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカノレボニノレ、 2—プロポキ シカルボニル等が挙げられる。置換アルコキシカルボニル基における置換基としては 、置換アルキル基における置換基と同じものが挙げられる。
[0082] アルケニル基としては、 1〜3個の 2重結合を有する炭素数 2〜： LOの直鎖または分 岐鎖のアルケ-ル基が挙げられる。具体的には、ェテュル、 1—プロべ-ル、 2—プロ ぺニル、 1ーメチルェテニル、 1ーブテニル、 2 ブテニル、 3 ブテニル、 2 メチル —2 プロぺニル、 1—ペンテニル、 2 ペンテニル、 4 ペンテニル、 3—メチノレ一 2 ブテニノレ、 1一へキセニノレ、 2—へキセニノレ、 1一へプテニノレ、 2—へプテニノレ、 1 ォクテニル、 2 ォクテニル、 1, 3—ォクタジェニル、 2 ノネニル、 1, 3 ノナジェ -ル、 2—デセニル等が挙げられる。好ましいアルケニル基としては、例えばエテュ ル、 1—プロべ-ル、 1ーブテュル基が挙げられる。低級ァルケ-ル基としては、炭素 数 2〜6のァルケ-ル基が挙げられる。
置換ァルケ-ル基の置換基としては、例えばノヽロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、メ ルカプト基、ォキソ基、チォキソ基、置換されてよぃァミノ基、水酸基、低級アルコキシ 基、低級ハロアルコキシ基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、ァ シル基、ァシルォキシ基、カルボキシ基、置換されてよい力ルバモイル基、 R1Q、 - OR1Q、— SR1Q、— OCH R1Q、— SCH R1Q (式中、 R1Qは前記と同義である。）等が挙げ
2 2
られる。
また、ァルケ-ルォキシ基とは、アルケニル基が結合したォキシ基をいう。
[0083] アルキニル基としては、 1〜3個の 3重結合を有する炭素数 2〜： L0の直鎖または分 岐鎖のアルキ-ル基が挙げられる。具体的にはェチュル、 1 プロビュル、 2—プロ ピニル、 1ーブチニル、 2 ブチニル、 3 ブチニル、 1 ペンチニル、 2 ペンチ二 ル、 4 ペンチ-ル、 1ーォクチ-ル、 6—メチルー 1一へプチ-ル、 2 デシ-ル等 が挙げられる。好ましいアルキ-ル基としては、例えば 1 プロビュル、 1ーブチュル 基等が挙げられる。低級アルキ-ル基としては、炭素数 2〜6のアルキニル基が挙げ られる。
置換アルキニル基の置換基としては、例えばノヽロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、メ ルカプト基、ォキソ基、チォキソ基、置換されてよぃァミノ基、水酸基、低級アルコキシ 基、低級ハロアルコキシ基、ァシル基、ァシルォキシ基、低級アルキルチオ基、カル ボキシ基、置換されてよい力ルバモイル基、低級アルコキシカルボ-ル基、—R1Q、一 OR1Q、— SR1Q、—OCH R1Q、—SCH R1Q (式中、 R1Qは前記と同義である。）等が挙げ
2 2
られる。
また、アルキ-ルォキシ基とは、アルキ-ル基が結合したォキシ基をいう。
[0084] シクロアルキル基としては、例えば炭素数 3〜10のシクロアルキル基が挙げられ、 具体的には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへキシル、シクロ ヘプチル等が挙げられる。低級シクロアルキル基としては、炭素数 3〜6のシクロアル キル基が挙げられる。また、シクロアルキルォキシ基とは、シクロアルキル基が結合し たォキシ基をいう。
シクロアルケ-ル基としては、例えば炭素数 3〜10のものが挙げられ、具体的には シクロへキセニル等が挙げられる。低級シクロアルケニル基としては、炭素数 3〜6の シクロアルケ-ル基が挙げられる。また、シクロアルケ-ルォキシ基とは、シクロアルケ -ル基が結合したォキシ基を 、う。
置換シクロアルキル基および置換シクロアルケ-ル基の置換基としては、例えばノヽ ロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、メルカプト基、ォキソ基、チォキソ基、低級アルキル 基、低級ハロアルキル基、置換されてよぃァミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、低級 ハロアルコキシ基、ァシル基、ァシルォキシ基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基 、置換されてよい力ルバモイル基、低級アルコキシカルボ-ル基等が挙げられる。
[0085] ァシル基としては、例えば、式一 Z— R11 (式中、 Zは一 CO 、 一 CS―、 一SO ま たは SO を表し、 R11は置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいァリール
2
基または置換されてもょ 、複素環基を表す。 )で表されるァシル基等が挙げられる。 ァシル基としては、具体的にはホルミル、ァセチル、プロパノィル、 2—プロパノィル、 ピバロィル、ノ レリノレ、ピバロィル、トリフルォロアセチル、ベンゾィル、ナフトイル、ニコ チノィル、メタンスルホニル、トリフルォロメタンスルホニル、 p—トルエンスルホニル等 が挙げられる。好ましいァシル基としては、ァセチル基等が挙げられる。また、ァシル ォキシ基とは、ァシル基が結合したォキシ基を!ヽぅ。
[0086] 置換力ルバモイル基における置換基としては、例えばァリール基もしくは複素環基 で置換されてもよいアルキル基、およびァリール基、複素環基等が挙げられ、同一ま たは異なった複数のものが独立して置換してもよ ヽ。置換力ルバモイル基としては、 具体的にはェチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、フエ-ルカルバモイル、 2 ピリジルカルバモイル、ベンジルカルバモイル、 （3—ピリジルメチル）力ルバモイル 等が挙げられる。
置換スルファモイル基における置換基としては、例えばアルキル基、ァリール基、複 素環基等が挙げられ、同一または異なった複数のものが独立して置換してもよい。置 換スルファモイル基としては、具体的にはェチルスルファモイル、ジメチルスルファモ ィル、フエ-ルスルファモイル、 2—ピリジルスルファモイル等が挙げられる。
置換アミノ基における置換基としては、例えばァシル基、アルキル基等が挙げられ、 同一または異なった複数のものが独立して置換してもよ 、。具体的な置換アミノ基と しては、ァセトアミド、プロピオンアミド、ブチルアミド、 2—ブチルアミド、メチルァミノ、 2—メチルー 1 プロピルァミノ、ジェチルァミノ等が挙げられる。 置換ヒドロキシルァミノ基における置換基は、窒素原子、酸素原子のいずれの原子 に置換してもよぐその置換基としては、置換アミノ基における置換基と同じものが挙 げられる。
[0087] ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が 挙げられる。
[0088] アルキレン基としては、例えば炭素数 1〜10の直鎖または分枝したアルキレン基が 挙げられる。具体的には、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチ レン、へキサメチレン、ヘプタメチレン、オタタメチレン、ノナメチレン、デカメチレン、メ チルメチレン、ェチルメチレン、ジメチルメチレン、 1, 1ージメチルエチレン、 1, 2—ジ メチルエチレン、 1—メチルトリメチレン、 2—メチルトリメチレン、 1, 1—ジメチルトリメ チレン、 1, 2 ジメチルトリメチレン、 1, 3 ジメチルトリメチレン、 2, 2 ジメチルトリメ チレン、 1ーェチルトリメチレン、 2—ェチルトリメチレン、 1, 1ージェチルトリメチレン、 1, 2 ジェチルトリメチレン、 1, 3 ジェチルトリメチレン、 2, 2 ジェチルトリメチレ ン等が挙げられる。
低級アルキレン基としては、例えば炭素数 1〜6の直鎖または分枝したアルキレン 基が挙げられる。
[0089] NH基の保護基としては、通常用いられる各種の保護基が可能である力 好適には 例えば、メトキシカルボ-ル、エトキシカルボ-ル、 tert ブトキシカルボ-ル、ベンジ ルォキシカルボ-ル等の力ルバメート型の保護基、ァセチル、ベンゾィル等のアミド 型の保護基、ベンジル、ニトロ、 p トルエンスルホ -ル、メタンスルホ-ル等が挙げら れる。
[0090] R3および R4のうちの任意の 2つが結合して一緒になつて窒素原子と共に形 成される置換されてもよい複素環における複素環としては、例えば 1〜6個の窒素原 子、酸素原子および Zまたは硫黄原子を含有する（窒素原子を少なくとも 1つ含む） 5 〜7員環の単環もしくは 2環の飽和複素環または不飽和複素環が挙げられる。具体 的には、ピロリジン、イミダゾリジン、 4, 5 ジヒドロー 1H—イミダゾール、ピぺリジン、 ピぺリジンー4 オン、ピぺラジン、モルホリン、チアモルホリン、 1, 4, 5, 6—テトラヒ ドローピリミジン、へキサヒドローピリミジン、 3, 6 ジヒドロー 2H—[1, 3, 5]ォキサジ ァジン等が挙げられる。置換複素環における置換基としては、置換複素環基におけ る置換基と同じちのが挙げられる。
R8および R9が結合して一緒になつて炭素原子と共に形成される置換されてもよい 炭化水素環としては、例えば置換されてもよい炭素数 3〜8のシクロアルカン環また は置換されてもょ 、炭素数 3〜8のシクロアルケン環等が挙げられる。力かるシクロア ルカン環またはシクロアルケン環としては、具体的には、シクロプロパン、シクロブタン 、シクロペンタン、シクロへキサン、シクロヘプタン、シクロプロペン、シクロブテン、シク 口ペンテン、シクロへキセン、シクロヘプテン等が挙げられる。置換炭化水素環にお ける置換基としては、置換シクロアルキル基における置換基と同じものが挙げられる。
[0091] 式 1のイソキサゾール誘導体にお!、てイソキサゾール環に極性を有する官能基を導 入した化合物は、特に、体内動態が改善され、副作用も少なぐ長期間投与が可能 である。
[0092] 式 1のイソキサゾール誘導体の薬学上許容される塩としては、酸付加塩および塩基 付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ョ ゥ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クェン酸塩、シユウ酸塩、酢酸塩、 ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルォロ酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸 塩、酒石酸塩、ァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンス ルホン酸塩、カンファ一—スルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。塩基付加塩とし ては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモ-ゥム塩等の 無機塩基塩、トリェチルアンモ -ゥム塩、トリエタノールアンモ-ゥム塩、ピリジ-ゥム 塩、ジイソプロピルアンモ-ゥム塩等の有機塩基塩等が挙げられる。
[0093] 本発明における CaMKII阻害剤には、本明細書中で例示した具体的化合物 (例え ば、式 1のイソキサゾール誘導体、化合物 (I)、化合物 (lb)、化合物 (Ic)、化合物 (II )など)のあらゆる立体異性体、光学活性体、互変異性体、プロドラッグ、誘導体等を 包含している。また、本発明はそれらの水和物等の溶媒和物およびあらゆる態様の 結晶形のものも包含して 、る。
[0094] 式 1のイソキサゾール誘導体は、例えば、特許文献 3に記載の方法によって製造す ることがでさる。 [0095] 以下、本発明の自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤、および本発明の Ca ΜΚΠ阻害剤のスクリーニング方法について詳細に説明する。
[0096] I. a P 疫疾唐、予防剤および/または '治療剤
一般に「自己免疫疾患」は、自己の組織を構成する成分に反応する抗体ある ヽはリ ンパ球が、体内で持続的に産生されることによって組織障害をきたす疾患であり、大 別すると下記に掲げる臓器特異的自己免疫疾患と臓器非特異的自己免疫疾患 (全 身性自己免疫疾患）の 2つに分類することができる。
[0097] (1)臓器特異的自己免疫疾患:橋本病、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧 血、 Good-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡 、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、 I型糖尿病、アジソン 病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、多発性硬化 症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性血液性疾 患 (例えば、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症等）、発作性血色素尿症 、突発性血小板減少性紫斑病、間質性肺腺維症およびシヱーダレン症候群。
[0098] (2)臓器非特異的自己免疫疾患 (全身性自己免疫疾患）：関節リウマチ、全身性エリ テマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症および混合結合組織病
[0099] 本発明はこれらの「自己免疫疾患」を任意に対象とするものである。好ましくは、関 節リウマチおよび多発性硬化症を例示することができる。さらに好ましくは、関節リウ マチを例示することができる。本発明の予防剤および Zまたは治療剤、増強剤、組成 物、商業パッケージ、キット、使用、または方法はこれらの自己免疫疾患に罹患した 哺乳動物を任意に対象とすることができ、より好ましくは、自己免疫疾患に罹患した 患者を対象とすることができる。
[0100] また本発明の「自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤」とは、上記各種の自 己免疫疾患に対して、以下の（1)および（2)に示した作用力 選ばれる 1または複数 の作用を有するものである。
(1)予防作用：その発症を抑制する作用（発症抑制作用）、およびその発症を遅延さ せる作用 (発症遅延作用） (2)治療作用:発症後その症状を軽減若しくは改善する作用（症状緩和作用、症状 改善作用）、病態の進行を抑制する作用（進行抑制作用）、病態の進展を抑制する 作用 (進展抑制作用）、または疾患を治癒する作用（治癒作用）
その意味で、本発明の「自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤」には、自己 免疫疾患予防剤 (自己免疫疾患予防剤には、自己免疫疾患発症抑制剤および自己 免疫疾患発症遅延剤などが含まれる）、自己免疫疾患治療剤 (自己免疫疾患治療剤 には、自己免疫疾患症状緩和剤、自己免疫疾患症状改善剤、自己免疫疾患進行抑 制剤および自己免疫疾患進展抑制剤などが含まれる）、および、自己免疫疾患の予 防作用と治療作用とを併せ持つ剤が含まれる。予防作用は予防効果と、治療作用は 治療効果と言 ヽ換えることもできる。
[0101] 本発明において「CaMKII阻害作用」とは、その作用機序の別を問うことなぐ CaMKI Iの機能発現を阻害する作用を広く意味するものである。なお、ここで「CaMKIIの機能 発現を阻害する作用」には、 CaMKIIの蛋白質合成 (CaMKIIの遺伝子発現を含む)や 分泌を阻害する作用、発現した CaMKIIの活性化 (リン酸化)を阻害する作用、活性化 した CaMKIIを不活性ィ匕 (脱リン酸化)する作用、及び活性ィ匕した CaMKII酵素活性を 阻害する作用が包含される。本明細書では、このような CaMKIIの機能発現の阻害を 単に CaMKII阻害作用または CaMKIIの阻害ということもある。
[0102] なお、本発明の「CaMKII阻害剤（CaMKII阻害作用を有する物質)」は、上記に掲げ る阻害作用のいずれか少なくとも 1つの作用を有する物質であればよぐその形態や 性状の別を何ら問うものではない。また、本発明の「CaMKII阻害剤」は、少なくともヒト CaMKIIに対して阻害作用を有するものであればよぐヒト以外の哺乳類やその他の 生物種に由来する CaMKIIに対する阻害作用の有無は、特に制限されない。
[0103] 本発明の CaMKII阻害剤には、蛋白質、ペプチド、及び低分子化合物等も含まれる 。 CaMKII阻害作用を有する例えば低分子化合物は、低分子化合物ライブラリー (例 えば、 CamBridge Research Laboratories社等の低分子化合物ライブラリー）等に対し て後述する本発明のスクリーニング方法を実施することによって、取得することができ る。
[0104] 本発明の CaMKII阻害剤が抗 CaMKII抗体である場合、当該抗体は、 CaMKIIを特異 的に認識することができるものであれば 、かなる抗体でもよぐこのような抗体は CaM ΚΠタンパクを用いて、公知の方法で調製することができる。本発明の抗 CaMKII抗体 には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、および Fa bフラグメント、 Fab発現ライブラリーなどによって生成されるフラグメントのような抗原結 合性を有する上記抗体の一部が包含される。
[0105] 本発明の CaMKII阻害剤として、 CaMKII遺伝子の塩基配列において連続する少な くとも 15塩基を有するポリヌクレオチドおよび Zまたは該ポリヌクレオチドに相補的な ポリヌクレオチドを例示することもできる。 CaMKII遺伝子としては、 α、 β、 β '、 γ、 δ などいずれのァイソフォームでもよいが、好ましくは CaMKII γ遺伝子または CaMKII δ 遺伝子を挙げることができ、さらに好ましくは CaMKII γ遺伝子を挙げることができる。 例えば、 GenBankに以下の Accession No.で登録されている遺伝子配列が利用できる ヒト CaMKII a Accession No. AF145710
ヒト CaMKII β Accession No. NM_172084
ヒト CaMKII y Accession No. L07044
ヒト CaMKII δ Accession No. AF071569
また、 GenBankには、 CaMKII遺伝子の各ァイソフォームにおける種々の変異体の 遺伝子配列も登録されており、これらの配列情報を利用することもできる。
[0106] ここで相補的なポリヌクレオチド (相補鎖、逆鎖)とは、 CaMKII遺伝子の塩基配列か らなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列にお!、て少なくとも連続した 15 塩基長の塩基配列を有するその部分配列 (ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう） に対して、 A： Tおよび G： Cといった塩基対関係に基づき、塩基的に相補的な関係 にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、力かる相補鎖は、対象とする正 鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリン ジェントな条件でハイブリダイスすることができる程度の相補関係を有するものであつ てもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、 Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, S an Diego CA)に示されるように、複合体或いはプローブと結合する核酸の融解温度（ Tm)に基づいて決定することができる。例えば、ハイブリダィズ後の洗浄条件として、 通常「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」程度の条件を挙げることができる。相補鎖は力かる条 件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダィズ状態を維持するものであることが好ま しい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダィズ条件としては「0.5 X SSC、 0.1%S DS、 42°C」程度、さらに厳しいハイブリダィズ条件としては「0.1 X SSC、 0.1%SDS、 65°C 」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象 の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖並びに該鎖と 少なくとも 90%、好ましくは 95%の相同性を有する塩基配列力 なる鎖を例示するこ とがでさる。
[0107] また、正鎖側のポリヌクレオチドには、前記 CaMKII遺伝子の塩基配列、またはその 部分配列を有するものだけでなぐ上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な 関係にある塩基配列力もなる鎖を含めることができる。
上記正鎖のポリヌクレオチドおよび相補鎖 (逆鎖)のポリヌクレオチドは、各々一本鎖 の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして 使用されてもよい。
[0108] また、本発明の CaMKII阻害剤としては、 CaMKII遺伝子の塩基配列において連続 する少なくとも 15塩基を有するポリヌクレオチドおよび Zまたは該ポリヌクレオチドに相 補的なポリヌクレオチドの一態様として、 CaMKII遺伝子に対する siRNA(small interferi ng RNA)を挙げることもできる。 siRNAとは、 RNAi (RNA干渉； RNA interference)で使 用する 21〜23塩基の二本鎖 RNAの総称である。 RNAiとは、細胞に導入された二本 鎖 RNAが、それと同じ配列を持つ遺伝子の発現 (タンパク質合成)を抑制する現象の ことであり、この方法は、標的遺伝子 (mRNA)を破壊することで発現を抑制する為、遺 伝子の機能解析に有効な方法として近年注目されて 、る。
[0109] CaMKII遺伝子に対する siRNAは、 CaMKII遺伝子（ α、 β、 β '、 γ、 δなどいずれ のァイソフォームでもよい）に関する前記の塩基配列情報 (GenBank等）を元に、公知 の方法で種々設計し、調製することができる。例えば、 siRNAの設計方法として、 Chal k et al., Improved and automated prediction of effective siRNA , Biochem Biophys Res Commun. 2004 ;319(1):264— 74、あるいは Reynolds et al., "Rational siRNA desig n for RNA interference", Nature Biotechnology 2004 ;22, 326-330に記載の方法を 用いることができる。また、インターネット上で利用可能な siRNA設計プログラム（例え は、 Cold spring Harbor Laboratory, siRNA sequence nnder , nttp://www.sinc.suny sb.edu/Stu/shilin/rnai.html など）を利用して適切な siRNAを設計することも可能であ る。このようにして設計し、調製した siRNAは、例えば実施例 16に例示したような試験 方法により、実際に CaMKII遺伝子発現を抑制する作用を有するか否かを確認するこ とがでさる。
[0110] 以上説明する CaMKII阻害剤は、自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤とし て、特に DMARDsと併用される自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤として有 用である。また CaMKII阻害剤は、上記に具体的に掲げる物質に特に限定されること なぐ下記に記載する本発明のスクリーング方法によって取得することも可能である。
