WO2006095654A1 - レポータ遺伝子アッセイ法 - Google Patents

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WO2006095654A1
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transcription
reporter gene
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Koji Enomoto
Yoshito Numata
Hiroshi Takemoto
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Shionogi and Co Ltd
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Shionogi and Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Definitions

  • the present invention relates to a reporter gene assembly method.
  • reporter gene assemblies A plasmid containing DNA that links a reporter gene and a region necessary for initiation of transcription, such as a promoter, is introduced into a cell, and the reporter gene transcription / translation reporter gene is introduced. The effect of the test substance is investigated using the amount of protein produced as an index.
  • firefly luciferase As a reporter gene, firefly luciferase, bacterial luciferase, green fluorescent protein (GFP), enhanced green fluorescent protein (EGFP), chloramphie-cholacetyltransferase (CAT), alkaline phosphatase, ⁇ -galatatosidase, etc. are widely used. ing.
  • Non-patent document 1 “Revised 4th edition, New Genetic Engineering Handbook”, ⁇ 223-226, Yochisha, 200 3 years
  • a test substance, the first epitope is inserted into a cell having a vector in which a reporter gene containing a gene encoding an epitope tag having the first and second epitopes is connected downstream of the transcription factor recognition sequence and the base sequence necessary for transcription initiation.
  • a detection antibody that recognizes the second epitope, and a detection antibody that recognizes the second epitope and detects the phenomenon that occurs when the two detection antibodies bind to the first and second epitopes and come close to each other.
  • a reporter gene assembly method characterized by being arranged.
  • the cell is allowed to express any one selected from a transcription factor, a ligand, a receptor, and a group force that is a coactivator.
  • the assay method of the present invention since the amount of reporter protein produced is directly measured, misunderstanding of measurement results based on various factors such as cells and test substances can be avoided. In addition, since the measurement method of the present invention excludes measurement errors (color quenching) caused by the color of the test substance, the transcription control ability of the test substance can be accurately measured.
  • Fig. 1 is a diagram of a reporter plasmid.
  • FIG. 2 shows the results of measurement by the reporter gene assembly method of the present invention.
  • Panel A is a graph showing the relationship between the stimulation time of cells and the ratio value when IL-4 was added at 20 ng / ml.
  • Panel B is a graph showing the relationship between the amount of IL-4 added and the fluorescence intensity when cells are stimulated with IL-4 for 24 hours.
  • the present invention provides a first epitope downstream of a recognition sequence for a transcription factor and a base sequence necessary for initiation of transcription.
  • a test substance, a detection antibody that recognizes the first epitope, and a detection antibody that recognizes the second epitope are contacted with a cell having a vector connected to a reporter gene containing a gene encoding an epitope tag that has a second and second epitope.
  • a reporter gene assembly method wherein the first and second epitopes are arranged such that when the detection antibodies recognizing each of the first and second epitopes are combined, the detection antibodies can be brought close to each other. It is about.
  • the above method according to the present invention can be easily carried out by using a specific vector or kit, and the present invention also provides a powerful vector or kit.
  • a vector in which a reporter gene containing a gene encoding an epitope tag is connected downstream of a recognition sequence of a transcription factor and a base sequence necessary for initiation of transcription And (b) the epitope tag is arranged so that the two detection antibodies can be brought close to each other when the detection antibodies that recognize each of the two types of epitopes are bound.
  • Cells are used.
  • the cell used in the method of the present invention has a vector (hereinafter also referred to as "reporter plasmid") in which a reporter gene is connected downstream of a transcription factor recognition sequence and a base sequence necessary for initiation of transcription. It is characterized by reluctantly.
  • Such a reporter plasmid is used as an appropriate vector so that the above reporter gene can function downstream of, for example, a DNA having a transcription factor recognition sequence and a DNA having a base sequence necessary for transcription initiation. It can be prepared by introducing and linking.
  • a vector suitable for genetic engineering technology using Escherichia coli or the like can be used.
  • Specific examples include a commercially available vector having a replication origin (revlikon) that can function in microorganisms and a drug resistance gene and a gene insertion site (multicloning site) downstream thereof.
  • revlikon replication origin
  • multicloning site multicloning site
  • It can also be constructed by inserting a gene encoding an epitope tag into a commercially available reporter plasmid.
  • Cis Factors include an enzyme that activates transcription and a silencer that suppresses transcription.
  • a factor that binds to a cis factor (trans factor) is called a sequence-specific factor or a transcriptional control factor for a basic transcription factor that binds to a promoter.
  • sequence-specific transcription factors hereinafter referred to as transcription factors
  • transcription factors have been reported, and their recognition sequences vary depending on the transcription factor. There are hundreds of transcription factors identified to date. Known transcription factors include, for example, SRF, Spl, HNF_1, STAT, NF ⁇ B, etc.
  • transcription factor recognition sequences When such transcription factors or their complex forces are recognized and bound to promote / suppress the transcription of target genes located downstream of them, these DNA sequences are referred to as “transcription factor recognition sequences”. That's it.
  • transcription factor recognition sequences In the assembly method of the present invention, such an arrangement can be arbitrarily changed according to the purpose. In order to obtain sufficient transcription control ability, it is preferable that the response factor of the transcription factor is usually connected in a tandem of about 2 to 5.
  • DNA having a strong base sequence can be prepared by chemical synthesis, or by amplification and cloning using a PCR method or the like.
  • the "base sequence necessary for initiation of transcription” refers to a base sequence involved in the initiation of the transcription reaction of a target gene such as a downstream reporter gene after the transcription factor is bound to the above-mentioned recognition sequence or its efficiency. These are generally called promoters or engineers. These base sequences need to be linked so that the downstream sequence functions if it is involved in the regulation of transcription of the downstream sequence. Various sequences are known to those skilled in the art as regions having such properties, all of which are applicable to the present invention.
  • the 5 ′ upstream region of the thymidine kinase gene (tk) of the Examples the 5 ′ upstream region of the dartathione S-transferase Ya subunit gene (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 382). 6-3830 (1990)), the 5 ′ upstream region of the cytochrome P4501A1 gene (Eur. J. Biochem., 159, 219-225 (1986)), and the like.
  • a region in which all or part of the "transcription factor recognition sequence” and the "base sequence necessary for initiation of transcription” is a known body is also known. It can be applied to the method of the invention. Examples of such regions include cAMP response element (CRE), estrogen receptor element (ERE), serum response element (SRE), and TPA response element. Rement (TRE).
  • CRE cAMP response element
  • EEE estrogen receptor element
  • SRE serum response element
  • TRE TPA response element.
  • the IL-4 regulatory elements used in the examples described later include a recognition sequence for STAT6, which is a transcription factor, and a binding sequence (enhancer) for CCAAT-enhancer binding protein (C / EBP).
  • a DNA having such a base sequence is prepared by designing an oligonucleotide for amplifying a DNA encoding a target region based on a known base sequence, and using the prepared oligonucleotide as a primer. It can be prepared by performing the PCR used.
  • An epitope tag is a polypeptide (tag) having a specific amino acid sequence that can be fused to a protein of interest, and that amino acid sequence includes a region (epitope) that binds to an antibody.
  • the epitope tag used in the method of the present invention has at least two types of epitopes, and when each of the epitopes is bound with a detection antibody that recognizes the epitope, both the detection antibodies are close to each other. It is arranged so that it can be.
  • “close to each other” means a detection antibody that can specifically bind to an epitope (hereinafter referred to as “first epitope”) and another epitope (hereinafter “second epitope”).
  • first epitope an epitope
  • second epitope another epitope
  • the detection antibodies that can specifically bind to the immune reaction are allowed to bind to the epitope without causing steric hindrance, and each detection antibody is bound between the labels. It means that the reaction is in a positional relationship where the reaction can be detected.
  • a detection antibody that recognizes the first epitope and a detection antibody that recognizes the second epitope are used.
  • recognizing means “binding immunospecifically”.
  • Immunospecific binding refers to a binding reaction between an antibody and an amino acid sequence, and this binding proves that the amino acid sequence exists in a mixed state like a cell debris. .
  • antibodies bind preferentially to a particular sequence and do not bind in significant amounts to other amino acid sequences present in the sample. This interaction is said to bind immunospecifically when referring to the reaction between the epitope and the antibody.
  • the two epitopes can be cross-linked by a suitable peptide linker which may be directly linked. You can also.
  • an antibody has a molecular weight of about 150 KDa, and the binding of the antibody itself to the epitope may be hindered by steric hindrance between the detection antibodies, which is larger than the size of the epitope tag. Therefore, it is desirable to insert a peptide linker having an appropriate length between the first and second epitopes.
  • a peptide linker having an appropriate length between the first and second epitopes.
  • amino acid residues that can be used as the linker are not particularly limited, but are selected so as to have a relatively small side chain without cross-reactivity with the detection antibody.
  • amino acid sequences of the first and second epitopes are not limited to being derived from the same species, but may be derived from different species.
  • reporter genes in cells used in the method of the present invention include arbitrary proteins and
  • a gene encoding a fusion protein in which the above-mentioned epitopic tag is linked can be mentioned.
  • An arbitrary protein is designed and produced based on a nucleotide sequence known from a database or the like to amplify a gene encoding the protein, and PCR is performed using this oligonucleotide as a primer. It can be prepared by performing. Examples of the gene that can be used as the saddle type used at this time include cDNA prepared from various cell lines. After inserting the reporter gene prepared in this way into a commercially available vector using a restriction enzyme, the gene encoding the epitope tag is similarly inserted downstream of the gene encoding the protein on the vector. Can produce a reporter plasmid.
  • the amino acid sequence of the epitope used in the practice of the present invention is specified.
  • the sequence of the epitope is an amino acid known as an epitope.
  • An array may be used, or the array may be designed by itself. Usually, a part of the protein that does not bind to the protein present in the cell to induce expression is used. At this time, it is desirable that the epitopes are composed of 6 to 30 amino acid residues, preferably 6 to 8 amino acid residues.
  • FLAG DYKDDDDK, Sigma, registered trademark
  • c-myc EQKLIS EEL
  • polyhistidine HHHHHH
  • the like are well-known epitopes of those skilled in the art, and antibodies that can specifically bind to these epitopes Is commercially available, so it is easy to obtain antibodies.
  • Those containing these amino acid sequences can be used as the epitope of the present invention even if those amino acids are added before and after that.
  • an amino acid sequence by itself it can be used as the epitope of the present invention by confirming that the epitope has a property of specifically binding to an antibody by the method described below.
  • Methods for identifying an antibody epitope include (A) a method of determining by specifying an amino acid sequence that specifically binds to an antibody, and (B) a method of immunization with a specific peptide antigen. There is a method using an antibody, but the method of the present invention is not limited to any method.
  • An appropriate expression vector may be any one that is suitable for the host into which it is introduced.
  • pET PNMT p cDNA
  • pFastBac all available from Invitrogen, etc.
  • a transcription / translation system a cell-free transcription / translation system prepared on the basis of a rabbit herd reticulocyte, an extracted wheat germ, an E. coli extract (E. coli S30 extract), or the like can also be used. This narrows the epitope into a peptide fragment and subsequently encodes about 5-50 amino acid sequences in that peptide fragment.
  • DNA fragments to be prepared are prepared by polymerase chain reaction (PCR), synthetic oligonucleotides, etc., and this is ligated with an appropriate protein and expressed as a fusion protein to examine the binding property to an antibody.
  • Appropriate proteins to be used for this fusion protein are those that do not bind to the antibody to be analyzed!
  • the epitope, the smallest unit polypeptide necessary and sufficient to bind to the antibody by force, can be identified.
  • the method using an antibody prepared by immunization with a specific peptide antigen is a method in which a peptide having a specific amino acid sequence is used as an antigen in preparation of the antibody, and the antibody screening is performed as described above This is a method performed with peptides. Since the antibody epitope prepared in this manner has already been determined, the peptide can be identified as the antibody epitope.
  • an immunogen refers to a substance that has the ability to generate or cause an immune response, usually in vivo.
  • the immunogen can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • the immunogen is used as a complex with a carrier protein such as urine serum albumin (BSA), cythyroglobulin (BTG), or moth guanine hemocyanin (KLH) as required. It is desirable to use such a complex as an immunogen because peptides usually have a low molecular weight and are not immunoresponsive.
  • BSA urine serum albumin
  • BSG cythyroglobulin
  • KLH moth guanine hemocyanin
  • Immunization can be performed, for example, by administering the above immunogen to a mammal by intravenous, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal injection or the like. More specifically, for example, the immunogen is diluted to an appropriate concentration with a physiological saline-containing phosphate buffer (PBS), physiological saline, or the like, and is used in combination with a normal adjuvant if desired. Administer about 3 to 10 times at intervals of ⁇ 6 weeks. As mammals to be immunized, generally rabbits, goats, hidges, mice, rats and the like are used. When using mice, the dose should be about 50 g per mouse.
  • PBS physiological saline-containing phosphate buffer
  • the adjuvant is a substance that, when administered together with an antigen, nonspecifically enhances an immune response to the antigen.
  • adjuvants include pertussis vaccine, Freund's horse mackerel An example is a vantant.
  • Polyclonal antibodies can be obtained by collecting blood from mammals 3 to 10 days after the final immunization.
  • the monoclonal antibody is produced by producing a fused cell (neubridoma, hybrid oma) of a mammalian plasma cell (immune cell) immunized with an immunogen and a mammalian plasmacytoma cell (myeloma cell). From this, a clone producing a monoclonal antibody that recognizes a desired antigen is selected, and the clone is cultured.
