WO2006069803A1 - Verfahren zur herstellung von proteinhydrolysaten - Google Patents

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WO2006069803A1
WO2006069803A1 PCT/EP2005/014183 EP2005014183W WO2006069803A1 WO 2006069803 A1 WO2006069803 A1 WO 2006069803A1 EP 2005014183 W EP2005014183 W EP 2005014183W WO 2006069803 A1 WO2006069803 A1 WO 2006069803A1
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reaction
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Axel HÖHLING
Maria Schultze
Sigmar Mothes
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Animox GmbH
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of hydrolysates from protein-containing vegetable and animal raw materials.
  • Protein-containing plant and animal natural and waste products can be processed in many ways for recycling. As a rule, it is necessary to split the macromolecules (proteins) into amino acids on the one hand and peptides that consist of several amino acids on the other hand.
  • the protein cleavage can also be carried out enzymatically with the aid of proteases of microbial origin. Both endopeptidases, which break down peptide chains into different fragments according to their cleavage specificity, as well as exopeptidases, which provide amino acids, are used. Methods and methods of pH-dependent and enzymatic protein hydrolysis are u. a. in GB 846682, RU 2132142 and US 6221423.
  • Macromolecules of complex materials from animal and plant wastes can also be cleaved under the influence of elevated pressure and elevated temperature.
  • the resulting fragments are thus made accessible to a microbially supported energetic utilization, eg of methane formation.
  • US 6365047, ES 2162462T and DE 10117321 show the state of the art of pressure-temperature hydrolysis with regard to the process engineering solutions.
  • DE 10113537 describes the pressure-temperature treatment for animal meal. Mainly under the aspect of the inactivation of the BSE pathogen of infected animal meal and meat pulp in the basic environment a pressure of 2.5 bar and a temperature of 150 0 C act on the aqueous animal meal suspension for at least 15 min.
  • BSE-free animal meal is split by total hydrolysis of the protein of the animal meal to amino acids with the addition of acids / alkalis and optionally subsequent treatment with proteases.
  • the splitting process must be followed by neutralization.
  • the present invention has for its object to provide a method by which it is possible to produce protein hydrolysates with defined molecular weight limits without adjusting pH and without enzymatic process steps.
  • the process for the preparation of protein hydrolysates from protein-containing vegetable and animal raw materials is characterized in that the raw materials are cleaved in an aqueous medium by a controlled by a system characteristic temperature and reaction time and under targeted pressure buildup in a reaction space and that the suspension after the cleavage process into a sediment containing the insoluble constituents of the starting material, and an aqueous supernatant in which the cleavage products of the raw materials are dissolved, is separated, the cleavage products are protein hydrolysates such as peptides and amino acids.
  • the inventive method is characterized in that the cleavage is preferably carried out in the temperature range of 140 0 C to 250 0 C, at a pressure of 5 bar to 220 bar and reaction times up to 120 min.
  • targeted molecules are obtained with defined different molecular weights in the order of 10 - 50 kDa as cleavage products.
  • the inventive method is characterized in that the cleavage of the protein molecules is preferably carried out in the temperature range between 180 0 C and 220 0 C and at a pressure between 50 and 75 bar and reaction times of 25 to 40 min.
  • protein hydrolysates having a molecular weight ⁇ 20 kDa are obtained here.
  • the cleavage in tubular reactors is carried out continuously (FIG. 1) or according to the batch principle while simultaneously avoiding by-products.
  • the cleavage process is controlled by an analysis of the molecular size of the peptides in the aqueous supernatant. In a further embodiment of the method, the cleavage process is controlled by ongoing investigations (analyzes) of the molecular size of the peptides in the aqueous supernatant.
  • the raw material with water is processed by a colloid mill with a certain gap size and a certain duration, preferably 15 to 60 min, to an eligible suspension.
  • a colloid mill with a certain gap size and a certain duration, preferably 15 to 60 min, to an eligible suspension.
  • a further embodiment provides that the temperature range of the cleavage between 140 ° C and 250 0 C is selected and a targeted pressure between 1.1 and 10 times the vapor pressure of the respective temperature is set. This advantageously ensures a uniformly liquid phase state within the system. Due to the permanently liquid state of the suspension their continuous and trouble-free promotion is guaranteed.
  • the cleavage is carried out at a temperature of> 150 0 C and a pressure> 45 bar.
  • a cleavage product profile with amino acids and peptides ⁇ 20 kDa is obtained.
  • a further embodiment provides that vegetable and animal materials, such as wheat meal or animal meal, are preferably used as raw materials for protein cleavage as raw materials, preferably by cleaning or extraction steps.
  • a further embodiment provides that the raw material for setting a specific grain size, preferably ⁇ 2 mm, is sieved.
  • concentrations of from 5 to 40% of aqueous mash are treated directly, or after sedimentation of the undissolved constituents, only the supernatant is processed.
  • a further embodiment provides that the suspension is circulated by means of a pump.
  • a booster pump is suitable for circulating the suspension.
  • the process pump is connected according to the suspension.
  • the soluble cleavage products can be used in liquid or dried form for chemical processes. They are also suitable for use as culture media for the cultivation of microorganisms.
  • the cleavage pattern of the proteins is determined by the parameters of temperature, pressure and reaction time in a reactor.
  • the pressure is consistently above the Vampfeigen mobiliss of water, so that the maintenance of a single-phase system throughout the reaction is secured.
  • a defined peptide-amino acid mixture can be obtained from protein-containing raw materials by the controlled pressure-temperature action and the reaction time even without pH change and without enzyme addition.
  • a material is obtained with the method according to the invention which is suitable as a base material for biotechnological and chemical syntheses and processes.
  • the process is controlled. Through the use of inert gas unwanted side reactions can be excluded.
  • the present invention provides a method for recycling animal meal which is variably adaptable to the required product-related process conditions.
