WO2006117242A2 - Verfahren zur charakterisierung der transaktivierungs- und transrespressionsaktivität von glukokortikoidrezeptor-liganden in primären immunzellen - Google Patents

Verfahren zur charakterisierung der transaktivierungs- und transrespressionsaktivität von glukokortikoidrezeptor-liganden in primären immunzellen Download PDF

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    • G01N2333/723—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor

Definitions

  • the invention relates to a method for characterizing the transactivation and transrepression activity of glucocorticoid receptor (GR) ligands by gene and / or protein expression analysis in primary immune cells.
  • GR glucocorticoid receptor
  • Glucocorticoids are among the most commonly used drugs in the clinic. They have significant effects on the inflammatory and immune systems and on the metabolism. The different effects are mediated by different mechanisms via the glucocorticoid receptor (GR).
  • Selective glucocorticoid receptor (GR) ligands represent a new class of GR ligands that influence the GR mechanisms of gene regulation, transactivation and transrepression of genes, selectively agonistically or antagonistically.
  • a dissociation of the transactivation and the transrepression activity of GR ligands or of agonistic and antagonistic effects of GR ligands is possible. This is intended to selectively influence the therapeutic profile of GR ligands.
  • Examples include the application of GR ligands upon initiation of inflammation or detection of effects of GR ligand after metabolic loading or after administration of metabolism regulating hormones. This approach is associated with significant burden or unreasonable in human studies. On the other hand, under experimental conditions, the GR ligand-mediated gene regulation is examined directly in the extracted target organs or in organ samples. This approach is usually not possible for human studies.
  • the idea was to define genes in primary immune cells that, in their regulation, reflect the transactivation and transrepression activity of GR ligands.
  • GR ligands that, in their regulation, reflect the transactivation and transrepression activity of GR ligands.
  • the regulation of the selected genes by the selective GR ligands was further characterized in dose / effect and kinetic studies. Kinetic studies in animal models demonstrated the reproducibility of gene regulation under in vivo conditions.
  • GR ligands particularly suitable for detecting the transrepression activity of GR ligands in unstimulated primary immune cells was the suppression of gene expression of IL-1ß, IL-8, Rantes and especially TNF- ⁇ .
  • the parameters were able to characterize both the agonistic and antagonistic effects of selective GR ligands or standard glucocorticoids on the transactivation or transrepression activity of the GR both in vitro and after in vivo administration. The use of these parameters to characterize the molecular mechanism of GR ligands is new.
  • the detectability of the parameters in unstimulated primary immune cells also allows a direct determination of the parameters in blood samples of GR ligand-treated organisms. This provides easy accessibility for the examination material for in vivo investigations.
  • the parameters can be determined in blood samples from organisms treated with GR ligands, without an additional burden on the blood collection. An additional intervention for the administration of the corresponding GR ligand and for blood sampling is not necessary.
  • the mandatory blood volume for the examinations is less than one milliliter.
  • the parameters can be detected in whole blood assays, so that an impairment of the results, eg by cell separation, is eliminated. Commercially available detection systems are available for this purpose.
  • the parameters are suitable as biomarkers for the characterization of the molecular wVo mechanism of GR ligands in human studies.
  • the selected parameters for the transrepression (suppression of the expression of the inflammatory mediators IL-1ß, IL-8, Rantes and in particular of TNF- ⁇ ) additionally allow a characterization of the anti-inflammatory and immunomodulatory effect of GR ligands.
  • the transactivation and transrepression activity decisively determines the effects of GR ligands in the organism, the characterization of the defined gene and / or protein expression parameters in the unstimulated primary immune cells of the peripheral blood can contribute to the healthy already in early studies To obtain information about the molecular in vivo mechanism and thus the expected effect / side effect profile of the GR ligand (eg Phase I studies).
  • Primary immune cells in the sense of the patent are all immune cells of the living organism.
  • the immune cells of the blood, the bone marrow and the lymphatic organs are meant (eg thymus, spleen, lymph nodes, Peyer 's plaques). Very particularly preferred are the immune cells of the blood. Principle of the method
  • the method describes the characterization of the molecular mechanism of glucocorticoid receptor (GR) ligands (standard glucocorticoids and selective GR ligands) by analysis of gene and protein expression of GR-sensitive genes in primary immune cells.
  • GR glucocorticoid receptor
  • Selective GR ligands represent a new class of GR ligands that serve the two mechanisms of GR mediated regulation of gene expression, transactivation or transrepression of sensitive genes, to varying degrees. These may be agonists, partial agonists, partial antagonists and antagonists for the particular mechanism. According to the GR-mediated antiinflammatory, immunosuppressive and metabolic effects, indications for selective GR ligands may be indicated. inflammatory diseases or conditions with altered metabolic activity. An essential prerequisite for the discovery, successful development, and clinical use of such novel GR ligands is the characterization of their molecular mechanism in relevant in vitro and in vivo experiments and in Phase I and human clinical trials.
  • the aim of the method is to investigate the transrepression and transactivation activity of selective GR ligands and standard glucocorticoids by means of changes in gene and / or protein expression or protein release in experimental in vitro or in vivo studies as well as in phase I and human clinical trials unstimulated immune cells, in lymphoid organs and in the blood.
  • parameters were selected and analyzed in more detail. Key selection criteria were 1) the correlation of gene regulation with the transrepression or transactivation activity of selective GR ligands, 2) consistent gene regulation in unstimulated primary immune cells, and 3) rapid response in in vitro assays and good and sustained Detectability in wVo application of GR ligands.
  • HLA-DR co-processing molecules
  • CD86 co-processing molecules
  • IFN- ⁇ R1, TNF-R1, IL-1R1, IL-2R ⁇ , IL-13Ra, CXCR4, GITR cytokine receptors
  • other genes ⁇ 2 adrenoceptor, heme oxygenase 1, IL-2, MIF, annexin i, thrombospondin 1
  • Detection of the regulation of expression of the listed parameters may be accomplished by methods for mRNA detection (e.g., quantitative real-time PCR) and / or for protein detection (e.g., flow cytometry, immunoassays, Western blotting) in the primary immune cells.
  • mRNA detection e.g., quantitative real-time PCR
  • protein detection e.g., flow cytometry, immunoassays, Western blotting
  • Secreted proteins can be detected in culture supernatants, serum, plasma and other biological fluids.
  • the detection methods are known - they are also sufficiently described in the literature, so that their execution is possible.
  • the assays for GR ligand-mediated regulation of gene and / or protein expression can be used to detect the competitive or non-competitive agonist as well as antagonist activity of substances for the transactivation or transrepression mechanism of the GR. For the latter, the antagonization of the effects of another added GR ligand is examined. In in v / Vo experiments the antagonization of endogenous glucocorticoid effects can additionally be characterized.
  • the presented method is suitable for the characterization of the molecular mechanism of GR ligands in in vitro and in vivo experiments and in phase I biomarker assays and human clinical trials.
  • the adrenal glands of the healthy adult produce between 40 and 80 ⁇ mol (15 and 30 mg, 8-10 mg / m 2 ) of endogenous cortisone daily.
  • Plasma concentration is determined by secretion, inactivation rate, and free cortisol formation, and shows a clear circadian profile.
  • the circadian cycle, interactions with the autonomic nervous system and with physical and emotional stress, as well as the response to hypoglycaemia and systemic inflammation are controlled by the regulation of adrenal cortisone production by the hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) axis.
  • HPA hypothalamic-pituitary-adrenocortical
  • the hypothalamic corticotropin-releasing hormone (CRH) triggered by the above-mentioned stimuli induces the production of the adrenocorticotropic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which increases cortisone synthesis by stimulating the adrenal cortex.
  • ACTH adrenocorticotropic hormone
  • Systemically elevated glucocorticoid levels inhibit CRH synthesis and ACTH release as part of negative feedback regulation.
  • the 11 ß-HSD I catalyzes the conversion biologically inactive
  • 11-ß-HSD II promotes the conversion of active cortisol into inactive cortisone.
  • the system is localized mainly in the liver but also in other tissues, as well as in adipose tissue (Tomlinson JW;
  • the effects of glucocorticosteroids are mediated by the glucocorticoid receptor (GR).
  • GR glucocorticoid receptor
  • the GR belongs to the protein family of nuclear receptors that
  • Binding of their respective ligand can be activated as transcription factors and Influence the expression of certain target genes.
  • the binding of the ligand to the GR present in the cytoplasm of the cell induces a change in the receptor conformation, which in turn results in a translocation of the now ligand-bound GR into the cell nucleus.
  • the activated GR is able to influence the expression of target genes positively or negatively.
  • the GR In the case of positive regulation of gene expression (transactivation), the GR binds as a homodimer to specific sequences (glucocorticoid response elements, GREs) in the promoter of sensitive genes. That dimerization of GRs is a prerequisite for transactivation has been demonstrated by mutational analyzes in vitro and in vivo (Reichardt HM, Cell, 1998, 93: 531, Heck S, EMBO J. 1994, 13: 4087). However, recent findings suggest that many, but not all GR induced transactivation events are dependent on dimerization of the receptor (Rogatsky I, PNAS 2003, 100: 13845).
  • the ligand-activated GR is also able to inhibit the expression of certain target genes (transrepression).
  • the most common mechanism of negative regulation is by binding the activated GR as a monomer to other transcription factors already linked to the DNA. This binding suppresses the activity of the other transcription factors and thus also the expression of the target gene.
  • binding of the activated GR to so-called negative GREs occurs in promoters of some genes. In this case, the binding of the GR to a displacement leads to other transcription factors which are essential for the induction of the expression of the gene.
  • binding of the GR to the nGREs prevents transcription of the corresponding target genes.
  • the GR is able to intervene in certain signal transmission pathways of the MAP kinases and thus mediate its effects.
  • TAT tyrosine aminotransferase
  • glutamine synthetase or tryptophan oxygenase Becker PB, Nature 1986, 324: 686, Schmid E, Eur. J. Blochen). 1987.165: 499; Danesch U, EMBO J. 1987,6: 625; Gaunitz F, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002.296: 1026).
  • Glucocorticosteroids are also regulated by the regulation of the expression of some fat / protein involved in the fat balance. It has been shown that the hormone sensitive lipase HSL and the lipoprotein lipase LPL are up-regulated by glucocorticoids (Zilberfarb V, Diabetologia 2001, 44: 377).
  • VLDLR VLDLR
  • Anti-inflammatory and immunomodulatory activity is achieved by glucocorticoids by interfering with inflammatory signaling pathways. This is done either by inhibiting the activity of cells of the adaptive or innate immune system or by directly interfering with the pro-inflammatory, cytokine-controlled signaling pathways.
  • the main mechanism for the anti-inflammatory and immunosuppressive activity of glucocorticoids has been described as transrepression.
  • cytokines eg TNF- ⁇ , GMCSF 1 IL-1 ⁇ , IL-2, IL-3, IL-12
  • Chemokines eg IL-8, RANTES, eotaxin, MIP
  • enzymes iNOS, COX-2
  • ICM-1 Adhesion molecules
  • non-genomic effects such as disruption of MAP kinase signaling pathways, are also attributed to involvement in the anti-inflammatory and immunosuppressive effects of glucocorticosteroids.
  • glucocorticosteroids may also be associated with chronic excess of existing glucocorticoids (eg endogenous hypercortisolism or therapeutic glucocorticoid administration) but also a number of undesirable effects such as the induction of hyperglycemia and the onset of diabetes mellitus, hypertension, muscle atrophy and / or myopathy, trunk fatty tissue, osteoporosis, etc. to lead.
  • chronic excess of existing glucocorticoids eg endogenous hypercortisolism or therapeutic glucocorticoid administration
  • undesirable effects such as the induction of hyperglycemia and the onset of diabetes mellitus, hypertension, muscle atrophy and / or myopathy, trunk fatty tissue, osteoporosis, etc. to lead.
  • effects that interfere with the glucose and fat budgets are regulated to a significant degree by glucocorticoid-induced transactivation processes.
  • other enzymes involved in protein catabolism e.g. glutamate dehydrogenase, glutamate oxalate transaminase and serine dehydratase, induced by glucocorticoid administration (Timmerman M, Exp. Biol. Med. (Maywood) 2003,228: 100; Barouki R, Eur. J. Biochem. 186: 79; Su Y, Arch. Biochem., Biophys., 1992, 299: 239). Permanently upregulated gluconeogenesis can lead to hyperglycemia, insulin resistance, and diabetes mellitus.
