WO2006098332A1

WO2006098332A1 - 硬組織形成促進剤

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Publication number: WO2006098332A1
Application number: PCT/JP2006/305052
Authority: WO
Inventors: Takashi Takata; Yuji Kaneda
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2005-03-14
Filing date: 2006-03-14
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2007-09-14
Also published as: US20110288048A1; US8604003B2; EP1859803B1; EP1859803A4; JPWO2006098332A1; JP5153324B2; EP1859803A1; US20090012278A1

Abstract

　本発明は、細胞に直接的に作用して、硬組織形成の促進、細胞分化の促進、細胞のアルカリフォスファターゼ活性の増強を惹起させる剤を提供する。具体的には、硫酸基を保持し、かつ、次の（１）及び（２）の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩を有効成分とする、硬組織形成促進剤、細胞の分化誘導剤及び細胞のアルカリフォスファターゼ活性増強剤を提供する；（１）ヘキスロン酸残基とグルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、（２）前記（１）の基本骨格におけるヘキスロン酸残基の２位のヒロドキシル基、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基及びグルコサミン残基の２位のアミノ基のうちいずれか１つ以下の位置には硫酸基を保持していない。なおヘキスロン酸残基は、グルクロン酸残基又はイズロン酸残基であるものが好ましい。

Description

硬組織形成促進剤

技術分野

[0001] 本発明は、グリコサミノダリカン又はその塩を含有する硬組織形成促進剤等に関する。

背景技術

[0002] 本出願の出願書類では、以下の略号を使用する。

ALP：ァノレカリフォスファターゼ (alkaline phosphatase)

a MEM： a最 ,J、必須 ¾·地 (minimum essential medium alpha medium)

BMP一 2：骨誘導因子一 2 (bone morphogenetic protein- 2)

BSP：骨シァロプロテイン (bone sialoprotein)

COLI : I型コラーゲン（type I collagen)

FBS：ゥシ胎仔血清（fetal bovine serum)

GAG：グリコサミノグリカン (glycosaminoglycan)

GlcN：グノレコサミン (glucosamine)

GlcA：グノレクロン酸 (glucuronic acid)

Hep：へノヽジン (heparin)

HexA :へキスロン酸 (hexuronic acid)

HS：へパラン硫酸（heparan sulfate)

IdoA:ィズロン酸 (iduronic acid)

PCR:ポリメフーセ連鎖反 J心 ^polymerase chain reaction)

RT—PCR:逆転写 PCR (reverse transcription PCR)

2DSH : 2— O—脱硫酸化 Hep (2-0-desulfated heparin) (Hepにおける HexA残基の 2位のヒロドキシル基が脱硫酸ィ匕されたもの）

6DSH : 6— 0—脱硫酸化 Hep (6-0-desulfated heparin) (Hepにおける GlcN残基の 6位のヒロドキシル基が脱硫酸ィ匕されたもの）

NDSH : N—脱硫酸化 Hep (N- desulfated heparin) (Hepにおける GlcN残基の 2位のァミノ基が脱硫酸ィ匕されたもの）

[0003] 以下、本発明の背景技術について説明する。

特許文献 1には、 HexA残基と GlcN残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有する GAGを有効成分として含有し、該 GAGが、 2位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されて、な、HexA残基又は 2位ァミノ基がスルファミノ化されてヽなヽ GlcN残基を含むことを特徴とする細胞間連絡亢進剤が記載されてヽる。

[0004] 特許文献 2には、 HexA残基と GlcN残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有する GAGを有効成分として含有し、該 GAGが、 6位ヒドロキシル基が硫酸エステル化されてヽなヽ Glc残基を含むことを特徴とする細胞間連絡抑制剤が記載されている。

[0005] 特許文献 3には、ある種の脱硫酸ィ匕 Hepが開示されており、これを有効成分として含有する塩基性繊維芽細胞増殖因子活性促進剤や、これと塩基性繊維芽細胞増殖因子とを含有する塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性が促進された組成物が開示されて!ヽる。

[0006] 特許文献 4には、分子量が 20Kダルトンカゝら 40Kダルトンである骨誘導活性を有するヒアルロン酸フラクションが開示されている。

[0007] 特許文献 1：特開 2003 - 113090号公報

特許文献 2：特開 2003— 119146号公報

特許文献 3 :国際公開第 96Z01278号パンフレット

特許文献 4:特許第 3333205号公報

[0008] しかし、硫酸基を保持し、 HexA残基と GlcN残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とし、基本骨格における HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6 位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2位のアミノ基のうちいずれ力 1つ以下の位置には硫酸基を保持してヽな、GAG又はその塩それ自体が、直接硬組織形成を促進したり、細胞の分化を促進したり、細胞の ALP活性を増強したりする作用を有することにつ!/ヽては開示も示唆もな!/ヽ。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題 [0009] 本発明は、細胞に直接的に作用して、硬組織形成の促進、細胞分化の促進、細胞の ALP活性の増強を惹起させる剤を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ある種の GAG又はその塩力細胞に直接的に作用して、硬組織形成の促進、細胞分化の促進及び細胞の AL