  • the production of this monoclonal antibody can basically follow conventional methods (Kohler, G. and Milstein, C, Nature, 256, 495-497. (1975)) o
  • the mammal to be immunized is preferably a mouse, a rat or the like that is desirably selected in consideration of compatibility with the plasmacytoma cell used for cell fusion.
  • a hyperidoma obtained by fusing a plasmacytoma cell and an immune cell producing an antibody in the presence of polyethylene glycol. It is desirable to use plasmacytoma cells derived from the same isothermal animal even in the same isothermal animal. For example, when a mouse is fused with a spleen cell obtained as an immunized animal, mouse myeloma is used. It is preferable to use cells.
  • Plasmacytoma cells such as p3x63-Ag8.UI can be used.
  • Hypridoma can usually be selected by culturing in HAT medium (medium supplemented with hypoxanthine, aminopterin, and thymidine). When a colony is confirmed, a hyperidoma that produces the target antibody can be obtained by examining (screening) the binding between the antibody secreted into the culture supernatant and the antigen.
  • the screening method includes, for example, various methods commonly used for antibody detection such as spot method, agglutination reaction method, Western plot method, ELISA method, etc. This is carried out according to an ELISA method using the reactivity with an antigen as an index. By this screening, a target antibody-producing strain that reacts specifically with the antigen can be selected.
  • Cloning of the target antibody-producing strain can usually be performed by a limiting dilution method or the like. Claw If necessary, Jung's rooster and ibridoma can be cultivated in large quantities in a serum medium or serum-free medium. According to this culture, a relatively high purity desired antibody can be obtained as a culture supernatant. Further, it is possible to inoculate the abdominal cavity of a mammal that is compatible with hyperidoma, for example, a mouse, and to collect a large amount of the desired antibody as mouse ascites.
  • the culture supernatant of the antibody-producing hyperpridoma of the present invention and ascites fluid from mice can be used as a crude antibody solution as they are. Alternatively, it can be purified by ammonium sulfate fractionation, salting-out, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 derived from human type 2 collagen already specified by Downs et al. (Journal of Immunological Methods, 247, (2001)) A polypeptide containing the amino acid sequence shown in the sequence listing was used. In addition, a monoclonal antibody that specifically recognizes this epitope was prepared according to the method described herein.
  • an antibody that can be used in the method of the present invention thus prepared, for example, a high-priority antibody as an antibody that specifically binds to a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • a high-priority antibody as an antibody that specifically binds to a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • Monoclonal antibody produced by Dorma TAG-6G4 hereinafter sometimes referred to as “6G4 antibody”
  • Hypridoma TAG-2E6 as an antibody that specifically binds to the polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • Monoclonal antibodies produced by the above hereinafter sometimes referred to as “2E6 antibodies”).
  • Amino acid sequence GEPGDDAPS Specifically binds to a peptide having a potential.
  • a 150 kDa protein consisting of an H chain variable region (VH region) represented by SEQ ID NO: 4 and an L chain variable region (VL region) represented by SEQ ID NO: 5 consisting of an H chain of 50 kDa and an L chain of 27 kDa. is there.
  • a 150 kDa protein consisting of an H chain of 50 kDa and an L chain of 27 kDa having a VH region represented by SEQ ID NO: 6 and a VL region represented by SEQ ID NO: 7.
  • Cells used in the method of the present invention are those obtained by introducing the above-mentioned reporter plasmid using normal animal cells or the like as host cells.
  • host cells that can be used include mammalian cells derived from humans, mice, rats, and the like, amphibian animal cells, insect animal cells, and the like derived from force L. Considering operability and reproducibility, cells that can be stably passaged are preferred.
  • preferred host cells include, for example, human-derived 293 cells, human-derived A-431 cells, human-derived HeLa cells, human-derived Neuroblastoma cells, mouse-derived NI H3T3 cells, and hamster-derived CHO-K1 cells. , Monkey-derived COS-1 cells, and rat-derived L6 cells.
  • a reporter plasmid In order to introduce a reporter plasmid into a host cell, as long as various genes contained in the plasmid can function in the cell, for example, general DNA introduction such as the electopore method, the calcium phosphate method, and the lipofusion method. It can be done by the law (Transfusion method). In addition, if a drug resistance gene is added to a reporter plasmid, a cell line stably retaining the reporter plasmid can be selected.
  • the medium composition used for the preparation of the cells used in the method of the present invention, the cell culture conditions, the transfection conditions of each vector plasmid, etc. are V, and all of these host cells and gene transfer vectors are used. It can be the same as those used in the conventional method.
  • a cell having a gene encoding a constituent factor (receptor, ligand, transcription factor, coactivator, etc.) necessary for conducting a transcription reaction in a cell is the reporter plasmid described above. Can only be used in the assembly method of the present invention. The However, in cells that do not have endogenous genes encoding the components necessary for performing the transcription reaction, the necessary gene expression (co-transformation) is introduced as needed to increase the expression ability of the gene. May be granted.
  • Receptors involved in transcription include G protein-coupled receptors (GPCRs), enzyme-type receptors (tyrosine kinase type, serine 'threonine kinase type, gallate cyclase type), cytoforce in receptors and ions
  • GPCRs G protein-coupled receptors
  • enzyme-type receptors tyrosine kinase type, serine 'threonine kinase type, gallate cyclase type
  • cytoforce in receptors and ions Steroid hormone receptors such as androgen receptor (GenBank Access! On No.M23263) and estrogen receptor (GenBank Accession No.X03635) that are only present on the cell surface (cell membrane receptors) such as channel receptors, Intracellular receptors including nitric oxide (NO) receptors are known.
  • NO nitric oxide
  • cytoforce-in receptors do not show tyrosine kinase activity in the receptor molecule itself, and a non-receptor tyrosine kinase called JAK (Janus kinase) existing in the vicinity of the receptor is activated and directed into the cell. Give the first signal. Upon receiving this signal, other information transfer molecules such as STAT (Signal transducer and activator of transcription protein) are phosphorylated.
  • JAK Jun tyrosine kinase
  • IL-4 shown in Example 4 described below is a site force involved in induction of expression of MHC class II, CD23 antigen, IL-4 receptor a, B cell class switch, differentiation of helper T cells, etc.
  • IL-4 binds to a receptor present on the cell membrane
  • tyrosine kinases JAK1 and JAK3 are activated in the cell along with the receptor dimer.
  • -4 Phosphorylates the receptor.
  • STAT6 a transcription factor, is induced to the phosphorylation site of the receptor, and receives phosphate from JAK.
  • STAT6 phosphorylated is dimerized, translocates to the nucleus, binds to a recognition sequence on DNA, activates the promoter, and induces expression of genes involved in cellular responses. It has been known.
  • the IL-4 regulatory element has a STAT6 recognition sequence and a CCAAT-enhancer binding protein (C / EBP) binding region next to it (SEQ ID NO: 16).
  • STAT6 located downstream of the intracellular signal transduction system of IL-4 regulates transcription of downstream genes by binding to the above elements. It is known that the terminal fraction of B cells is involved in antibody class switching. Therefore, when this transcriptional regulatory mechanism is disturbed for some reason, functions such as the B cell antigen-specific activity, class switch, etc., fail, causing humoral immune deficiency, allergic diseases and self May cause immune disease.
  • intracellular receptors may form a complex with an intracellular ligand and then bind to a specific recognition sequence to promote transcription of a gene existing downstream thereof.
  • a specific recognition sequence for example, darcocorticoid (Nature., 318, 635-641 (1985)), estrogen, dioxin (J. Biol. Chem., 263, 17221-17224 (1988)) and the like are known.
  • a gene encoding a ligand may be introduced into the cell to confer expression ability.
  • An oligonucleotide for amplifying DNA can be prepared by designing and producing an oligonucleotide based on a known base sequence, and performing a PCR reaction using the prepared oligonucleotide as a primer.
  • DNA that can be used as a cage in vigorous PCR include commercial cDNAs derived from various organisms.
  • the genes When introducing these foreign genes into a host cell, the genes are inserted into a vector in a form in which these genes are functionally connected downstream of an appropriate promoter, and the resulting vector is introduced into the cell. To do.
  • the promoter at this time is a promoter that can function in the introduced cell, that is, has a transcription initiation ability.
  • RSV Rous sarcoma virus
  • Examples include promoters, cytomegalovirus (CMV) promoters, and simian winoles (SV40) early or late promoters.
  • the vector also includes A drug resistance gene for selecting a target cell can be provided. Such vector can be introduced into a host cell in accordance with the above-described method for introducing a reporter plasmid.
  • the method of the present invention includes a step of bringing a test substance into contact with the cells thus provided.
  • the test substance can be brought into contact with the cells by adding it to the cell culture.
  • the test substance when it is a protein, it can be insectized by expressing a gene encoding the protein in the cell.
  • the method of the present invention further comprises a step of contacting the above-mentioned cells with a detection antibody.
  • the detection antibody at this time refers to an antibody labeled with a labeling substance in order to detect the proximity of the antibodies.
  • This detection antibody may be added to the medium in advance to culture the cells, or may be added after the end of the culture.
  • the antibody may be either monoclonal or polyclonal as long as it specifically recognizes a polypeptide having an amino acid sequence containing the above epitope, but the former is preferred.
  • the antibody can be prepared by following the method described above.
  • Examples of the labeling substance include phosphors, enzymes, fluorescent substances, beads, radioisotopes, metals, biotin, and the like.
  • Luminescent substances refer to chemiluminescent substances such as luciferol, luminol, equorin, and acrylamide-umester.
  • Examples of enzymes include luciferase, / 3-galatatosidase, alkaline phosphatase, peroxidase and the like.
  • Fluorescent substances include, for example, lanthanide elements such as Euguchi Pium (Eu) and terbium (Tb), lanthanide element derivatives such as Palladium Cryptate, fluorescein derivatives such as FITC (fluorescein isothiocyanate), RITC (tetramethylrhodamin isothiocyanate) ) And other fluorescent proteins such as rhodamine derivatives, YFP, GFP, CFP, BFP, and alophycocyanin.
  • Beads refer to beads that have been specially treated, such as protein A beads, wheat germ agglutinin (WGA) beads, and streptavidin beads. Examples of radioisotopes are 14 C and 125 I, 3 H, 35 S, etc. It also includes compounds labeled with these. Examples of metals include ferritin and gold colloid.
  • a combination that can detect a phenomenon associated with the proximity of the detection antibody, as will be described later.
  • a combination for example, a combination of a fluorescent substance label and a fluorescent substance label, a phosphor label and a fluorescent substance label, a radioisotope label and a bead is generally known.
  • the "step of contacting a detection antibody recognizing an epitope” refers to a detection capable of immunospecifically recognizing two types of epitopes (first and second epitopes) contained in a reporter protein. Adding antibody to a cell sample containing a reporter protein.
  • the detection antibody is usually diluted with an appropriate buffer (for example, Tris buffered saline containing 0.8 M potassium fluoride and 0.5% ushi serum albumin).
  • the dilution concentration to be used can be determined by confirming that the “phenomenon caused by the proximity of the detection antibody” as described below satisfies the conditions for efficient detection by preliminary examination.
  • the concentration of the detection antibody used in the assay can be determined by checking its efficiency with the fluorescence intensity of the acceptor. Can be determined.
  • the method of the present invention detects a phenomenon that occurs when two detection antibodies are brought into contact with each other after contacting two types of detection antibodies with the above-mentioned cells, and relates to the action of the test substance on the transcriptional regulatory mechanism.
  • Detecting a phenomenon caused by proximity means that when a detection antibody that recognizes the first epitope is bound to the first epitope and a detection antibody that recognizes the second epitope is bound to the second epitope, Detecting a phenomenon that occurs when a sign approaches each other.
  • Such methods for detecting the interaction of two proteins are well known to researchers in this field. For example, BRET method, FRET method, Alpnabcreen, mplined luminescent proximity homogeneous assay ⁇ registered trademark, SP A ( Scintillation Proximity Assay (registered trademark) and the like.
  • the above phenomenon can be related to the action of the test substance on the transcriptional regulatory mechanism. wear.
  • the magnitude of the detected value reflects the magnitude of transcriptional regulatory activity. Therefore, by detecting a phenomenon that occurs when the two detection antibodies come close to each other, the action (transcription promoting activity, transcription inhibiting activity, etc.) of the test substance on the transcription regulation mechanism can be evaluated.
  • a method for detecting the movement of the excitation energy due to resonance can be mentioned.
  • a fluorescent substance is excited when irradiated with excitation light, and its energy is released as fluorescence or thermal energy and returns to the ground state (quenching).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the form includes a method of selecting a fluorescent substance as a donor (a molecule that provides energy), a long fluorescence lifetime (time until quenching), and the like. .
  • a fluorescent substance as a donor (a molecule that provides energy)
  • a long fluorescence lifetime time until quenching
  • the form includes a method of selecting a fluorescent substance as a donor (a molecule that provides energy), a long fluorescence lifetime (time until quenching), and the like.
  • a fluorescent substance a donor
  • time until quenching time until quenching
  • HTRF is characterized by using two kinds of fluorescent substances. More specifically, the eucalyptus compound, euglena pium cribate (hereinafter referred to as cryptate, a trisbipyridine cage structure with a rare earth element eucalyptus ion coordinated), It is a nin derivative, X L665 (a stable protein obtained by crosslinking three molecules of alfalcocynin, a fluorescent protein derived from cyanobacteria).
  • cryptate a trisbipyridine cage structure with a rare earth element eucalyptus ion coordinated
  • X L665 a stable protein obtained by crosslinking three molecules of alfalcocynin, a fluorescent protein derived from cyanobacteria.