  • the key enzymes of gluconeogenesis in the liver are induced by glucocorticosteroids.
  • Constant immunosuppression due to chronic glucocorticoid treatment or endogenous hypercortisolism may lead to an increased risk of infection.
  • the mechanisms involved are essentially those which are responsible for the therapeutic effects (anti-inflammatory and / or immunosuppressive).
  • the GR is also involved in the increased risk of infection by direct induction of viral promoters.
  • Selective GR ligands represent a new class of GR ligands that express the two mechanisms for regulating gene expression, transactivation, or the Transrepression of sensitive genes to a varying extent (Schaecke H, PNAS 2004, 101: 227 & Curr. Opin., Investig. Drugs, 2004, 5: 524).
  • Glucocorticoids and / or standard therapeutic glucocorticoids comparable, increased, reduced and reversed effects in the transactivation or in the transrepression and their different combinations are possible.
  • agonists may be agonists, partial agonists, partial antagonists and antagonists for the particular mechanism.
  • antagonistic effects are defined by the direct effects of GR ligands on the expression of sensitive genes and / or promoter constructs
  • antagonistic effects are characterized by inhibiting the effects of other ligands on the GR.
  • Corresponding example assays for this are listed below in the characterization of the molecular mechanism of two selective GR agonists (SEGRA), from WO 00/32584 Compound 1 and from WO 02/10143 Compound 2 from Schering AG.
  • transactivation agonistic ligands of the GR activate the receptor by their binding in the form that it is able to induce their transcription by binding to the GREs in promoter regions of sensitive genes.
  • antagonists are called antagonists.
  • Another group of ligands may be termed partial agonists or antagonists become. These induce only partially agonistic or antagonistic GR activities.
  • the antagonistic or partial agonist activities of GR ligands are dependent on the cellular background and the structure of the promoter, which regulates the expression of sensitive genes.
  • transrepression agonistic ligands of GR activate the receptor by their binding in the form that the ligand-activated receptor is able to inhibit the expression of certain target genes. This can be done by interaction and subsequent inhibition of the action of other transcription factors or by binding to negative GREs. Partial agonists, partial antagonists and antagonists in transrepression mediate this GR effect only partially and / or inhibit the agonistic action of other GR ligands in transrepression.
  • Treatment with selective GR ligands has its indications for use wherever standard glucocorticoids are indicated.
  • a dissociated effect on GR may be an advantage of the selective GR ligands in terms of reduced induction relative to standard glucocorticoids induction of adverse effects, i. lead to an improved effect / side effect profile.
  • selective GR ligands can be used to antagonize the adverse effects of existing GR ligands.
  • a selective substitution of deficient effects of the endogenous glucocorticoids by selective GR ligands is possible without the side effects of unwanted effects being mediated at the GR.
  • Glucocorticoids are among the most widely used anti-inflammatory and immunosuppressive drugs (Franchimont D, Ann NY Acad Sei. 2004, 1024: 124). However, their use is limited by some severe and non-reversible side effects. It has been shown that the transrepression activity of GR is essential for the anti-inflammatory and immunosuppressive effect of GR ligands, while important side effects (eg induction of GR ligands) are shown Gluconeogenesis) via transactivation (Schaecke H, Pharmacol. Ther. 2002, 96: 23).
  • Selective GR ligands with reduced transactivation activity with retained transrepression activity could be effective anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that induce, in comparison with standard glucocorticoids, reduced side effects mediated substantially via the transactivation mechanism.
  • endogenous cervical isolism A pathophysiological significance of a, z.T. Tissue-specific, increased activity of endogenous glucocorticoids is being discussed for a variety of diseases and syndromes (e.g., diabetes mellitus, stem adiposity, metabolic syndrome, hypertension, atherosclerosis). These syndromes are characterized by increased metabolic effects of endogenous glucocorticoids (including hyperglycemia, hyperlipidemia) with their adverse consequences. In addition, chronic low-level inflammation (Li JJ, Medical Hypotheses 2005, 64: 236; Wang M, Nutr. Metab. (Lond), 2005: 2, 3, Dandona P, Circulation. 111: 1448). However, treatment with standard glucocorticoids approved today is not indicated due to the expected increase in the undesirable metabolic effects.
  • Selective GR ligands with a (partial) antagonistic effect in transactivation could decrease the adverse metabolic effects of endogenous glucocorticoids via different mechanisms. These include the inhibition of endogenous glucocorticoid synthesis via inhibition of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis and the competitive and / or non-competitive antagonization of metabolic effects of endogenous glucocorticoids on GR. In addition, agonism of the selective GR ligand in transrepression could curb chronic inflammation. Treatment of conditions with a deficiency of metabolic effects
  • glucocorticosteroids In various predominantly severe diseases, the additional metabolic effects of glucocorticosteroids are desired. This includes cachexia, e.g. in tumors, cardiovascular diseases or HIV infection. However, these conditions are also characterized by an immune depression that would be exacerbated by treatment with standard glucocorticoids (Mulligan K, Int J Cardio, 2002, 35, 51; Tijerina AJ, Dimens Cht Care Nurs., 2004, 23, 237).
  • the direct detection of gene regulation in the primary immune cells can be carried out by mRNA detection, for example by RT-PCR or other amplification methods or methods for direct mRNA detection.
  • mRNA detection for example by RT-PCR or other amplification methods or methods for direct mRNA detection.
  • flow cytometry, immunoassays or Western ⁇ / of methods can be used for protein detection.
  • the protein detection can be carried out on or in the cells, in cell lysates or in the supernatants of cell cultures or in plasma, serum or other biological fluids.
  • the aim of the methodology is to characterize the molecular mechanism of GR ligands by means of the regulation of the expression of genes and / or proteins in primary immune cells
  • Prednisolone is the standard GK, compared to which the SEGRA substances should show an increased dissociation and which could be the reference substance in clinical studies with SEGRA development candidates. It is clear to the person skilled in the art that the normalization could in principle also be applied to any other glucocorticoid.
  • the prednisolone / GR ligand quotient was formed for gene suppression, ie a low value ( ⁇ 1) indicates a relatively weaker suppression by the GR ligand (higher value in the residual gene expression) Normalization of the quotient "GR ligand / prednisolone" is formed, ie a value ⁇ 1 indicates a relatively weaker induction by the GR ligand.
  • the aim was to characterize the extent of dissociation of a substance by a value that summarizes the different effects on the expression of various transrepression and transactivation parameters.
  • a dissociation factor was therefore defined which represents the dissociation of transactivation and transrepression activity on the basis of the induction or suppression of selected genes.
  • the ratio is thus the nth root of the product of n different prednisolone normalized transrepression parameters divided by the mth root of the product of m different prednisolone normalized transactivation parameters.
  • Suitable transrepression parameters are all known parameters, including the expression of co-accessory molecules (HLA-DR, CD86). Particularly suitable parameters are IL-1 ⁇ , IL-8, Rantes - particularly preferred is TNF- ⁇ .
  • transactivation parameters are all known parameters, including the expression of cytokine receptors (IFN- ⁇ R1, TNF-R1, IL-1 R1, IL-2R ⁇ , IL-13Ra, CXCR4, GITR) and other genes (ß2-adrenoreceptor, heme oxygenase 1 , IL-2, MIF, annexin 1, thrombospondin 1).
  • cytokine receptors IFN- ⁇ R1, TNF-R1, IL-1 R1, IL-2R ⁇ , IL-13Ra, CXCR4, GITR
  • ß2-adrenoreceptor heme oxygenase 1 , IL-2, MIF, annexin 1, thrombospondin 1
  • glutamine synthetase and GILZ are particularly those of CD163 and FKBP51.
  • any can be selected and used according to the above formula for determining the ratio according to formula 1.
  • TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ are preferably selected.
  • CD163 and FKBP51 are preferably selected.
  • a ratio between transrepression and transactivation parameters is formed according to the following formula 2:
  • RNA detection the total RNA was isolated from the respective samples (human PBMC or human whole blood or spleen cells of mice), transcribed into the cDNA and subsequently amplified and detected by means of real-time TaqMan PCR (Applied Biosystems). Relative quantitation compared to the HPRT housekeeping gene expression is shown, in each case the ratio of the result for the GR ligand to the result of the vehicle control.
  • Flow cytometric detection of the expression of receptors on the human immune cells was performed with commercially available fluorescently labeled monoclonal antibodies against the corresponding receptor proteins. The labeling was in whole blood. Flow cytometric analysis was performed after erythrocyte lysing using a FACScalibur flow cytometer (Becton Dickinson). Shown is the mean fluorescence activity.
  • mice The wVo effect of prednisolone on the expression of genes inhibited by standard glucocorticoids (TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , Rantes) was examined in the spleen cells of mice after 24 hours.
  • HLA-DR MHC class II
  • cytokine receptors eg TNF-R1, IFN- ⁇ R1, IL-1R1, IL-2R ⁇ , IL-13Ra , GITR, CXCR4
  • CD163, FKBP51 annexin 1 IL-2, ⁇ 2 adrenoreceptor, MIF, GILZ, heme oxygenase 1, thrombospondin 1 and glutamine synthetase.
  • TNF-R1, IFN- ⁇ R1, IL-1R1, IL-2R ⁇ , IL-13Ra , GITR, CXCR4 CD163, FKBP51, annexin 1, IL-2, ⁇ 2 adrenoreceptor, MIF, GILZ, heme oxygenase 1, thrombospondin 1 and glutamine synthetase.
  • the figure shows the induction of genes by prednisolone in 4-hr cultures of human PBMC.
  • the expression of selected genes was detected in the spleen cells of n-treated mice.
  • the substances undergo receptor binding assays to demonstrate binding to the GR and, at the same time, selectivity to the GR.
  • glucocorticoid receptor GR
  • other steroid hormone receptors mineralocorticoid receptor (MR), progesterone receptor (PR) and androgen receptor (AR)
  • MR glucocorticoid receptor
  • PR progesterone receptor
  • AR androgen receptor
  • extracts from Sf9 cells which were infected with baculoviruses which contain the coding sequences for the respective steroid hormone receptor were used.
  • the substances show a high to very high affinity for GR.
  • the mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter contains specific binding sites for the activated GR (so-called GREs). This promoter was cloned in front of a reporter gene (luciferase) and the construct was stably integrated into the genome of the human cell line HeLa (cervix carcinoma cells). The addition of test and reference substances activates the MMTV promoter and expresses the luciferase whose activity can be detected by photometric measurement.
  • GREs activated GR
  • HeLa cervix carcinoma cells
  • tyrosine aminotransferase TAT
  • GREs tyrosine aminotransferase
  • H4IIE3 rat hepatoma cells
  • a promoter system which contains parts of the collagenase promoter.
  • the promoter was placed in front of a reporter gene (luciferase) and the resulting construct was stably integrated into the genome of the human cell line HeLa. After stimulation of the cells with phorbol ester this promoter is activated.
  • the administration of SEGRA test substances and glucocorticoids inhibits the phorbol ester-induced promoter activity. The detection takes place via the photometric determination of the luciferase activity.
  • the activities of SEGRA substances in the respective transactivation and transrepression systems are determined in comparison to the activities of the reference substance dexamethasone.
  • the SEGRA substance compound 1 has been tested as an agonist in the two mentioned transactivation assays.
  • compound 2 is a clear antagonist with respect to the MMTV promoter.
  • the substance antagonizes those induced by dexamethasone
  • Promoter behaves compound 2 as a partial agonist. With a power of 67 ⁇
  • the SEGRA substances show a comparable inhibition of the expression of cytokines in human PBMC as parameters for the transrepression activity.
  • transactivation parameters CD163 and FKBP51 are induced only by prednisolone, but not by the antagonist in transactivation, Compound 2.
  • the concomitant administration of compound 2 and prednisolone results in a significantly lower induction of transactivation parameters compared to the sole administration of prednisolone.
  • CD163 expression is reduced by compound 2 in all approaches.
  • the genes selected for in vivo regulation of expression were characterized in the spleen cells of SEGRA-treated mice after 24 hours.
  • Compound 1 Treatment with the agonist in transactivation, Compound 1, leads to a marked induction of the expression of FKBP51, CD163, GILZ and glutamine synthetase in the spleen cells. In contrast, the antagonist in transactivation, compound 2, reduces the expression of these genes.
