WO2006093222A1 - インスリンの多量体形成阻害剤 - Google Patents

インスリンの多量体形成阻害剤 Download PDF

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Takefumi Nakamura
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Definitions

  • the present invention relates to a method for inhibiting insulin dimer formation and Z or hexamer formation. Furthermore, the present invention relates to a substance that inhibits insulin dimer formation and / or hexamer formation, and an insulin preparation to which the substance is added.
  • Diabetes is a disease that causes chronic systemic metabolic disorders, and it is known that its onset is caused by insulin secretion deficiency or insulin resistance.
  • the number of people with diabetes is estimated to exceed 300 million in 2025, which is about 200 million people worldwide in 2003.
  • the market for anti-diabetic drugs is expected to exceed approximately 2 trillion yen in 2006, which is approximately 900 billion yen as of 2000. In this way, the market for targeting diabetes is very large, and research has been actively conducted in various parts of the world.
  • Antidiabetic drugs can be broadly divided into insulin and oral drugs, of which insulin products account for about half of sales.
  • wild-type insulin was used as an insulin preparation. However, it took 30 minutes or more to take effect after administration. This is because wild-type insulin has the property of first forming a dimer and then forming a hexamer in the solution formulation, and it takes time to dissociate into monomers that can be easily absorbed into capillaries. It is a cause. An attempt was made to prevent hexamerization by introducing site-specific mutations into wild-type insulin.
  • insulin analogues are less likely to form a stable hexameric structure in the preparation, and thus are absorbed into the capillaries immediately after administration and exhibit a medicinal effect.
  • insulin analogues introduced with site-specific mutations have various problems because their amino acid sequences are different from wild-type insulin.
  • insulin analogues are wild Compared with type insulin, it has the property of being easily aggregated and is unstable (see Patent Document 1 or 2). This is due to exposure to a solvent by forming a hydrophobic surface monomer of an insulin analog that has been obscured by dimer or hexamer formation.
  • Patent Literature l Bakaysa, D.L. et al., US Pat. No. 5,474,978
  • Patent Document 2 Michael, R. et al., US Patent Publication No. 20030104983
  • the present inventors have started research for the purpose of developing a super fast-acting insulin preparation using wild-type insulin itself. First, an attempt was made to inhibit dimer and / or hexamer formation without impairing the interaction between insulin and the insulin receptor. Furthermore, it was considered possible to realize a super fast-acting insulin preparation by adding a substance that inhibits dimer and / or hexamer formation to wild-type insulin.
  • one of the objects of the present invention is to provide a method for inhibiting dimer formation and / or hexamer formation of wild-type insulin.
  • Another object of the present invention is to provide a substance that inhibits dimer formation and / or hexamer formation of wild-type insulin, and to use such a substance as a super fast-acting insulin preparation. Is to manufacture.
  • the present inventors diligently studied to solve the above problems. As a result, the present inventors have completed the present invention by finding a substance capable of inhibiting insulin dimer and hexamer formation without impairing insulin receptor binding activity.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method of inhibiting insulin dimer formation and / or hexamer formation by adding a substance that interacts with insulin dimer formation surface or hexamer formation surface to an insulin solution.
  • the substance that interacts with the dimer-forming surface or hexamer-forming surface of insulin is a compound, The method according to (1), which is a peptide or protein.
  • a substance that interacts with the dimer formation surface or hexamer formation surface of insulin inhibits dimer formation and / or hexamer formation without inhibiting the binding between insulin and the insulin receptor.
  • An insulin monomer formation promoter comprising a substance that interacts with the dimer formation surface or hexamer formation surface of insulin used in any one of the methods (1) to (3).
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide of (5) or (6) and insulin.
  • a method for selecting a substance that interacts with a dimer formation surface or a hexamer formation surface of insulin and promotes insulin monomer formation includes the following steps:
  • a peptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 2 or an analog thereof and an insulin dimer or insulin hexamer are brought into contact with each other to serve as a test control for insulin monomer formation.
  • FIG. 1 Designed peptide sequence.
  • the residues present at the insulin dimer interface in the B chain ⁇ -helix region are indicated by a single underline.
  • glutamic acid residues and lysine residues incorporated so as to facilitate the formation of ⁇ -helices are indicated by double underlining.
  • FIG. 2 is a gel filtration chromatogram showing inhibition of insulin hexamer formation by INHD1 peptide or INDH2 peptide.
  • INHD1 peptide the results in the absence of INHD peptide are also shown (Insulin).
  • the hexamer is observed as the main peak (elution amount of about 12 to 13ml peak).
  • the insulin hexamer is greatly reduced. Les.
  • FIG. 3 Interaction analysis of insulin and insulin receptor using BIACORE2000. Fc-fused human insulin receptor was immobilized, and the insulin solution was calcined at time zero. In all measurements, the concentration of insulin is 5 ⁇ M.
  • the substance used in the method for inhibiting dimer formation and / or hexamer formation of insulin of the present invention interacts with the insulin dimer or hexamer formation surface, so that the dimer formation and / or hexamer formation is performed. It is a substance that inhibits the formation of a monomer. In the present specification, such a substance is referred to as an insulin multimer formation inhibitor, an insulin dimer and z or hexamer formation inhibitor, or an insulin monomer formation promoter.
  • Insulin multimer formation inhibitors are preferably substances that also select low molecular weight compounds, peptides or protein powers.
  • the insulin dimer formation surface is composed of residues consisting of a B chain helix followed by a strand, and the B chain (SEQ ID NO: 3) Nos.
  • the amino acid residue at the position is involved.
  • the surface of insulin hexamer formation refers to the amino acid residues at positions 7, 8, 9, 10, 13 of the A chain (SEQ ID NO: 5) and the third, 7, 10, 11, 14, B chain. It consists of the amino acid residue force at position 17.
  • the ⁇ -helitatus of the B chain is different in terms of force S, which is important for dimer formation and hexamer formation.
  • the insulin multimer formation inhibitor of the present invention is either a substance that interacts with either the dimer formation surface or the hexamer formation surface of insulin, or a substance that interacts with both surfaces. However, it is preferable to interact with the dimer forming surface. Insulin first forms a dimer as a step prior to forming a hexamer. In other words, between insulins, the interaction at the dimer formation surface is stronger than the interaction at the hexamer formation surface. That is, a substance that interacts with the dimer formation surface of insulin can effectively inhibit insulin dimer and hexamer formation.
  • an insulin multimer formation inhibitor one that interacts with the hexamer formation surface of insulin can be designed.
  • binding surfaces 1 and 2 for the insulin receptor.
  • the binding surface of insulin to the insulin receptor has been studied using site-specific mutagenesis and chemical modification methods.
  • the binding surface 1 has both residues of A chain Le ul 3 and B chain Leul 7.
  • Binding surface 2 includes A-chain Glyl, A-chain Ile2, A-chain Val3, A-chain Tyrl 9, ⁇ -chain Asn21, B-chain Vail 2, B-chain Tyrl6, B-chain Gly23, B-chain Phe24, B-chain Phe25, and B It is known that each residue of the chain Tyr26 is included (De Meyts, P. et al. Nat. Rev. Drug. Discov. 1, 769-783 (2002)).
  • Insulin is thought to express its physiological function by first interacting with the insulin receptor at binding surface 1 (primary binding) and then binding to the interaction at binding surface 2).