  • the cryptate When the cryptate is irradiated with 337 nm excitation light, it emits long-lived fluorescence of 620 nm.However, when the detection antibody is close to and XL665 is in the vicinity, the FRET moves to the excitation energy force 3 ⁇ 4L665, so the long lifetime from XL665 to 665 nm Fluorescence Arise. By measuring this long-lived fluorescence, it is possible to measure the reporter protein.
  • the advantage of this method is that by measuring the force and fluorescence after a certain period of time has elapsed after excitation of the cryptate, short-lived knock-ground fluorescence (up to 10 nanoseconds) due to the fluorescent substance contained in the measurement sample or measurement tube It is possible to selectively detect only long-lived fluorescence ( ⁇ 1 ms).
  • the measured value is expressed as a ratio value of (665nm fluorescence intensity ⁇ 620nm fluorescence intensity) x 10,000. It is also possible to compensate for fluctuations in measured values due to the color quenching effect (inner filter effect) of the measurement sample.
  • BRET Bioluminescence resonance energy transfer
  • antibodies labeled with luciferase and a green fluorescent protein mutant (GFP mutant) are used as two types of detection antibodies.
  • GFP mutant green fluorescent protein mutant
  • Other forms include a method of using a combination of detection antibody labeled with beads (e.g. SPA beads) and radioisotopes (e.g. 3 H, 1 4 C and 125 1, etc.).
  • beads e.g. SPA beads
  • radioisotopes e.g. 3 H, 1 4 C and 125 1, etc.
  • an intracellular information transmission system via interleukin 4 can be mentioned.
  • IL-4 regulatory element T. Mikita et al. Mol. Cell. Biol.
  • the correlation between the added concentration of IL-4, the stimulation time with IL-4, and the detected value was determined by the method of the present invention. It was measured. As a result, it was confirmed that the intensity of the fluorescence intensity varied depending on the stimulation concentration and stimulation time of IL-4. This indicates that the method of the present invention can detect enhanced transcription due to intracellular signal transduction starting from IL-4.
  • the mode of use of the reporter gene assembly method of the present invention is basically the same as that of this type of reporter gene assembly method, which is also known in the prior art, and the screening method can be said to be one embodiment thereof.
  • the cells of the present invention are seeded in a cell culture vessel and cultured. For example, when using a 96-well plate, inoculate approximately ⁇ 4 to ⁇ 5 cells per well and culture for about 1 hour to 1 ⁇ .
  • a test substance is added to the cell culture medium.
  • the test substance may be any of peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds (low molecular weight compounds, etc.), fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the solution containing these may be sufficient.
  • a solution in which a substance having ligand activity of a receptor is dissolved in a culture medium is added to the culture medium so that the concentration of the ligand in the culture medium is usually about EC50.
  • a solution in which a substance having ligand activity of a receptor is dissolved in a culture medium is added to the culture medium so that the concentration of the ligand in the culture medium is usually about EC50.
  • a solution in which a substance having ligand activity of a receptor is dissolved in a culture medium is added to the culture medium so that the concentration of the ligand in the culture medium is usually about EC50.
  • a solution in which a substance having ligand activity of a receptor is dissolved in a culture medium is added to the culture medium so that the concentration of the ligand in the
  • test substance in a test for measuring the transcriptional activity of a test substance, if the detected value per cell of the cell of the system to which the test substance is added is higher than the cell of the system to which only the solvent is added, The test substance is judged to exhibit transcription promoting activity.
  • the measurement test of the transcription inhibitory activity of the test substance when the detection value of the cell to which the ligand and the test substance are added is lower than the detection value of the cell to which the ligand alone is added, The test substance Is more judged on transcription inhibition activity.
  • TK promoter SEQ ID NO: 17
  • PGL3-Basic vector Promega
  • PGL3-TK restriction enzyme sites
  • an IL-4 regulatory element SEQ ID NO: 16
  • SEQ ID NO: 16 was synthesized, polymerized with 4 polynucleotide kinase, and tetramer fragments were separated by agarose gel electrophoresis. A tetramer fragment was inserted upstream of the TK promoter of pGL3-TK via a restriction enzyme site (Bglll).
  • RNA fragment (3.4 kb) digested with restriction enzymes Ncol and Xbal and excluding the luciferase gene was purified by agarose gel electrophoresis.
  • Total RNA was purified from U20S cells (human osteosarcoma cell line, American Type Culture Collection) and subjected to RT-PCR by SPDS (GenBank Accession number BC000309, a human working draft contig identifier NM—003132) and the epitope tag gene (SEQ ID NO: The gene linked to 14) (SEQ ID NO: 15) was amplified.
  • the PCR product was inserted into a 3.4 kb DNA fragment via restriction enzyme sites (Ncol and Xbal) to form a reporter plasmid ( Figure 1).
  • a polypeptide with an amino acid sequence that has cysteine added to the C-terminal side of the region corresponding to amino acid numbers 757-765 of human type 2 collagen (SEQ ID NO: 1) and moth guanine (KLH, manufactured by Pierce) Sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC, manufactured by Pierce) was used as an immunogen.
  • the immunogen was mixed with Freund's complete adjuvant (manufactured by Difco) to give an emulsion, and 40 g was administered intraperitoneally to mice (Balb / c CrSlc, 6 weeks old, female) every 3 weeks.
  • mice spleen was removed and myeloma cells (p3 X 63-Ag8.UI , Tokyo Mass Research Laboratories) and hybridomas were prepared.
  • myeloma cells p3 X 63-Ag8.UI , Tokyo Mass Research Laboratories
  • hybridomas were prepared.
  • the culture supernatant was collected and screened for positive wells containing antibody-producing and hybridomas. Screening was performed at the time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA, Amersham) described below.
  • Microtiter plate manufactured by Sumitomo Beklite Co., Ltd.
  • anti-mouse IgG antibody manufactured by Shiba Gogi Co., Ltd.
  • a measurement buffer 150 mM NaCl, 0.01% Tween 80, 0.5% BSA, 0.05% NaN
  • Buffer solution pH 7.5
  • Measurement buffer containing g / ml piotin-labeled antigenic peptide and 100 ng / ml plutonium labeled streptavidin (manufactured by PerkinElmer Life Sciences) 50 ⁇ l continuously, react at 4 ° C for 16 hours I let you.
  • Cleaning solution 150 mM NaCl, 0.02% NaN
  • Hypridoma TAG-6G4 was administered intraperitoneally to nude mice (BALB / cANNCrj-nu-nu) to collect ascites (consigned to Labo Products).
  • a purified antibody was also obtained from ascites by affinity chromatography using a protein A column.
  • RNA was purified from 1 ⁇ 10 7 high- pridoma using the RneasyMini kit (Qiagen).
  • the VH and VL region gene sequences were determined according to the kit operation procedure.
  • SM ARTII A oligonucleotide included in the kit and a primer specific to the VH region of TAG-6G4 (SEQ ID NO: 8), a primer specific to the VH region of TAG-2E6 (SEQ ID NO: 9), and a BR specific to the VI region CDNA was synthesized using the image (SEQ ID NO: 10).
  • a universal primer included in the kit a primer specific to the VH region of TAG-6G4 (SEQ ID NO: 11), a primer specific to the VH region of TAG-2E6 (SEQ ID NO: 12), VI region PCR was performed using a primer specific for (SEQ ID NO: 13) to amplify the VH and VL genes.
  • These PCR products were cloned using the TOPO TA cloning kit (manufactured by Invitrogen), and the sequence was analyzed (consigned to Operon Biotechnology). The amino acid sequences of the VH region and VL region were determined from the obtained gene sequence.
  • the 6G4 antibody was adjusted to 1 mg / ml with 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0).
  • Cryptate TBP monosuberate (manufactured by CIS Biointernational) was added to 1 mol of antibody and reacted at 25 ° C for 1 hour.
  • the reaction solution was subjected to gel filtration using a PD-10 column (manufactured by Amersham) equilibrated in advance with PBS to fractionate the labeled antibody.
  • the labeled antibody was stored at ⁇ 70 ° C. with 0.1% sushi serum albumin, 0.1% Tween 20, and 0.05% sodium azide.
  • 2E6 antibody dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), 8 times molar amount of N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP, manufactured by Pierce) at 25 ° C For 20 minutes.
  • SPDP N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate
  • PD was pre-equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 10 mM EDTA after adding 10 mM dithiothreitol (DTT) to the reaction solution and reacting for another 10 minutes.
  • DTT dithiothreitol
  • XL665 Dilute XL665 (manufactured by CIS Bio-International) in 0.1 M phosphate buffer (PH7.0), add 5-fold molar amount of Sulfo-SMCC, and react at 25 ° C for 30 minutes. It was. Gel filtration using a PD-10 column pre-equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) was performed to fractionate XL665 into which maleimide groups had been introduced (maleimidated XL665). To 1 mol of maleimidated XL665, 3 mol of the above SH-2E6 antibody was added and reacted at 4 ° C. for 16 hours to obtain an XL665 labeled antibody.
  • PH7.0 0.1 M phosphate buffer
  • SH-2E6 antibody To 1 mol of maleimidated XL665, 3 mol of the above SH-2E6 antibody was added and reacted at 4 ° C. for 16 hours to obtain an XL665 labeled antibody.
  • HeLa cells (ATCC deposited cells) in medium (MEM medium containing 10% urinary fetal serum, 100unit / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin) at 1.2 ⁇ 10 5 cells / ml, and this is 96-well tissue culture 100 1 was spread on the plate. 24 hours later, 20 ⁇ g of repo-tablasmid prepared in Example 1 and 60 ⁇ 1 of FuGENE6 (Roche) were added to 2 ml of urine fetal serum-free medium, and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. The wells were mixed with 51 and cultured for 24 hours, and the reporter plasmid was transfected.
  • IL-4 IL-4 diluted in medium so that the final concentration of each well is 0, 4, 20, and lOOng / ml. Incubated for 24, 48 hours. After culturing, 100 1 of a cell solubilization buffer (Tris buffered saline containing 1% Triton X-100, 5 mM EDTA and protease inhibitor cocktail) was added to each well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • a cell solubilization buffer Tris buffered saline containing 1% Triton X-100, 5 mM EDTA and protease inhibitor cocktail
  • each well 101 is transferred to a 384 well-attached plate (black, low volume type, manufactured by Kojung Co., Ltd.), and an assay buffer (200 ng / ml cryptate-labeled 6G4 antibody, 5000 ng / ml ml XL665-labeled 2E6 antibody, 0.8M potassium fluoride, and Tris-buffered saline containing 0.5% BSA) were added and reacted at room temperature for 24 hours. After completion of the reaction, the fluorescence intensity of each well at 665 nm was measured with a time-resolved fluorescence microphone plate reader (Rubystar, BMG Labtechnologis). The measured value was expressed as a ratio value with respect to the fluorescence intensity of cryptate at 620 ⁇ m.
  • an assay buffer 200 ng / ml cryptate-labeled 6G4 antibody, 5000 ng / ml ml XL665-labeled 2E6 antibody
  • the ratio value increased about 10-fold by stimulation with IL-4 indicates that the method of the present invention can be applied to no-throughput screening for the purpose of drug development.
  • Example 4 Helium that was transferred according to Example 4 to a 384 well plate (Corning Co., Ltd., ⁇ .3709) containing 1 ⁇ l of a 10% DMSO solution in which 0.15 mg / ml of the test compound was dissolved was added. After culturing La cells at 20 ⁇ l (2 ⁇ 10 4 cells) for 30 minutes, 10 ⁇ l of a medium containing 3 ng / ml of IL-4 was added and further cultured for 24 hours. After culturing, 301 HTRF reagents described above were added and allowed to react at room temperature for a while, and HTRF of each well was measured with Rubystar. The transcription inhibitory activity of the test compound is 0% of the measured value obtained from cells treated with IL-4 without addition of the compound, and 100% of the measured value obtained without treatment with IL-4. Calculated as
  • a fragment in which mTK and four IL-4 regulatory elements described in Example 1 were ligated was inserted into the pGL 3-Basic vector via the restriction enzyme sites of Bgll I and Hindlll, and used as a reporter vector for luciferase activity.
  • HeLa cells stably transfected with this vector were selected (HL-10 cells).
  • each well was washed 3 times with 100 ⁇ l of a washing solution (TBS containing 0.0 1% Tween 20), and then 30 ⁇ l of a cell sample was added and reacted at 4 ° C. once. Wash each well 3 times with 100 1 wash solution, then add 330 ng / ml HRP-labeled anti-luciferase polyclonal antibody (Rockland), 30% TBS containing 0.01% Tween20 and 0.1% BSA at room temperature For 5 hours. After the reaction, each well was washed three times with 100 ⁇ l of washing solution, and 30 ⁇ l of a substrate solution (manufactured by Dako) was added and allowed to develop at room temperature for 30 minutes. After color development, 30 1 of 1N sulfuric acid was added to stop the reaction, and the absorbance at 450 ⁇ m was measured with a multilabel counter. The transcription inhibitory activity of the test compound was calculated in the same manner as the HTRF method.
  • HTRF method and luciferase assay Some of the compounds used inhibited cell growth. These compounds appear to apparently inhibit STAT6 transcription, and indeed, for the HTRF method and luciferase assay (ELISA), compounds that inhibit cell proliferation also inhibited transcription. However, Luciferase Atssay (chemiluminescence) does not prevent cell growth There was a compound that apparently did not interfere. On the other hand, among compounds that do not inhibit cell growth, HTRF method and luciferase activity (ELISA) showed strong transcription inhibition activity, but luciferase activity (chemiluminescence method) showed transcription inhibition activity. Some compounds did not exist, and on the other hand, some compounds showed strong inhibitory activity only with luciferase activity. Thus, the divergence of the results between luciferase assembly and other methods is not due to the fact that measurement systems using chemiluminescence are susceptible to test compounds. It was guessed.
