WO2006121156A1 - 皮膚再生を促進する医療用組成物 - Google Patents

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skin
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saccharide
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Yasuhiro Kanatani
Tetsuro Kiyozumi
Yoshiaki Okada
Daizoh Saitoh
Masayuki Ishihara
Hirofumi Yura
Yoshinori Misawa
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Yaizu Suisan Kagaku Kogyo Co Ltd
NeTech Inc
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Yaizu Suisan Kagaku Kogyo Co Ltd
NeTech Inc
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    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like

Definitions

  • the present invention relates to a medical composition that can promote skin regeneration, comprising a photocrosslinkable chitosan derivative and a sugar such as glucose and / or an amino acid such as glycine.
  • the skin originally has a self-repair function, and if it is a mild wound such as a simple trauma, the skin is regenerated by the self-repair function, but it is difficult to treat severe burns, radiation-exposed complex wounds, wounds, etc. Complete repair is difficult for sexual wounds (Non-patent Document 1).
  • the mechanism of wound healing proceeds in the following order: (1) Inflammatory cells, then connective tissue cells, epidermal cells recognize wounds, (2) wound contractions, and (3) granulation and epithelialization
  • Inflammatory cells then connective tissue cells, epidermal cells recognize wounds, (2) wound contractions, and (3) granulation and epithelialization
  • the cells involved in each stage, various factors, site force-in, secretions, etc. have been elucidated.
  • Skin substitutes have been used to treat patients with full-thickness skin defects.
  • Skin substitutes incorporating epidermal cells are called cultured epidermis
  • skin substitutes incorporating dermal fibroblasts are called cultured dermis
  • those incorporating both are called cultured skin.
  • frozen cultured epidermis is used for the treatment of deep-grade II burns, and the autologous cultured epidermis is replaced by autologous cells.
  • the ability to promote granulation may be epithelial even in full-thickness skin thigh ulcers or severe burns. Have to rely on autologous skin transplants Yes.
  • Apligraf (NOVARTI S), VivoDerm (Convatec) and the like are commercially available as cultured skin in which epidermal cells and fibroblasts are incorporated.
  • problems such as the affinity between the cultured epithelial layer and the dermis layer and the inability to obtain clinical effects in infected wounds, and it is far from the completion of a skin substitute that can replace autologous skin. There is a thing.
  • Non-Patent Document 1 Kenji Takayanagi and Norio Kumagai, “Protein Nucleic Acid Enzyme” No. 45, No. 13, pp. 2832-2287, 2000
  • the problem in the present invention is that the autologous skin graft can be simply immobilized in autologous skin transplantation, which is the only epithelial regeneration method for wide-ranging full-thickness skin defects such as severe burns, and the efficiency of epithelialization is improved. It is to provide a medical composition that can promote skin regeneration by raising the skin. In particular, in the treatment of severe burns, it is known that promoting the formation of granulation at an early stage is greatly involved in the establishment of autologous skin grafts, and the development of simple polymer skin preparations that promote granulation has not been developed. , Means to solve the problems that have been expected of many burn specialists
  • the present invention provides a medical composition
  • a medical composition comprising a base material and a saccharide and Z or an amino acid.
  • a so-called coating material that is used for wounds and supports wound repair and tissue healing / regeneration is preferably used.
  • various nodule gels, nodoid colloids, collagen, gelatin preparations and the like can be mentioned.
  • the photo-crosslinkable chitosan derivative (PRC) used in the present invention is selected from, for example, those described in the WO00 / 27889 pamphlet, and is adhesive with safe ultraviolet light around 400 nm. It is a functional polymer that can be used as an adhesive gel and is suitably used as a medical adhesive. Therefore, the composition of the present invention containing the PRC prevents infection of the affected area while fixing and sealing the transplanted tissue such as autograft by a simple operation, and preserves the active granulation ability of the living body. In addition to the basic characteristics of the PRC, it has characteristics particularly suitable for the use of the present invention including burn healing that there is no fear of re-failure during replacement due to early degradation.
  • the wound healing activity can be enhanced by including a wound healing promoter such as a cell growth factor in the PRC (see WO03 / 090765 pamphlet), the composition of the present invention does not contain a growth factor or the like.
  • a wound healing promoter such as a cell growth factor in the PRC (see WO03 / 090765 pamphlet)
  • the composition of the present invention does not contain a growth factor or the like.
  • autologous skin grafts can engraft other skin substitutes at the wound site, and can be used as a material to support skin grafts for skin wounds such as severe burns. Skin grafts have the effect of promoting epidermis and healing even without a skin substitute, and can be used as a skin wound treatment.
  • composition of the present invention is not a human tissue-derived preparation such as fibrin glue or collagen preparation, which is a conventional adhesive, and therefore has the advantage that there is no risk of infection.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing an outline of a method of an autologous skin transplantation experiment in an example.
  • FIG. 2 is a photomicrograph showing the tissue change of a wound site when the composition (A) of the present invention is used in Example 2.
  • FIG. 3 is a photomicrograph showing the tissue change at the wound site when the composition (B) containing no amino acid and saccharide was used in Example 2.
  • FIG. 4 is a photomicrograph showing a cross-section of a wound site tissue stained with anti-VEGF when the composition (A) of the present invention is used in Example 3.
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing a cross-section of a wound site tissue stained with anti-VEGF when the composition (A) of the present invention is used in Example 3.
  • FIG. 6 is a photograph showing a method for forming and treating artificial burns in Example 6.
  • FIG. 7 is a graph showing the change in thickness of the granulation tissue at the burn site in Example 6.
  • FIG. 8 is a graph showing changes in the number of capillaries at the burn site in Example 6.
  • the photocrosslinkable chitosan derivative (PRC) used in the medical composition of the present invention introduces a photoreactive substituent and a sugar chain structure into a polymer skeleton generally called chitin 'chitosans.
  • a polymer skeleton generally called chitin 'chitosans.
  • at least a part of the 2-position amino group of the darcosamine unit constituting the chitin 'chitosan deacetylated at least partially has a reducing end.
  • a saccharide to be introduced is introduced and a photoreactive functional group is introduced into at least a part of the other.
  • chitin 'chitosans are deacetylated acids obtained by alkali treatment of crustaceans derived from crustaceans such as shrimp shells and force-shells (poly-N-acetylethyldarcosamine). It is a soluble fraction and generally has a constitutional unit represented by the following formulas (1) and (2). In addition, there is no problem even if the raw material is derived from squid cartilage, insects or plants.
  • chitin ⁇ chitosans those having a low degree of deacetylation (usually less than 40%) are “chitin”, and those having a high degree of deacetylation (usually 40% or more) are “ In the present specification, chitins that have been at least partially deacetylated will be collectively referred to as “chitosan”.
  • the chitosan in the present invention is not limited to a naturally derived one, but may be a chemically modified sugar chain having a similar structure synthesized chemically, enzymatically, or fermentation engineering.
  • degree of deacetylation means that the acetylylamino group at the 2-position of the sugar unit constituting chitosan (or poly-N-acetylyldarcosamine) is converted to a free amino group by deacetylation. It is a ratio.
  • degree of deacetylation is quantified by the “colloid titration method” described in “Health Food Standard Criteria (Part 4)”, Japan Health and Nutrition Food Association (1996), p. 55. .
  • the chitosan derivative of the present invention is functionalized by further chemically modifying this chitosan.
  • the degree of deacetylation is at least 40%, particularly 60%. Those in the range of -100%, more particularly 65-95% are preferred.
  • chitosan having a deacetylation degree of 100% can be used only for the structural unit of the above formula (1), and does not include the structural unit of the formula ( 2 ).
  • the molecular weight of the chitosan is not particularly limited and can be varied in a wide range depending on the intended use of the final chitosan derivative. Generally, the number average molecular weight is 5,000 to 2,000,000, preferably ⁇ is 10,000 to The power is also 1,800,000, more preferred ⁇ is in the range of 40,000 to 1,500,000 0!
  • a chitosan derivative preferable in the present invention introduces a saccharide having a reducing end in at least a part of the amino group at the 2-position of the darcosamine unit of the formula (1) constituting the chitosan, and the other part is a light A reactive functional group is introduced.
  • chitosan derivatives refer to WO00Z27889 pamphlet.