  • Schering AG has been shown to be able to demonstrate that the expression of defined genes and / or proteins in the test system of the unstimulated primary immune cells is suitable for examining the molecular mechanism of selective GR ligands, based on Seller Selective GR (SEGRA) agonists their agonistic or antagonistic in vitro and wVo activity in the transactivation or transrepression to characterize.
  • SEGRA Seller Selective GR
  • the aim was to characterize the extent of dissociation of a substance by a value that summarizes the different effects on the expression of various transrepression and transactivation parameters.
  • a dissociation factor was therefore defined which represents the dissociation of transactivation and transrepression activity on the basis of the induction or suppression of selected genes.
  • TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ were selected.
  • CD163 and FKBP51 are used to detect transactivation activity.
  • the ratios were calculated after normalization of gene expression levels to prednisolone from the quotient of the geometric mean of the parameters for transrepression (TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ ) and for transactivation (CD 163 and FKBP51). Mean values ⁇ SD.
  • a ratio (dissociation factor) was determined from the gene expression values in PBMC cultures, which characterizes the differentiated dissociated molecular mechanism of the SEGRA test substances compared to prednisolone. Especially for the TA antagonist, a good persistence of the ratio increase (starting with the 2 hour value) over time is observed.
  • the standard GC prednisolone and dexamethasone are largely comparable in terms of their transrepression and transactivation properties at all times using this dissociation factor.
  • Parameters for gene suppression were TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ , parameters for gene induction CD163 and FKBP51.
  • the dissociation factor was calculated according to the formula 2 explained from the quotient of the geometric mean values of the transrepression and the transactivation parameters.
  • the above figure graphically illustrates the kinetics of dissociation ratios versus prednisolone for the SEGRA test substances.
  • the greatest in wVo dissociation was detectable 24 hours after application.
  • the lowest dissociation was observed for all SEGRA test substances after 6 hours.
  • the levels were even significantly lower compared to prednisolone.
  • the ratios were calculated after normalization of gene expression levels to prednisolone from the quotient of the geometric mean of the parameters for transrepression (TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ ) and for transactivation (CD 163 and FKBP51).
  • the selected parameters also proved to be suitable in vivo to represent the transrepression and transactivation activity of the GR ligands and the dissociated effect of the TA partial agonist and the TA antagonist.
  • the selected parameters were lower in Vivo dissociation in the mouse spleen cells and not as consistent as in the in w 'fro-tests on human PBMC. At least partly responsible for this is the lower activity of the SEGRA test substances in the in vivo suppression of the transrepression parameters TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ .
  • the parameters can also be used to directly represent antagonism by preventing TA-mediated gene induction by a standard glucocorticoid, such as prednisolone, in primary human immune cells, while TR-mediated inhibition, e.g. TNFa expression is not affected. That is, one sees a dissociation in antagonism.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung der Transaktivierungs- und Transrespressionsaktivität von Glukokortikoidrezeptor(GR)-Liganden durch Gen- und/oder Proteinexpressionsanalyse in primären Immunzellen sowie deren Verwendung.

Description

Verfahren zur Charakterisierung der Transaktivierungs- und Transrespressionsaktivität von Glukokortikoidrezeptor-Liganden in primären Immunzellen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung der Transaktivierungs- und Transrespressionsaktivität von Glukokortikoidrezeptor(GR)-Liganden durch Gen- und/oder Proteinexpressionsanalyse in primären Immunzellen.
Glukokortikoide gehören zu den am häufigsten in der Klinik angewandten Medikamenten. Sie haben wesentliche Wirkungen auf das Entzündungs- und Immunsystem und auf den Metabolismus. Die verschiedenen Wirkungen werden durch unterschiedliche Mechanismen über den Glukokortikoidrezeptor (GR) vermittelt. Selektive Glukokortikoidrezeptor (GR)-Liganden repräsentieren eine neue Klasse von GR-Liganden, die die GR-Mechanismen der Genregulation, die Transaktivierung und die Transrepression von Genen, selektiv agonistisch oder antagonistisch beeinflussen. Eine Dissoziation der Transaktivierungs- und der Transrepressionsaktivität von GR- Liganden bzw. von agonistischen und antagonistischen Wirkungen von GR-Liganden ist möglich. Hierdurch soll das therapeutische Profil der GR-Liganden selektiv beeinflusst werden.
Zur in wϊro-Charakerisierung der GR-Liganden hinsichtlich der Aktivität in der Transaktivierung und in der Transrepression werden derzeit humane und tierische Zelllinien eingesetzt, die z.T. mit Promoter-Konstrukten transfiziert sind. In diesen Zelllinien werden selektiv Einzelaspekte der GR-Wirkungen abgefragt. Zudem ist häufig für den Nachweis der entsprechenden Aktivität der GR-Liganden eine Stimulation der Zellen notwendig. Ein Rückschluss aus den Ergebnissen derartiger Assays an Zelllinien auf die Wirkungen der GR-Liganden in primären Zellen und insbesondere auf das humane System ist nur sehr bedingt möglich. Zur in wVo-Charakterisierung von GR-Liganden hinsichtlich ihres molekularen Mechanismus werden zum einen Funktionsteste verwandt. Beispiele hierfür sind die Applikation von GR-Liganden bei Auslösung einer Entzündung oder der Nachweis von Wirkungen des GR-Liganden nach einer metabolischen Belastung oder nach Gabe von den Metabolismus regulierenden Hormonen. Dieser Ansatz ist bei Studien am Menschen mit signifikanten Belastungen verbunden oder nicht zumutbar. Zum anderen wird unter experimentellen Bedingungen die GR-Ligand-vermittelte Genregulation direkt in den extrahierten Zielorganen bzw. in Organproben untersucht. Dieser Ansatz ist für Studien am Menschen in der Regel nicht möglich.
Aufgrund der genannten, wesentlichen Limitierungen der derzeitigen Assays ist die Entwicklung von Assays erwünscht, die 1 ) eine größere Relevanz für die Charakterisierung der GR-Ligand-Wirkungen in primären Zellen besitzen und 2) für die Charakterisierung des molekularen Mechanismus von GR-Liganden in Studien am Menschen verwandt werden können, ohne eine wesentliche Belastung darzustellen.
Die Idee war es, Gene in primären Immunzellen zu definieren, die in ihrer Regulation die Transaktivierungs- und Transrepressionsaktivität von GR-Liganden widerspiegeln. Hierzu wurden in einem Screening mit selektiven GR-Liganden mit definierter Transaktivierungs- und Transrepressionsaktivität in unstimulierten humanen primären Immunzellen des peripheren Blutes Gene ausgewählt, die die Transaktivierungs- bzw. Transrepressionsaktivität der Substanzen schnell, reproduzierbar und konsistent in der Suppression- bzw. in der Induktion der Genexpression widerspiegeln. Die Regulation der ausgewählten Gene durch die selektiven GR-Liganden wurde in Dosis/Wirkungsund kinetischen Untersuchungen weiter charakterisiert. Kinetische Untersuchungen im Tiermodell belegten die Reproduzierbarkeit der Genregulation unter in vivo- Bedingungen.
Als besonders geeignet für den Nachweis der Transrepressionsaktivität von GR-Liganden in unstimulierten primären Immunzellen erwies sich die Suppression der Genexpression von IL-1ß, IL-8, Rantes und insbesondere von TNF-α. Als besonders geeignet für den Nachweis der Transaktivierungsaktivität erwies sich die Induktion der Expression von Glutaminsynthetase und GILZ und ganz besonders die von CD163 und FKBP51. Mit den Parametern konnten sowohl in vitro als auch nach in wVo-Applikation sowohl agonistische als auch antagonistische Wirkungen von selektiven GR-Liganden bzw. Standardglukokortikoiden auf die Transaktivierungs- bzw. Transrepressionsaktivität des GR charakterisiert werden. Der Einsatz dieser Parameter zur Charakterisierung des molekularen Mechanismus von GR-Liganden ist neu.
Folgende Vorteile sind aus dem Einsatz der Gen- und/oder Protein- Expressionsanalyse in unstimulierten primären Immunzellen zum Nachweis des molekularen Mechanismus von GR-Liganden zu erwarten:
1 ) Primäre Immunzellen sind ein nicht artifizielles Zellsystem mit großer Relevanz für die Wirkungen von GR-Liganden im Organismus.
2) Der Nachweis der Parameter in unstimulierten primären Immunzellen vermeidet die Notwendigkeit von Stimulationen, welche die Parameter verfälschen könnten und nicht die Situation im Organismus widerspiegeln.
3) Die Untersuchungen belegen, dass die Parameter in den primären Immunzellen den molekularen Mechanismus von GR-Liganden schnell, dosisabhängig, reproduzierbar und konsistent sowohl nach in wfro-Zugabe als auch nach in wVo-Applikation widerspiegeln.
4) Die sehr gute Übereinstimmung der in vitro an unstimulierten primären humanen Immunzellen und der in tierexperimentellen Untersuchungen nach in wVo-Applikation von GR-Liganden erhaltenen Ergebnisse macht die
Anwendbarkeit der definierten Parameter für in wVo-Studien am Menschen sehr wahrscheinlich.
5) Der Nachweisbarkeit der Parameter in unstimulierten primären Immunzellen erlaubt auch eine direkte Bestimmung der Parameter in Blutproben von mit GR-Liganden behandelten Organismen. Damit ist eine leichte Zugänglichkeit für das Untersuchungsmaterial für in wVo-Untersuchungen gegeben.
6) Die Parameter können in Blutproben von mit GR-Liganden behandelten Organismen bestimmt werden, ohne dass eine zur Blutentnahme zusätzliche Belastung entsteht. Eine zur Gabe des entsprechenden GR-Liganden und zur Blutentnahme zusätzliche Intervention ist nicht notwendig. Das zwingend notwendige Blutvolumen für die Untersuchungen liegt unter einem Milliliter. 7) Die Parameter können in Vollblutassays nachgewiesen werden, so dass eine Beeinträchtigung der Ergebnisse, z.B. durch eine Zellseparation, entfällt. Hierfür stehen kommerziell erhältliche Nachweissysteme zur Verfügung.
8) Der Nachweis der Parameter in unstimulierten primären Immunzellen ist sowohl für experimentelle in vitro- und in wVo-Untersuchungen als auch für Phase I und klinische Studien einsetzbar. Hierdurch ist eine Konsistenz der Parameter für den molekularen Mechanismus von GR-Liganden in der Entdeckung, Entwicklung und im klinischen Gebrauch von GR-Liganden möglich.
9) Die Parameter sind als Biomarker für die Charakterisierung des molekularen in wVo-Mechanismus von GR-Liganden in Studien am Menschen geeignet.
10) Die ausgewählten Parameter für die Transrepression (Suppression der Expression der Entzündungsmediatoren IL-1ß, IL-8, Rantes und insbesondere von TNF-α) erlauben zusätzlich eine Charakterisierung der antientzündlichen und immunmodulatorischen Wirkung der GR-Liganden. 11 ) Da die Transaktivierungs- und Transrepressionsaktivität entscheidend die Wirkungen von GR-Liganden im Organismus bestimmt, kann die Charakterisierung der definierten Gen- und/oder Protein-Expressionsparameter in den unstimulierten primären Immunzellen des peripheren Blutes dazu beitragen, bereits in frühen Studien auch am gesunden Menschen (z.B. Phase I-Studien) Aussagen über den molekularen in wVo-Mechanismus und damit das zu erwartende Wirkungs-/ Nebenwirkungs-Profil des GR-Liganden zu erlangen.
Primäre Immunzellen im Sinne des Patentes sind alle Immunzellen des lebenden Organismus. Insbesondere gemeint sind die Immunzellen des Blutes, des Knochenmarkes und der lymphatischen Organe (z.B. Thymus, Milz, Lymphknoten, Peyer'sche Plaques). Ganz besonders bevorzugt sind die Immunzellen des Blutes. Prinzip der Methode
Die Methode beschreibt die Charakterisierung des molekularen Mechanismus von Glukokortikoidrezeptor (GR)-Liganden (Standardglukokortikoide und selektive GR-Liganden) mittels Analyse der Gen- und Proteinexpression von GR-sensitiven Genen in primären Immunzellen.
