WO2006115026A1 - ヒューマニン受容体又はヒュ－マニン様ポリペプチド受容体 - Google Patents

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human
cntf
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Masaaki Matsuoka
Ikuo Nishimoto
Sadakazu Aiso
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Japan Science and Technology Agency
Keio University
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Japan Science and Technology Agency
Keio University
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    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • Humanin receptor or humanin-like polypeptide receptor are Humanin receptor or humanin-like polypeptide receptor
  • the present invention relates to a humane receptor or humane-like polypeptide receptor (hereinafter sometimes collectively referred to as "HNR"), a transformed cell in which the receptor is forcibly expressed, the receptor
  • HNR humane receptor or humane-like polypeptide receptor
  • the present invention relates to a method for screening a compound that binds to a body, a pharmaceutical composition containing the compound, and the like. Note that this application claims priority based on Japanese Patent Application 2005-124394 filed on April 22, 2005 and Japanese Patent Application 2005-255972 filed on September 5, 2005. The contents of which are incorporated herein by reference and are considered part of the disclosure.
  • AD Alzheimer's disease
  • a ⁇ s amyloid beta precursor
  • Familial AD has been found to be caused by missense mutations in three genes, APP, precerin-1 (PS1), precerin-2 (PS2) (Shastry and Ginlin, 19 99). It is unclear how these mutant genes contribute to neuronal loss in the FAD brain in vivo, but several groups have been found in cultured cells (Yamatsuji et al., 1996a, b; Wolozin et al., 1996 Zhao et al., 1997; Nishimura et al., 1998; Luo et al., 1999; Hashimoto et al., 2000) or primary cultured cortical nerve (PCN) (Niikura et al, 2004) It was proved that the expression of PS gene mutant causes neuronal cell death.
  • PCN primary cultured cortical nerve
  • the present inventor has proposed a functional screening method that does not bias a compound that prevents cell death using a cDNA library prepared by occipital lobe in an autopsy brain after death of an AD patient.
  • a cDNA encoding the 24-amino acid peptide MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA named “Heumannin (HN)” was identified (Patent Document 1).
  • HN antagonizes neuronal cell death caused by various FAD genes, anti-APP antibodies, and all AD-related injuries such as beta amyloid peptide (A
  • HN is a type of neuronal and non-neural cell death, such as cell death for PC12 (Kariya et al., 2002) and lymphocytes (Kariya et al., 2003) in serum-free medium, and humans caused by AD. Subsequent studies have shown that it also antagonizes cerebrovascular smooth muscle cell toxicity (Jung et al, 2003) and neurotoxicity by prion-derived peptides (Sponne et al, 2004).
  • HN is secreted intracellularly and exerts an antagonistic effect on neuronal cell death caused by AD-related injury via a receptor on the extracellular force cell surface (Hashi moto et al., 2001a; Nishimoto et al., 2004).
  • HN binds to a PC 12 cell line and binds human formyl peptide receptor uniform-1 (FPRL-1), a PTX-sensitive G protein-coupled receptor, as a receptor.
  • FPRL-1 human formyl peptide receptor uniform-1
  • ⁇ antagonizes neuronal cell death caused by ⁇ (1-42).
  • ⁇ antagonizes ⁇
  • FPRL-1 is involved in the neuroprotective action against HN-mediated AD-related injury, the Fl 1 neurohybrid cell line or primary cultured cortical nerve (PCN) In this system, FPRL-1 is involved in the neuroprotective action mediated by HN, and there are receptors other than FPRL-1 in the system. It was pointed out that it exerts a neuroprotective action.
  • gpl30 is a site force-in receptor subunit shared by the interleukin 6 (IL-6) receptor family. Receptors containing gpl30 are stimulated by type 1 site force-in, including IL-6, IL-11, LIF, CNTF, oncostatin M (OSM), cardioto-fin 1 and IL-27. The binding of these site force-in receptors induces homodimerization of gpl30 or heterodimerization with gpl30-related receptors such as LIF receptor, OSM receptor, and WSX-1 (IL27 receptor).
  • IL-27 (IL-27p28 / EBV-inducible gene 3) belonging to IL-6 / IL-12-site in-family binds to WSX-lZgpl30 (Roo et al., 2004) to induce Thl and Th2 immune responses. Control was shown (Yoshida et a 1., 2004).
  • CNTF-R is a gpl30-related receptor that does not have its intracellular signal domain.
  • Patent Document 1 Tokurei WO01 / 021787 Polypeptide that suppresses neuronal cell death
  • Patent Document 2 WO03 / 097687 Neuroprotective Polypeptides and Methods of Use Disclosure of Invention
  • the object of the present invention is to search for a receptor based on information on the HN signal pathway and to find a human receptor or a human-like polypeptide receptor (HNR).
  • HNR human-like polypeptide receptor
  • the present invention relates to the following aspects.
  • CNTF-R CNTF receptor ⁇ chain
  • HNR humane-like polypeptide receptor
  • a human manine receptor or humanin-like polypeptide receptor composed of gpl30 or a partial polypeptide thereof, CNTF-R and WSX-1.
  • a human or human polypeptide-like receptor comprising gp130 or a partial polypeptide thereof and WSX-1.
  • Partial polypeptide power of gpl30 The humanin receptor or humanin-like polypeptide receptor according to any one of the above 1 to 3, having at least the 1-133th amino acid sequence of the intracellular domain.
  • [7] A method for screening for a compound that binds to the humane receptor or humane-like polypeptide receptor according to any one of 1 to 6 above.
  • a compound that binds to a eueumannin receptor or a eueumannin-like polypeptide receptor [8] A compound that binds to a eueumannin receptor or a eueumannin-like polypeptide receptor
  • a compound that binds to a eueumannin receptor or a eueumannin-like polypeptide receptor [9] A compound that binds to a eueumannin receptor or a eueumannin-like polypeptide receptor
  • test sample as described in 12 above, wherein the test sample is contacted with the eueumannin receptor or eueumannin-like polypeptide receptor or at least one protein constituting the eueumannin or eueumannin-like polypeptide in the presence of eueumannin or eueumannin-like polypeptide. Screening method.
  • the eumannin receptor or eumannin-like polypeptide receptor is forcibly expressed in a cell transformed with an expression vector comprising a gene encoding at least one protein constituting the receptor. 14.
  • a pharmaceutical composition which is a neuronal cell death inhibitor comprising as an active ingredient a compound that binds to the above-mentioned 1-6, or a human binding receptor or a human binding-like polypeptide receptor according to any one of the above.
  • a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of a disease associated with neurodegeneration comprising as an active ingredient a compound that binds to the above-described 1 to 6! .
  • a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of Alzheimer's disease comprising as an active ingredient a compound that binds to the above-mentioned 1 to 6 !, a human binding receptor or a human binding like polypeptide receptor.
  • a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of mad cow disease comprising as an active ingredient a compound that binds to the human drug receptor or the human drug-like polypeptide receptor described in any one of 1 to 6 above.
  • a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of vascular dementia comprising as an active ingredient a compound that binds to the human receptor or human-like polypeptide receptor according to any one of 1 to 6 above.
  • the structure of a humane receptor or humane-like polypeptide receptor is clarified, and a method for screening a compound that binds to the receptor, a pharmaceutical composition containing the compound, and the like are provided. Became possible.
  • FIG. 1 i) Neurohybrid strain F11 cells were treated with pcDNA3 vector or pcDNA3- V642I- The vector (0.5 ⁇ g) and the pCAG vector, pCAG-wild type mouse gpl30 (mgpl30wt) or pCAG-mouse gpl30 extracellular domain (mgpl30tr) (0.5 g) were transfected. It is a graph which shows the cell viability calculated
  • 8 is a graph showing the cell viability determined by WST-8 Atsey (top) and force lucein fluorescence method (bottom) 72 hours after the start of treatment.
  • 8 is a graph showing cell viability (left) determined by force lucein fluorescence method (left) and cell mortality (right) determined by LDH atsey 72 hours after the start of treatment.
  • FIG. 2 is a graph showing cell mortality (left) and cell viability (right) determined by Trypan Blue exclusion assay and WST-8 assay after 72 hours of transfection. The result (photograph) of confirming the expression of V642I-APP and human gpl30wt by immunoplotting is also shown.
  • FIG.2 A) F11 cells were fused with pcDNA3 vector or pcDNA3- ⁇ (0.5 ⁇ g) and pEFBos vector or human GCSF receptor extracellular domain into gp130 with the C-terminal of the membrane domain and intracellular domain truncated.
  • the pEFBos vector (0.5 ⁇ g) encoding the chimera (expressed as G-CSFR / gpl30) was transfected.
  • the results (photographs) of the expression of each chimeric protein confirmed by immunoplot after 48 hours are shown.
  • RNA was extracted from the cells, and IL-6R and LIFR mRNA levels were quantified by reaH: ime PCR. As an internal control, the amount of G3PDH mRNA was quantified and corrected. Moreover, the change of each protein was quantified by the immunoplot method.
  • FIG. 4 A) F11 cells were treated with pEF-Bos, pEF--mycHis CREME9, pEF--mycHis human WSX-1 or pEF—V5—human CNTF—R (0.5 g) and pCAG—human gpl30 (0.5 g) was transfected or pEF—mycHis human WSX-1, pEF—V5 human CNTF—R and pCAG human gpl30 (0.5 ⁇ g) were transfected. In order to maintain the total amount of the accessory vector at 1.5 g, an appropriate amount of pEF-Bos vector was added. FIG.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of an assay obtained by detecting the immunofluorescence reaction of the amount of binding between piotin-labeled HN and each transfected cell. Below, the expression of each protein was shown by immunoplot (photo).
  • On the right is a photograph of the fluorescence signal detected with a laser scanning confocal microscope LSM (Carl Seiss, Germany).
  • FIG. 5 Graph showing the results of knocking down expression of these proteins in the F11 cell line using plasmid siRNA method to confirm the involvement of CNTF-R and WSX-1 in HN-mediated neuroprotective signals It is.
  • N O p11U6.1 / Shuttle vector
  • W pRNAU6.1 / Shuttle—siWSX—1 vector
  • C pRNAU6.1 / Shuttle—siCNTF—R vector
  • FIG. 6 A) Transfection of pFEBos vector or pEF-mycHis-human WSX-1, or / and pEF-V5-human CNTF-R (0.5 g each, total volume 1. O / zg) into COS7 cells. 72 hours later, co-immunoprecipitation experiments were conducted with anti-myc antibody (against myc-WSX-1) or anti-mouse and human CNTF-R antibodies. It is a photograph which shows the result of having processed the immunoprecipitate on the immunoplot.
  • FIG. 7 0.5 ⁇ g of pcDNA3 vector or pcDNA3-V642I-APP was introduced into F11 cells, and 5 hours later, 10 nM HNG or 10 / z M HN or human IL-27 at the concentration shown in the figure was applied. In some experiments, IL-27 or IL-6 at the concentrations shown in the figure were administered simultaneously with HNG. 72 hours after administration, WST-8 assembly was performed. F11 cells indicated by numbers were simultaneously checked for V642I-APP expression. Below, the expression of V642I-APP is shown by immunoblot (Photo).
  • FIG. 8 A) F11 cells are seeded in 96-well plates (7x10 3 cells / well) coated with poly-L-lysine and labeled with biotin-HN or biotin-HNG at the concentration shown in the figure. A binding assay (2) based on immunofluorescence was performed in the absence or presence of HNG or HNA (left panel). In the right panel, F11 cells were transfected with 0.5 g of pcDNA3.1 / GS-human CNTF-R, pEFl / MycHis-human WSX-1, and 1.0 g of pCAG-human gpl30 for 24 hours.
  • FIG. 10 A) Results of immunoplot using mWSX-1-C antibody using extract of F11 cells (lane 1). Simultaneously, using 10 times the amount of extract, mWSX-1-C antibody By immunoprecipitation -Photos showing the results of immunoblotting (lane 3) and the results of pseudoimmunoprecipitation with preimmune serum (lane 2) as a negative control.
  • FIG. 11 A) An antibody that recognizes the 706th phosphorylated tyrosine of STAT3 and an antibody that recognizes STAT3 after collecting F11 cells with the concentrations of HN, HNG, and HNA shown in the diagram and harvesting them after 15 minutes. It is a photograph which shows the result of having performed the immune plot by.
  • FIG. 12 A) Transfer 1 g of pRNA-U6.1 / Shuttle vector or pRNA-U6.1 / Shuttle-Bax to F11 cells plated with 7xl0 4 wells per 6-well plate 72 hours later The mRNA expression of mouse Bax was quantified by reaH: ime PCR. G3PDH mRNA was measured and corrected as an internal control. B) Seven or four 7xl0 per well of 6-well plate F11 cells plated with 0.5 or 1 ⁇ g of pRNA-U6.1 / Shuttle vector or pRNA-U6.1 / Shuttle-Bax, 72 hours later Bax protein expression was verified by immunoplot.
  • the humanin-like polypeptide receptor is at least two selected from the group consisting of gpl30 or a partial polypeptide thereof, CNTF receptor ex-chain (CNTF-R) and WSX-1 It contains the protein of. Therefore, specific examples thereof include, for example, a receptor composed of three kinds of proteins, gp130 or a partial polypeptide thereof, CNTF-R and WSX-1, 2 of gp130 or a partial polypeptide thereof and WSX-1 Examples include receptors composed of various types of proteins, and receptors composed of two types of proteins: ⁇ [ ⁇ -1 ⁇ and 1 ⁇ 3-1. Furthermore, as long as the function as the receptor of the present invention is not impaired, in addition to these proteins, other proteins can be included as components.
  • each subunit such as gp130 or a partial polypeptide thereof, CNTF-R and WSX-1 constituting a humanin-like polypeptide receptor substantially has a function as a subunit constituting HNR.
  • one or more amino acids may be modified to include substitutions, deletions, insertions, and Z or added amino acid sequences. These can be prepared by any method known to those skilled in the art.
  • the term “hyumanin-like polypeptide” refers to an AD-related injury equal to or higher than that of the above-mentioned polypeptide (hyumanin) having 24 amino acid strength disclosed in WO01 / 021787 pamphlet. It includes polypeptides and derivatives thereof that have antagonistic or inhibitory effects on the neuronal cell death that occurs.
  • the term “eueumannin-like polypeptide (receptor)” simply includes “eueumannin (receptor)” itself.
  • humanoid-like polypeptides include, for example, International Publication WO01 / 0 Formula (I) described in the 21787 pamphlet
  • CysZbXaa is Cys or basic amino acid
  • (LeuZArg) is Leu or Ar g
  • (GlyZSer) is Gly or Ser
  • Xn, Xn, and Xn are each independently
  • SEQ ID NOs: 5 to 8, 10, 12, 13, 21 to 24, 26 to 29, 32, 33, 37 to 37 described in International Publication WO01 / 021787 Pamphlet A neuron caused by AD-related injury comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added in an amino acid sequence selected from the group consisting of 40, 46, 48, 54 and 60 Mention may be made of polypeptides having an antagonistic or inhibitory effect on cell death.
  • the polypeptide of the present invention includes various derivatives.
  • the “derivative” means a compound having a form in which the functional group of the polypeptide of the present invention is modified by a known method by modification, addition, mutation, substitution, or deletion.
  • modification of the functional group can be performed using any method known to those skilled in the art, for example, protection of the functional group present in the polypeptide, control of polypeptide stability or tissue migration, or activity of the polypeptide. This can be done for the purpose of controlling the above.
  • the polypeptide may be naturally modified by post-translational modification or the like. It may also be artificially modified. Modifications include modifications such as peptide backbone, amino acid side chain, amino terminus, or carboxyl terminus.
  • the polypeptide may be branched or cyclic.
  • Modifications include acetylation, acylation, ADP ribosylation, amidation, covalent bonds such as [flavin, nucleotides, nucleotide derivatives, lipids, lipid derivatives, or phosphatidylinositol], cross-linking, cyclic , Disulfide bond formation, demethylation, pyroglutamine oxidation, carboxylation, glycosylation, hydroxylation, odolation, methylation, myristoylation, oxidation, phosphorylation, ubiquitin, etc. Not limited.
  • the polypeptide may be any It is also possible to form salts and esters.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by a known peptide synthesis technique, and can also be produced by expressing DNA encoding these polypeptides.