  • Examples of the saccharide having a reducing end introduced into the chitosan derivative include aldoses and ketoses. Among them, those having 20 or less, particularly 1 to 7 saccharide units are preferred. Used properly. Specifically, for example, pentaose and hexaose such as glucose, fructose, galactose, fucose, mannose, arabinose, xylose, erythrose, heprose, hexylose; darcosamine, N-acetylethyldarcosamine, galaxamine, etc.
  • aldoses and ketoses those having 20 or less, particularly 1 to 7 saccharide units are preferred.
  • pentaose and hexaose such as glucose, fructose, galactose, fucose, mannose, arabinose, xylose, erythrose, heprose, hexylose
  • darcosamine N-acetylethyldarco
  • Amino sugars include sugar derivatives such as uronic acids and deoxy sugars; di- or tri-saccharides such as maltose, isomaltose, ratatoose, melibiose, maltotriose; Among them, neutral disaccharides such as maltose, latatose and melibiose are preferable. In particular, Darcos is preferable.
  • Organic compounds such as polyethers and polyhydric alcohols can be derived into chitosan instead of the above saccharides, but it is preferable to use natural sugar chains in terms of biocompatibility and the like.
  • the introduction of the above saccharide into the 2-position amino group of the darcosamine unit of the formula (1) of chitosan can be carried out using a method known per se.
  • the reducing end of the saccharide is substituted with carboxyl.
  • the amide bond is attached to the 2-position amino group (see, for example, JP-A-10-120705), or the reducing end of the saccharide is aldehyded or carbonylated, and then the 2-position of the darcosamine unit.
  • a method of binding to an amino group by a reduced alkyl group method via a Schiff base for example, Chitin's Chitosan Study Group, “Application of Chitin's Chitosan”, p. 53-56, February 20, 1990, Technical Hall Publishing Co., Ltd.) ) Issuance reference).
  • the sugars introduced into chitosan in the present invention are not limited to only one kind, and two or more kinds can be used in combination.
  • sugar side chain constituting the chitosan derivative of the present invention include, but are not limited to, the following.
  • the degree of substitution of the 2-position amino group of the darcosamine unit of chitosan with the sugar side chain can be varied depending on the physical properties desired for the final chitosan derivative, but the degree of substitution is generally 0.1-80. It is preferred that it is in the range of%, especially 0.5-60%, more particularly 1-40%.
  • the “degree of substitution” of the sugar side chain is such that the amino group at the 2-position of the sugar unit constituting the chitosan is substituted with the sugar side chain, and the free amino at the 2-position of the sugar unit constituting the chitosan.
  • the ratio is the ratio of the substituted amino group to the total of the group and the substituted amino group.
  • the degree of substitution of sugar side chains is measured by the “phenol-sulfuric acid method” which detects the characteristic color development based on the reaction of sugar chains with phenol in sulfuric acid at an absorbance of 490 nm (JEHodge, BTHof reiter, Methods in arbohydrate Chemistry, ed.
  • the chitosan derivative of the present invention is self-crosslinkable by light irradiation by introducing a photoreactive functional group into at least a part of the 2-position amino group of the darcosamine unit of the formula (1) constituting the chitosan. Is granted.
  • the photoreactive functional groups used for the chemical modification of chitosan according to the present invention may be produced by irradiation with ultraviolet light, particularly ultraviolet light containing a near ultraviolet region of about 200 to 380 nm, and / or in the chitosan. It includes groups that react with existing amino groups or hydroxyl groups to form crosslinks, such as cyclic unsaturated compounds such as benzophenones, kainates, azides, diolefins, and bisanthracene. In particular, those having a carbonyl azide group, a sulfonyl azide group or an aromatic azide group are preferred.
  • the photoreactive functional group may be a substituent that reacts with irradiation of visible light of about 400 to 500 nm.
  • a functional group include a formylstilil compound described in Journal of Polymer Science: Polymer Chemistry Edition, Vol. 20, 1419-1432 (1982) as represented by the following formula: Can be mentioned.
  • Ar represents a heterocyclic ring such as pyridine, alkyl pyridinium salt, quinoline, alkyl quinolium salt, etc.
  • the powerful photoreactive functional group can be introduced into the amino group at the 2-position of the darcosamine unit of chitosan by a method known per se.
  • an azide compound having a carboxyl group can be introduced in the presence of a condensing agent.
  • the photoreactive functional group constituting the chitosan derivative (PRC) of the present invention are represented by the following formulas (A) to (D) in the case of ultraviolet rays, for example.
  • the group of formula (A) is one that also induces P-azidobenzoic acid
  • the group of formula (B) is one that induces P-azidebenzaldehyde
  • the group of formula (C) is p-Benzylbenzoic acid power is induced
  • the group of formula (D) is key skin acid power induced
  • formula (E) is 1-methyl-4- [2- ( Formylfuel) etul] pyridium force is to be induced.
  • the degree of introduction of these photoreactive functional groups can be changed depending on the degree of gelation (insolubilization) based on the crosslinking reaction desired for the final chitosan derivative.
  • the degree of substitution is preferably in the range of 0.1% to 80%, particularly 0.5 to 50%, more particularly 1 to 30%.
  • the “substitution degree” of the photoreactive functional group is such that the amino group at the 2-position of the sugar unit constituting the chitosan is substituted with the photoreactive sensitive group, and the sugar unit constituting the chitosan is This is the ratio of the substituted amino group to the total of the 2-position free amino group and the substituted amino group.
  • the degree of substitution of a photoreactive functional group for example, an azide group
  • a calibration curve that also provides the characteristic absorptivity of 270 nm of 4-azidobenzoic acid. it can.
  • the total substitution degree of the sugar side chain and the photoreactive functional group in the chitosan derivative of the present invention is a force that can be changed over a wide range that is not particularly limited, and is generally 0.2 to 80%, preferably 1 5 to 65%, more preferably 3 to 50%
  • An amphiphilic group may be introduced into at least a part of the hydroxyl group, whereby a drastically improved water content can be added to the crosslinked matrix.
  • This amphiphilic group is a group having a hydrophobic block having a hydrophobic group and a hydrophilic block having a hydrophilic group, and generally has a surfactant function in many cases.
  • the group of can be used more suitably.
  • Particularly preferred are polyoxyalkylene alkyl ethers having a molecular weight of at least 90, more preferably 500 to 10,000, which also comprise a hydrophobic alkyl block and a hydrophilic polyoxyalkylene blocking force! /. Does not have a hydrophobic block! ⁇ Ability to use polyethers S, Polyoxyalkylene alkyl ethers having both a hydrophobic block and a hydrophilic block are preferred for improving water content.
  • a powerful amphiphilic group into chitosan is, for example, a group capable of reacting with an amino group to form a covalent bond at either end of the hydrophilic block or hydrophobic block of the amphiphilic group, For example, after introducing a compound having an aldehyde group or an epoxy group, it reacts with the 2-position amino group of darcosamine of chitosan, or reacts a polyoxyalkylene alkyl ether derivative having a carboxyl group with chitosan in the presence of a condensing agent. And a method in which a polyoxyalkylene alkyl ether derivative having an acid chloride group is reacted with a hydroxyl group amino group of chitosan.
  • a polyoxyalkylene alkyl ether group derived from an epoxy group at the end or a polyoxyalkylene alkyl ether group derived from an aldehyde group at the end is introduced into the amino group of chitosan, it is bonded to the chitosan skeleton.
  • the side chain is represented by the following formula (a) or (b).
  • polyoxyalkylene alkyl derivatives having acid chloride groups at the ends are also provided.
  • the side chain bonded to the chitosan skeleton is represented by the following formula (c).
  • n and m in the following formulas (a) to (c) are the number of repeating units of 1 or more.
  • the degree of introduction of the amphiphilic group in the chitosan derivative of the present invention is particularly limited. However, based on the change in the weight of the chitosan derivative after introduction, it can usually be in the range of 5 to 70%, preferably 15 to 55%.
  • a saccharide having a reducing end in the chitosan skeleton and a photoreactive functional group are introduced.
  • an amphiphilic group may be introduced.
  • an insoluble gel body is immediately formed by light irradiation after application to an arbitrary site, so that a graft such as a skin substitute can be fixed to the tissue. It can promote epithelialization and regenerate the skin.
  • any polymer such as a polysaccharide such as hyaluronic acid, a protein such as collagen, or other synthetic polymer may be used in place of chitosan as the polymer constituting the skeleton of the photocrosslinkable chitosan derivative of the present invention.