  • the method on which the invention is based is suitable, at the same time, for ensuring the destruction of the BSE pathogen if the process control is inventively designed such that the amino acid / peptide mixture has molecular weights of the individual components below 20 kDa. It is known that the molecular weight of the BSE pathogen is 27 kDa to 30 kDa (Prusiner, St. B. (1996) TIBS 21, 482-481: Molecular biology and pathogenesis of prion diseases).
  • the process can be carried out both in continuous tubular reactors and in batch reactors.
  • Tubular reactors offer the great advantage that the reactor volume can be adapted at any time to changing qualities of the starting material.
  • Fig. 3 is an exemplary representation of the dependence of the method according to the invention of reaction time and temperature and Fig. 4 is an illustration of the embodiments Rl to R5.
  • Fig. 1 the flow of the method according to the invention is shown by way of example.
  • the raw material Prior to entry of the raw materials into a silo 1, the raw material is screened to remove foreign matter and the oversize. Then the raw material is discharged from the silo 1 by means of a known discharge device 2 and mixed with water in a stirred vessel 3 and subsequently comminuted and suspended by a colloid mill 4 with a defined gap width. By comminution in the colloid mill 4, the suspension is homogenized, and the mechanical digestion of the biomass achieves a better hydrothermal cleavage of the proteins. In order to prevent sedimentation and settling, the suspension is stirred in the stirred tank 3. After suspending, a booster pump 5 of commercially available type sucks the suspension and conveys it back into the stirred tank 3 in the circulation. The container is still stirred.
  • the inflow to a process pump 6 takes place from the pressure line of the booster pump 5.
  • the process pump 6 sets a pressure of 5-220 bar, preferably 40-100 bar, on the system side.
  • the suspension then passes first into a heat exchanger 7 in which it is heated in countercurrent by the cleavage product leaving the reactor 8.
  • the suspension is heated from about 20 0 C to 120 0 C - 140 0 C.
  • the cleavage product cools from about 140 0 C - 250 0 C to 30 0 C - 60 0 C from.
  • the reaction space consists of several tube reactors, which are connected in series.
  • the reactor 8 is heated from the outside and the suspension is heated to temperatures of 140 0 C - 250 0 C.
  • the proteins are split from the raw material to peptides and amino acids under the influence of pressure and temperature.
  • static mixing devices in the heat exchanger 7 and / or in front of the reactor 8 and / or in the reactor 8 it is possible to carry out a thorough mixing of the material flow.
  • the cleavage product has left the reactor 8 and cooled in the heat exchanger 7, it is relaxed by means of a pressure reducing valve 9 to ambient conditions. This relaxation can be done in one stage and / or two stages, but preferably in one stage.
  • the resulting in a flash tank 10 gases are passed into an external scrubber 15 to remove any odors contained.
  • the hydrolyzate collected in the flash tank 10 is then further treated by a centrifuge / decanter 11 so as to separate the existing sediment.
  • the sediment is collected in a collection container 12.
  • the thus obtained soluble phase (supernatant) is further separated by a filtration 13, preferably an ultrafiltration.
  • the filtrate obtained therefrom can be dried in a drying process 14 and used in such a way or in liquid form.
  • Fig. 2 shows temperature-response time characteristics in continuous implementation of the method.
  • reaction temperature and reaction time By maintaining a certain profile of the parameters reaction temperature and reaction time, a defined average molecular weight of the proteins is achieved at a given reaction pressure with the temperature-pressure hydrolysis process.
  • additional influencing factors are plant parameters and dry matter content in the suspension into consideration.
  • a clear influence of reaction time and temperature can be seen.
  • the temperature In order to achieve the same products, the temperature must be increased with a shorter reaction time or longer reaction times must be selected at a lower temperature.
  • molecules with a molecular weight of 10 kDa are formed on average.
  • molecules In the middle-line process, on average, molecules are formed with one Molecular weight of 15 kDa and in the process line according to the lower line on average those of 25 kDa.
  • Fig. 3 shows the dependence of the method according to the invention (protein cleavage) on the reaction time and the cleavage temperature. The following dependencies can be recognized:
  • reaction time increases, the average molecular weight decreases at the same temperature. A longer reaction time thus causes a further cleavage of the proteins into smaller fragments.
  • Fig. 4 the embodiments Rl, R2, R3, R4 and R5 are shown. Different process parameters (pressure, temperature, reaction time) are shown. By way of example, it has been proven that different average molecular weights are obtained by specific adjustment of pressure, temperature and reaction time in the plant.
  • the crude product used is animal meal produced in slaughter by-products processing plants.
  • the animal meal is sieved to remove foreign matter and oversize (> 2 mm).
  • a stirred tank 3 is added with stirring a colloid mill 4 made a 30% animal meal-water suspension.
  • the process pump 6 conveys the suspension from the storage tank and compresses it to a pressure of> 50 bar (T).
  • the temperature in the reactor 8 is> 200 0 C, the reaction time 30 min and the throughput 100 kg / h. After cleavage, the hydrolyzate suspension is depressurized in one stage from the process pressure to ambient pressure.
  • the collected hydrolyzate is then separated from the sediment by separation and filtration. Subsequently, an ultrafiltration 13 is carried out with a cut off of 20 kDa.
  • the filtrate is preferably dried in a spray dryer 14. At 300 0 C supply air and 95 0 C exhaust air temperature, a dry, free-flowing powder is obtained.
  • the yield of dry powder is 35% based on the dry matter of the starting material.
  • the proteinogenic compounds (peptides, amino acids) are at 89% of the dry matter of the product.
  • Gel chromatography of the product shows that the average molecular weight of the sample is 7 kDa.
  • the crude product used is Category II meat-and-bone meal manufactured by slaughter by-products processing plants.