  • “having an antagonism or an inhibitory action against nerve cell death caused by AD-related injury” means to antagonize or inhibit at least one of the above-mentioned nerve cell deaths associated with AD. Point to. That is, the above-mentioned humanin-like polypeptides include those having the activity of suppressing at least one of these neuronal cell deaths related to AD. Even if the suppression of cell death is not complete suppression, it may be suppressed significantly.
  • the inhibitory activity of neuronal cell death can be assayed according to the method described in the following examples or other methods (for example, see International Publication No. WO00Z14204).
  • the screening method of the present invention can identify a compound that binds to a humanin-like polypeptide receptor.
  • the compound may be a substance originally contained in a living body such as a human or an artificially synthesized substance.
  • the compound may bind to any portion of a humanin-like polypeptide receptor, such as the extracellular domain or the intracellular domain. Further, the compound can be the receptor antagonist or the receptor antagonist.
  • the screening method of the present invention can be carried out by any method known to those skilled in the art.
  • it can be carried out in a cell-based system or a cell-free system.
  • a cell-based system is a system that uses a cell itself that expresses a humanin-like polypeptide receptor.
  • the protein constituting the humanin-like polypeptide receptor has been elucidated for the first time in the present invention, the cell in which the humanin-like polypeptide receptor is forcibly expressed based on the knowledge is known to those skilled in the art. It can be produced by any method.
  • the screening method of the present invention can be carried out, for example, in the following steps.
  • the binding characteristics of the compound can be determined by utilizing a competitive reaction with the eueumannin or eueumannin-like polypeptide.
  • the binding properties of the compound can be measured.
  • the contact between the receptor and the test sample in the above step (a) is such that the test sample is added to the culture system of cells expressing the receptor. This can be done by contacting the cells with the test sample by any means known to those skilled in the art.
  • the binding property between the receptor and the compound is detected by detecting an antagonistic action or an inhibitory action against nerve cell death (enhancement, reduction, inhibition, etc. of the inhibitory action). Can be measured.
  • the human eumanin or the human eumannin-like polypeptide enhances the phosphorylation of the 706th tyrosine of SATAT3, so that the binding property between the receptor and the compound is improved. It can also be measured by detecting the enhancement or suppression of phosphorylation of the 706th tyrosine of SATAT3.
  • the expression vector can be easily prepared by any method known to those skilled in the art.
  • a gene encoding at least one protein that constitutes a humanin-like polypeptide receptor can be easily prepared based on the description of WO 01/021787 pamphlet and other known documents.
  • the expression vector includes 5 ′ and 3 ′ non-coding sequences (non-transcribed sequences, non-translated sequences, promoters, enhancers, suppressors, transcription factor binding sequences, splicing sequences, polysequencing sequences, A additional sequence, IRES, mRNA stabilization (including unstable sequences) may be included.
  • Host cells used in the screening method of the present invention are not particularly limited, and cells or individuals such as mammalian cells including humans and monkeys, plant cells, and insect cells can be used.
  • Host-vector systems include, for example, the baculovirus-Sf cell system (O kamoto et al., J. Biol. Chem. 270: 4205-4208, 1995), pcDNA—CHO cell line (Takahashi et al., J. Biol. Chem. 270: 19041-19045, 1995), and CMV promoter Plasmid-COS cell line (Yamatsuji et al., EMBO J. 15:49 8-509, 1996). These cells can be cultured under any conditions known to those skilled in the art.
  • a host cell itself originally expresses HNR.
  • a tissue or cell that is originally expected to express the receptor such as a brain cortex tissue, a neuronal cell line, or a neuroblastoma or teratoma cell.
  • Examples of neuronal cell lines include F11 cells, PC12 cells (LA Greene and AS Tischler, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73: 2424-2428), NTERA2 cells (J. Skowronski and MF Singer, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6050-6054), SH-SY5Y cells (L.
  • the screening method of the present invention can be carried out in a cell-free system.
  • a cell-free screening method any means known to those skilled in the art can be used.
  • the receptor of the present invention or at least one protein constituting the receptor can be used for screening in a soluble state or in a form bound to a carrier, depending on the screening method.
  • the receptor of the present invention may be labeled. Examples of the label include a label with a radioactive isotope, a label with a fluorescent substance, a label with piotin or digoxigenin, and an addition of a tag sequence.
  • the test sample is placed on the affinity column on which the HNR of the present invention or at least one protein constituting it is immobilized, and the compound that specifically binds to the column is purified to bind to it.
  • Compound screening can be performed.
  • a synthetic compound, a natural product bank, or a random phage peptide display library may be allowed to act on the immobilized receptor of the present invention or at least one protein constituting the receptor to screen for a molecule to be bound. It is done.
  • the surface Screening by detecting binding using the plasmon resonance phenomenon is also possible (for example, Biacore (manufactured by BIAcore)). These screenings can also be performed by no-throughput screening using combinatorial chemistry technology.
  • test samples used in the screening of the present invention include purified proteins (including antibodies), gene library expression products, synthetic peptide libraries, cell extracts, cell culture supernatants, and synthetic low molecular weight compounds. Libraries, natural materials such as soil, solutions containing bacteria-releasing substances such as actinomycete broth.
  • the test sample can be used by appropriately labeling with, for example, a radiolabel or a fluorescent label as necessary.
  • At least one protein constituting the HNR of the present invention that is, a cell in which a gene encoding at least one protein selected from gpl30, CNTF-R and WSX-1 is knocked out is It can be prepared by gene targeting using homologous recombination known to those skilled in the art. Mammalian cells such as mice and humans are preferred as such knockout cells, and various knockout animals can be prepared using the knockout cells thus obtained by means known to those skilled in the art. . Such knockout animals are heterozygotes or homozygotes. In particular, knockout animals that are rodents such as mice and rats can be used as experimental animals useful for the study of diseases associated with neurodegeneration such as Arno and Imah's disease.
  • the compound that binds to HNR of the present invention has activity as an agost or anti-antagonist against eumannin, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, mad cow disease, and It can be used for the prevention or treatment of diseases associated with neurodegeneration such as vascular dementia.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is expected to be used as a drug for protecting neurodegeneration in Alzheimer's disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention it is also possible to prevent diseases caused by neuronal cell death due to cerebral ischemia, for example, besides Argno's disease (T. Kirino, 1 982, Brain Res., 239: 57-69).
  • Argno's disease T. Kirino, 1 982, Brain Res., 239: 57-69.
  • Other Parkinson's disease with dementia ⁇ . ⁇ . ⁇ lymeropoulos et al., 1997, Science, 276: 2045-2047
  • diffuse Lewy bodies disease MG Spillantini et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 6469
  • dementia associated with Down's syndrome is also subject to treatment and prevention.
  • APLP1 a related molecule of APP
  • APLP1 a related molecule of APP
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a compound that binds to HNR as an active ingredient, and can be formulated by a known pharmaceutical method in addition to administering the active ingredient itself directly to a patient.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, sustained release agent, etc. It is conceivable to administer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of an aqueous solution, a tablet, a capsule, a troche, a knock tablet, an elixir, a suspension, a syrup, a nasal solution, or an inhalation solution.
  • the content of the compound of the present invention can be appropriately determined by those skilled in the art according to the therapeutic purpose, administration route, treatment target, and the like.
  • administration to the patient may be, for example, transdermal, intranasal, transtracheal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, intrathecal, intraventricular, or Can be done orally.
  • the pharmaceutical composition of the invention is introduced into the central nervous system by any suitable route including intravenous, intrathecal, intraventricular or intradural injection. Is desirable.
  • a person skilled in the art can appropriately select an appropriate dose according to the patient's age, weight, symptoms, administration method and the like.
  • the dosage and administration method can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the tissue transferability of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, the purpose of treatment, the patient's weight, age, symptoms, and the like.
  • the compound when administering for the purpose of treatment of Alzheimer's disease or the like for the purpose of deprotection protection of cerebral neurons, the compound is administered so as to have a concentration that effectively suppresses neurodegeneration around the target cells. It is preferred that That is, if it is a humanin polypeptide or an equivalent neuronal cell death protecting effect, it will be at least InM, preferably ⁇ , more preferably ⁇ , more preferably 1 ⁇ . Should be administered.
  • the antibody of the present invention includes any form and type known to those skilled in the art. For example, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, and chimeric antibodies such as various humanized antibodies that can be prepared by genetic engineering methods known to those skilled in the art are also included.
  • Nerve hybrid strain F11 cells and pcDNA3 vectors encoding V642I-APP, K595N / M596L-APP (NL-APP), Ml 46L-PS1, N141-I-PS2 cDNA were prepared as previously described (Hashimoto et al. al., 2000, 2001a, 2003).
  • PCAG-human gpl30 and pCAG-human gpl30 ED extracellular human gp 130
  • O Gpl30 extracellular domain and G-CSF receptor extracellular domain were prepared according to the report! (Fukuda et al, 1996).
  • G277 contains 277 amino acids in the total length of the intracellular domain of gpl30, and G-195, G-133, G-68, and G-25 are intracellular domain amino acids 1-195, 1-133, 1-68, 1 Includes -25.
  • Human WSX-1 with C-terminal mycHis tag, mouse CREME9 with mycHis tag uses a set of sense and antisense primers from human and mouse embryo cDNA (BioChain), and human WSX-1 has (5 , -ACTAGTACCATGCGGGGAGGCAGGGG-3 'and 5, -GAATTCGGCCAGAACCTG TGGCCTGG-3, and mouse CREM9 were amplified by PCR using (5, -GGATCCACCATGAAGGGCGCGATGG AGCC-3' and 5, GAATTCAAATACCAGCACTTTCCATCCAGG-3).
  • Plasmids encoding human CNTF-R (V5-CNTF-R) and rat IL-6R (pUC M18-rat IL-6R) with a V5 tag at the C-terminus are from Invitrogen and American Type Culture collections, respectively. Purchased.
  • the plasmid encoding the familial ALS (FALS) gene G85R-SOD1 into the pEFBos vector was a gift from Dr. Tsuji (Hashimoto et a 1., 2001a, Kanekura et al, 2004) 0 Human wild type
  • the gpl30 cosmid was constructed by inserting full-length gpl30 into the Swal site of pAxCAw t (TaKaRa). [0040] Recombinant site force-in and soluble receptor
  • Mouse Cardioto Mouth Pin 1 (CT1), Lac HL-6, Mouse LIF, Mouse IL11, Soluble Lac HL-6R, Soluble Human CNTF-R, Recombinant Mouse gpl30 / Fc Chimera and Recombinant Human Soluble CNTF-R is R & D System (Minneapolis, Minnesota, USA).
  • HI-6, human costatin 1, rat CNTF, and human GCSF were obtained from Peprotech EC Ltd (London, UK).
  • Human CNTF was obtained from R & D system or Beprotech EC Ltd.
  • Human IL-27 was obtained from R & D.
  • Anti-mouse APP antibody (22C11) and anti-mouse PS1 antibody were purchased from Chemicon (Ternecula, CA, USA), and anti-PS2 antibody and phoshoSTAT3 (Tyr 7 ° 5 ) antibody were purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).
  • HRP-conjugated or non-conjugated anti-myc monoclonal antibody was purchased from Biomol (Plymouth Meeting, PA). Invitrogenka also purchased HRP-conjugated or non-conjugated anti-V5 antibodies.
  • Rabbit polyclonal anti-HN antibody P04 was prepared as reported (Tajimaet al, 2002) 0 Anti-G-CSFR, gpl30, CNTF-R, LIFR, SOD1, STAT3, IL-6 R antibodies were santa cruz biotechnology (Santa Cruz, USA) also purchased power.
  • Antiphosphorylated tyrosine monoclonal antibody, 4G10 was purchased from Upstate USA (Chiatout Tesville, New York, USA).
  • Two rabbit polyclonal antibodies, anti-mouse WSX-1 antibody, are synthetic peptide MNRLRVARLTPLELLL (mW SX- 1-N) corresponding to N-terminal 16 amino acids of WSX-1 and synthetic peptide YSGYEKHFLPTPEELGLLV (mWS X--) corresponding to C-terminal 16 amino acids 1-C) was obtained by immunizing a keyhole limpet with a covalently bound mosyanine (Sigma).
  • WSX-1 antibodies two rabbit polyclonal anti-human WSX-1 antibodies were synthesized with a synthetic peptide MRGGRGAPFWLWPLPKC (hWSX- 1-N) corresponding to N-terminal 17 amino acids of WSX-1 and a synthetic peptide LPTPEELGLLGPPRPQVLAC (hWSX) corresponding to C-terminal 20 amino acids.
  • -lC was obtained by immunizing a kihol limpet with mosyanin (Sigma) covalently bound thereto.
  • Anti-mouse gpl30 neutralizing antibody, anti-mouse LIFR neutralizing antibody, anti-mouse IL-11R neutralizing antibody, anti-human CNTF-R neutralizing antibody, and anti-rat CNTF-R neutralizing antibody were purchased from R & D system.
  • Other monoclonal antibodies, anti-mouse gpl30 and RX435 were a gift from Dr. Fukuda, Keio University School of Medicine. The antibody against Bax was purchased from Santa Cruz Biotechnology (P-19).
  • HN ⁇ synthesis S14G-HN (HNG), C8A-HN (HNA), and human amyloid-j8 (1-42) peptide were purchased from Peptide Institute (Mino, Osaka). Biotin-HN and Biotin-HNG were purchased from Kobe Natural Products Chemicals.
  • PCN Primary cultured mouse cortex-euron
  • F1 1 cells in 6 well plates 7xl0 4 / well in mycHis- WSX- 1, V5- CNTF- R or rats the HL- 6R (V6 tag) was introduced plasmids encoding. 48 hours after introduction, a cell lysate (cell lysate) was collected for pull-down assay with Sepharose 4B-HN or HNA.
  • the binding reaction between Sepharose 4B and HN or HNA was performed according to the manufacturer's instructions (Amersham Pharmacia Biotech, Apsara, Sweden) with 3 ml of CNBr-activated Sepharose 4B and 5 mg of HN or HNA in a coupling buffer (0.1 M NaHCO 0.5M NaCl
  • Plasmid vectors encoding small interfering RNA (sRNAi) for mouse FPR2, mouse CNTF-R, mouse WSX-1, mouse IL-6R, and mouse LIFR were constructed as follows.
  • Antisense DNA fragment 5'-TGCAAGCTTTTGGAAAAAATAACTTACCACTAAGC mouse CNTF-R
  • Sense DNA fragment 5 '-TTGGATCCCGTGTGTGCTGTGCCATCCGAGATTGATATC Antisense DNA fragment:
  • Sense DNA fragment 5'-TTGGATCCCATATCCACTTGAGAGAAGATCTTGATATCC
  • Antisense DNA fragment 5'-AAGGTACCTTGGAAAAAAATATCCACTTGAGGAAG mouse IL-6R
  • Antisense DNA fragment 5'-GCAAGCTTTTGGAAAAAATTTAAGCTGTGAAACGC mouse LIFR
  • Sense DNA fragment 5'-TTGGATCCCATATCCACTTGAGAGAAGATCTTGATATCC
  • Antisense DNA fragment 5'-AAGGTACCTTGGAAAAAAATATCCACTTGAGGAAG mouse Bax
  • Sense DNA fragment 5,-CGGGATCCCATGATCTGTTCAGAGCTGGTGTTGATATC
  • Antisense DNA fragment 5 '-GGGGTACCTTGGAAAAAAATGATCTGTTCAGAGCT
  • HN-mediated neuroprotective signaling pathway Hashimoto et al., 2005
  • the HN receptor is thought to belong to the site force receptor family .
  • gpl30 is a subunit common to the site force receptors of the IL6R receptor family. Force to express (gpl30tr) in the extracellular domain and membrane domain, or the extracellular domain (gpl30ED) force of human gpl30.
  • FIGs 1A and 1B HN-mediated neuroprotection against V642I-APP overexpression toxicity (A) and M Aj8 toxicity (B) is completely achieved by adding recombinant soluble human gpl30. To suppress.
  • G-CSF for the extracellular domain
  • gp 130 for the cell membrane domain
  • C-terminal shortened for the intracellular domain to various lengths.
  • Human gpl30 was constructed (Fukuda et al., 1996).