P活性の増強を惹起させることを見い出し、本発明を完成するに至った。

[0011] すなわち本発明は、硫酸基を保持し、かつ、以下の（1)及び（2)の特性を有する G

AG又はその塩を有効成分とする、硬組織形成剤（以下、「本発明形成促進剤」という

。）を提供する。

(1) HexA残基と GlcN残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。

(2)前記（1)の基本骨格における HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6 位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2位のアミノ基のうちいずれ力 1つ以下の位置には硫酸基を保持していない。

[0012] この HexA残基は、 GlcA残基又は IdoA残基であることが好ましい。また硫酸基を保持し、かつ、前記の特性を有する GAGとして、具体的には Hep、 Hepにおける He xA残基の 2位のヒドロキシル基に硫酸基を保持して!/、な!/、もの、 Hepにおける GlcN 残基の 6位のヒドロキシル基に硫酸基を保持して!/、な!/、もの及び Hepにおける GlcN 残基の 2位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群力選ばれる 1又は 2 以上のものであることが好ましい。また、硬組織は骨であることが好ましい。

[0013] また本発明は、硫酸基を保持し、かつ、以下の（1)及び（2)の特性を有する GAG 又はその塩を有効成分とする、細胞の分化促進剤（以下、「本発明分化促進剤」という。）を提供する。

[0014] この HexA残基は、 GlcA残基又は IdoA残基であることが好ましい。また硫酸基を保持し、かつ、前記の特性を有する GAGとして、具体的には Hep、 Hepにおける He xA残基の 2位のヒドロキシル基に硫酸基を保持して!/、な!/、もの、 Hepにおける GlcN 残基の 6位のヒドロキシル基に硫酸基を保持して!/、な!/、もの及び Hepにおける GlcN 残基の 2位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群力選ばれる 1又は 2 以上のものであることが好ましい。また、細胞は骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞であることが好ましい。

[0015] また本発明は、硫酸基を保持し、かつ、以下の（1)及び（2)の特性を有する GAG 又はその塩を有効成分とする、細胞の ALP活性増強剤 (以下、「本発明活性増強剤」という。）を提供する。

[0016] この HexA残基は、 GlcA残基又は IdoA残基であることが好ましい。また硫酸基を保持し、かつ、前記の特性を有する GAGとして、具体的には Hep、 Hepにおける He xA残基の 2位のヒドロキシル基に硫酸基を保持して!/、な!/、もの、 Hepにおける GlcN 残基の 6位のヒドロキシル基に硫酸基を保持して!/、な!/、もの及び Hepにおける GlcN 残基の 2位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群力選ばれる 1又は 2 以上のものであることが好ましい。また、細胞は骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞であることが好ましい。

[0017] 以下、本発明形成促進剤、本発明分化促進剤及び本発明活性増強剤を、まとめて「本発明の剤」という。

発明の効果

[0018] 本発明の剤は、有効成分である GAGが、硬組織形成、細胞の分化促進又は細胞の ALP活性増強に対して直接的に作用して優れた効果を発揮することから、極めて有用である。

発明を実施するための最良の形態

[0019] 以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。

< 1 >本発明の剤の有効成分本発明の剤は、硫酸基を保持し、かつ、以下の（1)及び（2)の特性を有する GAG 又はその塩を有効成分とする。

[0020] ここで HexA残基は特に限定されないが、 GlcA残基又は IdoA残基であることが好ましい。そのなかでも、 GlcA残基は D— GlcA残基であることが好ましぐ IdoA残基は L IdoA残基であることが好ましい。また、 GlcN残基も特に限定されないが D—G lcN残基であることが好まし、。

また、 GlcN残基のアミノ基はァセチル化されていてもよい。この場合、 GlcN残基の部分は N ァセチルダルコサミン（GlcNAc)となる。

[0021] 本発明の剤の有効成分である GAGは、このような HexA残基と GlcN残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。すなわち、 HexA残基を「a」とし、 GlcN残基を「b」とすると、本発明の剤の有効成分である GAGは、「a—b— a—b 」又は「b— a— b— a 」と、う基本骨格力もなる。なお「―」はグリコシド結合を示す。 aが GlcA残基であるときは、 aと bとの間のグリコシド結合 (a— b)は、 β 1→4結合であることが好ましい。また aが IdoA残基であるときは、 aと bとの間のグリコシド結合 (a— b )は α 1→4結合であることが好ましい。また bと aとの間のグリコシド結合 (b— a)は α 1 →4結合であることが好ま、。

[0022] 本発明の剤の有効成分であるこのような GAGは、硫酸基を保持していることを特徴とする。前記の基本骨格における硫酸基が保持されうる位置は特に限定されないが、 HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2位のアミノ基力選ばれる 1つ以上の位置であることが好ましい。このような位置に硫酸基が保持されている GAGとしては、例えば Hepや HSが例示される。

[0023] ただし、本発明の剤の有効成分とするためには、前記の基本骨格における HexA 残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2 位のアミノ基のうち、いずれか 1つ以下の位置には硫酸基を保持していないことが必要である。したがって、本発明の剤の有効成分としては、例えば Hep (HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2位のアミノ基のいずれにも硫酸基が保持されている）、 2DSH、 6DSH、 NDSH等が例示される。