Selektive GR-Liganden repräsentieren eine neue Klasse von GR-Liganden, die die beiden Mechanismen zur GR-vermittelten Regulation der Genexpression, die Transaktivierung oder die Transrepression von sensitiven Genen, in unterschiedlichem Ausmaß bedienen. Es kann sich um Agonisten, Partialagonisten, Partialantagonisten und Antagonisten für den jeweiligen Mechanismus handeln. Entsprechend den durch den GR-vermittelten antientzündlichen, immunsuppressiven und metabolischen Wirkungen können Indikationen für selektive GR-Liganden u.a. entzündliche Erkrankungen oder Zustände mit einer veränderten metabolischen Aktivität sein. Eine wesentliche Voraussetzung für die Entdeckung, die erfolgreiche Entwicklung und für den klinischen Einsatz derartiger neuer GR-Liganden ist die Charakterisierung ihres molekularen Mechanismus in relevanten in vitro- und in wVo-Experimenten und in Phase I und klinischen Studien am Menschen.
Das Ziel der Methode ist es, in experimentellen in vitro oder in wVo-Untersuchungen sowie in Phase I und klinischen Studien am Menschen die Transrepressions- und Transaktivierungsaktivität von selektiven GR-Liganden und Standardglukokortikoiden durch Veränderungen der Gen- und/oder Proteinexpression bzw. Proteinfreisetzung in unstimulierten Immunzellen, in lymphatischen Organen und im Blut zu charakterisieren. Hierzu wurden in einem Screening aus über 50 Genen Parameter ausgewählt und näher analysiert. Wesentliche Auswahlkriterien waren 1 ) die Korrelation der Genregulation mit der Transrepressions- bzw. Transaktivierungs- Aktivität von selektiven GR-Liganden, 2) die konsistente Genregulation in unstimulierten primären Immunzellen und 3) die schnelle Reaktion in den in vitro- Assays sowie die gute und anhaltende Nachweisbarkeit nach in wVo-Applikation von GR-Liganden. Diese Kriterien sind wesentlich für den Einsatz der Parameter als Biomarker. Sowohl für den in vitro- als auch für den ex wVo-Nachweis als besonders geeignet erwiesen haben sich für die Charakterisierung der Transrepressionsaktivität die Suppression der proinflammatorischen Zytokine IL-1ß, IL-8, Rantes und insbesondere von TNF-α und für die Transaktivierungaktivität die Induktion von Glutaminsynthetase und GILZ und ganz besonders die von CD163 und FKBP51.
Weitere geeignete Parameter sind die Expression von koakzessorischen Molekülen (HLA-DR, CD86) für den Nachweis der Transrepression und die Expression von Zytokinrezeptoren (IFN-γR1 , TNF-R1 , IL-1 R1 , IL-2Rα, IL-13Ra, CXCR4, GITR) sowie weiterer Gene (ß2-Adrenorezeptor, Hämoxygenase 1 , IL-2, MIF, Annexin i , Thrombospondin 1 ) für den Nachweis der Transaktivierungsaktivität.
Der Nachweis der Regulation der Expression der aufgeführten Parameter kann durch Methoden für den mRNA-Nachweis (z.B. quantitative real-time PCR) und/oder für den Proteinnachweis (z.B. Durchflusszytometrie, Immunoassays, Western Blot) in den primären Immunzellen erfolgen. Sezernierte Proteine können in Kulturüberständen, Serum, Plasma und anderen biologischen Flüssigkeiten nachgewiesen werden. Dem Fachmann auf diesem Gebiet sind die Nachweismethoden bekannt - sie sind zudem in der Fachliteratur ausreichend beschrieben, so dass ihre Ausführung möglich ist.
Die Anwendbarkeit der Methode wird im folgenden anhand der Charakterisierung des Standardglukokortikoides Prednisolon sowie von zwei selektiven GR-Agonisten (SEGRA) der Schering AG belegt. Der differentielle Mechanismus der Substanzen in üblichen Assays für die agonistische bzw. antagonistische Transaktivierungs- und Transrepressionsaktivität am GR korreliert mit der Regulation der Expression ausgewählter Gene in in vitro-Assays von primären humanen Immunzellen und in den Milzzellen von Substanz-behandelten Mäusen.
Die Assays für die GR-Ligand-vermittelte Regulation der Gen- und/oder Proteinexpression können sowohl zum Nachweis der kompetitiven oder nicht- kompetitiven agonistischen als auch antagonistischen Aktivität von Substanzen für den Transaktivierungs- bzw. Transrepressionsmechanismus des GR eingesetzt werden. Für letzteres wird die Antagonisierung der Wirkungen eines anderen zugegebenen GR-Liganden untersucht. In in v/Vo-Experimenten kann zusätzlich die Antagonisierung der endogenen Glukokortikoidwirkungen charakterisiert werden. Die dargestellte Methode ist geeignet für die Charakterisierung des molekularen Mechanismus von GR-Liganden in in vitro- und in v/Vo-Experimenten und in Biomarkerassays für Phase I und klinische Studien am Menschen.
1 Regulation und Wirkung endogener Glukokortikoide 1.1 Regulation endogener Glukokortikoide
Die Nebennieren des gesunden Erwachsenen produzieren täglich zwischen 40 and 80 μmol (15 and 30 mg; 8-10 mg/m2) endogenes Kortison. Die Plasmakonzentration wird von der Sekretion, der Inaktivierungsrate und der Bildung von freiem Kortisol bestimmt und zeigt ein deutlich zirkadianes Profil. Der zirkadiane Zyklus, Interaktionen mit dem autonomen Nervensystem und mit physischem und emotionalem Stress, sowie die Reaktion auf Hypoglykämien und systemische Entzündung werden über die Regulation der adrenalen Kortisonproduktion durch die Hypothalamus-Hypophysen- Nebennierenrinden (HPA)-Achse gesteuert. Das durch die o.g. Stimuli getriggerte hypothalamische "corticotropin-releasing hormone" (CRH) induziert die Produktion des "adrenocorticotropic hormone" (ACTH) aus der Hirnanhangsdrüse, welches durch Stimulierung der Nebennierenrinde die Kortisonsynthese steigert. Systemisch erhöhte Glukokortikoidspiegel inhibieren im Rahmen einer negativen Feedback-Regulation die CRH-Synthese und ACTH-Freisetzung.
Die biologischen Effekte von endogenen und iatrogenen Glukokortikoiden im Körper hängen nicht allein von den Kortison-Plasmaspiegeln ab. Sie werden außerdem von den zwei Isoformen eines Enzymsystems, den 11 ß-Hydroxysteroiddehydrogenasen
(11 ß-HSD), geregelt. Die 11 ß-HSD I katalysiert die Konversion biologisch inaktiven
Kortisons in aktives Kortisol. Umgekehrt unterstützt die 11-ß-HSD Il die Umwandlung von aktivem Kortisol in inaktives Kortison. Das System ist vor allem in der Leber aber auch in anderen Geweben, wie auch im Fettgewebe, lokalisiert (Tomlinson JW;
Endocr. Rev. 2004,25:831 ).
1.2 Mechanismus der Wirkung von Glukokortikoiden durch den GR
Die Wirkungen von Glukokortikoiden werden über den Glukokortikoid-Rezeptor (GR) vermittelt / übertragen. Der GR gehört zur Proteinfamilie der Kernrezeptoren, die nach
Bindung ihres jeweiligen Liganden als Transkriptionsfaktoren aktiviert werden und Einfluss auf die Expression bestimmter Zielgene nehmen. Die Bindung des Liganden an den im Zytoplasma der Zelle vorliegenden GR induziert eine Änderung in der Rezeptorkonformation, die wiederum eine Translokation des nun Ligand-gebundenen GRs in den Zellkern zur Folge hat. Dort ist der aktivierte GR in der Lage die Expression von Zielgenen positiv oder negativ zu beeinflussen.
Im Fall einer positiven Regulation der Genexpression (Transaktivierung), bindet der GR als Homodimer an spezifische Sequenzen (glucocorticoid response elements; GREs) im Promotor von sensitiven Genen. Dass die Dimerisierung des GRs eine Voraussetzung für die Transaktivierung ist, wurde durch Mutationsanalysen in vitro und in vivo gezeigt (Reichardt HM, Cell. 1998,93:531 ; Heck S, EMBO J. 1994,13:4087). Nach neueren Erkenntnissen muss jedoch einschränkend gesagt werden, dass viele, aber nicht alle GR induzierten Transaktivierungsvorgänge von der Dimerisierung des Rezeptors abhängig sind (Rogatsky I, PNAS 2003,100:13845).
Der Ligand-aktivierte GR ist auch in der Lage die Expression bestimmter Zielgene zu inhibieren (Transrepression). Der häufigste Mechanismus der negativen Regulation erfolgt durch Bindung des aktivierten GRs als Monomer an andere, schon an die DNA- gebundene Transkriptionsfaktoren. Durch diese Bindung wird die Aktivität der anderen Transkriptionsfaktoren unterdrückt und somit auch die Expression des Zielgens. In einem weiteren Mechanismus der negative Regulation der Genexpression erfolgt die Bindung des aktivierten GRs an sogenannte negativ GREs, die in Promotoren einiger Gene zu finden sind. Hierbei kommt es durch die Bindung des GRs zu einer Verdrängung andere Transkriptionsfaktoren, die für die Induktion der Expression des Gens essentiell sind. Somit verhindert die Bindung des GR an die nGREs die Transkription der entsprechenden Zielgene. Weiterhin ist der GR in der Lage, in bestimmte Signalübertragungswege der MAP- Kinasen inhibierend einzugreifen und auf diese Weise seine Effekte zu vermitteln.
1.3 Wichtige GK-Wirkunαen und Mechanismen
Metabolische GK-Wirkunαen Viele physiologische Prozesse, wie die Regulation des Glukosehaushaltes, Protein- und Fett-Metabolismus werden durch Glukokortikoide gesteuert. Auf viele dieser physiologischen Prozesse wirken Glukokortikoide durch Einflussnahme auf die Expression beteiligter Proteine/Enzyme (Wang M, Nutr. Metab. (Lond). 2005,2:3). So werden die leberspezifische Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK) und auch die Glukose-6-phosphatase durch Glukokortikoide verstärkt exprimiert. Ebenfalls induziert wird die Expression des Glukosetransporters GLUT4. (Imai E, Mol. Cell. BIoI. 1990,10:4712; Schmoll D, FEBS Lett. 1996,383:63; Lin B, DNA Cell. Biol. 1998,17:967; Grosfeld A, Diabetologia 2002,45:527)
Ein verstärkter Aminosäurekatabolismus, der in Hungersituationen die Energieversorgung des Organismus sicher stellt, resultiert aus der von Glukokortikoiden verstärkten Expression von z.B. der Tyrosinaminotransferase (TAT) (Becker et al., 1986; Jantzen et al., 1987), der Glutaminsynthetase oder der Tryptophanoxygenase (Becker PB, Nature 1986,324:686; Schmid E, Eur. J. Blochen). 1987,165:499; Danesch U, EMBO J. 1987,6:625; Gaunitz F, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002,296:1026).
Der Eingriff in den Fetthaushalt durch Glukokortikoide erfolgt ebenfalls durch die Regulation der Expression einiger am Fetthaushalt beteiligter Proteine/Enzyme. So wurde gezeigt, dass die Hormon sensitive Lipase HSL und die Lipoprotein Lipase LPL durch Glukokortikoide hoch reguliert wird (Zilberfarb V, Diabetologia. 2001 ,44:377).
Gleiches gilt für die am Energie- bzw. Fettstoffwechsel beteiligten Proteine Leptin und
VLDLR („very low density lipoprotein receptor") (Slieker LJ, J. Biol. Chem. 1996,271 ,5301 ; Ensler K, Biochim. Biophys. Acta. 2002,1581 :36).