  • a mash of 70 g of animal meal in 350 ml of water is made. This mash is presented in a batch reactor. With stirring, a temperature of 200 0 C is set. Under nitrogen atmosphere, a pressure of 100 bar is built up. The reaction time is 120 min.
  • the sample is separated in the centrifuge for 20 min at 3,000 g.
  • the insoluble constituents (sediment) are separated and the supernatant is used as a reaction product for further analysis.
  • the product has a yield of 58% based on the dry matter of the starting material.
  • the proteinogenic compounds are at 81% of the dry matter of the product.
  • Gel chromatography of the product shows that 100% of the sample has a molecular weight ⁇ 20 kDa.
  • a mash was made from 70 g of animal meal in 350 ml of water. This mash is presented in a batch reactor. With stirring, a temperature of 140 0 C is set. Under nitrogen atmosphere, a pressure of 100 bar is built up. The reaction time is 120 min.
  • the sample is separated in the centrifuge for 20 min at 3,000 g.
  • the insoluble constituents (sediment) are separated and the supernatant is used as a reaction product for further analysis.
  • the product has a yield of 40% based on the dry matter of the starting material.
  • the proportion of proteinogenic substances (peptides / amino acids) of the product is 84% of the dry matter of the cleavage product.
  • Gel chromatography of the product shows that 56.2% of the sample has a molecular weight ⁇ 20 kDa.
  • the raw product used is wheat meal. It is made a mash of 87.5 g of wheat meal in 350 ml of water. This mash is presented in a batch reactor. With stirring, a temperature of 180 0 C is set. Under nitrogen atmosphere, a pressure of 50 bar is built up. The reaction time is 30 min.
  • the sample is separated in the centrifuge for 20 min at 3,000 g.
  • the insoluble constituents (sediment) are separated and the supernatant filtered as a reaction product with a 0.45 micron filter and used for further analysis.
  • the product has a yield of 79.5% based on the dry matter of the starting material.
  • the proportion of proteinogenic compounds is 6% of the dry matter of the cleavage product.
  • Gel chromatography of the product shows that 99.5% of the sample has a molecular weight ⁇ 20 kDa.
  • the dry weight comprises the dissolved and undissolved ingredients of a sample, which remain after drying at 103 0 C. The drying takes place until a constant weight is reached. For evaluation, the weight is related to the volume used.
  • the standard method according to DIN 38409 - H 1 - 1 is used to determine the dry weight.
  • the dry weight is determined from both 20 ml of supernatant and the sediment of 80 ml of split animal meal suspension.
  • Inorganically and organically bound nitrogen is oxidized in the alkaline medium by digestion with peroxodisulfate to nitrate.
  • the nitrate ions react in sulfuric and phosphoric acid solution with 2,6-dimethylphenol to form a nitrophenol.
  • a cuvette test (Dr. Lange, LCK 338) is used. After deducting the inorganic nitrogen fractions, the amount of proteinogenic compounds (peptides, amino acids) can be calculated from the total nitrogen content.
  • Gel chromatography is a method of separating molecules by size using porous gel material. Larger molecules are eluted first, later the smaller ones. Based on a suitable standard with defined molecular sizes, molecular size determination by comparison is possible.
  • Gel chromatography was performed on a Pharmacia system with a column (diameter: 1.6 cm, length: 30 cm, column volume: 60.3 ml). The detection of the proteins and peptides takes place at 280 nm.
  • the stationary phase used is column material Sephadex G-100 (separation range from 4 to 150 kDa).
  • the mobile phase uses PBS buffer. To determine the molecular sizes, a gel chromatography standard from Biorad is used as marker substance.
  • the determination of the germ count by turbidity measurement in the photometer is a method for the indirect determination of the microbial count of a microorganism suspension.
  • visible light - a specific wave Length (600 nm) partially absorbed and partially scattered and can be read as optical density (OD) on the photometer scale.
  • OD optical density
  • the optical density increases in proportion to the number of microbes.
  • a minimum germ count of 5 x 10 6 cfu / ml is necessary for the measurement. Since the measurement of the OD is only up to approximately 0.3 linearly proportional to the cell count, the sample must be diluted at a higher OD.
  • CFU Coldy Forming Units

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Abstract

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzubieten, mit dem es möglich ist, Proteinhydrolysate mit definierten Molekulargewichtsgrenzen ohne pH-Wert einstellende und ohne enzymatische Verfahrensschritte herzustellen. Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit den Merkmalen des Anspruches 1. Danach ist das Verfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysaten aus proteinhaltigen pflanzlichen und tierischen Rohstoffen dadurch gekennzeichnet, dass die Rohstoffe im wässrigen Medium durch eine anhand einer Systemkennlinie gesteuerte Temperatur- und Reaktionszeiteinwirkung und unter gezieltem Druckaufbau in einem Reaktionsraum gespalten werden und dass die Suspension nach dem Spaltprozess in ein Sediment, das die unlöslichen Bestandteile des Ausgangsmaterials enthält, und einen wässrigen Überstand, in dem die Spaltprodukte der Rohstoffe gelöst sind, getrennt wird.

Description

Verfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysaten
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Hydrolysaten aus proteinhaltigen pflanzlichen und tierischen Rohstoffen.
Proteinhaltige pflanzliche und tierische Natur- und Abprodukte können in vielfältiger Weise für eine stoffliche Verwertung aufbereitet werden. In der Regel ist es dafür notwendig, die Makromoleküle (Proteine) in Aminosäuren einerseits und Peptide, die aus mehreren Aminosäuren bestehen, anderseits aufzuspalten.
Bekannt ist die Protein-Hydrolyse, die durch Zusatz von Säuren oder Basen unter Temperatureinwirkung zu einem Aminosäuregemisch führt. Nach Aufspaltung des Proteins muss die Lösung neutralisiert werden. Allerdings wird bei der Säurehydrolyse die wichtige und wirtschaftlich interessante Aminosäure Tryptophan zerstört.