  • Good are sugars that can seal wounds and tissues, have drug retention and moderate biodegradability, and are capable of controlled release of drugs at a rate that is too fast.
  • chitosan which has antibacterial properties while maintaining high wound healing activity in the living body, or saccharides such as hyaluronic acid, particularly in terms of points such as supply and cost of raw materials, is preferred.
  • a functional group having chemical crosslinkability may be introduced instead of the photoreactive functional group. It is preferable that rapid intramolecular crosslinking is possible and the switching thereof is easy. Since the switching is easy, the reactivity is high, and there are few unreacted active sites. It can be suitably used.
  • chitosan having an amino group at the 2-position is advantageous for the reaction of introducing a photoreactive functional group, and can be suitably used from this point.
  • composition of the present invention is characterized by containing a saccharide and / or an amino acid in addition to the photocrosslinkable chitosan derivative (PRC)! /
  • the amino acid used in the present invention is not particularly limited as long as it is a commonly known amino acid such as glutamine, lanine, serine, and the like, but particularly essential amino acids (ferruleanine, leucine, norin, histidine). Methionine, isoleucine, lysine, threonine, tryptophan, arginine, glycine).
  • the medical composition of the present invention comprises a photocrosslinkable chitosan derivative (PRC), an amino acid, Z or saccharide, and other optional components in a solvent, preferably an aqueous medium, preferably neutral pH. It can be prepared by dissolving with. For example, amino acids or saccharides may be added to PRC in distilled water or phosphate buffer solution (PBS), or the PRC solution may be prepared by mixing with a cell culture medium containing amino acids and / or saccharides.
  • a cell culture medium particularly preferably used in the present invention is a mixed medium (DMEM / F12) of Dulbecco's modified Eagle's medium (D-MEM) and Norm's F12 medium (DMEM / F12).
  • the desired degradation characteristics can be obtained even if the culture medium is a human cell line culture medium that is commercially available from Nissui Pharmaceutical and used in Riken Cell Bank. For other media, see for example http://fonc-p.co.jp/hitoseihin.html and http: //www.brc.rike n.jp/lab/cell/distribution/med—table.shtml. ! ,.
  • the content of the photocrosslinkable chitosan derivative (PRC) in the medical composition of the present invention ensures injectability into the periphery of the skin graft, and ensures that the skin graft is supported by the crosslinked gel.
  • PRC photocrosslinkable chitosan derivative
  • L00 mgZml more preferably at least 150 mg / mU, more preferably 530 mgZml, in particular around 20 mgZml.
  • the content of amino acids and / or saccharides is not particularly limited, but the amino acid is about 0.01 50 mgZml, more preferably about 0.125 mg / ml, and even more preferably about 0.2 200 mg / ml.
  • the desired degradability can be obtained with about 0.1 250 mg / ml, more preferably about 1.0 200 mg Zml, and even more preferably about 1.5 150 mg Zml as the saccharide.
  • the effect of adding these amino acids and saccharides can be obtained in the same way by adding them alone or by mixing them as long as they do not dissolve in the PRC solution before light irradiation.
  • the medical composition of the present invention prepared as described above contains a photocrosslinkable chitosan derivative (PRC), so that light of a predetermined intensity (such as ultraviolet light and visible light) is emitted.
  • PRC photocrosslinkable chitosan derivative
  • the photocrosslinking conditions vary depending on the type and degree of substitution of photoreactive functional groups introduced into the photocrosslinkable chitosan derivative used, the amount of chitosan derivative contained in the composition, and the amount of composition used. However, if a predetermined integrated amount of light by ultraviolet rays having a wavelength of 400 or less is obtained, the cross-linking reaction is quickly achieved and a practical chitosan hydrate gel body can be obtained. For example, when measuring light intensity with a commercially available illuminometer of 365 nm detection type (UIT-150, Usio Electric), the composition achieves good cross-linked hydration gel formation with an integrated light intensity of 50-300 mj / cm 2 .
  • the composition undergoes a cross-linking reaction with ultraviolet light from a UV-LED, excimer laser, mercury lamp, etc. with a wavelength of 400 nm or less, and the irradiation time can be shortened to obtain the required integrated light intensity by increasing the irradiation intensity. It is also possible to obtain a desired hide-mouthed gel body with an irradiation time of seconds or less.
  • the crosslinking reactivity of the photoreactive group of the chitosan matrix is not particularly limited, but the crosslinked chitosan matrix of the present invention is at least 30%, preferably 40 100%, more preferably 50 to: LO 0%, more Preferably 60 to: LOO%, more preferably 70 100% cross-linking reactivity.
  • the “degree of crosslinking reaction (or degree of crosslinking)” as used in the present invention refers to the proportion of the photoreactive functional groups present in the photocrosslinkable chitosan derivative bonded to other functional groups.
  • glucose and amino acids are added to the chitosan gel layer, so that the intermolecular distance of the chitosan molecule after the photocrosslinking reaction is increased, and cell infiltration is caused. Is considered to be easier.
  • Glucose and glutamate are known to stimulate the proliferation of white blood cells!
  • the inventors of the present application believe that the main cause of the effect observed in the present invention is the energy effect of the cells by saccharides or amino acids. That is, in the following examples, a photocrosslinkable chitosan gel is used as the base material, but the chitosan gel is replaced with a base material such as another hydose gel, collagen, or gelatin preparation.
  • the effects of the present invention can be obtained by using a saccharide such as glucose or an amino acid together, and a medical composition containing such a substrate and the saccharide and / or amino acid is also within the scope of the present invention.
  • PRC in which an ultraviolet-reactive functional group and a sugar chain were introduced into the chitosan skeleton was synthesized according to the method described in WO00 / 27889. Specifically, the amino group of chitosan (made by Yaizu Suisan Kogyo Co., Ltd.) with a molecular weight of 800-1000 kDa and a deacetylated degree of 85 derived from shrimp, azide (p-azidobenzoic acid) and ratatoose (ratatobion) Acid) was introduced by a condensation reaction. Due to the introduction of ratatoose, it was soluble at a neutral pH, and the degree of substitution of P-azidobenzoic acid and ratatobionic acid was confirmed to be about 2.5% and 5.0%, respectively.
  • Methyl-4- [2- (4-formylphenol) pyridine] -pyridine (FPP) represented by the following formula is converted into Journal of Polymer science: Polymer Chemistry Edition, Vol.20, 14 19- It was synthesized according to the method described in 1432 (1982).
  • a 3 cm x 3 cm full-thickness skin defect was artificially created on the back of the rat.
  • the cut skin was used as an autologous skin graft, and 12 holes with a diameter of 5 mm were formed in the graft.
  • the graft in which a hole is formed in the entire skin defect region is allowed to stand, (A) when left as it is, (B) when the graft is sutured, and (C) a conventional medical adhesive in the hole. (Siano acrylamide type, product name: manufactured by Dermabond CF & J)), and (D) when the composition of the present invention is filled in the hole and irradiated with ultraviolet rays (wavelength 330 nm x 15 seconds), The following items were evaluated. The results are shown in Table 1.
  • the untreated graft (A) has a significantly lower survival rate when the graft is sutured (B). It takes more than a minute.
  • the Cyanacrylamide adhesive was used (C)
  • the force was excellent in terms of treatment time and survival rate.
  • the composition of the present invention was used (D)
  • all of the treatment time, engraftment rate and granulation formation were excellent.
  • a 4% aqueous solution of PRC (distilled water) was prepared and mixed with an equal volume of medium (DMEM / F12, manufactured by Invitrogen) to obtain the composition (A) of this example. Further, a comparative composition (B) was prepared by mixing with an equal amount of PBS instead of the medium.
  • the medium (DMEM / F12) used in the composition (A) is a serum-free tissue culture medium containing various amino acids, glucose, and other components.
  • the autologous skin graft was allowed to stand at the entire skin defect region of the mouse, filled with the compositions (A) and (B), and irradiated with ultraviolet rays. The results of observation of the cross-sectional tissue at the transplant site are shown in Figs.
  • Example (A) using a medium containing amino acids, glucose and the like and Comparative Example (B) using PBS are shown in FIGS. 4 and 5, respectively.
  • FIG. 4 (A) using the composition of the present invention strong staining was observed inside the PRC gel layer (FIG. 4 (A)).