Anti-inflammatorische und immunsuppressive Wirkungen
Anti-inflammatorische und immunmodulatorische Aktivität erzielen Glukokortikoide durch Eingreifen in inflammatorische Signalübertragungswege. Dies geschieht entweder durch Inhibieren der Aktivität von Zellen des adaptiven oder innaten Immunsystems oder durch direkte Störung der pro-inflammatorischen, Zytokin- gesteuerten Signalübertragungswege. Als Hauptmechanismus für die antiinflammatorische und immunsuppressive Aktivität von Glukokortikoiden ist die Transrepression beschrieben worden. Über die Inhibierung der Aktivität einiger Transkriptionsfaktoren (im besonderen von NF-κB und AP-1 ) wird die Bereitstellung vieler pro-inflammatorischer Zytokine (z.B. TNF-α, GMCSF1 IL-1ß, IL-2, IL-3, IL-12), Chemokine (z.B. IL-8, RANTES, Eotaxin, MIP), Enzyme (iNOS, COX-2) und/oder Adhäsionsmoleküle (ICAM-1 , VCAM-1 ) reduziert (Barnes PJ, Clin. Sei. (Lond). 1998,94:557, Almawi WY, J. Mol. Endocrinol. 2002,28:69)
Aber auch die Induktion von anti-inflammatorischen Proteinen (Lipocortin-1 , serum leucoprotease inhibitor, neural endopeptidase, MKP-1 ) ist an der entzündungshemmenden Wirkung von Glukokortikoiden beteiligt (Barnes PJ, Clin. Sei. (Lond). 1998,94:557; Kassel O, EMBO J. 2001 ,20:7108).
Weiteren, nicht-genomischen Effekten, wie die Unterbrechung von MAP-Kinase- Signalwegen, wird ebenfalls eine Beteiligung an den entzündungshemmenden und immunsuppressiven Wirkungen von Glukokortikoiden zugeschrieben.
1.4 Nebenwirkungen von Glukokortikoiden
Die oben genannten physiologischen und anti-inflammatorisch und/oder immunsuppressiven Wirkungen von Glukokortikoiden können bei chronischem Überschuss an vorhandenen Glukokortikoiden (z.B. bei endogenem Hypercortisolismus oder therapeutischer Glukokortikoidgabe) aber auch zu einer Anzahl von unerwünschten Effekten wie zur Induktion von Hyperglykämie bis hin zur Auslösung von Diabetes mellitus, Bluthochdruck, Muskelatrophie und/oder Myopathie, Stammfettsucht, Osteoporose u.a. führen.
Besonders Effekte, die in den Glukose- und Fetthaushalt eingreifen werden zu einem wesentlichen Teil durch Glukokortikoid-induzierte Transaktivierungsvorgänge reguliert. Neben den oben erwähnten Enzymen werden weitere, am Proteinkatabolismus beteiligte Enzyme wie z.B. die Glutamat-Dehydrogenase, die Glutamat-Oxalazetat- Transaminase und die Serin-Dehydratase, durch Glukokortikoidgabe induziert (Timmerman M, Exp. Biol. Med. (Maywood) 2003,228:100; Barouki R, Eur. J. Biochem. 1989,186:79; Su Y, Arch. Biochem. Biophys. 1992,297:239). Eine permanent hochregulierte Glukoneogenese kann zu Hyperglykämie, Insulinresistenz und als Folge zu Diabetes mellitus führen. Wie oben genannt werden die Schlüsselenzyme der Glukoneogenese in der Leber von Glukokortikoiden induziert.
Eine ständige Immunsuppression durch chronische Glukokortikoidbehandlung bzw. einen endogenen Hyperkortisolismus kann zu einem erhöhten Infektionsrisiko führen. Die hieran beteiligten Mechanismen sind im Wesentlichen die, welche für die therapeutischen Wirkungen (anti-inflammatorisch und/oder immunsuppressiv) verantwortlich gemacht werden. Neben der Inhibierung der Expression vieler proinflammatorischer Proteine ist der GR aber auch durch eine direkte Induktion von viralen Promotoren an einem erhöhten Infektionsrisiko beteiligt.
2 Selektive GR-Liganden und Indikationen für ihre Anwendung
2.1 Selektive GR-Liαanden
Selektive GR-Liganden (z.B. Selektive GR-Agonisten - SEGRA, Selektive GR-Modulatoren - SGRM, Dissoziierte bzw. differenzierte GR-Liganden) repräsentieren eine neue Klasse von GR-Liganden, die die beiden Mechanismen zur Regulation der Genexpression, die Transaktivierung oder die Transrepression von sensitiven Genen, in unterschiedlichem Ausmaß bedienen (Schaecke H, PNAS 2004,101 :227 & Curr. Opin. Investig. Drugs. 2004,5:524). Hierbei sind im Vergleich zu den endogenen Glukokortikoiden und/oder therapeutischen Standardglukokortikoiden vergleichbare, gesteigerte, verminderte und aufgehobene Wirkungen in der Transaktivierung bzw. in der Transrepression und deren unterschiedliche Kombinationen möglich. Es kann sich um Agonisten, Partialagonisten, Partialantagonisten und Antagonisten für den jeweiligen Mechanismus handeln. Während die agonistischen Wirkungen durch die direkten Effekten der GR-Liganden auf die Expression sensitiver Gene und/oder Promoterkonstrukte definiert werden, werden die antagonistischen Wirkungen über die Hemmung der Effekte anderer Liganden am GR charakterisiert. Entsprechende Beispielassays hierfür sind untenstehend bei der Charakterisierung des molekularen Mechanismus von zwei selektiven GR-Agonisten (SEGRA), aus der WO 00/32584 Verbindung 1 und aus der WO 02/10143 Verbindung 2 der Schering AG aufgeführt.
Für die Transaktivierung agonistische Liganden des GR aktivieren den Rezeptor durch ihre Bindung in der Form, dass dieser in der Lage ist, durch Binden an die GREs in Promoterregionen sensitiver Gene deren Transkription zu induzieren. Es gibt weiterhin Liganden, welche durch Bindung an den GR eine Antagonisten-Konformation des Rezeptors hervorrufen und nicht zu einer Induktion der Promoteraktivitäten sensitiver Gene führen. Solche Liganden werden als Antagonisten bezeichnet. Eine weitere Gruppe von Liganden kann als Partialagonisten oder -antagonisten bezeichnet werden. Diese induzieren nur teilweise agonistische oder antagonistische GR-Aktivitäten. Die antagonistischen bzw. partial-agonistischen Aktivitäten von GR- Liganden sind abhängig vom zellulären Hintergrund und der Struktur des Promoters, der die Expression von sensitiven Genen reguliert. Für die Transrepression agonistische Liganden des GR aktivieren den Rezeptor durch ihre Bindung in der Form, dass der Ligand-aktivierte Rezeptor in der Lage ist, die Expression bestimmter Zielgene zu inhibieren. Das kann durch Interaktion und nachfolgende Hemmung der Wirkung anderer Transkriptionsfaktoren oder durch Bindung an negative GREs erfolgen. Partialagonisten, Partialantagonisten und Antagonisten in der Transrepression vermitteln diese GR-Wirkung nur teilweise und/oder hemmen die agonistische Wirkung anderer GR-Liganden in der Transrepression.
2.2 Beispiel-Indikationen für die Behandlung mit selektiven GR-Liqanden Eine Behandlung mit selektiven GR-Liganden hat ihre Indikationen zum einem überall dort, wo Standardglukokortikoide indiziert sind. Hier kann eine dissoziierte Wirkung am GR zu einem Vorteil der selektiven GR-Liganden hinsichtlich einer im Vergleich zu Standardglukokortikoiden verminderten Induktion von unerwünschten Wirkungen, d.h. zu einem verbesserten Wirkungs-/ Nebenwirkungsprofil führen. Zum anderen können selektive GR-Liganden eingesetzt werden, um die adversen Effekte von vorhandenen GR-Liganden zu antagonisieren. Weiterhin ist eine selektive Substitution mangelnder Wirkungen der endogenen Glukokortikoide durch selektive GR-Liganden möglich, ohne dass die Nebenwirkungen unerwünschter Effekte am GR vermittelt werden. Diese Behandlungsprinzipien können auch in Kombination auftreten. Anwendungsbeispiele werden im folgenden gegeben.
Anti-entzündliche und immunsuppressive Behandlung
Glukokortikoide gehören zu den am häufigsten eingesetzten antientzündlichen und immunsuppressiven Medikamenten (Franchimont D, Ann N Y Acad Sei. 2004, 1024:124). Ihre Anwendung ist jedoch durch z.T. schwerwiegende und nicht reversible Nebenwirkungen limitiert. Es hat sich gezeigt, dass die Transrepressionsaktivität des GR wesentlich für die antientzündliche und immunsuppressive Wirkung von GR-Liganden ist, während wichtige Nebenwirkungen (z.B. Induktion der Glukoneogenese) über die Transaktivierung vermittelt werden (Schaecke H, Pharmacol. Ther. 2002,96:23).
Selektive GR-Liganden mit einer verminderten Transaktivierungsaktivität bei erhaltener Transrepressionsaktivität könnten effektive antientzündliche und immunsuppressive Medikamente darstellen, die im Vergleich zu Standardglukokortikoiden vermindert Nebenwirkungen induzieren, welche wesentlich über den Transaktivierungsmechanismus vermittelt werden.
Behandlung des endogenen Hvperkortisolismus Eine pathophysiologische Bedeutung einer, z.T. Gewebe-spezifischen, erhöhten Aktivität der endogenen Glukokortikoide wird für eine Vielzahl von Erkrankungen und Syndromen diskutiert (z.B. Diabetes mellitus, Stammfettsucht, Metabolisches Syndrom, Hypertonus, Atherosklerose). Diese Syndrome sind charakterisiert durch gesteigerte metabolische Wirkungen der endogenen Glukokortikoide (u.a. Hyperglykämie, Hyperlipidämie) mit ihren adversen Folgen. Darüber hinaus findet sich häufig eine chronische Entzündung (low-level inflammation) (Li JJ, Medical Hypotheses 2005,64:236; Wang M, Nutr. Metab. (Lond). 2005,2:3, Dandona P, Circulation. 2005,111 :1448). Eine Behandlung mit heute zugelassenen Standardglukokortikoiden ist aufgrund der zu erwartenden Steigerung der unerwünschten metabolischen Effekte jedoch nicht indiziert.
Selektive GR-Liganden mit einer (partial-) antagonistischen Wirkung in der Transaktivierung könnten über unterschiedliche Mechanismen die adversen metabolischen Wirkungen der endogenen Glukokortikoide vermindern. Hierzu gehören die Hemmung der endogenen Glukokortikoidsynthese über die Inhibition der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse und die kompetitive und/oder nicht-kompetitive Antagonisierung der metabolischen Wirkungen der endogenen Glukokortikoide am GR. Darüber hinaus könnte ein Agonismus des selektiven GR-Liganden in der Transrepression die chronische Entzündung eindämmen. Behandlung von Zuständen mit einer Defizienz von metabolischen Wirkungen
Bei verschiedenen, überwiegend schweren Erkrankungen sind die zusätzlichen metabolischen Wirkungen von Glukokortikoiden erwünscht. Hierzu gehört die Kachexie, z.B. bei Tumoren, kardiovaskulären Erkrankungen oder HIV-Infektion. Allerdings sind diese Zustände auch durch eine Immundepression charakterisiert, die durch eine Behandlung mit Standardglukokortikoiden noch verstärkt würde (Mulligan K, Int J Cardio/. 2002,85,151 ; Tijerina AJ, Dimens Cht Care Nurs. 2004,23:237).
Selektive GR-Liganden mit einer ausgeprägten agonistischen Wirkung in der Transaktivierung und einem (Partial-) Antagonismus in der Transrepression könnten die erwünschten metabolischen Wirkungen des GR induzieren, ohne die Abwehrsituation des Organismus zu verschlechtern. Denkbar wäre sogar eine resultierende verbesserte Infektionsabwehr durch die Antagonisierung der Transrepressionswirkungen der endogenen Glukokortikoide.