  • the following table shows the results of measuring the transcription inhibitory activity of 15 compounds using the HTRF method and the luciferase method (aluminoluminescence method and ELISA), and the cell growth inhibitory activity of these compounds. The results are shown.
  • SEQ ID NO: 1 is the sequence of the polypeptide used to produce the antibody.
  • SEQ ID NO: 2 is the sequence of the polypeptide used to produce the antibody.
  • SEQ ID NO: 3 is the sequence of the polypeptide used as the epitope tag.
  • SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the variable region (VH) of the 6G4 antibody.
  • SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence of the variable region (VL) of the 6G4 antibody.
  • SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence of the variable region (VH) of the 2E6 antibody.
  • SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of the variable region (VL) of the 2E6 antibody.
  • SEQ ID NO: 8 is an oligonucleotide designed to synthesize cDNA for VH region of 6G4 antibody.
  • SEQ ID NO: 9 is an oligonucleotide designed to synthesize cDNA for the VH region of 2E6 antibody.
  • SEQ ID NO: 10 is an oligonucleotide designed for synthesizing cDNA of VL region of 6G4 antibody and 2E6 antibody.
  • SEQ ID NO: 11 is a PCR primer designed to amplify the gene for the VH region of the 6G4 antibody.
  • SEQ ID NO: 12 is a PCR primer designed to amplify the gene for the VH region of the 2E6 antibody.
  • SEQ ID NO: 13 is a PCR primer designed to amplify the gene of the VL region of 6G4 antibody and 2E6 antibody.
  • SEQ ID NO: 14 is the gene sequence of the epitope tag used in the examples.
  • SEQ ID NO: 15 is the gene sequence of the reporter gene used in the examples.
  • SEQ ID NO: 16 is the gene sequence of the IL-4 regulatory element of the germline ⁇ promoter of the immunoglobulin heavy chain.
  • SEQ ID NO: 17 is the gene sequence of the thymidine kinase promoter used in the examples

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Abstract

　被験物質の転写調節活性を測定するためのより精度の高い方法を提供する。転写因子の認識配列と転写開始に必要な塩基配列の下流に、エピトープタグをコードする遺伝子を含むレポータ遺伝子を接続したベクターを有する細胞に、被験物質、検出抗体を接触させ、２種類の検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出して前記被験物質の転写調節機構に対する作用と関連づける工程を含むレポータ遺伝子アッセイ方法を見出した。

Description

明 細 書
レポータ遺伝子アツセィ法
技術分野
[0001] 本発明は、レポータ遺伝子アツセィ法に関する。
背景技術
[0002] サイト力イン、ホルモン、抗原等が細胞膜上に存在する受容体と結合すると、細胞内 でカノレシゥムイオン、サイクリック AMPなどのセカンドメッセンジャーやプロテインキナ ーゼなどが複雑に絡んだ反応カスケードが活性ィ匕して情報が伝達される。このとき情 報伝達経路の下流に位置する転写因子が情報を受け取って核内に移行し、 DNA上 の特定の翻訳開始点に存在する認識配列と結合して、標的遺伝子の転写を促進す る。このような転写調節機構は、生殖、細胞分化、エネルギー代謝、増殖、生物の恒 常性の維持などに重要な役割を果たしている。そのため転写調節が正常に行われな くなると、前記標的遺伝子の発現量に異常を来し種々の疾患や異常の原因となるこ とが知られている。そこで、力かる疾患等の治療剤もしくは予防剤を開発するため、前 記標的遺伝子の転写を制御する物質を見出すためのさまざまなアツセィが当該分野 において知られている。一般に、これらのアツセィは、レポータ遺伝子アツセィとよば れ、プロモーター等の転写開始に必要な領域とレポータ遺伝子を連結した DNAを含 むプラスミドを細胞に導入し、レポータ遺伝子の転写 ·翻訳に伴うレポータ蛋白質の 生成量を指標にして被験物質の作用を調べている。このときレポータ遺伝子としては 、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフ ラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP)、強化緑 色蛍光タンパク質 (EGFP)、クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ（CAT)、 アルカリホスファターゼ、 β—ガラタトシダーゼ等が汎用されている。
非特許文献 1：「改訂第 4版 新 遺伝子工学ハンドブック」、 ρ223〜226、羊土社、 200 3年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 従来のレポータ遺伝子アツセィ方法では、レポータ蛋白質の酵素活性に伴う発光、 蛍光、試薬の色の変化、または遺伝子が導入されている細胞におけるいくつかの検 出可能な表現型の変化を指標として転写活性が測定されていた。しかし、これらはい ずれもレポータ蛋白質の生成量を間接的に測定するため、その精度に問題があった 。例えば、細胞内に内在する酵素により非特異的なシグナルが生じたり、被験物質が レポータ蛋白質の酵素活性に影響を及ぼすなどして、被験物質の転写制御能を誤 つて評価してしまう場合があった。そこで、これらの問題点を解消し、し力も転写活性 を簡便で迅速に測定できる新しいアツセィ方法の開発が切望されていた。
課題を解決するための手段
本発明者らは、鋭意研究の結果、上記目的が以下に述べるレポータ遺伝子アツセィ 法によって達成されることを見出し、ここに本発明を完成するに至った。
即ち本発明によれば
[1]
転写因子の認識配列と転写開始に必要な塩基配列の下流に、第 1ェピトープ及び 第 2ェピトープを有するェピトープタグをコードする遺伝子を含むレポータ遺伝子を 接続したベクターを有する細胞に、被験物質、第 1ェピトープを認識する検出抗体、 及び第 2ェピトープを認識する検出抗体を接触させ、前記両検出抗体がそれぞれ前 記第 1ェピトープ及び第 2ェピトープに結合し互いに近接することにより生じる現象を 検出し、前記被験物質の転写調節機構に対する作用と関連づける工程を含み、前 記第 1ェピトープ及び第 2ェピトープが、それぞれを認識する検出抗体が結合した場 合に、前記両検出抗体が互いに近接することができるように配置されて 、ることを特 徴とする、レポータ遺伝子アツセィ方法。
[2]
前記細胞に転写因子、リガンド、レセプター及びコアクチベータ一力 なる群力 選 択されるいずれかを発現させることを特徴とする上記 [1]記載の方法。
[3]
前記検出抗体がともに蛍光体により標識されたものである上記 [1ほたは [2]に記載の 方法。
[4] 前記蛍光体がユーロピウム化合物及びァロフィコシァニン誘導体の組み合わせから なる上記 [3]記載の方法。
[5]
転写因子の認識配列と転写開始に必要な塩基配列の下流に、第 1ェピトープ及び 第 2ェピトープを有するェピトープタグをコードする遺伝子を含むレポータ遺伝子を 接続したベクターを有する細胞、
[6]
前記レポータ遺伝子が配列表の配列番号 15に示す配列を有するものである上記 [5] 記載の細胞、
[7]
上記 [1]〜[4]のいずれかの方法に使用するためのベクター、
[8]
上記 [1]〜[4]のいずれかの方法に使用するためのキット、
が提供される。
発明の効果
[0005] 本発明のアツセィ方法では、レポータ蛋白質の生成量を直接測定するので、細胞や 被験物質などの諸要因に基づく測定結果の誤認を回避することができる。また、本発 明のアツセィ方法では被験物質の色合いに起因する測定誤差 (カラークェンチング） を除外して測定するので、被験物質の有する転写制御能を正確に測定することがで きる。
図面の簡単な説明
[0006] [図 1]レポータプラスミドの図である。
[図 2]本発明のレポータ遺伝子アツセィ法による測定結果を示す。パネル Aは、 IL-4を 20ng/ml添カ卩したときの細胞の刺激時間とレシオ値の関係を示すグラフである。パネ ル Bは、細胞を IL-4で 24時間刺激したときの IL-4の添加量と蛍光強度の関係を示す グラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0007] 本発明は、転写因子の認識配列と転写開始に必要な塩基配列の下流に、第 1ェピト ープ及び第 2ェピトープを有するェピトープタグをコードする遺伝子を含むレポータ 遺伝子を接続したベクターを有する細胞に、被験物質、第 1ェピトープを認識する検 出抗体、及び第 2ェピトープを認識する検出抗体を接触させ、前記両検出抗体がそ れぞれ前記第 1ェピトープ及び第 2ェピトープに結合し互いに近接することにより生じ る現象を検出し、前記被験物質の転写調節機構に対する作用と関連づける工程を 含み、前記第 1ェピトープ及び第 2ェピトープが、それぞれを認識する検出抗体が結 合した場合に前記両検出抗体が互いに近接することができるように配置されて 、るこ とを特徴とする、レポータ遺伝子アツセィ方法に関するものである。
[0008] 更に、本発明に係わる上記の方法は、特定のベクターやキットの利用により簡便に実 施可能であり、本発明は力かるベクターやキットをも提供する。
[0009] 本発明にお 、ては、（a)転写因子の認識配列と転写開始に必要な塩基配列の下流に 、ェピトープタグをコードする遺伝子を含むレポータ遺伝子を接続したベクターを有し ており、かつ (b)前記ェピトープタグには、 2種類のェピトープがそれぞれを認識する 検出抗体を結合させた場合に前記両検出抗体が互いに近接することができるように 配置されて ヽる、と ヽぅ特徴を有する細胞が使用される。
[0010] 本発明の方法に使用する細胞には、転写因子の認識配列と転写開始に必要な塩基 配列の下流に、レポータ遺伝子を接続したベクター（以下、「レポータプラスミド」とも 言う）を有して ヽることを特徴とする。
[0011] このようなレポータプラスミドは、例えば転写因子の認識配列を有する DNAと転写開 始に必要な塩基配列を有する DNAとの下流に上記のレポータ遺伝子が機能し得るよ うに、適当なベクターに導入連結させることにより調製することができる。
[0012] このとき、ベクターとしては大腸菌等を用いた遺伝子工学的技術に適したものを使用 することができる。具体的には、微生物内で機能可能な複製起点（レブリコン)および 薬剤耐性遺伝子を有しその下流に遺伝子挿入部位 (マルチクロー-ングサイト）を有 する市販のベクター等をあげることができる。
[0013] また市販されて ヽるレポータプラスミドにェピトープタグをコードする遺伝子を挿入す ること〖こよっても構築することができる。
[0014] 遺伝子の転写には、プロモーター及び転写制御領域 (シス因子）が必要である。シス 因子には転写を活性ィ匕するェンノヽンサ一及び転写を抑制するサイレンサーが存在 する。シス因子に結合する因子（トランス因子)を、プロモーターに結合する基本転写 因子に対して配列特異的因子または転写制御因子と呼んでいる。多数の配列特異 的転写因子 (以下、転写因子）が報告されており、またその認識配列も転写因子によ り異なっている。現在までに同定された転写因子は数百に及ぶ。公知の転写因子と しては、例えば、 SRF、 Spl、 HNF_1、 STAT, NF κ B等が挙げられる（別冊'医学のあ ゆみ「転写因子と疾患」、 vol.190、 No.6、 1999年、 52-57)。このような転写因子、もしく はその複合体力 認識して結合することによりその下流に存在する標的遺伝子の転 写が促進/抑制されるとき、このような DNA配列を「転写因子の認識配列」という。本発 明のアツセィ方法においては、このような配列は、その目的に応じて任意に変更する ことができる。尚、十分な転写制御能を得るには、前記転写因子の応答配は通常 2〜 5程度タンデムに連結されていることが好ましい。力かる塩基配列を有する DNAは、化 学合成するか、または PCR法などにより増幅しクローユングすること等により調製する ことができる。