  • a fibrosis layer containing many neutrophils was present in the upper part of the gel layer, and intense VEGF staining was observed (FIG. 4 (B)).
  • Comparative Example (B) dissolved in PBS, the PRC gel layer was not decomposed, and the PRC gel layer was strongly stained in the lowermost layer in contact with the subcutaneous tissue (FIG. 5 (A)). In the interface region, the PRC gel was denatured into a fibrous shape, and VEGF intensity and staining were observed.
  • composition in which PRC is dissolved in PBS (A)
  • a composition in which 5 mg / ml glutamine is added to (A) ( C) was prepared.
  • a composition (D) was prepared by adding glucose and amino acids at the same concentrations as the compositions B and C.
  • Example 5 A 2 cm full-thickness skin defect was formed on the back of the mouse and treated with the composition of the present invention or a commercially available artificial dermis collagen membrane (Terdermis; made of Thermonet) (no autologous skin transplantation).
  • Tedermis made of Thermonet
  • FIG. 6A A severe burn was artificially formed on the back of the rat, and the necrotic tissue was excised (FIG. 6A).
  • the site was treated with the composition of the present invention (FIG. 6A) or collagen sponge (Terdermis; made of Thermonet) (FIG. 6C) as a support material. That is, an example in which a composition of the present invention (DMEM / F12-containing PRC aqueous solution) was filled in a wound and photocured was compared with an example in which a collagen sponge was used.
  • DMEM / F12-containing PRC aqueous solution DMEM / F12-containing PRC aqueous solution
  • the thickness of the epithelium at 32 days after transplantation reached an average of 67.1 ⁇ m in the case treated with the yarn and the composition of the present invention, whereas in the example treated with the collagen sponge, 55.8 ⁇ m. m. That is, from the results of this example, by using the medical composition of the present invention, the increase in neovascularization following granulocyte infiltration into the chitosan gel layer without using autologous skin grafts, Furthermore, the surprising result that epithelialization is induced was obtained.

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Abstract

　本発明は、広範囲の全層皮膚欠損においても上皮形成を誘導できる唯一の手段である自家皮膚移植において、自家皮膚移植片を簡便に固定化することができ、上皮化の効率を上げて皮膚再生を促すことのできる医療用組成物を提供する。本発明は、光架橋性キトサン誘導体と、アミノ酸及び／又は糖類とを含有することを特徴とする医療用組成物に関する。当該アミノ酸は必須アミノ酸であるのが好ましく、糖類はグルコース、ガラクトース、マンノース、フコースから選択される中性糖であるのが好ましい。

Description

明 細 書
皮膚再生を促進する医療用組成物
技術分野
[0001] 本発明は、光架橋性キトサン誘導体とグルコース等の糖類及び/又はグリシン等の アミノ酸を含有する、皮膚再生を促進することのできる医療用組成物に関する。 背景技術
[0002] 皮膚には元来自己修復機能が備わっており、単純外傷等の軽度の創傷であれば 自己修復機能によって皮膚が再生されるが、重度熱傷、放射線被曝複合創傷、褥創 等の難治性創傷にお!ヽては完全な修復は困難である (非特許文献 1)。
創傷治癒の機序は、（1)炎症性細胞、次いで結合組織の細胞、表皮細胞による損 傷部の認識、（2)創傷部の収縮、そして (3)肉芽形成及び上皮化という順序で進行 するとされており、各段階において関与する細胞、各種因子、サイト力イン、分泌物な どが解明されてきている。
[0003] 皮膚の修復を人工的に行う皮膚創傷治癒の研究も、創面の一時的保護を目的とす る創傷被覆剤の材料改質に始まり、創傷治癒に係わるサイト力インや増殖因子など の薬剤利用による積極的な治癒を誘導する試みにまで及んだ。しかし、単純創傷か ら難治性創傷に至る様々な程度の皮膚創傷に有効な被覆剤や単一成分の薬剤は 未だ存在せず、特に重度熱傷や広範囲外傷にとって重要な上皮形成までを促進- 誘導できる技術は皆無である。
[0004] このような状況にあって、全層皮膚欠損した患者の治療に皮膚代替物が用いられる ようになった。表皮細胞を組み込んだ皮膚代替物は培養表皮、真皮の線維芽細胞を 組み込んだ皮膚代替物は培養真皮、それらの両方を組み込んだ物は培養皮膚と呼 ばれている。
例えば、深達性 II度熱傷の治療には凍結培養表皮が利用されており、同種培養表 皮から自己細胞に置き換わっていく。しかし、小さな全層欠損である場合、全層皮膚 腿潰瘍や ΠΙ度熱傷においても肉芽形成の促進力も上皮化することもあるが、広範囲 全層欠損では培養表皮の生着が悪ぐ最終的には自家皮膚移植に頼らざるを得な い。
[0005] 現在、培養真皮としては、線維芽細胞が組み込まれるマトリックス素材が異なる Tran sCyteや Dermagraft等の製品が Smith & Nephew社から販売されている。し力し、培養 真皮も培養表皮と同様に広範囲の創傷で上皮化を誘導する能力はなぐ機能的創 傷被覆剤の範疇力 逸脱しな 、ものと言える。
一方、表皮細胞と線維芽細胞が組み込まれた培養皮膚として、 Apligraf(NOVARTI S社)や VivoDerm (Convatec社)等が市販されている。しかし、現実には、培養上皮層 と真皮層との親和性の問題や感染創での臨床効果が得られないといった問題があり 、自家皮膚に置換可能な皮膚代替物の完成までにはほど遠 、ものがある。
[0006] また、従来の皮膚代替物は動物性コラーゲンゃヒト血漿成分の利用依存度が高ぐ その安全性も懸念されて 、る。
さらに、重症熱傷に対し人工真皮も使用されるようになっているが、最終的に上皮 化させるためには、再度の自家皮膚移植が必要となる。また、培養皮膚単独の重度 熱傷への移植は有効性に乏しぐ無細胞性の真皮と合わせたハイブリッド型の培養 皮膚を研究して 、る施設もあるが、その臨床評価は未だ定まって 、な 、。