  • a chimeric protein called G277 contains all the intracellular domains of gpl30, G-195, G-133, G-68, and G-25 are respectively 1-195, 1-133, 1-68, It contains amino acids 1-25 (the N-terminal amino acid of the intracellular domain is the first).
  • Fig. 2A the expression of these chimeric proteins was confirmed (Fig. 2A).
  • G-CSF is the arch of the Cu / Zn-SOD 1 mutant gene that has been previously shown as the causative gene for familial amyotrophic lateral sclerosis. It did not protect against neuronal cell death (Fig. 2D). In addition, an increase in the phosphorylation level of gpl30 was observed with HN treatment (Fig. 2E).
  • Result 3 To explore the molecular basis of the HN receptor, we investigated whether the known IL-6 family site force-in could mimic HN-mediated neuroprotective effects. As shown in Figure 3A, mouse Cardioto Mouth Pin 1 (CT-1), Lac HL-6, Mouse IL-11, Human OSM, Mouse LIF, and Human CNTF capable of binding to mouse CNTF-R. None inhibited Aj8-induced F11 cell death at physiological levels (up to 1 OOng / ml). This was the same for nerve cell death caused by overexpression of V642I-A PP (data not shown).
  • CT-1 Cardioto Mouth Pin 1
  • Lac HL-6 Lac HL-6
  • Mouse IL-11 Human OSM
  • Mouse LIF Mouse LIF
  • Human CNTF capable of binding to mouse CNTF-R. None inhibited Aj8-induced F11 cell death at physiological levels (up to 1 OOng / ml). This was the same for nerve cell death caused by overexpression of V642I-A PP (data not
  • IL-6 receptor It is expressed in IL-6 receptor, IL-11 receptor, LIF receptor, or CNTF receptor and gpl30 force SF11 cells and primary cultured brain cortical nerves (unpublished view of YH and MM).
  • a functional IL-6 receptor, IL-11 receptor, OSM receptor, LIF receptor, or CNTF receptor combined with the unit should be generated. Therefore, we concluded that IL-6, IL-11, CT-1, OSM, LIF, and CNTF-induced gpl30-mediated pathways are insufficient for cell death due to AD-related injury. Based on the above findings, it is unlikely that HN binds to these site force receptors and exerts a neuroprotective effect.
  • soluble IL-6 receptor soluble IL-6 receptor
  • soluble CNTF-R 100 ng / ml
  • the respective ligands IL-6 and CNTF 100 ng / ml
  • 8 on neuronal cell death was examined (FIG. 3B).
  • IL-6 induced gpl30 homodimerization when sIL-6R was expressed, and showed the same activity as HN.
  • CNTF did not show HN-like activity even when soluble CNTF-R (sCNTF-R) was overexpressed.
  • CNTF-R binding to CNTF-R is considered to be involved in the neuroprotective action through HN, considering that intracellular signals are transmitted by heterodimer between gpl30 and LIF-R. It is guessed.
  • FIG. 3D a vector encoding siRNA specific for IL-6R and LIF-R was prepared (FIG. 3D). By expressing these vectors in F11 cells and decreasing the endogenous IL-6R or LIF-R expression, it was not possible to attenuate the phosphorylation of STAT3 when HN was activated (Fig. 3E). This confirms that HN transmits cell survival signals via IL-6R and LIF-R.
  • HN receptor HN receptor
  • gp130 Plant et al., 2004
  • IL-27 receptor WSX-1 Plant et al., 1998)
  • CREME9 CREME9
  • HN binding experiments were conducted in the presence of HNA in a large amount of HNA, which is a derivative of HNG that is 1000 times more active than HN or is not active as a negative control (Fig. 4B).
  • HNA In cells expressing WSX-1 and gpl 30, HNG inhibited HN binding but not HNA. This indicates that HN specifically binds to WSX-1.
  • In vitro pull-down assay with Sepharose 4B beads covalently bound to HN or HNA.
  • HN binds to CNTF-R and WSX-1 overexpressed in F11 cells. I found it ( Figure 4C).
  • HNA does not bind to these receptors! That was confirmed ( Figure 4C).
  • Result 7 In order to confirm the involvement of HN-mediated neuroprotective signals CNTF-R and WSX-1, the expression of these proteins was knocked down in the F11 cell line using the plasmid siRNA method. The efficiency of this method was examined by mRNA by real-time PCR and protein quantification by Western method (Sui et al., 2001, Kanekura et al., 2004) (Fig. 5A). As a negative control, siRNA of mouse FPR-2 (Ying et al., 2004), a recently published HN receptor, was used. As shown in FIG. 5B, blocking endogenous WSX-1 expression completely abolished HN activity against neuronal cell death due to V642I-APP overexpression.
  • CNTF-R can form a complex with WSX-1.
  • the myc tag was attached to human WSX-1
  • the V5 tag was attached to human CNTF-R and overexpressed in COS7 cells, and analyzed by co-immunoprecipitation experiments.
  • FIG. 6A immunoprecipitation of WSX-1 coprecipitated CNTF-R, and immunoprecipitation of CNTF-R coprecipitated WSX-1. This suggests that WSX-1 is bound to CNTF-R.
  • HN treatment induces binding between CNTF-R and WSX-1, or WSX-1 and gpl30.
  • F11 cells were treated with NG ⁇ HNG or HNA, and cells were collected after 0, 1, 3, 6 hours, and immunoprecipitated with gpl30 antibody and CNTF-R antibody. Immunoplot analysis was performed with mWSX-1 antibody. As a result, it was revealed that the binding of CNTF-R and WSX-1 or WSX-1 and gpl30 was induced by HNG treatment in the expression of specific endogenous levels. [0063] Result 10:
  • IL-27 has been reported to have WSX-lZgpl30 as its receptor. Therefore, IL-27 may have the same effect as HN. As expected, treatment of IL-11 with F11 cells showed an HN-like effect in the high concentration region (1-10 / zM). At the same time, IL-27 treatment below ⁇ was found to suppress the effect of HN (Fig. 7).
  • binding assay (2) based on more sensitive immunofluorescence and succeeded in detecting binding to endogenous levels of HN receptors.
  • the binding strength of HN or HNG and HNR is increased by using F11 cells with an internal level of HNR (Fig. 8, left two panels) and CNTF-RZWSX-lZgpl30 by means of a transfer cushion. Binding assays were performed using the expressed F11 cells (right two panels). The upper two panels examined HN binding, and the lower two panels examined HNG binding. As a result, HN and HNG showed concentration-dependent bonds that saturate at concentrations of 10 M and ⁇ , respectively, and their KD values were in the range of 1-10 ⁇ and 1- ⁇ .
  • Result 13 Furthermore, using PCN, which is a more physiological neuron, we investigated whether high-concentration IL-27 and CNTF treatment inhibits the binding of HN and PCN cells, as already observed in F11 cells (Fig. 7). It was. Similar to the results in F11 cells, IL-27 treatment of ⁇ -1 M was found to suppress HN binding to PCN (Fig. 9A). The same concentration of CNT-F, like IL-27, also inhibited HN binding to PCN, but IL-6 was found to have no such effect.
  • siRNA-Bax A siRNA specific to mouse Bax (siRNA-Bax) was generated.
  • siRNA-Bax showed a marked inhibitory effect on staurosporine-induced Fl 1 cell apoptosis, this siRNA-Bax was judged to function effectively (FIG. 12C). Therefore, the endogenous Bax expression of F11 cells was suppressed with siRNA-Bax, and the ability of HN to inhibit V642I-APP and M146L-PS1 high expression induced F11 neuronal cell death by HN was investigated. It was.
  • siRNA-Bax has an inhibitory effect on V 642I-APP neuronal cell death itself. Therefore, in the system that detects V642I-APP neuronal cell death, the effect of siRNA-Bax on HN action is verified. I could't do it.
  • siRNA-Bax has no inhibitory effect on M146L-PS1-induced neuronal cell death, so it was possible to verify the effect of siRNA-Bax on HN action. As shown in FIG. 12D, even when endogenous Bax expression was suppressed, the inhibitory effect of HN on M146L-PS1-induced neuronal cell death was not affected at all.
  • the IL-27 Receptor (WSX-1) is an Inhibitor of Innate and Adaptive Elements of Typ e 2 Immunity.J. Immunol., 173, 5626-5634.
  • Two signals are necessary for cell proliferation induced by a cytokine receptor gpl3 0: involvement of STA1 3 in anti— apoptosis.
  • Humanin antagonists mutants that interfere with dimerization inhibit neuroprotection n by Humanin. Eur J Neurosci. 19: 2356—64.
  • Amyloid ⁇ activates
  • Soluble interleukin -6 receptor potentiates the antagonistic activity of soluble gpl30 on interleukin— 6 responses. J.
  • Brain Res 88b 54—66.
  • Rho Family GTPases Are Required for Activation of Jak / STAT Signaling by G Protein-Coupled Receptors. Molecular and Cellular Biology 23 (4), 1316 -1333.
  • IL-27 Mediates Complete Regression of Orthotopic Primary and Metastatic Murine Neuroblastoma Tumors: Role for CD8 + T Cells J. Immunol. 173, 7170-7182.
  • the humanin-like polypeptide receptor (HNR) elucidated by the present invention is useful for elucidating a mechanism for promoting or suppressing an intracellular signal pathway that exerts an activity such as a neuroprotective action of HN. It can be used for clinical applications such as the development of therapeutic agents for degenerative diseases, especially Alzheimer's disease.