[0024] なお、 GAGは多糖 (ポリマー）であり、ある GAGの画分中に存在する全ての GAG 分子のサイズ、構成糖の組成や配列、硫酸基の位置、硫酸基の数等が完全に同一であることが実質的にありえないことは、当技術分野の技術常識であることは言うまでもない。また、例えばこのような GAGにおいて「HexA残基の 2位のヒロドキシル基には硫酸基を保持していない」と言った場合、「GAG分子中の全ての HexA残基の 2 位のヒロドキシル基が完全に硫酸基を保持して、な、」 t 、うことを意味するものではなぐ「GAG分子中の大部分の HexA残基の 2位のヒロドキシル基が硫酸基を保持して!、なければ足り、若干の HexA残基の 2位のヒロドキシル基に硫酸基が保持されて V、るものを排除するものではな、」 t 、うことを意味することも、同様に当技術分野の技術常識である。したがって本出願書類におけるこれらの記載も、このような当技術分野における技術常識に従って解釈された、。

[0025] 前記の基本骨格における HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2位のアミノ基のうち、いずれ力 1つ以下の位置には硫酸基を保持して、な、ことが必要である。

[0026] 本発明の剤の有効成分である GAGの由来も特に限定されず、天然物をそのまま用いてもよぐ天然物を化学的手法、酵素的手法その他の手法によって加工したものを用いてもよぐ化学的に合成したものを用いてもょ、。

[0027] 例えば、本発明の剤の有効成分として Hepを用いる場合には、天然物等から公知の方法で取得された Hepをそのまま用いてもよぐ既に医薬品や試薬として販売されている Hepを用いても良い。また、公知の化学的手法、酵素的手法その他の手法によって HSの硫酸ィ匕の度合いを増加させ、 Hepと同程度としたものを用いてもよい。本願の出願書類における「Hep」の用語には、純然たる Hepのみならず、このように He pと実質的に同一の物と認識されるものも包含される。

[0028] また、例えば本発明の剤の有効成分として 2DSH、 6DSH又は NDSHを用いる場合にも、前記の特許文献 1や特許文献 2に記載されている方法によって製造することができる。

[0029] 本発明の剤の有効成分とすることができる GAGのサイズ (重量平均分子量）は、当技術分野における当業者にぉ、て「多糖」として認識されるものである限りにお、て特に限定されないが、例えば重量平均分子量が 5000〜20000程度のものが好ましく、 10000〜15000程度のものカょり好ましぃ。なお重量平均分子量は、 WOOO/ 06608に記載された方法に従って測定することができる。

[0030] また、本発明の剤の有効成分とする GAGの純度も特に限定されず、本発明の剤を適用する場面や目的等に応じて適宜選定することができる。

例えば、生体内の組織や、無菌条件下で培養された細胞等、高度の無菌性や清浄性等が求められる対象に本発明の剤を適用する場合には、高純度に精製され、医学的や培養学的に許容されない物質 (例えばエンドトキシンや微生物等)を実質的に含有しないものを用いることが望ましい。また、それほどの無菌性や清浄性等が求められていない対象に本発明の剤を適用する場合には、その場面や目的に応じて、適宜精製度を低減させてもょヽ。

[0031] また「GAGの塩」についても特に限定されず、本発明の剤を適用する場面や目的等に応じて適宜選定することができる。例えば、生体内の組織に適用する場合には、医学的に許容される塩を選定すればよい。 GAGの塩としては、例えばアルカリ金属塩 (ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニゥム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロへキシルァミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩等が例示される。なかでもナトリウム塩が好ましい。

[0032] 本発明の剤は、 1種類の前記 GAG又はその塩のみを有効成分として含有していてもよぐ複数種類の前記 GAG又はその塩を有効成分として含有して、てもよ、。このような GAG又はその塩を用いることにより、極めて優れた効果を有する本発明形成促進剤、本発明分化促進剤、本発明活性増強剤とすることができる。

[0033] < 2>本発明の剤の剤形等

本発明の剤の剤形等は、前記の GAG又はその塩を含有しており、かっこれによる硬組織形成の促進作用や、細胞の分化促進作用や、細胞の ALP活性増強作用が発揮される限りにおいて特に限定されず、本発明の剤を適用する場面や目的等に応じて適宜選定することができる。

[0034] 例えば本発明の剤を、前記の GAG又はその塩を含有する溶液状態の剤としてもよぐ粉末、顆粒その他の固形剤等としても良い。また、例えば溶液状態の剤として提供する場合には、凍結状態で提供してもよぐ溶液のまま提供してもよぐ用時溶解用の剤等として提供してもよい。

[0035] 本発明の剤中の前記 GAG又はその塩の濃度も特に限定されず、本発明の剤を適用する場面や目的等に応じて適宜選定することができる。

[0036] 本発明の剤の製剤化は、公知の方法により行うことができる。また製剤化にあたり、前記の GAG又はその塩に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の薬物除去成分や、安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、矯味剤、保存剤、 pH調整剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等の他の成分を配合することができる。

[0037] < 3 >本発明の剤の用途、使用方法等

本発明の剤は、硬組織形成の促進剤、細胞の分化促進剤又は細胞の ALP活性増強剤とすることができる。硬組織形成の促進剤 (本発明形成促進剤）とする場合、その「硬組織」は骨であることが好まヽ。なお「硬組織形成の促進」には、石灰化の促進の意義も包含される。また細胞の分化促進剤 (本発明分化促進剤)や細胞の ALP 活性増強剤 (本発明活性増強剤)とする場合、その「細胞」は骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞であることが好ましい。また本発明の剤は、これらの用途の 1つを目的とする 1つの剤としてもよぐこれらの複数の用途を目的とする 1つの剤としてもよい。