[0015] 「転写開始に必要な塩基配列」とは上述の認識配列に転写因子が結合した後、下流 のレポータ遺伝子等の標的遺伝子の転写反応開始もしくはその効率に関与する塩 基配列をさす。これらは一般にプロモーターもしくはェンノヽンサ一と呼ばれる。これら の塩基配列は、それが下流配列の転写の調節に関与する場合、下流配列が機能す るように連結されて 、る必要がある。このような性質を有する領域として様々な配列が 当業者には公知であり、そのすべてが本発明に適用可能である。例えば、実施例の チミジンキナーゼ遺伝子 (tk)の 5'上流領域の塩基配列の他、ダルタチオン S-トランス フェラーゼ Yaサブユニット遺伝子の 5'上流領域（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 382 6-3830 (1990))の塩基配列、チトクロム P4501A1遺伝子の 5'上流領域（Eur. J. Bioche m.， 159, 219-225(1986))の塩基配列等を挙げることができる。
[0016] なお、「転写因子の認識配列」と「転写開始に必要な塩基配列」の全部、もしくは一部 がー体となった領域も公知となっており、この場合は領域を一体として本発明の方法 に適用することができる。このような領域の例としては、 cAMP応答エレメント (CRE)、 エストロゲンレセプターエレメント (ERE)、血清応答エレメント (SRE)、および TPA応答ェ レメント (TRE)等を挙げることができる。後述する実施例において使用する IL-4調節 エレメントにも、転写因子である STAT6の認識配列、及び CCAAT-ェンハンサー結合 タンパク（C/EBP)の結合配列（ェンハンサー）が含まれて 、る。このような塩基配列を 有する DNAは、例えば、目的の領域をコードする DNAを増幅するためのオリゴヌタレ ォチドを、既知の塩基配列に基づいて設計して作製し、作製されたオリゴヌクレオチ ドをプライマーとして用いる PCRを行うことにより調製することができる。
[0017] レポータ遺伝子
本発明の方法に使用する「レポータ遺伝子」は、その種類は特に限定されないが、ェ ピトープタグをコードする遺伝子が含まれて 、ることが重要である。ェピトープタグとは 着目の蛋白質に融合させることができる、ある特定のアミノ酸配列を有するポリべプチ ド (タグ)であり、そのアミノ酸配列には抗体と結合する領域 (ェピトープ)を含むものを いう。
[0018] 本発明の方法に使用するェピトープタグは、少なくとも 2種類のェピトープを有してお り、各ェピトープは、これを認識する検出抗体を結合させた場合に前記両検出抗体 が互いに近接することができるように配置されて 、ることを特徴とする。このとき「互 ヽ に近接する」とは、あるェピトープ (以下、「第 1ェピトープ」と称する）に免疫反応特異 的に結合することができる検出抗体と、別のェピトープ (以下、「第 2ェピトープ」と称 する）に免疫反応特異的に結合することができる検出抗体がェピトープにお互いが 立体障害となることなく結合することを許容し、かつ各検出抗体が結合した状態で標 識間に生じる反応を検出することができる位置関係にあることを意味する。
[0019] 本発明においては、第 1ェピトープを認識する検出抗体、及び第 2ェピトープを認識 する検出抗体を用いる。ここで、「認識する」とは、「免疫特異的に結合する」ことを意 味する。「免疫特異的に結合する」とは、抗体とアミノ酸配列の間の結合反応をいい、 この結合は、細胞破砕物のように混合状態にぉ 、てアミノ酸配列が存在することの証 明となる。従って、指定の条件下では、抗体は特定の配列に優先的に結合し、サン プル中に存在する他のアミノ酸配列に有意な量で結合しない。この相互作用を、ェピ トープと抗体との間の反応に言及するとき、免疫特異的に結合する、と言う。
[0020] 2つのェピトープは直接連結されてもよぐ適当なペプチドリンカ一により架橋されるこ ともできる。一般的に抗体は分子量約 150KDaと、ェピトープタグの大きさに比べて大 きぐ各検出抗体同士の立体障害により抗体自身のェピトープへの結合が妨げられ る場合が生じる。そのため、適当な長さのペプチドリンカ一を第 1ェピトープ及び第 2 ェピトープ間に挿入することが望ましい。ペプチドリンカ一により 2つのェピトープを架 橋する場合は、通常 0個以上 20個以下、好ましくは 3個以上 6個以下のアミノ酸残基を 挿入することが望ましい。またリンカ一として使用できるアミノ酸残基は特に限定され ないが、検出抗体と交差反応性はなぐかつ、比較的小さな側鎖をもつように選ばれ る。また第 1ェピトープ及び第 2ェピトープのアミノ酸配列については同一種由来に限 定されず異種由来であっても良 ヽ。
[0021] 本発明の方法に用いる細胞におけるレポータ遺伝子としては、例えば、任意の蛋白 質と
上記のェピトープタグを連結させた融合蛋白質をコードする遺伝子を挙げることがで きる。任意の蛋白質は、データーベース等により公知となっている塩基配列に基づい て、当該蛋白質をコードする遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドを設計、作 製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PCRを行うことにより調製するこ とが可能である。この時に用いる铸型として使用できる遺伝子としては、例えば、各種 細胞株より調製した cDNAをあげることができる。このようにして調製したレポーター遺 伝子を市販のベクターに制限酵素を利用して挿入した後、同様にしてェピトープタグ をコードする遺伝子を、ベクター上の前記蛋白質をコードする遺伝子の下流に組み 込むことによりレポータプラスミドを作製できる。
[0022] 実施例にお!、ては、ヒトスペルミジン合成酵素（SPDS、 GenBank Accession No. NP00 3123)に、 2種類のェピトープを有する 19残基力もなるェピトープタグ (配列番号 3)を 連結させた融合蛋白質をコードする遺伝子 (配列番号 15)を使用した。スペルミジン 合成酵素とは核酸合成の基質となるポリアミンの 1種であるスペルミジンを合成する酵 素である。
[0023] ェピトープ
本発明の実施において使用するェピトープはそのアミノ酸配列が特定されていること が重要である。このとき、ェピトープの配列としては、ェピトープとして既知のアミノ酸 配列を利用してもよぐまた自らその配列を設計しても良い。通常は、発現誘導する 細胞内に存在する蛋白質と結合性のない蛋白質の一部を用いる。このときェピトー プは 6個以上 30個以下、好ましくは 6個以上 8個以下のアミノ酸残基力 構成されるこ とが望ましい。例えば、 FLAG (DYKDDDDK、シグマ社、登録商標）、 c- myc (EQKLIS EEL)、ポリヒスチジン（HHHHHH)等はこの分野の当業者において公知のェピトープ であり、これらのェピトープと特異的に結合できる抗体は市販されているので抗体の 入手も容易である。これらのアミノ酸配列を含むものであればその前後に 、かなるァ ミノ酸が添加されたものでも本発明のェピトープとして用いることができる。また、自ら アミノ酸配列を設計する場合は、ェピトープが抗体と特異的に結合する性質を有する ことを以下に示す記載の方法等によって確認することにより、本発明のェピトープとし て用いることができる。
[0024] 抗体のェピトープを特定する方法としては、（A)ある抗体と特異的に結合するアミノ酸 配列を特定することにより決定する方法と、（B)特定のペプチド抗原により免疫して作 製した抗体を用いる方法があるが、本発明の方法を実施するにあたってはいずれか の方法に限定されるものではな 、。
[0025] (A)抗体と特異的に結合するアミノ酸配列を決定する方法としては、前記抗体を用い たウェスタンブロット（Pro Natl.Acad.Sci.U.S.A.76,3116(1979))により特定していく方 法が挙げられる。具体的には、例えば抗原として蛋白質を用いた場合には、まず蛋 白質をコードする DNAを 50〜200個程度のアミノ酸をコードする断片に制限酵素等に より切断し、それぞれの DNA断片を適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な宿主 により転写、翻訳させて蛋白質を発現させ、この蛋白質と抗体との結合性を調べる。 適当な発現ベクターとは、これを導入する宿主に適したものであればいかなるもので あってもよいが、例えば宿主として大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等を用いる場 合には、それぞれ pET、 pNMT、 p cDNA、 pFastBac (すべてインビトロジェン社などか ら入手可)等を用いることができる。また転写、翻訳を行う系として、ゥサギ網状赤血 球、抽出小麦胚芽、大腸菌力 の抽出液 (大腸菌 S30抽出液)等に基づいて調製さ れた無細胞転写翻訳系を用いることもできる。これによりあるペプチド断片にェピトー プを絞り込み、引き続いてそのペプチド断片中のアミノ酸配列 5〜50個程度をコード する DNA断片をポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)や合成オリゴヌクレオチド等で作製し、 これを適当な蛋白質と連結させて融合蛋白質として発現させ、抗体との結合性を調 ベる。この融合蛋白質に用いる適当な蛋白質とは、解析する抗体に結合しないもの であれば!/、かなるものであってもよ 、。力べして抗体に結合するために必要かつ十分 な最も小さい単位のポリペプチドであるェピトープを特定することができる。
[0026] (B)—方、特定のペプチド抗原により免疫して作製した抗体を用いる方法とは、抗体 を作製する際に予め特定のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、抗体の スクリーニングも前記ペプチドにより行う方法である。このように作製された抗体のェピ トープはすでに決定されて 、るのであるから、前記ペプチドを前記抗体のェピトープ として特定することができる。
[0027] ある蛋白質に含まれる特定のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体の作製方法とし て ίま、 f列 、 Antibodies： A Laboratory Manual (1989) (し old bpnng Harbor Laborat ory Press)に記載の方法等を用いることができる。具体的には以下の通りである。抗 体を作製するにあたり、まず免疫原が必要となる。「免疫原」とは、通常生体内におい て免疫応答を生じる、あるいは引き起こす能力を有する物質を表す。免疫原は、それ 自体公知あるいはそれに準ずる方法にしたがって製造することができる。免疫原は必 要に応じて、例えばゥシ血清アルブミン（BSA)、ゥシチログロブリン（BTG)、力ギアナ カサガイのへモシァニン (KLH)などのキャリアタンパクとの複合体として用いられる。 通常ペプチドは分子量が小さく免疫応答性を有しないためこのような複合体を免疫 原として用いることが望まし 、。
[0028] 免疫は、例えば上記の免疫原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射など により投与することにより行い得る。より具体的には、例えば免疫原を生理食塩水含 有リン酸緩衝液 (PBS)、生理食塩水などで適当濃度に希釈し、所望により通常のアジ ュバントと併用して、供試動物に 2〜6週間間隔で計 3〜10回程度投与する。免疫され る哺乳動物としては、一般には、ゥサギ、ャギ、ヒッジ、マウス、ラットなどが用いられる 。マウスを用いる場合は、一回の投与量を一匹あたり 50 g程度とする。ここで前記ァ ジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的に抗原に対する免疫反応を増強す る物質をいう。通常用いられるアジュバントとしては、百日咳ワクチン、フロインドアジ ュバントなどを例示できる。最終免疫後 3〜10日目に哺乳動物の採血を行うことによつ て、ポリクロナル抗体を得ることができる。
[0029] モノクロナル抗体の製造方法は、免疫原で免疫した哺乳動物の形質細胞 (免疫細胞) と哺乳動物の形質細胞腫細胞 (ミエローマ細胞)との融合細胞 (ノヽイブリドーマ、 hybrid oma)を作製し、これより所望の抗原を認識するモノクロナル抗体を産生するクローン を選択し、前記クローンを培養することにより実施できる。このモノクロナル抗体の製 造は、基本的には常法に従うことができる (Kohler, G. and Milstein, C, Nature, 256, 495-497.(1975) )o
[0030] 前記方法において、免疫される哺乳動物は、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞 との適合性を考慮して選択するのが望ましぐマウス、ラットなどが用いられる。
[0031] 得られた免疫細胞からハイプリドーマを得るには、例えば、「分子細胞生物学基礎実 験法」（南江堂堀江武一ら 1994年)等に記載されている方法により、継代培養可能 な細胞とすることを目的として、例えば、ポリエチレングリコール存在下、形質細胞腫 細胞と抗体を産生する免疫細胞とを融合させて、ハイプリドーマを得ることができる。 ここで用いられる形質細胞腫細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物由来の形質 細胞腫細胞を用いることが望ましぐ例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細 胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。形質細胞腫細胞 は p3x63-Ag8.UIなどの公知のものを利用できる。
[0032] ハイプリドーマは、通常 HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地） において培養することにより選択することができる。コロニーが確認された段階で、培 養上清に分泌される抗体と抗原との結合を調べる (スクリーニングする）ことにより目的 の抗体を産生するハイプリドーマを得ることができる。スクリーニングする方法としては 、例えば、スポット法、凝集反応法、ウェスタンプロット法、 ELISA法などの一般に抗体 の検出に用いられている種々の方法が挙げられる力 好ましくは、ノ、イブリドーマの 培養上清について、抗原との反応性を指標とする ELISA法に従い実施される。このス クリーニングによって、抗原と特異的に反応する目的抗体産生株を選択することがで きる。