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Abstract

本発明の目的は、HNシグナル経路の情報に基づいてリセプターを探索し、ヒューマニン受容体又はヒュ－マニン様ポリペプチド受容体（HNR）を見いだすことによって、HNの神経保護作用などの活性を発揮する細胞内シグナル伝達を促進あるいは抑制するメカニズムを解明して、それにかかわる化合物を特定し、HNRアゴニスト及びHNRアンタゴニストのスクリーニング方法を確立すること、スクリーニングした化合物を神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療薬開発に役立てること、アルツハイマー病神経細胞死アッセイシステムを提供すること、及び、HNR遺伝子強制発現法や細胞内遺伝子ノックアウト法等を提供することである。 従って、本発明は、ｇｐ１３０又はその部分ポリペプチド、CNTF-R及びＷＳＸ－１から成る群から選択される少なくとも２種の蛋白質を含むヒューマニン受容体又はヒューマニン様ポリペプチド受容体（ＨＮＲ）に関する。

Description

明 細 書
ヒユーマニン受容体又はヒュ—マニン様ポリペプチド受容体
技術分野
[0001] 本発明は、ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体 (以下、まと めて、「HNR」と標記する場合もある）、該受容体が強制発現された形質転換細胞、 該受容体に結合する化合物のスクリーニング方法、該化合物を含む医薬組成物等 に関する。尚、本願は、 2005年 4月 22日出願の日本特許出願 2005— 124394及 び 2005年 9月 5日出願の日本特許出願 2005— 255972に基づき優先権を主張す る出願であり、これらに記載された内容は本明細書に引用され、その開示内容の一 部と見なされる。
背景技術
[0002] 神経脱落、それはアルツハイマー病 (AD)の主な神経学的徴候あるいは症状発現 と直接関連していると考えられ、その病理学的メカニズムは解明されていないが、 AD 治療の最も重要なターゲットである。 In vitroでは種々の AD関連の傷害、すなわち家 族性 AD (FAD)遺伝子変異体の過剰発現やアミロイドベータ前駆体 (APP)由来の毒 性ベータ一アミロイド (A β s)の増加及び添加等は様々な経路で神経細胞死を誘導 する。
[0003] 家族性 AD(FAD)は 3遺伝子、 APP、プレセ-リン 1(PS1)、プレセ-リン 2(PS2)におけ るミスセンス変異が原因となっておこることが見い出されている (Shastry and Ginlin, 19 99)。これらの変異遺伝子が FAD脳において in vivoでどのように神経脱落に寄与して いるかは不明であるけれど、複数のグループが培養細胞において (Yamatsuji et al., 1996a,b; Wolozin et al., 1996; Zhao et al., 1997; Nishimura et al., 1998; Luo et al., 1999; Hashimoto et al., 2000)或いは初代培養皮質神経（PCN)において（Niikura e t al, 2004) FAD関連の APPと PS遺伝子変異体の発現が神経細胞死を引き起こすこ とを証明した。
[0004] さらに、 AD病理に密接に関連すると考えられている（Hardy and Selkoe, 2002)、ベ 一ターアミロイドの増加が生理的に高すぎる濃度ではあるが in vitroで神経細胞死を 引き起こすこと力 s示された (Loo et al., 1994; Hashimoto et al" 2001; Hashimoto et a 1., 2004)。
[0005] 本発明者は、 AD患者死亡後の剖検脳における後頭葉カゝら作成した cDNAライブラ リーを使用して細胞死を防ぐ化合物をバイアスをかけない機能的なスクリーニング方 法、「デストラップスリーユング法」を実施することにより、ヒユーマニン (HN)と名付けた 24アミノ酸ペプチド MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRAをコードする cDNAを同定した (特許文献 1)。 HNは種々の FAD遺伝子ゃ抗 APP抗体、さらにベータアミロイドべプチ ド (A |8 )等のすべての AD関連傷害にょリ引き起こされる神経細胞死に対し拮抗作用 をしめす。 (Hashimoto et al., 2001a and b; Nishimoto et al., 2004) 0その拮抗作用は の HNで完全である。さらに HNはある種の神経細胞や非神経細胞死、例えば 、無血清培地における PC12 (Kariya et al., 2002)やリンパ球（Kariya et al., 2003)に たいする細胞死や， ADによるヒト脳血管性平滑筋細胞の毒性 (Jung et al, 2003)、さ らにはプリオン由来のペプチドによる神経毒性（Sponne et al, 2004)にも拮抗するこ とが後続の研究で示された。
[0006] 我々は HNが細胞内から分泌され、細胞外力 細胞表面のリセプターを介して AD関 連傷害により起こる神経細胞死にたいして拮抗作用を発揮することを報告した (Hashi moto et al., 2001a; Nishimoto et al., 2004)。
[0007] 最近 Ying等 (2004)は HNが PC 12細胞株にぉ 、て PTX感受性 Gタンパク結合受容体 であるヒトフオルミルペプチドリセプタ一様- 1 (FPRL-1)をリセプタ一として結合し A β (1-42)による神経細胞死に拮抗していることを報告した。 Ying等は ΗΝが Α |8が誘導 する神経毒性に拮抗作用をしめすのは FPRL-1に Α |8が結合するのを競争的に阻止 するためであると示唆した。しかしながら、 FPRL-1が HNを介した AD関連傷害にたい する神経保護作用に関与して ヽるかを調べたところ、 Fl 1神経ハイブリッド細胞株あ るいは初代培養皮質神経 (PCN)にお 、ては HNを介する神経保護作用には FPRL-1 は関与して ヽな 、ことがみ 、だされ、その系にお ヽては FPRL-1以外のリセプターが 存在しそのリセプターを介して HNが神経保護作用を発揮することが指摘された。
[0008] 更に、我々は STAT3と或る種のチロシンキナーゼが HNを介する神経保護作用に関 与することを示し、このことはサイト力インリセプタ一様のリセプターがそのシグナル経 路に存在することを示唆した。
[0009] gpl30はインターロイキン 6(IL-6)リセプターファミリーに共有のサイト力イン受容体サ ブユニットである。 gpl30を含む受容体は IL- 6, IL-11, LIF, CNTF,オンコスタチン M ( OSM) ,カルディオト口フィン一 1や IL- 27を含むタイプ 1サイト力インにより刺激される。 これらのサイト力インのリセプターへの結合は gpl30のホモ二量体化あるいは gpl30 関連リセプター、たとえば LIFリセプター、 OSMリセプター、 WSX- 1 (IL27リセプター）と のへテロ二量体化を誘導しサイト力インのシグナルを JAK/STAT又は RAS/MAPKシ グナル経路を介した細胞内シグナル経路へと伝達する（Taga et al.， 1997; Boulay et al, 2003; Boulanger et al.， 2004) 0ごく最近、 IL- 6./IL- 12サイト力インファミリーに 属する IL- 27 (IL- 27p28/EBV誘導遺伝子 3)が WSX- lZgpl30 (Pflanz et al.,2004)と 結合することにより Thlと Th2免疫反応をコントロールすることが示された (Yoshida et a 1., 2004)。又、 CNTF-Rはその細胞内シグナルドメインを有しない gpl30関連リセプ ターである。
特許文献 1 :特再 WO01/021787 神経細胞死を抑制するポリペプチド、 Humanin 特許文献 2 :WO03/097687 Neuroprotective Polypeptides and Methods of Use 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 従って、本発明の目的は、 HNシグナル経路の情報に基づいてリセプターを探索し 、ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体 (HNR)を見いだすこと によって、 HNの神経保護作用などの活性を発揮する細胞内シグナル伝達を促進あ るいは抑制するメカニズムを解明して、それにかかわる化合物を特定し、 HNRァゴ- スト及び HNRアンタゴ-ストのスクリーニング方法を確立すること、スクリーニングした 化合物を神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療薬開発に役立てること、アル ッハイマー病神経細胞死アツセィシステムを提供すること、及び、 HNR遺伝子強制発 現法や細胞内遺伝子ノックアウト法等を提供すること等である。
課題を解決するための手段
[0011] 即ち、本発明は、以下の各態様に係る。
[ 1 ] gp 130又はその部分ポリペプチド、 CNTF受容体 α鎖（CNTF— R)及び WSX 1から成る群力 選択される少なくとも 2種の蛋白質を含むヒユーマニン受容体又は ヒユーマニン様ポリペプチド受容体 (HNR)。
[2]gpl30又はその部分ポリペプチド、 CNTF— R及び WSX— 1から構成されるヒュ 一マニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体。
[3] gp 130又はその部分ポリペプチド及び WSX—1から構成されるヒユーマニン受 容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体。
[4]gpl30の部分ポリペプチド力 少なくとも細胞内ドメインの 1-133番目のアミノ酸配 列を有する、上記 1〜3のいずれか一項に記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマ- ン様ポリペプチド受容体。
コじ？^！^ー！^及び^^^^ ー：！から構成されるヒューマ-ン受容体又はヒューマ-ン様 ポリペプチド受容体。
[6]gpl30、 CNTF— R及び WSX— 1がヒト由来の蛋白質である、上記 1〜5のいず れか一項に記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体。
[7]上記 1〜6のいずれか一項に記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリ ペプチド受容体に結合する化合物のスクリーニング方法。
[8]ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体に結合する化合物が
、該受容体の細胞外ドメインに結合する、上記 7記載のスクリーニング方法。
[9]ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体に結合する化合物が
、該受容体の細胞内ドメインに結合する、上記 7記載のスクリーニング方法。
[10]ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体に結合する化合物 力 該受容体ァゴニストである、上記 7記載のスクリーニング方法。
[11]ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体に結合する化合物 力 該受容体アンタゴ-ストである、上記 7記載のスクリーニング方法。
[12]上記 7〜： L 1のいずれか一項に記載のスクリーニング方法であって、
(a)ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体又はそれを構成す る少なくとも 1つのタンパク質に試験試料を接触させる工程、
(b)該受容体と該試験試料に含まれる化合物との結合特性を測定する工程、及び
(c)該受容体に結合する化合物を選択する工程、を含む前記方法。 [13]ヒユーマニン又はヒユーマニン様ポリペプチドの存在下で、ヒユーマニン受容体 又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体又はそれを構成する少なくとも 1つのタンパク 質に試験試料を接触させることを特徴とする、上記 12記載のスクリーニング方法。
[14]ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体又はそれを構成す る少なくとも 1つのタンパク質が細胞で強制発現されて 、るものである、上記 12又は 1 3に記載のスクリーニング方法。
[15]ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体が、該受容体を構 成する少なくとも一つのタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターによって 形質転換された細胞で強制発現されているものである、上記 12又は 13に記載のスク リーニング方法。
[16]該受容体と化合物との結合特性を、神経細胞死に対する拮抗作用又は抑制作 用の変化を検出することにより測定する、上記 12〜15のいずれか一項に記載のスク リーニング方法。
[17]該受容体と化合物との結合特性を、 SATAT3の 706番目のチロシンのリン酸 化の亢進又は抑制を検出することにより測定する、上記 12〜15のいずれか一項に 記載のスクリーニング方法。
[ 18]無細胞系にお 、て実施する上記 7〜 12の 、ずれか一項に記載のスクリーニン グ方法。
[19]gpl30、 CNTF— R及び WSX— 1から成る群から選択されるヒユーマニン受容 体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体を構成する少なくとも一つのタンパク質をコ ードする遺伝子を含む発現ベクターによって形質転換された細胞。
[20]ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体が強制発現されて V、る上記 19記載の形質転換細胞。
[21]gpl30、 CNTF— R及び WSX— 1から成る群から選択されるヒユーマニン受容 体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体を構成する少なくとも一つのタンパク質をコ ードする遺伝子がノックアウトされて ヽる細胞。
[22]ES細胞である、上記 21記載の細胞。
[23]上記 22記載の ES細胞に由来するヒト以外のノックアウト動物。 [24]ホモ接合体である、上記 23記載のノックアウト動物。
[25]齧歯類である、上記 23又は 24記載のノックアウト動物。
[26]上記 1から 6の!、ずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリべ プチド受容体に結合する化合物を有効成分とする神経細胞死抑制剤である医薬組 成物。
[27]上記 1から 6の!、ずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリべ プチド受容体に結合する化合物を有効成分とする神経変性を伴う疾病の予防または 治療に用いられる医薬組成物。
[28]上記 1から 6の!、ずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリべ プチド受容体に結合する化合物を有効成分とするアルツハイマー病の予防または治 療に用いられる医薬組成物。
[29]上記 1から 6の!、ずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリべ プチド受容体に結合する化合物を有効成分とする筋萎縮性側索硬化症の予防また は治療に用いられる医薬組成物。
[30]上記 1から 6の!、ずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリべ プチド受容体に結合する化合物を有効成分とする狂牛病の予防または治療に用い られる医薬組成物。
[31]上記 1から 6のいずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリべ プチド受容体に結合する化合物を有効成分とする血管性痴呆症の予防または治療 に用いられる医薬組成物。
[32]上記 1から 6の!、ずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリべ プチド受容体に特異的に結合する抗体。
発明の効果
[0012] 本発明によって、ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体 (HNR )の構造が明らかとなり、該受容体に結合する化合物のスクリーニング方法、及び該 化合物を含む医薬組成物等を提供することが可能となった。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]Α)神経ハイブリッド株 F11細胞に、 pcDNA3ベクター又は pcDNA3- V642I- ΑΡΡ ベクター（0.5 μ g)と、 pCAGベクター、 pCAG-野生型マウス gpl30 (mgpl30wt)又は p CAG-マウス gpl30細胞外ドメイン (mgpl30tr) (0.5 g)をトランスフエクシヨンした。導 入後 72時間で WST8アツセィより求めた細胞生存率を示すグラフである。下に、 V642 I-APPの発現と mgpl30wt又は mgpl30trの発現を免疫プロット法で確認した結果（写 真）を示す。 B)リコンビナント可溶性ヒト gpl30 (図中、下段「 +」）又は BSA (図中、下 段「一」）（10 g)の存在下、初代培養皮質神経 (PCN)を Α |8 (25 Μ) (図中、上 段）と共にインキュベートした。 Α |8処理開始 72時間後に、 WST- 8アツセィ（上)及び 力ルセイン蛍光法（下）で求めた細胞生存率を示すグラフである。 C) PCNを 1 μ gの 抗マウス gpl30中和抗体（RX435)又はコントロール IgGの存在下で、 25 μ Μの A j8 1 -43と共にインキュベートした。 A |8処理開始 72時間後に、力ルセイン蛍光法で求め た細胞生存率 (左)及び LDHアツセィで求めた細胞死亡率 (右）を示すグラフである。 D) F11細胞に、 pcDNA3ベクター又は pcDNA3— V642ト ΑΡΡ(0.5 μ g)と、 pEFBosベ クタ一又は pEFBos -野生型ヒト gpl30 (0.5 g)をトランスフエクシヨンした。導入後 24 時間に、： gの抗マウス gpl30中和抗体を添カ卩した。トランスフエクシヨン 72時間後 に、トリパンブルー除外アツセィおよび WST-8アツセィにより求めた、夫々、細胞死亡 率 (左）及び細胞生存率 (右）を示すグラフである。 V642I-APPの発現とヒト gpl30wtの 発現を免疫プロット法で確認した結果 (写真)も示す。