3 Charakterisierung des molekularen Mechanismus von selektiven
GR-Liganden in primären Immunzellen
3.1 Prinzipdarstellunq
Die obenstehenden Beispiele zeigen, dass selektive GR-Liganden mit unterschiedlichem Transaktivierungs-/Transrepressionsprofil bei einer Vielzahl von Indikationen ihren Einsatz finden könnten. Eine wesentliche Voraussetzung für die Entdeckung, die erfolgreiche Entwicklung und für den klinischen Einsatz derartiger neuer GR-Liganden ist die Charakterisierung ihres molekularen Mechanismus in relevanten in vitro- und in wVo-Experimenten und in Phase I und klinischen Studien am Menschen. Insbesondere geeignet für das Monitoring der Transaktivierungs- und Transrepressions-vermittelten Genregulation durch selektive GR-Liganden und Standardglukokortikoide sind die kernhaltigen Zellen des peripheren Blutes, d.h. die peripheren Blutleukozyten, und die von ihnen stammenden Proteine. Wesentliche Vorteile gegenüber anderen Assays für die Charakterisierung des molekularen Mechanismus von GR-Liganden sind 1 ) die Verwendung von unstimulierten primären Zellen, die Relevanz für die in v/Vo-Wirkung von Glukokortikoiden haben, sowie 2) die einfache Anwendbarkeit als Biomarker in Studien am Menschen (Nachweis im Blut, ohne invasive Eingriffe, z B. Biopsien, oder sonstige zusätzliche Belastungen). Der direkte Nachweis der Genregulation in den primären Immunzellen kann durch den mRNA-Nachweis, z.B. durch eine RT-PCR oder andere Amplifikationsmethoden oder durch Methoden für den direkten mRNA-Nachweis, erfolgen. Für den Proteinnachweis können z.B. die Durchflusszytometrie, Immunoassays oder Western ß/of-Methoden verwandt werden. Der Proteinnachweis kann an bzw. in den Zellen, in Zelllysaten oder in den Überständen von Zellkulturen bzw. im Plasma, Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten durchgeführt werden.
Das Ziel der Methodik ist es, anhand der Regulation der Expression von Genen und/oder Proteinen in primären Immunzellen den molekularen Mechanismus von GR-Liganden zu charakterisieren und dadurch Hinweise über das mögliche
Wirkungsprofil der eingesetzten Substanzen bei äqui-effizienter Dosierung zu erhalten.
Zur Definition geeigneter Parameter wurden in einem breiten Screening-Ansatz die durch Standardglukokortikoide und selektive GR-Liganden vermittelte Regulation von mehr als 50 Genen in primären humanen Immunzellen untersucht. Ausgewählte Gene wurden in vitro und in vivo in kinetischen Experimenten weiter charakterisiert. Die von den Literaturarbeiten abweichenden Bedingungen führten z.T. zu gegenläufigen Ergebnissen. Entscheidende Kriterien für die Parameterauswahl waren 1 ) die konsistente Widerspiegelung von Transaktivierungs- bzw. Transrepressions- Eigenschaften von GR-Liganden, 2) der Nachweis der Regulation in nicht-stimulierten Immunzellen sowie 3) die schnelle Reaktion der Genexpression in in vitro-Assays (für das Screening wurde der 4h-Zeitpunkt verwandt) und die gute und anhaltende Nachweisbarkeit nach in wVo-Applikation von GR-Liganden. Diese Eigenschaften machen eine direkte Regulation der Genexpression durch die GR-Liganden sowie eine Verwendbarkeit der Parameter in in wVo-Studien (z.B. als Biomarker) wahrscheinlich.
Um einen Vergleich mit einem Standard-GK zu haben, wurden die GR-Ligand- beeinflussten Genexpressionen für diese Parameter auf die Genexpression nach Behandlung mit dem Standard-GK, Prednisolon, normiert. Prednisolon ist das Standard-GK, im Vergleich zu dem die SEGRA-Substanzen eine verstärkte Dissoziation aufweisen sollen und das bei klinischen Studien mit SEGRA- Entwicklungskandidaten die Vergleichssubstanz darstellen könnte. Dem Fachmann ist klar, dass die Normierung prinzipeil auch auf jedes andere Glukokortikoid bezogen werden könnte. Für die Gensuppression wurde zur Normierung der Quotient „Prednisolon/GR-Ligand" gebildet, d.h. ein niedriger Wert (<1 ) zeigt eine relativ schwächere Suppression durch den GR-Liganden (höherer Wert in der residualen Genexpression) an. Für die Geninduktion wurde zur Normierung der Quotient „GR-Ligand/Prednisolon" gebildet, d.h. ein Wert <1 zeigt eine relativ schwächere Induktion durch den GR-Liganden an.
Auf die Prednisolonbehandlung normierte in vitro-mRNA-Expression von ausgewählten Transaktivierungs- und Transrepressions-Parametern
Transaktivierung vs. Transrepression vs. Prednisolon Prednisolon
CDl 63 FKBP51 IL-lß TNF-α
Prednisolon 1 Stunde 1,00 1,00 1,00 1,00
Prednisolon 2 Stunden 1,00 1,00 1,00 1,00
Prednisolon 4 Stunden 1,00 1,00 1,00 1,00
Prednisolon 12 Stunden 1,00 1,00 1,00 1,00
Prednisolon 24 Stunden 1,00 1,00 1,00 1,00
Dexamethason 1 Stunde 1,02 0,89 0,61 0,80
Dexamethason 2 Stunden 1,89 1,13 0,69 0,85
Dexamethason 4 Stunden 1,34 1,08 1,27 1,01
Dexamethason 12 Stunden 1,13 1,07 0,96 1,00
Dexamethason 24 Stunden 1,04 1,05 1,16 0,97
ZK 238587 IStunde 0,84 0,99 1,16 0,99
ZK 238587 2 Stunden 0,52 0,93 0,87 0,86
ZK 238587 4Stunden 0,49 0,79 1,28 0,89
ZK 238587 12 Stunden 0,48 0,74 0,97 1,06
ZK 238587 24 Stunden 0,49 0,82 0,73 0,79
ZK 243185 I Stunde 0,93 0,77 1,17 0,76
ZK 243185 2 Stunden 0,33 0,19 0,51 0,59
ZK 243185 4 Stunden 0,04 0,26 1,25 0,73
ZK 243185 12 Stunden 0,07 0,26 0,45 0,67
ZK 243185 24 Stunden 0,06 0,33 0,85 0,52
Ziel war es, das Ausmaß der Dissoziation einer Substanz durch einen Wert zu charakterisieren, der die unterschiedliche Beeinflussung der Expression verschiedener Transrepressions- und Transaktivierungsparameter zusammenfassend widerspiegelt. Zur Charakterisierung der dissoziierten Wirksamkeit der SEGRA-Testsubstanzen wurde deshalb ein Dissoziationsfaktor definiert, der die Dissoziation von Transaktivierung- und Transrepressionsaktivität anhand der Induktion bzw. Suppression ausgewählter Gene darstellt.
Nachfolgend wurde aus den auf Prednisolon genormten Werten eine Ratio zwischen Transrepressions- und Transaktivierungsparametern nach folgender Formel gebildet:
Formel 1 : Rati ,o.
Figure imgf000018_0001
Bei dieser Formel stehen:
TR für den normierten Transrepressionsparameter )
TA für den normierten Transaktivierungsparameter
Figure imgf000018_0002
)
ml M für die m-te Wurzel aus M
3 /97 _ "x Beispiel: V Z / — J
■*■ , für das Produkt aller Werte Tx, wobei der Index x von 1 bis t läuft
5
D Be-ispie 1l: T 1T A Tx = TXXTIXTIXTAXTS x=l
Die Ratio ist somit die n-te Wurzel des Produktes von n verschiedenen, auf Prednisolon normierten, Transrepressionsparametern geteilt durch die m-te Wurzel des Produktes von m verschiedenen, auf Prednisolon normierten, Transaktivierungsparametern. Als Transrepressionsparameter kommen alle bekannten Parameter in Frage, einschließlich der die Expression von koakzessorischen Molekülen (HLA-DR, CD86). Besonders geeignete Parameter sind IL-1 ß, IL-8, Rantes - besonders bevorzugt ist TNF-α.
Als Transaktivierungsparameter kommen alle bekannten Parameter in Frage, einschließlich der Expression von Zytokinrezeptoren (IFN-γR1 , TNF-R1 , IL-1 R1 , IL-2Rα, IL-13Ra, CXCR4, GITR) sowie weiterer Gene (ß2-Adrenorezeptor, Hämoxygenase 1 , IL-2, MIF, Annexin 1 , Thrombospondin 1 ). Besonders geeignete Parameter sind die Expression von Glutaminsynthetase und GILZ und ganz besonders die von CD163 und FKBP51.
Aus diesen Transrepressions- und Transaktivierungsparametern können beliebige ausgewählt und gemäß der oben genannten Formel zur Bestimmung der Ratio gemäß Formel 1 verwendet werden.
Zur Bestimmung der Transrepression werden bevorzugt TNF-α und IL-1ß ausgewählt. Zur Bestimmung der Transaktivierung werden bevorzugt CD163 und FKBP51 ausgewählt.
Gemäß dieser bevorzugten Kombination der Parameter werden nach Normierung der Einzelparameter eine Ratio zwischen Transrepressions- und Transaktivierungsparametern nach folgender Formel 2 gebildet:
Formel 2: Ratio =
Figure imgf000019_0001
Dem Fachmann auf diesem Gebiet ist klar, das eine Ratio gemäß oben genannter Formel 1 oder 2 prinzipiell auch aus abgeleiteten Werten (z.B. IC5O oder ED50) gebildet werden könnte. Dem Fachmann ist aus den mathematischen Zusammenhängen klar, dass die Ratio gegebenenfalls bei einer derartig veränderten Rechenmethodik bei stärkerer Differenzierung von Transaktivierung und Transrepression Werte kleiner als 1 ergeben würde. Experimenteller Teil
Die im nachfolgenden experimentellen Teil erhaltenen Ergebnisse zur Gen- bzw. Proteinexpression wurden mittels quantitativer real-time-RT-PCR bzw. mittels Durchflusszytometrie erhalten und sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.
Für den mRNA-Nachweis wurde die Gesamt-RNA aus den jeweiligen Proben (humane PBMC oder humanes Vollblut oder Milzzellen von Mäusen) isoliert, in die cDNA umgeschrieben und nachfolgend mittels Real-time-TaqMan-PCR (Applied Biosystems) amplifiziert und nachgewiesen. Es erfolgte eine relative Quantifizierung im Vergleich zur Expression des „house-keeping"-Genes HPRT. Dargestellt ist jeweils die Ratio aus dem Ergebnis für den GR-Liganden zum Ergebnis der Vehikelkontrolle.
Der durchflusszytometrische Nachweis der Expression von Rezeptoren auf den humanen Immunzellen wurde mit kommerziell erhältlichen Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörpern gegen die entsprechenden Rezeptorproteine durchgeführt. Die Markierung erfolgte im Vollblut. Die durchflusszytometrische Analyse erfolgte nach Lysierung der Erythrozyten mittels eines FACScalibur-Durchflusszytometers (Becton Dickinson). Dargestellt ist die mittlere Fluoreszenzaktivität.
Die beispelhaft gestesteten Verbindung sind Verbindung 1 (ZK 238587)
Figure imgf000020_0001
aus WO 00/32584 und
Verbindung 2 (ZK243185)
Figure imgf000020_0002
aus WO 03/082827. 3.2 Gen/Protein-Suppression als Parameter für die Transrepressionsaktivität
Eine Hemmung der Expression durch Standardglukokortikoide ist für viele Gene in den Immunzellen bekannt (Galon J, FASEB J. 2002,16:61 ; Hayashi R, Eur. J. Pharmacol. 2004,500:51 ).
In unseren Untersuchungen an unstimulierten primären Immunzellen haben sich als Indikatoren für die Transrepressionsaktivität Gene/Proteine als geeignet erwiesen, die in der Entzündung und der spezifischen Immunantwort eine Rolle spielen. Diese Parameter haben zudem den Vorteil, dass ihre Hemmung die antientzündlichen und immunsuppressiven Effekte von GR-Liganden widerspiegelt. Die nachfolgende Abbildung zeigt die mittels quantitativer Real-time-PCR nachgewiesene Genregulation von inflammatorischen Zytokinen (TNF-α, IL-1 ß, IL-8, Rantes) und des kostimulatorischen Moleküls CD86 durch das Standardglukokortikoid Prednisolon in 4-Stunden-Kulturen von unstimulierten humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC).
Figure imgf000021_0001
Die in wVo-Wirkung von Prednisolon auf die Expression von durch Standardglukokortikoide inhibierten Genen (TNF-α, IL-1 ß, Rantes) wurde in den Milzzellen von Mäusen nach 24 Stunden untersucht.
Effect of Prednisolone (30 mg/kg) on gene expression in mice spieen cells at 24h after application (n=5)
TNF-a IL-1 B RANTES
Figure imgf000022_0001
Ein Beispielparameter für die Verminderung der spontanen Proteinexpression, welcher die antientzündlichen und immunsuppressiven Wirkungen von GR-Liganden widerspiegelt, ist die durchflusszytometrisch in einem Vollblutassay bestimmte MHC Klasse Il (HLA-DR)-Expression auf den Monozyten.