[0111] 従って、本発明が対象とする自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤、特に D MARDsと併用される自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤には、
(1)上記の CaMKII阻害剤を有効量含有する製剤；並びに
(2)下記に記載するスクリーング方法によって取得される CaMKII阻害剤を有効量含 有する製剤；
がいずれも包含される。なお、ここで CaMKII阻害剤の有効量は、それを含有する自 己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤が結果として CaMKII阻害効果を発揮する ような CaMKII阻害作用物質の配合量であればよぐ特に制限されるものではない。ま た自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤は、 CaMKII阻害作用物質以外に薬 学的に許容される担体や各種の添加剤を含有して！/ヽてもよ ヽ。
[0112] 力かる担体や添加剤の種類、自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤の形態 、並びに自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤の用法 (投与形態、投与方法、 投与量）については、後述の (III)の欄で詳細に説明する。
[0113] II. 自己免疫疾唐、予防剤および/または '治療剤 (特に、 DMARDs の併用で有効な 自己免疫疾唐、予防剤および/または '治療剤)の有効成分のスクリーニング方法 本発明者らは、後述する実施例に示すように、 CaMKIIの機能発現を阻害すること によって自己免疫疾患の発症を抑制し、かつ Zまたは病態を改善することができると いう新たな知見を取得した。このことから、 CaMKII阻害剤は自己免疫疾患予防剤お よび Zまたは治療剤の有効成分として有用と考えられる。さらに本発明者らは、実施 例に示すように、 CaMKII阻害剤と DMARDsとを組み合わせて投与することにより、自 己免疫疾患に対して、それぞれ単独の効果力 は予測することができない顕著に優 れた予防効果および Zまたは治療効果を有すると 、う新たな知見を取得した。このこ とから、 CaMKII阻害剤は、 DMARDsと併用される自己免疫疾患予防および Zまたは 治療のための併用剤として、また、疾患修飾性抗リウマチ薬による自己免疫疾患予 防および Zまたは治療効果の増強剤として有用と考えられる。
本発明のスクリーニング方法は、かかる知見に基づいて開発されたものであり、被 験物質の中から CaMKII阻害剤を探索することによって、（i)単独使用でも有効な自 己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤、または (ii) DMARDsと併用される自己免 疫疾患予防および Zまたは治療のための併用剤、の有効成分を取得しょうとするも のである。
[0114] 本発明のスクリーニング方法が対象とする「CaMKII阻害剤」は、結果として CaMKII の機能発現 (機能発揮、作用）を阻害し得る物質であればよぐその作用機序を特に 限定するものではない。 CaMKII阻害作用として、具体的には、 1)活性ィ匕した CaMKII 酵素活性を阻害する作用、 2) CaMKIIの活性ィ匕を阻害する作用、 3)活性ィ匕した CaM ΚΠを不活性化 (脱リン酸化)する作用、及び 4) CaMKIIの発現又は分泌を阻害する 作用を挙げることができる。 CaMKII阻害剤は、力かる CaMKII阻害作用の少なくとも 1 つを有するものであればょ 、。
[0115] CaMKII阻害剤となり得る候補物質としては、核酸、ペプチド、蛋白質、有機化合物
(低分子化合物を含む）、無機化合物などを挙げることができる。本発明のスクリー- ング方法は、これらの候補物質となりえる物質または該物質を含む試料 (これらを総 称して「被験物質」という）を対象として実施することができる。さらに、候補物質を含 む試料 (被験物質)として、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、微生物培 養上清、及び菌体成分などを使用することもできる。
[0116] 本発明の「CaMKII阻害剤」は、薬学的に許容される限りいかなる構造のものでも良 ぐ以下に限定されないが、その好ましい具体例として例えば以下のものを挙げること ができる。
'式 1のイソキサゾール誘導体
式 1 :
[0117] [化 13]
N-O
A B
D
[式中、 A、 B、および Dは前記の項 [6]と同意義を表す]
•式 1のイソキサゾール誘導体の中で、より好ましいものとしては、前記の項 [7]、 [8] 、 [9]、 [10]、 [11]、 [12]、 [13]、 [14]、 [15]および [16]に記載した化合物を挙 げることができる。
•3-[(lS)-l-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-5- { [アミノ (モルフォリン- 4-ィル） メチレン]アミノ}イソキサゾール (化合物 (I) )
·Ν'-{3-[1-(2-フルォロ-ビフエ-ル -4-ィル) -ェチル]-イソキサゾール -5-ィル }-N,N- ジメチル-グァ-ジン塩酸塩 (化合物 (lb) )
• N-ェチル - Ν'-{3-[1-(2-フルォロ-ビフエ-ル -4-ィル) -ェチル]-イソキサゾール -5- ィル }-グァ-ジン塩酸塩 (化合物 (Ic) )
•4-[l-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-2- (メチルァミノ)チアゾール（化合物（I 1) )
• KN-93： N- (2- [N- [4-クロ口シンナミル]- N-メチルアミノメチル]フエ-ル)- N- (2-ヒド 口キシェチル) -4-メトキシベンゼンスルホンアミド
• 1- [1-ォキソ - 11- (5,6-ジヒドロ- 3-ィミノべンゾ [h]シノリン- 2(3H)-ィル)ゥンデシル]- 4- (2-ピリミジ-ル)-ピぺラジン
'配列 Lys-Lys-X-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Phe-Asp-Ala-Tyr (式中、 Xは Alaま たは Lysである。）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド
'配列 Lys- Lys- Ala- Leu- His- Arg- Gin- Glu- Ala- Va卜 Asp- Cys- Leuで示されるァミノ 酸配列を有するペプチド
[0118] 本発明のスクリーニング方法は、力かる被験物質の中から上記に掲げる CaMKII阻 害作用を指標として上記 CaMKII阻害作用の少なくとも 1つを有する物質を探索する ことによって実施される。斯くして選別取得される被験物質は、自己免疫疾患予防剤 および Zまたは治療剤の有効成分として有用であるとともに、 DMARDsと併用される 自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤の有効成分として有用である。
本発明のスクリーニング方法の具体的態様としては、限定されないが、例えば以下 に示す方法をあげることができる。
去 1
下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む、 CaMKII阻害剤のスクリーニング方法：
(a)被験物質と CaMKII酵素および基質とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた CaMKII酵素による基質のリン酸ィ匕レベルを測定し、該リン 酸ィ匕レベルを、被験物質を接触させな！/、対照酵素の上記リン酸ィ匕レベルと比較する 工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づいて、 CaMKIIの活性を阻害する被験物質を選択する 工程。
去 2
下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む、 CaMKIIの産生阻害作用を有する物質のスクリ 一ユング方法:
(a)被験物質と CaMKII発現細胞 (Jurkat細胞、 THP-1細胞など）を接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた CaMKII発現細胞内の CaMKII蛋白量を測定し (ウェスタン ブロッテイング法など）、該蛋白量を、被験物質を接触させない対照細胞内の上記蛋 白量と比較する工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づいて、 CaMKIIの産生を阻害する被験物質を選択する 工程。
她 3
下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む、 CaMKIIの遺伝子発現阻害作用を有する物質 のスクリーニング方法：
(a)被験物質と CaMKII発現細胞 (Jurkat細胞、 THP-1細胞など）を接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた CaMKII発現細胞内の CaMKII遺伝子発現量を測定し (ノ 一ザンブロッテイング、 RT-PCR法など）、該遺伝子発現量を、被験物質を接触させな い対照細胞内の上記遺伝子発現量と比較する工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づいて、 CaMKIIの遺伝子発現を阻害する被験物質を選 択する工程。
法 4
下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む、 CaMKIIの活性化阻害作用を有する物質のス クリーニング方法：
(a)被験物質と脱リン酸化 CaMKII酵素を接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた CaMKII酵素のリン酸ィ匕レベルを測定し、該リン酸化レベル を、被験物質を接触させな!/ヽ対照酵素リン酸化レベルと比較する工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づいて、 CaMKIIの活性化を阻害する被験物質を選択す る工程。
上記の方法 1〜方法 4において、スクリーニングの際の被験物質濃度、および「CaM ΚΠ阻害作用を有する」と判定するための判定基準は、適宜設定することができる。例 えば被験物質濃度としては、これに限定されないが、 100 M、 10 M、 1 M、 0.1 μ Μ、 0.01 Μ、 0.001 Μ、およびこれらの中間的な濃度 Μ、 3 /ζ Μ、 Μ、 0.5 Μ、 0.3 μ Μ、 0.2 μ Μなど）を挙げることができる。「CaMKII阻害作用を有する」と判定 するための判定基準としては、これに限定されないが、対照と比較しての CaMKIIの 阻害率力 例えば以下のものを挙げることができる。
(1)被験物質濃度 10 μ Μにお!/、て CaMKIIの阻害率が 30%以上；
(2)被験物質濃度 10 μ Μにおいて CaMKIIの阻害率が 40%以上；
(3)被験物質濃度 10 μ Μにおいて CaMKIIの阻害率が 60%以上；
(4)被験物質濃度 1 μ Μにおいて CaMKIIの阻害率が 40%以上；
(5)被験物質濃度 1 μ Μにおいて CaMKIIの阻害率が 60%以上；
(6)被験物質濃度 0.1 μ Μにおいて CaMKIIの阻害率が 40%以上； および
(7)被験物質濃度 0.1 μ Μにおいて CaMKIIの阻害率が 60%以上。
好ましい判定基準としては、上記基準の中で、例えば（1)、（2)、（3)、（4)または（ 5)が挙げられる。より好ましくは、（1)、（3)または (4)が挙げられる。さらに好ましくは 、（3)または (4)が挙げられる。
[0121] また、上記のスクリーニング方法において使用する CaMKIIは、 α、 β、 β γ、 δ などいずれのァイソフォームでもよいが、好ましくは CaMKII yまたは CaMKII δを挙げ ることができ、さらに好ましくは CaMKII yを挙げることができる。
[0122] 本発明における、 CaMKII阻害剤のスクリーニング方法は、上記態様には限定され ず、当業者の技術常識に基づいて適宜設計することが可能である。
[0123] 以上説明した、 CaMKII阻害剤のスクリーニング方法によって被験物質の中力も選 別された候補物質は、更に、例えばヒトの各種の自己免疫疾患を模倣した病態モデ ル動物を用いた薬効試験 (特に DMARDsとの併用薬効試験)や安全性試験に供する ことにより、より一層実用的な自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤 (特に、 DM ARDsとの併用に適した自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤）の有効成分と して取得することができる。
[0124] より具体的には、本発明のスクリーニング方法によって選別された候補物質につい て、自己免疫疾患の治療剤として有用かどうか、特にリウマチ等の慢性炎症に有効 力どうかは、関節リウマチの病態モデル動物（例えば、コラーゲン誘導性関節炎 [Tre ntham DE.Townes AS. ang AH:Autoimunity to typell collagens:An experimental mo del of arthritis J Exp Med 146:857-868,1977]、抗原誘導性関節炎、またはアジュバ ント！ ¾導†¾関節炎 [Pearson CM： Development of arthritis, periarthritis and penotitis in rats given adjuvant. Proc Soc Expe Biolo Med 91:95- 101, 1956]等のいずれかのマ ウスもしくはラット)を用いた薬効試験を行うことにより評価できる。
[0125] 特に、ラットのアジュバント関節炎モデルを用いることにより、当該候補物質につい て関節リウマチに対する抑制効果 (予防効果、治療効果)を詳細に評価することがで きる。ラットのアジュバント関節炎は、発症機序に Tリンパ球が関与し、関節の軟骨'骨 変化および線維化を主体に進行する実験的関節炎であり、慢性炎症の基礎的研究 および治療薬の薬効薬理研究における疾患モデルとして広く用いられて 、る。アジュ バント関節炎の病態は通常、（1)注射足のみが腫脹する非特異的 1次炎症期 (ピー ク: 4〜5日後）、（2)所属リンパ節内に活性化リンパ球が増加する誘導期 (期間： 5〜 9日）、（3)多発性関節炎が発症するアジュバント関節炎の増悪期（ピーク： 15〜17日 )、および (4)関節の変形'破壊を残し炎症が鎮静化する自然治癒期 (25日以降の期 間）のように進行する。注射足側はアジュバント感作による非特異的な 1次炎症も病 態の進行に関与しているのに対し、非注射足側は Tリンパ球の関与により発症し病態 が進行していくことから、より関節リウマチに近い現象がみられると考えられる。また、 薬物作用は、接種日から投与する予防効果と、関節炎が発症した後に投与を開始す る治療効果が検討されている。薬効評価の指標としては、（1)左右後肢それぞれの 容積、（2)薬物投与の前後に左右それぞれの後肢容積を測定し、投与前後の容積 差を算出することにより得られる浮腫量の変化、（3)軟 X線による骨の形態学的評価 、および (4)組織切片による病理学的評価などが一般的に用いられて 、る。
[0126] また、選別された候補物質につ!、て、多発性硬化症の病態モデル動物（例えば EA E発症誘導マウス)を用いた薬効試験を行うことにより、当該候補物質について多発 性硬化症に対する抑制効果 (予防効果、治療効果)を評価することができる。
[0127] 以上述べた、自己免疫疾患（関節リウマチ、多発性硬化症など)の病態モデル動物 を用いた薬効試験において、 DMARDsと併用投与する試験を行うことにより、当該候 補物質について DMARDsと併用した場合の自己免疫疾患予防および Zまたは治療 効果を評価することができる。
[0128] このようにして選別、取得された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化 学的合成、生物学的合成 (発酵)または遺伝子学的操作によって、工業的に製造す ることがでさる。
[0129] 以上のような本発明のスクリーニング方法を用いて選択される CaMKII阻害剤は、前 述の如き自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤の有効成分として、特に DMAR Dsとの併用剤として有用である。ここで自己免疫疾患としては、具体的には本明細書 の第 I章に記載する各種の疾病を任意に挙げることができるが、特に本発明が対象と する CaMKII阻害剤は、関節リウマチ、多発性硬化症、及び全身性エリテマトーデス、 好ましくは関節リウマチ、及び多発性硬化症、さらに好ましくは関節リウマチに対して 有効に使用することができる。
[0130] 本発明は、上記のスクリーニング方法により得られる CaMKII阻害剤を含有する、 D MARDsと併用される自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤を提供するもので ある。また、本発明には、併用剤、増強剤、キット、使用、方法等、他の実施態様も含 まれる力 他の態様については後述の (III)の欄で詳細に説明する。
[0131] III. a己 唐、チ防剤および/または '治療剤の开 および 去について
以下、本発明における自己免疫疾患予防および zまたは治療のための併用剤の 製造方法、投与形態、投与方法及び投与量等につき説明する。
[0132] 本発明における自己免疫疾患予防および Zまたは治療のための併用剤は、少なく とも一種の CaMKII阻害剤と、少なくとも一種の疾患修飾性抗リウマチ薬 (DMARDs)と を組み合わせてなる製剤であり、両者をそれぞれ単独で、又は、適宜薬理学的に許 容され得る担体もしくは賦形剤と混合した後に組み合わせてなる医薬であり、経口的 または非経口的に用いることができる。併用剤の形態としては、有効成分である CaM ΚΠ阻害剤と DMARDsとを、例えば（1)公知の製剤学的製造法に準じ、所望により適 宜製剤学的に許容され得る賦形剤等と共に単一の製剤に製造する、 (2)それぞれを 所望により製剤学的に許容され得る賦形剤等を用いて各製剤とし同時又は時差を設 けて組み合わせて使用（併用）する、又は（3)それぞれを常法により適宜賦形剤と共 にそれぞれ製剤化したものをセット (キット剤等)等としてもよい。本発明の製剤は、そ れぞれの化合物が別々に製剤化されている場合、本発明の目的が達成される限り、 製剤を別々に、同時に又は時間差をおいて、同一の投与対象に用いてもよぐ各製 剤の投与経路および投与回数は異なっていてもよい。本発明の自己免疫疾患予防 および Zまたは治療のための併用剤においては、有効成分のすべてが一製剤中に 含まれていてもよぐまた有効成分のそれぞれ又は一部が別々に製剤化されていて ちょい。
[0133] すなわち本発明には、自己免疫疾患の予防および Zまたは治療のための併用の 態様であって、限定されないが、以下に示すような態様が含まれる。
(1) CaMKII阻害剤および DMARDsを含有する予防剤および/または治療剤；
(2) DMARDsと併用するための、 CaMKII阻害剤を含有する予防剤および Zまたは治 療剤；
(3) CaMKII阻害剤を有効成分として含有する、 DMARDsによる予防および Zまたは 治療効果の増強剤； (4) CaMKII阻害剤を含む第 1の組成物、および疾患修飾性抗リウマチ薬を含む第 2 の組成物を含むキット；
(5) CaMKII阻害剤と併用するための、 DMARDsを含有する予防剤および Zまたは治 療剤； および
(6) DMARDsを有効成分として含有する、 CaMKII阻害剤による予防および Zまたは 治療効果の増強剤；
これらの態様において、予防剤は「予防用医薬組成物」と、治療剤は「治療用医薬 組成物」と、増強剤は「増強用医薬組成物」と、それぞれ言い換えることも可能である
[0134] また、上記種々の予防剤および Zまたは治療剤、増強剤、キット等を製造するため の CaMKII阻害剤および疾患修飾性抗リウマチ薬の一方、または両方を組み合わせ ての使用も本発明の態様として挙げられる。
さらに、 CaMKH阻害剤を疾患修飾性抗リウマチ薬と併用して投与することを特徴と する自己免疫疾患の予防および Zまたは治療方法も本発明の態様として挙げられる 。また、 CaMKII阻害剤を投与することを含む、疾患修飾性抗リウマチ薬による自己免 疫疾患予防および Zまたは治療効果の増強方法も本発明の態様として挙げられる。
[0135] CaMKII阻害剤が低分子化合物、ペプチドまたは抗体などの蛋白質である場合は、 これらの物質について通常用いられる一般的な医薬組成物（医薬製剤)の形態に調 製することができ、その形態に応じて経口または非経口的に投与することができる。 一般的には以下のような投与形態、及び投与方法が挙げられる。
[0136] 投与形態としては、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤及 びカプセル剤等の固形製剤や、溶液、懸濁液、乳液、シロップ及びエリキシルなどの 液剤などの形態を挙げることができる。これらの各種形態は、投与経路に応じて経口 投与剤の他、経鼻剤、経皮剤、直腸投与剤 (坐剤)、舌下剤、経膣剤、注射剤 (経静 脈、経動脈、経筋肉、皮下、皮内)や点滴剤等の非経口投与剤に分類することがで きる。例えば、経口投与剤としては、例えば錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カブ セル剤、溶液、懸濁液、乳液、及びシロップ等力 又は直腸投与剤や経膣剤としては 、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤などの形態を採ることができる。経皮剤としては、例 えばローション等の液剤の他、クリームや軟膏等の半固形剤の形態を採ることもでき る。
[0137] 注射剤としては、例えば溶液、懸濁液または乳剤等の形態を採ることができ、具体 的には無菌処理した水、水 プロピレングリコール溶液、緩衝化液、 0.4重量％濃度 の生理食塩水等を例示することができる。さらに注射剤は、液剤に調製した後、凍結 処理又は凍結乾燥処理されていてもよぐこれにより保存することができる。後者の凍 結乾燥処理で調製される凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶 解して使用される。
[0138] 上記の医薬組成物（医薬製剤）の形態には、当該分野で行われている通常の手法 により、 CaMKII阻害剤と薬学的に許容される担体を配合することによって調製される 。薬学的に許容される担体としては、賦形剤、希釈剤、充填剤、増量剤、結合剤、崩 壊剤、湿潤剤、滑沢剤及び分散剤などを例示することができる。また、さらに当該分 野において通常用いられる添加剤を配合することもできる。力かる添加剤は、調製す る医薬組成物の形態に応じて、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、増粘剤、 pH調 整剤、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤、香料、着色料、張度調節剤、キレート剤、界面活 性剤などの中から適宜選択して用いることができる。
[0139] CaMKII阻害剤が式 1で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容され る塩である場合には、 CaMKII阻害剤を含有する製剤として、例えば、特開平 11-2408 73、 WO 98/47880、特開 2000-186077等に記載の方法で製造することができる製剤 が挙げられる。また、化合物 (I)を含有する製剤は、例えば国際公開第 02Z092094 号パンフレット (対応 EP特許: EP 1374871 A1)に記載の方法で製造することもできる。