[図 2]A) F11細胞に pcDNA3ベクターまたは pcDNA3- ΑΡΡ(0.5 μ g)と pEFBosベクター またはヒト GCSF受容体の細胞外ドメインを細胞膜ドメインと細胞内ドメインの C末端を 短縮した gp 130に融合したキメラ（G- CSFR/gpl30として表わす）をコードする pEFBos ベクター（0.5 μ g)をトランスフエクシヨンした。 48時間後、各々のキメラタンパク質の発 現を免疫プロット法で確認した結果 (写真）を示す。 B) Fl 1細胞に pcDNA3ベクターま たは pcDNA3- ΑΡΡ(0.5 μ g)と pEFBosベクターまたはヒト GCSF受容体の細胞外ドメイ ンを細胞膜ドメインと細胞内ドメインの C末端を短縮した gpl30に融合したキメラ (G-C SFR/gpl30として表わす）をコードする pEFBosベクター（0.5 μ g)をトランスフエクシヨン した。 G-CSFR/gpl30 (277)は細胞内アミノ酸番号 1-277に相当する gpl30の細胞内 ドメインのすべてを含んでおり、一方、 G- CSFR/gpl30 (133), (68), (25)は夫々、細胞 内の 1-133, 1-68, 1-25アミノ酸を含むものである。トランスフエクシヨン 24時間後に、 夫々の量のヒト G— CSFを添カ卩した。トランスフエクシヨン 72時間後に、トリパンブルー 除外アツセィにより求めた細胞死亡率を示すグラフである。下に、 V642I-APPの発現 を免疫ブロット法で確認した結果（写真)も示す。 C) pcDNA3- V642I-APPベクターの 代わりに、 pcDNA3- K595N/M596L-APP (NL- APP)、 M146L- PS1、及び N141- 1- PS2 ベクターを用いて、図 2Aと同様の実験を行って得られた結果を示すグラフである。下 に NL-APP, M146L-PS1 ,及び N141-I-PS2の発現を免疫プロット法で確認した結果（ 写真）も示す。 D) F1 1細胞に、 pEFBosベクター又は PEF—G85R—SOD 1ベクター（0.5 μ g)と、 pEFBosベクター、又は G- CSFR/gpl30 (277)又は G- CSFR/gpl30 (25)をコ ードする pEFBosベクター（0.5 /z g)をトランスフエクシヨンした。トランスフエクシヨン 24 時間後に、夫々の量のヒト G— CSFを添カ卩した。トランスフエクシヨン 72時間後に、トリ パンブルー除外アツセィにより求めた細胞死亡率を示すグラフである。下に G85R-S OD1の発現を免疫プロット法で確認した結果 (写真)も示す。 E) HN処理により、 gpl3 0のチロシンリン酸化が増強される。 PCNs (1.0 X 106 cells/well in 6- well plated) (DIV 3)に MOI 25で human gp 130- encoding adenovirusesを感染させ、 60時間後, 1 ^ M H NG, 1 ju M HNA,あるいは 100 ng/mlラット IL— 6と 1 μ g/ml sIL— 6Rをカ卩え、 37° C で 15分間処理した。 2 gの gpl30抗体で免疫沈降した沈降物を phosphotyrosine 抗体で免疫プロットした結果 (写真)を示す。
[図3]八）？じ?^を96穴プレートに2.5或ぃは5 xl04Zwellで播種し、 A j8 (25 M)の 存在又は非存在下、及び、各サイト力インの存在又は非存在下でインキュベーション した。 72時間後に WST-8アツセィ及び力ルセイン蛍光法で求めた細胞生存率を示 すグラフである。 B)上記 Aと同様に、可溶性 IL- 6リセプター a (SIL-6R)或いは可溶 性 CNTF- R ( 100 ng/ml)を添加し、それぞれのリガンド IL- 6および CNTF ( 100 ng/ml) で刺激し A |8による神経細胞死に対する影響を調べた結果を示すグラフである。尚、 左は力ルセイン蛍光法で求めた細胞生存率、右は WST-8アツセィで求めた細胞生 存率を示すグラフである。 C)上記 Αと同様に、マウス gpl30、マウス LIFR、マウス IL-11 R、及びラット CNTF-Rに対する中和抗体（1 /z g)を添加して、 72時間後に細胞生存 率を力ルセイン蛍光法で求めた。 D) F11細胞に対して、図に記載された量の pRNA- U6.1/Shuttle vector (empty), pRNA—U6.1 /Shuttle— IL—6R siRNA,あるいは pRNA— U6 .1/Shuttle-LIFR siRNAを導入した。 72時間後,細胞より total RNAを抽出し、 IL-6Rと LIFR mRNA量を reaH:ime PCR法により定量した。内部コントロールとして G3PDHの mRNA.量を定量し、補正した。また、免疫プロット法により、各々のタンパク質の変化 を定量した。 E) F11細胞に対して、図に記載された量の pRNA_U6.1/Shuttle vector (empty), pRNA—U6.1 /Shuttle— IL—6R siRNA,あるいは pRNA—U6.1/Shuttle— LIFR siR NAを導入した。 48時間後、細胞を 100 ng/ml IL- 6, 100 ng/ml CNTF,あるいは 1 μ M HNGで 37。 C 15分間処理し、ハーべストした。 phosphoSTAT3 (Tyr7。5)抗体と ST AT3抗体で免疫プロットを行った結果 (写真)を示す。
[図 4]A) F11細胞に、 pEF- Bos, pEF- - mycHis CREME9, pEF- - mycHisヒト WSX- 1又 は pEF— V5—ヒト CNTF— R (0.5 g)と、 pCAG—ヒト gpl30 (0.5 g)をトランスフエクシヨン するか、 pEF— mycHisヒト WSX—1、 pEF— V5ヒト CNTF— R及び pCAGヒト gpl30 (0.5 ^ g) をトランスフエクシヨンした。添カ卩ベクターの全量を 1.5 gに維持するために、 pEF-Bo sベクターを適当量添加した。ピオチン標識 HNと各々トランスフエクシヨンした細胞と の結合量を免疫蛍光反応を検出することにより求めたアツセィの結果を示すグラフで ある。下に各々のタンパク質の発現は免疫プロットにより示した (写真)。 B) F11細胞 に、 pEF- mycHisヒト CREME9又は pEF- mycHisヒト WSX-1 (0.5 μ g)と、 pCAG-ヒト gpl 30 (0.5 g)をトランスフエクシヨンした。幾つかの実験では、競合させる目的で、 10 μ Μの非標識 HNG又は ΗΝΑを添加した。右側は、レーザースキャニング共焦点顕微 鏡 LSM (Carl Seiss, Germany)で検出した蛍光シグナルの写真である。 C) HNあるい は HNAを共有結合させたセファロース 4Bビーズによる In vitroプルダウンアツセィの 結果を示す写真である。 F11細胞中に CNTF-R, WSX-1, IL-6-Rを過剰発現させ、 各々の 4Bビーズによる In vitroプルダウンアツセィを行った。免疫プロットはヒユーマ- ンに対する P04抗体を用いておこなった（下パネル）。上パネルでは用いたセファロ ース 4Bビーズに含まれて!/、る HNある!/、は HNAを HN合成ペプチド (50 pmol)を陽性コ ントロールとして比較した。
[図 5]HNを介する神経保護作用シグナルに CNTF-Rと WSX-1の関与を確認するため に、プラスミド siRNA法をもちいて、これらタンパクの発現を F11細胞株においてノック ダウンした結果を示すグラフである。 A) F11細胞に、 pRNAU6.1/Shuttleベクター（N O)、 pRNAU6.1/Shuttle— siWSX— 1ベクター（W)、又は pRNAU6.1 /Shuttle— siCNTF—R ベクター（C)をトランスフエクシヨンし、その 72時間後に細胞を溶解して RNAを抽出し 、 mRNA量をリアルタイム PCRで、タンパク質量を免疫プロット法により測定した。 B ) F11細胞に、 pcDNA3ベクター又は pcDNA3— V642卜 ΑΡΡ(0.5 μ g)と、 pRNAU6.1/S huttleベクター（NO)、 pRNAU6.1/Shuttle-siWSX-l (W)、 pRNAU6.1 /Shuttle— siCNT F- R(C)、又は pRNAU6.1/Shuttle-siFPR- 2 (F)をトランスフエクシヨンし、その 24時間 後に、 ΙΟηΜの HNGを添カ卩した。トランスフエクシヨン 72時間後に、 WST— 8アツセィ を行った。 C) F11細胞に、 pcDNA3ベクター又は pcDNA3— V642I— APP(0.5 g)と p RNAU6.1/Shuttleベクター（Vec)叉は pRNAU6.1/Shuttle- siWSX- 1 (W)叉は pRNAU6 • 1/Shuttle— siCNTF— R(C) (0.5 g)と pFEBosベクター又は pEF— V5—ヒト CNTF— R叉 は pEFl/mycHis-human WSX-1 (1 μ g)からなる 3種類のベクターをトランスフエクショ ンし、その 24時間後に、 10nMの HNGを添カロした。トランスフエクシヨン 72時間後に、 WST— 8アツセィを実施した。
[図 6]A) pFEBosベクター或いは pEF- mycHis-ヒト WSX- 1、又は/及び pEF-V5-ヒト C NTF- R (各 0. 5 g、全量 1. O /z g)を COS7細胞にトランスフエクシヨンし、 72時間後 に抗 myc抗体 (myc-WSX-1に対して）或いは抗マウス及びヒト CNTF-R抗体で共免疫 沈降実験をおこなった。その免疫沈降物を免疫プロットに処した結果を示す写真で ある。細胞溶解 B) F11細胞に 10 μ ΜΗΝΑあるいは lOnMHNGを 1、 3、 6時間処理 した。ハーべスト前 30分間、クロスリンカ一である 1 mM BS3処理を行った。 Gpl30あ るいは CNTFRに対する抗体で免疫沈降し、 WSX_1、 gpl30、 CNTF-Rに対する抗体 で免疫プロットを行った。コントロールの免疫沈降として、一部に SOD1に対する抗体 で免疫沈降を行った結果を示す写真である。 Inputとして 20分の 1量の各々のライゼ ートを免疫プロットを行つた。
[図 7]F11細胞に 0.5 μ gの pcDNA3 vectorあるいは pcDNA3- V642I- APPを導入し 5 時間後 10 nM HNGあるいは 10 /z M HNあるいは図に示した濃度のヒト IL- 27を投 与した。一部の実験では図に示した濃度の IL-27あるいは IL-6を HNGと同時に投与 した。投与後、 72時間後、 WST-8アツセィを行った。数字で示された F11細胞は同 時に V642I-APP発現をチェックした。下に、 V642I-APPの発現を免疫ブロットで示す (写真)。
[図 8]A) F11細胞を poly- L- lysineをコートした 96- well plates (7x103 cells/well)に播き 、図で示された濃度の biotin- HNあるいは biotin- HNGを 10 Mの標識していない H NGあるいは HNA非存在下あるいは存在下に加え、免疫蛍光を基盤とした結合アツ セィ（2)を行った（左サイドのパネル)。また、右サイドのパネルでは F11細胞に対して 0.5 gの pcDNA3.1/GS- human CNTF- R, pEFl/MycHis- human WSX- 1,と 1.0 gの pCAG- human gpl30で遺伝子導入し、 24時間後、 poly- L- lysineをコートした 96- well plates (7x103 cells/well)に播きなおし、 36時間後、図に記載された濃度の biotin -HNあるいは biotin- HNGを 10 μ Μの標識していない HNGあるいは HNA非存在下 あるいは存在下に加え、免疫蛍光を基盤とした結合アツセィ（2)を行った。 B) F11細 胞に 0.5 mgの pRNA— U6.1/Shuttle vector, pRNA— U6.1 /Shuttle— WSX— 1 siRNAゝ pR NA-U6.1/Shuttle— CNTF— RsiRNA, pRNA—U6.1 /Shuttle— WSXと pRNA—U6.1 /Shuttle - CNTFR siRNA -1 siRNA両者（0.5 μ gずつ）、、 pRNA-U6.1 /Shuttle- FPR2 siRNA, あるいは pRNA-U6.1/Shuttle-LIFRを導入した。トランスフエタトする全体のベクター 量はバックボーンベクターを加えて、 1.0 /z gとした。 24時間後、図に記載した濃度 の biotin-HNGを 100 nMの非標識 HNG存在下非存在下で処理し、トランスフエクシ ヨン 72時間後に、免疫蛍光を基盤とした結合アツセィ (2)を行った。
[図 9]A) poly- L- lysineをコートした 96- well plates (7x104 cells/well)に処理後 3日目 の PCN細胞を図に示した濃度の biotin- HNGあるいは biotin- HNあるいはヒト IL- 27 を投与して、免疫蛍光を基盤とした結合アツセィ（2)を行った。一部の実験では ΙΟηΜ biotin-HNGに加えて、図に示した濃度の標識していない IL-27、 CNTF,IL- 6,あるい は HNGを同時に加えた。 B) poly-L-lysineをコートした 96-well plates (5.0 x lOVwell) に処理後 3日目の PCN細胞に対して、図に示した濃度のヒト IL-27、 10 nMHNGと図 に記載した濃度の IL- 27, IL-6, CNTFもしくは 2 ;z Lの mWSX- 1- N抗体あるいは preim mune seraを投与した。投与後 16時間で、 10 Mの Ab( 1-43)処理を開始した。 Ab(l -43)処理開始 72時間後， WST-8アツセィを行った
[図 10]A) F11細胞の抽出液を用いて、 mWSX-1-C抗体による免疫プロットを行った 結果 (レーン 1)、同時に 10倍量の抽出液を用いて、 mWSX-1-C抗体による免疫沈降 -免疫ブロットを行った結果（レーン 3)、及び、陰性コントロールとして preimmune seru mによる疑似免疫沈降を行った結果 (レーン 2)を示す写真である。 B) PCNs (DIV3)と Fl 1細胞の抽出液を用いて、 mWSX-1-C抗体による免疫プロットを行った結果を示 す写真である。
[図 11]A) F11細胞を図に記載した濃度の HN、 HNG、 HNAをカ卩えて、 15分後にハー ベストし、 STAT3の 706番目のリン酸化チロシンを認識する抗体と STAT3を認識する 抗体で免疫プロットを行った結果を示す写真である。 B) F11細胞に 0.5 μ gの pRNA -U6.1/Shuttle vector, pRNA— U6.1 /Shuttle— WSX— 1 siRNA、 pRNA—U6.1 /Shuttle— C NTF-RsiRNA, pRNA— U6.1 /Shuttle— WSX— 1と pRNA—U6.1 /Shuttle— CNTFR siRNA - 1 siRNA両者（0.5 ;z gずつ）、あるいは pRNA- U6.1/Shuttle- FPR2 siRNAを導入した。 トランスフエタトする全体のベクター量はバックボーンベクターをカ卩えて、 1.0 gとし た。 48時間後、 HNG,CNTF,IL-27を加え、 15分後に、ハーべストし、 STAT3の 706番 目のリン酸ィ匕チ口シンを認識する抗体と STAT3を認識する抗体で免疫プロットを行つ た。
[図 12]A) 6穴プレート 1ゥエルあたり 7xl04個まかれた F11細胞に pRNA- U6.1/Shuttle vectorあるいは pRNA-U6.1/Shuttle-Baxを 1 gトランスフエタトし、 72時間後のマウ ス Baxの mRNA発現を reaH:ime PCRで定量した。内部コントロールとして G3PDHの m RNAを測定し補正した。 B) 6穴プレート 1ゥエルあたり 7xl04個まかれた F11細胞に pR NA-U6.1/Shuttle vectorあるいは pRNA-U6.1/Shuttle- Baxを 0.5あるいは 1 μ gトラン スフエタトし、 72時間後の Bax蛋白質発現を免疫プロットで検証した。 C) 6穴プレート 1ゥエルあたり 7xl04個まかれた F11細胞に pRNA-U6.1/Shuttle vectorあるいは pRNA - U6.1/Shuttle- Baxを 1 gトランスフエタトし、 72時間後、 100nMのスタウロスポリンあ るいは DMSOをカ卩えて 3、 6、 9時間培養し、生細胞量を WST-8アツセィで定量した。 Vector/DMSO処理された細胞の値を 100%として補正した数字を図に示した。 D) 6 穴プレート 1ゥエルあたり 7xl04個まかれた F11細胞に pcDNA3ベクター又は pcDNA3- V642ト APP叉は pcDNA3— M146L— PS1 (0.5 g)と 1.0 gの pRNA—U6.1 /Shuttle vec torあるいは pRNA-U6.1/Shuttle- Bax siRNAあるいは pRNA-U6.1/Shuttle- WSX- 1を トランスフエタトした。 24時間後に 10 μ Μの ΗΝを添カ卩し, 72時間後に WST-8アツセィ を行った。一部の細胞ライセートは免疫プロット法により APPと PS1の発現を確認した。
E) 6穴プレート 1ゥエルあたり 7xl04個まかれた F1 1細胞に 1.0 gの pRNA-U6.1/Shu ttle vectorあるいは pRNA—U6.1 /Shuttle— Bax siRNA、あるいは pRNA— U6.1/Shuttle— WSX- 1および pRNA- U6.1/Shuttle- CNTFR (各々 0.5 g)をトランスフエタトした。 72 時間後に記載した濃度の biotin-HNを一部の実験では標識して 、な 、HNあるいは H ΝΑ(100 μ Μ)を同時に添カ卩し,免疫蛍光 ΗΝ結合アツセィを行った。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明に於いて、ヒユーマニン様ポリペプチド受容体は、 gp l 30又はその部分ポリ ペプチド、 CNTF受容体 ex鎖（CNTF— R)及び WSX— 1から成る群から選択される 少なくとも 2種の蛋白質を含むものである。従って、その具体例としては、例えば、 gp 130又はその部分ポリペプチド、 CNTF— R及び WSX— 1の 3種類のタンパク質から 構成される受容体、 gp 130又はその部分ポリペプチド及び WSX— 1の 2種類のタン パク質から構成され受容体、並びに、じ?^[^ー1^及び1^3 ー1の2種類のタンパク 質から構成される受容体を挙げることが出来る。更に、本発明の受容体としての機能 が損なわれない限り、これらのタンパク質に加えてその他のタンパク質を構成要素と して含むことが出来る。
[0015] 尚、ヒユーマニン様ポリペプチド受容体を構成する gp 130又はその部分ポリペプチド 、 CNTF— R及び WSX— 1等の各サブユニットは、 HNRを構成するサブユニットとし ての機能が実質的に影響を受けない限り、 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿 入、及び Z又は付加したアミノ酸配列を含むよう改変されたものでも良い。これらは、 当業者に公知の任意の方法で作製することが出来る。
[0016] 本明細書において、「ヒユーマニン様ポリペプチド」とは、国際公開 WO01/021787号 パンフレットに開示された、上記の 24アミノ酸力も成るポリペプチド (ヒユーマニン）と 同等又はそれ以上の AD関連傷害により起こる神経細胞死に対して拮抗作用又は抑 制作用を有するポリペプチド及びその誘導体を含むものである。尚、本明細書にお いて、単に、「ヒユーマニン様ポリペプチド (受容体)」と記載されている場合には、「ヒ ユーマニン (受容体)」自体も含まれる。
[0017] 従って、ヒユーマニン様ポリペプチドの具体的としては、例えば、国際公開 WO01/0 21787号パンフレツトに記載された式 (I)
Pro-Xn - (Cys/bXaa) - (Leu/Arg)— Xn— Leu— Thr— (Gly/Ser)—X
1 2
n Pro (I)
3
(式中、「CysZbXaa」は Cysまたは塩基性アミノ酸、「（LeuZArg)」は Leuまたは Ar g、「（GlyZSer)」は Glyまたは Serであり、 Xn、 Xn、および Xnはそれぞれ独立に