[0038] 本発明の剤は、その有効成分である前記の GAG又はその塩の分子と、適用される対象となる生体組織や細胞等が接触する状態となる限りにおヽて、その投与や適用の方法は限定されない。

[0039] 本発明の剤は、例えば硬組織形成の促進や、細胞の分化促進や、細胞の ALP活性増強を目的とする医薬や試薬等として利用することができる。本発明の剤を医薬とする場合、その投与量は、投与の目的 (予防、維持 (悪化防止)、軽減 (症状の改善)または治療)、疾患の種類、患者の症状、性別、年令、体重、投与部位、投与方法等によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人 1人 1回あたり概ね、前記の GAG又はその塩として 0. 03mg/投与部位〜 3mg/投与部位程度を投与することができる。

[0040] 本発明の剤を医薬とする場合、これが投与される動物も特に限定されないが、脊椎動物が好ましぐ哺乳動物がより好ましぐヒトが特に好ましい。この場合、それぞれの用途に応じて、例えば以下のような動物に投与することができる。

[0041] 硬組織形成促進剤として用いる場合には、硬組織の形成の促進が望まれて！/ヽる状態にある動物に対して投与することができる。このような状態としては、例えば骨折、骨欠損、骨粗鬆症等に罹患している場合や、歯科治療、整形外科治療、骨補填等が施された直後の状態等が例示される。

[0042] 細胞の分化促進剤として用いる場合には、細胞の分ィ匕が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。特に、骨髄由来間葉系幹細胞や骨芽細胞等の分ィ匕が望まれている状態にある動物に投与されることが好ましい。このような細胞の分化が望まれている状態の例示は、前記の硬組織形成促進剤における場合と同様である。

[0043] 細胞の ALP活性増強剤として用いる場合には、細胞の ALP活性の増強が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。このような状態の例示は、前記における硬組織形成促進剤や細胞の分化促進剤における場合と同様である。

[0044] 例えば本発明の剤を試薬とする場合、その適用対象も特に限定されないが、例えば生体力採取された組織や培養細胞等を例示することができる。

[0045] また、本発明の剤の有効成分である前記の GAG又はその塩を、適当な不溶性担体の表面に固着させたり、適当な素材と混合したりすることによって、硬組織形成の促進や、細胞の分化の促進や、細胞の ALP活性の増強等を目的とする素材としてもよい。このような不溶性担体 (素材）としては、ビーズ、フィルム、プレート、モノフィラメント、不織布、スポンジ、織物、編物、短繊維、チューブ、中空糸、ノ、イドロキシァパタイト等をはじめとする種々の形状のものを使用できる。具体的には、医用複合材料としてインプラント、骨セメント、骨補填剤、根管充填剤、骨折プレート、人工関節等に用いることができる。また本発明の剤は、再生医療分野における素材として応用することちでさる。

実施例

[0046] 以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。

< 1 >材料

以下に、本実施例で用いた材料を説明する。

1.細胞株

マウス骨髄由来間葉系細胞株である ST2細胞株と、より分ィ匕度の高いマウス骨芽細胞様細胞株である MC3T3-E1細胞株（いずれも RIKEN CELL BANKより入手）を用いた。以下、これらの細胞の培養は全て 37°C、 5% CO条件下で行った。またこれらの

2

細胞の培養に用いる培地には、全て抗生物質 (終濃度 100 U/mlペニシリン G、終濃度 100 g/mlストレプトマイシン及び終濃度 250 g/mlゲンタマイシン）を共存させた。

[0047] 2.被験サンプル

被験サンプルとして以下のものを用いた。サンプルは全て生化学工業株式会社より提供されたものを用いた。なお括弧内の記号は、図 1中に示す記号を意味する。 •重量平均分子量 1万のヒアルロン酸（ヒアルロン酸 1万）

•重量平均分子量 6万のヒアルロン酸（ヒアルロン酸 6万）

•重量平均分子量 35万のヒアルロン酸（ヒアルロン酸 35万）

•重量平均分子量 100万のヒアルロン酸（ヒアルロン酸 100万）

•重量平均分子量 150万のヒアルロン酸（ヒアルロン酸 150万）

•重量平均分子量 250万のヒアルロン酸（ヒアルロン酸 250万）

•Hep

•2DSH

•6DSH

•NDSH

•NSH (Hepにおける GlcN残基の 2位のアミノ基が硫酸化され、 HexA残基の 2位のヒロドキシル基と GlcN残基の 6位のヒドロキシル基には硫酸基を保持しないもの） • 6SH (6— O—硫酸化 Hep； 6-0- sulfated heparin； GlcN残基の 6位のヒドロキシル基が硫酸化され、 HexA残基の 2位のヒロドキシル基と GlcN残基の 2位のアミノ基には硫酸基を保持しないもの）

• 2SH (2-0-硫酸化 Hep； 2-0- sulfated heparin； Hepにおける HexA残基の 2位のヒロドキシル基が硫酸化され、 GlcN残基の 6位のヒドロキシル基と GlcN残基の 2位のァミノ基には硫酸基を保持しな、もの）