Die Proteinspaltung kann auch enzymatisch mit Hilfe von Proteasen mikrobiellen Ursprungs durchgeführt werden. Dabei werden sowohl Endopeptidasen, die Peptidketten in unterschiedliche Fragmente entsprechend ihrer Spaltungsspezifität zerlegen, als auch Exopeptidasen, die Aminosäuren liefern, eingesetzt. Methoden und Verfahren der ph-Wert-abhängigen und der enzyma- tischen Proteinhydrolyse werden u. a. in GB 846682, RU 2132142 und US 6221423 dargelegt.
Makromoleküle komplexer Materialien aus tierischen und pflanzlichen Abfällen, wie Kohlenhydrate, Fette und Proteine, können auch unter Einwirkung von erhöhtem Druck und erhöhter Temperatur gespalten werden. Die entstehenden Bruchstücke werden so einer mikrobiell gestützten energetischen Verwertung, z.B. der Methanbildung, zugänglich gemacht. In US 6365047, ES 2162462T und DE 10117321 wird der Stand der Technik der Druck-Temperatur-Hydrolyse hinsichtlich der verfahrenstechnischen Lösungen dargestellt.
In DE 10113537 ist die Druck-Temperaturbehandlung für Tiermehl beschrieben. Vorwiegend unter dem Aspekt der Inaktivierung des BSE-Erregers von infiziertem Tiermehl und Fleischbrei wirken im basischen Milieu ein Druck von 2,5 bar und eine Temperatur von 150 0C mindestens 15 min auf die wässrige Tiermehlsuspension ein.
Nach EP 1406508 wird BSE-freies Tiermehl durch Totalhydrolyse des Proteins des Tiermehls zu Aminosäuren unter Zugabe von Säuren/Laugen und ggf. nachfolgender Behandlung mit Proteasen gespalten. Dem Spaltprozess muss sich eine Neutralisation anschließen.
All diese Verfahren sind jedoch nicht dazu geeignet, Hydroly- sate in definierten Molekulargewichtsgrenzen herzustellen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzubieten, mit dem es möglich ist, Proteinhydrolysate mit definierten Molekulargewichtsgrenzen ohne pH-Wert einstellende und ohne enzymatische Verfahrensschritte herzustellen.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit den Merkmalen des Anspruches 1.
Danach ist das Verfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysaten aus proteinhaltigen pflanzlichen und tierischen Rohstoffen dadurch gekennzeichnet, die Rohstoffe im wässrigen Medium durch eine anhand einer Systemkennlinie gesteuerte Temperatur- und Reaktionszeiteinwirkung und unter gezieltem Druckaufbau in einem Reaktionsraum gespalten werden und dass die Suspension nach dem Spaltprozess in ein Sediment, das die unlöslichen Bestandteile des Ausgangsmaterials enthält, und einen wässrigen Überstand, in dem die Spaltprodukte der Rohstoffe gelöst sind, getrennt wird, wobei die Spaltprodukte Proteinhydrolysate wie Peptide und Aminosäuren sind.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
In einer Ausgestaltung der Erfindung ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltung vorzugsweise im Temperaturbereich von 1400C bis 2500C, bei einem Druck von 5 bar bis 220 bar und Reaktionszeiten bis 120 min durchgeführt wird. Hierbei werden gezielt Moleküle mit definierten unterschiedlichen Molekulargewichten in der Größenordnung von 10 - 50 kDa als Spaltprodukte erhalten.
In einer weiteren Ausgestaltung ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltung der Proteinmoleküle vorzugsweise im Temperaturbereich zwischen 180 0C und 220 0C und mit einem Druck zwischen 50 und 75 bar und Reaktionszeiten von 25 bis 40 min durchgeführt wird. Vorteilhafterweise erhält man hier Proteinhydrolysate mit einem Molekulargewicht < 20 kDa.
In einer weiteren Ausgestaltung erfolgt die Spaltung in Rohrreaktoren kontinuierlich (Fig.l) oder nach dem Batch-Prinzip unter gleichzeitiger Vermeidung von Nebenprodukten.
In einer weiteren Ausgestaltung wird der Spaltprozess durch eine Analyse der Molekülgröße der Peptide im wässrigen Überstand kontrolliert. In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens wird der Spalt- prozess durch laufende Ermittlungen (Analysen) der Molekülgröße der Peptide im wässrigen Überstand kontrolliert.
In einer weiteren Ausgestaltung ist vorgesehen, dass vor dem Eintrag in den Reaktor der Rohstoff mit Wasser durch eine Kolloid-Mühle mit bestimmter Spaltgröße und bestimmter Dauer, vorzugsweise 15 bis 60 min, zu einer förderfähigen Suspension verarbeitet wird. Vorteilhafterweise wird dadurch bereits ein VoraufSchluss der Moleküle erreicht.
Eine weitere Ausgestaltung sieht vor, dass der Temperaturbereich der Spaltung zwischen 140°C und 2500C gewählt wird und ein gezielter Druck zwischen dem 1,1- und dem 10-fachen des Dampfdruckes der jeweiligen Temperatur eingestellt wird. Damit wird vorteilhafterweise ein einheitlich flüssiger Phasenzustand innerhalb des Systems sichergestellt. Durch den permanent flüssigen Zustand der Suspension ist deren kontinuierliche und störungsfreie Förderung gewährleistet.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird die Spaltung bei einer Temperatur von > 1500C und einem Druck > 45 bar durchgeführt. Hierbei wird ein Spaltproduktprofil mit Aminosäuren und Peptiden < 20 kDa erhalten.
Eine weitere Ausgestaltung sieht vor, dass .als Rohstoffe vorzugsweise durch Reinigungs- bzw. Extraktionsschritte vorbehan- delte pflanzliche und tierische Materialien wie Weizenschrot oder Tiermehl zur Proteinspaltung eingesetzt werden.