[0140] 上記の CaMKII阻害剤を含む製剤は、 DMARDsを含有する製剤と併用することがで きるが、例えば、 DMARDsを上記製剤に加えて配合した製剤とすることもできる。また 、両者を医師の処方箋に従って混合して医薬を製造することもできる。併用する場合 には、 CaMKII阻害剤と、 DMARDsとは、種々異なるルートにより同時にもしくは別々 に、または例えば同日に時間をずらして、または数日間〜数週間さらには数ケ月に わたり所定の間隔をおいて投与することができる。
[0141] これらの医薬組成物における CaMKII阻害剤の投与量や投与回数は、投与形態、 患者の疾患やその病状の程度、患者の年令、体重、一般的健康状態、性別、食事、 投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ等、あるいはその他の要因を考慮して決め られる。典型的には、 CaMKII阻害剤と DMARDsとの併用に関する個々の一日投与量 は、それらが単独で投与される場合の実態 (推奨臨床投与量)に対して最少推奨臨 床投与量の約 1Z50以上最大推奨臨床投与量以下の範囲である。例えば、 CaMKII 阻害剤の投与量として、通常は成人に対し 1日あたり有効成分の量として約 0. 0001 〜約 lOOOmgの範囲、好ましくは約 0. 001〜約 300mgの範囲、さらに好ましくは約 0. 1〜約 300mgの範囲を 1日 1回または数回に分けて投与することができる。好まし くは経口投与である。また、これらの投与量は、併用される DMARDsとの併用効果を 観察しながら、適宜減量することもできる。
[0142] CaMKII阻害剤が化合物（I)である場合は、成人に対し 1日あたり投与量として好まし くは約 20〜約 300mgの範囲を、より好ましくは約 30〜約 300mgの範囲を、さらに好 ましくは約 40〜約 240mgの範囲を、特に好ましくは約 80〜約 240mgの範囲を 1日 1回または数回に分けて経口投与することができる。投与回数は 1日 1回投与が好ま し ヽ。より具体的【こ ίま、 f列え if80mgを 1曰 1回、 120mgを 1曰 1回、また ίま 240mgを 1日 1回経口投与することができる。また、これらの投与量は、併用される DMARDsと の併用効果を見ながら、適宜減量することもできる。
[0143] CaMKII阻害剤と併用される疾患修飾性抗リウマチ薬 (DMARDs)としては、関節リウ マチの免疫異常を是正することによりリウマチ性炎症を鎮静化させて、寛解導入をす る薬物が挙げられる。具体的には、以下の薬物を挙げることができる。
レフルノミド (leflunomide : Lancet. 1999 Jan 23;353(9149):259- 66)
メソトレキサート (methotrexate： US 2512572)
D—ぺ-シラミン (D— penicillamine : Nature, 151, 107(1943》
ブシラミン (bucillamine : US 4305958)
サラゾスルファピリジン (salazosulfapyridine : Br Med J. 1980 Feb 16;280(6212):442-4 ; スルフアサラジン (sulphasalazine)とも呼ばれる）
ァクタリット (actarit : US 4720506)
口ベンザリット (lobenzarit :J Rheumatol. 1984 Oct;l l(5):615— 23) シクロフォスフアミド (cyclophosphamide : Naturwiss, 45, 64(1957))
クロラムブシル (chlorambucil： US 2944079)
ミゾリビン (mizoribine : US 3888843)
ァザチォプリン (azathioprine： US 3056785)
オーラノフィン (auranofin : US 3635945)
金チオマレイン酸ナトリウム (gold sodium thiomalate： Rheumatol Rehabil 1975 May; 14 (2):101-14)
金チォ硫酸 (aurotiosulfate)
金チォグルコース (aurothioglucose : Agents Actions 1976 Feb;6(l- 3):355- 63) シクロスポリン (cyclosporins： US 4117118)
ヒドロキシクロロキン (hydroxychloroquine： US 2546658)
クロ口キン (chloroquine : US 2233970)
タクロリムス (tacrolimus, FK506 : EP 184162)
エタネルセプ KEtanercept :Ann Pharmacother 1997 Nov;31(l l):1335- 8) インフリキシマブ (Infliximab : Lancet 1994 Oct 22;344(8930)： 1105-10)
アナキンラ (Anakinra: Expert Opin Investig Drugs. 2000 Jan;9(l):113— 27) ケリキシマブ (keliximab :J Rheumatol 2002 Feb;29(2):220-9)
ァダリムマブ（adalimumab, D2E7 :Ann Rheum Dis. 1999 Nov;58 Suppl 1:170-2) リツキシマブ（rituximab, IDEC-102 : Blood 1994 Jan;83(2):435-45, Blood 1997 Sep;9
0(6):2188-95)
ヒト型抗 IL- 6R抗体（MRA:Ann Rheum Dis. 2000 Nov;59 Suppl l:i21- 7)
[0144] これらの DMARDsの中で、好ましくはレフルノミド、メソトレキサートおよびサラゾスル ファピリジンを挙げることができる。さらに好ましくはメソトレキサートを挙げることができ る。
[0145] これらの DMARDsの使用においては、しばしば副作用が問題となる。副作用として は、例えば、肝障害、腎障害、胃腸障害、血液障害、または骨髄障害などが挙げら れる。より具体的には、例えば DMARDsとしてメトトレキサートまたはレフルノミドを選択 した場合、肝障害、血液障害、または骨髄障害を持った自己免疫疾患 (例えば、関 節リウマチ）患者には副作用のためメトトレキサートまたはレフルノミドは服用困難であ る。また、投与開始時にこれらの症状が無くとも、投与を継続する間にこれらの副作 用が発現し、これら DMARDs (メトトレキサートまたはレフルノミド）の投与継続が困難 になる力、投与量の減量を余儀なくされる、あるいは DMARDsの更なる増量が困難に なることも起こる。一方、本発明の CaMKII阻害剤（例えば、化合物（I)に代表される式 1のイソキサゾール誘導体）はこれらの副作用がないか少ないため、メトトレキサートま たはレフルノミドなどの DMARDsで十分な治療ができない上記の自己免疫疾患患者 には特に有効である。また、 CaMKII阻害剤と DMARDsとを併用することで、それぞれ の作用を相互に補完しあうことができるため、上記の副作用のために十分な自己免 疫疾患予防および Zまたは治療効果が得られる量の DMARDsが投与できない自己 免疫疾患患者に対し、 DMARDsと本発明の CaMKII阻害剤を併用することにより、単 剤投与の場合より DMARDsの投与量を低減した形で有効性 (予防および Zまたは治 療効果)を高めることができる。従って、本発明により、副作用が少なく有効性の高い 、総合的に優れた自己免疫疾患予防剤および Zまたは治療剤を提供することができ る。
[0146] DMARDsが低分子化合物、ペプチドまたは抗体などの蛋白質である場合は、これら の物質について通常用いられる一般的な医薬組成物（医薬製剤)の形態に調製する ことができ、その形態に応じて経口または非経口的に投与することができる。一般的 には以下のような投与形態、及び投与方法が挙げられる。
[0147] 投与形態としては、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤及 びカプセル剤等の固形製剤や、溶液、懸濁液、乳液、シロップ及びエリキシルなどの 液剤などの形態を挙げることができる。これらの各種形態は、投与経路に応じて経口 投与剤の他、経鼻剤、経皮剤、直腸投与剤 (坐剤)、舌下剤、経膣剤、注射剤 (経静 脈、経動脈、経筋肉、皮下、皮内)や点滴剤等の非経口投与剤に分類することがで きる。例えば、経口投与剤としては、例えば錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カブ セル剤、溶液、懸濁液、乳液、及びシロップ等力 又は直腸投与剤や経膣剤としては 、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤などの形態を採ることができる。経皮剤としては、例 えばローション等の液剤の他、クリームや軟膏等の半固形剤の形態を採ることもでき る。
[0148] 注射剤としては、例えば溶液、懸濁液または乳剤等の形態を採ることができ、具体 的には無菌処理した水、水 プロピレングリコール溶液、緩衝化液、 0.4重量％濃度 の生理食塩水等を例示することができる。さらに注射剤は、液剤に調製した後、凍結 処理又は凍結乾燥処理されていてもよぐこれにより保存することができる。後者の凍 結乾燥処理で調製される凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶 解して使用される。
[0149] 上記の医薬組成物（医薬製剤）の形態には、当該分野で行われている通常の手法 により、 DMARDsと薬学的に許容される担体を配合することによって調製される。薬学 的に許容される担体としては、賦形剤、希釈剤、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、 湿潤剤、滑沢剤及び分散剤などを例示することができる。また、さらに当該分野にお いて通常用いられる添加剤を配合することもできる。力かる添加剤は、調製する医薬 組成物の形態に応じて、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、増粘剤、 pH調整剤、乳 ィ匕剤、懸濁化剤、防腐剤、香料、着色料、張度調節剤、キレート剤、界面活性剤など の中力 適宜選択して用いることができる。
このような形態を有する医薬組成物は、目的とする疾患、標的臓器等に応じた適当 な投与経路により投与され得る。例えば、経口投与、あるいは静脈、動脈、皮下、皮 内または筋肉内に投与する力、又は病変の認められる組織そのものに直接局所投 与してもよいし、また経皮投与や直腸投与も可能である。
[0150] これらの医薬組成物における DMARDsの投与量や投与回数は、投与形態、患者の 疾患やその病状の程度、患者の年令、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時 間、排泄速度、薬物の組み合わせ等、あるいはその他の要因を考慮して決められる 。典型的には、 DMARDsと CaMKII阻害剤との併用に関する個々の一日投与量は、そ れらが単独で投与される場合の実態 (推奨臨床投与量)に対して最少推奨臨床投与 量の約 1Z50以上最大推奨臨床投与量以下の範囲である。例えば、 DMARDsの投 与量として、通常は成人に対し 1日あたり有効成分の量として約 0. 0001〜約 4000 mgの範囲、好ましくは約 0. 001〜約 3000mgの範囲、さらに好ましくは約 0. 1〜約 300mgの範囲を 1日 1回または数回に分けて投与することができる。また、投与サイ クルを 1週間として 1週間毎に 1回、または 2〜3回に分けて投与することもできる。
[0151] 個々の DMARDsの具体的な臨床投与量および用法としては、例えば以下のものが 挙げられる。レフノレノミドでは 1日当たり 5— 30mg、好ましくは 10— 20mgを 1日 1回 投与することができる。メソトレキサートでは 1週間当たり 5— 30mg、好ましくは 6— 25 mgを単回、または 2— 3回に分けて投与することができる。サラゾスルファピリジンで は 1日当たり 0. 5— 4g、好ましくは 1— 3gを 1日 1回、または 2— 3回に分けて投与す ることができる。いずれの剤も、経口投与が好ましい。これらの投与量は、併用される CaMKII阻害剤との併用効果を見ながら、適宜減量することもできる。
[0152] 本発明の併用薬は、さらに非ステロイド系抗炎症薬または副腎皮質ステロイド薬等 と併用することもできる。非ステロイド系抗炎症薬としては、具体的には、サリチル酸 系（アスピリン等）、アントラ-ル系（メフエナム酸、フルフエナム酸等）、インドール酢酸 系（インドメタシン、スリンダック、ァセメタシン等）、フエ-ル酢酸系（ジクロフエナック、 フェンブフェン等）、プロピオン酸系（イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン 、ナプロキセン、チアプロフェン等）、ォキシカム系（ピロキシカム、テノキシカム、アン ピロキシカム等）、ピラゾロン系（ケトフェン、ブタゾン等)等が挙げられる。副腎皮質ス テロイド薬としては、具体的にはデキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレド ニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンァセト -ド、ベクロメタゾン、フルオシノ -ド、フルオシノロンァセトニド、ハロブレドン等が挙 げられる。これらの化合物は、エステルイ匕されていてもよぐナトリウム塩等の塩の形 態であってもよぐ水和物等の溶媒和物であってもよい。
[0153] 本発明の「治療効果」とは、自己免疫疾患に対する治療作用のことを指す。前述し たように、 自己免疫疾患に対する治療作用とは、例えば、発症後その症状を軽減若 しくは改善する作用（症状緩和作用、症状改善作用）、病態の進行を抑制する作用（ 進行抑制作用）、病態の進展を抑制する作用（進展抑制作用）、または疾患を治癒 する作用（治癒作用）などが挙げられる。
[0154] 自己免疫疾患が関節リウマチである場合には、本発明の「治療効果」は、関節リウ マチ患者における慢性炎症の抑制効果、関節破壊の抑制効果、関節変形への進行 抑制効果および身体機能の改善効果等を指標として、その効果を判断することがで きる。
[0155] 関節リウマチ患者における「身体機能の改善」とは、滑膜の慢性炎症による関節の 疼痛'膨張などの関節症状を改善し、関節の破壊や変形を抑制することにより日常生 活動作能力が改善することをいう。 日常生活動作能力は、例えば、衣類着脱'身支 度、起立、食事、歩行、衛生、伸展、握力および活動を指標として評価することができ る。具体的には、例えば、患者による HAQ (Health Assessment Questionnaire) (Fries JF, et al., Arthritis Rheumatism, 23, p.137-145, 1980)を用いて評価することができ る。
[0156] また、関節リウマチにおける「治療効果」の評価のために、米国リウマチ学会による 改善基 φ (ACR20； Felson Dt et al. The American college of Rheumatology prelimin ary definition of improvement in rheumatoid arthritis., Arthritis Rheum. 1995, 38:p.7 27-735; 1996, 39:p.34- 40)を使用することができる。
来 ¾リウマチ学会による改善某準 (ACR20)： 以下の 1)および 2)で 20%以上の改善 が認められ、かつ、 3)-7)の 5項目のうち少なくともいずれか 3項目で 20%以上の改善が 認められた場合に、「米国リウマチ学会による基準 : 20%改善」（ACR基準 20%改善） とする。
1)疼痛関節数の減少
2)膨張関節数の減少
3)患者による疾患活動性の全般的評価
4)担当医による疾患活動性の全般的評価
5)患者による疼痛度評価
6)患者による身体機能評価
7) CRPまたは赤沈値
同様に、 1)および 2)で 50%以上の改善が認められ、かつ、 3)-7)の 5項目のうち少なく ともいずれか 3項目で 50%以上の改善が認められた場合に、「米国リウマチ学会による 基準: 50%改善」（ACR基準 50%改善）とする。また、 1)および 2)で 70%以上の改善が 認められ、かつ、 3)-7)の 5項目のうち少なくともいずれか 3項目で 70%以上の改善が認 められた場合に、「米国リウマチ学会による基準： 70%改善」（ACR基準 70%改善）と する。
[0157] また、 X線像による手 ·足の関節破壊の進行度を評価することにより、関節破壊抑制 効果を評価し、治療効果を判断することができる。評価方法としては、例えば Larsen スコアまたは Sharpスコアを用いることができる（Acta Radiologica Diagnosis 18: 481-4 91,1977 ; J Rheumatol 22(10): 1974-1975, 1995 ; Bailliere's Clinical Rheumatology: 1 0(3):435- 453, 1996)。
[0158] ACR基準 20%改善を満たす患者の割合、 ACR基準 50%改善を満たす患者の割合 、 ACR基準 70%改善を満たす患者の割合、または関節破壊抑制効果 (X線)等の評 価指標から任意に選択した指標を用い、 CaMKII阻害剤または DMARDs ヽずれかの 単独投与群 (またはその両方の群)の治療効果と併用投与群の治療効果を比較する ことにより、本発明の CaMKII阻害剤と DMARDsとの併用にカゝかる併用効果を評価す ることがでさる。
[0159] 本発明における「副作用によって、十分な自己免疫疾患予防および Zまたは治療 効果が得られる量の疾患修飾性抗リウマチ薬 (DMARDs)が投与できない自己免疫 疾患患者」とは、以下に限定されないが、例えば以下に述べる患者が挙げられる。
(1)通常用いられる当該 DMARDsの最大用量 (以下、「最大推奨臨床投与量」と称す る）を既に投与されているが、自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果として十分 な効果が得られて 、な 、患者；
(2)当該 DMARDsの投与を少量より開始し、効果を観察しながら用量を段階的に増 カロさせて来たが、副作用の発現により現在の用量より増量投与することができない患 者；
(3)—定用量 (この場合の用量は、最大推奨臨床投与量の場合、およびそれより低 用量の場合の両方の場合が考えられる）で当該 DMARDsの投与を継続してきたが、 前述のエスケープ現象 (投与継続により耐性を示し、効果減弱を示す状態）により十 分な自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果が得られなくなつている状態の患 者であり、副作用のためにこれ以上用量を増加できな!、患者；および
(4)当該 DMARDsの投与により引き起こされ易い副作用に関し、当該副作用が起こり やすい素因を持つ患者であって、当該 DMARDsの単剤投与では、効果が得られるた めの推奨投与量を投与することは副作用のために危険であると考えられる患者;など 具体的な DMARDsの副作用としては、前述したものが挙げられる。
[0160] これらの自己免疫疾患患者に対して、本発明の CaMKII阻害剤との併用投与を行う ことにより、 DMARDsの投与量を増カロさせることなぐ併用による優れた自己免疫疾患 予防および Zまたは治療効果を達成することが可能である。従って、副作用を軽減し た形で、優れた自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果を達成することが可能と なる。
[0161] 「十分な治療効果」とは、前述した種々の評価指標から選択される指標によって評 価可能であり、患者の疾患やその病状等、種々の要因により変わりうるが、例えば関 節リウマチの場合、前述の「米国リウマチ学会による基準 : 20%改善」、あるいは「米国 リウマチ学会による基準: 50%改善」などを具体的な基準として例示することができる
[0162] 本発明の以下の態様（1)および (2)において、「治療効果の合計を上回り」、および 「治療効果を上回り」の意味について、以下に具体的に説明する。
(態様 1)第 2医薬組成物と共に用いて自己免疫疾患に罹患した哺乳動物において 自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果を達成するための第 1医薬組成物であ つて、該効果は該第 1及び第 2医薬組成物を別々に投与することによって達成される 自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果の合計を上回り、該第 2医薬組成物は 疾患修飾性抗リウマチ薬を含み、該第 1医薬組成物は CaMKII阻害剤を含む組成物
(態様 2)第 2医薬組成物と共に用いて自己免疫疾患に罹患した哺乳動物において 自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果を達成するための第 1医薬組成物であ つて、該効果は該第 1及び第 2医薬組成物を別々に投与することによって達成される 自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果を上回り、該第 2医薬組成物は疾患修 飾性抗リウマチ薬を含み、該第 1医薬組成物は CaMKII阻害剤を含む組成物。
[0163] 例えば以下の 4群を比較対照する試験を想定する。グループ Aとグループ Cとの間 で、第 1医薬組成物の有効投与量 (有効成分の投与量）は等しぐグループ Bとダル ープ Cとの間で、第 2医薬組成物の有効投与量 (有効成分の投与量)は等しいものと する。
グループ P：薬物非投与群 (またはプラセボ投与群）
グループ A：第 1医薬組成物単独投与群
グループ B：第 2医薬組成物単独投与群
グループ C：第 1医薬組成物および第 2医薬組成物の併用投与群
この場合にお 、て、着目した特定の治療効果の指標 (仮に Eとする）に関し、グルー プ!3、 A、 Bおよび Cの指標 Eによる効果がそれぞれ E (P)、 E (A)、 E (B)および E (C) であるとき、前記「態様 1」における「治療効果の合計を上回り」とは、グループじでの 効果が、グループ Aでの効果とグループ Bでの効果の合計を上回ること、すなわち、 E (C) >E (A) +E (B)であることを言う。比較のために、通常は Eとして、薬物非投与 群 (またはプラセボ投与群）と比較した値、すなわち E (P) =0となるように標準化した 値を用いる。
一方、前記「態様 2」における「治療効果を上回り」とは、グループ Cでの効果が、グ ループ Aでの効果を上回り、かつ、グループ Bでの効果をも上回ること、すなわち、「 E (C) >E (A) かつ E (C) >E (B)であること」を言う。指標 Eとしては、定量的な指 標でも定性的な指標でもよい。定量的な指標としては、例えば前述の ACR基準 20% 改善を満たす患者の割合および ACR基準 50%改善を満たす患者の割合などが挙げ られ、定性的な指標としては、例えば前述の、 X線像による手 ·足関節破壊抑制効果 (スコアによる評価)などが挙げられる。
実施例
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により なんら限定されるものではな 、。
なお、実施例において、下記の化合物を使用した。
化合物（I)： 3-「(lS)-l-(2-フルォロビフエニル -4-ィル)ェチル 1-5- ί「ァミノ (モルフオリ ン -4-ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾール (例えば、特許第 3237608号明細書に記 載の方法に従って合成できる）
式 la : [化 14]
Figure imgf000073_0001
化合物（lb)： Ν'-ί 3-「1-(2-フルォロ-ビフ ニル -4-ィル)-ェチル 1-イソキサゾール- 5- ィル }-Ν,Ν-ジメチル-グァ-ジン塩酸塩 (例えば、特許第 3237608号明細書に記載 の方法に従って合成できる）
式 lb :
[化 15]
Figure imgf000073_0002