Figure imgf000022_0002
Als besonders geeignet für den in vitro- und ex wVo-Nachweis der Transrepressionsaktivität von GR-Liganden im primären unstimulierten Immunzellen erwiesen sich die m-RNA-Expression von IL-1 ß, IL-8 (nur im humanen System verfügbar), Rantes und insbesondere die von TNF-α. 3.3 Gen- und/oder Protein-Induktion als Parameter für die Transaktivierungsaktivität
Eine Induktion von Genen durch Standardglukokortikoide in Immunzellen ist bekannt (Galon J, FASEB J. 2002,16:61 ).
Für die nachfolgenden in unserem Screening identifizierten Gene konnten wir eine Korrelation der Induktion in unstimulierten Immunzellen mit den Transaktivierungseigenschaften von selektiven GR-Liganden nachweisen: Zytokinrezeptoren (z.B. TNF-R1 , IFN-γR1 , IL-1 R1 , IL-2Rα, IL-13Ra, GITR, CXCR4), CD163, FKBP51 , Annexin 1 , IL-2, ß2-Adrenorezeptor, MIF, GILZ, Hämoxygenase 1 , Thrombospondin 1 und Glutaminsynthetase. Diese Proteine sind z.T. wesentlich in die antientzündlichen und metabolischen Wirkungen von GR-Liganden und in die Regulation der GR-Wirkungen involviert. Es wurden z.T. zur Literatur gegenläufige Ergebnisse erhalten, so wurde z.B. eine Repression, nicht Induktion, der Expression von IL-1 RA beobachtet (nicht dargestellt).
Als besonders geeignet für den in vitro- und ex wVo-Nachweis der Transaktivierungsaktivität von GR-Liganden erwiesen sich die Gen- und/oder Proteinexpression von CD163, FKBP51 , GILZ und der Glutaminsynthetase.
Die Abbildung zeigt die Induktion von Genen durch Prednisolon in 4-Stunden-Kulturen humaner PBMC.
Effect of Prednisolone (1e-7 mol/l) on gene expression
Figure imgf000024_0001
Die Dosisabhängigkeit der Wirkung von Prednisolon auf die Genexpression zeigt die nachfolgende Abbildung an ausgewählten Parametern für die Transrepressions- und für die Transaktivierungsaktivität von GR-Liganden.
Figure imgf000024_0002
duktion der Expression ausgewählter Gene wurde in den Milzzellen von n behandelten Mäusen nachgewiesen.
Effect of Prednisolone (30 mg/kg) on gene expression in mice spieen cells at 24h after applicaüon (n=5)
7,0
,2 6,0
5,0
0)
2 o w 4,0
Ε ■o
2 3,0
Q. O
2 2,0
1,0
FKBP51 CD163 Ainexin i GILZ Gutarrin syrthetase
Nachfolgend sind die durchflusszytometrisch nachgewiesenen steigernden Wirkungen von Prednisolon auf die Protein-Expression von Rezeptoren auf den Monozyten in humanen Vollblutkulturen dargestellt. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Granulozyten gefunden.
Zusammenfassend sind sowohl Untersuchungen der Genexpression als auch der Proteinexpression in Immunzellen geeignet, die hemmenden (Transrepression) bzw. steigernden Wirkungen (Transaktivierung) von GR-Liganden zu charakterisieren. Die Korrelation derartiger Ergebnisse mit den Ergebnissen von Transaktivierungs- und Transrepressions-Screeningassays wird im weiteren gezeigt. 4 Selektive GR-Agonisten (SEGRA) aus WO 00/32584 und WO 02/10143
Nachfolgend sind die Assays für die Charakterisierung des molekularen Mechanismus der SEGRA-Substanzen im Screening sowie die Ergebnisse für zwei ausgewählte SEGRA-Substanzen mit unterschiedlicher Transaktivierungsaktivität dargestellt.
Diese Assays dokumentieren den Status heute üblicher Verfahren zur Charakterisierung des molekularen Mechanismus von GR-Liganden anhand von Rezeptor- assays bzw. Promoterassays in Zelllinien.
4.1 Charakterisierung des molekularen Mechanismus von GR-Liqanden
Als erstes werden die Substanzen Rezeptorbindungstesten unterzogen, um die Bindung an den GR und gleichzeitig die Selektivität für den GR zu zeigen.
Die Bindung der Substanzen an den Glukokortikoidrezeptor (GR) und weitere Steroidhormon-Rezeptoren (Mineralokortikoidrezeptor (MR), Progesteronrezeptor (PR) und Androgenrezeptor (AR)) wird mit Hilfe rekombinant hergestellter Rezeptoren überprüft. Hierzu dienen Extrakte aus Sf9-Zellen, die mit Baculoviren, welche die kodierenden Sequenzen für den jeweiligen Steroidhormon-Rezeptor enthalten, infiziert waren. Im Vergleich zur Bezugssubstanz [3H]-Dexamethason zeigen die Substanzen eine hohe bis sehr hohe Affinität zum GR.
Zur Bestimmung der transaktivierenden Aktivitäten von SEGRA-Substanzen werden zwei Testsysteme verwendet. Der Promoter des Mouse mammary tumor virus (MMTV) enthält spezifische Bindungsstellen für den aktivierten GR (sog. GREs). Dieser Promoter wurde vor ein Reportergen (Luciferase) kloniert und das Konstrukt stabil in das Genom der humanen Zelllinie HeLa (cervix Carcinoma cells) integriert. Durch Zugabe von Test- und Referenzsubstanzen wird der MMTV-Promoter aktiviert und die Luciferase exprimiert, deren Aktivität mittels photometrischer Messung nachweisbar ist.
In einem zweiten Transaktivierungssystem wird die Induktion der Tyrosinaminotransferase (TAT) durch Glukokortikoide bestimmt. Im Promoter des Gens für die TAT sind ebenfalls GREs lokalisiert, so dass dieses Gen durch Bindung des Ligand-aktivierten GR verstärkt exprimiert wird. Dazu werden Ratten- Hepatomzellen (H4IIE3) für 24 Stunden mit Test- und Referenzsubstanzen behandelt und anschließend die TAT-Aktivität photometrisch bestimmt. Für beide Assays ist sowohl der Nachweis von agonistischen Wirkungen von SEGRA-Substanzen in der Transaktivierung als auch der Nachweis von antagonistischen Wirkungen auf die Induktion der Parameter durch andere GR-Liganden möglich. Zur Bestimmung der Aktivität in der Transrepression wird ein Promotersystem verwendet, welches Teile des Kollagenase-Promoters enthält. Der Promoter wurde vor ein Reportergen (Luciferase) gesetzt und das entstandene Konstrukt stabil in das Genom der humanen Zelllinie HeLa integriert. Nach Stimulation der Zellen mit Phorbolester wird dieser Promoter aktiviert. Die Gabe von SEGRA-Testsubstanzen und Glukokortikoiden inhibiert die Phorbolester-induzierte Promoter-Aktivität. Der Nachweis erfolgt über die photometrische Bestimmung der Luciferaseaktivität.
Die Aktivitäten von SEGRA-Substanzen in den jeweiligen Transaktivierungs- und Transrepressionssystemen werden im Vergleich zu den Aktivitäten der Referenzsubstanz Dexamethason bestimmt.
4.2 Transaktivierunqs-Aqonist Verbindung 1
Die SEGRA-Substanz Verbindung 1 ist in den beiden genannten Transaktivierungsassays als Agonist getestet worden. Verbindung 1 induziert die Aktivität des MMTV-Promoters mit einer Potenz von 10 ± 1.4 nM und einer Effektivität von 73 ± 2.8 % des maximalen Dexamethason-Effektes (n = 2). Die Substanz zeigt bei der Induktion der TAT-Aktivität in den Ratten-Hepatomzellen eine Potenz von 5.7 ± 0.6 nM und eine Effektivität von 86 ± 12.7 % des maximalen Dexamethason-Effektes (n = 2). Sie wirkt weder im MMTV- noch im TAT-Promoterassay antagonistisch.
4.3 Transaktivierungs-Antaqonist Verbindung 2
Im Gegensatz zu Verbindung 1 ist Verbindung 2 ein klarer Antagonist in bezug auf den MMTV-Promotor. Die Substanz antagonisiert die von Dexamethason induzierte
MMTV-Promotoraktivität mit einer Potenz von 85 ± 12 nM und einer Effektivität von
119 ± 3,6 % des maximalen Effektes des GR-Antagonisten RU 486 (n = 3). Am TAT-
Promoter verhält sich Verbindung 2 wie ein Partial-Agonist. Mit einer Potenz von 67 ±
10 nM und einer Effektivität von 43,5 ± 10,6 % (n=2) des maximalen Dexamethason- Effektes wird die Aktivität des TAT-Promotors durch Verbindung 2 induziert. Bei einer Konzentration von 1 μM antagonisiert Verbindung 2 die von Dexamethason induzierte TAT-Aktivität mit 35% des maximalen Effektes von RU 486.
5 Charakterisierung der Transaktivierungs- und Transrepressions-Aktivität von Verbindung 1 und Verbindung 2 mittels Genexpressionsanalyse in s primären Immunzellen
Im folgenden wird beispielhaft die Anwendung der Charakterisierung der Transaktivierungs- und Transrepressionsaktivität von selektiven GR-Liganden mittels Genexpressionsanalyse in primären Immunzellen anhand von zwei SEGRA- Substanzen, des Agonisten in der Transaktivierung, Verbindung 1 , und des 0 Antagonisten in der Transaktivierung, Verbindung 2, vergleichend dargestellt. Der molekulare Mechanismus dieser Substanzen war zuvor in den üblichen Assays charakterisiert worden (siehe 5.2 und 5.3). Die Genexpressionsanalyse wurde mittels quantitativer Real-Time-TaqMan-PCR durchgeführt. Dargestellt sind die Rationes (Mittelwert ± Standardabweichung) der Ergebnisse für die GR-Liganden zu den 5 Ergebnissen für die Vehikelkontrolle.
5.1 In wfro-Erqebnisse an primären humanen Immunzellen
Die SEGRA-Substanzen zeigen eine vergleichbare Hemmung der Expression von Zytokinen in humanen PBMC als Parameter für die Transrepressionsaktivität.
Figure imgf000030_0001
Im Gegensatz dazu spiegelt sich das unterschiedliche Transaktivierungsprofil der SEGRA-Substanzen in einer unterschiedlich starken Induktion von Genen wider. Während der Agonist, Verbindung 1 , die Gene deutlich induziert, führt der Antagonist in der Transaktivierung, Verbindung 2, zu einer geringeren bzw. keiner Geninduktion.
Figure imgf000030_0002
Für die Parameter CD163 und FKBP51 wurde zusätzlich der Zeit-abhängige Einfluss von GR-Liganden auf die mRNA-Expression in humanen Vollblutkulturen untersucht. Während Prednisolon und der Agonist in der Transaktivierung, Verbindung 1 , die Expression dieser Gene nachhaltig induzierten, führte der Antagonist in der Transaktivierung, Verbindung 2, nicht zum Anstieg der Genexpression.
2
Figure imgf000031_0001
Weiterhin wurde untersucht, ob der Antagonist in der Transaktivierung die Geninduktion durch das Standardglukokortikoid Prednisolon für ausgewählte Parameter für die Transaktivierungsaktivität selektiv verhindern kann. Sowohl Prednisolon als auch Verbindung 2 führen zur Suppression der mRNA- Expression der Transrepressionsparameter TNF-α und IL-1 ß in humanen PBMC- Kulturen. Die Kombination beider GR-Liganden führt zu ähnlichen Ergebnissen wie die Einzelgabe. ZK 243185 antagonizes gene induction by prednisolone in human PBMC culture (20h, n=1)
Figure imgf000032_0001
Im Unterschied dazu werden die Transaktivierungsparameter CD163 und FKBP51 nur durch Prednisolon, nicht aber durch den Antagonisten in der Transaktivierung, Verbindung 2, induziert. Die gleichzeitige Gabe von Verbindung 2 und Prednisolon resultiert in einer im Vergleich zur alleinigen Prednisolongabe deutlich geringeren Induktion der Transaktivierungsparameter. Tatsächlich wird die CD163-Expression durch Verbindung 2 in allen Ansätzen reduziert.