[0007] 即ち、最も機能的な皮膚再生'治療技術を必要とするのは、広範囲重度熱傷など に代表される皮膚付属器の残っていない全層皮膚欠損で、その治癒の鍵は、速や かな真皮形成と上皮形成が握っている。し力しながら、従来の皮膚代替物では、上 皮形成に至らしめる程の能力を有するものは得られていない。よって、唯一、上皮化 誘導が期待できるのは自家皮膚移植のみということになる。しかし、広範囲に熱傷を 受けた場合、自家皮膚移植のために採取できる皮膚の範囲が限られ、創面全体の 上皮化に必要な量を確保することは困難である。さらに、移植組織を皮下組織に強 固に固着するための縫合あるいはスティブラー等による処置は時間を要するのみな らず、術後包帯交換処置の疼痛や再障害の危険を伴い、患者及び医師への負担が 大きいものとなっている。
非特許文献 1 :高柳健二、熊谷憲夫、「蛋白質 核酸 酵素」第 45卷、第 13号、 2283- 2287頁、 2000年
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0008] よって本発明における課題は、重度熱傷などの広範囲全層皮膚欠損における唯一 の上皮再生法である自家皮膚移植において、自家皮膚移植片を簡便に固定化する ことができ、上皮化の効率を上げて皮膚再生を促すことのできる医療用組成物を提 供することにある。特に、重症熱傷の治療においては、早期に肉芽の形成を促進さ せることが自家皮膚移植舳片の定着に大きく関与することが知られており、肉芽形成 を促す単純高分子皮膚製剤の開発は、これまで多くの熱傷専門医に期待されてきた 課題を解決するための手段
[0009] カゝかる課題を解決するため、本発明は、基材と、糖類及び Z又はアミノ酸とを含有 することを特徴とする医療用組成物を提供する。前記基材としては、創傷などに使用 され、傷の修復や組織治癒 ·再生をサポートする、いわゆる被覆材料が好ましく用い られる。例えば、各種ノヽイド口ゲル、ノ、イド口コロイド、コラーゲン、ゼラチン製剤などを 挙げることができる。特に、後述する光架橋性キトサン誘導体から形成されるハイド口 ゲルを用いるのが好まし 、。
発明の効果
[0010] 本発明で使用される光架橋性キトサン誘導体（PRC： Photo-Crosslinkable Chitosa n)は、例えば、 WO00/27889パンフレットに記載されているものから選択され、 400nm 付近の安全な紫外線で接着性のノ、イド口ゲルになる機能性ポリマーであり、医療用 接着剤として好適に用いられるものである。従って、当該 PRCを含有する本発明の 組成物は、簡便な操作によって自家移植片等の移植組織を固定'密閉しながら患部 の感染を予防し、生体が有する活発な肉芽形成能を保全するという PRCが有する基 本的特徴に加え、なおかつ早期分解することにより交換時の再障害の心配がないと いう熱傷治癒を含む本願発明の用途に特に適した特性を有している。
[0011] さらに、驚くべき事に、 PRCを溶解させる媒体に、アミノ酸及び Z又は糖類を共存さ せることにより、好中球を中心とする多核球が速やかにキトサン層に浸潤し、多核球 による VEGF発現亢進、それに伴う新生血管形成、肉芽形成及び上皮形成の促進 力 組織の傷害部位のみならずサポート素材としてのキトサンゲル内でも（PRCの分 解を伴って)観察された。
PRCに細胞増殖因子等の創傷治癒促進剤を含有せしめることにより、その創傷治 癒活性を高めることができるが（WO03/090765パンフレット参照）、本発明の組成物 は、増殖因子等を含有しなくても、自家皮膚移植片ゃ他の皮膚代替物を創傷部位に 生着させることができ、重度熱傷等の皮膚創傷にぉ 、て皮膚移植片をサポートする 素材として使用できるばカゝりではなぐ皮膚移植片ゃ皮膚代替物が存在しなくても上 皮化を促し治癒を促進させる効果があり、皮膚創傷治療薬として使用することもでき る。
また、本発明の組成物は、従来の接着剤であるフイブリン糊やコラーゲン製剤等よう にヒト組織由来の製剤でな 、ことから感染の危険が無 、と 、う利点も有して 、る。 図面の簡単な説明
[0012] [図 1]実施例における自家皮膚移植実験の手法の概略を示す説明図である。
[図 2]実施例 2にお ヽて本発明の組成物 (A)を用いたときの創傷部位の組織変化を 示す顕微鏡写真である。
[図 3]実施例 2にお 、てアミノ酸及び糖類を含まな 、組成物（B)を用いたときの創傷 部位の組織変化を示す顕微鏡写真である。
[図 4]実施例 3にお ヽて本発明の組成物 (A)を用いたときに、創傷部位組織の抗 -V EGF染色した断面を示す顕微鏡写真である。
[図 5]実施例 3にお ヽて本発明の組成物 (A)を用いたときに、創傷部位組織の抗 -V EGF染色した断面を示す顕微鏡写真である。
[図 6]実施例 6にお 、て、人為的熱傷の形成及び処置方法を示す写真である。
[図 7]実施例 6において、熱傷部位の肉芽組織の厚み変化を示すグラフである。
[図 8]実施例 6において、熱傷部位の毛細血管数の変化を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明の医療用組成物で使用される光架橋性キトサン誘導体 (PRC)は、一般に キチン'キトサン類と呼ばれている高分子骨格に光反応性置換基と糖鎖構造とを導 入した構造を有しており、中でも、少なくとも一部が脱ァセチルイ匕されたキチン'キトサ ン類を構成するダルコサミン単位の 2位ァミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有 する糖類を導入し、他の少なくとも一部に光反応性官能基を導入してなるものである のが好ましい。
[0014] 通常、キチン'キトサン類は、ェビ殻や力-殻などの甲殻類由来のキチン質 (ポリ— N—ァセチルダルコサミン）をアルカリ処理することによって得られる脱ァセチルイ匕し た酸可溶性画分であって、一般に下記式（1)、（2)で示される構成単位を有するもの である。その他、イカ軟骨、昆虫や植物由来の原料であっても何ら問題はない。
Figure imgf000007_0001
[0015] これらのキチン ·キトサン類のうち脱ァセチル化度の低いもの（通常 40%未満のもの )を「キチン」、そして脱ァセチル化度の高 、もの（通常 40%以上のもの）を「キトサン」 と呼ぶこともあるが、以下、本明細書では、少なくとも一部が脱ァセチルイ匕されたキチ ン 'キトサン類を総称して「キトサン」という。なお、本発明におけるキトサンは天然由来 のものに限らず、化学的、酵素的、または発酵工学的に合成された類似構造を有す る化学修飾糖鎖であってもよ 、。
ここで、「脱ァセチル化度」とは、キトサン（あるいは、ポリ—N—ァセチルダルコサミ ン）を構成する糖単位の 2位のァセチルァミノ基が脱ァセチルイ匕によって遊離アミノ基 に変換されている割合である。本明細書では、脱ァセチルイ匕度は、「健康食品規格 規準集 (その 4)」財団法人日本健康'栄養食品協会（1996年)第 55頁に記載の「コロ イド滴定法」によって定量される。
[0016] 本発明のキトサン誘導体は、このキトサンをさらに化学的に修飾することにより機能 化したものであり、原料として使用されるキトサンとしては、脱ァセチル化度が少なくと も 40%、特に 60〜100%、さらに特に 65〜95%の範囲にあるものが好適である。な お、脱ァセチルイ匕度が 100%のキトサンは、上記式（1)の構成単位のみ力もなり、式 (2)の構成単位は含まない。 また、該キトサンの分子量には特に制限はなぐ最終のキトサン誘導体の使用目的 に応じて広い範囲で変えることができる力 一般には、数平均分子量が 5,000〜2,0 00,000、好まし <は 10,000〜力も 1,800,000、より好まし <は 40,000〜1,500,00 0の範囲のものが適して!/、る。
[0017] 本発明で好ましいキトサン誘導体は、上記キトサンを構成する式（1)のダルコサミン 単位の 2位のアミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖類を導入し、他の一 部に光反応性官能基を導入したものである。このようなキトサン誘導体の詳細につい ては、 WO00Z27889号パンフレットを参照されたい。
[0018] キトサン誘導体に導入される還元性末端を有する糖類としては、アルドース類、ケト ース類が包含され、中でも、構成糖単位の数が 20個以下、特に 1〜7個のものが好 適に使用される。具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、フコ ース、マンノース、ァラビノース、キシロース、エリトロース、ヘプッロース、へキシロー スなどのペンタオースやへキサオース；ダルコサミン、 N—ァセチルダルコサミン、ガラ クサミンなどのアミノ糖類；ゥロン酸類ゃデォキシ糖類などの糖誘導体；これらの単糖 類を組み合わせた糖鎖力もなる、マルトース、イソマルトース、ラタトース、メリビオース 、マルトトリオースなどの二もしくは三糖類;各種オリゴ糖類などが挙げられるが、中で もマルトース、ラタトース、メリビオースなどの中性二糖類が好適である。特にダルコ一 スが好ましい。