化合物（Ic)： N-ェチル -Ν'-ί 3-「1- (2-フルォロ-ビフエニル- 4-ィル)-ェチル 1-イソキ サゾール -5-ィルトグァ-ジン塩酸塩 (例えば、特許第 3237608号明細書に記載の 方法に従って合成できる）
式 lc :
[化 16]
Figure imgf000073_0003
HC1
化合物（Π) :4-「1-(2-フルォロビフ ニル -4-ィル)ェチル 1-2- (メチルァミノ)チアゾ' ル (例えば、特公平 4— 80035号公報に記載の方法に従って合成できる） 式 2 :
[化 17]
Figure imgf000074_0001
KN-93： N- (2- [N- [4-クロ口シンナミル]- N-メチルアミノメチル]フエ-ル)- N- (2-ヒドロキ シェチル) -4-メトキシベンゼンスルホンアミド (特開平 6— 293730号公報に記載の方 法に従って合成できる）
式 3 :
[0169] [化 18]
Figure imgf000074_0002
実施例 1
[0170] m ι caMKi蘭.害活件の檢射 ( ι)
被験物質は DMSOに溶解し、 CaMKII反応緩衝液 (50mM Tris- HC1： pH7.5, 10 mM MgCl , ImM Dithiothreitol(DTT)) (すべて NakalaiTesque社)で各種濃度に希釈した。
2
ラット由来の CaMKIIひ （最終濃度 0.75 μ g/ml) (Santa Cruz社)を被験物質存在下で CaMKII反応緩衝液に溶解した Autocamtide-2(R) (40 ^ M) (CALBIOCHEM社）およ び CaMKII活性化緩衝液 (1 mM CaCl , 1 μ Μ calmodulin) (NakalaiTesque社)と混合
2
し、さらに ATP (50 μ Μ) (NakalaiTesque社)をカ卩えることで反応を開始した。反応は 30 °Cで 5分間行い、その後、 SDS-PAGEサンプル緩衝液を加え、 5分間の boilingで反 応を停止した。反応液中の蛋白は 15% SDS-PAGEで分離し、 PVDF膜に blottingした 。 Autocamtide-2に取り込まれたリンは抗リン酸化セリン Zスレオ-ン抗体 (Santa Cruz 社)を反応させ、 ECLシステム (Amersham社)と NIH Image (http://rsb.info.nih.gov/nih -image/よりダウンロードできる）を用いて定量ィ匕した。
各被験物質の CaMKII阻害活性を表 1に示した。いずれの各被験物質も 1 /z Mある いは 10 M以上の濃度で CaMKIIの活性を阻害する作用を有することが明らかにな つた o
表 1.被験物質による CaMKII阻害作用
[0171] [表 1]
被験物質 濃度（μ Μ) 阻害率«)
化合物 ( I) 10 85
1 47
0. 1 39
化合物 ( I I) 10 92
1 62
0, 1 45
化合物 （ l b ) 10 71
1 42
0, 1 13
化合物 （〗 c ) 10 68
1 36
0. 1 11
KN-93 10 77
1 58
0, 1 25 実施例 2
[0172] 実施例 2 CaMKI蘭.害活件の枪討 (2)
CaMKII y遺伝子は、 GenBankの Accession No丄 07044の配列をもとに合成したプ ライマー 2種（5'— TC GGA TCC AGC ATG GCC ACC ACC GCC ACC TG— 3 配列 番号 4]、 5'-TA GAA TTC ACA CTG CAG CGG TGC GGC AGG 己列番号 5])と 、定法にしたがって調製した培養細胞 Jurket T細胞由来の cDNAを铸型として PCR法 によって調製した。調製した CaMKII γの遺伝子は、 BamHI,EcoRIで切り出して、 trans fer vectorの pFastBaclの MCSに導入した。この vectorをもとに発現ウィルスを作製、 増幅した。詳細は Bac- to- Bacバキュロウィルス発現システム (Invitrogen社)のマ-ユア ルに従った。発現した CaMKII γの精製は、文献記載の方法（Biochemical & Biophysi cal Research Communications. 173(2):578- 84, 1990)に準じて行った。即ち、発現細 胞を超音波によって破砕し、遠心操作で得た細胞可溶性画分から、最終濃度 60%の 硫安分画、カルモジュリンセファロース（Amasham Biosciences社）によるァフィ-ティ 一精製により調製した。発現の確認は、 y特異的抗 CaMKII抗体、 scl541 (SantaCruz 社）を用い、 western blotting法により行った。
ラット由来の CaMKII aに替えて、上記手順により調製したヒト CaMKII γを用い、他 の条件は実施例 1と同様にして被験物質の CaMKII γ阻害活性を測定した。
各被験物質の CaMKII阻害活性を表 2に示した。 KN-93は 1 M以上の濃度で、化 合物（I)は 10 M以上の濃度で、いずれも CaMKIIの活性を阻害する作用を有するこ とが明らかになった。
表 2. 被験物質による CaMKII阻害作用
[0173] [表 2]
被験物質 濃度（ μ 阻害率 «)
化合物 ( I) 30 57
10 33
1 7
KN-93 30 107
10 101
1 27 実施例 3
[0174] 実施例 3 Tリンパ球に針する作用
Tリンパ球を Phorbol 12- myristate 13- acetate (PMA)と Calcium Ionophore A23187 で刺激した時の IL-2産生に対する化合物（I)および KN-93の作用を評価した。
EL- 4細胞（マウス Tリンパ球系細胞株）を 10%仔ゥシ血清含有 Dulbecco's Modified E agle Medium (DMEM:GIBCO社）で培養し、実験に供した。 5 X 104個/ wellの割合で細 胞を 96穴プレートに播き込み、被験化合物を含む DMEM培地と刺激剤として PMAお よび A23187を含む DMEM培地を添カ卩し、 20時間培養した。被験化合物および刺激 剤の最終濃度は化合物（I)が 1-30 μ Μ、 ΚΝ- 93が 1-10 μ M、 PMA力^ 5ng/ml、 A2318 7が 250ng/mlとなるように調製した。培養後プレートを遠心し、マイクロピペットで上清 を回収した。上清中の IL- 2量を Enzyme- linked Immunosorbent Assay (ELISA)法で定 量した。定量方法はキット（MOUSE IL-2 Immunoassay; R&D Systems)の使用説明書 に従って実施した。
図 1に示す通り、化合物（I)および KN- 93は用量依存的に IL-2の産生を抑制した。 実施例 4
[0175] 実施例 4 マクロファージに対する作用
マクロファージをリポポリサッカライド (LPS)で刺激した時の IL-6産生に対する化合 物（I)および KN-93の作用を評価した。
J774A.1細胞（マウスマクロファージ細胞株）を 10%仔ゥシ血清含有 Dulbecco's Modif ied Eagle Medium (DMEM:GIBCO社）で培養し、実験に供した。 5 X 104個/ wellの割 合で細胞を 96穴プレートに播き込み、被験化合物を含む DMEM培地と刺激剤として LPSを含む DMEM培地を添加し、 24時間培養した。被験化合物および刺激剤の最終 濃度は化合物（I)が 1-30 μ Μ、 KN-93が 1-3 μ M、 LPSが 1 μ g/mlとなるように調製した 。培養後プレートを遠心し、マイクロピペットで上清を回収した。上清中の IL-6量を En zyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)法で定量した。定量方法はキット（MOUS E IL-6 Immunoassay; R&D Systems)の使用説明書に従って実施した。
図 2に示す通り、化合物（I)および KN- 93は用量依存的に IL-6の産生を抑制した。 実施例 5
[0176] 実施例 5 線維芽細胞の増殖に針する作用
線維芽細胞を basic fibroblast growth factor (bFGF)で刺激した時の細胞増殖に対 する化合物（I)および KN-93の作用を評価した。
L929細胞（マウス線維芽細胞株）を 10%仔ゥシ血清含有 MEMアール培地（E-MEM: GIBCO社)で培養し、実験に供した。細胞を血清不含の E-MEMに懸濁し 2 X 104個/ wellの割合で細胞を 96穴プレートに播き込み、 72時間培養した。被験化合物を含む E -MEM培地を添カ卩後 1時間培養し、刺激剤として Recombinant human FGF basic (bF GF)を含む E- MEM培地を添カ卩し 20時間培養した。各 wellに 5- bromo 2 ' -deoxyuridin e (Brd-U)溶液を添カ卩し、 37°Cにて更に 4時間培養した。細胞を固定し、取り込まれた Brd- Uを Cell proliferation ELISA system(Amersham)を用いて検出し、マイクロプレー トリーダーにて 450nmの吸光度を測定した。この吸光度の値を細胞増殖の指標とした 図 3に示す通り、化合物（I)および KN-93は用量依存的に線維芽細胞の増殖を抑 制した。 実施例 6
[0177] 実施例 6 ヒト滑膜由 細胞の に針する作用
ヒト滑膜細胞株 SW982細胞の増殖に対する化合物（I)および KN-93の作用を評価し た。
SW982細胞（ヒト滑膜細胞株； ATCCより入手）を FCS (SIGMA社製）含有 DMEM培地 (GIBCO社製)で培養し、実験に供した。 SW982を 96well平底プレートに無血清下で 4 X 104Zwellで播き込んだ。薬剤は細胞の播き込みと同時に添カ卩し、 200 ^ 1 / wellで 培養した。 18時間後に alamar blue(R) (BIOSOURCE社） 20 μ 1を各 wellに添カ卩し、更に 6 時間培養し、マイクロプレートリーダーにて各 wellの吸光度を測定した。吸光度は 570 nmと 600nmの 2波長で測定した。 Al = 570nmの吸光度 (細胞の入っている well)、 A2 = 600nmの吸光度 (細胞の入っている well)、 Bl = 570nmの吸光度 (培地のみの入ってい る well)、 B2 = 600nmの吸光度 (培地のみの入っている well)とした場合、（A1-A2) - (B1 -B2)の値を算出し、細胞数の指標として表示した。
図 4に示す通り、 CaMKII阻害剤である化合物（I)および KN- 93は用量依存的にヒト 滑膜細胞 SW982の増殖を抑制した。これらの結果は SW982の増殖の維持に CaMKII 活性が関与していることを示しており、化合物（I)および KN-93が CaMKII阻害によつ て SW982の細胞死を誘導して!/、ることを強く示唆して 、る。
実施例 7
[0178] M7 #糸田 の Hfeに するィ乍 ffl
破骨細胞の形成に対する化合物（I)および KN-93の作用を評価した。
コラーゲン関節炎を発症したマウスの罹患足を採取し、 10%仔ゥシ血清含有 a -ME M培地（GIBCO社）中で Dispase (合同酒造）および collagenase SI (新田ゼラチン）存 在下で 37°C、 5-6時間処理し、単分散細胞浮遊液を回収した。これを遠心、再懸濁に より洗浄し実験に供した。 2 X 104個/ wellの割合で細胞を 96穴プレートに播き込み、被 験化合物を含む a -MEM培地を添加し、 9日間培養した。培養後、 TRAP染色用キッ ト（Sigma社)を用い染色し、顕微鏡下でゥエルあたりの破骨細胞数を計測した。 TRAP 染色はキットの使用説明書に従って実施した。
図 5に示す通り、化合物（I)および KN- 93は用量依存的に破骨細胞の形成を抑制し た。
実施例 8
[0179] ms アジュバント謙 閗節炎に針する作用
アジュバント誘発関節炎モデルはラットに惹起される代表的な慢性炎症モデルであ り、抗炎症剤ゃ抗リウマチ剤の薬理評価に広く用いられている。そこで、このモデルを 用い化合物 (I)および化合物 (II)の効果を治療試験または発症予防試験で検討した 。治療試験では、薬物投与による浮腫抑制効果を検討するため、投与期間前後の後 肢容積の差を算出し、浮腫量の変化を検討した。発症予防試験では投与期間中、 経時的に後肢容積を測定し、長期間にわたる薬物の効果を検討した。なお、薬効評 価の指標として後肢容積または浮腫量を用いているが、浮腫量とはアジュバントを感 作していない正常の後肢容積からの増加分なので、どちらの指標もほぼ同義に用い ることがでさる。
(実験方法）
Mycobacterium butyricum (アジュバント）の流動パラフィン懸濁液（lmg/200 μ 1)を S Dまたは Lewisラット (共に雄性、 6週齢)の右側後肢足躕皮下に注入し関節炎を惹起 した。治療試験ではアジュバント注入後 17日目から、体重 100g当たり lmlの投与量に なるように調製したィ匕合物（I)または化合物（II)の 0.5%メチルセルロース懸濁液を 1 日 1回連続 5日間経口投与した。陽性対照として同様に調製したインドメタシン懸濁液 を投与した。投与直前および最終投与の 5時間後に水置換法にて左右それぞれの 後肢容積を測定し、投与直前の値と最終投与 5時間後の値との差を算出し浮腫量の 変化とした。発症予防試験ではアジュバントを注入した当日力ら 1日 1回連続 21日間 投与した。隔日に水置換法にて左右後肢容積を測定した。また化合物 (II)の発症予 防試験では対照として抗リウマチ薬 D-ぺ-シラミン懸濁液を同様に投与した。
尚、コントロールとして被験化合物を含まない 0.5%メチルセルロースのみを上記と 同様にして投与した。
[0180] (結果）
アジュバントを注入すると、 10日前後に左後肢 (非注射足）に関節炎を発症し、肢容 積は 17日目前後まで増大し、最大値に達する。そこで、化合物（I) (2.5-80mg/kg)を 1日 1回 5日間経口投与した場合の左後肢における浮腫量の変化を図 6に示した。化 合物（II) (10-50mg/kg)を 1日 1回 5日間経口投与した場合の左右後肢における浮腫 量の変化を図 7に示した。また、化合物（I) (2.5-80mg/kg)をアジュバント注入の当日 力ら 21日間経口投与した場合の左右後肢容積を図 8に示した。化合物（II) (50mg/k g)をアジュバント注入の当日力ら 21日間経口投与した場合の浮腫量を図 9に示した 。比較対照のため、陽性対照インドメタシン (0.5mg/kg)、 D-ぺ-シラミン (50mg/kg) およびコントロール群の結果も各図中に合わせて示した。
図 6および図 7に示したように、アジュバント注入により引き起こされた左後肢の浮腫 が最大値に達して力 投与を開始する治療試験において、化合物 (I)およびィ匕合物 (II)投与群では、顕著な浮腫抑制効果がみられた。また、左後肢が浮腫を呈する前 に投与を開始する発症予防試験においても、図 8および図 9に示したように、化合物 (I)および化合物 (Π)は顕著な浮腫抑制効果を示した。
実施例 9
実施例 9 コラーゲン閣節炎マウスに針する作用
関節リウマチの動物モデルであるコラーゲン関節炎マウスを用いて、化合物 (I)の 薬効評価を行った。コラーゲン関節炎の惹起は常法に従った。すなわち、エーテル 麻酔下、マウス（DBAZlJ、雄性、 日本チャールズリバ一）の尾根部に 0.1mlのェマル ジョンを注入し初回免疫を行った。ェマルジヨンはゥシ II型コラーゲン溶液 (2mg/ml； コラーゲン研修会）とフロイント完全アジュバント (Difco)を等量混合し作製した。 3週 間後、同組成のェマルジヨンを 0.1ml尾根部に注入し追加免疫を行い、関節炎を惹 起した。関節炎の程度は次の基準に従 、スコアで表示した。
0 ：無症状
1 : 2関節以下の腫脹
2 ： 3関節以上の腫脹/手足の軽度の発赤 ·浮腫
3 ： 3関節以上の腫脹/手足の中度の発赤 ·浮腫
4 ：手足の重度の発赤 ·浮腫/関節強直
各肢について 0-4点で評価する為、 1個体で取りうる最大スコアは 16となる。
化合物（I)および陽性対照のプレドニゾロンは 0.5%メチルセルロース溶液に懸濁し、 マウスの体重 10 g当たり 0.1 mlを経口投与した。対照群には 0.5%メチルセルロース溶 液のみを経口投与した。投与は初回免疫と同時に開始し、 1日 1回、 35日間連日実 施した。
その結果を、図 10および図 11に示す。対照群のマウスは 10匹中 9匹が関節炎を発 症し、その程度も重篤であった。一方、化合物 (I)を投与したマウスでは用量依存的 に発症を抑制し、関節炎の程度も軽微であった。
実施例 10
mw ,験 アレルギー' に するィ乍
多発性硬化症の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎マウスを用いて κ
N-93の薬効評価を行なった。実験的アレルギー性脳脊髄炎の惹起は Bradleyらの方 法 (J. Clinical Investigation, 107: 995-1006, 2001)に従った。すなわち、 7週齢の雌 性 SJL/Jマウス (チャールズリバ一より購入)の背後部皮下に Freund完全アジュバント に混和した PLP部分ペプチド（PLP ： NH -HSLGKWLGHPDKF-COOH；配列番
139-151 2
号 12) 150 gを注射した。症状の重篤さの程度は次の基準に従いスコア (病態スコア )で表示した。
0 ：無症状
0. 5 ：尾の軽い麻痺
1 ：尾の麻痺
2 ：軽度の後肢の麻痺
3 ：中程度から強度の後肢の麻痺、あるいは軽度の前肢の麻痺
4 ：完全な後肢の麻痺、あるいは中程度から強度の前肢の麻痺
5 ：四肢の麻痺あるいは死線期にある
6 ：死亡
KN- 93は 0.5%メチルセルロース溶液に懸濁（0.1mg/ml)し、マウスの体重 10 g当たり 0.1 mlを皮下投与した。対照群には 0.5%メチルセルロース溶液のみを皮下投与した。 投与は感作後 7日目から開始し、 1日 1回、 24日間連日実施した。
その結果を、図 12に示す。対照群のマウスは重篤な実験的アレルギー性脳脊髄炎 を発症し、試験期間中に 10匹中 7匹が神経麻痺により死亡した。一方、 KN-93(lmg/ kg)を投与したマウスも発症はした力 症状は対照群に比べはるかに軽ぐ死亡例は
10匹中 2匹であった。
実施例 11
m ,験的アレルギー件脳脊^!炎に針する作用
多発性硬化症の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎マウスを用いて 化合物 (I)の薬効評価を行なった。実験的アレルギー性脳脊髄炎の惹起は Bradleyら の方法 (J. Clinical Investigation, 107: 995-1006, 2001)に従った。すなわち、 7週齢 の雌性 SJL/Jマウス (チャールズリバ一より購入)の背後部皮下に Freund完全アジュ バントに混和した PLP部分ペプチド (PLP ) 150 μ gを注射した。症状の重篤さの
139-151
程度は次の基準に従いスコア (病態スコア）で表示した。
0 ：無症状
0. 5 ：尾の軽い麻痺
1 ：尾の麻痺
2 ：軽度の後肢の麻痺
3 ：中程度から強度の後肢の麻痺、あるいは軽度の前肢の麻痺
4 ：完全な後肢の麻痺、あるいは中程度から強度の前肢の麻痺
5 ：四肢の麻痺あるいは死線期にある
6 ：死亡
化合物（I)は 0.5%メチルセルロース溶液に懸濁してそれぞれ 8mg/ml (80mg/kg投与 群）、 4mg/ml (40mg/kg投与群）および 2mg/ml (20mg/kg投与群）の投与液を調製し、 マウスの体重 10 g当たり 0.1 mlを経口投与した。陽性対照としてのプレドニゾロン群で は、プレドニゾロンを 0.5%メチルセルロース溶液に懸濁して 0.3mg/mlの投与液を調製 し、マウスの体重 10 g当たり 0.1 mlを経口投与した。対照群には 0.5%メチルセルロース 溶液のみを皮下投与した。投与は感作日から開始し、 1日 1回、 40日間連日実施し た。 Normal群では、 PLP 感作および被験物質投与を共に行わなかった。
139-151
その結果を、表 3、図 13および図 14に示す。化合物（I)は、病態スコアをいずれの 投与量でも抑制し、その作用は用量依存的であった。また、対照群では全例 (9匹中 9匹）が発症し、試験期間中に 9匹中 4匹が神経麻痺により死亡したのに対し、化合物 (I)投与群では 80mg/kg投与群で 10匹中 1匹死亡した以外は死亡例がな力つた。プ レドニゾロンは発症を強く抑制した（10匹中 2匹のみ発症）が、対照群やィ匕合物 (I)投 与群とは異なり、発育による体重の自然増加を強く抑制した。この結果はプレドニゾロ ンの連続投与に伴う作用であり、慢性の病態に長期投与を行う場合の問題点となる。 即ち、 CaMKII阻害剤である化合物 (I)は、代表的なステロイドであるプレドニゾロン投 与群において見られた長期投与時の強い体重増加抑制を伴うことなぐ実験的ァレ ルギー性脳脊髄炎の病態重症化を用量依存的に抑制することが示された。
表 3.実験的アレルギー性脳脊髄炎マウスにおける効果
[0184] [表 3]
被験物質 用量 η 発症率 死亡率
(mg/kg)
対照群 9 9/ 9 4/ 9
Normal群 10 0/10 0/10
プレ ドニゾロン 3 10 2/10 0/10
化合物 ( I) 20 10 8/10 0/10
40 10 7/10 0/10
80 10 8/10 1/10 実施例 12
[0185] mi2 コラーゲン閗節炎 (CIA)マウス閗節炎罹唐、部における CaMKIIの 現
CIAマウスの関節炎罹患部の組織切片を作成し、免疫染色法により炎症部位にお ける CaMKII蛋白の発現を検討した。
CIAは常法により惹起した。すなわち、エーテル麻酔下、マウス (DBA/1J、雄性、日 本チャールズリバ一）の尾根部に 0.1mlのェマルジヨンを注入し初回免疫を行った。ェ マルジヨンはゥシ II型コラーゲン溶液（2mg/ml；コラーゲン研修会）とフロイント完全ァ ジュバント（Difco)を等量混合し作製した。 3週間後、同組成のェマルジヨンを 0.1ml尾 根部に注入し追加免疫を行い、さらに 4週間飼育した後、関節炎を発症したマウスの 後肢を採取し、 4%パラホルムアルデヒド中で固定した。固定した後肢から病理組織 標本を作製し免疫染色に用いた。免疫染色はべクタスティン (R) ABC-PO (ゥサギ IgG) キット（Vector社）を用い、一次抗体としてラビット抗 CaMKIIポリクローナル抗体（M-17 6 ; Santa Cruz Biotechnology)を 50倍希釈で用い、モイストチャンバ一内でー晚反応 させた。その他はキットの使用説明書に従って実施した。
図 15に示す通り、正常滑膜では CaMKII発現細胞はほとんど見られないが、滑膜炎 部位では CaMKII発現細胞が多数みられる。また図 16に示す通り、炎症の亢進した パンヌス（肉芽状組織）において、 CaMKII発現細胞が多数観察された。以上の知見 は、 CaMKIIがリウマチの病態形成に関与していることを示唆している。
実施例 13
[0186] mi3 B "の分解に針する作用の檢討
Tリンパ球を Phorbol 12- myristate 13- acetate (PMA)と Calcium Ionophore A23187 で刺激した時の I κ Β αの分解に対する化合物（I)および ΚΝ-93の作用を評価した。
EL- 4細胞（マウス Τリンパ球系細胞株）を 10%仔ゥシ血清含有 Dulbecco's Modified E agle Medium (DMEM:GIBCO社）で培養し、実験に供した。サブコンフルェントに増殖 した細胞を遠心回収し、 5 X 106cells/tubeとなるようにエツペンドルフチューブに分注 した。化合物（I) (final 30 μ Μ)または ΚΝ- 93 (final 10 μ M)を添加し 37°Cウォーターパ スでプレインキュベーションした後、 PMA (final 125ng/ml)および A23187 (final 1 μ g/ ml)で刺激した (total volume 500 μ 1)。刺激後 15分または 30分インキュベーションした 後、 ice cold Stop Solution(l X PBSゝ ImM Na VO、 5mM EDTA)lml添加し反応を停
3 4