• DSH (脱硫酸化 Hep； desulfated heparin； Hepを完全に脱硫酸化したもの）

• NAH (N -ァセチノレへパロザン； N- Acetyl heparosan)

•CDS (デルマタン硫酸； dermatan sulfate)

• 60SCDS (デルマタン硫酸におけるガラクトサミン残基の 6位を硫酸ィ匕したもの） [0048] これらの糖は、全て生化学工業株式会社より入手可能である。 Hepは同社から試薬として販売されているものを用いた。なお 2DSH、 6DSH及び NDSHは、 Hepを原料として、特開 2003— 113090号公報及び特開 2003— 119146号公報に記載された方法に従って製造されたものである。

[0049] ここで用いた Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHを、 WO00/06608に記載された「G AG分解酵素による消化と高速液体クロマトグラフィーとを組み合わせた酵素的二糖分析法」により分析した (表 1)。表中 A DiHS- OSは 2-ァセトアミド- 2-デォキシ- 4-0- (4 -デォキシ- α - L- threo- hex- 4-エノピラノシルゥロン酸)- D-グルコースを、 Δ DiHS- N Sは 2-デォキシ- 2-スルファミノ- 4-0- (4-デォキシ- a - L- threo- hex- 4-エノビラノシルゥロン酸)- D-グルコースを、 Δ DiHS- 6Sは 2-ァセトアミド- 2-デォキシ- 4-0- (4-デォキシ- a -L- threo- hex- 4-エノピラノシルゥロン酸)- 6-0-スルホ -D-グルコースを、 Δ Di HS- USは 2-ァセトアミド- 2-デォキシ- 4-0- (4-デォキシ- 2-0-スルホ- a -L- threo- he x-4-エノピラノシルゥロン酸)- D-グルコースを、 Δ DiHS-di(6,N)Sは 2-デォキシ -2-スルファミノ- 4-0- (4-デォキシ- a -L- threo- hex- 4-エノピラノシルゥロン酸)- 6-0-スルホ- D-グルコースを、 Δ DiHS- di(U,N)Sは 2-デォキシ- 2-スルファミノ- 4-0- (4-デォキシ- 2-0-スルホ- a -L- threo- hex- 4-エノピラノシルゥロン酸)- D-グルコースを、 Δ Di HS- di(U,6)Sは 2-ァセトアミド- 2-デォキシ- 4- 0- (4-デォキシ- 2- 0-スルホ - α - L- thre o- hex- 4-エノピラノシルゥロン酸)- 6-0-スルホ -D-グルコースを、 Δ DiHS- tri(U,6,N)S は 2-デォキシ -2-スルファミノ- 4-0- (4-デォキシ- 2-0-スルホ- α - L-threo- hex-4-ェノビラノシルゥロン酸)- 6-0-スルホ -D-グルコースをそれぞれ示す,

[0050] [表 1]

[0051] またこれらの重量平均分子量を WO00/06608に記載された方法により測定したところ、 Hep力 S 14000、 2DSH力 12000、 6DSH力 12500、 NDSH力 S 11000であった

[0052] 3.その他の試薬

FBSは、 EQUITECH- BIO社製のものを用いた。

[0053] < 2 >方法と結果

1.細胞分化に対する作用（1)

細胞の分ィ匕の指標として、細胞の ALP活性を測定した。 24ゥエルの培養プレートに、 5 X 10³細胞/ゥエルの割合で細胞を播種し、 2% FBSを含有する α MEMに被験サンプルをを終濃度 50 g/mlで添加して培養した。細胞がコンフルェントに達した時点力も 1週間目に以下の酵素化学的方法 (Bessey-Lowry法）によって ALP活性を測定した。

[0054] (ALP活性の測定方法）

培養細胞を PBSで洗浄後、超音波ホモジナイザー（Handy Sonic model UR-20P;トミー工業製)を用いて 10mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.4、 500 1)中で 40秒間細胞を破砕し撹拌した。次いで、このサンプル液 25 1を ALP緩衝液 (0.1M炭酸塩緩衝液 pH 9.8、 6.7mM p—二トロフエ-ルホスフェート、 2mM MgCl ) 125 μ 1に添加し、 37°Cで 30分

2

間インキュベートした. 0.2N NaOHを 125 μ 1を添加することによって反応を終了させた後、マイクロプレートリーダー（Model 550, Bio- Rad Laboratories製）を用いて 405nm における吸光度を測定した。算出された ALP活性は、細胞数あたりの単位 (ユニット）で示した。また被験サンプルを添カ卩しな、ものをコントロールとした。

[0055] MC3T3-E1細胞株に対して各種被験サンプルを添カ卩した結果を図 1に、別途 MC3 T3-E1細胞株に対して被験サンプル（Hep、 2DSH、 6DSH又は NDSH)を添カロした結果を図 2に、 ST2細胞株に対して被験サンプル（Hep、 2DSH、 6DSH又は ND SH)を添カ卩した結果を図 3にそれぞれ示す。

[0056] 図 1及び図 2より、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、いずれも MC3T3- El細胞株の ALP活性を増強させた。なかでも、 Hepは、 MC3T3-E1細胞株の ALP活性の増強に対して特に有効であることが示された。