Eine weitere Ausgestaltung sieht vor, dass der Rohstoff zur Einstellung einer bestimmten Korngröße, vorzugsweise < 2 mm, gesiebt wird. In einer weiteren Ausgestaltung werden Konzentrationen von 5 bis 40% wässriger Maische direkt behandelt, oder nach Sedimentation der ungelösten Bestandteile wird lediglich der Überstand verarbeitet.
Eine weitere Ausgestaltung sieht vor, dass die Suspension mittels einer Pumpe im Kreislauf geführt wird. Insbesondere eignet sich eine Booster-Pumpe, um die Suspension im Kreislauf zu fördern. Die Prozesspumpe wird suspensionsgerecht angeschlossen.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass nach Entspannung des Reaktionsproduktes die festen von den wasserlöslichen Bestandteilen getrennt werden.
Die löslichen Spaltprodukte können in flüssiger oder getrockneter Form für chemische Verfahren eingesetzt werden. Sie eignen sich weiter dazu, als Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen eingesetzt zu werden.
Erfindungsgemäß wird durch die Parameter Temperatur, Druck und Reaktionszeit in einem Reaktor das Spaltungsmuster der Proteine festgelegt. Dabei liegt insbesondere der Druck beständig oberhalb des Dampfeigendrucks von Wasser, so dass die Einhaltung eines Einphasensystems im Reaktionsverlauf durchgängig gesichert wird.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass durch die gesteuerte Druck-Temperatureinwirkung und die Reaktionszeit auch ohne pH- Veränderung und ohne Enzymzusatz ein definiertes Peptid- Aminosäuregemisch aus proteinhaltigen Rohstoffen gewonnen werden kann. Unter strikter Einhaltung von vorgegebenen Systemkennlinien (Fig. 2) wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Material gewonnen, das als Grundstoff für biotechnologische und chemische Synthesen und Prozesse geeignet ist. Über die Analyse der Molekülgrößen der Peptide und der mikro- biellen Verwertbarkeit der Spaltprodukte wird der Prozess kontrolliert. Durch die Verwendung von Schutzgas können unerwünschte Nebenreaktionen ausgeschlossen werden.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur stofflichen Verwertung von Tiermehl, das variabel an die benötigten produktbezogenen Prozessbedingungen anpassungsfähig ist.
Das der Erfindung zugrunde liegende Verfahren ist geeignet, zugleich die Zerstörung des BSE-Erregers zu gewährleisten, wenn die Prozessführung erfinderisch so gestaltet wird, dass das Aminosäure-Peptid-Gemisch Molekulargewichte der Einzelkom- ponenten unter 20 kDa aufweist. Bekannt ist, dass das Molekulargewicht des BSE-Erregers 27 kDa bis 30 kDa beträgt (Prusi- ner, St. B. (1996) TIBS 21, 482 - 481: Molecular biology and pathogenesis of prion diseases) .
Das Verfahren kann sowohl in kontinuierlich arbeitenden Rohrreaktoren als auch in Batch-Reaktoren ausgeführt werden. Rohrreaktoren bieten den großen Vorteil, dass das Reaktorvolumen jederzeit sich ändernden Qualitäten des Ausgangsmaterials an- gepasst werden kann.
Die Erfindung wird anhand von Figuren beispielhaft erläutert.
Es zeigen
Fig. 1 eine schematische Darstellung des Verfahrensablaufes,
Fig. 2 eine beispielhafte Darstellung von Systemkennlinien (Temperatur-Reaktionszeit) im kontinuierlichen Reaktor,
Fig. 3 eine beispielhafte Darstellung der Abhängigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens von Reaktionszeit und Temperatur und Fig. 4 eine Darstellung der Ausführungsbeispiele Rl bis R5.
In Fig. 1 ist beispielhaft der Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt.
Vor dem Eintrag der Rohstoffe in ein Silo 1 wird der Rohstoff gesiebt, um Fremdbestandteile und das Überkorn zu entfernen. Dann wird der Rohstoff durch eine an sich bekannte Austrags- vorrichtung 2 aus dem Silo 1 ausgetragen und in einem Rührbehälter 3 mit Wasser gemischt und anschließend durch eine Kolloidmühle 4 mit definierter Spaltweite zerkleinert und suspendiert. Durch die Zerkleinerung in der Kolloidmühle 4 wird die Suspension homogenisiert, und durch den mechanischen Auf- schluss der Biomasse wird eine bessere hydrothermale Spaltung der Proteine erreicht. Um ein Sedimentieren und Absetzen zu verhindern, wird die Suspension im Rührbehälter 3 gerührt. Nach dem Suspendieren saugt eine Boosterpumpe 5 handelsüblichen Typs die Suspension an und fördert diese im Kreislauf in den Rührbehälter 3 zurück. Der Behälter wird weiterhin gerührt.
Der Zustrom zu einer Prozesspumpe 6 erfolgt aus der Druckleitung der Booster-Pumpe 5. Durch die Prozesspumpe 6 wird anla- genseitig ein Druck von 5 - 220 bar, vorzugsweise 40 - 100 bar, eingestellt. Die Suspension gelangt dann zunächst in einen Wärmeübertrager 7, in dem sie durch das aus dem Reaktor 8 austretende Spaltprodukt im Gegenstrom erwärmt wird. Dabei wird die Suspension von ca. 20 0C auf 120 0C - 140 0C erwärmt. Das Spaltprodukt kühlt sich dabei von ca. 140 0C - 250 0C auf 30 0C - 60 0C ab.