[0033] 目的抗体産生株のクローユングは、通常、限界希釈法などにより実施できる。クロー ユングされたノ、イブリドーマは、必要に応じて、血清培地または無血清培地で大量培 養することができる。この培養によれば、比較的高純度の所望抗体を培養上清として 得ることができる。また、ハイプリドーマと適合性のある哺乳動物、例えばマウスなどの 腹腔に、ハイプリドーマを接種して、所望抗体をマウス腹水として大量に回収すること ちでさる。
[0034] 本発明の抗体産生ハイプリドーマの培養上清およびマウスなどの腹水は、そのまま 粗製抗体液として用いることができる。または硫酸アンモ-ゥム分画、塩析、ゲル濾過 法、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-テイク口マトグラフィ法などにより精製する ことができる。
[0035] 本発明の実施例において使用するェピトープとして、 Downs等（Journal of Immunolog ical Methods ,247, (2001) )によって既に特定されているヒト 2型コラーゲンに由来す る配列番号 1及び配列番号 2として配列表に示されるアミノ酸配列を含むポリべプチ ドを用いた。また、本ェピトープを特異的に認識するモノクロナル抗体は本明細書中 に記載の方法に従って作製した。
[0036] このようにして作製した本発明の方法に使用できる抗体の具体的な例としては、例え ば配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体と してハイプリドーマ TAG-6G4により産生されるモノクロナル抗体（以下、「6G4抗体」と 称することがある）、配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的 に結合する抗体としてハイプリドーマ TAG-2E6により産生されるモノクロナル抗体 (以 下、「2E6抗体」と称することがある）が挙げられる。平成 18年 1月 1 3日に、独立行政法 人産業技術総合研究所内特許生物寄託センター (茨城県つくば巿東 1-1-1中央第 6)に、「Mouse- Mouse Hybridoma TAG- 2E6」（受領番号 FERM ABP- 10482)及び「M ouse-Mouse Hybridoma TAG-6G4J (受領番号 FERM ABP-10483)なる表示で特許 手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて国際寄託 されている。
[0037] これらの抗体は、以下の理ィ匕学的および免疫学的性質を有している。
6G4抗体
(a)アミノ酸配列 GEPGDDAPS力 なるペプチドと特異的に結合する。 (b)配列番号 4で示される H鎖の可変領域 (VH領域)と、配列番号 5で示される L鎖の 可変領域 (VL領域）をもつ H鎖 50kDa、 L鎖 27kDaからなる 150kDaの蛋白質である。
(c)免疫グロブリンクラス IgGl (k)に属する。
2E6抗体
(d)アミノ酸配列 GPPGPQG力 なるペプチドと特異的に結合する。
(e)配列番号 6で示される VH領域と、配列番号 7で示される VL領域をもつ H鎖 50kDa 、 L鎖 27kDaからなる 150kDaの蛋白質である。
(f)免疫グロブリンクラス IgG2b (k)に属する。
[0038] 細胞
本発明の方法に用いる細胞は、通常の動物細胞等を宿主細胞として、前記のレポ一 タプラスミドを導入したものである。宿主細胞としては、例えばヒト、マウス、ラットなど に由来する哺乳動物細胞、力エルなどに由来する両生類動物細胞、昆虫動物細胞 などを利用することができる。操作性、再現性などを考慮すると安定に継代可能な細 胞が好ましい。好ましい宿主細胞の具体例には、例えばヒト由来の 293細胞、ヒト由来 の A- 431細胞、ヒト由来の HeLa細胞、ヒト由来の Neuroblastoma細胞、マウス由来の NI H3T3細胞、ハムスター由来の CHO-K1細胞、モンキー由来の COS-1細胞、ラット由 来の L6細胞などが含まれる。
[0039] 宿主細胞へレポータプラスミドを導入するには、プラスミドに含まれる各種遺伝子が細 胞内で機能し得る限り、例えばエレクト口ポレーシヨン法、燐酸カルシウム法、リポフエ クシヨン法などの一般的な DNA導入法（トランスフエクシヨン法）によって行うことが可 能である。また、レポータプラスミドに薬剤耐性遺伝子を付加しておけば、レポ一タブ ラスミドを安定に保持した細胞株を選別することができる。
[0040] 本発明の方法に使用する細胞の調製に用いられる培地組成、細胞培養条件、各べ クタ一プラスミドのトランスフエクシヨン条件などは、 V、ずれもこの種の宿主細胞および 遺伝子導入ベクターを利用する常法におけるそれらと同様のものとすることができる。
[0041] また、転写反応を細胞内で行うために必要となる構成因子（レセプター、リガンド、転 写因子、コアクチベータ一等）をコードする遺伝子を内在的に有する細胞は、上述し たレポータプラスミドのみを導入することによって、本発明のアツセィ方法に使用でき る。しかし、転写反応を行うのに必要となる構成因子をコードする遺伝子を内在的に 有しない細胞では、所望により、適宜必要となる遺伝子を導入 (コトランスフエクシヨン )して前記遺伝子の発現能を付与してもよ ヽ。
[0042] 転写に関与するレセプターとしては、 Gタンパク質共役型レセプター (GPCR)、酵素型 レセプター（チロシンキナーゼ型、セリン 'トレオニンキナーゼ型、グァ-ル酸シクラ一 ゼ型）、サイト力インレセプターおよびイオンチャネル型レセプターなどの細胞表面に 存在するもの（細胞膜受容体）だけでなぐアンドロゲンレセプター（GenBank Access! on No.M23263)やエストロゲンレセプター（GenBank Accession No.X03635)等のステ ロイドホルモン受容体や、一酸化窒素 (NO)受容体を含む細胞内レセプターが知られ ている。
[0043] 一般的にサイト力インレセプターは、受容体分子自体はチロシンキナーゼ活性を示さ ず、受容体近傍に存在する JAK (ャヌスキナーゼ）と呼ばれる非受容体型チロシンキ ナーゼが活性化され、細胞内へ向けての最初のシグナルを出す。このシグナルを受 けて STAT(Signal transducer and activator of transcription protein)など他の情報伝 達分子がリン酸化される。
[0044] 例えば、後述の実施例 4に示す IL-4は MHCクラス II、 CD23抗原、 IL-4レセプター aの 発現誘導、 B細胞のクラススィッチ、ヘルパー T細胞の分化誘導などに関与するサイト 力インとして知られおり、 IL-4が細胞膜上に存在するレセプターに結合すると、レセプ ターの二量体ィ匕に伴って、チロシンキナーゼである JAK1と JAK3が細胞内で活性ィ匕さ れ、 IL-4レセプターをリン酸化する。次に、転写因子である STAT6は、レセプターのリ ン酸化部位へ誘導され、 JAKによりリン酸ィ匕を受ける。リン酸ィ匕された STAT6は二量 体を形成して核へ移行し、 DNA上の認識配列と結合することによりプロモーターが活 性化され、細胞応答に関与する遺伝子の発現が誘導されることが知られている。
[0045] 後述の実施例では、免疫グロブリン H鎖の germ line εプロモーター領域に含まれる I L-4調節エレメントを介した転写調節活性を調べている。 IL-4調節エレメントには ST AT6の認識配列及び、その隣に CCAAT-ェンハンサー結合タンパク（C/EBP)の結 合領域が存在して 、る（配列番号 16)。 IL-4の細胞内情報伝達系の下流に位置する STAT6は前記エレメントと結合することにより下流にある遺伝子の転写を制御しており 、 B細胞の終末分ィ匕ゃ抗体のクラススィッチに関与することが知られている。そのた め、この転写調節機構が何らかの要因により乱された場合には、 B細胞の抗原特異 的な活性ィ匕ゃクラススィッチなどの機能が不全となり、体液性免疫不全を引き起こし、 アレルギー疾患や自己免疫疾患を引き起こす可能性がある。
[0046] 従って、この転写機能を制御することにより、例えば B細胞の機能不全あるいは免疫 グロブリンのクラススィッチの不全に起因する種々の免疫不全症（例えば、 IgA腎症、 低 Ίグロブリン血症、高 IgM血症など）、 自己免疫疾患またはアレルギーを予防並び に治療することが可能であると考えられ、 IL-4レセプターを介した細胞内情報伝達に よる転写調節機構を阻害する低分子性化合物は、そのような疾患治療のための医薬 品となり得る。
[0047] また、細胞内レセプターには、細胞内のリガンドと複合体を形成した後、ある特定の 認識配列に結合することによりその下流に存在する遺伝子の転写を促進させる場合 がある。このときのリガンドとしてダルココルチコイド (Nature.,318,635- 641(1985))、エス トロゲン、ダイォキシン (J.Biol.Chem., 263, 17221- 17224(1988))などが知られている。 これらのレセプターに対する転写阻害 (アンタゴニスト)活性を測定する場合、リガンド をコードするような遺伝子を細胞内に導入して発現能を付与してもよい。
[0048] 以上のような転写反応に関係する因子の遺伝子配列の DNAは、例えば、コードする
DNAを増幅するためのオリゴヌクレオチドを、既知の塩基配列に基づ 、て設計して作 製し、作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる PCR反応を行うことによ り調製することができる。力かる PCRにおいて铸型として使用される DNAとしては、例 えば、各種生物由来の市販の cDNAをあげることができる。
[0049] これらの外来遺伝子を宿主細胞に導入する場合には、これらの遺伝子を適当なプロ モーターの下流に機能的に接続した形で前記遺伝子をベクターに挿入し、得られる ベクターを細胞に導入する。
[0050] このときのプロモーターとしては、導入される細胞で機能可能な、即ち転写開始能を 有するプロモーターであって、例えば、当該細胞が真核生物細胞の場合には、ラウス 肉腫ウィルス（RSV)プロモーター、サイトメガロウィルス（CMV)プロモーター、シミアン ウイノレス（SV40)の初期もしくは後期プロモーター等があげられる。またベクターには、 目的とする細胞を選択するための薬剤耐性遺伝子を付与することができる。かかるベ クタ一の宿主細胞への導入方法は上記のレポータプラスミドの導入法に従って行うこ とがでさる。
[0051] 被験物質を接触させる工程
本発明の方法は、こうして提供された細胞に、被験物質を接触させる工程を含む。被 験物質は、細胞培養物に添加することによって細胞に接触させることができる。ある いは、被験物質が蛋白質の場合には、当該蛋白質をコードする遺伝子を前記細胞 中で発現させること〖こより接虫させることができる。
[0052] 検出抗体を接触させる工程
本発明の方法には、上記の細胞に、さらに検出抗体を接触させる工程を含む。このと き検出抗体とは、抗体同士の近接を検出するため、標識物質により標識された抗体 をさす。この検出抗体は予め培地中に添加して細胞を培養してもよぐまた培養終了 後に添加しても良い。抗体は前記ェピトープを含むアミノ酸配列を有するポリべプチ ドを特異的に認識するものであればモノクロナル、ポリクロナルのどちらでもよいが、 前者の方が望ましい。抗体の作製は上述した方法に準ずることにより可能となる。ま た、抗体を標識物質により標識するには、例えば「分子細胞生物学基礎実験法」（南 江堂堀江武一ら 1994年)等に記載されている常法により、もしくは標識物質に附属 するマ-ユアルに従って行うことができる。
[0053] 標識物質としては発光体、酵素、蛍光物質、ビーズ、ラジオアイソトープ、金属類、ビ ォチン等が挙げられる。発光体とは例えばルシフエノール、ルミノール、ェクオリン、ァ クリジ -ゥムエステルなどの化学発光物質をさす。酵素とは例えばルシフェラーゼ、 /3 -ガラタトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルォキシダーゼなどをさす。蛍光物質 とは例えば、ユウ口ピウム (Eu)やテルビウム (Tb)などのランタ-ド元素、ユウ口ピウムクリ プテートなどのランタ-ド元素誘導体、 FITC (fluorescein isothiocyanate)などフルォ ロセイン誘導体、 RITC (tetramethylrhodamin isothiocyanate)などローダミン誘導体、 YFP、 GFP、 CFP、 BFP、ァロフィコシァニン等の蛍光蛋白質が含まれる。ビーズとは 例えばプロテイン Aビーズ、 wheat germ agglutinin (WGA)ビーズ、ストレプトアビジン ビーズなど特殊な処理を施されたビーズをさす。ラジオアイソトープとは例えば14 C、 125 I、 3H、 35Sなどをさす。またこれらで標識されたィ匕合物も含むものとする。金属類とは 例えばフェリチンや金コロイドなどをさす。
[0054] ただし、標識物質を選択するにあたっては後述するように、検出抗体の近接に伴う現 象を検出できるような組み合わせを選択する必要がある。このような組み合わせとして 、例えば蛍光物質標識と蛍光物質標識、発光体標識と蛍光物質標識、放射性同位 体標識とビーズ等の組み合わせが一般に知られている。
[0055] 「ェピトープを認識する検出抗体を接触させる工程」とは、レポータ蛋白質に含まれる 、 2種類のェピトープ (第 1ェピトープ及び第 2ェピトープ)をそれぞれ免疫特異的に認 識することができる検出抗体を、レポータ蛋白質を含む細胞試料中に添加することを さす。検出抗体は通常、適当な緩衝液 (例えば 0.8Mフッ化カリウム、 0.5%ゥシ血清ァ ルブミンを含むトリス緩衝化生理食塩水）により希釈して添加する。使用する希釈濃 度は予備検討により以下に述べるような「検出抗体の近接により生じる現象」が効率 よく検出できる条件を満たすことを確認することにより決定できる。例えば、「検出抗体 の近接により生じる現象」が蛍光物質の共鳴による励起エネルギーの移動 (FRET)で あれば、ァクセプターの蛍光強度でその効率を確認することによりアツセィに使用す る検出抗体の濃度を決定することができる。
[0056] 前記両検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出し、前記被験物質の 転写調節機構に対する作用と関連づける工程