上記糖類に換えて、ポリエーテル、多価アルコールなどの有機化合物をキトサンに 誘導することもできるが、生体適合性などの面で天然の糖鎖を利用するのが好ましい
[0019] キトサンの前記式（1)のダルコサミン単位の 2位ァミノ基への上記の糖類の導入は、 それ自体既知の方法を用いて行うことができ、例えば、糖類の還元性末端をカルボ キシル化した後、該 2位ァミノ基にアミド結合により結合させる方法 (例えば、特開平 1 0— 120705号公報参照）や、糖類の還元性末端をアルデヒド化またはカルボニル化 した後、ダルコサミン単位の 2位ァミノ基に、シッフ塩基を経由する還元アルキルィ匕法 により結合させる方法 (例えば、キチン'キトサン研究会編「キチン'キトサンの応用」 53 -56頁、 1990年 2月 20日、技法堂出版 (株)発行参照)などが含まれる。 本発明でキトサンに導入される糖類は 1種のみに限定されるものではなぐ 2種以上 を組み合わせて使用することもできる。
本発明のキトサン誘導体を構成する糖側鎖の具体例としては、以下のものが挙げら れるが、これらに限られるわけではない。
(0ラタトース力 誘導される糖鎖：
Figure imgf000009_0001
(V)ラミナリビオース力 誘導される糖鎖:
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
(vii) N-ァセチルキトビオース力も誘導される糖鎖:
Figure imgf000010_0003
上記 (i)〜(vii)の糖側鎖のうち、左側に記載したもの力 糖のカルボキシル基とキトサ ンの 2位ァミノ基との縮合によって導入される残基を表し、右側に記載したものが、シ ッフ塩基を介して結合させた残基を表す。
このようにして、キトサンのダルコサミン単位の 2位アミノ基を糖類で置換することによ り、キトサンの酸依存的溶解性が緩和され、中性領域での可溶化が達成される。 キトサンのダルコサミン単位の 2位ァミノ基の糖側鎖による置換度は、最終のキトサ ン誘導体に望まれる物性などに応じて変えることができるが、置換度が、一般的には 0. 1〜80%、特に 0. 5〜60%、さらに特に 1〜40%の範囲内にあるのが好適である 。ここで、糖側鎖の「置換度」は、キトサンを構成する糖単位の 2位のアミノ基が糖側鎖 で置換されている程度であり、キトサンを構成する糖単位の 2位の遊離アミノ基と置換 ァミノ基の合計に対する置換アミノ基の割合として示す。本明細書では、糖側鎖の置 換度は、硫酸中で糖鎖がフエノールと反応することに基づく特徴的な発色を 490nm の吸光度で検知する「フエノールー硫酸法」によって測定される (J.E.Hodge, B.T.Hof reiter, Methods inし arbohydrate Chemistry , ed. by R.L. Whistler, M.L.Wolfrom, v ol.l, p388, Academic Press, New York(1962)参照）。 また、本発明のキトサン誘導体は、キトサンを構成する前記式（1)のダルコサミン単 位の 2位ァミノ基の少なくとも一部に光反応性官能基を導入することにより、光照射に よる自己架橋性が付与されている。
本発明に従ってキトサンの化学修飾に使用される光反応性官能基は、紫外線、特 に約 200〜380nmの近紫外領域を含む紫外線の照射によって該光反応性官能基 同士で及び/又はキトサン中に存在するァミノ基あるいは水酸基などと反応して架橋 結合を形成するような基を含み、例えば、ベンゾフエノン類、ケィ皮酸類、アジド類、 ジォレフイン類、ビスアントラセンのような環状不飽和化合物など力 誘導されるもの が包含され、特に、カルボニルアジド基、スルホニルアジド基、芳香族アジド基を有す るものが好適である。
また、光反応性官能基は、約 400〜500nm程度の可視光の照射で反応する置換 基であってもよい。このような官能基としては、例えば、下記式であらわされるような、 J ournal of Polymer Science: Polymer Chemistry Edition, Vol.20, 1419—1432 (1982)に 記載されたホルミルスチリルイ匕合物等が挙げられる。
Figure imgf000011_0001
(上記式中、 Arは、ピリジン、アルキルピリジ-ゥム塩、キノリン、アルキルキノリュウム 塩等の複素環を表す。 )
キトサンのダルコサミン単位の 2位のアミノ基への力かる光反応性官能基の導入は、 それ自体既知の方法により行うことができ、例えば、カルボキシル基を有するアジドィ匕 合物を縮合剤の存在下に該 2位のアミノ基に結合させる方法 (特開平 10— 120705 号公報参照）；酸クロリド基、アルデヒド基、 N—ヒドロキシコハク酸イミドエステル基又 はエポキシ基を介してアジドィ匕合物を該 2位のアミノ基と反応させる方法 (キチン'キト サン研究会編「キチン、キトサンの応用」第 45〜65頁、 1990年 2月 20日、技報堂出版（ 株)発行、参照）等の方法により行うことができきる。上記のホルミルスチリル化合物の ホルミル基をキトサンのァミノ基とカップリングさせることによつても好適に導入できる。 なお、従来、アジド基の架橋反応において、ビスアジド以上の多官能性ィヒ合物が有 効であるとされているが（特開平 9— 103481号公報参照）、本発明ではその必要は なぐモノアジドィ匕合物の導入によっても、十分に自己架橋性を有するキトサン誘導 体が得られる。
[0024] しかして、本発明のキトサン誘導体 (PRC)を構成する光反応性官能基の具体例と しては、例えば、紫外線の場合は、下記式 (A)から (D)で表されるものが挙げられる 。式 (A)の基は、 P—アジド安息香酸力も誘導されるものであり、式 (B)の基は、 P—ァ ジドベンズアルデヒド力 誘導されるものであり、式（C)の基は、 p—ベンゾィル安息 香酸力 誘導されるものであり、式 (D)の基は、ケィ皮酸力 誘導されるものであり、 そして式 (E)は、 1-メチル -4-[2- (ホルミルフエ-ル)ェテュル]ピリジ-ゥム力 誘導さ れるものである。
Figure imgf000012_0001
[0025] これらの光反応性官能基の導入の程度は、最終のキトサン誘導体に望まれる架橋 反応に基づくゲル化 (不溶化)の程度等に応じて変えることができるが、光反応性官 能基の置換度が 0.1%〜80%、特に 0.5〜50%、さらに特に 1〜30%の範囲内にす ることが望ましい。ここで、光反応性官能基の「置換度」は、キトサンを構成する糖単 位の 2位のアミノ基が光反応性感応基で置換されている程度であり、キトサンを構成 する糖単位の 2位の遊離アミノ基と置換ァミノ基の合計に対する置換アミノ基の割合 である。本明細書では、光反応性官能基、例えばアジド基の置換度は、 4—アジド安 息香酸の 270nmにおける特性吸収力も得られる検量線に基づいて決定することが できる。
本発明のキトサン誘導体における糖側鎖と光反応性官能基の合計の置換度は、特 に制限されるものではなぐ広い範囲にわたり変えることができる力 一般には 0. 2〜 80%、好ましくは 1. 5〜65%、さらに好ましくは 3〜50%の範囲内とすることができる
[0026] また、本発明のキトサン誘導体では、キトサンを構成する前記式（1)の糖単位の 2位 のァミノ基や、式（1)又は（2)の糖単位の 3位あるいは 6位の水酸基の少なくとも一部 に、両親媒性基を導入してもよぐそれにより架橋後のマトリクスに飛躍的に向上した 含水性を付加することができる。この両親媒性基は、疎水性基を具備する疎水ブロッ クと親水基を具備する親水ブロックとを有する基であり、一般に界面活性剤機能を有 する場合が多い。中でも、疎水ブロック (X)と親水ブロック (Y)の分子量の割合力 X ： Y= 1： 5〜 5： 1のものが好適に用いられ、解離性のイオン基を持たな!、非イオン性の 基がより好適に使用できる。特に、疎水性のアルキルブロックと親水性のポリオキシァ ルキレンブロック力も構成される分子量が少なくとも 90以上、より好ましくは 500〜10, 000のポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好まし!/、。疎水ブロックを持たな!ヽ ポリエーテル類も使用できる力 S、疎水ブロックと親水ブロックの両方を有するポリオキ シアルキレンアルキルエーテルが含水性向上の点力 好ましい。