  • interaction at binding surface 2 is essential for the functional expression of insulin
  • insulin is effective because a single interaction at binding surface 2 that does not form a primary bond shows very weak insulin activity. It can be seen that primary binding through the binding surface 1 is important in order to achieve functional expression.
  • the binding surface 1 is not limited to the effective expression of insulin, but also improves the affinity between insulin and the insulin receptor, and the selectivity between other receptors such as the insulin-like growth factor receptor and the insulin receptor. It has been found to play an important role (Schlein, M. et al.
  • the insulin multimer formation inhibitor used in the present invention is preferably a substance that inhibits insulin dimer formation and hexamer formation and does not significantly impair the interaction between insulin and the insulin receptor. If the substance interacts with the binding surface of insulin and the insulin receptor at the same time as the multimer formation surface, the substance has a higher interaction with the binding surface 2 than with the binding surface 1 of insulin. More preferred. This is because, as described above, in order for insulin to exhibit effective functions, it is essential that insulin first interacts with the insulin receptor at the binding surface 1.
  • the molecular weight is measured by gel filtration experiments, etc.
  • the fact that insulin receptor binding is not inhibited can be easily determined using a commercially available device or kit such as BIAC ORE by an interaction experiment between insulin and insulin receptor. it can.
  • the insulin B chain helix interacts with the other insulin B chain helix, and the C-terminal region also forms / 3 strands, respectively. Interacts. Therefore, the substance that interacts with the dimerization surface of insulin without interacting with the binding surface 1 is the peptide corresponding to the insulin B chain chain followed by the C-terminal region or similar to the peptide. It is preferable that the substance has the structure of
  • a substance having the above-mentioned properties may be appropriately selected or designed.
  • a method for designing and selecting the compound follow the screening method for an insulin multimer formation inhibitor described later, and a compound designed by the method for designing an insulin multimer formation inhibitor described below as a reference compound. By screening the ability to form insulin monomer, screening can be performed efficiently.
  • the insulin multimer formation inhibitor of the present invention is preferably a peptide corresponding to the insulin B chain ⁇ -helix and the subsequent C-terminal region or a substance having a similar structure to the peptide.
  • the three-dimensional structure information of insulin is obtained from a database such as a protein database (www.rcsb.org/pdb/), and the molecular coordinate information of the region is used to obtain an appropriate target compound. The ability to design the structure is possible.
  • each functional group The interatomic distance is calculated on the insulin steric structure.
  • Low molecular weight compounds that meet these functional group and interatomic distance requirements can be obtained by using a chemical compound database such as Available Chemical Database (MDL Information System Inc., San Leandro, USA). Tripos Inc., St. Louis, USA) and Isis / Base (MDL Information Sys Search using search software such as tern Inc., San Leandro, USA) to extract candidate compounds.
  • the functional group to be selected is not limited to the above combinations.
  • B chain His5, Gly8, Ser9, Vail 2, Glul 3, Tyrl6, Gly20 It may be a combination of any three or more functional groups selected from the side chain forces.
  • the functional group to be used is not necessarily limited to any of the above amino acid residues.
  • the peptide is easily separated from the insulin B chain helix. It may be modified so as to make the ⁇ helix easier to interact with. For example, in order to facilitate the formation of a helix, glutamic acid residues and lysine residues can be incorporated at intervals of 3 residues in the peptide.
  • the amino acid sequence of the insulin B chain As the amino acid sequence of the insulin B chain, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 can be mentioned. Of these, residues located at the insulin dimer interface are thought to be important for hexamer formation and dimer formation inhibition. In the insulin B chain shown in IJ No. 3, amino acid residues at positions 5, 8, 9, 12, 13, 16, and 20 correspond to the dimer interface. Therefore, the amino acid sequence of positions 5-20
  • the peptide having (SEQ ID NO: 4) can be used as the insulin multimer formation inhibitor of the present invention.
  • a peptide having an amino acid sequence obtained by modifying the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 1 or 2, etc.) can also be used.
  • SEQ ID NO: 4 a glutamic acid residue and a lysine residue are introduced every three residues, and glutamic acid at the 9th position is further substituted with glutamine.
  • amino acid residues at positions 1, 4, 5, 8, 9, 12, and 16 correspond to the dimer interface.
  • position 13 of the insulin B chain (SEQ ID NO: 3) is glutamic acid, but due to electrostatic repulsion, it is known as an unfavorable residue for hexamer formation (Bentley, GA et al., J Mol. B iol. 228, 1163-1176 (1992)). Therefore, the amino acid residue corresponding to position 13 of SEQ ID NO: 3 (position 9 of SEQ ID NO: 4) was modified in the present invention and replaced with a glutamine residue in the designed peptide (SEQ ID NO: 2) (Fig. 1).
  • the peptide of SEQ ID NO: 1, 2 or 5 or a modified form thereof can be prepared according to a normal peptide synthesis method. Alternatively, it may be produced by a gene recombination method using a polynucleotide encoding these peptides.
  • the polynucleotide encoding the above peptide is a primer designed based on the nucleotide sequence encoding insulin (for example, the nucleotide sequence I registered in GenBank Accession No. J00265 etc.). If the above peptide contains an amino acid substitution relative to the wild-type sequence, the polynucleotide should be modified by site-directed mutagenesis so that such substitution occurs.
  • the polynucleotide encoding the above-mentioned polypeptide can also be obtained by synthesizing a sense strand encoding the above-mentioned polypeptide and an antisense strand having a complementary sequence thereof and annealing them.
  • the polynucleotide obtained as described above can be transformed into Escherichia coli, mammalian cells, and insect cells.
  • the target peptide can also be obtained by expressing and purifying in any suitable host cell, and the polynucleotide can be introduced into the host cell by conventional means, for example, a method using a plasmid or a viral vector. (Sambrook, J "Fritsch, EF, and Maniatis, ⁇ ," Molec ular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition ", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).).
  • positions 5, 8, 9, 12, 13, 16, and 20 forming the dimer interface positions 5, 8, 9, 12 of SEQ ID NO: 4
  • Position 16 amino acid residues are thought to be important for the inhibition of hexamer formation and dimer formation, so one or several amino acid substitutions, deletions, insertions and It may be an amino acid sequence having an attached label.
  • sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 may have one or more amino acids added to the N-terminal side and / or the C-terminal side.
  • the molecular weight of the dimer formation and hexamer formation inhibitor is too large, the molecular weight of the complex with insulin may increase, making it difficult to be taken into blood vessels. It is desirable that there are 20 residues or less in total at the N-terminal and Z- or C-terminal. In order to make the molecule smaller, amino acid residues to be added should be a total of 5 residues or less on the N-terminal and / or C-terminal side.
  • substitutions are preferably conservative substitutions: Ala to Ser or Thr, Arg to Gln, His or Lys, Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp Substitution, Asp force also from Asn, Glu or Gin, Cys to Ser or Ala, Gin to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Substitution Asp, Gly to Pro, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr, lie to Leu, Met, Val or Phe, Leu to Ile, Met, Val or Phe Substitution, Lys Ka et al.
  • the first, fourth, fifth, eighth, ninth, twelfth, and sixteenth positions forming the dimer interface It may be an amino acid sequence considered to be important for the inhibition of dimer formation and having one or several amino acid substitutions, deletions, insertions and / or attachments at other sites.
  • sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 may have one or more amino acids added to the N-terminal side and / or the C-terminal side. If the molecular weight of the dimer formation and hexamer formation inhibitor is too large, the molecular weight of the complex with insulin increases, making it difficult for the amino acid residue to be incorporated into the blood vessel. And a total of 30 residues or less on the Z or C terminal side. In addition, in order to make a smaller molecule, it is more desirable that amino acid residues to be added are 10 residues or less in total on the N-terminal and / or C-terminal side. In addition, even if it is positioned at positions 1, 4, 5, 8, 9, 12, or 16, it may be substituted with 1 or 2 amino acid amino acids or similar amino acids. It ’s not limited. The amino acid residue substitution is preferably conservative substitution as described above.
  • a desired substance can be obtained by a method other than the above-described production method.
  • a step of contacting a candidate substance with an insulin dimer or insulin hexamer and measuring insulin monomer formation, a peptide comprising the sequence described in SEQ ID NO: 2 or an analog thereof, and an insulin dimer or insulin A step of contacting the hexamer to serve as a test control for insulin monomer formation and comparing with the formation of insulin monomer in the above step 1), and from the candidate substance, a peptide or substitution containing the sequence of SEQ ID NO: 2 Insulin multimer formation inhibitor is screened by performing a step of selecting a substance having the ability to form insulin monomers, preferably 10% or more of those analogs having deletion etc. You can also.
  • insulin monomer, dimer and hexamer can be detected by, for example, gel filtration chromatography.
  • Whether or not the selected substance interacts with the dimer and / or hexamer formation surface of insulin is determined according to, for example, the method described in Example 4 described below. It can be evaluated using commercially available devices and kits.
  • the insulin multimer formation inhibitor may be a substance that weakly interacts with insulin.
  • a compound having a dissociation constant with insulin of 0. InM or more is preferable. This is because the blood concentration of insulin that expresses physiological functions is 0.1 to:! OnM. Substances with a dissociation constant of 0. InM or higher will not inhibit insulin receptor binding, regardless of the binding site to insulin. On the other hand, the insulin concentration in the preparation is very high, for example, lOOUZmL (about 600 ⁇ ), and even a weakly interacting substance can inhibit insulin hexamer formation.
  • insulin induces a structural change when interacting with the insulin receptor on the binding surface 1, and this structural change causes an interaction with the dimer or hexamer formation surface of insulin. It is expected that the insulin multimer formation inhibitor was released from insulin.
  • wild-type insulin that causes the action of an insulin multimer formation inhibitor is particularly limited, such as human insulin, ushi insulin, porcine insulin, insulin lisp mouth, insulin aspart, and avidra insulin.
  • human insulin is preferable from the viewpoint of reducing side effects when applied to humans.
  • it contains protamine, zinc ions, and cobanenoto ions.
  • insulin multimer formation method of the present invention By applying the insulin multimer formation method of the present invention at any power stage in the preparation process of a normal insulin preparation, it is possible to inhibit insulin dimer and hexamer formation, and as a result. Insulin can be stabilized in monomer form in the preparation. That is, by blending the insulin multimer formation inhibitor of the present invention with insulin, it is possible to produce a super fast-acting insulin preparation that acts immediately after insulin is administered subcutaneously.
  • the insulin multimer formation inhibitor and insulin of the present invention may be formulated in combination with a pharmaceutically acceptable carrier such as a diluent, stabilizer, preservative, and buffer.
  • the dosage form of the insulin preparation of the present invention is not particularly limited. For example, it can be used as an injection, a nasal administration agent, a pulmonary absorption agent, a transdermal / transmucosal preparation. In addition, when insulin is absorbed directly from the lungs or skin, insulin is a single amount.
  • the insulin preparation of the present invention can be used as a dosage form other than an injection. Therefore, the present invention has versatility. Furthermore, it can be used to stably store insulin monomers. The details of the insulin preparation are described in Nihon Rinsha Co., Ltd. Nihon Rinkyu Special Issue “New Age Diabetes 3” 2002 P179-309 etc., and the insulin multimer formation inhibitor of the present invention was added.
  • the super fast-acting insulin preparation of the present invention can be similarly formulated.
  • the super fast-acting insulin preparation of the present invention is useful as a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of diabetes.
  • the inhibitor of the present invention is added to an insulin solution, it is preferably added at a concentration of 0.1 to 10,000 times that of insulin.
  • B chain ⁇ -helix followed by C-terminal region constructs a dimer formation surface and electrostatic repulsion of cocoon chain Glul 3 makes the hexamer formation interface extremely It has a weak interaction, force S. Therefore, the peptide corresponding to positions 5 to 29 of the B chain was partially modified as shown below.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence IJ of the designed peptide
  • SEQ ID NO: 3 shows the insulin B chain sequence.
  • sequences of the insulin B chain helix region iiis5, Gly8, Ser9, Vail 2, Glul 3, Tyrl6, and Gly20, which are indicated by a single underline in Fig. 1, are mainly present at the insulin dimer interface. ing. Therefore, with the exception of these residues, glutamine and lysine residues were introduced at intervals of 3 residues.
  • Insulin Hexamer Dismptor (INHD1) peptide (SEQ ID NO: 1).
  • INDH1 page In order to identify an important site in the peptide, a peptide that cut out only the portion corresponding to the ⁇ helix of insulin B chain (5-20) was designed and named INDH2 (SEQ ID NO: 2)
  • Figure 2 shows the results. In the case of 5 insulin solution, hexamer force S is observed as the main peak, and the monomer ratio is very low.
  • FIG. 1 shows the experimental results when 5 ⁇ M insulin and 500 ⁇ ⁇ INDH1 peptide were mixed. In the presence of INDH1 peptide, the peak of insulin hexamer was significantly reduced, and it was revealed that INDH1 peptide inhibited insulin hexamer formation.
  • the INHD2 peptide had slightly lower hexamer formation inhibitory activity than the INHD1 peptide, similar results were obtained (Fig. 2). As a result, the amino acid residues at positions 1, 4, 5, 8, 9, and 12 in the peptide sequence shown in SEQ ID NO: 2 could be shown to be important.
  • Insulin exists mainly as a hexamer (Fig. 2), and exists mainly as a monomer in the absence of ZnCl.
  • the peptide does not inhibit the binding of insulin and insulin receptor. Since insulin has two independent receptor binding sites, it was found that inhibition of hexamer formation did not impair receptor binding.
  • insulin dimer formation and hexamer formation can be inhibited without impairing insulin receptor binding activity. Furthermore, a super fast-acting insulin preparation using wild-type insulin can be prepared.