Nach dem Wärmeübertrager 7 wird die Suspension in den Reaktor 8 geleitet. Der Reaktionsraum besteht aus mehreren Rohrreaktoren, die in Reihe geschaltet sind. Der Reaktor 8 wird von außen beheizt und die Suspension auf Temperaturen von 140 0C - 250 0C erwärmt. Nach dem Eintritt in den Reaktor 8 werden, unter Druck- und Temperatureinfluss die Proteine aus dem Rohstoff zu Peptiden und Aminosäuren gespalten. Durch statische Mischeinrichtungen im Wärmeübertrager 7 und/oder vor dem Reaktor 8 und/oder im Reaktor 8 besteht die Möglichkeit, eine Durchmischung des StoffStromes vorzunehmen. Nachdem das Spaltprodukt den Reaktor 8 verlassen hat und im Wärmeüberträger 7 abgekühlt ist, wird es mittels eines Druckreduzierventils 9 auf Umgebungsbedingungen entspannt. Diese Entspannung kann einstufig und/oder zweistufig, vorzugsweise jedoch einstufig erfolgen. Die in einem Entspannungsbehälter 10 anfallenden Gase werden in einen externen Abgaswäscher 15 geleitet, um eventuell enthaltene Geruchsstoffe abzuscheiden. Das im Entspannungsbehälter 10 gesammelte Hydrolysat wird anschließend durch eine Zentrifuge/einen Dekanter 11 so weiterbehandelt, dass dabei das vorhandene Sediment abgetrennt wird. Das Sediment wird in einem Sammelbehälter 12 gesammelt. Nachfolgend wird die so gewonnene lösliche Phase (Überstand) durch eine Filtration 13, vorzugsweise eine ültrafiltration, weiter aufgetrennt. Das daraus erhaltene Filtrat kann in einer Trocknung 14 getrocknet werden und so oder in flüssiger Form zum Einsatz kommen.
Fig. 2 zeigt Temperatur-Reaktionszeit-Kennlinien bei kontinuierlicher Durchführung des Verfahrens. Bei Einhaltung eines bestimmten Profils der Parameter Reaktionstemperatur und Reaktionszeit wird bei einem vorgegebenen Reaktionsdruck mit dem Temperatur-Druck-Hydrolyseverfahren ein definiertes durchschnittliches Molekulargewicht der Proteine erreicht. Als zusätzliche Einflussgrößen kommen Anlagenparameter und Trockensubstanzgehalt in der Suspension in Betracht. Zu erkennen ist ein deutlicher Einfluss von Reaktionszeit und Temperatur. Um gleiche Produkte zu erreichen, muss bei geringerer Reaktionszeit die Temperatur erhöht werden bzw. bei geringerer Temperatur längere Reaktionszeiten gewählt werden. Bei Verfahrensführung gemäß oberer Linie entstehen im Durchschnitt Moleküle mit einem Molekulargewicht von 10 kDa. Bei Verfahrensführung gemäß mittlerer Linie entstehen im Durchschnitt Moleküle mit einem Molekulargewicht von 15 kDa und bei Verfahrensführung gemäß unterer Linie im Durchschnitt solche von 25 kDa.
Fig. 3 zeigt die Abhängigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens (Proteinspaltung) von der Reaktionszeit und der Spaltungstemperatur. Zu erkennen sind folgende Abhängigkeiten:
1. Mit steigender Temperatur sinkt .das durchschnittliche Peptid-Molekulargewicht. Somit wird mehr Protein gespalten und man erhält kleinere Proteinfragmente (Peptide und Aminosäuren) .
2. Mit steigender Reaktionszeit sinkt das durchschnittliche Molekulargewicht bei gleicher Temperatur. Eine längere Reaktionszeit bewirkt demnach eine weitere Spaltung der Proteine in kleinere Fragmente.
3. Die Daten sind anlagenspezifisch bei bestimmten Druckeinstellungen aufgenommen worden. Veränderungen dieser Einflussgrößen bewirken abweichende Spaltungsergebnisse der Hochdruckhydrolyse.
In Fig. 4 sind die Ausführungsbeispiele Rl, R2, R3, R4 und R5 dargestellt. Es werden unterschiedliche Verfahrensparameter (Druck, Temperatur, Reaktionszeit) dargestellt. Es wird beispielhaft belegt, dass durch spezifische Einstellung von Druck, Temperatur und Reaktionszeit in der Anlage verschiedene durchschnittliche Molekulargewichte erhalten werden.
Die Erfindung wird anhand weiterer Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Als Rohprodukt wird in Verarbeitungsbetrieben für Schlachtnebenprodukte hergestelltes Tiermehl eingesetzt. Das Tiermehl wird gesiebt, um Fremdbestandteile und Überkörn (> 2 mm) zu entfernen. In einem Rührbehälter 3 wird unter Rühren mit Hilfe einer Kolloidiαühle 4 eine 30%-ige Tiermehl-Wasser-Suspension hergestellt. Die Prozesspumpe 6 fördert die Suspension aus dem Vorlagebehälter und verdichtet diese auf einen Druck von > 50 bar (Ü) . Die Temperatur im Reaktor 8 beträgt > 2000C, die Reaktionszeit 30 min und der Durchsatz 100 kg/h. Nach der Spaltung wird die Hydrolysat-Suspension einstufig vom Prozessdruck auf Umgebungsdruck entspannt.
Das gesammelte Hydrolysat wird anschließend durch Separation und Filtration vom Sediment getrennt. Nachfolgend wird eine Ultrafiltration 13 mit einem cut off von 20 kDa durchgeführt. Das Filtrat wird vorzugsweise in einem Sprühtrockner 14 getrocknet. Bei 3000C Zuluft- und 950C Ablufttemperatur wird ein trockenes, rieselfähiges Pulver gewonnen.
Die Ausbeute an Trockenpulver beträgt 35 % bezogen auf die Trockensubstanz des Ausgangsmaterials. Die proteinogenen Verbindungen (Peptide, Aminosäuren) liegen bei 89 % der Trockensubstanz des Produktes. Die Gelchromatographie des Produktes zeigt, dass das durchschnittliche Molekulargewicht der Probe bei 7 kDa liegt.