本発明の方法は、 2種類の検出抗体を上記細胞に接触させた後に、前記両検出杭 体が互いに近接することにより生じる現象を検出し、前記被験物質の転写調節機構 に対する作用と関連づけることを特徴とする。「近接することにより生じる現象を検出」 とは、第 1ェピトープに第 1ェピトープを認識する検出抗体、第 2ェピトープに第 2ェピ トープを認識する検出抗体が結合した場合、二つの検出抗体の標識が互いに接近 することにより生じる現象を検出することをさす。このように二つの蛋白質の相互作用 を検出する方法はこの分野における研究者においてはよく知られており、例えば BRE T法、 FRET法、 Alpnabcreen、 mplined luminescent proximity homogeneous assay ^ 登録商標）、 SP A(Scintillation Proximity Assay,登録商標）等が挙げられる。
[0057] また、上記の現象は、被験物質の転写調節機構に対する作用と関連づけることがで きる。本発明の方法においては、検出される値の大きさは、転写調節活性の大きさを 反映している。従って、前記両検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検 出することによって、被験物質の転写調節機構に対する作用（転写促進活性や転写 阻害活性等)を評価することができる。
[0058] 近接することにより生じる現象を検出する方法の好ましい形態としては、共鳴による励 起工ネルギ一の移動を検出する方法を挙げることができる。例えば、蛍光物質は励 起光が照射されると励起状態となりそのエネルギーは蛍光もしくは熱エネルギーとし て放出され基底状態に戻る（消光)。このとき近くに別の蛍光物質が存在すると、エネ ルギーを受けることによりこの蛍光物質がさらに励起されて同様に蛍光を発するという 現象が生じる。このような現象は、蛍光共鳴エネルギー移動 (fluorescence resonance energy transfer;以下 FRETともいう)として知られている。このときの蛍光強度を蛍光 光度計等の測定機器で測定すれば被験物質の転写調節機構に対する作用を測定 することが可能となる。
[0059] この場合にお 、て、特に好ま 、形態としては、蛍光寿命（消光するまでの時間）の 長 、蛍光物質をドナー (エネルギーを提供する分子)として選択する方法を挙げるこ とができる。この方法では細胞試料やプラスチックなどの妨害物質の蛍光が短寿命で あるため、励起後、一定時間経過後に測定すれば妨害物質力もたらすバックグラウン ド蛍光の影響を排除できる。このような FRETを、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ TR— FRET)と呼ぶ。 TR— FRETを検出する方法として、 HTRF (Homogeneous Time-Re solved Fluorescence, CISバイオインターナショナル社）や LANCE (パーキンエルマ一 ライフサイエンス社)等が挙げられる。
[0060] HTRFは二種類の蛍光物質を用いることを特徴とする。具体的にはユウ口ピウム化合 物であるユウ口ピウムクリブテート（以下クリプテート、トリスビピリジンの籠状構造の中 に希土類元素のユウ口ピウムイオンが配位した構造をもつ）及び、ァロフィコシァニン 誘導体の X L665 (藍藻由来蛍光性タンパクであるァロフィコシァニンを 3分子架橋し て安定ィ匕したもの）である。クリプテートに 337nmの励起光を照射すると 620nmの長寿 命蛍光を発するが、検出抗体同士が接近して近傍に XL665が存在する場合、 FRET により、励起エネルギー力 ¾L665へ移動するので XL665から 665nmの長寿命蛍光が 生ずる。この長寿命蛍光を測定すればレポーター蛋白質を測定することが可能とな る。この方法の利点としてはクリプテートを励起後一定時間経過して力も蛍光を測定 することにより、測定試料や測定チューブに含まれる蛍光性物質に起因する短寿命 のノ ックグラウンド蛍光 (〜10ナノ秒)を排除して、長寿命蛍光 (〜1ミリ秒)のみを選択 的に検出することが可能であることが挙げられる。また、 XL665の 665nmの蛍光とタリ プテートの 620nmの蛍光を同時に測定することにより、測定値を (665nmの蛍光強度 ÷620nmの蛍光強度） X 10,000のレシオ値で表すことで試薬添加量のばらつきや測 定試料のカラークェンチング効果 (インナーフィルター効果）による測定値の変動を 補正することも可能である。
[0061] 他の形態として BRET(Bioluminescence resonance energy transfer)と呼ばれる、生体 発光共鳴によるエネルギー転移を利用する検出方法も挙げられる。例えば、二種類 の検出抗体として、ルシフェラーゼ及び緑色蛍光蛋白質変異体 (GFP変異体）により 標識した抗体を用いる。これらの検出抗体が近接すると、ルシフェリンとルシフェラー ゼの発光反応により生じたエネルギーの一部が GFP変異体に移動して蛍光を発する 現象 (BRET)が生じる。このとき、蛍光強度を測定することにより、被験物質の転写調 節機構に対する作用を測定することが可能となる。
[0062] その他の形態として、ビーズ (例えば SPAビーズ)及びラジオアイソトープ (例えば3 H、 1 4Cや1251等)で標識した検出抗体を組み合わせて使用する方法が挙げられる。 2つの 検出抗体が接近した場合、ラジオアイソトープ力 発せられた β線などの放射線がビ ーズ内のシンチレ一ターに到達し、発光現象が生じるので、この発光を検出すること により、被験物質の転写調節機構に対する作用を測定することが可能となる。
[0063] 本発明の方法により検出可能な具体例として、インターロイキン 4 (IL -4)を介した細 胞内情報伝達系を挙げることができる。免疫グロブリン Η鎖の germ line ε プロモー ターの IL- 4調節エレメント（T. Mikita et al. Mol.Cell. Biol. 1996 p5811-5820、配列 番号 16)と phRL-TKベクター（プロメガ社）のチミジンキナーゼプロモーター（配列番 号 17)を pGL3 basicベクター（プロメガ社製）のルシフェラーゼ遺伝子上流に組み込 み、さらにルシフェラーゼ遺伝子を本発明のレポータ遺伝子（SPDSとェピトープタグ を連結した遺伝子、配列番号 15)に置き換えたレポータプラスミドを作製した。レポ一 タプラスミドの概要を図 1に示す。このプラスミドを、ヒト上皮癌由来の HeLa細胞にトラ ンスフヱクシヨン法で導入した細胞を使用して、 IL-4の添加濃度及び IL-4による刺激 時間と、検出値の相関関係を本発明の方法により測定した。その結果、 IL-4の刺激 濃度や刺激時間に依存して蛍光強度の強さが変化することを確認できた。これは、 本発明の方法により、 IL-4を起点とした細胞内情報伝達による転写の亢進を検出で さることを示している。
[0064] レポータ遺伝子アツセィ方法
本発明のレポータ遺伝子アツセィ法の使用態様は、基本的には従来力も知られてい るこの種のレポータ遺伝子アツセィ法のものと同様であり、スクリーニング方法もその 一態様といえる。
[0065] 具体的には、まず、本発明細胞を細胞培養容器に播種して培養する。例えば、 96ゥ エルプレートを使用する場合、通常、 1ゥエルあたり ιο4〜ιο5個程度の細胞を播種し、 1時間から 1晚程度培養する。次いで、細胞培養液に被験物質を添加する。このとき 被験物質は、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物 (低分子化合物 等）、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などのいずれであつ てもよい。またこれらを含む溶液であってもよい。被験物質の転写促進活性を測定す る場合は、被験物質を溶媒に溶解させた溶液または溶媒のみを、培養液における溶 媒の最終濃度が通常 0.1〜2%程度の範囲になるようにして前記細胞培養液に添カロ する。被験物質の転写阻害活性を測定する場合は、レセプターのリガンド活性を有 する物質を培地などに溶解させた溶液を、培養液における前記リガンドの濃度が通 常 EC50程度となるように前記培養液に添加した系および前記系にさらに被験物質を 添カロした系を調製する。ここで溶媒としては、ジメチルスルフォキシド (DMSO)、ェタノ ールなどがよく用いられる。
[0066] 例えば、被験物質の転写促進活性測定試験において、溶媒のみが添加された系の 細胞よりも、被験物質が添加された系の細胞の方力 細胞あたりの検出値が高い場 合、当該被験物質は転写促進活性を示すと判断される。被験物質の転写阻害活性 測定試験において、リガンドのみが添加された系の細胞の検出値に比較して、前記リ ガンドと被験物質とが添加された系の細胞の検出値が低い場合には、当該被験物質 は転写阻害活性をもっと判断される。
[0067] 以下において、実施例により本発明をより具体的にするが本発明はこれらに限定さ れるものではない。
実施例 1
[0068] レポータプラスミドの調製
phRL-TKベクター（プロメガ社製）のチミジンキナーゼプロモーター（TKプロモーター 、配列番号 17)を PCRで増幅し、制限酵素サイト（Bglllおよび Hindlll)を介して、 pGL3 -Basicベクター（プロメガ社製）に挿入した (pGL3- TK)。次に、 IL- 4調節エレメント (配 列番号 16)を合成して、これを Τ4ポリヌクレオチドキナーゼで重合させ、 4量体フラグメ ントをァガロースゲル電気泳動で分離した。制限酵素サイト (Bglll)を介して、 pGL3- TKの TKプロモーターの上流に 4量体フラグメントを挿入した。さらに、制限酵素 Ncolと Xbalで消化し、ルシフェラーゼ遺伝子を除いた DNAフラグメント（3.4kb)をァガロース ゲル電気泳動で精製した。 U20S細胞 (ヒト骨肉腫細胞株、 American Type Culture C ollection)から totalRNAを精製し、 RT- PCRにより、 SPDS (GenBank Accession number BC000309、 a human working draft contig identifier NM— 003132)とェピトープタグ の遺伝子 (配列番号 14)を連結した遺伝子 (配列番号 15)を増幅した。制限酵素サイ ト（Ncolおよび Xbal)を介して、 PCR産物を 3.4kbの DNAフラグメントに挿入してレポ一 タプラスミドとした（図 1)。
実施例 2
[0069] 抗体の作製方法
(1) 6G4抗体の作製
ヒト 2型コラーゲンのアミノ酸番号 757-765に相当する領域 (配列番号 1)の C末端側に システィンを付加したアミノ酸配列力もなるポリペプチドと力ギアナカサガイのへモシ ァニン（KLH、ピアス社製）を、スルフォスクシンィミジル 4-(N-マレイミドメチル) -シクロ へキサン- 1-カルボキシレート（sulfo-SMCC、ピアス社製）を用いてコンジュゲートさせ 、免疫原とした。免疫原をフロイントの完全アジュバント (ディフコ社製)と混合してエマ ルジョンとし、 3週間毎にマウス（Balb/c CrSlc、 6週齢、雌）の腹腔内に 40 g投与した 。 4回免疫後にマウスの脾臓を摘出し、 PEG法によりミエローマ細胞（p3 X 63- Ag8.UI 、東京腫瘤研究所)と融合させ、ノ、イブリドーマを調製した。培養 9日目に培養上清を 採取し、抗体産生ノ、イブリドーマを含む陽性ゥエルのスクリーニングを行った。スクリ 一ユングは以下に述べる時間分解蛍光ィムノアッセィ（DELFIA、アマシャム社)で行 つた。抗マウス IgG抗体 (シバヤギ社製)を固相したマイクロタイタープレート (住友べ 一クライト社製）に、測定緩衝液（150mM NaCl、 0.01%Tween80、 0.5%BSA、 0.05% NaNを含む δθ mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.5) ) 50 1、培養上清 δθ μ 1、標識抗原 (20η
3
g/mlピオチン標識抗原ペプチドと 100ng/mlユウ口ピウム標識ストレプトアビジン (パー キンエルマ一ライフサイエンス社製)を含む測定緩衝液) 50 μ 1を連続してカ卩え、 4°C で 16時間反応させた。洗浄液（150mM NaCl、 0.02%NaN
3、 0.01%Tween20) 200 1 でプレートを 2回洗浄した後、エンハンスメントソルーシヨン（パーキンエルマ一ライフ サイエンス社製）を 150 μ 1加え、 1420ARVOsxマルチラベルカウンタ（パーキンエルマ 一ライフサイエンス社製)で時間分解蛍光を測定した。本スクリーニングで反応性の 高力つた 1ゥエルを選択し、限界希釈法によるクローユングを 2回繰り返して抗体産生 ハイプリドーマ TAG-6G4を確立した。 TAG-6G4のサブクラスをマウスモノクロナル抗 体ァイソタイピング ELISAキット（BDノィォサイエンス社製)で調べたところ、 IgGl (k) であった。ハイプリドーマ TAG- 6G4をヌードマウス（BALB/cANNCrj- nu- nu)の腹腔 内に投与して腹水を採取した (ラボプロダクツ社に委託)。プロテイン Aカラムを用いた ァフィ-ティクロマトグラフィーにより腹水力も精製抗体を得た。
[0070] (2) 2E6抗体の作製
ヒト 2型コラーゲンのアミノ酸番号 769-775に相当する領域 (配列番号 2)の N末端側に システィンを付加したアミノ酸配列力もなるポリペプチドとゥシ血清アルブミン (BSA、 ピアス社製）を（N-e-マレイミドカプロイロキシ）スルフォスクシンイミドエステル（Sulfo- EMCS、ピアス社製)を用いてコンジュゲートさせ、免疫原とした。 TAG-6G4と同様、免 疫原をマウス (A/J Jms Sic, 6週齢、雌)へ投与し、脾臓を摘出して細胞融合を行った 。 DELFIAによるスクリーニングとクロー-ングを行い、抗体産生ハイブリドーマ TAG- 2 E6を確立した。抗体のサブクラスは IgG2b (k)であった。ヌードマウスの腹水化とプロ ティン Aカラムを用いたァフィ-ティクロマトグラフィーにより精製抗体を得た。
[0071] (3) VH領域と VL領域のアミノ酸配列の決定 RneasyMiniキット（キアゲン社製）を用いて 1 X 107個のハイプリドーマから total RNAを 精製した。 SMART RACE cDNA増幅キット（BDバイオサイエンス社製）を利用して、キ ットの操作手順に従って VH領域と VL領域の遺伝子配列を決定した。キット付属の SM ARTII Aオリゴヌクレオチドと TAG-6G4の VH領域に特異的なプライマー（配列番号 8 )、 TAG-2E6の VH領域に特異的なプライマー（配列番号 9)、 VI領域に特異的なブラ イマ一（配列番号 10)を用いて cDNAを合成した。これらの cDNAを铸型として、キット 付属のユニバーサルプライマーと TAG-6G4の VH領域に特異的なプライマー（配列 番号 11)、 TAG-2E6の VH領域に特異的なプライマー（配列番号 12)、 VI領域に特異 的なプライマー（配列番号 13)を用いて PCRを行い、 VH遺伝子、 VL遺伝子を増幅し た。これらの PCR産物を TOPO TAクロー-ングキット（インビトロジェン社製）でクロー ユングし、シークェンスを解析した (オペロンバイオテクノロジー社に依託)。得られた 遺伝子配列から VH領域と VL領域のアミノ酸配列を決定した。