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Abstract

インスリン溶液にインスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質を添加して、インスリンの二量体形成および／又は六量体形成が阻害された超速効型インスリン製剤を提供する。

Description

明 細 書
インスリンの多量体形成阻害剤
技術分野
[oooi] 本発明は、インスリンの二量体形成及び Z又は六量体形成を阻害する方法に関す る。さらに、インスリンの二量体形成及び/又は六量体形成を阻害する物質、及び当 該物質が添加されてなるインスリン製剤に関する。
背景技術
[0002] 糖尿病は慢性の全身性代謝障害を引き起こす疾患であり、その発症原因はインス リン分泌不全またはインスリン抵抗性によることが知られている。糖尿病疾患者数は、 全世界において 2003年の時点で約 2億人である力 2025年には 3億人を超えると 予想されている。また、糖尿病治療薬の巿場は、全世界において 2000年の時点で 約 9000億円である力 2006年には 2兆円を超えると予想されている。このように、糖 尿病をターゲットした市場規模は非常に大きぐこれまで世界各地で盛んに研究が行 われてきた。
糖尿病治療薬は、インスリン製剤および経口剤に大別でき、そのうちインスリン製剤 は売り上げの約半分を占める。インスリン製剤として以前は野生型インスリンを用いて レ、たが、投与してから薬効を示すまでに 30分以上の時間を要するという難点があつ た。これは、野生型インスリンが溶液製剤中でまず二量体を形成し、さらに六量体を 形成する性質を持っており、毛細血管へ容易に吸収され得る単量体へ解離するまで に時間を要することが原因である。そこで、野生型インスリンに部位特異的変異を導 入して六量体化を妨げる試みが行われた。その結果として、短時間で薬効を示す超 速効型のインスリン製剤、例えばリスプ口インスリン (ィーライリリー社）、ァスパルトイン スリン（ノボ 'ノルディスク社）、およびァピドラインスリン（アベンテイス'ファーマシュー ティカルス社)が開発された。このようなインスリンアナログは、製剤中で安定な六量体 構造を形成しにくいため、投与後速やかに毛細血管へ吸収されて薬効を示す。しか し、部位特異的変異を導入したインスリンアナログは、野生型インスリンとはアミノ酸配 列が異なることから、様々な問題点も生じている。例えば、インスリンアナログは野生 型インスリンと比べて凝集しやすい性質があり、不安定であることが挙げられる（特許 文献 1又は 2参照）。これは、二量体あるいは六量体形成により覆い隠されていたイン スリンアナログの疎水面力 単量体化することによって溶媒へ露出してしまうことによ る。
このような背景の中、より安定なインスリンアナログを開発する試みは今でも行われ ているが、インスリンの変異体を用いている限り、六量体形成を阻害することは実現で きても、変異体の示す未知の副作用や物性に関しては、その危惧が消えることはな レ、。
特許文献 l : Bakaysa， D.L. et al.，米国特許第 5,474,978号明細書
特許文献 2 : Michael, R. et al.,米国特許公開第 20030104983号明細書
発明の開示
[0003] 本発明者らは、野生型インスリンそのものを用いて超速効型インスリン製剤を開発 することを目的に研究を開始した。まず、インスリンとインスリン受容体の相互作用を 損なうことなぐ二量体及び/又は六量体形成を阻害することを試みた。さらに、野生 型インスリンに二量体及び/又は六量体形成を阻害する物質を添加することによつ て、超速効型インスリン製剤を実現することが可能であると考えた。
すなわち、本発明の課題の一つは、野生型インスリンの二量体形成および/又は 六量体形成を阻害する方法を提供することである。また、本発明の別の課題は、野生 型インスリンの二量体形成および/又は六量体形成を阻害する物質を提供すること 、及びそのような物質を用レ、て超速効型インスリン製剤を製造することである。
[0004] 本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した。その結果、インスリンの レセプター結合活性を損なわずに、インスリンの二量体および六量体形成を阻害で きる物質を見出して、本発明を完成させるに至った。
[0005] すなわち、本発明は、以下の態様を含むものである。
(1)インスリン溶液に、インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用す る物質を添加することにより、インスリンの二量体形成および/又は六量体形成を阻 害する方法。
(2)インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質が、化合物、 ペプチド又はタンパク質であることを特徴とする、 (1)の方法。
(3)インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質が、インスリ ンとインスリンレセプターとの結合を阻害することなく二量体形成及び/又は六量体 形成を阻害するものである、（1)又は（2)のレ、ずれかの方法。
(4) (1)〜（3)のいずれかの方法に用いられるインスリンの二量体形成面又は六量 体形成面と相互作用する物質からなるインスリン単量体形成促進剤。
(5)インスリンの二量体および Zまたは六量体形成を阻害する活性を有するぺプチ ドであって、以下の（a)〜（d)のレ、ずれかのアミノ酸配列を含むペプチド：
(a)配列番号 4記載のアミノ酸配列、
(b)配列番号 4記載のアミノ酸配列において、第 1， 4, 5, 8， 9， 12及び 16位のアミ ノ酸残基以外の 1若しくは数個のアミノ酸残基に置換、欠失、揷入及び/又は付加を 有するアミノ酸配列、
(c)配列番号 1または 2記載のアミノ酸配列、又は
(d)配列番号 1または 2記載のアミノ酸配列において、第 2、 3、 6、 7、 10、 11、 13、 14及び 15位のアミノ酸残基のうちの 1若しくは数個のアミノ酸残基に置換、欠失、挿 入および/または付加を有するアミノ酸配列。
(6)配列番号 2記載のアミノ酸配列において、第 2、 3、 6、 7、 10、 11、 13、 14及び 15位のアミノ酸残基のうちの 1若しくは数個のアミノ酸残基に置換、欠失、挿入およ び/または付加を有し、第 1、 4、 5、 8、 9、 12及び 16位のアミノ酸残基のうちの少な くとも 5残基が保持されてなる、インスリンの二量体および六量体形成を阻害するぺプ チド。
(7) (5)または（6)のペプチド及びインスリンを含む医薬組成物。
(8)インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用を有し、インスリン単 量体形成を促進する物質を選択する方法であって、以下の工程を含む方法：
1)候補物質を、インスリン二量体又はインスリン六量体と接触せしめ、インスリン 単量体形成を測定する工程、
2)配列番号 2記載の配列を含むペプチドまたはそのアナログとインスリン二量体 又はインスリン六量体を接触せしめ、インスリン単量体形成の被検対照とし、前記ェ 程 1)のインスリン単量体形成と比較する工程、及び
3)候補物質から、配列番号 2記載の配列を含むペプチドまたはそのアナログと 同程度以上のインスリン単量体形成能を有する物質を選択する工程。
(9)インスリン含有製剤を製造する方法であって、 (8)の方法を用いてインスリン単 量体形成能を有する物質を同定する工程、並びに、該物質をインスリンを含有する 溶液に添加する工程を含む方法。
図面の簡単な説明
[0006] [図 1]設計したペプチドの配列。インスリン B鎖のアミノ酸配列のうち、 B鎖 αヘリックス 領域でインスリン二量体界面に存在する残基を一重下線で示した。また、 αヘリック スを形成しやすいように組み込んだグルタミン酸残基とリジン残基を二重下線で示し た。