Diese Daten belegen, dass die ausgewählten Parameter in dem von uns definierten neuen Testsystem, d.h. in unstimulierten primären Immunzellen, für den Nachweis einer antagonistischen Aktivität von selektiven GR-Liganden geeignet sind.
5.2 In wVo-Erαebnisse in der Maus
Die Verminderung der Nebennierengewichte nach einer Applikation der SEGRA- Substanzen über 5 Tage belegt, dass beide Substanzen in der gewählten Dosierung (30 mg/kg) in vivo aktiv sind. Adrenal welghts of mlce (5/group) SEGRA s.c. appllcation (30 mg/kg) over S days
Figure imgf000033_0001
Vβhlclβ ZK 238587 ZK 243185
Die in wVo-Regulation der Expression ausgewählter Gene wurde in den Milzzellen von mit SEGRA behandelten Mäusen nach 24 Stunden charakterisiert.
Die Inhibition von inflammatorischen Zytokinen als Parameter für die Transrepression war für den Antagonisten in der Transaktivierung, Verbindung 2, geringer ausgeprägt als für den Agonisten, Verbindung 1. Durch beide Substanzen wurde die Expression dieser Gene jedoch signifikant im Vergleich zur Vehikelkontrolle gehemmt.
Nachfolgend sind die Ergebnisse für die in wVo-Regulation von ausgewählten Genen dargestellt, deren Induktion mit der Transaktivierungsaktivität von GR-Liganden korreliert.
Figure imgf000034_0001
Die Behandlung mit dem Agonisten in der Transaktivierung, Verbindung 1 , führt zu einer deutlichen Induktion der Expression von FKBP51 , CD163, GILZ und Glutaminsynthetase in den Milzzellen. Im Unterschied dazu vermindert der Antagonist in der Transaktivierung, Verbindung 2, die Expression dieser Gene.
Für alle ausgewählten Parameter ist für den Transaktivierungsantagonisten nicht nur eine verminderte Induktion sondern sogar eine Hemmung der Genexpression nachweisbar. Es ist wahrscheinlich, dass dieser Effekt durch die Antagonisierung der Transaktivierungsaktivität der endogenen Glukokortikoide bedingt ist.
Zusammenfassend konnte anhand von 2 ausgewählten selektiven GR-Agonisten (SEGRA) der Schering AG gezeigt werden, dass die Untersuchung der Expression von definierten Genen und/oder Proteinen in dem Testsystem der unstimulierten primären Immunzellen geeignet ist, den molekularen Mechanismus von selektiven GR-Liganden hinsichtlich ihrer agonistischen bzw. antagonistischen in vitro und in wVo-Aktivität in der Transaktivierung bzw. Transrepression zu charakterisieren. 5.3 Auswertung der Ratio gemäß Formel 2
Ziel war es, das Ausmaß der Dissoziation einer Substanz durch einen Wert zu charakterisieren, der die unterschiedliche Beeinflussung der Expression verschiedener Transrepressions- und Transaktivierungsparameter zusammenfassend widerspiegelt.
Zur Charakterisierung der dissoziierten Wirksamkeit der SEGRA-Testsubstanzen wurde deshalb ein Dissoziationsfaktor definiert, der die Dissoziation von Transaktivierung- und Transrepressionsaktivität anhand der Induktion bzw. Suppression ausgewählter Gene darstellt.
Als Parameter, welche Hinweise auf den Mechanismus der Transrepression darstellen könnten, wurden TNF-α und IL-1ß ausgewählt. CD163 und FKBP51 werden zum Nachweis der Transaktivierungsaktivität verwandt.
Nachfolgend wurde eine Ratio zwischen den auf Prednisolon normierten Transrepressions- und Transaktivierungsparametern nach Formel 2 gebildet:
Ra
Figure imgf000035_0001
Die Faktoren für die Transaktivierungs- und Transrepressionsaktivität wurden geometrisch gemittelt und ins Verhältnis zueinander gesetzt. Eine verminderte Geninduktion von CD163 und FKBP51 führt nach dieser Formel bei einer mit Prednisolon vergleichbaren Suppression von TNF-α und IL-1 ß zu einem Anstieg der Ratio auf Werte > 1. Je höher die Ratio ist, desto dissoziierter ist der GR-Ligand im Vergleich zu Prednisolon (Ratio = 1 ). Die Ergebnisse werden in der folgenden Grafik dargestellt.
Figure imgf000036_0001
Prednisolon Dexamethason Verbindung 1 Verbindung 2 le-7 M le-8 M le-5 M le-5 M
Agonist Antagonist in in
Transaktivierung
Abbildung: Ratios zur Darstellung der in vitro-Dissoziation der GR-Liganden im Vergleich zu Prednisolon in PBMC-Kulturen (n=3) nach 1, 2, 4, 12 und 24 Stunden.
Die Ratios wurden nach der Normalisierung der Genexpressionswerte auf Prednisolon aus dem Quotienten des geometrischen Mittels der Parameter für die Transrepression (TNF-α und IL-1ß) und für die Transaktivierung (CD 163 und FKBP51) berechnet. Mittelwerte ±SD.
Zusammenfassend konnte aus den Genexpressionswerten in PBMC-Kulturen eine Ratio (Dissoziationsfaktor) erstellt werden, der den unterschiedlich stark dissoziierten molekularen Mechanismus der SEGRA-Testsubstanzen im Vergleich zu Prednisolon charakterisiert. Insbesondere für den TA-Antagonisten ist eine gute Persistenz des Ratio-Anstiegs (beginnend mit dem 2 Stunden-Wert) über die Zeit zu beobachten. Die Standard-GK Prednisolon und Dexamethason sind anhand dieses Dissoziationsfaktors in ihren Transrepressions- und Transaktivierungseigenschaften zu allen Zeitpunkten weitgehend vergleichbar. 5.4 In vivoVersuche
Kinetik Genexpression in Milzzellen von mit GR-Liqanden behandelten Mäusen
Zum Darstellen der dissoziierten in vivo-Wirksamkeit der SEGRA-Testsubstanzen wurde, wie im in vitro-Kinetik-Versuch, ein Dissoziationsfaktor berechnet In diesen Faktor gingen die auf die Expression nach Prednisolonbehandlung (Mittelwert der Prednisolongruppe zu den verschiedenen Zeitpunkten) normierten Genexpressionswerte für die Parameter für die Transrepression und Transaktivierung ein.
Parameter für die Gensuppression waren TNF-α und IL-1ß, Parameter für die Geninduktion CD163 und FKBP51. Der Dissoziationsfaktor wurde entsprechend der erläuterten Formel 2 aus dem Quotienten der geometrischen Mittelwerte der Transrepressions- und der Transaktivierungsparameter berechnet.
Die obige Abbildung stellt die Kinetik der Ratios für die Dissoziation im Vergleich zu Prednisolon für die SEGRA-Testsubstanzen graphisch dar. Für alle SEGRA- Testsubstanzen wurde 24 Stunden nach Applikation die größte in wVo-Dissoziation nachweisbar. Die geringste Dissoziation wurde für alle SEGRA-Testsubstanzen nach 6 Stunden beobachtet. Für den TA-Agonisten und TA-Partialagonisten waren die Werte sogar signifikant niedriger im Vergleich zu Prednisolon.
Figure imgf000038_0001
in in
T r a n s a k t i v i e r u n g
Abbildung: Ratio zur Darstellung der in vivo-Dissoziation der GR-Liganden im Vergleich zu Prednisolon in den Milzzellen von Balb/c-Mäusen (n=5) nach 2, 6 und 24 Stunden.
Die Ratios wurden nach der Normalisierung der Genexpressionswerte auf Prednisolon aus dem Quotienten des geometrischen Mittels der Parameter för die Transrepression (TNF-a und IL- Iß) und för die Transaktivierung (CD 163 und FKBP51) berechnet.
Zusammenfassend erwiesen sich die ausgewählten Parameter auch in vivo als geeignet, die Transrepressions- und Transaktivierungsaktivität der GR-Liganden und die dissoziierte Wirkung des TA-Partialagonisten und des TA-Antagonisten darzustellen. Insgesamt war jedoch die in wVo-Dissoziation in den Mausmilzzellen geringer und nicht so konsistent wie in den in w'fro-Versuchen an humanen PBMC. Zumindest mitverantwortlich hierfür ist die geringere Aktivität der SEGRA- Testsubstanzen in der in wVo-Suppression der Transrepressionsparameter TNF-α und IL-1ß. 5.5 Darstellung der Nutzung der Parameter zum Nachweis einer antagonistischen Wirkung
Die bisherigen Ergebnisse zeigten nur den unterschiedlichen Agonismus von GR- Liganden, d.h. z.B. eine verminderte bzw. fehlende Induktion von CD163 und FKBP51 durch den Antagonisten in der Transaktivierung ZK 243185 (Verbindung 2).
Die Parameter können auch genutzt werden, um direkt den Antagonismus darzustellen, indem die TA-vermittelte Geninduktion durch ein Standard-Glukokortikoid wie Prednisolone verhindert wird in primären humanen Immunzellen, während die TR- vermittelte Hemmung z.B. der TNFa-Expression nicht beeinträchtigt ist. D.h., man sieht eine Dissoziation im Antagonismus.
e
e
Figure imgf000039_0001

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Charakterisierung der Transaktivierungs- und Transrepressionsaktivität von Glukokortikoidrezeptor(GR)-Liganden durch Gen- und/oder Proteinexpressionsanalyse GR-sensitiver Gene dadurch gekennzeichnet, dass folgende Schritte durchgeführt werden: a) Exposition primärer Immunzellen mit einem GR-Liganden, b) Nachweis der Regulation der Expression von mindestens einem GR- sensitiven Gen zur Bestimmung der Transrepression, c) Nachweis der Regulation der Expression von mindestens einem GR- sensitiven Gen zur Bestimmung der Transaktivierung d) Normierung der erhaltenen Werte durch Bezug auf ein bekanntes Glukokortikoid e) Bildung der Ratio gemäß Formel 1
Figure imgf000040_0001
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass für die Charakterisierung der Transaktivierung die Expression von IFN-γR1 , TNF-R1 , IL-1 R1 , IL-2Rα, IL-13Ra, CXCR4, GITR, ß2-Adrenorezeptor, Hämoxygenase 1 , IL-2, MIF, Annexin 1 , Thrombospondin 1 bestimmt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass für die
Charakterisierung der Transaktivierungsaktivität die Induktion von CD163, FBKP51 , Glutaminsynthase oder GILZ bestimmt wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass für die Charakterisierung der Transrepressionsaktivität die Suppression von HLA-DR, CD86 oder der proinflammatorischen Zytokine IL-ß, IL-8, TNF-α oder Rantes bestimmt wird.
5. Verfahren zur Charakterisierung der Transaktivierungs- und Transrepressionsaktivität von Glukokortikoidrezeptor(GR)-Liganden durch Gen- und/oder Proteinexpressionsanalyse GR-sensitiver Gene dadurch gekennzeichnet, dass folgende Schritte durchgeführt werden: a) Exposition primärer Immunzellen mit einem GR-Liganden, b) Nachweis der Regulation der Expression von TNF-α und IL-1ß, c) Nachweis der Regulation der Expression von CD163 und FKBP51 , d) Normierung der erhaltenen Werte durch Bezug auf ein bekanntes Glukokortikoid e) Bildung der Ratio gemäß Formel 2
Ratio =
Figure imgf000041_0001
6. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die primären Immunzellen unstimuliert sind.
7. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteinnachweis an den Zellen oder nach Sekretion in Flüssigkeiten erfolgt.
8. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die primären Immunzellen aus lymphatischen Organen, aus Knochenmark oder aus Blut untersucht werden.
9. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Blut dem lebenden Organismus entnommen worden ist.
10. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Normierung der Transrepressions- und der Transaktivierungsparameter auf Prednisolon erfolgt.
11. Verwendung der Verfahren der vorhergehenden Ansprüche zum Nachweis der kompetitiven oder nicht-kompetitiven agonistischen, partialagonistischen, partialantagonistischen oder antagonistischen Aktivität eines GR-Liganden.
12. Verwendung der Verfahren gemäß der Ansprüche 1-10 in in vitro- und in vivo- Experimenten und als Biomarkerassay.
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