止させた。遠心洗浄後、 TNE buffer(50mM Tris— HC1、 1% NP— 40、 20mM EDTA、 100 μ g/ml PMSF、 30 μ 1/ml Aprotininゝ ImM Na VO、 5mM NaFゝ 12mM β -glycerolpho
3 4
sphate)で溶解した。 12% SDS-PAGE後、タンパクを PVDF membraneに転写し、抗 I κ 8 0；抗体 -21、 Santa Cruz社)を用いて western blottingを行った。
図 17に示す通り、化合物（I)および KN-93は I κ Β αの分解を抑制した。 実施例 14
[0187] mi4 サイクリン DIの 現および Aktのリン酸化に針する作用の檢討
線維芽細胞を basic fibroblast growth factor (bFGF)で刺激した時のサイクリン Dlの 発現および Aktのリン酸化に対する化合物（I)および KN-93の作用を評価した。
L929細胞（マウス線維芽細胞株）を 10%仔ゥシ血清含有 MEMアール培地（E-MEM: GIBCO社)で培養し、実験に供した。細胞を血清不含の E-MEMに懸濁し 72時間培 養した。被験化合物を含む E-MEM培地を添加後 1時間培養し、刺激剤として Recom binant human FGF basic (bFGF)を含む E-MEM培地を添カロしさらに培養した。 RIPA bufferで細胞を溶解し、 total cell lysateを得た。 SDS- PAGE後、タンパクを PVDF mem braneに転 % "し、饥 cycliniHi体ま 7こは InAkt抗体 (共に Santa Cruz社) 用 ヽて western blottingを行った。
図 18および図 19に示す通り、化合物（I)および KN-93はサイタリン D 1の発現増強 を抑制し、 Aktのリン酸化も抑制した。
実施例 15
[0188] miB 件刺激による CaMKIIの
ヒト単球系細胞株である THP- 大日本製薬より購入)を実験に供した。 10%FCS (SI GMA)を含む RPMI1640培地（GIBCO)を用いて THP- 1細胞を 5xl05 cells/mlの濃度 に調製し、 24wellプレートの各 wellに 0.5mlずつ加えた。さらに、 10%FCS (SIGMA)を 含む RPMI1640培地（GIBCO)を用いて 4 μ g/mlに調製したリポポリサッカライド（LPS: Difco)と 400 U/mlに調製した IFN- γ (ナカライテスタ）をそれぞれ 0.25 1ずつ添カロし て培養を開始した。無刺激群には 10%FCS (SIGMA)を含む RPMI1640培地（GIBCO )のみを添加した。その後、経時的に細胞を回収し、 RIPA Bufferで細胞溶解液を調 製後、蛋白量測定キット（Bio-Rad Dc Protein Assay: BIO RAD)を用いて蛋白量を定 量した。細胞溶解液 50 gを 8-16%グラジュェントゲル (旭テクノグラス）に添カ卩して SDS -PAGEを行なった。 PVDFメンブレンへトランスファー後、ブロッキング剤 (ECL Blocki ng agent: Amersham)を 1時間反応させ、その後、 1次抗体である抗 CaMKII γ抗体（S anta Cruz)あるいは抗 CaMKII δ抗体（Santa Cruz)を 500倍にブロッキング剤で希釈 したものを 1時間室温で反応させた。メンブレンを洗浄後、 2次抗体である horseradish i peroxidase標識抗ャギ IgG抗体 (Amersham)をブロッキング剤で 2000倍に希釈したも のを 40分間反応させた。その後、メンブレンを洗浄し、 ECL Plus (Amersham)を用いて メンブレンにプロットされた蛋白を検出した。
結果を図 20に示す。 THP-1細胞において、炎症性刺激により CaMKIIの発現が誘 導されることが明ら力となった。
実施例 16
[0189] 実施例 16 ヒト滑膜由 細胞の に針する siRNAの作用 CaMKIIと自己免疫疾患の関連をより明確にするため、 CaMKII配列に特異的な siR NAを設計、作製し、ヒト滑膜由来細胞株である SW982細胞を用いて CaMKII配列特異 的 siRNAの影響を検討した。
1. CaMKII配列特異的 siRNA(small interfering RNA)の設計、及び作製
CaMKII配列特異的 siRNAとして、 CaMKII y遺伝子（GenBank Accession No丄 0704 4)の塩基配列情報に基づき、表 4に示す 3種の特異的な siRNA配列を設定し、セン ス鎖とアンチセンス鎖により二本鎖が形成された siRNAを日本バイオサービス社より 購入した（3種の siRNAを、以下 CaMKII γ siRNA(A)、（B)および (C)と称する）。
表 4. CaMKII y siRNAの配列
siRNA名 配列 配列番号 位置
(A)センス鎖 5'- CGU GAG GCU CGG AUA UGU CdTdT- 3' 6 199-217
(A)アンチセンス鎖 5'- GAC AUA UCC GAG CCU CAC GdTdT- 3' 7
(B)センス鎖 5'- CAU CCA AAC AUC GUG CGC CdTdT- 3' 8 229-247
(B)アンチセンス鎖 5'- GGC GCA CGA UGU UUG GAU GdTdT- 3' 9
(C)センス鎖 5'- GCA GAU GCC AGC CAC UGU AdTdT- 3' 10 352-370 (C)アンチセンス鎖 5'- UAC AGU GGC UGG CAU CUG CdTdT- 3' 11
(「位置」は、 GenBank Accession No丄 07044に登録されている CaMKII γ配列中の位 置番号を表す。 )
コントロールとして哺乳類に存在しな 、配列で作製された siRNAである Scramble II Duplex (DHARMACON)を用いた。
2. CaMKII y 発現抑制による細朐增殖に対する効果
SW982細胞（ATCCより入手）は FCS (SIGMA)含有 DMEM培地 (GIBCO)で培養し、 実験に供した。この細胞を 24wellプレートに lxlO5 cell/well添カ卩し、 24時間後に、 CaM KII y siRNA 3 μ l(60pmol)および Gene ilencer (t^ene Therapy systems, Inc) 10.5 μ 1 を各 wellに加えた。
siRNAの導入効率を検討するために、蛍光を標識した siRNAである Fluorescein Lab eled Luciferase GL2 Duplex (DHARMACON)を CaMKII γ siRNAの代わりに添カ卩した 。 24時間の培養後、 siRNAの導入効率は細胞内に取り込まれた Fluorescein Labeled Luciferase GL2 Duplexをフローサイトメーターで測定した。また、細胞内の CaMKII量 は siRNAの導入 3日後に細胞を回収し、 RIPA Bufferで細胞溶解液を調製後、蛋白量 測定キット（Bio-Rad Dc Protein Assay: BIO RAD)を用いて蛋白量を定量し、 50 g を 8-16%グラジュェントゲル（旭テクノグラス）に添カ卩して SDS-PAGEを行った。 PVDFメ ンブレンへトランスファー後、ブロッキング剤 (ECL Blocking agent: Amersham)を 1時 間反応させ、その後、 1次抗体である抗 CaMKII γ抗体（Santa Cruz)を 500倍にブロッ キング剤で希釈したものを 1時間室温で反応させた。メンブレンを洗浄後、 2次抗体で ある horseradishi peroxidase標識抗ャギ IgG抗体 (Amersham)をブロッキング剤で 2000 倍に希釈したものを 40分間反応させた。その後、メンブレンを洗浄し、 ECL Plus (Ame rsham)を用いてメンブレンにブロットされた蛋白を検出した。
細胞の増殖は Alamar Blue(R)の取り込みを指標に測定した。すなわち、 siRNAを導 入後に 3日間細胞を培養し、血清を含まない DMEM培地に交換してさらに 24時間培 養した。その後、 Alamar Blue(R)を各 wellに添加し、 1時間後に蛍光光度計で蛍光強 度を測定した (励起： 544nm、波長: 590nm)。
その結果、本実験の条件下では約 80%の細胞に siRNAが導入されることが確認され た（図 21および図 22)。 3種類の siRNAの効果を CaMKII γの発現量で検討した結果 を図 23に示した。 SW982細胞では CaMKII γの発現が認められた力 （Α)配列の siRN Aを細胞内に導入することで CaMKII γの発現抑制が観察された。また、（Α)配列の siR NAを導入した細胞のみで増殖の抑制が認められた（図 24)。
3.考察
上記に記載した通り、 CaMKII阻害剤である化合物 (I)または KN-93を添加するとヒト 滑膜由来細胞 SW982の細胞増殖がほぼ完全に抑制されること（実施例 6)、および、 CaMKII γの発現を抑制する siRNAである CaMKII γ siRNA(A)を導入した SW982では 細胞増殖が抑制されること (本実施例）より、 SW982の細胞増殖には CaMKII γの発現 が深く関与していることが明ら力となった。このことは、 CaMKII yの発現を抑制、また は活性を阻害することにより、滑膜細胞の異常増殖が抑制され、よって関節リウマチ 等の疾患における関節の病態改善 (慢性炎症の抑制、関節破壊の抑制、関節変形 への進行抑制など）が達成されることを示している。
実施例 17
[0190] ¾施例 ί7 アジュバント謙 閗節炎に針する併用効菜
アジュバント誘発関節炎モデルはラットに惹起される代表的な慢性炎症モデルであ り、抗炎症剤ゃ抗リウマチ剤の薬理評価に広く用いられている。そこで、このモデルを 用いて、 CaMKII阻害剤である 3-[(lS)-l-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-5-{[ ァミノ (モルホリン- 4-ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾール（化合物（I) )と DMARDs (レフ ルノミドおよびサラゾスルフアビリジン）との併用効果を検討した。
(実験方法）
Mycobacterium butyricum (アジュバント）の流動パラフィン懸濁液（lmg/200 μ 1)を L ewisラット (雄性、 6週齢)の右側後肢足躕皮下に注入し関節炎を惹起した。アジュバ ント注入後 17日目から、体重 100g当たり 0.5mlの投与量になるように調製した化合物（ I) (10mg/kg)および DMARDs (レフルノミド（5mg/kg)またはサラゾスルフアビリジン（40 0mg/kg) )の 0.5%メチルセルロース懸濁液を単独または併用で 1日 1回連続 5日間経 口投与した。投与直前および最終投与の 5時間後に水置換法にて左後肢容積を測 定し、差を算出し浮腫量の変化とした。尚、コントロールとして被験化合物を含まない 0.5%メチルセルロースのみを上記と同様にして投与した。
[0191] (結果）
アジュバントを注入すると、 10日前後に左後肢 (非注射足）に関節炎を発症し、肢容 積は 17日目前後まで増大し、最大値に達する。そこで、化合物 (I)と DMARDsの代表 例としてレフルノミドまたはサラゾスルフアビリジンとを併用投与した場合の浮腫量の 変化を図 25および図 26に示した。比較対照のため、化合物 (I)単独投与群、 DMAR Ds単独投与群、およびコントロール群の結果も各図中に合わせて示した。
図 25および図 26に示したように、アジュバント注入により弓 Iき起こされた左後肢の 浮腫が最大値に達して力 投与を開始する試験において、化合物 (I)と DMARDsの 併用投与群では、化合物 (I)単独または DMARDs単独投与群に比べて顕著な浮腫 抑制効果がみられた。
実施例 18
[0192] ¾施例 ί8 アジュバント謙 閗節炎に針する併用効菜
実施例 17と同様にして、化合物 (I)と DMARDs (メソトレキサート）との併用効果を検 B、Jした。
(実験方法）
実施例 17と同様にしてアジュバント誘発関節炎を惹起したラットに対して、アジュバ ントを注入した当日力も DMARDs (メソトレキサート（0.060mg/kgまたは 0.045mg/kg;0. 5%メチルセルロース懸濁液)）の投与を開始し、 1日 1回連続 21日間経口投与した。 感作後 10日目から化合物 (I) (10mg/kg)を単独または併用で 1日 1回連続 12日間経 口投与した。隔日に水置換法にて左後肢容積を測定した。尚、コントロールとして被 験化合物を含まない 0.5%メチルセルロースのみを上記と同様にして投与した。
[0193] (結果）
DMARDsの代表例としてメソトレキサート（0.060mg/kg、 0.045mg/kg)をアジュバント 注入の当日から投与し、 10日目から化合物 (I) (10mg/kg)を併用投与した場合の左 後肢容積を図 27および図 29に、左後肢の発症率を図 28および図 30にそれぞれ示 した。比較対照のため、化合物 (I)単独投与群、 DMARDs単独投与群、およびコント ロール群の結果も各図中に合わせて示した。
図 27および図 28に示したように、左後肢が浮腫を呈する前に DMARDsの投与を開 始する試験にぉ 、て、化合物 (I)単独投与群ではほとんど効果がみられな 、場合で も、 DMARDs単独投与群の発症予防効果、浮腫抑制効果と比べて、化合物 (I)と DM ARDsとの併用投与群の方が、顕著な発症予防効果、浮腫抑制効果を示した。さらに 、図 29および図 30に示したように、 DMARDs単独投与群でもほとんど効果がみられ ない用量と化合物 (I)を併用投与した場合でも、併用投与群は顕著な浮腫抑制効果 を示した。
実施例 19
[0194] 実施例 19 アジュバント誘発閣節炎に針する併用効果 実施例 17と同様にラットアジュバント誘発関節炎に対する併用効果を検討した。 (実験方法）
実施例 17と同様の方法によって関節炎を惹起し、アジュバントを注入した当日から 、体重 100g当たり 0.5mlの投与量になるように調製した化合物（I)および DMARDsの 代表例としてのメソトレキサートの 0.5%メチルセルロース懸濁液を単独または併用で 1日 1回連続 17日間経口投与した。投与直前および最終投与後に水置換法にて左後 肢容積を測定し、さらに左後肢容積増加量の AUC (投与期間中の各時点の値に対 する群分け時の値の差を時間に対してプロットした曲線の曲線下面積)を求めた。ま た、左後肢 (非注射足)および右後肢 (注射足)の関節破壊を X線により測定し、これ を評価指標として併用効果を評価することも可能である。
(結果）
化合物 (I) (20mg/kg)とメソトレキサート（0.060mg/kg)とを併用投与した場合の浮腫 量 (左後肢容積の増加量、即ちその時点の容積と群分け時の容積の差で示した)の 変化、および左後肢の発症率を図 31および図 32に示した。同様に、化合物 (I) (40 mg/kg)とメソトレキサート（0.060mg/kg)とを併用投与した場合の結果を図 33および 図 34に、化合物 (I) (80mg/kg)とメソトレキサー H0.060mg/kg)とを併用投与した場 合の結果を図 35および図 36に示した。比較対照のため、化合物 (I)単独投与とメソト レキサート単独投与、およびコントロール群の結果も各図中に合わせて示した。さら に、各用量、単独投与および併用投与での左後肢容積増加量の AUC (投与期間中 の各時点の容積増加量を時間に対してプロットした曲線の曲線下面積)を図 37にま とめて示した。
図 31および図 32に示したように、アジュバント注入日力も投与する試験において、 化合物 (I) (20mg/kg)単独投与群は浮腫抑制効果を示し、メソトレキサート (0.060mg/ kg)単独投与群は発症予防効果および浮腫抑制効果を示したが、化合物 (I) (20mg/ kg)とメソトレキサートの併用投与群は各単独投与群に比較して顕著な浮腫抑制効果 を示した。また、図 33—図 36に示したように、化合物（1) (40および 80mg/kg)単独投 与群およびメソトレキサート (0.060mg/kg)単独投与群は!ヽずれも発症予防効果およ び浮腫抑制効果を示した力 この場合も化合物 (I) (40mg/kgおよび 80mg/kg)とメソト レキサート（0.060mg/kg)との併用投与群は、各用量の化合物 (I)単独投与群および メソトレキサート単独投与群のいずれと比較しても顕著な発症予防効果および浮腫 抑制効果を示した。さらに、図 37に示したように、左後肢容積増加量の AUCを指標 とした場合においても、化合物（I) (20、 40、および 80mg/kg)とメソトレキサート（0.060 mg/kg)との併用投与群が各用量の単独投与群に比較して顕著な浮腫抑制効果を 示すことが明らかとなった。
実施例 20
¾施例 20 アジュバント謙 閗 に針する ffl効 (閗 制効菜)
実施例 17と同様にラットアジュバント誘発関節炎に対する併用効果を検討した。 (実験方法）
実施例 17と同様の方法によって関節炎を惹起し、アジュバントを注入した当日から 、体重 100g当たり 0.5mlの投与量になるように調製した化合物（I)および DMARDsの 代表例としてのメソトレキサートの 0.5%メチルセルロース懸濁液を単独または併用で 1日 1回連続 17日間経口投与した。最終投与後に全てのラットについて、炭酸ガス高 濃度吸引による安楽死を実施した。両後肢を頸骨の中間部分より切断した。両後肢 は 10%中性緩衝ホルマリン液を用いて固定した。軟 X線写真を撮影し、関節部位の 構造をマイクロスコープを用いて観察した。関節破壊の程度をスコアで記録した。観 察部位は、脛骨 ·踵骨'足根骨の 3ケ所とし、とりうる最大のスコアは 12とした。 関節破壊スコア
0:正常
1：軽度の関節および骨破壊と軟骨の新生
2:中等度の関節および骨破壊と軟骨の新生ならびに軽度の化骨化
3:強度の関節および骨破壊と化骨化
4:著しい関節および骨破壊と変形ならびに強度の化骨化
(結果）
各用量 (化合物（I)は 1日当たり 20,40または 80mg/kg、メソトレキサートは 1日当たり 0 •06mg/kg)における単独投与および併用投与での右後肢関節破壊スコアを図 38に まとめて示した。また、コントロール群（図 39)、メソトレキサート単独投与群（0.06mg/k g;図 40)、化合物 (I)単独投与群 (40mg/kg;図 41)および化合物 (I) (40mg/kg) +メ ソトレキサート（0.06mg/kg)併用投与群（図 42)の 4つの群にっ 、て、関節炎ラット右 後肢の軟 X線写真を、各群のうち平均的なスコアを示した個体の代表的な例で示し た。
同様に、各用量における単独投与および併用投与での左後肢関節破壊スコアを 図 43にまとめて示した。また、コントロール群（図 44)、メソトレキサート単独投与群（0. 06mg/kg;図 45)、化合物（I)単独投与群 (40mg/kg;図 46)および化合物（I) (40mg/ kg) +メソトレキサート（0.06mg/kg)併用投与群（図 47)の 4つの群について、関節炎 ラット左後肢の軟 X線写真を、各群のうち平均的なスコアを示した個体の代表的な例 で示した。
図 38—図 47に示したように、アジュバント注入日力 投与する試験において、化合 物 (I)単独投与群は、左右両側後肢に対して用量依存的な関節破壊抑制効果を示 した。さらに、化合物 (I)は、メソトレキサート (0.06mg/kg)と併用投与することにより、メ ソトレキサートによる右後肢および左後肢の関節破壊抑制効果を用量依存的に、か つ顕著に増強した。とりわけ、化合物 (I) (80mg/kg) +メソトレキサート (0.06mg/kg)併 用投与群は、左後肢の関節破壊を完全に抑制し、極めて高い併用効果を示した。 以上のように、化合物 (I)とメソトレキサートの併用投与により、各単独投与に比較し て顕著に優れた関節破壊抑制効果が得られ、当該併用は関節リウマチの予防およ び Zまたは治療において顕著な有用性を示すことが明らかとなった。
以上に記載の実施例と同様にして、化合物 (I)と、メソトレキサート以外の DMARDs との併用投与試験を行うことにより、併用効果を確認することができる。
実施例 21
m2i T細胞に針する併用効巣
Tリンパ球を Phorbol 12- myristate 13- acetate (PMA)と Calcium Ionophore A23187 で刺激した時の IL-2産生に対する化合物 (I)とメソトレキサートの併用効果について 評価した。
(実験方法） EL- 4細胞（マウス Tリンパ球系細胞株）を 10%仔ゥシ血清含有 Dulbecco's Modified E agle Medium (DMEM:GIBCO社）で培養し、実験に供した。 5 X 104個/ wellの割合で細 胞を 96穴プレートに播き込み、被験化合物を含む DMEM培地と刺激剤として PMAお よび A23187を含む DMEM培地を添加し、 3日間培養した。被験化合物は、化合物 (I) とメソトレキサートの各単剤および併用とし、併用時の添加比率は化合物 (I)とメソトレ キサートを 10 : 1となるよう段階希釈調製した。刺激剤の最終濃度は PMAが 25nM、 A23 187が 250ng/mLとなるように調製した。培養後プレートを遠心し、マイクロピペットで上 清を回収した。上清中の IL- 2量を Enzyme- linked Immunosorbent Assay (ELISA)法で 定量した。定量方法はキット（MOUSE IL-2 Immunoassay; R&D Systems)の使用説明 書に従って実施した。
(Combination Indexの算出方法） Combination Index (CI)は以下の方法により算出 した。
fa/f = (D/Dm)m…式（Fl)
fa:薬剤による抑制率 (fa = 1-f) · · '式 (F2)
D:薬剤濃度
Dm:IC
50
m:薬剤濃度-曲線のパラメーター
式 (F1)と式 (F2)より、
(l-l)/f = (D/Dm) m · · '式（F3)
式 (F3)より、
D = Dm X ((1-D/Dl/m
= Dm X (fa/(l-fa))l/m · · '式（F4)
化合物 (I)、メソトレキサート (MTX)の単剤処理時、併用処理時の実験結果より、式 (F4)を用いてそれぞれの Dを求めた。
CI = Dcl/Dfl + Dc2/D12 + (Del X Dc2)/(Dfl X D12) · · '式（F5)
D1 :化合物 (I)の濃度
D2 :MTXの濃度
添え字 f:単剤 添え字 併用
式（F5)より CIを求め、 fa = 0.8における CIを用いて評価した。
CK1のとき相乗効果を、 CI=1のとき相加効果を、 CI〉1のとき拮抗をそれぞれ示す。 (結果）
図 48に示すように、 The SAS system Release 8.2 ( SAS Institute Inc. )を用いて求 めた fa=0.8 (80%阻害濃度）における CI値は、 0.368 ( 95%信頼区間： 0.144-0.619) であった。 このように、 T細胞からの IL-2産生における化合物 (I)とメソトレキサートを 併用した場合の抑制効果は有意に相乗的であることが示された (危険率 5%)。 実施例 22
m22 リウマチ唐、者に針する併用効菜
メソトレキサートによる治療においてメソトレキサートの効果がない、もしくは効果が 不十分と考えられる関節リウマチ患者に、メソトレキサートに加えて 1日 1回食後に化 合物 (I)を経口投与する。メソトレキサートの用量は、前治療と同用量とするか、また は 1週間当たり 6mg-25mgの範囲で患者の状態に合わせて選択される。化合物 (I)の 用量は、プラセボ、 80mg/日および 240mg/日とする（各群約 100症例)。投与期間は 4 8週間とするが、 24週目に規定の有効基準に達していない者は除外する (疼痛関節 数、膨張関節数または赤沈値のいずれかに 20%以上の改善が認められた場合を、 規定の有効基準に達したとする)。基準に達した者は、盲検を維持したまま 48週まで 投薬を続ける。投与開始 16週後または 24週後に、「米国リウマチ学会による基準 (AC R基準）： 20%改善」を満たす患者の割合をプラセボ、 80mg/日および 240mg/日群間 で比較することにより、化合物 (I)とメソトレキサートとの併用投与による有効性 (ィ匕合 物 (I)による、メソトレキサートの関節リウマチ治療効果の増強作用）が評価できる な お、本明細書の実施例において、 ACR基準の 3)患者による疾患活動性の全般的評 価、 4)担当医による疾患活動性の全般的評価、および 5)患者による疼痛度評価に ついては、視覚アナログスケール (VAS)により評価できる。「VAS (visual analog scale ；視覚アナログスケール）、 100mm」とは、評価者が、評価を 0から 100mmの線上に表 示することにより評価した指標であり、 0から 100までの整数で表される。線分の長さ は 100mm以外（例えば、 200mmなど）であっても良いが、本明細書で VAS (視覚アナ口 グスケール）とは、 0から 100までの範囲でスコア化したものを言う。