Beispiel 2
Als Rohprodukt wird durch Verarbeitungsbetriebe für Schlachtnebenprodukte hergestelltes Tiermehl der Kategorie II eingesetzt. Es wird eine Maische aus 70 g Tiermehl in 350 ml Wasser hergestellt. Diese Maische wird in einem Batch-Reaktor vorgelegt. Unter Rühren wird eine Temperatur von 200 0C eingestellt. Unter Stickstoffatmosphäre wird ein Druck von 100 bar aufgebaut. Die Reaktionszeit beträgt 120 min.
Die Probe wird in der Zentrifuge 20 min bei 3.000 g separiert. Die unlöslichen Bestandteile (Sediment) werden abgetrennt und der Überstand als Reaktionsprodukt für die weitere Analytik verwendet. Das Produkt hat eine Ausbeute von 58 % bezogen auf die Trockensubstanz des Ausgangsmaterials. Die proteinogenen Verbindungen liegen bei 81 % der Trockensubstanz des Produktes. Die Gelchromatographie des Produktes zeigt, dass 100 % der Probe ein Molekulargewicht < 20 kDa hat.
Beispiel 3
Als Rohprodukt wird durch Verarbeitungsbetriebe für 'Schlachtnebenprodukte hergestelltes Tiermehl der Kategorie III eingesetzt. Es wurde eine Maische aus 70 g Tiermehl in 350 ml Wasser hergestellt. Diese Maische wird in einem Batch-Reaktor vorgelegt. Unter Rühren wird eine Temperatur von 140 0C eingestellt. Unter Stickstoffatmosphäre wird ein Druck von 100 bar aufgebaut. Die Reaktionszeit beträgt 120 min.
Die Probe wird in der Zentrifuge 20 min bei 3.000 g separiert. Die unlöslichen Bestandteile (Sediment) werden abgetrennt und der Überstand als Reaktionsprodukt für die weitere Analytik verwendet. Das Produkt hat eine Ausbeute von 40 % bezogen auf die Trockensubstanz des Ausgangsmaterials. Der Anteil an proteinogenen Substanzen (Peptiden/Aminosäuren) des Produktes liegt bei 84 % der Trockensubstanz des Spaltproduktes. Die Gelchromatographie des Produktes zeigt, dass 56,2 % der Probe ein Molekulargewicht < 20 kDa hat.
Beispiel 4
Als Rohprodukt wird Weizenschrot eingesetzt. Es wird eine Maische aus 87,5 g Weizenschrot in 350 ml Wasser hergestellt. Diese Maische wird in einem Batch-Reaktor vorgelegt. Unter Rühren wird eine Temperatur von 1800C eingestellt. Unter Stickstoffatmosphäre wird ein Druck von 50 bar aufgebaut. Die Reaktionszeit beträgt 30 min.
Die Probe wird in der Zentrifuge 20 min bei 3.000 g separiert. Die unlöslichen Bestandteile (Sediment) werden abgetrennt und der Überstand als Reaktionsprodukt mit einem 0,45 μm Filter filtriert und für die weitere Analytik verwendet. Das Produkt hat eine Ausbeute von 79,5 % bezogen auf die Trockensubstanz des Ausgangsmaterials. Der Anteil an proteinogenen Verbindungen liegt bei 6 % der Trockensubstanz des Spaltproduktes. Die Gelchromatographie des Produktes zeigt, dass 99,5 % der Probe ein Molekulargewicht < 20 kDa hat.
Die genannten Beispiele werden durch folgende Methoden analytisch begleitet und kontrolliert:
Bestimmung der Trockensubstanz zur Ermittlung der Produktausbeute
Das Trockengewicht umfasst die gelösten und ungelösten Inhaltsstoffe einer Probe, welche nach der Trocknung bei 1030C zurückbleiben. Die Trocknung erfolgt solange bis ein konstantes Gewicht erreicht ist. Zur Auswertung wird das Gewicht auf das eingesetzte Volumen bezogen.
Für die Bestimmung des Trockengewichtes wird das Standardver- fahre.n nach DIN 38409 - H 1 - 1 eingesetzt. Das Trockengewicht wird sowohl von 20 ml Überstand als auch vom Sediment von 80 ml gespaltener Tiermehlsuspension ermittelt.
Bestimmung der proteinogenen Verbindungen
Anorganisch und organisch gebundener Stickstoff wird im alkalischen Milieu durch einen Aufschluss mit Peroxodisulfat zu Nitrat oxidiert. Die Nitrationen reagieren in schwefel- und phosphorsaurer Lösung mit 2,6 - Dimethylphenol zu einem Nitro- phenol. Es wird analog DIN EN ISO 11905-1 mit einem Küvetten- test (Fa. Dr. Lange, LCK 338) gearbeitet. Aus dem Gesamtstickstoffgehalt kann nach Abzug der anorganischen Stickstofffrak- tionen die Menge an proteinogenen Verbindungen (Peptide, Aminosäuren) berechnet werden.
Gelchromatographie Die Gelchromatographie ist ein Verfahren, bei dem mittels porösen Gelmaterials eine Trennung von Molekülen nach ihrer Größe erfolgt. Größere Moleküle werden zuerst eluiert, später die kleineren. Auf der Grundlage eines geeigneten Standards mit definierten Molekülgrößen ist die Molekülgrößenbestimmung durch Vergleich möglich. Die Gelchromatographie wurde auf einer Pharmacia-Anlage mit einer Säule (Durchmesser: 1,6 cm, Länge: 30 cm, Säulenvolumen: 60,3 ml) durchgeführt. Die Detek- tion der Proteine und Peptide erfolgt bei 280 nm. Als stationäre Phase wird Säulenmaterial Sephadex G - 100 (Trennbereich von 4 - 150 kDa) verwendet. Als mobile Phase wird PBS-Puffer genutzt. Zur Bestimmung der Molekülgrößen wird als Markersubstanz ein Gelchromatographie-Standard der Fa. Biorad verwendet.