[図 2]INHD1ペプチドまたは INDH2ペプチドによるインスリン六量体形成の阻害を 示したゲル濾過クロマトグラムである。対照として、 INHDペプチド非存在下の結果も 示している（Insulin)。 5 /i Mのインスリン溶液の場合、六量体がメインピーク（溶出量 約 12〜： 13mlのピーク）として観測される力 INHD1ペプチドを添加したことにより、 インスリン六量体が大幅に減少してレ、る。
[図 3]BIACORE2000による、インスリンとインスリンレセプターの相互作用解析。 Fc融 合ヒトインスリンレセプターを固定化し、インスリン溶液を時間ゼロのときに添カロした。 全測定においてインスリンの濃度は 5 μ Mである。 (a) ZnCl存在下、非存在下におけ るインスリンのインスリンレセプター結合実験。インスリンは ZnCl存在下では六量体を 形成し、非存在下では単量体として存在する。 (b) INHD1および INHD2ペプチド 存在下、非存在下におけるインスリンのインスリンレセプター結合。溶媒には ZnClを 添加しているため、ペプチド非存在下ではインスリンは六量体を形成している。ぺプ チドを添加することにより、六量体形成が阻害され、インスリンとインスリンレセプター の相互作用が向上している。
発明を実施するための最良の形態
[0007] 以下、本発明を具体的に説明する。
[0008] <インスリン多量体形成阻害剤 > 本発明のインスリンの二量体形成および/又は六量体形成を阻害する方法に用い る物質は、インスリン二量体又は六量体形成面と相互作用し、該ニ量体形成および /又は六量体の形成を阻害する物質である。本明細書においては、このような物質 を、インスリン多量体形成阻害剤、インスリン二量体および z又は六量体形成阻害剤 、またはインスリン単量体形成促進剤などと呼ぶ。
インスリン多量体形成阻害剤は、低分子化合物、ペプチド又はタンパク質力も選択 される物質であることが好ましレ、。
[0009] インスリン二量体および六量体の立体構造についてはすでに報告されており、イン スリン同士が相互作用する二量体および六量体形成面が明らかになつている（Blund ell, T.し et al., Nature 231, 506—511 (1971)、 Baker, E.N., Philos. Trans. R. So Lo ndon 319， 369—456 (1998)、 Derawenda, U. et al. , Nature 338, 594—596 (1989)、 Bad ger, J. Acta Crystallogr., Sect. B 47， 127-136 (1991))。インスリン二量体形成面とは 、 B鎖ひへリックスとそれに続く ストランドからなる残基から構成され、 B鎖（配列番号 3)の第 5、 8、 9、 12、 13、 16、 20— 29位のアミノ酸残基が関与している。一方、イン スリン六量体形成面とは、 A鎖（配列番号 5)の第 7、 8、 9、 10、 13位のアミノ酸残基と B鎖の第 3、 7、 10、 11、 14、 17位のアミノ酸残基力ら構成されている。 B鎖の αへリツ タスは二量体形成にも六量体形成にも重要である力 S、関与してレ、る面は異なる。
[0010] 本発明のインスリン多量体形成阻害剤は、インスリンの二量体形成面と六量体形成 面のいずれかと相互作用する物質、または、両方の面と相互作用する物質のいずれ であっても良いが、二量体形成面と相互作用することが好ましい。インスリンは六量体 を形成する前段階として、まず二量体を形成する。言い換えれば、インスリン同士で は、六量体形成面における相互作用よりも二量体形成面おける相互作用の方が強 レ、。つまり、インスリンの二量体形成面に相互作用する物質は、効果的にインスリンの 二量体および六量体形成を阻害することができる。
[0011] インスリン多量体形成阻害剤として、インスリンの六量体形成面と相互作用するもの を設計することも可能である。
[0012] インスリンとインスリンレセプターとの相互作用については、力イネティックス解析に よって、インスリンレセプターに対して 2分子以上のインスリンが結合すること、および 、インスリンはインスリンレセプターに対して 2つの結合面 (結合面 1および 2)を持つこ とが知られている。インスリンのインスリンレセプターに対する結合面については、部 位特異的変異法や化学修飾法などを用いて研究されており、結合面 1には、 A鎖 Le ul 3と B鎖 Leul 7の両残基力 結合面 2には A鎖 Glyl、 A鎖 Ile2、 A鎖 Val3、 A鎖 T yrl 9、 Α鎖 Asn21、 B鎖 Vail 2、 B鎖 Tyrl6、 B鎖 Gly23、 B鎖 Phe24、 B鎖 Phe25 、および B鎖 Tyr26の各残基が含まれることが知られている（De Meyts, P. et al. Nat. Rev. Drug. Discov. 1, 769-783 (2002))。
インスリンは、まず結合面 1においてインスリンレセプターと相互作用（一次結合）し た後、結合面 2において相互作用に次結合)することによって、生理機能を発現す ると考えられてレ、る。インスリンの機能発現には結合面 2における相互作用が必須で あるが、一次結合を形成していない結合面 2における単独の相互作用においては非 常に微弱なインスリン活性しか示さないことから、インスリンが効果的な機能発現を行 うためには、結合面 1を介した一次結合が重要であることがわかる。また、インスリンの 効果的な機能発現に留まらず、インスリンとインスリンレセプターとの親和性の向上、 および他のレセプター、例えばインスリン様成長因子レセプターとインスリンレセプタ 一との選択性においても、結合面 1が重要な役割を果たしていることが明らかとなつ ている（Schlein, M. et al. Biochemistry 40, 13520-13528 (2001)、 Pillutla, R.C. et al. J. Biol. Chem. 277, 22590—22594 (2002)、 Schaifer, L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 100, 4435-4439 (2003))。
そこで、本発明に用いるインスリン多量体形成阻害剤としては、インスリンの二量体 形成および六量体形成を阻害し、かつ、インスリンとインスリンレセプターとの相互作 用を大きく損なわない物質が好ましい。当該物質が、多量体形成面と同時に、インス リンとインスリンレセプターの結合面にも相互作用を有する場合は、インスリンの結合 面 1よりも結合面 2とより高い相互作用を有する物質であれば、より好ましい。これは、 上記で述べたように、インスリンが効果的な機能発現を行うためには、インスリンがィ ンスリンレセプターに対して、まず結合面 1において相互作用することが必須であるこ とによる。
当該物質が多量体形成を阻害することはゲルろ過実験などによって分子量を測定す ることにより判定することができ、また、インスリン受容体結合を阻害しないことは BIAC ORE等入手可能な市販の装置やキットを用い、インスリンとインスリン受容体の相互 作用実験により容易に判定することができる。
[0014] インスリン二量体の立体構造において、インスリン B鎖のひへリックスは、もう一方の インスリン B鎖のひヘリックスと相互作用し、また、 C末領域もそれぞれ /3ストランドを 形成することによって相互作用している。したがって、結合面 1と相互作用することな ぐインスリンの二量体形成面に対して相互作用する物質は、インスリン B鎖ひへリツ タスおよびそれに続く C末端領域に対応するペプチド又は当該ペプチドと類似の構 造を有する物質であることが好ましレヽ。
[0015] <インスリン多量体形成阻害剤の製造方法 >
本発明に用いるインスリン多量体形成阻害剤を製造するには、上記の特性を備え た物質を適宜選択、又は、設計すればよい。当該化合物を設計、選択する方法とし ては、後述するインスリン多量体形成阻害剤のスクリーニング方法に従レ、、以下に述 ベるインスリン多量体形成阻害剤の設計方法により設計される化合物をリファレンス 化合物とし、インスリン単量体形成能を検定することにより、効率的にスクリーニングを 実施することが出来る。
(1)インスリン多量体形成阻害剤の設計