実施例 23
[0198] ¾ 列 23 リウマチ唐、者に針する併用効菜
メソトレキサートによる治療においてメソトレキサートの効果がない、もしくは効果が 不十分と考えられる関節リウマチ患者に、メソトレキサートに加えて 1日 1回食後に化 合物 (I)を経口投与する。メソトレキサートの用量は、前治療と同用量とするか、また は 1週間当たり 10mg-25mgの範囲で患者の状態に合わせて選択される。投与期間は 48週間とし、最初の 24週間は、化合物（I)の用量として、プラセボ、 120mg/日、 240mg /日（各群約 100例、合計約 300例）を二重盲検下で投与する。その後の 24週間は、非 盲検下 (オープン試験)で全ての被験者に 240mg/日を投与する。投与開始 24週後に 、「米国リウマチ学会による基準 (ACR基準）：20%改善」を満たす患者の割合をブラ セボ、 120mg/日および 240mg/日群間で比較することにより、化合物（I)とメソトレキサ ートとの併用投与による有効性 (ィ匕合物 (I)による、メソトレキサートの関節リウマチ治 療効果の増強作用）が評価できる
実施例 24
[0199] ¾ 列 24 リウマチ唐、者に針する併用効 (閗節 爐¾制効菜)
メソトレキサートによる治療歴においてメソトレキサートの効果がない、もしくは効果 が不十分と考えられる関節リウマチ患者に、メソトレキサートに加えて 1日 1回食後に 化合物 (I)を経口投与する。メソトレキサートの用量は、前治療と同用量とするか、ま たは 1週間当たり 6mg-25mgの範囲で患者の状態に合わせて選択される。化合物 (I) の用量は、プラセボ、 80mg/日および 240mg/日とする（各群約 100症例)。投与期間 は 48週間とするが、 24週目に規定の有効基準に達していない者は除外する (疼痛関 節数、膨張関節数または赤沈値のいずれかに 20%以上の改善が認められた場合を 、規定の有効基準に達したとする)。基準に達した者は、盲検を維持したまま 48週ま で投薬を続ける。投与開始 48週後に、 X線像による手'足の関節破壊の進行度を評 価することにより、関節破壊抑制効果を評価する。当該効果をプラセボ、 80mg/日お よび 240mg/日群間で比較することにより、化合物 (I)とメソトレキサートとの併用投与 による有効性 (化合物 (I)による、メソトレキサートの関節リウマチ治療効果の増強作 用）が評価できる。
実施例 25
[0200] ¾ 列 25 リウマチ唐、者に針する併用効 (閗節 爐¾制効菜)
メソトレキサートによる治療歴においてメソトレキサートの効果がない、もしくは効果 が不十分と考えられる関節リウマチ患者に、メソトレキサートに加えて 1日 1回食後に 化合物 (I)を経口投与する。メソトレキサートの用量は、前治療と同用量とするか、ま たは 1週間当たり 10mg-25mgの範囲で患者の状態に合わせて選択される。投与期間 は 48週間とし、最初の 24週間は、化合物（I)の用量として、プラセボ、 120mg/日、 240 mg/日（各群約 100例、合計約 300例）を二重盲検下で投与する。その後の 24週間は 、非盲検下 (オープン試験)で全ての被験者に 240mg/日を投与する。投与開始 24週 後および 48週後に、 X線像による手'足の関節破壊の進行度を評価することにより、 関節破壊抑制効果を評価する。当該効果をプラセボ、 120mg/日および 240mg/日群 間で比較することにより、化合物 (I)とメソトレキサートとの併用投与による有効性 (ィ匕 合物 (I)による、メソトレキサートの関節リウマチ治療効果の増強作用）が評価できる。
[0201] 上記記載した実施例（実施例 17〜25)より、 CaMKII阻害剤（例えばィ匕合物（I)等）と DMARDs (例えばメソトレキサート、サラゾスルフアビリジン、レフルノミドなど）との併用 により、それぞれ単独の効果からは予測することができない顕著に優れた自己免疫 疾患の予防効果および Zまたは治療効果が達成されること、即ち CaMKII阻害剤と D MARDsとの併用は自己免疫疾患の予防および Zまたは治療にぉ 、て顕著な有用性 を示すことが明らかとなった。
また、別途行ったラットおよびヒトの反復投与試験の結果より、化合物 (I)の血中濃度 (AUC)を等しくするためには、ラットでの投与量 5mg/kg (l日 1回経口投与）は、ヒトで の投与量 14.2〜18.8mgZ人（1日 1回経口投与）に相当することが判明している。従 つて、上記実施例における化合物 (I)のラットへの 1日投与量である 10〜80mg/kgは、 ヒトでの 1日投与量としては約 28〜約 300mgZ人に対応すると考えられる。
産業上の利用可能性
[0202] 本発明により、自己免疫疾患を予防および Zまたは治療するための優れた併用薬 を提供することができる。さらに本発明により、当該併用薬の有効成分となる候補物 質を探索し取得するために有用なスクリーニング方法を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0203] [図 1]マウス Tリンパ球系細胞株 EL- 4細胞を Phorbol 12- myristate 13- acetate (PMA) と Calcium lonophore A23187で刺激した時の IL-2産生量を示すグラフである。結果は 各群とも 6ゥエルの平均値と標準偏差で示す。化合物（I)添加群（1-30 μ Μ)、 ΚΝ-93 添加群（1-10 μ Μ)およびコントロール群の結果を示す。
[図 2]マウスマクロファージ細胞株 J774A.1細胞をリポポリサッカライド (LPS)で刺激し た時の IL-6産生量を示すグラフである。結果は各群とも 6ゥエルの平均値と標準偏差 で示す。化合物（I)添加群（1-30 μ Μ)、 ΚΝ-93添加群（1-3 μ Μ)およびコントロール 群の結果を示す。
[図 3]マウス線維芽細胞株 L929細胞を Recombinant human FGF basic (bFGF)で刺 激した時の細胞増殖を示すグラフである。細胞増殖の指標としてブロモデォキシゥリ ジン (Brd-U)の取り込みを波長 450nmの吸光度として測定した。結果は各群とも 6ゥ ルの平均値と標準偏差で示す。▲は化合物（I)添加群 (0.3-10 μ Μ)の結果を示す。 國は ΚΝ-93添加群（1-30 μ Μ)の結果を示す。〇は無刺激コントロール群の結果を示 す。參は刺激コントロール群の結果を示す。
[図 4]ヒト滑膜由来細胞である SW982細胞の増殖を示すグラフである。結果は各群とも
6ゥエルの平均値で示す。▲は化合物（I)添加群（1-30 μ Μ)の結果を示す。國は ΚΝ
-93添加群（1-30 μ Μ)の結果を示す。參はコントロール群の結果を示す。
[図 5]コラーゲン関節炎マウス関節炎罹患部由来細胞を培養した時の破骨細胞形成 数を示すグラフである。結果は各群とも 6ゥエルの平均値と標準偏差で示す。化合物（
I)添カ卩群（0.5-20 μ Μ)、 ΚΝ- 93添加群（0.3-5 μ Μ)およびコントロール群の結果を示 す。
[0204] [図 6]ラットのアジュバント誘発関節炎における左後肢の浮腫量の変化を示すグラフ である。結果は各群とも 10例の平均値と標準偏差で示す。化合物 (I)投与群 (2.5-80 mg/kg)、インドメタシン投与群（0.5mg/kg)およびコントロール群の結果を示す。
[図 7]ラットのアジュバント誘発関節炎における左右後肢の浮腫量の変化を示すダラ フである。化合物 (II)投与群（10-50mg/kg) (各群 7例の平均値と標準偏差)およびコ ントロール群 (8例の平均値と標準偏差)の結果を示す。
[図 8]ラットのアジュバント誘発関節炎における左右後肢容積の経日推移を示すダラ フである。グラフ中、〇は化合物（I) (2.5mg/kg)投与群の結果を示す。國は化合物（I ) (5mg/kg)投与群の結果を示す。口は化合物（I) (10mg/kg)投与群の結果を示す。 ▲は化合物 (I) (20mg/kg)投与群の結果を示す。△は化合物 (I) (40mg/kg)投与群 の結果を示す。參は化合物（I) (80mg/kg)投与群の結果を示す。◊はインドメタシン（ 0.5mg/kg)投与群の結果を示す。 Xは被験化合物非投与群 (コントロール群）の結果 を示す。 +は正常コントロール群の結果を示す。各群とも 10例の平均値で示す。 AU C値を用いて統計解析を行った。ウイリアムズの多重比較、片側検定において、化合 物 (I) (20mg/kg)投与群は右後肢容積 (pく 0.01)および左後肢容積 (pく 0.05)で有意、 化合物 (I) (40mg/kg)投与群およびィ匕合物 (I) (80mg/kg)投与群は、左右いずれの 後肢容積においても有意 (Pく 0.01)であった。また、 Studentの t検定、両側検定にお いて、インドメタシン (0.5mg/kg)投与群は、左右いずれの後肢容積においても有意（ p〈0.01)であった。
[図 9]ラットのアジュバント誘発関節炎における左右後肢浮腫量の経日推移を示すグ ラフである。グラフ中、參は化合物（II) (50mg/kg)投与群の結果を示す。 は0—ぺ ニシラミン (50mg/kg)投与群の結果を示す。〇は被験化合物非投与群 (コントロール 群）の結果を示す。各群 10-12例の平均値で示す。
[図 10]関節リウマチの動物モデルであるコラーゲン関節炎マウスを用いて化合物 (I) を試験した時の、関節炎発症率を示すグラフである。〇は化合物 (I) (5mg/kg)投与 群の結果を示す。△は化合物（I) (10mg/kg)投与群の結果を示す。口は化合物（I) ( 20mg/kg)投与群の結果を示す。▲は化合物（I) (40mg/kg)投与群の結果を示す。 國は化合物（I) (80mg/kg)投与群の結果を示す。 Xはプレドニゾロン (3mg/kg)投与 群の結果を示す。參は被験化合物非投与群 (コントロール群)の結果を示す。各群と も 10例の平均値で示す。ボンフェロー-補正フィッシャーの直接確率法による頻度検 定において、化合物（I) (5mg/kg)投与群 (pく 0.05)、化合物（I) (10,20,40および 80mg /kg)投与群 (pく 0.01)はいずれも有意差を示した。また、フィッシャーの直接確率法に よる頻度検定にぉ 、て、プレドニゾロン (3mg/kg)投与群は有意差を示した (pく 0.01) [図 11]関節リウマチの動物モデルであるコラーゲン関節炎マウスを用いて化合物 (I) を試験した時の、関節炎スコアを示すグラフである。〇は化合物（I) (5mg/kg)投与群 の結果を示す。△は化合物（I) (10mg/kg)投与群の結果を示す。口は化合物（I) (20 mg/kg)投与群の結果を示す。▲は化合物（I) (40mg/kg)投与群の結果を示す。國は 化合物（I) (80mg/kg)投与群の結果を示す。 Xはプレドニゾロン (3mg/kg)投与群の 結果を示す。參は被験化合物非投与群 (コントロール群)の結果を示す。各群とも 10 例の平均値で示す。シヤーリーウイリアムズの多重比較検定において、化合物（I) (5 mg/kg)投与群 (pく 0.05)、化合物（I) (10,20,40および 80mg/kg)投与群 (pく 0.01)は 、 ずれも有意差を示した。また、ウィルコクソン検定において、プレドニゾロン (3mg/kg) 投与群は有意差を示した (pく 0.01)。
[図 12]多発性硬化症の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎マウスを用 いて KN— 93を試験した時の、病態スコアを示すグラフである。 *は KN— 93 (lmg/ kg)投与群の結果を示す。參は被験化合物非投与群 (コントロール群）の結果を示す 。各群とも 10例の平均値で示す。
[図 13]多発性硬化症の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎マウスを用 V、て化合物（I)を試験した時の、病態スコアを示すグラフである。□は化合物（I) (20m g/kg)投与群の結果を示す。▲は化合物（I) (40mg/kg)投与群の結果を示す。國は 化合物（I) (80mg/kg)投与群の結果を示す。 Xはプレドニゾロン (3mg/kg)投与群の 結果を示す。參は被験化合物非投与群 (コントロール群）の結果を示す。 +は正常コ ントロール群の結果を示す。対照群は 9例、他の各群は 10例の平均値で示す。
[図 14]多発性硬化症の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎マウスを用 Vヽて化合物（I)を試験した時の、体重増加に及ぼす作用を示すグラフである。□は化 合物（I) (20mg/kg)投与群の結果を示す。▲は化合物（I) (40mg/kg)投与群の結果 を示す。國は化合物（I) (80mg/kg)投与群の結果を示す。 Xはプレドニゾロン (3mg/k g)投与群の結果を示す。參は被験化合物非投与群 (コントロール群)の結果を示す。 +は正常コントロール群の結果を示す。対照群は 9例、他の各群は 10例の平均値で 示す。 [0206] [図 15]CIAマウスの滑膜部位における CaMKIIの免疫染色の結果である。黒色に見え る細胞は CaMKII発現細胞を示して!/、る。
[図 16]CIAマウスのパンヌス（肉芽状組織）における CaMKIIの免疫染色の結果である 。黒色に見える細胞は CaMKII発現細胞を示して 、る。
[0207] [図 17]マウス Tリンパ球系細胞株 EL- 4細胞を Phorbol 12- myristate 13- acetate (PMA) と Calcium Ionophore A23187で刺激した時の細胞質内における I κ Β αの発現をゥェ スタンプロッテイングで検出した結果である。化合物（I) 30 μ Μ添加、 ΚΝ-93 10 μ Μ添 加およびコントロールの結果を示す。
[図 18]マウス線維芽細胞株 L929細胞を Recombinant human FGF basic (bFGF)で刺 激した時の細胞内におけるサイクリン Dlの発現をウェスタンブロッテイングで検出した 結果である。化合物（I)添カ卩 (1.25-20 μ Μ)、 ΚΝ- 93添カ卩（5-20 μ Μ)、無刺激コント口 ールおよび刺激コントロールの結果を示す。
[図 19]マウス線維芽細胞株 L929細胞を Recombinant human FGF basic (bFGF)で刺 激した時の細胞内におけるリン酸化 Aktおよび Aktの発現をウェスタンブロッテイング で検出した結果である。化合物（1) 20 M添加、 KN-93 20 M添加、無刺激コント口 ールおよび刺激コントロールの結果を示す。
[0208] [図 20]ヒト単球系細胞株 THP-1細胞を LPS+IFN γで刺激した時の、細胞内における CaMKII γおよび CaMKII δの発現をウェスタンブロッテイングで検出した結果である。
[図 21]蛍光標識 siRNAを用いて最適な導入条件を検討した際の、対照としてのトラン スフエクシヨンがな 、場合のフローサイトメーター解析の結果を示す。縦軸は細胞数 を表し、横軸は蛍光強度を Logスケールで表す。
[図 22]蛍光標識 siRNAを用いて最適な導入条件を検討した際の、最適な条件時 (siR NA 60pmol)のフローサイトメーター解析の結果を示す。縦軸は細胞数を表し、横軸 は蛍光強度を Logスケールで表す。
[図 23]ヒト滑膜由来細胞 SW982細胞に、 CaMKII γ siRNA(A)、（B)および (C)をそれぞ れ導入した時の CaMKII γの発現をウェスタンブロッテイングで検出した結果である。 図中の (Α)、（Β)および (C)は CaMKII γ siRNA(A)、（B)および (C)を、それぞれ導入した 場合の結果を示す。 SCは、コントロールとして Scramble II Duplex(SC)を導入した場 合の結果を示す。 Mockは、 siRNAを何も含まず導入用試薬だけでトランスフエクショ ンを行った場合の結果を示す。図中に、「CaMKII y→」で示したバンドが CaMKII y のバンドである。
[図 24]ヒト滑膜由来細胞 SW982細胞に、 CaMKII γ siRNA(A)、（B)および (C)をそれぞ れ導入した時の細胞増殖を示すグラフである。細胞増殖の指標として、 Alamar Blue (R)添加後、蛍光強度 (励起: 544nm、波長: 590nm)を測定した。図中の (A)、（B)および（ C)は CaMKII γ siRNA(A)、（B)および (C)を、それぞれ導入した場合の結果を示す。 S Cは、コントロールとして Scramble II Duplex(SC)を導入した場合の結果を示す。 Moc kは、 siRNAを何も含まず導入用試薬だけでトランスフエクシヨンを行った場合の結果 を示す。
[0209] [図 25]ラットのアジュバント誘発関節炎における左後肢の浮腫量の変化を示すグラフ である。グラフ中、 Aは化合物 (I) (10mg/kg)とレフルノミド (5mg/kg)との併用投与群の 結果を示す。 Bは化合物 (I)単独投与群（10mg/kg)の結果を示す。 Cはレフルノミド単 独投与群 (5mg/kg)の結果を示す。 Dは被験化合物非投与群 (コントロール群）の結 果を示す。各群とも 7例の平均値で示す。グラフ中のパーセントは浮腫抑制率を示す
[図 26]ラットのアジュバント誘発関節炎における左後肢の浮腫量の変化を示すグラフ である。グラフ中、 Aは化合物 (I) (10mg/kg)とサラゾスルフアビリジン (400mg/kg)との 併用投与群の結果を示す。 Bは化合物 (I)単独投与群（10mg/kg)の結果を示す。 ま サラゾスルフアビリジン単独投与群 (400mg/kg)の結果を示す。 Dは被験化合物非投 与群 (コントロール群）の結果を示す。各群とも 7例の平均値で示す。グラフ中のパー セントは浮腫抑制率を示す。
[0210] [図 27]ラットのアジュバント誘発関節炎における左後肢の容積の経日推移を示すダラ フである。グラフ中、◊は化合物 (I) (10mg/kg)とメソトレキサート（0.060mg/kg)との併 用投与群の結果を示す。〇は化合物 0)単独投与群（10mg/kg)の結果を示す。▲は メソトレキサート単独投与群 (0.060mg/kg)の結果を示す。■は被験化合物非投与群 (コントロール群)の結果を示す。口はアジュバント誘発関節炎を惹起しない正常動物 群 (正常コントロール群）の結果を示す。各群とも 8例の平均値で示す。 [図 28]ラットのアジュバント誘発関節炎における発症率の経日推移を示すグラフであ る。グラフ中、◊は化合物 (I) (10mg/kg)とメソトレキサー H0.060mg/kg)との併用投与 群の結果を示す。〇は化合物 0)単独投与群（10mg/kg)の結果を示す。▲はメソトレ キサート単独投与群 (0.060mg/kg)の結果を示す。■は被験化合物非投与群 (コント ロール群）の結果を示す。各群とも 8例の平均値で示す。
[図 29]ラットのアジュバント誘発関節炎における左後肢の容積の経日推移を示すダラ フである。グラフ中、◊は化合物 (I) (10mg/kg)とメソトレキサート（0.045mg/kg)との併 用投与群の結果を示す。〇は化合物 0)単独投与群（10mg/kg)の結果を示す。▲は メソトレキサート単独投与群 (0.045mg/kg)の結果を示す。■は被験化合物非投与群 (コントロール群）の結果を示す。口は正常コントロール群の結果を示す。各群とも 8例 の平均値で示す。
[図 30]ラットのアジュバント誘発関節炎における発症率の経日推移を示すグラフであ る。グラフ中、◊は化合物 (I) (10mg/kg)とメソトレキサー H0.045mg/kg)との併用投与 群の結果を示す。〇は化合物 0)単独投与群（10mg/kg)の結果を示す。▲はメソトレ キサート単独投与群 (0.045mg/kg)の結果を示す。■は被験化合物非投与群 (コント ロール群）の結果を示す。各群とも 8例の平均値で示す。
[図 31]ラットのアジュバント誘発関節炎における左後肢容積の増加量 (その時点の容 積と群分け時の容積の差)の経日推移を示すグラフである。グラフ中、♦は化合物 (I) (20mg/kg)とメソトレキサート（0.06mg/kg)との併用投与群の結果を示す。〇は化合 物 0)単独投与群 (20mg/kg)の結果を示す。△はメソトレキサート単独投与群 (0.06mg /kg)の結果を示す。國は被験化合物非投与群 (コントロール群）の結果を示す。口は 正常コントロール群の結果を示す。各群とも 10例の平均値で示す。
[図 32]ラットのアジュバント誘発関節炎における発症率の経日推移を示すグラフであ る。グラフ中、♦は化合物 (I) (20mg/kg)とメソトレキサート（0.06mg/kg)との併用投与 群の結果を示す。〇は化合物 0)単独投与群 (20mg/kg)の結果を示す。△はメソトレ キサート単独投与群 (0.06mg/kg)の結果を示す。■は被験化合物非投与群 (コント口 ール群）の結果を示す。口は正常コントロール群の結果を示す。各群とも 10例の平均 値で示す。 圆 33]ラットのアジュバント誘発関節炎における左後肢容積の増加量 (その時点の容 積と群分け時の容積の差)の経日推移を示すグラフである。グラフ中、♦は化合物 (I) (40mg/kg)とメソトレキサート（0.06mg/kg)との併用投与群の結果を示す。〇は化合 物 0)単独投与群 (40mg/kg)の結果を示す。△はメソトレキサート単独投与群 (0.06mg /kg)の結果を示す。國は被験化合物非投与群 (コントロール群）の結果を示す。口は 正常コントロール群の結果を示す。各群とも 10例の平均値で示す。
[図 34]ラットのアジュバント誘発関節炎における発症率の経日推移を示すグラフであ る。グラフ中、♦は化合物 (I) (40mg/kg)とメソトレキサート（0.06mg/kg)との併用投与 群の結果を示す。〇は化合物 0)単独投与群 (40mg/kg)の結果を示す。△はメソトレ キサート単独投与群 (0.06mg/kg)の結果を示す。■は被験化合物非投与群 (コント口 ール群）の結果を示す。口は正常コントロール群の結果を示す。各群とも 10例の平均 値で示す。
圆 35]ラットのアジュバント誘発関節炎における左後肢容積の増加量 (その時点の容 積と群分け時の容積の差)の経日推移を示すグラフである。グラフ中、♦は化合物 (I) (80mg/kg)とメソトレキサート（0.06mg/kg)との併用投与群の結果を示す。〇は化合 物 0)単独投与群 (80mg/kg)の結果を示す。△はメソトレキサート単独投与群 (0.06mg /kg)の結果を示す。國は被験化合物非投与群 (コントロール群）の結果を示す。口は 正常コントロール群の結果を示す。各群とも 10例の平均値で示す。
[図 36]ラットのアジュバント誘発関節炎における発症率の経日推移を示すグラフであ る。グラフ中、♦は化合物 (I) (80mg/kg)とメソトレキサート（0.06mg/kg)との併用投与 群の結果を示す。〇は化合物 0)単独投与群 (80mg/kg)の結果を示す。△はメソトレ キサート単独投与群 (0.06mg/kg)の結果を示す。■は被験化合物非投与群 (コント口 ール群）の結果を示す。口は正常コントロール群の結果を示す。各群とも 10例の平均 値で示す。
圆 37]ラットのアジュバント誘発関節炎における左後肢容積増加量の AUC (投与期 間中の各時点の容積増加量を時間に対してプロットした曲線の曲線下面積)グラフ である。グラフ中、♦は化合物 (I) (20mg/kg、 40mg/kg、 80mg/kg)とメソトレキサート（0. 06mg/kg)との併用投与群の結果を示す。〇は化合物 (I)単独投与群の結果を示す。 △はメソトレキサート単独投与群 (0.06mg/kg)の結果を示す。國は被験化合物非投 与群 (コントロール群）の結果を示す。□は正常コントロール群の結果を示す。