[0057] また図 3より、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、いずれも ST2細胞株の ALP活性を増強させた。なかでも NDSHは、 ST2細胞株の ALP活性の増強に対して特に有効であることが示された。

[0058] これらの結果から、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、いずれも骨髄由来間葉系細胞及び骨芽細胞の ALP活性を増強させることが示された。このことは、 Hep骨格中にお、て 2位、 6位及び N位力なる群力選択される、ずれか 2つ以上の位置に硫酸基が保持されて、ることが、これらの細胞の ALP活性の増強に必要であることを示すものである。

[0059] なかでも Hepは骨芽細胞の ALP活性を特に効果的に増強させ、 NDSHは骨髄由来間葉系細胞の ALP活性を特に効果的に増強させることが示された。

[0060] 2.細胞分化に対する作用（2)

前記の「細胞分化に対する作用（1)」における培地を、血清を含有しな!、培地 (無血清培地）に換えて同様に ALP活性を測定した。 MC3T3-E1細胞株に対して被験サンプル（Hep、 2DSH、 6DSH又は NDSH)を添カ卩した結果を図 4に、 ST2細胞株に対して被験サンプル（Hep、 2DSH、 6DSH又は NDSH)を添カ卩した結果を図 5にそれぞれ示す。なお算出された ALP活性は、細胞の DNA重量あたりの数値で示した。

[0061] 図 4より、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、いずれも無血清条件下で MC3T3- E1細胞株の ALP活性を増強させた。なかでも、 Hep、 2DSH及び NDSHは、 MC3T3 -E1細胞株の ALP活性の増強に対して特に有効であることが示された。

また図 5より、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、いずれも無血清条件下で ST2 細胞株の ALP活性を増強させた。なかでも 2DSHは、 ST2細胞株の ALP活性の増強に対して特に有効であることが示された。

[0062] これらの結果から、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、いずれも無血清条件下で骨髄由来間葉系細胞及び骨芽細胞の ALP活性を増強させることが示された。このことは、 Hep骨格中において 2位、 6位及び N位からなる群から選択されるいずれ力 2 つ以上の位置に硫酸基が保持されている Hepは、血清中に含まれる種々の因子を介さずに直接これらの細胞に作用して、 ALP活性を増強させる作用を有していることを示すものである。

[0063] なかでも Hep、 2DSH及び NDSHは骨芽細胞の ALP活性を特に効果的に増強させ、 2DSHは骨髄由来間葉系細胞の ALP活性を特に効果的に増強させることが示された。

[0064] 3.細胞分化に対する作用（3)

前記の「細胞分化に対する作用（1)」において、被験サンプルの添加後 1週間目及び 2週間目にそれぞれ細胞を回収して全 RNAを抽出し、 COLI、 ALP、ォステオカルシン（osteocalcin)、： BSP、及び BMP— 2のmRNAの発現をRT—PCRで解析した。

[0065] その結果、 ST2細胞株では、 RT-PCRによる解析によっても ALP mRNAの高、誘導が確認された。 MC3T3- E1細胞株では、 ALPに加えて COLI及び BSP mRNAの発現の誘導も観察された。

[0066] 4.細胞分化に対する作用（4)

細胞の石灰化能を検討するため、前記の「細胞分化に対する作用（1)」において、細胞がコンフルェントに達した時点から 1週間目に、常法に従ってァリザリン染色 (AL Z staining;赤く染色されるほど石灰化が促進されている）を行った。細胞を PBSで洗浄後、 10中性緩衝ホルマリンにて固定し、 0.01ァリザリンレッド S (和光純薬）にて染色した。

[0067] その結果、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、 ST2細胞株及び MC3T3-E1細胞株のいずれに対しても石灰化物の形成を促進した。特に ST2細胞株では、 Hep, 2D SH及び NDSHが強!、促進を示した。

[0068] 5.細胞分化に対する作用（5) 8週齢の Wistar系ラットを、体重 100g当たり 0.5ml量の力ルバミル酸ェチル 20溶液で全身麻酔した後、前頭部の皮膚及び骨膜を切開し、頭蓋骨膜下に、 PBSで濃度 3 mg/mlに希釈した被験サンプル（Hep、 2DSH、 6DSH又は NDSH ;それぞれ 100 1)を移植した。その際、ハイドロキシアパタイトを担体として用いた。

[0069] 具体的には、濃度 3mg/mlの被験サンプルにハイドロキシアパタイトのブロック（サイズ：縦 3mm X横 2mm x高さ 2mm;約 0.1mlの溶液を吸収する）を 30分間浸し、これを移植に用いた。

被験サンプルを含有しな、PBSを用いたものをコントロールとした。

[0070] 被験サンプルの移植後 4週間目と 8週間目に屠殺して、移植部分の切片を作成し、へマトキシリンーェォシン染色 (HE染色）して光学顕微鏡で観察することにより、硬組織 (骨)の形成の程度を評価した。

[0071] その結果、コントロール群では血管や線維性結合組織のみが観察され、骨形成は観察されなかった。一方、 Hep群、 2DSH群、 6DSH群又は NDSH群では、いずれも骨形成が観察された。なかでも 2DSH群では、顕著な骨の形成が認められた。

[0072] 6.細胞分化に対する作用（6)