前述のとおり、本発明のインスリン多量体形成阻害剤は、インスリン B鎖 αヘリックス およびそれに続く C末端領域に対応するペプチド又は当該ペプチドと類似の構造を 有する物質であることが好ましい。かかる物質を設計するには、インスリンの立体構造 情報をプロテインデータベース（www.rcsb.org/pdb/)等のデータベースから入手し、 当該領域の分子座標情報を利用することにより、適切な目的化合物の構造を設計す ること力 Sできる。例えば、二量体界面に含まれる Β鎖 Vall 2のメチル基、 B鎖 Glul 3の カルボキシアミド基、および B鎖 Tyrl6の芳香環の 3つの官能基を模倣した化合物を 設計する場合、各官能基の原子間距離をインスリン立体構造上において算出する。 これら官能基と原子間距離の条件に合致する低分子化合物を、 Available Chemical Database (MDL Information System Inc. , San Leandro, USA)などのィ匕合物データべ ~ス ίこおレヽて、 Sybyl (Tripos Inc., St. Louis, USA)や Isis/Base (MDL Information Sys tern Inc., San Leandro, USA)などの検索ソフトを用いて探索し、候補化合物を抽出 する。得られた候補化合物群がインスリンの多量体形成を阻害することをゲルろ過実 験などで評価することによって、二量体界面を模した低分子化合物を合理的に得る ことができる。二量体界面を模倣した化合物を設計する上で、選択する官能基は上 記の組み合わせに限定されるものではなぐ例えば、 B鎖 His5、 Gly8、 Ser9、 Vail 2、 Glul 3、 Tyrl6、 Gly20の側鎖力、ら選択される任意の 3つ、もしくはそれ以上の官 能基の組み合わせであっても良い。ただし、用いる官能基は、上記各アミノ酸残基の いずれかに必ずしも限定されるものではない。
(2)インスリン多量体形成阻害活性を有するペプチドの設計
インスリン多量体形成阻害剤として、インスリン B鎖 aヘリックスおよびそれに続く C 末端領域に対応するペプチド又は当該ペプチドと類似の構造を有するペプチドを選 択する場合、当該ペプチドはインスリン B鎖のひヘリックスと容易に相互作用させるた めに、より αヘリックスの構造をとりやすくするように改変されたものでもよい。例えば、 aヘリックスを形成し易くするために、該ペプチドにおいて 3残基間隔でグルタミン酸 残基とリジン残基を組み入れることができる。
なお、 αヘリックスを形成するペプチドを作製する方法としては、ペプチドをリンカ一 によって環化する方法（Judice, J.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13426-13 430 (1997))や、金属イオンをキレートさせる方法（Kelso, M.J. et al. , J. Am. Chem. S oc. 122, 10488-10489 (2000))などが確立されている。また、 αヘリックスを形成する タンパク質を铸型として必要な残基を組み込む方法（Zondlo, N.J. et al., J. Am. Che m. Soc. 121， 6938-6939 (1999)、 Schepartz, S.A. et al., U.S. Patent Application 200 30166240)なども報告されており、いずれもインスリンの二量体および六量体形成を 阻害するペプチドを設計する方法として適用することができるが、該方法に限定され るものではない。
インスリン B鎖のアミノ酸配列としては配列番号 3のアミノ酸配列が挙げられる。このう ちのインスリン二量体界面に位置する残基が六量体形成や二量体形成の阻害に重 要と考えられる。酉己歹 IJ番号 3に記したインスリン B鎖では第 5、 8、 9、 12、 13、 16、 20 位のアミノ酸残基が二量体界面に対応する。したがって、第 5〜20位のアミノ酸配列 (配列番号 4)を有するペプチドを本発明のインスリン多量体形成阻害剤として用いる こと力 Sできる。
さらに、配列番号 4のアミノ酸配列を改変したアミノ酸配列を有するペプチド（配列 番号 1または 2など）を用いることもできる。これらの配列は、配列番号 4のアミノ酸配 列において、 3残基ごとにグルタミン酸残基とリジン残基を導入し、さらに、第 9位のグ ルタミン酸をグルタミンに置換したものである。
この配列番号 1または 2に記したペプチドでは第 1、 4、 5、 8、 9、 12、 16位のアミノ 酸残基が二量体界面に対応する。
インスリン B鎖（配列番号 3)の第 13位はグルタミン酸であるが、静電的な反発のた め、六量体形成に好ましくない残基として知られている（Bentley, G.A. et al., J.Mol.B iol.228, 1163-1176 (1992))。したがって、配列番号 3の第 13位（配列番号 4の第 9位） に対応するアミノ酸残基は、本発明において改変し、設計したペプチド（配列番号 2) ではグルタミン残基へと置換した（図 1)。
なお、配列番号 1 , 2または 5のペプチド、それらの改変体などは通常のペプチド合 成法に従って作製することができる。また、これらのペプチドをコードするポリヌクレオ チドを用いた遺伝子組換え法によって作製してもよい。遺伝子組換え法を利用する 場合、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、インスリンをコードする塩基配列 (例えば、 GenBank Accession No.J00265などに登録されている塩基配歹 I に基づい て設計されたプライマーを用いた PCR法によって得ることができる。また、上記べプチ ドが野生型の配列に対してアミノ酸置換を含む場合は、そのような置換が生じるよう に部位特異的変異法によってポリヌクレオチドを改変すればよい。さらに、上記ポリべ プチドをコードするポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードするセンス鎖と、そ の相補配列を有するアンチセンス鎖をそれぞれ合成し、それらをアニーリングさせる ことによつても得ることができる。上記のようにして得られたポリヌクレオチドを大腸菌、 哺乳動物細胞、昆虫細胞などの適当な宿主細胞において発現させ、精製することに よって目的ペプチドを得ることもできる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は通常 の手段によって行うことができ、例えば、プラスミドを用いる方法やウィルスベクターを 用いる方法などが挙げられる（Sambrook, J" Fritsch, E.F. , and Maniatis, Τ·， "Molec ular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).)。
インスリン B鎖（配列番号 3)のうち、二量体界面を形成する第 5、 8、 9、 12、 13、 16 、 20位（配列番号 4の第 1、 4、 5、 8、 9、 12、 16位）のアミノ酸残基が六量体形成や 二量体形成の阻害に重要であると考えられるため、それ以外の残基に 1若しくは数 個のアミノ酸の置換、欠失、揷入及び/又は付カ卩を有するアミノ酸配列であっても良 レ、。
また、配列番号 3または 4の配列は N末端側及び/または C末端側に 1または複数 のアミノ酸が付加されたものであってもよい。ただし、二量体形成及び六量体形成阻 害剤の分子量が大きくなりすぎるとインスリンとの複合体の分子量が大きくなり、血管 へ取り込まれにくくなる恐れがあることから、付加するアミノ酸残基は N末端及び Z又 は C末端側に合計 20残基以下であることが望ましい。また、より小さい分子とするた めには、付加するアミノ酸残基は N末端及び/又は C末端側に合計 5残基以下であ ること力 Sより望ましレ、。さらに、酉己歹 IJ番号 3の酉己歹 IJにおける、第 5、 8、 9、 12、 13、 16、 20位（配列番号 4の第 1、 4、 5、 8、 9、 12、 16位）、および改変したアミノ酸配列を有 するペプチドにおけるこれらに対応する部位においても、 1乃至は 2残基のアミノ酸の 置換や類似したアミノ酸への置換があっても良ぐ該配列に限定されるものではない