実施例 3
[0072] 検出抗体の作製方法
( 1) 6G4抗体のクリプテート標識
6G4抗体を 0.1 Mリン酸塩緩衝液 (pH8.0)で 1 mg/mlとした。抗体 1モルに対してクリプ テート TBPモノスべレート（CISバイオインターナショナル社製）を 15モルカ卩えて 25 °C で 1時間反応させた。反応液につき、 PBSで予め平衡ィ匕した PD- 10カラム（アマシャム 社製)を用いたゲルろ過を行い標識抗体を分取した。標識抗体は 0.1 %ゥシ血清アル ブミン、 0.1 % Tween20、 0.05%アジ化ナトリウムを添カ卩して- 70 °Cで保存した。
[0073] (2) 2E6抗体の XL665標識
0.1 Mリン酸塩緩衝液 (pH7.0)に溶かした 2E6抗体に、 8倍モル量の N-スクシンイミジ ル 3- (2-ピリジルジチォ）プロピオネート（SPDP、ピアス社製）をカ卩えて 25 °Cで 20分 間反応させた。反応液に終濃度 10 mMのジチオスレィトール (DTT)をカ卩えてさらに 10 分間反応させた後、 10 mM EDTAを含む 0.1 Mリン酸塩緩衝液 (pH7.0)で予め平衡 化した PD- 10カラムを用いたゲルろ過を行 ヽ、システィン基を導入した 2E6抗体を分 取した（SH-2E6抗体）。 XL665 (CISバイオインターナショナル社製）を 0.1 Mリン酸塩 緩衝液（PH7.0)に薄め、 5倍モル量の Sulfo-SMCCをカ卩えて 25 °Cで 30分間反応させ た。 0.1 Mリン酸塩緩衝液 (pH7.0)で予め平衡化した PD-10カラムを用いたゲルろ過 を行い、マレイミド基を導入した XL665を分取した（マレイミド化 XL665)。 1モルのマレ イミド化 XL665に対して上記の SH- 2E6抗体を 3モルカ卩えて 4 °Cで 16時間反応させ、 X L665標識抗体を得た。標識抗体は 100倍モル量の N-ェチルマレイミドをカ卩えて室温 で 10分間放置した後、 0.1 %ゥシ血清アルブミン、 0.1 % Tween20、 0.05%アジ化ナトリ ゥムを添カ卩して- 70 °Cで保存した。
実施例 4
[0074] (1)本発明レポータアツセィ法の細胞の作製
HeLa細胞 (ATCC寄託細胞)を培地（10%ゥシ胎児血清、 100unit/mlペニシリン G、 100 μ g/mlストレプトマイシンを含む MEM培地）で 1.2 X 105細胞/ mlとし、これを 96ゥエル 組織培養プレートに 100 1ずつ展開した。 24時間後、実施例 1で作製したレポ一タブ ラスミド 20 μ gと FuGENE6 (ロシュ社製） 60 μ 1をゥシ胎児血清不含の培地 2mlに加えて 、室温で 20分間放置した後、各ゥエルに 5 1添カ卩して 24時間培養し、レポータプラス ミドをトランスフ タトした。
[0075] (2)転写調節活性の確認
上記の細胞の培養上清を除去した後、各ゥエルに終濃度がそれぞれ 0、 4、 20、 lOOng /mlとなるように、培地で希釈した IL-4を 100 μ 1添加し、 3、 6、 24、 48時間培養した。 培養後、細胞可溶化バッファー（1% TritonX- 100、 5mM EDTA及びプロテアーゼイン ヒビターカクテルを含むトリス緩衝ィ匕生理食塩水）を各ゥエルに 100 1加えて、室温で 1時間放置した。各ゥエルの上清 10 1を 384ゥエルアツセィプレート（黒色、ローボリュ ームタイプ、コーユング社製）に移し、 2種類の検出抗体を含むアツセィバッファー（20 0ng/mlクリプテート標識 6G4抗体、 5,000ng/ml XL665標識 2E6抗体、 0.8Mフッ化カリ ゥム、及び 0.5%BSAを含むトリス緩衝化生理食塩水）を 10 1加えて室温で 24時間反 応させた。反応終了後、各ゥエルの 665nmにおける蛍光強度を時間分解蛍光マイク 口プレートリーダ（Rubystar、 BMG Labtechnologis社製）で測定した。測定値は、 620η mにおけるクリプテートの蛍光強度に対するレシオ値として表した。
[0076] 得られた結果を図 2に示す。レポータプラスミドを導入した細胞は、 IL-4濃度および IL -4による刺激時間に依存してレシオ値が増大した。レシオ値の増大は、 IL-4に発す る細胞内情報伝達によりレポータ分子 (SPDS-ェピトープフラグメント）の発現が亢進 したことを示すものであり、活性ィ匕した STAT6が IL-4調節エレメントに結合した結果、 転写が活性ィ匕したことを反映したものである、と言える。
[0077] また、レシオ値が IL-4による刺激で約 10倍上昇することは、本発明の方法を、医薬品 開発を目的としたノ、イスループットスクリーニングにも適用できることを示している。例 えば、上記の（1)と同手法により HeLa細胞をトランスフエタトして培養上清を除去した のち、新しい培地を 90 1加え、さらに適当な溶媒により 0.2〜lmg/mlの濃度に調製 した被験物質を各ゥエルに: 1添加して 30分間前培養する。つづいて、 IL-4を 40ng/ ml含む培地を各ゥエルに 10 1添カ卩して 24時間培養したのち、上記の（2)の手順に 従って蛍光強度を測定する。被験物質非存在下に比べて、有意に蛍光強度を下げ ることを確認することにより、 IL-4レセプターを介した細胞内情報伝達による転写調節 機構に対して阻害活性を有する被験物質を検出することができる。
実施例 5
[0078] HTRF法とルシフェラーゼアツセィの比較
(1) HTRF法
0.15mg/mlのテスト化合物を溶かした 10%DMSO溶液をあらかじめ 1 μ 1添カ卩した 384ゥ エルプレート（コ一-ング社製、 Νο.3709)に、実施例 4に従ってトランスフエタトした He La細胞を 20 μ 1カ卩ぇ（2 X 104個）、 30分間培養した後に、 IL-4を 3ng/ml含む培地を 10u 1カロえてさらに 24時間培養した。培養後、上述の HTRF試薬を 30 1カ卩えて室温で一 晚反応させ、 Rubystarで各ゥエルの HTRFを測定した。テスト化合物の転写阻害活性 は、化合物を添加せずに IL-4で処理した細胞カゝら得られた測定値を 0%、 IL-4で処 理しない細胞力 得られた測定値を 100%として算出した。
(2) ルシフェラーゼアツセィ (ィ匕学発光法）
実施例 1に記載した mTKと IL-4 regulatory elementを 4個連結したフラグメントを、 Bgll Iと Hindlllの制限酵素サイトを介して pGL 3-Basicベクターに挿入し、ルシフェラーゼ アツセィのレポーターベクターとして用いた。まず、このベクターを安定導入した HeLa 細胞を選別した（HL-10細胞）。 384ゥエルプレート（コ一-ング社製、 No.3704)に上 述のテストイ匕合物溶液を 1 β 1、 HL-10細胞を 20 μ \ {2 Χ 104個）添加して 30分間培養し た後に、 IL-4を 3ng/ml含む培地を 10 /z lカ卩えて 24時間培養した。培養後、ピツカジー ン (東洋インキ社製)を 30 μ 1加えて室温で 1時間反応させ、マルチラベルカウンタ (AR VO)で各ゥエルの発光を測定した。テスト化合物の転写阻害活性は、上述の HTRF 法と同様にして算出した。
(3)ルシフェラーゼアツセィ（ELISA)
上述の化学発光法と同様にして HL-10細胞をテストイ匕合物および IL-4で処理し、ピッ 力ジーンの代わりにプロテアーゼ阻害剤カクテル、 2% Triton Χ-100を含む TBSを 10 1加え、室温で 1時間反応させた。 384ゥエルプレート（ヌンク社製、マキシソープ)に ャギ由来抗ルシフェラーゼポリクロナル抗体 (ケミコン社製）の TBS溶液（10 μ g/ml)を 30ulカ卩えて 4°Cでー晚放置した。抗体溶液を取り除いた後に、 0.5% BSAを含む TBSを 100 1カ卩えて室温で 2時間放置してゥエルをブロッキングした。各ゥエルを洗浄液 (0.0 1% Tween20を含む TBS) 100 μ 1で 3回洗浄した後に、細胞試料を 30 μ 1加えて 4°Cで一 晚反応させた。各ゥエルを洗浄液 100 1で 3回洗浄した後に、 330ng/ml HRP標識ャ ギ由来抗ルシフェラーゼポリクロナル抗体（ロックランド社製）、 0.01% Tween20および 0.1% BSAを含む TBSを 30 1カ卩えて室温で 5時間反応させた。反応後、各ゥエルを洗 浄液 10 0 μ 1で 3回洗浄し、 ΤΜΒ基質液 (ダコ社製）を 30 μ 1カ卩えて室温で 30分間発色 させた。発色後、 1N硫酸を 30 1カ卩えて反応を停止し、マルチラベルカウンタで 450η mの吸光度を測定した。テスト化合物の転写阻害活性は、 HTRF法と同様にして算出 した。
(4) 細胞増殖の測定
化学発光法と同様にして HL-10細胞をテストイ匕合物および IL-4で 24時間処理した後 に、 WST- 8試薬 (キシダイ匕学社製)を 3 μ 1添加してさらに 1時間培養し、マルチラベル カウンタで 450應の吸光度を測定した。細胞増殖阻害率（％)は、化合物を添加せず に IL-4で処理した細胞力 得られた吸光度を 100%として算出した。
使用したィ匕合物には細胞増殖を阻害するものがいくつか存在した。これらの化合物 は STAT6の転写を見かけ上阻害すると考えられ、確かに HTRF法とルシフェラーゼァ ッセィ (ELISA)については、細胞増殖を阻害する化合物は転写も阻害した。しかし、 ルシフェラーゼアツセィ (化学発光法)では、細胞増殖を阻害するにもかかわらず転 写を見かけ上阻害しない化合物が存在した。一方、細胞増殖を阻害しない化合物の 中に、 HTRF法とルシフェラーゼアツセィ（ELISA)では強 、転写阻害活性を示したに もかかわらず、ルシフェラーゼアツセィ (化学発光法)では転写阻害活性が認められ ないものが存在し、反対に、ルシフェラーゼアツセィ (ィ匕学発光法)でのみ強い阻害 活性を示す化合物も存在した。このように、ルシフェラーゼアツセィ (ィ匕学発光法）と他 の方法で結果が乖離するのは、化学発光を利用した測定系がテストイ匕合物の影響を 受けやす 、ことが原因ではな 、かと推察された。
本実験結果から、本発明の HTRF法を用いれば、一般法であるルシフェラーゼアツセ ィに比べて化合物の影響を受けにくぐより精度の高い探索実験を実施でき、 ELISA と比べても迅速性、簡便性に優れた探索実験が可能になると考えられた。
[0080] 下記の表に、 HTRF法とルシフェラーゼ法（ィ匕学発光法および ELISA)で 15種類の化 合物の転写阻害活性を測定した結果と、これらの化合物の細胞増殖阻害活性を測 定した結果を示す。
[0081] [表 1]
Figure imgf000028_0001
配列番号 1は、抗体を作製するのに用いたポリペプチドの配列である。 配列番号 2は、抗体を作製するのに用いたポリペプチドの配列である。 配列番号 3は、ェピトープタグとして用いたポリペプチドの配列である。 配列番号 4は、 6G4抗体の可変領域 (VH)のアミノ酸配列である。 配列番号 5は、 6G4抗体の可変領域 (VL)のアミノ酸配列である。
配列番号 6は、 2E6抗体の可変領域 (VH)のアミノ酸配列である。
配列番号 7は、 2E6抗体の可変領域 (VL)のアミノ酸配列である。
配列番号 8は、 6G4抗体の VH領域の cDNAを合成するために設計されたオリゴヌタレ ォチドである。
配列番号 9は、 2E6抗体の VH領域の cDNAを合成するために設計されたオリゴヌタレ ォチドである。
配列番号 10は、 6G4抗体及び 2E6抗体の VL領域の cDNAを合成するために設計され たオリゴヌクレオチドである。
配列番号 11は、 6G4抗体の VH領域の遺伝子を増幅するために設計された PCRのプ ライマーである。
配列番号 12は、 2E6抗体の VH領域の遺伝子を増幅するために設計された PCRのプ ライマーである。
配列番号 13は、 6G4抗体及び 2E6抗体の VL領域の遺伝子を増幅するために設計さ れた PCRのプライマーである。
配列番号 14は、実施例で用いたェピトープタグの遺伝子配列である。
配列番号 15は、実施例で用いたレポータ遺伝子の遺伝子配列である。
配列番号 16は、免疫グロブリン H鎖の germ line εプロモーターの IL-4調節エレメント の遺伝子配列である。
配列番号 17は、実施例で用いたチミジンキナーゼプロモーターの遺伝子配列である

Claims

請求の範囲
[1] 転写因子の認識配列と転写開始に必要な塩基配列の下流に、第 1ェピトープ及び 第 2ェピトープを有するェピトープタグをコードする遺伝子を含むレポータ遺伝子を 接続したベクターを有する細胞に、被験物質、第 1ェピトープを認識する検出抗体、 及び第 2ェピトープを認識する検出抗体を接触させ、前記両検出抗体がそれぞれ前 記第 1ェピトープ及び第 2ェピトープに結合し互いに近接することにより生じる現象を 検出し、前記被験物質の転写調節機構に対する作用と関連づける工程を含み、前 記第 1ェピトープ及び第 2ェピトープが、それぞれを認識する検出抗体が結合した場 合に、前記両検出抗体が互いに近接することができるように配置されて 、ることを特 徴とする、レポータ遺伝子アツセィ方法。
[2] 前記細胞に転写因子、リガンド、レセプター及びコアクチベータ一力 なる群力 選 択されるいずれかを発現させることを特徴とする請求項 1記載の方法。
[3] 前記検出抗体がともに蛍光体により標識されたものである請求項 1または 2に記載の 方法。
[4] 前記蛍光体がユーロピウム化合物及びァロフィコシァニン誘導体の組み合わせから なる請求項 3記載の方法。
[5] 転写因子の認識配列と転写開始に必要な塩基配列の下流に、第 1ェピトープ及び 第 2ェピトープを有するェピトープタグをコードする遺伝子を含むレポータ遺伝子を 接続したベクターを有する細胞。
[6] 前記レポータ遺伝子が配列番号 15に示す配列を有するものである請求項 5記載の 細胞。
[7] 請求項 1から 4のいずれかの方法に使用するためのベクター。
[8] 請求項 1から 4のいずれかの方法に使用するためのキット。
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