力かる両親媒性基のキトサンへの導入は、例えば、両親媒性基の親水ブロック又は 疎水ブロックの!/ヽずれか一方の末端に、ァミノ基と反応して共有結合を形成しうる基、 例えば、アルデヒド基やエポキシ基などを持つ化合物を導入した後、キトサンのダル コサミンの 2位ァミノ基と反応させる方法や、カルボキシル基を有するポリオキシアル キレンアルキルエーテル誘導体とキトサンを縮合剤の存在下で反応させる方法、さら には酸クロリド基を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテル誘導体とキトサンの 水酸基ゃァミノ基と反応させる方法などを用いて行うことができる。
[0027] 例えば、末端にエポキシ基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基あ るいは末端にアルデヒド基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基をキ トサンのァミノ基に導入した場合、キトサン骨格に結合した側鎖は下記式 (a)あるいは (b)で表される。また、末端に酸クロリド基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルェ 一テル基をキトサンの 3位または 6位の水酸基に結合させた場合、キトサン骨格に結 合した側鎖は、下記式 (c)で表される。ただし、下記式 (a)〜（c)における n及び mは 1以上の繰返し単位数である。
CH3 -(CHa)r,-0-(CH 2 CH 20)m_CH 2_ CH- CH2- NH- (a)
OH
CH3 - (CH 2)n- 0- (CH - CH - 0)m-CH 2 - CONH- (b)
CH3 -(CHa)n-0-(CH2CH20)m-CH -C0-CH2- (c) 本発明のキトサン誘導体における両親媒性基の導入の程度は、特に制限されるも のではないが、導入後のキトサン誘導体の重量変化に基づいて、通常 5〜70%、好 ましくは 15〜55%の範囲内とすることができる。
[0028] 以上詳細に述べたように、本発明の医療用組成物に使用される光架橋性キトサン 誘導体にあっては、キトサン骨格に還元性末端を有する糖類及び光反応性官能基 が導入され、任意に両親媒性基が導入されていてもよい。糖類を導入することにより 、キトサン誘導体は中性領域での可溶性に優れており、生理的緩衝液や培地などで 溶液ィ匕することができ、蛋白質等の酸やアルカリで変性する可能性のある薬物の活 性を失うことなく混合できる。さらに、光反応性官能基を導入することにより、任意の部 位に適用した後に光照射することによって即時に不溶性ゲル体を形成するので、皮 膚代替物等の移植片を組織に固着させるとともに、上皮化を促進して皮膚を再生さ せることができる。
[0029] なお、本発明の光架橋性キトサン誘導体の骨格をなす高分子として、キトサンに代 えてヒアルロン酸等の多糖類やコラーゲン等のタンパク質、その他の合成高分子など いかなるものを使用してもよいが、創傷や組織を密閉することができて薬物保持性や 適度な生分解性を有し、速すぎな 、速度で薬物のコントロールドリリースができる糖 類が好適であり、中でも、それ自体が生体の高い創傷治癒活性を保全しながら抗菌 性を有するキトサン、あるいはヒアルロン酸等の糖類、特に原材料の供給やコストなど の点力もキトサンが好まし 、。
また、光反応性官能基に代えて化学的架橋性を有する官能基を導入してもよ 、が 、速やかな分子内架橋が可能でそのスイッチングが容易なものであるのが好ましぐ スイッチングが容易で反応性も高く未反応の活性部位が残ることも少な 、ことから、光 反応性官能基が好適に使用されうる。また、 2位にアミノ基を有するキトサンは、光反 応性官能基の導入反応にとっても有利であるため、この点からも好適に使用されうる
[0030] 本発明の組成物は、前記の光架橋性キトサン誘導体 (PRC)に加えて、糖類及び/ 又はアミノ酸を含有することを特徴として！/、る。
本発明で用いられる糖類は、特にグルコース、ガラクトース、マンノース又はフコー ス等の中性の単糖類、二糖類、オリゴ糖類などの比較的低分子量の糖類が好ましい 。特にグルコースが好ましい。ァ-オン性の糖類を使用した場合、キトサン誘導体との 間でポリイオンコンプレックスを形成して光照射しなくてもゲルイ匕してしまうことがある。
[0031] 一方、本発明で用いられるアミノ酸は、グルタミン、了ラニン、セリン等の一般に知ら れたアミノ酸であってよぐ特に限定されないが、特に必須アミノ酸 (フエ-ルァラニン 、ロイシン、ノ リン、ヒスチジン、メチォニン、イソロイシン、リジン、スレオニン、トリプトフ アン、アルギニン、グリシン）を用いるのが好ましい。
[0032] 本発明の医療用組成物は、光架橋性キトサン誘導体 (PRC)及びアミノ酸及び Z又 は糖類、並びに他の任意成分を、溶媒、好ましくは水性媒体に、好ましくは中性の p Hで溶解せしめることにより調製することができる。例えば、 PRCの蒸留水又はリン酸 緩衝液 (PBS)溶液に、アミノ酸又は糖類を添加してもよいし、 PRC溶液をアミノ酸及 び/又は糖類を含有する細胞培養液と混合して調製してもよ ヽ。本発明にお ヽて特 に好ましく用いられる細胞培養液は、ダルベッコの変性イーグル培地（D-MEM)とノヽ ムの F12培地との混合培地（DMEM/F12)である力 機能性ペプチド研究所や日水製 薬で市販されて ヽるものゃ理研セルバンクなどで用いられて ヽるヒト細胞株の培養用 培地などであっても、所望の分解特性 (多核球浸潤特性)を得ることができる。その他 の培地としては、例えば http://fonc-p.co.jp/hitoseihin.html及び http://www.brc.rike n.jp/lab/ cell/distribution/med— table.shtmlを参照された！、。
[0033] 本発明の医療用組成物における光架橋性キトサン誘導体 (PRC)の含有量は、皮 膚移植片周辺部への注入性を確保し、架橋後のゲルによる皮膚移植片の担持を確 実にするために、一般的には 0. 01〜： L00mgZml、より好ましくは少なくとも 1 50 mg/mU更に好ましくは 5 30mgZml、特に 20mgZml程度とされる。
一方、アミノ酸及び/又は糖類の含有量は特に限られないが、アミノ酸としては約 0 .01 50mgZml、より好ましくは約 0.1 25mg/ml、更に好ましくは約 0.2 200 mg/mlで所望の分解性が得られ、また、糖類としては約 0.1 250mg/mlで、より 好ましくは約 1.0 200mgZml、更に好ましくは約 1.5 150mgZmlで所望の分解 性が得られる。これらのアミノ酸類や糖類の添加効果は、 PRC溶液として光照射前に 不溶ィ匕しない限り、単独添加でも混合添加でも同様に得られる。
[0034] このようにして調製された本発明の医療用組成物は、光架橋性キトサン誘導体 (PR C)を含有して!/ヽるため、所定強度の光 (紫外線及び可視光など)を所定時間照射す ることにより、短時間で架橋して不溶性のゲルを形成し、皮膚移植片を固定ィ匕するこ とがでさる。
光による架橋条件は、使用する光架橋性キトサン誘導体に導入した光反応性官能 基の種類や置換度、組成物に含有されるキトサン誘導体の量や、使用する組成物の 量に応じて変化しうるが、 400 以下の波長の紫外線による所定の積算光量が得ら れれば架橋反応が速やかに達成され、実用的なキトサンハイド口ゲル体が得られる。 例えば、 365nm検出タイプの市販の照度計 (UIT- 150、ゥシォ電機）による光量測定 にお 、て、 50-300mj/cm2の積算光量で当該組成物は良好な架橋ハイド口ゲル形成 を達成する。当該組成物は 400nm以下の波長の UV-LED、エキシマレーザー、水銀 ランプなどによる紫外線で架橋反応し、照射時間は照射強度を高くすれば必要な積 算光量を得るまでの時間を短縮でき、 1秒以下の照射時間で所望のハイド口ゲル体 を得ることも可會である。
[0035] キトサンマトリクスの光反応性基の架橋反応度は特に限られないが、本発明の架橋 キトサンマトリクスは、少なくとも 30%、好ましくは 40 100%、より好ましくは 50〜： LO 0%、より好ましくは 60〜： LOO%、さらに好ましくは 70 100%の架橋反応度を有す る。ここで、本発明でいう「架橋反応度 (又は架橋度)」は、光架橋性キトサン誘導体に 存在する光反応性官能基の中で他の官能基等と結合したものの割合を指すものとす る。 [0036] 本発明の医療用組成物を用いた場合、キトサンゲル層にグルコースやアミノ酸が添 カロされていることにより、光架橋反応後のキトサン分子の分子間距離が広がって、細 胞の浸潤が容易になって 、るものと考えられる。