なお、上記置換は保存的置換が好ましぐ保存的置換としては、 Alaから Ser又は Thr への置換、 Argから Gln、 His又は Lysへの置換、 Asnから Glu、 Gln、 Lys、 His又は Aspへ の置換、 Asp力も Asn、 Glu又は Ginへの置換、 Cysから Ser又は Alaへの置換、 Ginから Asn、 Glu、 Lys、 His, Asp又は Argへの置換、 Gluから Gly、 Asn、 Gln、 Lys又は Aspへの 置換、 Glyから Proへの置換、 Hisから Asn、 Lys、 Gln、 Arg又は Tyrへの置換、 lieから Le u、 Met, Val又は Pheへの置換、 Leuから Ile、 Met, Val又は Pheへの置換、 Lysカゝら Asn 、 Glu、 Gln、 His又は Argへの置換、 Metから Ile、 Leu、 Val又は Pheへの置換、 Phe力、ら T 卬、 Tyr, Met, lie又は Leuへの置換、 Serから Thr又は Alaへの置換、 Thrから Ser又は A laへの置換、 TYpから Phe又は Tyrへの置換、 Tyrから His、 Phe又は TYpへの置換、及び 、 Val力 Met、 lie又は Leuへの置換などが挙げられる。 [0019] インスリン B鎖 aヘリックスに対応するペプチド（配列番号 1または 2)の場合、二量 体界面を形成する第 1、 4、 5、 8、 9、 12、 16位が六量体形成や二量体形成の阻害 に重要であると考えられ、それ以外の部位に 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、 揷入及び/又は付カ卩を有するアミノ酸配列であっても良い。
また、配列番号 1または 2の配列は N末端側及び/または C末端側に 1または複数 のアミノ酸が付加されたものであってもよい。二量体形成及び六量体形成阻害剤の 分子量が大きくなりすぎるとインスリンとの複合体の分子量が大きくなり、血管へ取り 込まれにくくなる恐れがあることから、付加するアミノ酸残基は N末端及び Z又は C末 端側に合計 30残基以下であることが望ましい。また、より小さい分子とするためには、 付加するアミノ酸残基は N末端及び/又は C末端側に合計 10残基以下であることが より望ましレヽ。さらに、第 1、 4、 5、 8、 9、 12、 16位におレヽても、 1乃至は 2残基のァミノ 酸の置換や類似したアミノ酸への置換があっても良ぐ該配列に限定されるものでは なレ、。なお、アミノ酸残基の置換は上述したような保存的置換が好ましい。
[0020] <インスリン多量体形成阻害剤のスクリーニング方法 >
インスリン多量体形成阻害剤としては、上述した製造方法以外の方法によっても目 的とする物質を得ることができる。
すなわち、候補物質を、インスリン二量体又はインスリン六量体と接触せしめ、イン スリン単量体形成を測定する工程、配列番号 2記載の配列を含むペプチドまたはそ のアナログとインスリン二量体又はインスリン六量体を接触せしめ、インスリン単量体 形成の被検対照とし、前記工程 1)のインスリン単量体形成と比較する工程、および 候補物質から、配列番号 2記載の配列を含むペプチドまたは置換 ·欠失等を有する そのアナログと同程度、好ましくはそれらの 10%以上のインスリン単量体形成能を有 する物質を選択する工程を実行することによって、インスリン多量体形成阻害剤をス クリーニングすることもできる。
なお、インスリン単量体、二量体および六量体の形成は、例えば、ゲルろ過クロマト グラフィーなどによって検出することができる。
選択された物質がインスリンの二量体および/または六量体形成面と相互作用す るか否かについては、例えば、後述する実施例 4に記載の方法に従って、 BIACORE 等入手可能な市販の装置やキットを用いて評価することができる。
[0021] インスリン多量体形成阻害剤は、インスリンと弱い相互作用をする物質であっても良 レ、。その場合、インスリンとの解離定数が 0. InM以上を示す化合物であることが好ま しい。これは、生理機能を発現するインスリンの血中濃度が 0. 1〜： !OnMであること による。解離定数が 0. InM以上の物質では、インスリンへの結合部位に関わらず、 インスリンの受容体結合を阻害することはなレ、。一方で、製剤中のインスリン濃度は、 例えば lOOUZmL (約 600 μ Μ)と非常に高濃度であり、弱い相互作用をする物質 であってもインスリンの六量体形成を阻害し得る。
なお、インスリンは結合面 1においてインスリンレセプターと相互作用した際に構造 変化を誘起することが知られており、この構造変化に伴ってインスリンの二量体また は六量体形成面に相互作用をしていたインスリン多量体形成阻害剤がインスリンと解 離することが期待される。
[0022] なお、インスリン多量体形成阻害剤を作用させる野生型インスリンとしては、ヒトイン スリン、ゥシインスリン、ブタインスリン、インスリンリスプ口、インスリンァスパルト、およ びアビドラインスリンなど、特に限定されるものではなレ、が、ヒトに適用する場合は副 作用低減の観点などからヒトインスリンが好ましい。また、プロタミン、亜鉛イオン、コバ ノレトイオンなどが含まれてレ、ても良レヽ。
[0023] 本発明のインスリン多量体形成方法を通常のインスリン製剤の製剤工程のいずれ 力の段階で適用することによって、インスリンの二量体および六量体形成を阻害する ことが可能となり、結果として、製剤中でインスリンを単量体型で安定化することができ る。つまり、本発明のインスリン多量体形成阻害剤をインスリンに配合することによって 、インスリンが皮下に投与された後、直ちに作用する、超速攻型インスリン製剤を作製 すること力 Sできる。本発明のインスリン多量体形成阻害剤及びインスリンは、希釈剤、 安定剤、保存剤、緩衝剤等の薬学的に許容され得るキャリアと組合わせて配合しても よい。
本発明のインスリン製剤の剤形は、特に限定されるものではないが、例えば、注射 剤や、経鼻投与剤、経肺吸収剤、経皮 ·経粘膜適用製剤として用いることができる。 また、肺や皮膚などからインスリンを直接吸収させる場合においてもインスリンは単量 体であることが望ましいと報告されており、本発明のインスリン製剤は注射剤以外の 剤型として用いることもできる。したがって、本発明には汎用性がある。さらに、インス リン単量体を安定的に保存することにも利用できる。インスリン製剤に関しては、（株） 日本臨牀社 日本臨牀 増刊号 「新時代の糖尿病学 3」 2002年 P179— 309等 に詳細が記述されており、本発明のインスリン多量体形成阻害剤が添加された、本 発明の超速効型インスリン製剤も同様に製剤化することが可能である。
本発明の超速攻型インスリン製剤は、糖尿病の予防や治療などに用レ、られる医薬 組成物として有用である。本発明の阻害剤をインスリン溶液に添加する場合、インスリ ンに対し、 0. 1〜： 10000倍の濃度で添加することが好ましい。
実施例
[0024] 以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例 に限定されるものではない。
[0025] [実施例 1]インスリン二量体及び六量体形成を阻害するペプチドの設計（図 1)
インスリン六量体の特徴として、 B鎖 αヘリックスとそれに続く C末領域が二量体形 成面を構築していること、および Β鎖 Glul 3の静電的な反発により六量体形成界面 が非常に弱い相互作用をしていること、力 S挙げられる。そこで、 B鎖第 5〜29位に対 応するペプチドを以下に示すように一部改変した。
(1) 3残基間隔でグルタミン酸残基とリジン残基を組み込み、 ひヘリックスを形成し やすくした。配列番号 1に設計したペプチドのアミノ酸配歹 IJ、配列番号 3にインスリン B 鎖の配列を示す。インスリン B鎖のひへリックス領域の配列のうち、図 1で一重下線に て表示した iiis5、 Gly8、 Ser9、 Vail 2, Glul 3、 Tyrl6、および Gly20カ主にイン スリン二量体界面に存在している。そこで、これらの残基を除き、 3残基間隔でグルタ ミン残基やリジン残基を導入した。