前記の「5.細胞分化に対する作用（5)」と同様に被験サンプルを移植後、 4週間目と 6週間目に屠殺して、移植部分の切片を作成した (各群とも n= 2)。当該切片の画像中に観察されるハイドロキシアパタイト領域の面積に対する、形成された骨 (硬組織）の面積の割合を画像解析ソフト（Scion image; Scion Corporation)を用いて解析した。結果を図 6に示す。なお図 6中の灰色の棒は 4週間目における結果を、黒色の棒は 6週間目における結果をそれぞれ示す。

[0073] 図 6より、 Hep群、 2DSH群、 6DSH群又は NDSH群では、 4週間目及び 6週間目ともに広い範囲で骨 (硬組織）の形成が認められた力、コントロール群においてはほとんど認められないことが示された。なかでも、 2DSHと NDSHにおいてその効果が顕著であった。

[0074] 7.細胞分化に対する作用（7)

前記の「5.細胞分化に対する作用（5)」と同様に被験サンプルを移植後、 4週間目、 8週間目及び 12週間目に屠殺して、移植部分の切片を作成した (各群とも n= 5)。移植領域の切片画像中に観察される全組織の面積に対する、骨組織の面積の割合を、画像解析ソフト（Scion image ; Scion Corporation)を用いて解析した。結果を図 7 に示す。なお図 7中の各週における棒は、いずれも左からコントロール群、 2DSH群、 6DSH群、 NDSH群、 Hep群における結果をそれぞれ示す。

[0075] 図 7より、 Hep群、 2DSH群、 6DSH群又は NDSH群では、 4週間目、 8週間目及び 12週間目の、ずれにお、ても広、範囲で骨 (硬組織）の形成が認められた力コントロール群においてはほとんど認められないことが示された。なかでも、 2DSH、 He p及び NDSHにおいてその効果が顕著であった。これらの結果は、別個独立に行つた「5.細胞分ィ匕に対する作用（5)」及び「6.細胞分ィ匕に対する作用（6)」の結果とも整合することから、再現性あるものであることが示された。

[0076] 8.細胞増殖に対する作用

24ゥエルの培養プレート（FALCON社製）に、細胞を 5 X 10³細胞/ゥエルの割合で播種した。播種後 1日目力ら、被験サンプル（Hep、 2DSH、 6DSH又は NDSH)を終濃度 50 g/mlで培養液 (2% FBSを含有する α ΜΕΜ)に添加した。被験サンプルを添カロして力ら 0日目、 1日目、 3日目及び 6日目に、コーノレターカウンター (COULT ER Zl, Coulter Electronics社製）を用いて細胞数を計測した。被験サンプルを添カロしないものをコントロールとした。 MC3T3-E1細胞株の結果を図 8に、 ST2細胞株の結果を図 9に示す。図 8及び図 9における横軸は被験サンプル添加後の日数を、縦軸は細胞数を示す。

[0077] 図 8より、いずれの被験サンプルも MC3T3-E1細胞株の増殖を抑制した力 2DSH 、 6DSH及び NDSHの増殖抑制効果は、いずれも Hepに比して小さかった。また図 9より、 2DSHは ST2細胞株の増殖を促進した力 Hepは逆に抑制した。

[0078] この結果から、 2DSHは、骨髄由来間葉系細胞の増殖を促進する効果を発揮することが示された。また、 Hepは骨髄由来間葉系細胞の増殖を抑制する効果を発揮することが示された。

[0079] また Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHのいずれも、骨芽細胞の増殖を抑制する効果を発揮することが示された。

[0080] 以上の結果を総合的に勘案すると、 2DSH及び NDSHは、骨髄由来間葉系細胞や骨芽細胞における ALP活性の増加や、骨 (硬組織)の形成に対して特に有効であることが示された。

[0081] 9.製剤例

以下に本発明薬剤の製剤例を示すが、これらはあくまで例示であり、本発明薬剤の剤形がこれらに限定されるものではない。

[0082] (1)軟膏剤

Hep 1 Omg

モノステアリン酸ソルビタン 7mg

モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン 7mg

パルミチン酸イソプロピル 37mg

ワセリン 37mg

流動パラフィン 37mg

セタノーノレ 50mg

グリセリン 70mg

ステアリン酸マグネシウム 2mg

上記成分に精製水を加えて、 lgのクリームとした。

[0083] (2)錠剤

2DSH lOOmg

乳糖 670mg

バレイショデンプン 150mg

結晶セ /レロース 60mg

軽質無水ケィ酸 50mg

上記成分を混合し、ヒドロキシプロピルセルロースを 30mgをメタノールに溶解した溶液（ヒドロキシプロピルセルロース 10重量⁰ /₀)をカ卩えて混練したのち造粒した。これを径 0. 8mmのスクリーンで押し出して顆粒状にし、乾燥した後、ステアリン酸マグネシゥム 15mgを加え 200mgづっ打錠して錠剤を得た。