1 2 3
10残基以下の任意のアミノ酸を表す）
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
[0018] 更に、より具体的な例として、国際公開 WO01/021787号パンフレットに記載された 配列番号： 5〜8、 10、 12、 13、 21〜24、 26~29, 32, 33、 37〜40、 46, 48, 54 、および 60からなる群より選択されるアミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸が 置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を含み、 AD関連傷害により 起こる神経細胞死に対して拮抗作用又は抑制作用を有するポリペプチドを挙げるこ とが出来る。
[0019] 上記本発明のポリペプチドには各種誘導体も含まれる。ここで「誘導体」とは、本発 明のポリペプチドの官能基を既知の方法により修飾、付加、変異、置換、または削除 などにより改変された形態を持つ化合物を意味する。このような官能基の改変は、当 業者に公知の任意の方法を用いて、例えば、ポリペプチドに存在する官能基の保護 、ポリペプチドの安定性または組織移行性の制御、あるいはポリペプチドの活性の制 御等を目的として行なうことが出来る。
[0020] 即ち、ポリペプチドは翻訳後修飾などにより天然に修飾されていてもよい。また人工 的に修飾されていてもよい。修飾には、ペプチドのバックボーン、アミノ酸側鎖、ァミノ 末端、またはカルボキシル末端などの修飾が含まれる。また、ポリペプチドは分岐し ていてもよく、環状でもよい。修飾には、ァセチル化、ァシル化、 ADPリボシル化、ァ ミド化、 [フラビン (flavin)、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、脂質、脂質誘導体、ま たはホスファチジルイノシトール]等の共有結合、クロスリンク形成、環状化、ジスルフ イド結合形成、脱メチル化、ピログルタミン酸化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロ キシル化、ョード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、ュビキチンィ匕などが含 まれるが、これらに制限されない。更に、上記ポリペプチドは当業者に公知の任意の 塩及びエステル体とすることも可能である。本発明のポリペプチドは、公知のペプチド 合成技術により製造することが可能であり、また、これらポリペプチドをコードする DN Aを発現させることによつても製造することが可能である。
[0021] 尚、本発明において「AD関連傷害により起こる神経細胞死に対して拮抗作用又は 抑制作用を有する」とは、上記の ADに関連する神経細胞死の少なくとも 1つを拮抗 又は抑制することを指す。すなわち上記のヒユーマニン様ポリペプチドには、これらの ADに関連する神経細胞死の少なくともいずれかを抑制する活性を有しているものが 含まれる。細胞死の抑制は、完全な抑制ではなくても、有意に抑制されればよい。神 経細胞死の抑制活性は、以下の実施例に記載された方法または他に記載の方法（ 例えば国際公開番号 WO00Z14204参照）に従って検定することができる。
[0022] 本発明のスクリーニング方法により、ヒユーマニン様ポリペプチド受容体に結合する 化合物を同定することが出来る。該化合物は、ヒト等の生体内に元来含まれている物 質、又は人工的に合成された物質でもよい。該化合物は、ヒユーマニン様ポリべプチ ド受容体の任意の部分、例えば、細胞外ドメイン又は細胞内ドメインに結合するもの であり得る。更に、該化合物は、該受容体ァゴニスト又は該受容体アンタゴ-ストであ り得る。
[0023] 本発明のスクリーニング方法は、当業者に公知の任意の方法'系で実施することが 出来る。例えば、有細胞系又は無細胞系で実施することが出来る。有細胞系とは、ヒ ユーマニン様ポリペプチド受容体を発現する細胞自体を用いて実施する系である。 特に、本発明にお 、て初めてヒユーマニン様ポリペプチド受容体を構成するタンパク 質が解明されたので、その知見に基きヒユーマニン様ポリペプチド受容体が強制発 現されている細胞を当業者に公知の任意の方法で作製することが出来る。例えば、ヒ ユーマニン様ポリペプチド受容体を構成する少なくとも一つのタンパク質をコードする 遺伝子を含む発現ベクターによって適当な宿主細胞を形質転換することにより容易 に得ることが出来る。このような細胞を使用した場合には、試験試料に含まれる化合 物とヒユーマニン様ポリペプチド受容体との結合特性が増強される可能性があるので 、試験試料中に目的化合物が少量しか含まれていない場合、又は結合力 (親和性） が比較的弱い化合物を有意に測定することが出来る。 [0024] 本発明のスクリーニング方法は、例えば、以下の工程で実施することが出来る。
(a)ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体又はそれを構成す る少なくとも 1つのタンパク質に試験試料を接触させる工程、
(b)該受容体と該試験試料に含まれる化合物との結合特性を測定する工程、及び
(c)該受容体に結合する化合物を選択する工程、を含む前記方法。
ここで、上記工程（a)を適当量のヒユーマニン又はヒユーマニン様ポリペプチドの存在 下で行うことによって、該化合物の結合特性をヒユーマニン又はヒユーマニン様ポリべ プチドとの間の競合反応を利用して該化合物の結合特性を測定することが出来る。
[0025] 有細胞系で実施するスクリーニング方法においては、上記工程（a)における受容体 と試験試料との接触は、該受容体を発現する細胞の培養系に試験試料を添加するこ と等の当業者に公知の任意の手段によって、該細胞と試験試料を接触させることによ つて実施することが出来る。尚、このような有細胞系の場合には、該受容体と化合物 との結合特性を、神経細胞死に対する拮抗作用又は抑制作用の変化 (抑制作用の 増強、減少及び阻害など)を検出することにより測定することが出来る。更に、以下の 実施例に示されるように、ヒユーマニン又はヒユーマニン様ポリペプチドは SATAT3 の 706番目のチロシンのリン酸ィ匕を亢進させることが判明したので、該受容体と化合 物との結合特性を、 SATAT3の 706番目のチロシンのリン酸化の亢進又は抑制を 検出することにより測定することも可能である。
[0026] 尚、発現ベクターは当業者に公知の任意の方法で容易に調製することが出来る。ヒ ユーマニン様ポリペプチド受容体を構成する少なくとも一つのタンパク質をコードする 遺伝子は、国際公開 WO01/021787号パンフレット及びその他の公知文献の記載に 基き容易に調製することが出来る。該発現べクタ一には、上記タンパク質のコード領 域以外に、 5'および 3'に非コード配列（非転写配列、非翻訳配列、プロモーター、 ェンハンサー、サプレッサー、転写因子結合配列、スプライシング配列、ポリ A付加配 列、 IRES、 mRNA安定化'不安定ィ匕配列等を含む）を含んでもよい。
[0027] 本発明のスクリーニング方法に使用する宿主細胞に特に制限はなぐ特に、ヒト及 びサル等を含む哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などの細胞または個体を用い ることができる。宿主一ベクター系としては、例えば、バキュロウィルス一 Sf細胞系（O kamoto et al. , J. Biol. Chem. 270 :4205—4208, 1995)、 pcDNA— CHO細 胞系（Takahashi et al. , J. Biol. Chem. 270 : 19041 - 19045, 1995)、および CMVプロモータープラスミド一 COS細胞系（Yamatsuji et al. , EMBO J. 15 :49 8- 509, 1996)などを挙げることが出来る。又、これらの細胞は当業者に公知の任 意の条件で培養することが出来る。
[0028] このような宿主細胞自体が元々 HNRを発現している必要はない。しかしながら、元 来、該受容体を発現していると予想される組織または細胞、例えば脳皮質組織、神 経細胞株、または神経芽細胞腫や奇形腫細胞などカゝら調製することも可能である。 神経細胞株としては、例えば F11細胞、 PC12細胞（L. A. Greeneおよび A. S. Ti schler, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73 : 2424— 2428)、 NTERA2細 胞 (J. Skowronskiおよび M. F. Singer, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 6050— 6054)、 SH— SY5Y細胞（L. Odelstad et al. , 1981, Brain Res. , 224 : 69— 82)等が挙げることができる。このような場合には、導入した発現べクタ 一由来の受容体の強制発現によって、元来の発現量よりも多量のヒユーマニン様ポリ ペプチド受容体が発現される結果、測定感度が一層向上することが予想される。
[0029] 本発明のスクリーニング方法を無細胞系で実施することが出来る。かかる無細胞系 のスクリーニング方法としては当業者に公知の任意の手段を用いることが出来る。例 えば、本発明の受容体又はそれを構成する少なくとも 1つのタンパク質を、スクリー- ングの手法に応じて、可溶状態として、また担体に結合させた形態としてスクリーニン グに用いることができる。本発明の受容体は標識されていてもよい。標識としては、放 射性同位元素による標識、蛍光物質による標識、ピオチンゃジゴキシゲニンによる標 識、タグ配列の付加などが挙げられる。
[0030] 例えば、本発明の HNR又はそれを構成する少なくとも 1つのタンパク質を固定した ァフィユティーカラムに試験試料をのせ、カラムに特異的に結合する化合物を精製す ることにより、これらに結合する化合物のスクリーニングを実施することが可能である。 また、固定ィ匕した本発明の受容体又はそれを構成する少なくとも 1つのタンパク質に 、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラ リーなどを作用させ、結合する分子をスクリーニングすることも考えられる。また、表面 プラズモン共鳴現象を利用した結合の検出によるスクリーニングも可能である（例え ばビアコア（BIAcore社製)など)。これらのスクリーニングは、コンビナトリアルケミスト リー技術を用いたノ、イスループットスクリーニングにより行うことも可能である。
[0031] 本発明のスクリーニングに用いる試験試料としては、例えば、精製タンパク質 (抗体 を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液 、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、土壌などの天然材料、放線菌 ブロースなどの細菌放出物質を含む溶液などを挙げることが出来る。尚、試験試料 は、必要に応じて適宜、標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などで標識して 用いることが出来る。
[0032] 本発明の HNRを構成する少なくとも一つのタンパク質、即ち、 gpl30、 CNTF— R 及び WSX—1から成る群力 選択される少なくとも一つのタンパク質をコードする遺 伝子がノックアウトされている細胞は、当業者に公知の相同組換えを利用した遺伝子 ターゲッティングにより調製することが出来る。このようなノックアウト細胞としてはマウ ス、ヒト等の哺乳類細胞が好ましぐ更に、こうして得られたノックアウト細胞を使用して 当業者に公知の手段を用いて各種のノックアウト動物を作製することが出来る。かか るノックアウト動物はへテロ接合体又はホモ接合体である。特に、マウス及びラット等 の齧歯類であるノックアウト動物は、アルッノ、イマ一病等の神経変性を伴う疾病の研 究に有用な実験動物として利用することが出来る。
[0033] 本発明の HNRに結合する化合物は、ヒユーマニンに対するァゴ-スト又はアンタゴ 二ストとしての活性を有しているために、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、 狂牛病、及び血管性痴呆症等の神経変性を伴う疾病一般の予防または治療に用い ることが出来る。
[0034] 即ち、既に述べたように、これまでの研究力 アルッノ、イマ一病において神経細胞 の細胞死が起こることが明らかにされている。このため、本発明の医薬組成物は、ァ ルツハイマー病における神経変性を保護する薬剤として用いられることが期待される
。また、本発明の医薬組成物を用いて、アルッノヽイマ一病以外にも、例えば脳虚血 による神経細胞の細胞死に起因する疾患を予防することも可能である (T. Kirino, 1 982, Brain Res. , 239 : 57— 69)。その他、痴呆を伴うパーキンソン病（Μ. Η. Ρο lymeropoulos et al. , 1997, Science, 276 : 2045— 2047)、びまん性レービ一 小体（Lewy bodies)病（M. G. Spillantini et al. , 1998, Proc. Natl. Acad. S ci. USA, 95 : 6469— 6473)、ダウン症に伴う痴呆なども、治療や予防の対象とな る。また、 APPの類縁分子である APLP1が、先天性ネフローゼ症候群の原因遺伝 子と!/ヽゎれて!ヽる（Lenkkeri, U. et al. , 1998, Hum. Genet. 102 : 192— 196) ことから、ネフローゼ症候群などの腎疾患も治療や予防の対象となる。
[0035] 従って、本発明の医薬組成物は HNRに結合する化合物を有効成分として含有し、 該有効成分自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化 することも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、 滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤など と適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。本発明の医薬組成物は 、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、ノ ッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点 鼻液、または吸入液などの形態であり得る。本発明化合物の含有率は、治療目的、 投与経路、治療対象等に応じて、当業者が適宜決定することが出来る。
[0036] 患者への投与は、有効成分の性質に応じて、例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管 支的、筋内的、腹腔内、静脈内、脊髄腔内、脳室内、または経口的に行なうことがで きる。例えば、脳神経変性疾患の治療に用いる場合においては、本発明の医薬組成 物は、静脈内、脊髄腔内、脳室内または硬膜内注射を含む任意の適当な経路で中 枢神経系に導入するのが望ましい。当業者であれば、患者の年齢、体重、症状、投 与方法等に応じて、適宜適当な投与量を選択することが可能である。投与量、投与 方法は、本発明の医薬組成物の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や 年齢、症状等に応じて、当業者であれば適宜選択することが可能である。例えば、ァ ルツハイマー病治療などにぉ 、て、脳神経細胞の変性保護を目的とした投与を行う 場合には、上記化合物が標的とする細胞周囲において神経変性を有効に抑制する 濃度となるように投与されることが好ましい。すなわち、ヒユーマニンポリペプチドまた はこれと同等の神経細胞死保護作用を有するものであれば、少なくとも InM以上、 好ましくは ΙΟηΜ以上、より好ましくは ΙΟΟηΜ以上、より好ましくは 1 μ Μ以上となるよ うに投与されるべきである。 [0037] 本発明の抗体としては、等業者に公知の任意の形態及び種類を含む。例えば、ポリ クローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びに、当業者に公知の遺伝子工学的手 法により調製することが可能な各種ヒト化抗体などのキメラ抗体も含まれる。
実施例
[0038] 以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲は これらの記載によって何等制限されるものではない。
[0039] 実験材料と実験方法
細 伝子
神経ハイブリッド株 F11細胞及び V642I- APP、 K595N/M596L- APP (NL- APP)、 Ml 46L-PS1、 N141-I-PS2 cDNAをコードする pcDNA3ベクターについてはすでに記述 された通りに調製した (Hashimoto et al.， 2000, 2001a, 2003)。 PCAG- human gpl30と pCAG- human gpl30 ED (細胞外ヒト gp 130)については報告に従った（Kumanogoh et al, 1997) o gpl30の細胞膜ドメインと種々の細胞内ドメイン部分に G- CSFリセプター の細胞外ドメインを融合した pcDNAベクターにつ!/、ては報告に従!、調製した (Fukuda et al, 1996)。 gpl30の細胞内ドメインは C端力も短縮された。 G277と称するキメラタ ンノクは gpl30の細胞内ドメイン全長 277アミノ酸を含み、 G- 195、 G- 133、 G- 68、 G- 25は細胞内ドメインアミノ酸 1-195、 1-133、 1-68、 1-25を含む。 C末端に mycHi sタグをつけたヒト WSX- 1、 mycHisタグをつけたマウス CREME9はヒトおよびマウス胚 c DNA(BioChain)よりセンス、アンチセンスプライマのセットをもちい、ヒト WSX-1には (5， -ACTAGTACCATGCGGGGAGGCAGGGG-3 ' と 5， - GAATTCGGCCAGAACCTG TGGCCTGG— 3，）、マウス CREM9には（5，— GGATCCACCATGAAGGGCGCGATGG AGCC-3' と 5，— GAATTCAAATACCAGCACTTTCCATCCAGG— 3，）を用いて PCR により増幅した。 C端に V5タグをつけたヒト CNTF- R(V5- CNTF- R)とラット IL- 6R(pUC M18-rat IL-6R)をコードするプラスミドはインヴィトロジェンとアメリカンタイプカルチヤ 一コレクションから各々購入した。家族性 ALS(FALS)遺伝子 G85R-SOD1を pEFBosベ クタ一にコードするプラスミドは辻省次博士より贈与されたものである（Hashimoto et a 1., 2001a, Kanekura et al, 2004) 0ヒト野生型 gpl30のコスミドは全長 gpl30を pAxCAw t(TaKaRa)の Swalサイトに挿入することにより構築した。 [0040] リコンビナントサイト力インと可溶性リセプター
マウスカルディオト口ピン 1 (CT1) ,ラッ HL- 6、マウス LIF、マウス IL11、可溶性ラッ HL - 6R、可溶性ヒト CNTF- R,リコンビナントマウス gpl30/Fcキメラとリコンビナントヒト可 溶性 CNTF- Rは R&Dシステム（ミネアポリス、ミネソタ、 USA)力 得た。ヒ HL- 6、ヒトォ ンコスタティン\1、ラット CNTF、ヒト GCSFはぺプロテック EC Ltd (ロンドン、 UK)から得 た。ヒト CNTFは R&Dシステム或いはべプロテック EC Ltd.から得た。ヒト IL- 27は R&D 社から入手した。
[0041] 碰