(2) B鎖 Glul 3に対応する部位に関しては Ginへと置換し、静電的な反発を抑制す るようにデザインした。
(3) B鎖 Leul7に対応する部位に関しては立体障害を生じにくい Alaへ、 B鎖 Cys 19に関しては酸化されないように Serへと置換した。以下、当該ペプチドを Insulin Hexamer Dismptor (INHD1)ペプチドと呼ぶ（配列番号 1)。さらに、 INDH1ぺ プチドのうち重要な部位を特定するため、インスリン B鎖の αヘリックスに対応する部 位（5〜20番）のみを切り出したペプチドを設計し、 INDH2と名付けた（配列番号 2)
[0026] [実施例 2]インスリンの六量体形成
インスリン六量体と単量体を別々に検出するために、ゲルろ過クロマトグラフィーを 行った。当該実験濃度（5 μ Μ)において六量体を形成させるため、溶媒として PBS に ΙΟΟ μ Μの ZnClを添加したものを用いた。これは、亜鉛イオンがインスリン六量体
2
を安定化することによる。図 2に結果を示す。 5 のインスリン溶液の場合、六量体 力 Sメインピークとして観測されており、単量体の比率は極めて低い。
[0027] [実施例 3]INDHペプチドによるインスリン六量体形成の阻害
INDHペプチドによりインスリン六量体形成が阻害されることを示すために、 INDH ペプチド存在下におけるインスリン溶液のゲルろ過クロマトグラフィーを行った。 5 μ M のインスリン、および 500 μ Μの INDH1ペプチドを混合した際の実験結果を図 2に 示す。 INDH1ペプチド存在下においてはインスリン六量体のピークが大幅に減少し ており、 INDH1ペプチドによりインスリン六量体形成が阻害されていることが明らかと なった。
さらに、 INHD2ペプチドについても、 INHD1ペプチドに比べ六量体形成阻害活性 が若干低いものの、同様な結果が得られた（図 2)。以上の結果、配列番号 2に示す ペプチド配列のうち、第 1、 4、 5、 8、 9、 12位のアミノ酸残基が重要であることが示す ことができた。
[0028] [実施例 4]ペプチド存在下におけるインスリンとインスリン受容体の相互作用
Fc融合ヒトインスリンレセプター（Bass, J. J. Biol. Chem. 271, 19367 (1996))をコード する遺伝子配列を構築し、ベクター pEF_B〇S (Nucleic Acids Res. 1990 Septembe r 11; 18(17): 5322.)へ組み込んだ。哺乳細胞 FreeStyle293 _F細胞を 37°Cにお いて培養し、細胞濃度 1 X 106 (個/ mL)に調製した。セルフヱクチン (Invitrogen)と インキュベートしたインスリンレセプター発現プラスミドを添加し、さらに 2日間培養した 。得られた培養上清をプロテイン Aァフィ二ティークロマトグラフィーによって精製し、 F (2)相互作用解析
市販のインスリン (シグマ社製)及び（1)の方法により得た Fc融合インスリン受容体 を用いて、インスリンとインスリンレセプターの相互作用解析を行った（BIACORE2000 、 BIACORE社製）。まず、 PBSに ΙΟΟ μ Μ ZnClを添加した溶媒と添加していない溶媒
2
を用いて、 5 μ Mのインスリン溶液を作成した。ゲルろ過実験により、 ZnCl存在下では
2 インスリンは主に六量体として存在し（図 2)、 ZnCl非存在下では主に単量体として存
2
在することが知られている。それぞれのインスリン溶液を用いて、インスリンレセプター との相互作用を観測したところ、 ZnCl存在下では相互作用するインスリン量が低下し
2
ていることが判明した（図 3a)。これは、亜 イオン存在下においてインスリンが六量 体を形成し、インスリンレセプターとの相互作用が抑制されたためと考えられる。 続いて、 ZnCl存在下において六量体を形成しているインスリンに対し、 500 μ Μの
2
INDH1および INDH2ペプチドを添加し、インスリンレセプターとの相互作用を観測 した。両者ともに受容体結合が大幅に増加し、インスリン単量体とほぼ同レベルにな ることが明ら力となった（図 3b)。 INHD1および INHD2ペプチドを添加することにより 、インスリンの六量体形成が阻害されたためと考えられる。
また、当該ペプチドによってインスリンとインスリンレセプターの結合が阻害されてい なレ、。インスリンには 2つのレセプター結合部位がそれぞれ独立に存在するため、六 量体形成を阻害しても、レセプター結合が損なわれないことがわかった。
産業上の利用可能性
本発明によれば、インスリンのレセプター結合活性を損なわずに、インスリンの二量 体形成および六量体形成を阻害することが可能になる。さらに、野生型インスリンを 用いた超速効型インスリン製剤を作製することができる。

Claims

請求の範囲
[1] インスリン溶液に、インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質 を添加することにより、インスリンの二量体形成および/又は六量体形成を阻害する 方法。
[2] インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質が、化合物、ぺプ チド又はタンパク質であることを特徴とする、請求項 1記載の方法。
[3] インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質が、インスリンとィ ンスリンレセプターとの結合を阻害することなく二量体形成及び/又は六量体形成を 阻害するものである、請求項 1又は 2のいずれかに記載の方法。
[4] 請求項 1〜3のいずれか一項に記載の方法に用いられるインスリンの二量体形成面 又は六量体形成面と相互作用する物質からなるインスリン単量体形成促進剤。
[5] インスリンの二量体および/または六量体形成を阻害する活性を有するペプチドで あって、以下の（a)〜（d)のレ、ずれかのアミノ酸配列を含むペプチド：
(a)配列番号 4記載のアミノ酸配列、
(b)配列番号 4記載のアミノ酸配列において、第 1 , 4, 5, 8, 9, 12及び 16位のアミ ノ酸残基以外の 1若しくは数個のアミノ酸残基に置換、欠失、揷入及び/又は付加を 有するアミノ酸配列、
(c)配列番号 1または 2記載のアミノ酸配列、又は
(d)配列番号 1または 2記載のアミノ酸配列において、第 2、 3、 6、 7、 10、 11、 13、 14及び 15位のアミノ酸残基のうちの 1若しくは数個のアミノ酸残基に置換、欠失、揷 入および/または付加を有するアミノ酸配列。
[6] 配列番号 2記載のアミノ酸配列において、第 2、 3、 6、 7、 10、 11、 13、 14及び 15位 のアミノ酸残基のうちの 1若しくは数個のアミノ酸残基に置換、欠失、揷入および/ま たは付カロを有し、第 1、 4、 5、 8、 9、 12及び 16位のアミノ酸残基のうちの z少なくとも 5 残基が保持されてなる、インスリンの二量体および六量体形成を阻害するペプチド。
[7] 請求項 5または 6記載のペプチド及びインスリンを含む医薬組成物。
[8] インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用を有し、インスリン単量体形 成を促進する物質を選択する方法であって、以下の工程を含む方法： (i)候補物質を、インスリン二量体又はインスリン六量体と接触せしめ、インスリン単量 体形成を測定する工程、
(ii)配列番号 2記載の配列を含むペプチドまたはそのアナログとインスリン二量体又 はインスリン六量体を接触せしめ、インスリン単量体形成の被検対照とし、前記工程 1 )のインスリン単量体形成と比較する工程、及び
(iii)候補物質から、配列番号 2記載の配列を含むペプチドまたはそのアナログと同程 度以上のインスリン単量体形成能を有する物質を選択する工程。
インスリン含有製剤を製造する方法であって、請求項 8に記載の方法を用いてインス リン単量体形成促進能を有する物質を同定する工程、並びに、該物質をインスリンを 含有する溶液に添加する工程を含む方法。
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