[0084] (3)カプセル剤

6DSH lOOmg 乳糖 80mg

上記成分を均一に混合し、硬カプセルに充填してカプセル剤を得た。

[0085] (4)注射剤

NDSH 30mg

上記成分を 5%マン-トール水溶液 2mLに溶解し、これを無菌濾過した後、アンプルに入れて密封した。

[0086] (5)用時溶解用注射剤

(A) 2DSH (凍結乾燥体） 30mg (アンプル封入した）

(B)無菌濾過した PBS 2mL (アンプル封入した）

上記 (A)および (B)を 1セットとして、用時溶解用注射剤を製造した。使用時には (A) を (B)で溶解して用いることができる。

[0087] なお本発明の剤の有効成分は、前記の薬効薬理試験において細胞や動物の状態を毎日観察したが、特段の変化は認められな力つた。これらのことから、本発明の剤の安全性が十分に推定される。

[0088] 本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。

本出願は、 2005年 3月 14日出願の日本特許出願（特願 2005-071023)及び 2005年 6月 16日出願の日本特許出願（特願 2005-176311)に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

産業上の利用可能性

[0089] 本発明の剤は、硬組織形成の促進や、細胞の分化促進や、細胞の ALP活性増強などを目的とする医薬や試薬などとして利用することができる。

図面の簡単な説明

[0090] [図 1]MC3T3-E1細胞における ALP活性の増強を示す図である。

[図 2]MC3T3-E1細胞における ALP活性の増強を示す図である。

[図 3]ST2細胞における ALP活性の増強を示す図である。 [図 4]無血清条件下での、 MC3T3-E1細胞における ALP活性の増強を示す図である

[図 5]無血清条件下での、 ST2細胞における ALP活性の増強を示す図である。圆 6]骨 (硬組織)が形成された部分の面積の割合を示す図である。

[図 7]骨 (硬組織)が形成された部分の面積の割合を示す図である。

[図 8]MC3T3-E1細胞の増殖に対する影響を示す図である。

圆 9]ST2細胞の増殖に対する影響を示す図である。

Claims

請求の範囲 [1] 硫酸基を保持し、かつ、以下の（1)及び（2)の特性を有するグリコサミノダリカン又はその塩を有効成分とする、硬組織形成促進剤。

(1)へキスロン酸残基とダルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。

(2)前記（1)の基本骨格におけるへキスロン酸残基の 2位のヒロドキシル基、ダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基及びダルコサミン残基の 2位のアミノ基のうちいずれ力 1つ以下の位置には硫酸基を保持してヽな、。

[2] へキスロン酸残基が、グルクロン酸残基又はィズロン酸残基である、請求項 1に記載の硬組織形成促進剤。

[3] 硫酸基を保持し、かつ、前記（1)及び（2)の特性を有するグリコサミノダリカンが、へノ《リン、へパリンにおけるへキスロン酸残基の 2位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの、へパリンにおけるダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの及びへパリンにおけるダルコサミン残基の 2位のアミノ基に硫酸基を保持していないもの力もなる群力も選ばれる 1又は 2以上のものである、請求項 1 又は 2に記載の硬組織形成促進剤。

[4] 硬組織が、骨である、請求項 1〜3の!ヽずれか 1項に記載の硬組織形成促進剤。

[5] 硫酸基を保持し、かつ、以下の（1)及び（2)の特性を有するグリコサミノダリカン又はその塩を有効成分とする、細胞の分化促進剤。

[6] へキスロン酸残基が、グルクロン酸残基又はィズロン酸残基である、請求項 5に記載の分化促進剤。

[7] 硫酸基を保持し、かつ、前記（1)及び（2)の特性を有するグリコサミノダリカンが、へノ《リン、へパリンにおけるへキスロン酸残基の 2位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの、へパリンにおけるダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの及びへパリンにおけるダルコサミン残基の 2位のアミノ基に硫酸基を保持していないもの力もなる群力も選ばれる 1又は 2以上のものである、請求項 5 又は 6に記載の分化促進剤。

[8] 細胞が、骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞である、請求項 5〜7のいずれか 1項に記載の分化促進剤。

[9] 硫酸基を保持し、かつ、以下の（1)及び（2)の特性を有するグリコサミノダリカン又はその塩を有効成分とする、細胞のアルカリフォスファターゼ活性増強剤。

[10] へキスロン酸残基が、グルクロン酸残基又はィズロン酸残基である、請求項 9に記載のアルカリフォスファターゼ活性増強剤。

[11] 硫酸基を保持し、かつ、前記（1)及び（2)の特性を有するグリコサミノダリカンが、へノ《リン、へパリンにおけるへキスロン酸残基の 2位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの、へパリンにおけるダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基に硫酸基を保持していないもの及びへパリンにおけるダルコサミン残基の 2位のアミノ基に硫酸基を保持していないもの力もなる群力も選ばれる 1又は 2以上のものである、請求項 9 又は 10に記載のアルカリフォスファターゼ活性増強剤。

[12] 細胞が、骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞である、請求項 9〜11のいずれか 1項に記載のアルカリフォスファターゼ活性増強剤。

[13] 硫酸基を保持し、かつ、以下の（1)及び（2)の特性を有するグリコサミノダリカン又はその塩の、硬組織形成促進剤の製造のための使用。

[14] 硫酸基を保持し、かつ、以下の（1)及び（2)の特性を有するグリコサミノダリカン又はその塩の、細胞の分化促進剤の製造のための使用。

[15] 硫酸基を保持し、かつ、以下の（1)及び（2)の特性を有するグリコサミノダリカン又はその塩の、細胞のアルカリフォスファターゼ活性増強剤の製造のための使用。