抗マウス APP抗体（22C11)と抗マウス PS1抗体はケミコン（Ternecula, CA, USA)より 、抗 PS2抗体と phoshoSTAT3(Tyr7°5)抗体はセルシグナリングテクノロジー（Beverly, M A, USA)より購入した。 HRP結合或いは非結合抗 mycモノクローナル抗体はバイオモ ル（Plymouth Meeting, PA)より購入した。 HRP結合或いは非結合抗 V5抗体はインヴ イトロジェンカも購入した。ラビットポリクローナル抗 HN抗体 P04は報告したように作成 した（Tajimaet al, 2002) 0抗 G- CSFR, gpl30, CNTF- R, LIFR, SOD1, STAT3, IL- 6 R抗体はサンタクルツバイオテクノロジー（サンタクルツ、 USA)力も購入した。抗リン酸 化チロシンモノクローナル抗体、 4G10はアップステート USA (チヤ一口テスヴィレ、ノ ージ -ァ、 USA)から購入した。ふたつのラビットポリクローナル抗体、抗マウス WSX-1 抗体は WSX-1の N末 16アミノ酸に相当する合成ペプチド MNRLRVARLTPLELLL(mW SX- 1- N)と C末 16アミノ酸に相当する合成ペプチド YSGYEKHFLPTPEELGLLV(mWS X-1-C)をキーホールリンペットへモシァニン（Sigma)に共有結合した物を免疫して得 た。また、同様にしてふたつのラビットポリクローナル抗ヒト WSX-1抗体は WSX-1の N 末 17アミノ酸に相当する合成ペプチド MRGGRGAPFWLWPLPKC(hWSX- 1-N)と C末 20アミノ酸に相当する合成ペプチド LPTPEELGLLGPPRPQVLAC(hWSX-l-C)をキ 一ホールリンペットへモシァニン (Sigma)に共有結合した物を免疫して得た。抗マウス gpl30中和抗体、抗マウス LIFR中和抗体、抗マウス IL- 11R中和抗体、抗ヒト CNTF- R 中和抗体、抗ラット CNTF-R中和抗体は R&Dシステム力 購入した。他のモノクロ一 ナル抗体、抗マウス gpl30、 RX435は慶應義塾大学医学部、福田博士より贈呈された 。 Baxに対する抗体はサンタクルツバイオテクノロジーより購入した (P-19)。 [0042] ペプチド
合成 HNゝ合成 S14G- HN (HNG)、 C8A- HN (HNA)、ヒトアミロイド- j8 (1—42)ぺプ チドはペプチド研（箕面、大坂）から購入した。 Biotin-HN, Biotin-HNGは神戸天然物 化学株式会社より購入した。
[0043] トランスフ クシヨン、細朐死アツセィ、細朐生存率アツセィ
トランスフエクシヨンの方法は以前報告した（Hashimoto et al., 200, 2001a, 2003)。 F 11細胞を 7xl04Zwellで 6wellディッシュにまき、指示されたベクターを導入した。導入 効率はこのプロトコールで一定して約 70%であった。導入後 72時間で、トリパンブル 一除外アツセィ及び LDHアツセィにより細胞死率をもとめ、 WST-8アツセィにより細胞 生存率を求めた（Hashimoto et al., 2000, 2001a, 2003)。通常トランスフエクシヨン開 始後 5時間後より HNを添加した力 HN効果はほぼ同様のため、一部の実験では HN を添加する時間を 24時間後にした。
[0044] 初代谘着皮皙神終 細朐牛存率アツセィ
初代培養マウス皮質-ユーロン (PCN)は以前報告した方法で準備した (Sudo et al, 2000) o簡単に述べると、初代培養皮質ニューロンは ICRマウス 14日胚 (E14)より得、 ポリ Lリジンを表面処理した 96穴プレート (住友ベークライト)に-ユーロン培地を使い 2. 5或いは 5xl04Zwellで播種した、或いは 6穴プレートに 1.0xl06/wellで播種し、ニュ 一ロンメディア（住友ベークライト）を用いた。（Hashimoto et al., 2003, Niikura et al., 2004) o 3日後、細胞培地を N2サプリメントを含む DMEMに交換した。 4日目にヴィト口 で 25 Mの A |8 1-43を示した濃度の HN或いはサイト力インとカロえ、可溶性サイト力 インリセプター、あるいは中和抗体の存在下、非存在下でその影響をみた。処理後 7 2時間で WST-8又は力ルセイン蛍光法で細胞生存率を、トリパンブルー排除アツセィ 又は LDHアツセィにより細胞死亡率を求めた（Hashimoto et al., 2000, 2001a,b, 2003
) o
[0045] 免疫带光を某盤 した結合アツセィ ( 1)
Fl 1細胞（6穴プレートに 7xl04Zwell)に示された量の V5- CNTF- Rか mycHis- WSX -1をコードする発現プラスミドを必要に応じて PCAG- human gpl30と一緒に導入し、 その 24時間後に 96穴プレート（7xl03Zwell)に播き直した。導入後 36時間目で、 1 OOnMのピオチンを標識した HNG- FLAGを 10 μ Μの HNG (S 14G- HN)あるいは HNA (C8A-HN)存在下あるいは非存在下で添加した (Hashimoto et al.， 2001a)。 6時間の 反応後細胞を 4%パラフオルムアルデヒド ZPBSで 30分間固定した。 PBSで洗浄後細 胞を FITCを結合させたアビディン（モレキュラープローブ、ユージン、オレゴン、 USA) で染色した。免疫蛍光強度を (励起 =485nm,放出 = 535nm)蛍光吸収測定器 (Wallac 1420 ARVOsx Multi Label Counter)で測定して得た。免疫ヒストケミカル解析がレー ザ一スキャニング共焦点顕微鏡 LSM (Carl Seiss, Germany)によりなされた。
[0046] 免疫带光を某盤 した結合アツセィ (2)
Fl 1細胞（6穴プレートに 7xlCTZwell)に示された量の V5- CNTF- Rか mycHis- WSX -1をコードする発現プラスミドを必要に応じて PCAG- human gpl30と一緒に導入し、 その 24時間後に poly- L- lysineコートした 96穴プレート（7xl 03Zwell)に播き直した。 導入後 36時間目で、表示された濃度のピオチンを標識した HNあるいは HNGを表示 された濃度の HNG (S 14G-HN)あるいは HNA (C8A- HN)存在下あるいは非存在下 で添カ卩した (Hashimoto et al.， 2001a)。 6時間の反応後細胞を PBSで洗浄後 FITCを結 合させたアビディン（モレキュラープローブ、ユージン、オレゴン、 USA)で染色した。 免疫蛍光強度を (励起 =485nm,放出 = 535nm)蛍光吸収測定器 (Wallacl420 ARVO sx Multi Label Counter)で測定して得た。免疫ヒストケミカル解析がレーザースキヤ ユング共焦点顕微鏡 LSM (Carl Seiss, Germany)によりなされた。
[0047] プルダウンアツセィ
F1 1細胞（6穴プレートで 7xl04/well)に mycHis- WSX- 1、 V5- CNTF- Rあるいはラ ッ HL- 6R (V6タグ)をコードするプラスミドを導入した。導入後 48時間で細胞溶解液（ セルライセート）をセファロース 4B- HN或!、は HNAでプルダウンアツセィをするために 採取した。セファロース 4Bと HNあるいは HNAの結合反応は製造会社 (Amersham Ph armacia Biotech,ァプサラ、スエーデン）の指示どおり 3mlの CNBr-活性化セファロー ス 4Bと 5mgの HN或いは HNAとをカップリングバッファ一中（0.1M NaHCO 0.5M NaCl
3
, pH8.3) 4°Cで一晩反応させた。ビーズは非特異的結合を防ぐためブロッキングバッ ファー（0.2Mグリシン、 pH8.0)に 2時間室温で反応させその後カップリングバッファー で洗浄し、プルダウンアツセィまで 4°Cで保存した。各プルダウンアツセィにおいて、 1 00 1の細胞溶解液にたいして 20 1の 1： 1セファローススラリーを用いた。
[0048] 免疫プロット分析
セルライセート（10-20 μ g/lane)或 、はプルダウン沈殿物をすでに報告したように
SDS-PAGEに処し、ゲル上で分画されたタンパクを PVDF膜に移した（Hashimoto et a
1., 2000) o免疫反応を起こしたタンパクバンドを ECL法（Amsharm Pharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden)〖こより可視ィ匕した。
[0049] プラスミドを某盤とした小 RNAi
マウス FPR2、マウス CNTF- R、マウス WSX- 1、マウス IL- 6R、及びマウス LIFRに対す る小インターフェアリング RNA (sRNAi)をコードするプラスミドベクターを以下のように 構築した。
マウス FPR2
センス DNA断片：
TAGTGGTAGTTATTTTTTCCAAAAGCTTGCA-3 '、
アンチセンス DNA断片： 5 ' -TGCAAGCTTTTGGAAAAAATAACTTACCACTAAGC マウス CNTF- R
センス DNA断片： 5 ' - TTGGATCCCGTGTGTGCTGTGCCATCCGAGATTGATATC アンチセンス DNA断片：
TCTCGGATGGCACAGCACACGGGATCCAA-3，。
マウス WSX- 1
センス DNA断片： 5 ' -TTGGATCCCATATCCACTTGAGAGAAGATCTTGATATCC アンチセンス DNA断片： 5 ' -AAGGTACCTTGGAAAAAAATATCCACTTGAGGAAG マウス IL-6R アンチセンス DNA断片： 5 ' -GCAAGCTTTTGGAAAAAATTTAAGCTGTGAAACGC マウス LIFR
センス DNA断片： 5 ' -TTGGATCCCATATCCACTTGAGAGAAGATCTTGATATCC アンチセンス DNA断片： 5 ' -AAGGTACCTTGGAAAAAAATATCCACTTGAGGAAG マウス Bax
センス DNA断片： 5， - CGGGATCCCATGATCTGTTCAGAGCTGGTGTTGATATC アンチセンス DNA断片： 5 ' -GGGGTACCTTGGAAAAAAATGATCTGTTCAGAGCT これらの DNA断片は製造元の指示にしたがって加熱、加冷によりァニールさせた。こ れらァニールしたプライマーと pRNAU6.1/Shuttle空ベクター（GenScript, NJ, USA)を BamHlと Kpnlを用いー晚 37°Cで消化反応させた。切られた DNA断片と空ベクターは GENE CLEAN IIキット（Q BlOgene, USA)で精製した。ライゲーシヨンは Ligation Con venienceキット（NIPPON GENE, Tokyo, Japan)を用いてキットの指示にしたがって行 つた。これらの siRNAベクター配列は直接配列を測定して確認し、 siRNAプラスミドの 効果は以下に述べるリアルタイム PCRによって確かめた。
リアルタイム PCR
内在性の mRNAを査定するためリアルタイム PCRを実施した。 ISOGEN試薬（NIPPO N Gene, Toyama, Japan)で RNAを抽出し、つづいて、リアルタイム PCRを行った。 Firs t strand cDNAを Sensiscript逆転写酵素（QIAGEN, Germany)により 0.5mgのトータル RNAから合成した。リアルタイム PCRは QuantiTect SYBR Green PCRキット（QIAGEN )を使って実施し、つづいて ABI PRISM7700 (Applied Biosystems, Foster City CA) で分析した。センスプライマーとアンチセンスプライマーのセットを以下のように作成し た。マウス CNTF— Rには 5，— TTCCACCGTGACTCCTGCACCTG— 3，、 5，— GAGGGC TGGGTCCTTCTCACAGAC-3 ' 'マウス WSX— 1に ίま 5， -CCGCAGAAAGCTCTCAC CTGTCAG— 3，， 5，— CCATGGATATCCGTTCTCCACCTG— 3，、マウス LIFRには 5，— GTGGAAGATACGTCGGCAGACTCG- 3，， 5 ' -ACCCTGAAGGTCAGCAATCCTC AG- 3，、マウス IL- 6Rには (5，- CCCTGCCAGTATTCTCAGCAGCTG- 3，， 5，- CGG CCTTCCAGGTATGGCTGATAC— 3，）、マウス IL—6Rには 5 '—CCCTGCCAGTATTC TCAGCAGCTG— 3，， 5，— CGGCCTTCCAGGTATGGCTGATAC— 3，、マウス Baxに は 5， - GGAATTCACCATGGACGGGTCCGGGGAGCAG-3 ' , 5， - GGGGTACCGC CCATCTTCTTCCAGATGGTGAG— 3，，ヒト及びマウス G3PDHには 5，— TCCACCAC CCTGTTGCTGTA— 3 'と 5 '— ACCACAGTCCATGCCATCAC— 3 'である。データ解析 は sequence Detection System ver. 1.9.1 (Applied Biosystem)でおこなつァこ。 ^mRNA 発現レベルを調整するために G3PDH mRNAをコントロールとして用いた。
[0051] 統脑析
すべての細胞死実験、細胞生存実験、リアルタイム PCR、は n=3で行った。ヴィト口 実験の図におけるすべての値は平均^ ±SDである。 Varianceの分析による統計処 理がなされ、つづいて p〈0.05で有意とされる post hocテストがなされた。
[0052] 結 1 :
ある種のタイ口シンキナーゼゃ STAT3が HNを介する神経保護作用シグナル経路に 含まれている（Hashimoto et al.， 2005)ということを考慮すると、 HNリセプターがサイト 力インリセプターファミリーに属すると考えられる。 gpl30は IL6Rリセプターファミリーに 属するサイト力インリセプターに共通のサブユニットである力 その細胞外ドメイン及 び細胞膜ドメインを (gpl30tr)を強制発現する力、あるいは、ヒト gpl30の細胞外ドメ イン（gpl30ED)力 成るリコンビナント可溶性ヒト gpl30を添加すると、図 1Aと図 1B に示すように、 V642I-APPの過剰発現による毒性 (A)及び Mの A j8による毒性（ B)にたいする、 HNを介する神経保護作用を完全に抑制する。 gpl30EDと gpl30trは ドミナントネガティブ型として働くことが示されているので（Kumanogoh et al, 1997; Jo stock et al, 1998)、この結果は HNを介する神経保護作用のシグナルは gpl30を介 していることを意味している。我々はさらにこの結果を確認するため、抗 gpl30中和 抗体を反応させてこのシグナルにどう影響するかを調べた。この抗マウス gpl30抗体 (RX435)はマウス gpl30の機能を阻害し、ヒト gpl30の機能は阻害しないことがすで に示されて 、るが、この抗体は Fl 1細胞にぉ 、て HNを介する神経保護作用を抑制し (図 1C)、一方、その抑制はこの抗体に対して感受性のないヒト gpl30の同時発現に より抑えられている（図 1D)。この結果は明らかにこの HNシグナルに gpl30が関与す ることを意味している。
[0053] 結果 2 :
さらに HNの神経保護作用シグナルにおける gpl30の介入を確認するために、種々 のキメラタンパク、すなわち細胞外ドメインを G- CSF、細胞膜ドメインを gp 130、細胞 内ドメインを種々の長さに C端を短縮したヒト gpl30を構築した（Fukuda et al.， 1996) 。 G277と称するキメラタンパクは gpl30の細胞内のすべてのドメインを、 G-195、 G-133 , G-68, G- 25、は各々、細胞内の 1-195, 1-133, 1-68, 1-25番目のアミノ酸を含むも のである（細胞内ドメインの N末端アミノ酸を 1番目とする）。まず、最初にこれらのキメ ラタンパク質の発現を確認した（図 2A)。 G-277を発現させ ΙΟΟηΜ G- CSFで刺激す ると V642I-APP発現により誘導される神経細胞死を抑制する。ところが、 G-25あるい は G-68を発現させて同様に刺激してもその細胞死を抑制することはできな力つた (図 2B)。 G-133が発現している場合は、同様の刺激は中間的にその細胞死を抑制した（ 図 2B)。以前の研究で gpl30の細胞内ドメインの 3番目のチロシンが（これは G-133に 含まれて 、る）プロ B細胞（proBcells)における抗ァポプトーシス効果に必須であること が示されているので（Fukudaet al.， 1996)、 134-277に相当するドメインが介在する別 のシグナルが AD関連の傷害による神経細胞死を 100%保護するためには必要であ ることが推測された。同様に、 G-277が発現されていると ΙΟΟηΜの G- CSFによる刺激 で NL-APP, M146L-PS1, N141I-PS2による神経細胞死を防御する力 一方、 G-25が 発現されたときは防御しなカゝつた（図 2C)。これら AD関連神経細胞死と対照的に 100 nMの G-CSFは家族性筋萎縮性側索硬化症の原因遺伝子として今までに示された C u/Zn-SOD 1変異体遺伝子が弓 Iき起こす神経細胞死を防御しな力 た（図 2D)。また 、 HN処理により gpl30のリン酸化レベルの増加が見られた（図 2E)。
[0054] 結果 3 : HNリセプターの分子的基盤を探究するため、今まで知られている IL-6ファミリーの サイト力インが HNを介する神経保護作用を模倣できるかどうか調べた。図 3Aに示さ れるように、マウスカルディオト口ピン一 1 (CT- 1)、ラッ HL- 6、マウス IL- 11、ヒト OSM、 マウス LIF、マウスの CNTF-Rに結合可能であるヒト CNTFのどれもが生理的レベル（1 OOng/mlまで）で A j8が誘導する F11の細胞死を抑制しなかった。このことは V642I-A PP過剰発現による神経細胞死に対しても同様であった (データを示さず)。
[0055] IL-6リセプター、 IL-11リセプター、 LIFリセプター、あるいは CNTFリセプターと gpl30 力 SF11細胞及び初代培養脳皮質神経に発現して 、るので (YHと M.Mの未発表見解） これらリセプターのサブユニットと組み合わせられた機能的 IL- 6リセプター、 IL-11リセ プター、 OSMリセプター、 LIFリセプター、あるいは CNTFリセプターが生成されるはず である。従って、 IL- 6, IL-11,CT-1, OSM,LIF,そして、 CNTFが誘導する gpl30を介し た経路は AD関連の傷害による細胞死には不十分であるという結論に達した。以上の 知見から、 HNがこれらのサイト力インリセプターと結合して神経保護作用を発揮して V、ると 、う可能性は考えられな 、。
[0056] 結果 4 :
IL-6が介するシグナルを増大させるため、我々は可溶性 IL-6リセプターひ（SIL-6R) 或いは可溶性 CNTF-R(100 ng/ml)を添加し、それぞれのリガンド IL-6および CNTF ( 100 ng/ml)で刺激し A |8による神経細胞死にたいする影響を調べた（図 3B)。予想通 り IL- 6は sIL- 6Rを発現させておくと gpl30のホモ二量体化を誘導し、 HNと同様の活 性を示した。これに反して CNTFは可溶性 CNTF-R(sCNTF-R)を過剰発現させても H N様の活性を示すことはなかった。 CNTFの CNTF- Rへの結合は gpl30と LIF- Rとのへ テロ二量体ィ匕により細胞内シグナルを伝達することを考慮すると LIF-Rは HNを介する 神経保護作用には関与して 、な 、と推測される。