[0212] [図 38]ラットのアジュバント誘発関節炎における右後肢関節破壊スコアのグラフである 。結果は各群とも 10例の平均値と標準偏差で示す。正常コントロール群、被験化合 物非投与群 (コントロール群）、メソトレキサート (0.06mg/kg)単独投与群、化合物 (I) (2 0mg/kg、 40mg/kgおよび 80mg/kg)とメソトレキサート（0.06mg/kg)との併用投与群、 および化合物 (I) (20mg/kg、 40mg/kgおよび 80mg/kg)単独投与群の結果を示す。
[図 39]アジュバント誘発関節炎ラット右後肢の軟 X線像である。写真はコントロール群 群のうち平均的なスコアを示した個体の代表的な例である (スコア 10)。
[図 40]アジュバント誘発関節炎ラット右後肢の軟 X線像である。写真はメソトレキサー ト単独投与群 (0.06mg/kg)群のうち平均的なスコアを示した個体の代表的な例である (スコア 9)。
[図 41]アジュバント誘発関節炎ラット右後肢の軟 X線像である。写真は化合物 (I)単 独投与群 (40mg/kg)群のうち平均的なスコアを示した個体の代表的な例である (スコ ァ 5)。
[図 42]アジュバント誘発関節炎ラット右後肢の軟 X線像である。写真は化合物 (I) (40 mg/kg) +メソトレキサート（0.06mg/kg)併用投与群群のうち平均的なスコアを示した 個体の代表的な例である (スコア 2)。
[0213] [図 43]ラットのアジュバント誘発関節炎における左後肢関節破壊スコアのグラフである 。結果は各群とも 10例の平均値と標準偏差で示す。正常コントロール群、被験化合 物非投与群 (コントロール群）、メソトレキサート (0.06mg/kg)単独投与群、化合物 (I) (2 0mg/kg、 40mg/kgおよび 80mg/kg)とメソトレキサート（0.06mg/kg)との併用投与群、 および化合物 (I) (20mg/kg、 40mg/kgおよび 80mg/kg)単独投与群の結果を示す。
[図 44]アジュバント誘発関節炎ラット左後肢の軟 X線像である。写真はコントロール群 群のうち平均的なスコアを示した個体の代表的な例である (スコア 3)。
[図 45]アジュバント誘発関節炎ラット左後肢の軟 X線像である。写真はメソトレキサー ト単独投与群 (0.06mg/kg)群のうち平均的なスコアを示した個体の代表的な例である (スコア 2)。 [図 46]アジュバント誘発関節炎ラット左後肢の軟 X線像である。写真は化合物 (I)単 独投与群 (40mg/kg)群のうち平均的なスコアを示した個体の代表的な例である (スコ ァ 1)。
[図 47]アジュバント誘発関節炎ラット左後肢の軟 X線像である。写真は化合物 (I) (40 mg/kg) +メソトレキサート（0.06mg/kg)併用投与群群のうち平均的なスコアを示した 個体の代表的な例である (スコア 0)。
[0214] [図 48]マウス Tリンパ球系細胞株 EL- 4細胞を Phorbol 12- myristate 13- acetate (PMA) と Calcium lonophore A23187で刺激した時の IL-2産生に対する化合物（I)とメソトレキ サート併用効果について示した。図中の faは IL-2産生阻害率を、 CIは Combination In dexを示している。
配列表フリーテキスト
[0215] 配列番号 1 : 阻害剤ペプチド
配列番号 2 : 阻害剤ペプチド
配列番号 3 : 阻害剤ペプチド
配列番号 4 : プライマー
配列番号 5 : プライマー
配列番号 6 : siRNA
配列番号 7 : siRNA
配列番号 8 : siRNA
配列番号 9 : siRNA
配列番号 10 siRNA
配列番号 11 siRNA
配列番号 12 PLP(139- 151)

Claims

請求の範囲
[1] CaMKII阻害剤および疾患修飾性抗リウマチ薬を含有する自己免疫疾患の予防剤 および Zまたは治療剤。
[2] 疾患修飾性抗リウマチ薬と併用するための、 CaMKII阻害剤を含有する自己免疫疾 患の予防剤および Zまたは治療剤。
[3] 疾患修飾性抗リウマチ薬の投与と同時に、分離して、または続けて投与される請求 項 2記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[4] 副作用によって、十分な自己免疫疾患予防および Zまたは治療効果が得られる量 の疾患修飾性抗リウマチ薬が投与できない自己免疫疾患に罹患した哺乳動物に対 し、疾患修飾性抗リウマチ薬の投与と同時に、分離して、または続けて投与されるた めの CaMKII阻害剤を含有する自己免疫疾患の予防剤および Zまたは治療剤。
[5] 副作用が肝障害、腎障害および胃腸障害力 選ばれる 1または複数である請求項
4記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[6] CaMKII阻害剤が、式 1で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容さ れる塩である請求項 1〜5のいずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤。
式 1 :
[化 1]
Figure imgf000106_0001
[式中、 Dは水素原子、ハロゲン原子、水酸基、メルカプト基、ニトロ基、シァノ基、力 ルポキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換 されてもよい力ルバモイル基、置換されてもよいスルファモイル基、スルホ基、 R5、 -OR5, -CO R6、— SR7、 - (CO) SR7、 - (CS) OR7または— CS R7 (式中、 R5は
2 2
置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいァルケ-ル基、置換されてもよいァ ルキ-ル基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいシクロアルケ-ル 基、置換されてもよいァリール基、置換されてもよい複素環基またはァシル基を表す
。 R6は置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいァルケ-ル基、置換されてもよ 、アルキニル基、置換されてもょ 、ァリール基または置換されてもょ 、複素環基を表 す。 R7は置換されてもよいアルキル基または置換されてもよいァリール基を表す。）を 表す。
Aおよび Bは、一方が、式：
[化 2]
Figure imgf000107_0001
(Eは単結合またはアルキレン基を表す。
2つの破線は、一方が実線と共に 2重結合を意味し、他方が実線と共に単結合を意 味する。 R1は破線が実線と共に単結合を表す結合に結合する窒素原子に結合する R3および R4は、各々独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、メルカプ ト基、ニトロ基、シァノ基、カルボキシ基、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよい ヒドロキシルァミノ基、置換されてもよい力ルバモイル基、置換されてもよいスルファモ ィル基、スルホ基、 NH基の保護基、— R5、 -OR5, -CO R6、 一 SR7、 - (CO) SR7
2
、 - (CS) OR7または— CS R7 (式中、 R5、 R6および R7は前記と同義である。）を表す
2
。また、
Figure imgf000107_0002
R2、 R3および R4は、このうちの任意の 2つが結合して一緒になつて、窒素 原子と共に、置換されてもよい複素環を形成してもよい。また、式：— NR 4は、式： -N = C (NH ) NR43R44で表される基を表してもよい。
2
R43および R44は、以下の（1)または（2)の通りである。
(1)独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、一（CH ) -COCH (nは 1〜3
2 n 3 の整数を表す。）、 - (CH ) -CO R32 (nは前記と同義である。 R32は炭素数 1〜3の
2 n 2
アルキル基を表す。）、 - (CH ) — CONR33R34 (nは前記と同義である。 R33および R3
2 n
4は独立して水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す。）、 - (CH ) -OR35
2 m
(mは 2または 3を表す。 R35は水素原子、炭素数 1〜3のアルキル基または—（CH )
2 m
— OR36 (mは前記と同義である。 R36は水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を 表す。 )を表す。 ) , - (CH ) -NR37R38 (mは前記と同義である。 R37および R38は独
2 m 立して水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す力、または R37および R38は一 緒になって窒素原子と共に、ピロリジン、ピぺリジン、ァゼパン、モルホリンまたは N— メチルビペラジン（これらにおいて、ピロリジン、ピぺリジン、ァゼパン、モルホリンおよ び N—メチルビペラジンは、 1または 2個のメチルで置換されてもよい。）を表す。）、フ ェ -ル、ピリジル、ピリミジ -ル、ピリダジ -ル、ピラジュル、テトラゾリル、ベンジル、ピ リジルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジ -ルメチル、ピラジュルメチル、テトラゾリル メチル、水酸基、炭素数 1〜3のアルコキシ基または— NR39R4Q(R39および R4Qは、独 立して水素原子、炭素数 1〜3のアルキル基、フエニルまたはピリジルを表す。）を表 す。
(2)一緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基 (5〜7員飽和含窒 素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、ォキソ基力 なる群か ら任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよい。）を表す。 )
で表される基を表す。
Aおよび Bは、他方が、式： J G
(式中、 Gは置換されてもよいァリール基、もしくは置換されてもよい複素環基を表す 。 Jは一 C (R8R9)—または一 C ( = CR8R9)—を表す。 R8および R9は、各々独立して、 水素原子、置換されてもよい低級アルコキシ基、または置換されてもよい低級アルキ ル基を表す。また、 R8および R9が結合して一緒になつて、炭素原子と共に、置換され てもよい炭化水素環、置換されてもよい 1, 3 ジォキサン環または置換されてもよい 1, 3 ジォキソラン環を形成してもよい。）
で表される基を表す。 ]
[7] Eが単結合または低級アルキレン基である請求項 6記載の予防剤および Zまたは 治療剤。
[8] Dが水素原子、ニトロ基、シァノ基、カルボキシ基、置換されてもよ 、ァミノ基、置換 されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換されてもよい力ルバモイル基、 R5または一 C O R6 (式中、 R5および R6は請求項 6における意義と同義である。）である請求項 6また
2
は 7のいずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[9] Dが水素原子、カルボキシ基、—R5または— CO R6 (式中、 R5および R6は請求項 6 における意義と同義である。 )である請求項 8記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[10] R3および R4が、各々独立して、水素原子、水酸基、置換されてもょ 、ァミノ 基、置換されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、置換され てもよいアルキル基、置換されてもよいァルケ-ル基、置換されてもよいアルキ-ル 基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいシクロアルケ-ル基、置換 されてもよいァリール基、置換されてもよい複素環基またはァシル基を表す力、式：―
NR3R4が、式： N = C (NH ) NR43R44(R43および R44は、請求項 6における意義と同
2
義である。）で表される基を表すか、または、
Figure imgf000109_0001
R3および R4のうちの任意の 2つ が結合して一緒になつて、窒素原子と共に、置換されてもよい複素環を形成する請 求項 6〜9のいずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[11] R3および R4が、各々独立して、水素原子、水酸基、置換されてもよいァミノ 基、置換されてもよいヒドロキシルァミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、置換され てもよいアルキル基、置換されてもよいァルケ-ル基、置換されてもよいアルキ-ル 基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいァリール基、置換されても よい複素環基またはァシル基を表す力、式：—NR 4が、式： N = C (NH ) NR43R4
2
4 (R43および R44は、請求項 6における意義と同義である。）で表される基を表すか、ま たは、
Figure imgf000109_0002
R2、 R3および R4のうちの任意の 2つが結合して一緒になつて、窒素原子と 共に、置換されてもよい複素環を形成する請求項 10記載の予防剤および Zまたは 治療剤。
[12] Gが置換されてもよ!、フエ-ル、置換されてもよ!、ナフチル、置換されてもよ!、フリル 、置換されてもよいチェ-ル、置換されてもよいインドリル、置換されてもよいイソチア ゾリル、置換されてもよいべンゾチェ-ル、置換されてもよいイソベンゾフラ -ル、置 換されてもよいピロリル、置換されてもよいべンゾフリル、置換されてもよいイミダゾリル 、置換されてもよいピラゾリル、置換されてもよいイソキサゾリル、置換されてもよいイソ チアゾリル、置換されてもよいチアゾリル、置換されてもよいォキサゾリル、置換されて もよいべンズイミダゾリル、置換されてもよいべンゾチアゾリル、置換されてもよいベン ズォキサゾリル、置換されてもよいピリジル、置換されてもよいピラジュル、置換されて もよいピリミジ -ル、置換されてもよいピリダジ -ル、置換されてもよいトリアジ-ル、置 換されてもよいキノリル、置換されてもよいイソキノリル、置換されてもよいキナゾリニル
、置換されてもよいキノキサリニル、置換されてもよい 2, 3 ジヒドローべンゾ [1, 4] ジォキシュルまたは置換されてもよ!、カルバゾリルである請求項 6〜： L 1の!、ずれか記 載の予防剤および Zまたは治療剤。
CaMKII阻害剤力 式 A1または式 A2で表されるイソキサゾール誘導体またはその 薬学上許容される塩である請求項 6記載の予防剤および Zまたは治療剤。
式 A1 :
[化 3]
Figure imgf000110_0001
[式中、 G1は、フエ-ル、ビフエ-ルー 4—ィル、 3—ベンゾィルフエ-ル、 4—ベンゾィ ルフエ-ル、 1H—インドール— 2—ィル、 1H—インドール— 3—ィル、 1—メチル 1 H—インドール一 2—ィル、 1—メチル 1H—インドール一 3—ィル、 2, 3 ジヒドロ —ベンゾ [1, 4]ジォキシン一 6—ィル、 1—ベンゾフラン一 5—ィル、 1—ベンゾフラン —6—ィル、キノリル、イソキノリル、フエニルピリジル、フエニルピリミジニル、フエニル ピリダジ -ルまたはフエ-ルビラジュル（これらにおいて、フエ-ル、ビフエ-ルー 4— ィル、 3 ベンゾィルフエ-ル、 4 ベンゾィルフエ-ル、 1H—インドール— 2—ィル、 1H—インドール— 3—ィル、 1—メチル—1H—インドール— 2—ィル、 1—メチル 1 H—インドールー 3 ィル、 2, 3 ジヒドローべンゾ [1, 4]ジォキシンー6 ィル、 1 —ベンゾフラン一 5—ィル、 1—ベンゾフラン一 6—ィル、キノリル、イソキノリル、フエ二 ルピリジル、フエニルピリミジニル、フエ二ルビリダジニルおよびフエ二ルピラジニルは 、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ァセチル、シァ入—CO 9 29は炭素数1〜
2
3のアルキル基を表す。）および— CONR3°R31 (R3°および R31は、独立して水素原子 または炭素数 1〜3のアルキル基を表す。 )力 なる群力 任意に選ばれる 1または 2 個の基で置換されてもよい。）を表す。
R23および R24は、独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、メトキシまたはエト キシを表す力、または一緒になつてメチレンを表す。 式： =C (NR25R26) NR27R28は、以下の（1)、（2)または（3)の通りである。
(1) 5ぉょひ 26は、以下の（a)または (b)の通りであり、 R27および R28は、以下の（c) または（d)の通りである。
(a)独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、一（CH ) -COCH (nは請求
2 n 3 項 6における意義と同義である。）、 - (CH ) -CO R32 (nおよび R32は請求項 6にお
2 n 2
ける意義と同義である。）、 - (CH ) — CONR33R34 (n、 R33および R34は請求項 6にお
2 n
ける意義と同義である。）、 - (CH ) — OR35 (mおよび R35は請求項 6における意義と
2 m
同義である。；)、—（CH ) — NR37R38 (m、 R37および R38は請求項 6における意義と同
2 m
義である。 )、フエ-ル、ピリジル、ピリミジ -ル、ピリダジ -ル、ピラジュル、テトラゾリル 、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジ -ルメチル、ピリダジ -ルメチル、ピラジュルメチ ル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数 1〜3のアルコキシ基または— NR39R4Q (R39お よび R4Qは請求項 6における意義と同義である。 )を表す。
(b)一緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基 (5〜7員飽和含 窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、ォキソ基からなる群 から任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよい。 )を表す。
(c)独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、一（CH ) — COCH (nは前記
2 n 3 と同義である。 ) , - (CH ) -CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。 ) , - (CH )
2 n 2 2
— CONR33R34(n、 R33および R34は前記と同義である。 ) , - (CH ) — OR35 (mおよ n 2 m
び R35は前記と同義である。 ) , - (CH ) -NR37R38 (m, R37および R38は前記と同義
2 m
である。 )、フエ-ル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジ -ル、ピラジュル、テトラゾリル、 ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジ -ルメチル、ピリダジ -ルメチル、ピラジュルメチル 、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数 1〜3のアルコキシ基または— NR39R4Q (R39およ び R4Qは前記と同義である。）を表す。
(d)—緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基 (ここで、 5〜7員 飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、ォキソ基か らなる群から任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよい。 )を表す。
(2) R26および R27は、一緒になつて 2つの窒素原子、炭素原子と共に、 5〜7員飽和 含窒素複素環基 (ここで、 5〜7員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水 酸基、アルコキシ基、ォキソ基力 なる群から任意に選ばれる 1または 2個の置換基 で置換されてもよい)を表す。
R25および R28は、独立して水素原子、炭素数 1〜3のアルキル基、ァセチルまたは - (CH ) — OR36 (mは前記と同義である。 R36は請求項 6における意義と同義である
2 m
。 )を表す。
(3)式： =C (NR25R26) NR27R28が、式： = C (NR41R42) N = C (NH ) NR43R44を表す。
2
R41および R42は、以下の（a1)または (b1)の通りであり、 R43および R44は、以下の（c1) または（d1)の通りである。
(a1)独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、—（CH ) -COCH (nは前
2 n 3 記と同義である。）、一（CH ) -CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。）、一（C
2 n 2
H ) — CONR33R34 (n、 R33および R34は前記と同義である。）、 - (CH ) — OR35 (m
2 n 2 m
および R35は前記と同義である。 ) , - (CH ) -NR37R38 (m, R37および R38は前記と
2 m
同義である。）、フエ-ル、ピリジル、ピリミジ -ル、ピリダジ -ル、ピラジュル、テトラゾリ ル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジ -ルメチル、ピリダジ -ルメチル、ピラジュルメ チル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数 1〜3のアルコキシ基または— NR39R4Q (R39 および R4Qは前記と同義である。）を表す。
(b1)一緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基 (5〜7員飽和含 窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、ォキソ基からなる群 から任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよい。 )を表す。
(c1)独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、—（CH ) — COCH (nは前
2 n 3 記と同義である。）、一（CH ) —CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。）、一（C
2 n 2
H ) — CONR33R34 (n、 R33および R34は前記と同義である。）、 - (CH ) — OR35 (m
2 n 2 m
および R35は前記と同義である。 ) , - (CH ) -NR37R38 (m, R37および R38は前記と
2 m
同義である。）、フエ-ル、ピリジル、ピリミジ -ル、ピリダジ -ル、ピラジュル、テトラゾリ ル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジ -ルメチル、ピリダジ -ルメチル、ピラジュルメ チル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数 1〜3のアルコキシ基または— NR39R4Q (R39 および R4Qは前記と同義である。）を表す。