Bestimmung des Mikroorganismenwachstums
Zur. Überprüfung der mikrobiellen Verwertbarkeit der Proteinhydrolysate wird das Mikroorganismenwachstum mit der Probe als Nährsubstrat bestimmt. Von einer auf Nähragar befindlichen Mikroorganismenkultur wird eine einzelne Kolonie in einen Schüttelkolben mit Nährlösung angeimpft und unter entsprechenden Bedingungen 18 h kultiviert. Als Hauptkultur wird 100 ml Medium in einem 500 ml Schüttelkolben verwendet. Die einzelnen Medien werden mit je 1% der Vorkultur angeimpft. Bei entsprechender Temperatur und Belüftung (Schüttler) werden diese Hauptkulturen kultiviert. Der Verlauf der Wachstumskurve wird durch Bestimmung der Trübung im Photometer und durch die Bestimmung der Lebendkeimzahl im Stundentakt aufgenommen und anschließend ausgewertet
Bestimmung der Keimzahl durch Trübungsmessung
Die Bestimmung der Keimzahl durch Trübungsmessung im Photometer ist eine Methode zur indirekten Bestimmung der Keimzahl einer Mikroorganismensuspension. Bei der Messung einer Probe im Photometer wird sichtbares Licht- einer bestimmten Wellen- länge (600 nm) zum Teil absorbiert und zum Teil gestreut und kann als optische Dichte (OD) auf der Photometerskala abgelesen werden. Die optische Dichte nimmt proportional zur Keimzahl zu. Es ist eine Mindestkeimzahl von 5 x 106 KBE/ml für die Messung notwendig. Da die Messung der OD nur bis ca. 0,3 linear proportional zur Zellzahl ist, muss bei einer höheren OD die Probe verdünnt werden.
Bestimmung der Lebendkeimzahl mittels Spatelverfahren Bei der Lebendkeimzahlbestimmung werden die Zellen bestimmt, die in der Lage sind, eine Kolonie zu bilden. Das Ergebnis wird in „koloniebildenden Einheiten" (KBE) angegeben. In Verdünnungen mit dem Faktor 1:10 wird von der Probe eine Verdünnungsreihe bis zur erwarteten Zellzahl (z.B. 108 Zellen/ml) hergestellt und die letzten drei Verdünnungen im Spatelverfahren ausplattiert. Die Platten werden 24 h bebrütet und die Zahl der Kolonien ausgezählt und auf KBE/ml berechnet.
Bezeichnung:
1 Silo
2 AustrageVorrichtung
3 Rührbehälter
4 Kolloidmühle
5 Booster-Pumpe
6 Prozesspumpe
7 Wärmeübertrager
8 Reaktor
9 Druckreduzierventil
10 Entspannungsbehälter
11 Zentrifuge/Dekanter
12 Sammelbehälter
13 Filtration
14 Trocknung
15 Abgaswäscher

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysaten aus pro- teinhaltigen pflanzlichen und tierischen Rohstoffen, dadurch gekennzeichnet, dass die Rohstoffe im wässrigen Medium durch eine anhand einer Systemkennlinie gesteuerte Temperatur- und Reaktionszeiteinwirkung und unter gezieltem Druckaufbau in einem Reaktionsraum gespalten werden und dass die Suspension nach dem Spaltprozess in ein Sediment, das die unlöslichen Bestandteile des Ausgangsmaterials enthält, und einen wässrigen Überstand, in dem die Spaltprodukte der Rohstoffe gelöst sind, getrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltung vorzugsweise im Temperaturbereich von 140 0C bis 250 0C, bei einem Druck von 5 bar bis 220 bar und Reaktionszeiten bis 120 min durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltung der Proteinmoleküle vorzugsweise im Temperaturbereich zwischen 180 0C und 220 0C und mit einem Druck zwischen 50 und 75 bar und Reaktionszeiten von 25 bis 40 min durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltung in Rohrreaktoren kontinuierlich oder nach dem Batch-Prinzip unter gleichzeitiger Vermeidung von Nebenprodukten erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Spaltprozess durch laufende Ermittlungen (Analysen) der Molekülgröße der Peptide im wässrigen Überstand kontrolliert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Eintrag in den Reaktor der Rohstoff mit Wasser (Maische) durch eine Kolloid-Mühle mit bestimmter Spaltgröße und bestimmter Dauer, vorzugsweise 15 bis 50 min zu einer förderfähigen Suspension verarbeitet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Temperaturbereich der Spaltung zwischen 140 0C und
250 0C gewählt wird und ein gezielter Druck zwischen dem
1,1- und dem 10-fachen des Dampfdruckes der jeweiligen Temperatur eingestellt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Rohstoffe vorzugsweise durch Reinigungs- bzw. Extraktionsschritte vorbehandelte pflanzliche und tierische Materialien wie Tiermehl zur Proteinspaltung eingesetzt werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Rohstoff zur Einstellung einer bestimmten Korngröße, vorzugsweise < 2 mm, gesiebt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass
Konzentrationen von 5 bis 40 % der Maische im wässrigen und/oder nach Sedimentation der Maische der Überstand verarbeitet werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension im Kreislauf geführt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gekennzeichnet dadurch, dass nach der Entspannung des Reaktionsproduktes die festen von den wasserlöslichen Bestandteilen getrennt werden.
13. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass das lösliche Spaltprodukt in flüssiger oder getrockneter • Form für chemische Verfahren eingesetzt wird.
14. Verwendung nach Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, dass das lösliche Spaltproduktgemisch in flüssiger oder getrockneter Form für Nährmedien zur Kultivierung von Mikroben verwendet wird.
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