[0057] 結果 5 :
gpl30結合受容体に対する中和抗体を用いて我々はさらに既知の gpl30にカップ ルするリセプターが HNを介した神経保護作用に関与して ヽるかどうかを調べた。その 結果、抗ラット CNTF-R中和抗体はマウス CNTF-Rも認識すると考えられている力 こ の CNTF-Rに対する抗体が HN活性を消去することを見い出した（図 3C)。図 3Bにお ける CNTF/可溶性 CNTF- Rにつ!/、ての結果と合わせて考えると、 CNTF- R力 Sリガンド CNTFと会合し gpl30と LIFRとのへテロ二量体化を導く本来の形と全く違った形で HN シグナルに関与していると考えられる。さらに、 IL-6Rと LIF-Rに対する特異的な siRN Aをコードしたベクターを作成した（図 3D)。これらベクターを F11細胞に発現させ内 在性 IL-6Rあるいは LIF-R発現を低下させることで、 HNを作用させたときの STAT3の リン酸化を減弱させることはできなかった（図 3E)。このことは HNが IL-6Rや LIF-Rを 介して細胞生存シグナルを伝えて ヽな 、ことを裏づけて 、る。
[0058] 結果 6 :
更に、 HNリセプター（HNR)分子基盤を探索するために、 gp 130とリセプター複合体 を形成する（Pflanz et al., 2004) IL- 27受容体である WSX- 1( Specher et al., 1998)、 C NTF-R、及び、 gpl30と複合体を形成すると予測されるが未だあまり調べられていな いリセプター CREME9(CRL4) (Boulay et al., 2003)を Fl l細胞株に過剰発現させるこ とにより免疫蛍光 HNとの結合アツセィを内在レベルの HNRと HNの結合が反映されな Vヽ条件 (免疫蛍光を基盤とした結合アツセィ（1) )で行った。
[0059] F11細胞にヒト WSX-1或いはヒト CNTF-Rを発現させると HN結合が増加した力 CR EME9を同様に発現させても HNの結合量は増えなかった（図 4A)。同じアツセィにお いて、 CNTF-Rと WSX-1の同時過剰発現は HN結合量を相乗的に増加させた（図 4A ) o各々のタンパク質の発現は免疫プロットにより確認した。この結果は CNTF-Rと WS X-1力 ¾NRの成分であることを示唆している。 HNが特異的に WSX-1と結合するかを 確認するために、 HNの 1000倍活性の誘導体 HNG或いはネガティブコントロールとし て活性のな!、HNAの多量存在下で HN結合実験をおこなった（図 4B)。 WSX- 1と gpl 30を発現した細胞において HNの結合を HNGは抑制したが HNAは抑制しなかった。 このことは、 HNが WSX-1に特異的に結合することを示している。 HNあるいは HNAを 共有結合させたセファロース 4Bビーズによる In vitroプルダウンアツセィにおいて、 H Nは F11細胞中に過剰発現させた CNTF-Rと WSX-1に結合する力 IL-6受容体に 結合しないことを見いだした（図 4C)。また、 HNと異なり、 HNAはこれら受容体と結合 しな！/、ことを確認した（図 4C)。
[0060] 結果 7 : HNを介する神経保護作用シグナル〖こ CNTF-Rと WSX- 1の関与を確認するために 、プラスミド siRNA法をもちいて、これらタンパクの発現を F11細胞株においてノックダ ゥンした。この方法の効率はリアルタイム PCRによる mRNAとウェスタン法による蛋白定 量により検討した (Sui et al.， 2001, Kanekura et al.， 2004) (図 5A)。ネガティブコント口 ールとして、最近発表された HN受容体であるマウス FPR-2 (Ying et al.， 2004)の siRN Aを用いた。図 5Bに示すように、内在性 WSX-1発現を阻止すると、 V642I-APP過剰 発現による神経細胞死に対する HN活性が完全に消滅した。 CNTF-R発現を抑制す ると、 HN活性がコントロールにくらべ 30%減少した。ところが、 FPR-2発現を抑制して も HN活性は減少しなかった。更に、ヒト CNTF-Rあるいはヒト WSX-1を各々発現させ るとマウスの CNTF-Rおよび WSX-1の siRNAによって抑制されていた HN活性は完全 に回復した（図 5C)。以上の結果は CNTF-Rと WSX-1が HNのリセプターの成分であ ることを強く支持するものである。 CNTF-Rの中和抗体カ!"^活性を完全に阻害するこ と（図 3C)、一方 siRNAによる CNTF-Rの発現抑制が WSX-1の場合に比べて不完全 であることを考えると（図 5A)、 CNTF-R発現の不完全な抑制の為に、図 5Bにおいて HN活性を完全に押さえられなカゝつたと考えられた。
[0061] 結 8 :
CNTF-Rが WSX-1と複合体を形成し得るかを調べた。 mycタグをヒト WSX-1に付け 、 V5タグをヒト CNTF-Rにつけて COS7細胞に過剰発現し、共免疫沈降実験により、 解析した。図 6Aに示されるように、 WSX-1の免疫沈降は CNTF-Rを共沈させ CNTF- Rの免疫沈降は WSX-1を共沈させた。このことは WSX-1が CNTF-Rと結合しているこ とを示唆している。
[0062] 結果 9 :
HN処理により CNTF- Rと WSX- 1、あるいは WSX- 1と gpl30の結合が誘導される。図 6 Bで示すように、 F11細胞に ΙΟηΜの HNGあるいは HNA処理をして、 0、 1、 3、 6時間 後に細胞回収し、 gpl30抗体及び CNTF-R抗体で免疫沈降し、その沈降物を mWSX -1抗体で免疫プロット解析を行った。その結果、 HNG処理により特異的に内在レべ ルの発現において、 CNTF-Rと WSX- 1、あるいは WSX-1と gpl30の結合が誘導される ことが明らかになった。 [0063] 結果 10 :
IL-27は WSX-lZgpl30をその受容体とすることが報告されている。従って、 IL-27は HNと同様な効果を示す可能性がある。予想通り、 F11細胞に対して、 IL-27を処理す ると、高濃度領域（1-10 /z M)で HN様効果を示した。し力も同時に、 ΙΟΟηΜ以下の IL -27処理は逆に HNの効果を抑制することが判明した（図 7)。
[0064] 結果 11 :
さらに、より感度の高い免疫蛍光を基盤とした結合アツセィ（2)を開発し、内在レベル の HN受容体との結合を検出することに成功した。このアツセィ方法を用いて、 HNある いは HNGと HNRの結合の強さを内在レベルの HNRをもつ F11細胞（図 8、左の 2パネ ル）と CNTF- RZWSX- lZgpl30をトランスフエクッションにより高発現させた F11細 胞（右の 2パネル）を用いて結合アツセィを行った。上 2パネルは HN、下 2パネルは H NGの結合を検討した。その結果、 HNと HNGは各々、 10 Mと ΙΟηΜの濃度で飽和 する濃度依存性の結合を示し、各々の KDは 1-10 μ Μと 1-ΙΟηΜの範囲にあることが 判明した。結合の特異性はピオチンラベルのして 、な 、HNと HNGを過剰量添加する ことで結合がほぼ完全に抑制されることで確認された。以上で得られた HNあるいは H NGと HNRの結合のパラメータ一は以前の研究で報告した (Hashimoto et al.， 2001 a, b) HNあるいは HNGの神経細胞死抑制活性のパラメーターとほぼ完全に合致した（ 図 8A)。
[0065] 結 12：
また、 HNあるいは HNGと内在レベル HNRの結合が CNTF- Rと WSX-1発現に依存す ることを siRNAの手法を用いて、内在性の CNTF-Rと WSX-1発現を低下させた Fl 1細 胞で各々の活性が影響をうけるかどうかを検証することにより、確認した (図 8B)。図 8B に示すように内在性の CNTF-Rあるは WSX-1発現を低下させた Fl 1細胞では著明に 両者の結合が低下し、 CNTF-Rと WSX-1両者を同時に発現低下させるとほぼ完全に HNある!/、は HNGと Fl 1細胞との結合が阻止された。 FPR2あるいは LIFRの発現低下 により、結合は影響を受けなかった。これらの事実は、 HNあるいは HNGと F11細胞と の結合は CNTF-Rと WSX-1発現に依存することを意味している。
[0066] 結果 13 : さらに、より生理的な神経細胞である PCNを用いて、 F11細胞で既に観察した（図 7) と同じく、高濃度 IL-27,CNTF処理が HNと PCN細胞の結合を阻害するかどうか検討し た。 F11細胞での結果と同じように、 ΙΟΟηΜ-1 Mの IL- 27処理は HNの PCNへの結 合を抑制することが判明した（図 9A)。また、同濃度の CNT-Fも IL-27と同じく HNの PC Nへの結合を抑制するが、 IL-6にはそのような効果がないことが明らかになった。
[0067] 結果 14 :
結合阻害実験の結果に合致するように、 F11細胞と同じパターンで、 PCN細胞にお いても高濃度 IL-27は HN様効果をもち、かつ、 HNの機能を抑制することが示された（ 図 9B)。また、 CNT-Fも IL-27と同様に HNの機能を抑制すること、さらに、 HNの機能 は WSX-1抗体 (mWSX- 1-N)処理で抑制されることも判明した。これらの結果は PCNに おいても F11細胞と同じぐ HNは CNTF-RZWSX-lZgpl30を受容体として機能し ていることを支持している。
[0068] 結 15：
実際 PCNには F11細胞と同じぐ WSX-1の発現が確認された（図 10A及び B)。
[0069] 結 16：
Fl 1細胞にお!、て CNT- Fや IL- 27処理は STAT3の 706番目のチロシンリン酸化を亢 進させる力 HNや HNGも STAT3をリン酸化することをみいだした（図 11A)。さらに、 si RNAを用いて内在性 CNTF-Rある!/、は WSX-1発現を低下させると HNGによる STAT3 の 706番目のチロシンリン酸化はほぼ完全に抑制された（図 11B)。この結果は HNあ るいは HNGは CNTF-Rあるいは WSX-1依存的に STAT3の 706番目のチロシンリン酸 化を引き起こしていることを意味ししている。
[0070] 結果 17 :
マウス Baxに対する特異的な siRNA(siRNA-Bax)を作成した。この siRNAを Fl 1細胞に 発現させると内在性の Bax mRNA量と蛋白量が著明に減少した（図 12A, B)。さらに 、スタウロスポリン誘導性の Fl 1細胞アポトーシスに対して siRNA-Baxは著明な抑制 効果示したため、この siRNA-Baxは有効に機能していると判断された（図 12C)。そこ で、 F11細胞の内在性 Baxの発現を siRNA-Baxで抑制し、 HNによる V642I-APPや M 146L-PS1高発現誘導性 F11神経細胞死の抑制効果に如何なる変化が出る力調べ た。陽性コントロールとして WSX-1に対する siRNAの効果を同時に検討した。まず、 V 642I-APPによる神経細胞死自体に siRNA-Baxが抑制効果をもつことが判明したた め、 V642I-APPによる神経細胞死を検出する系では HN作用に対する siRNA-Baxの 効果を検証することはできな力つた。一方、 M146L-PS1誘導性神経細胞死に対して は siRNA-Baxが抑制効果をもつことはなぐ従って HN作用に対する siRNA-Baxの効 果を検証することが可能であった。図 12Dで示すように、内在性の Bax発現を抑制し ても、 HNの M146L-PS1誘導性神経細胞死に対する抑制効果は全く影響を受けなか つた。従って、 HNの細胞死抑制効果は Baxの機能を抑制することで発揮されている のではないことが結論された。また、図 12Eで示すように内在性 WSX-1と CNTFR、発 現を同時に抑制した場合と異なり、内在性 Bax発現を抑制しても、 HNの F11細胞に 対する結合活性は全く抑制できな力つた。以上の 2つの結果は少なくとも F11細胞に お!ヽては HNのターゲットが細胞内の Baxではな!/、ことを支持して!/、る。
[0071] 以下に挙げる技術文献の内容は本明細書に引用され、その開示内容の一部と見 なされる。
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Claims

請求の範囲
[I] gpl30又はその部分ポリペプチド、 CNTF受容体 α鎖（CNTF— R)及び WSX— 1 力 成る群力 選択される少なくとも 2種の蛋白質を含むヒユーマニン受容体又はヒュ 一マニン様ポリペプチド受容体 (HNR)。
[2] gpl30又はその部分ポリペプチド、 CNTF— R及び WSX— 1から構成されるヒユー マニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体。
[3] gp 130又はその部分ポリペプチド及び WSX— 1から構成されるヒユーマニン受容体 又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体。
[4] gpl30の部分ポリペプチド力 少なくとも細胞内ドメインの 1-133番目のアミノ酸配列 を有する、請求項 1〜3のいずれか一項に記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマ- ン様ポリペプチド受容体。
[5] CNTF—R及び WSX— 1から構成されるヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリ ペプチド受容体。
[6] gpl30、 CNTF—R及び WSX— 1がヒト由来の蛋白質である、請求項 1〜5のいずれ か一項に記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体。
[7] 請求項 1〜6のいずれか一項に記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリべ プチド受容体に結合する化合物のスクリーニング方法。
[8] ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体に結合する化合物が、該 受容体の細胞外ドメインに結合する、請求項 7記載のスクリーニング方法。
[9] ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体に結合する化合物が、該 受容体の細胞内ドメインに結合する、請求項 7記載のスクリーニング方法。
[10] ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体に結合する化合物が、該 受容体ァゴ-ストである、請求項 7記載のスクリ一ユング方法。
[II] ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体に結合する化合物が、該 受容体アンタゴニストである、請求項 7記載のスクリーニング方法。
[12] 請求項 7〜： L 1のいずれか一項に記載のスクリーニング方法であって、
(a)ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体又はそれを構成す る少なくとも 1つのタンパク質に試験試料を接触させる工程、 (b)該受容体と該試験試料に含まれる化合物との結合特性を測定する工程、及び (C)該受容体に結合する化合物を選択する工程、を含む前記方法。
[13] ヒユーマニン又はヒユーマニン様ポリペプチドの存在下で、ヒユーマニン受容体又はヒ ユーマニン様ポリペプチド受容体又はそれを構成する少なくとも 1つのタンパク質に 試験試料を接触させることを特徴とする、請求項 12記載のスクリーニング方法。
[14] ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体又はそれを構成する少な くとも 1つのタンパク質が細胞で強制発現されて 、るものである、請求項 12又は 13に 記載のスクリーニング方法。
[15] ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体が、該受容体を構成する 少なくとも一つのタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターによって形質転 換された細胞で強制発現されているものである、請求項 12又は 13に記載のスクリー ユング方法。
[16] 該受容体と化合物との結合特性を、神経細胞死に対する拮抗作用又は抑制作用の 変化を検出することにより測定する、請求項 12〜15のいずれか一項に記載のスクリ 一ユング方法。
[17] 該受容体と化合物との結合特性を、 SATAT3の 706番目のチロシンのリン酸化の亢 進又は抑制を検出することにより測定する、請求項 12〜15のいずれか一項に記載 のスクリーニング方法。
[18] 無細胞系において実施する請求項 7〜12のいずれか一項に記載のスクリーニング 方法。
[19] gpl30、 CNTF—R及び WSX—1から成る群力 選択されるヒユーマニン受容体又 はヒユーマニン様ポリペプチド受容体を構成する少なくとも一つのタンパク質をコード する遺伝子を含む発現ベクターによって形質転換された細胞。
[20] ヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリペプチド受容体が強制発現されて 、る請 求項 19記載の形質転換細胞。
[21] gpl30、 CNTF—R及び WSX—1から成る群力 選択されるヒユーマニン受容体又 はヒユーマニン様ポリペプチド受容体を構成する少なくとも一つのタンパク質をコード する遺伝子がノックアウトされて 、る細胞。
[22] ES細胞である、請求項 21記載の細胞。
[23] 請求項 22記載の ES細胞に由来するヒト以外のノックアウト動物。
[24] ホモ接合体である、請求項 23記載のノックアウト動物。
[25] 齧歯類である、請求項 23又は 24記載のノックアウト動物。
[26] 請求項 1から 6のいずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリぺプ チド受容体に結合する化合物を有効成分とする神経細胞死抑制剤である医薬組成 物。
[27] 請求項 1から 6のいずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリぺプ チド受容体に結合する化合物を有効成分とする神経変性を伴う疾病の予防または治 療に用いられる医薬組成物。
[28] 請求項 1から 6のいずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリぺプ チド受容体に結合する化合物を有効成分とするアルツハイマー病の予防または治療 に用いられる医薬組成物。
[29] 請求項 1から 6のいずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリぺプ チド受容体に結合する化合物を有効成分とする筋萎縮性側索硬化症の予防または 治療に用いられる医薬組成物。
[30] 請求項 1から 6のいずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリぺプ チド受容体に結合する化合物を有効成分とする狂牛病の予防または治療に用いら れる医薬組成物。
[31] 請求項 1から 6のいずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリぺプ チド受容体に結合する化合物を有効成分とする血管性痴呆症の予防または治療に 用いられる医薬組成物。
[32] 請求項 1から 6のいずれかに記載のヒユーマニン受容体又はヒユーマニン様ポリぺプ チド受容体に特異的に結合する抗体。
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