(d1)一緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基 (5〜7員飽和含 窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、ォキソ基からなる群 から任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよい。）を表す。 ]
式 A2 :
[化 4]
Figure imgf000113_0001
[式中、
Figure imgf000113_0002
R23および R24は前記と同義である。
式：— N (R45) C (NR46R47) =NR48は、以下の（I1)または（21)の通りである。
(l1)!^45は、炭素数 1〜3のアルキル基またはァセチルを表す。 R48は、水素原子、炭 素数 1〜 3のアルキル基またはァセチルを表す。
R46および R47は、以下の（a2)または (b2)の通りである。
(a2)独立して水素原子、炭素数 1〜4のアルキル基、—（CH ) -COCH (nは前
2 n 3 記と同義である。）、一（CH ) -CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。）、一（C
2 n 2
H ) — CONR33R34 (n、 R33および R34は前記と同義である。）、 - (CH ) — OR35 (m
2 n 2 m
および R35は前記と同義である。 ) , - (CH ) -NR37R38 (m, R37および R38は前記と
2 m
同義である。）、フエ-ル、ピリジル、ピリミジ -ル、ピリダジ -ル、ピラジュル、テトラゾリ ル、ベンジル、ピリジルメチル、ピリミジ -ルメチル、ピリダジ -ルメチル、ピラジュルメ チル、テトラゾリルメチル、水酸基、炭素数 1〜3のアルコキシ基または— NR39R4Q (R39 および R4Qは前記と同義である。）を表す。
(b2)一緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基 (5〜7員飽和含 窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、ォキソ基からなる群 から任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよい。 )を表す。
(2 1^5および R46は、一緒になつて窒素原子と共に、 5〜7員飽和含窒素複素環基（ ここで、 5〜7員飽和含窒素複素環基は、アルキル基、アミノ基、水酸基、アルコキシ 基、ォキソ基力 なる群力 任意に選ばれる 1または 2個の置換基で置換されてもよ い。）を表す。
R47および R48は、独立して水素原子、炭素数 1〜3のアルキル基、ァセチルまたは (CH ) — OR36 (mおよび R36は前記と同義である。）を表す。 ]
2 m
CaMKII阻害剤力 式 A3で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容さ れる塩である請求項 6記載の予防剤および Zまたは治療剤。
式 A3 :
[化 5]
Figure imgf000114_0001
[式中、 G2は、 2 フルォロ一ビフエ-ル一 4—ィル、 2，一フルォロ一ビフエ-ル一 4
—ィルまたは 3—ベンゾィルフエニルを表す。 R49は、メチルを表す。 R5Qは、水素原子
、メチル、メトキシまたはエトキシを表す。
式： =C (NR51R52) NR53R54は、（12)、（22)または（32)の通りである。
(12)R51および R52は、以下の（a3)、（b3)または（c3)の通りであり、 R53および R54は、以 下の（d3)、（ または (f3)の通りである。
( 独立して水素原子または炭素数 1〜4のアルキル基を表す。
(b3)—方が水素原子を表し、他方が一（CH ) — COCH (nは請求項 6における意
2 n 3
義と同義である。）、 - (CH ) -CO R32 (nおよび R32は請求項 6における意義と同義
2 n 2
である。）、 - (CH ) — CONR33R34(n、 R33および R34は請求項 6における意義と同義
2 n
である。）、 - (CH ) — OR35 (mおよび R35は請求項 6における意義と同義である。）ま
2 m
たは—（CH ) — NR37R38 (m、 R37および R38は請求項 6における意義と同義である。 )
2 m
を表す。
(c3)—緒になつて窒素原子と共に、ピロリジン、ァゼパン、モルホリン、チアゾリン、 ピぺリジン— 2—オン、ピぺリジン— 4—オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキ ル基で 4位が置換されてもょ 、ピペラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換 されてもよいピぺリジン、 4ーヒドロキシピペリジン、または 1もしくは 2個の炭素数 1〜3 のアルキル基で置換されてもょ 、ァミノ基で 4位が置換されたピペリジン (これらにお いて、ピロリジン、ァゼパン、モノレホリン、チアゾリン、ピぺリジン 2—オン、ピぺリジン 4 オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキル基で 4位が置換されてもよいピ ペラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換されてもよいピぺリジン、 4ーヒド 口キシピペリジン、および 1または 2個の炭素数 1〜3のアルキル基で置換されてもよ Vヽァミノ基で 4位が置換されたピペリジンは、 1または 2個のメチルで置換されてもょ ヽ 。 )を表す。
(d3)独立して水素原子または炭素数 1〜4のアルキル基を表す。
(e3)—方が水素原子を表し、他方が一（CH ) -COCH (nは前記と同義である。
2 n 3
) , - (CH ) -CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。）、 - (CH ) — CONR33R3
2 n 2 2 n
4 (n、 R33および R34は前記と同義である。 ) , - (CH ) — OR35 (mおよび R35は前記と
2 m
同義である。）または—（CH ) — NR37R38 (m、 R37および R38は前記と同義である。 )
2 m
を表す。
(f3)—緒になつて窒素原子と共に、ピロリジン、ァゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピ ペリジン— 2—オン、ピぺリジン— 4—オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキル 基で 4位が置換されてもょ 、ピペラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換さ れてもよぃピペリジン、 4ーヒドロキシピペリジン、または 1もしくは 2個の炭素数 1〜3の アルキル基で置換されてもょ 、ァミノ基で 4位が置換されたピペリジン (これらにぉ ヽ て、ピロリジン、ァゼパン、モノレホリン、チアゾリン、ピぺリジン 2—オン、ピぺリジン 4 オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキル基で 4位が置換されてもよいピぺ ラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換されてもよいピぺリジン、 4ーヒドロ キシピペリジン、および 1または 2個の炭素数 1〜3のアルキル基で置換されてもよい ァミノ基で 4位が置換されたピペリジンは、 1または 2個のメチルで置換されてもよい。 ) を表す。
(22)式： =C (NR51R52) NR53R54が、式：
[化 6]
Figure imgf000115_0001
前記と同義である。 R は水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す。）を表す 。；)で表される基を表す。
(32)式： =C (NR51R52) NR53R54が、式： = C (NR57R58) N = C (NH ) NR59R6°を表す
2
R57および R58は、以下の 4)、（b4)または (c4)の通りであり、 R59および R6°は、以下 の（d4)、（e4)または (f4)の通りである。
(a4)独立して水素原子または炭素数 1〜4のアルキル基を表す。
(b4)—方が水素原子を表し、他方が一（CH ) -COCH (nは前記と同義である。
2 n 3
) , - (CH ) -CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。）、 - (CH ) — CONR33R3
2 n 2 2 n
4 (n、 R33および R34は前記と同義である。 ) , - (CH ) — OR35 (mおよび R35は前記と
2 m
同義である。）または—（CH ) — NR37R38 (m、 R37および R38は前記と同義である。 )
2 m
を表す。
(c4)一緒になつて窒素原子と共に、ピロリジン、ァゼパン、モルホリン、チアゾリン、 ピぺリジン— 2—オン、ピぺリジン— 4—オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキ ル基で 4位が置換されてもょ 、ピペラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換 されてもよいピぺリジン、 4ーヒドロキシピペリジン、または 1もしくは 2個の炭素数 1〜3 のアルキル基で置換されてもょ 、ァミノ基で 4位が置換されたピペリジン (これらにお いて、ピロリジン、ァゼパン、モノレホリン、チアゾリン、ピぺリジン 2—オン、ピぺリジン 4 オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキル基で 4位が置換されてもよいピ ペラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換されてもよいピぺリジン、 4ーヒド 口キシピペリジン、および 1または 2個の炭素数 1〜3のアルキル基で置換されてもよ Vヽァミノ基で 4位が置換されたピペリジンは、 1または 2個のメチルで置換されてもょ ヽ 。 )を表す。
(d4)独立して水素原子または炭素数 1〜4のアルキル基を表す。
(e4)—方が水素原子を表し、他方が一（CH ) -COCH (nは前記と同義である。
2 n 3
) , - (CH ) -CO R32 (nおよび R32は前記と同義である。）、 - (CH ) — CONR33R3
2 n 2 2 n
4 (n、 R33および R34は前記と同義である。 ) , - (CH ) — OR35 (mおよび R35は前記と
2 m
同義である。）または—（CH ) — NR37R38 (m、 R37および R38は前記と同義である。 )
2 m
を表す。 (f4)一緒になつて窒素原子と共に、ピロリジン、ァゼパン、モルホリン、チアゾリン、ピ ペリジン— 2—オン、ピぺリジン— 4—オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキル 基で 4位が置換されてもょ 、ピペラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換さ れてもよぃピペリジン、 4ーヒドロキシピペリジン、または 1もしくは 2個の炭素数 1〜3の アルキル基で置換されてもょ 、ァミノ基で 4位が置換されたピペリジン (これらにぉ ヽ て、ピロリジン、ァゼパン、モノレホリン、チアゾリン、ピぺリジン 2—オン、ピぺリジン 4 オン、チアモルホリン、炭素数 1〜3のアルキル基で 4位が置換されてもよいピぺ ラジン、炭素数 1〜3のアルコキシ基で 4位が置換されてもよいピぺリジン、 4ーヒドロ キシピペリジン、および 1または 2個の炭素数 1〜3のアルキル基で置換されてもよい ァミノ基で 4位が置換されたピペリジンは、 1または 2個のメチルで置換されてもよい。 ) を表す。]
CaMKII阻害剤力 式 A4で表されるイソキサゾール誘導体またはその薬学上許容さ れる塩である請求項 6記載の予防剤および Zまたは治療剤。
式 A4 :
[化 7]
Figure imgf000117_0001
[式中、 G2、 R49および R5Qは、請求項 14における意義と同義である。
式： =C (NR61R62) NR63R64は、以下の（13)、（23)または（33)の通りである。
(13)R63および R64は、共に水素原子を表す。
R61および R62は、以下の（a5)、（b5)または (c5)の通りである。
(a5)独立して水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す。
(b5)—方が水素原子を表し、他方が一（CH ) -CO R32 (nおよび R32は請求項 6に
2 n 2
おける意義と同義である。 ) , - (CH ) — OR65 (mは 2または 3を表す。 R65は、水素
2 m
原子、炭素数 1〜3のアルキル基、 2 ヒドロキシェチルまたは 3 ヒドロキシプロピル を表す。）または—（CH ) — NR66R67 (mは前記と同義である。 R66および R67は、独立
2 m
して水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す力、または R66および R67は一緒 になって窒素原子と共に、ピロリジン、ピぺリジン、モルホリンまたは N—メチルビペラ ジン（これらにおいて、ピロリジン、ピぺリジン、モルホリンおよび N—メチルビペラジン は、 1または 2個のメチルで置換されてもよい。）を表す。）を表す。
(c5)—緒になつて窒素原子と共に、ピロリジン、ピぺリジン、モルホリンまたは N—メ チルピペラジン（これらにおいて、ピロリジン、ピぺリジン、モルホリンおよび N—メチル ピぺラジンは、 1または 2個のメチルで置換されてもよい。）を表す。
(23)式： =C (NR61R62) NR63R64が、式：
[化 8]
Figure imgf000118_0001
(R68は、炭素数 1〜3のアルキル基、 2—ヒドロキシェチルまたは 3—ヒドロキシプロピ ルを表す。）で表される基を表す。
(33)R61および R62は、一緒になつて窒素原子と共に、モルホリンを表し、 R63および R64 は、一緒になつて、アミノーモルホリン一 4—ィル一メチレンを表す。 ]
[16] G2が 2—フルォロ一ビフエ-ル一 4—ィルまたは 2，一フルォロ一ビフエ-ル一 4—ィ ルであり、 R5Qが水素原子またはメチルであり、 R63および R64が共に水素原子であり、 R61および R62が、以下の（a6)または (b6)の通りである、請求項 15記載の予防剤およ び Zまたは治療剤：
(a6)独立して水素原子または炭素数 1〜3のアルキル基を表す；
(b6)—緒になつて窒素原子と共に、モルホリン (モルホリンは、 1または 2個のメチル で置換されてもよい。）を表す。
[17] CaMKII阻害剤力 3-[(lS)-l-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-5- { [アミノ (モ ルフォリン- 4_ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾールまたはその薬学上許容される塩で ある請求項 1〜5のいずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[18] 疾患修飾性抗リウマチ薬が、下記力 選ばれる 1または複数の薬剤である請求項 1 〜 17の 、ずれか記載の予防剤および Zまたは治療剤：
レフルノミド、メソトレキサート、 D—ぺ-シラミン、ブシラミン、サラゾスルフアビリジン 、ァクタリット、口ベンザリット、シクロフォスフアミド、クロラムブシル、ミゾリビン、ァザチ ォプリン、オーラノフィン、金チオマレイン酸ナトリウム、金チォ硫酸、金チォダルコ一 ス、シクロスポリン、ヒドロキシクロロキン、クロ口キン、タクロリムス、エタネノレセプト、イン フリキシマブ、アナキンラ、ケリキシマブ、ァダリムマブ、リツキシマブ、およびヒト型抗 I L- 6R抗体。
[19] 疾患修飾性抗リウマチ薬カ^ソトレキサート、サラゾスルフアビリジンまたはレフルノミ ドである請求項 18記載の予防剤および Zまたは治療剤。
[20] 自己免疫疾患が、下記力も選ばれるいずれかの疾患である請求項 1〜19のいずれ か記載の予防剤および Zまたは治療剤：
関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強 皮症、混合結合組織病、橋本病、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、 Goo d-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性 類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、 I型糖尿病、アジソン病、萎縮 性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、、多発性硬化症、潰 瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性血液性疾患、自 己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症、発作性血色素尿症、突発性血小板 減少性紫斑病、間質性肺腺維症およびシエーダレン症候群。
[21] 自己免疫疾患が関節リウマチである請求項 20記載の予防剤および Zまたは治療 剤。
[22] CaMKII阻害剤を有効成分として含有する、疾患修飾性抗リウマチ薬による自己免 疫疾患予防および Zまたは治療効果の増強剤。
[23] CaMKII阻害剤力 下記の工程 (a)、（b)および (c)を含むスクリーニング方法により選 択された物質である請求項 22記載の増強剤：
(a)被験物質と CaMKII酵素および基質とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた CaMKII酵素による基質のリン酸ィ匕レベルを測定し、該リン 酸ィ匕レベルを、被験物質を接触させな！/、対照酵素の上記リン酸ィ匕レベルと比較する 工程、
(c)上記 (b)の比較結果に基づいて、 CaMKIIの活性を阻害する被験物質を選択する 工程。
[24] CaMKII阻害剤力 10 Mの濃度における CaMKIIの阻害率が 30%以上である物質 である請求項 23記載の増強剤。
[25] CaMKII阻害剤力 3-[(lS)-l-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-5- { [アミノ (モ ルフォリン- 4_ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾールまたはその薬学上許容される塩で ある、請求項 22記載の増強剤。
[26] 疾患修飾性抗リウマチ薬カ^ソトレキサート、サラゾスルフアビリジンまたはレフルノミ ドである請求項 22〜25のいずれか記載の増強剤。
[27] 自己免疫疾患が関節リウマチである請求項 22〜26のいずれか記載の増強剤。
[28] 第 2医薬糸且成物と共に用いて自己免疫疾患に罹患した哺乳動物において自己免 疫疾患予防および Zまたは治療効果を達成するための第 1医薬組成物であって、該 効果は該第 1及び第 2医薬組成物を別々に投与することによって達成される自己免 疫疾患予防および Zまたは治療効果の合計を上回り、該第 2医薬組成物は疾患修 飾性抗リウマチ薬を含み、該第 1医薬組成物は CaMKII阻害剤を含む組成物。
[29] 第 2医薬糸且成物と共に用いて自己免疫疾患に罹患した哺乳動物において自己免 疫疾患予防および Zまたは治療効果を達成するための第 1医薬組成物であって、該 効果は該第 1及び第 2医薬組成物を別々に投与することによって達成される自己免 疫疾患予防および Zまたは治療効果を上回り、該第 2医薬組成物は疾患修飾性抗リ ゥマチ薬を含み、該第 1医薬組成物は CaMKII阻害剤を含む組成物。
[30] CaMKII阻害剤力 3-[(lS)-l-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-5- { [アミノ (モ ルフォリン- 4_ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾールまたはその薬学上許容される塩で ある、請求項 28または 29の 、ずれか記載の組成物。
[31] 疾患修飾性抗リウマチ薬カ^ソトレキサート、サラゾスルフアビリジンまたはレフルノミ ドである請求項 28〜30のいずれか記載の組成物。
[32] 自己免疫疾患が関節リウマチである請求項 28〜31のいずれか記載の組成物。
[33] 以下の（1)および (2)を含む商業パッケージ：
(1) CaMKII阻害剤を含有する医薬組成物；
(2)当該医薬組成物を疾患修飾性抗リウマチ薬と併用して自己免疫疾患予防および zまたは治療用途に使用することができるまたは使用すべきであることを記載した、 該医薬組成物に関する記載物。
[34] 以下の（1)および (2)を含む商業パッケージ：
(1) CaMKII阻害剤を含有する医薬組成物；
(2)当該医薬組成物を、疾患修飾性抗リウマチ薬による自己免疫疾患予防および Z または治療効果を増強する用途に使用することができるまたは使用すべきであること を記載した、該医薬組成物に関する記載物。
[35] CaMKII阻害剤力 3-[(lS)-l-(2-フルォロビフエ-ル -4-ィル)ェチル ]-5- { [アミノ (モ ルフォリン- 4_ィル)メチレン]アミノ}イソキサゾールまたはその薬学上許容される塩で ある、請求項 33または 34記載の商業パッケージ。
[36] 疾患修飾性抗リウマチ薬カ^ソトレキサート、サラゾスルフアビリジンまたはレフルノミ ドである請求項 33〜35のいずれか記載の商業パッケージ。
[37] 自己免疫疾患が関節リウマチである請求項 33〜36のいずれか記載の商業パッケ ージ。
[38] CaMKII阻害剤を含む第 1の組成物、および疾患修飾性抗リウマチ薬を含む第 2の 組成物をパッケージ内に含有する、自己免疫疾患予防および Zまたは治療用のキッ
[39] 自己免疫疾患の予防および Zまたは治療用医薬組成物を製造するための、 CaMK
II阻害剤および疾患修飾性抗リウマチ薬の使用。
[40] 疾患修飾性抗リウマチ薬と併用することを特徴とする自己免疫疾患の予防剤およ び/または治療剤の製造のための CaMKII阻害剤の使用。
[41] 疾患修飾性抗リウマチ薬による自己免疫疾患の予防および Zまたは治療効果増強 用医薬組成物を製造するための、 CaMKII阻害剤の使用。
[42] CaMKH阻害剤を疾患修飾性抗リウマチ薬と併用して投与することを特徴とする自 己免疫疾患の予防および Zまたは治療方法。
[43] CaMKII阻害剤を投与することを含む、疾患修飾性抗リウマチ薬による自己免疫疾 患予防および Zまたは治療効果の増強方法。
[44] 疾患修飾性抗リウマチ薬によって十分な予防および Zまたは治療効果が得られな ぃ自己免疫疾患に罹患した哺乳動物に対して、疾患修飾性抗リウマチ薬の自己免 疫疾患予防および Zまたは治療効果の増強に有効な量の CaMKII阻害剤を投与す ることを含む自己免疫疾患の予防および Zまたは治療方法。
[45] CaMKII阻害剤と疾患修飾性抗リウマチ薬とを組み合わせてなる自己免疫疾患の予 防剤および Zまたは治療剤。
[46] CaMKII阻害剤と疾患修飾性抗リウマチ薬とを組み合わせてなる医薬。
[47] CaMKII阻害剤および疾患修飾性抗リウマチ薬を含有する関節破壊抑制剤。
[48] 疾患修飾性抗リウマチ薬と併用するための、 CaMKII阻害剤を含有する関節破壊抑 制剤。
[49] CaMKII阻害剤を有効成分として含有する、疾患修飾性抗リウマチ薬による関節破 壊効果の増強剤。
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