また、アミノ酸の添カ卩によって細胞の浸潤が促進されたのは、アミノ酸のコーティン グ効果であると推察される。すなわち、シアル酸で覆われた酸性粒子である細胞の進 入を妨げていたキトサンのアミノ基を、アミノ酸類が中和したことによって、細胞のモビ リティが容易になったものと考えられる。このような、キトサンゲル内への細胞浸潤を容 易にする添加物効果は、糖類やアミノ酸類を単独で使用しても複合して使用しても有 効であり、その効果を減ずることはない。
[0037] グルコースとグルタミン酸は白血球細胞の増殖を刺激することが知られて!/、る。本 願発明者等は、本発明で観察された効果の主要な原因が、糖類又はアミノ酸による 細胞のエネルギー効果であると考えている。即ち、下記の実施例においては、基材と して光架橋性キトサンゲルを使用して ヽるが、当該キトサンゲルを他のハイド口ゲルや コラーゲン、あるいはゼラチン製剤等の基材に置換しても、グルコース等の糖類又は アミノ酸とを併用することにより本発明の効果が得られ、そのような基材と糖類及び/ 又はアミノ酸とを含有する医療用組成物も本発明の範囲内にある。
実施例
[0038] 以下、本発明を具体例を用いて更に詳細に説明するが、これらの具体例は本発明 の範囲を限定するものではな 、。
(合成例 1)
光架橋性キトサン誘導体 (PRC)の合成
キトサン骨格に紫外線反応性官能基及び糖鎖を導入した PRCを、 WO00/2788 9に記載された方法に準じて合成した。具体的には、ェビ由来の 800〜1000kDaの 分子量及び 85の脱ァセチルイ匕度を持つキトサン (焼津水産工業 (株)製)のァミノ基 に、アジド (p-アジド安息香酸)及びラタトース (ラタトビオン酸)を縮合反応により導入 した。ラタトースの導入により中性領域の pHで可溶性であり、 P-アジド安息香酸及び ラタトビオン酸の置換度力 各々約 2. 5%及び 5.0%であることが確認された。
また、力-殻及びイカ軟骨由来のキトサン素材を使用した場合も、同様の誘導体が 合成できた。
[0039] (合成例 2)
光 (可視光)硬化性キトサン誘導体 (VL-RC)の合成
下記式で表されるメチル -4- [2-(4-ホルミルフエ-ル)ェテュル]ピリジンメトスルホ ネ ~~ト (FPP)を、 Journal of Polymer science: Polymer Chemistry Edition, Vol.20, 14 19-1432 (1982)記載の方法に準じて合成した。
O
H- C -(Q>- CH一 CH -<^N - CH^
CH3SO3" 具体的には、 γ -ピコリン (3.07g,33mmol)のメタノール (8.3ml)溶液を氷冷下、硫酸ジ メチル (4.16g,33mmol)に加えた。溶液を室温で 1時間放置した後、テレフタルアルデヒ ド (13.4g,100mmol)をカ卩え、加熱して溶解させた。続いてピぺリジン (0.47ml)を加え、 5 時間還流した。析出物を熱時口過により除いた。温濾液はエタノール (50ml)とアセトン (16.7ml)の混合溶媒と合わせ、室温で一晩放置した。黄色析出物をろ過により分取し 、エタノール及びアセトンで洗浄後、減圧乾燥をして FPPを得た。収量 4.81g(46%)、 融点 210〜213°Cであった。
[0040] (実施例 1)
ラットの背に 3cm X 3cmの大きさの皮膚全層欠損を人為的に作成した。その際、切 除した皮膚を自家皮膚移植片とし、当該移植片に直径 5mmの孔を 12個形成した。 次いで、前記皮膚全層欠損部位に孔を形成した移植片を静置し、（A)そのまま放 置した場合、（B)移植片を縫合した場合、（C)孔に従来の医療用接着剤 (シァノアク リルアミド系、商品名：ダーマボンド CF &J社製)）を充填した場合、及び (D)孔に本発 明の組成物を充填し、紫外線を照射した場合 (波長 330nm X 15秒間）について、以下 の項目について評価した。結果を表 1に示す。
[0041] [表 1] (A) ( B ) ( C ) (D)
( 1 ) 処置に要した時間 （分） 0. 8 10. 8 5. 5 7. 9
( 2 ) 移植片の生着率 （％) la) 69. 4 97. 2 100. 0 91. 7
( 3 ) 移植片周囲での肉芽形成 l:h> ( f ) (+) (一） (+)
(a)生着率：移植後 5日目のマクロ所見で生着が観察された移植片数 /移植片総数（N=12)。
(b)肉芽形成：
(+) ：移植後 7日目における組織所見で移植片周辺の肉芽組織の形成を認めた。
(一） ：移植後 7日目における組織所見で移植片周辺の肉芽組織の形成を認めなかった。
[0042] 表 1から明らかなように、未処理の移植片 (A)では生着率が格段に低ぐ移植片を 縫合した場合 (B)には生着率は向上するものの、処理に 10分以上の時間を要する。 一方、シァノアクリルアミド系接着剤を用いた場合 (C)には、処理時間及び生着率の 点で優れている力 移植片周辺における肉芽形成が見られな力つた。し力しながら、 本発明の組成物を用いた場合 (D)には、処理時間、生着率、及び肉芽形成の全て の点で優れていた。
[0043] (実施例 2)
PRCの 4%水溶液（蒸留水）を調製し、等量の培地（DMEM/F12、 Invitrogen社製）と 混合して本実施例の組成物 (A)とした。また、前記培地の代わりに等量の PBSと混 合して比較組成物（B)を調製した。組成物 (A)で使用した培地 (DMEM/F12)は、各 種アミノ酸、グルコース、及びその他の成分を含有する無血清組織培養培地である。 実施例 1と同様に、マウスの皮膚全層欠損部位に自家皮膚移植片を静置し、前記 組成物 (A)及び (B)を充填して紫外線照射した。その後、移植部位の断面組織を観 察した結果を図 2及び 3に示す。
[0044] 図 2に示されるように、本発明に係る組成物 (A)を用いた場合には、キトサン層に好 中球が高密度に浸潤し (2日目）、引き続きキトサン層が消失するとともに血管新生、 肉芽形成が見られ (4日目）、さらに上皮化が観察された (8日目）。それに対して、図 3に示すアミノ酸やグルコースを含まな 、組成物（B)を用いた場合は、キトサン層へ の細胞の浸潤が見られず、 8日目になってキトサン層の収縮が認められる力 キトサ ン層直下の糸且織における浸潤は著しく（2日目）、線維芽細胞などによる肉芽の形成 は活発であった。
[0045] (実施例 3)
実施例 2と同様の実験を行い、所定時間（4日）の後、 PRCゲル層を含む組織を取 り出し、抗 -VEGF抗体で免疫染色した。アミノ酸、グルコース等を含む培地を用いた 実施例 (A)及び PBSを用いた比較例（B)で得られた結果を各々図 4及び 5に示す。 図 4に示すように、本発明の組成物を用いた実施例 (A)では、 PRCゲル層内部に 強い染色が認められた（図 4 (A) )。特に、ゲル層の上層部に多くの好中球を含む線 維化した層が存在し、強 ヽ VEGF染色が観察された (図 4 (B) )。
一方、 PBSに溶解した比較例（B)では、 PRCゲル層の分解は見られず、 PRCゲル 層が皮下組織と接する最下層に強 、染色が認められた (図 5 (A) )。当該界面領域で は PRCゲルが線維状に変性し、 VEGFの強 、染色が観察された。
[0046] (実施例 4)
PRCを PBSに溶解した組成物（A)、 (A)に 50mg/mlの D-グルコースを添カ卩した 組成物（B)、及び (A)に 5mg/mlのグルタミンを添加した組成物（C)を調製した。ま た、組成物 Bおよび Cと同じ濃度のグルコースとアミノ酸を添加した組成物（D)を調製 した。
実施例 2及び 3と同様にマウスの背部に皮膚全層欠損部位を作製し、当該部位に 自家皮膚移植片を静置して、前記組成物 (A)、（B)、（C)又は (D)を充填して紫外 線照射により硬化させた。処理後 5日目に組織を採取し、顕微鏡観察によってキトサ ンゲル層への顆粒球の浸潤程度を比較した。結果を表 2に示す。
[0047] [表 2]
Figure imgf000020_0001
備考：
+++：顆粒球がゲル層全体に高密度で浸潤
++：顆粒球がゲル層全体に浸潤
+：顆粒球がゲル層と肉芽との界面付近にのみ浸潤
-：顆粒球のゲル層への浸潤は認められない 実施例 2および 3で認められた培地による添加物効果は、グルコースやアミノ酸単 独でも観察されることが明らかである。また、添加するアミノ酸を必須アミノ酸混合物と しても、同様に有効な顆粒球浸潤が観察できた (データは示さな 、)。
(実施例 5) マウス背部に 2cmの皮膚全層欠損を形成し、本発明の組成物又は市販の人工真 皮であるコラーゲン膜 (テルダーミス；テルモネ土製)で処理した（自家皮膚移植はして いない）。
処理後 6日目には、本発明の組成物で処理した創傷 (A)では、キトサンゲルが既に 消失し、肉芽形成が早く周辺組織力もの上皮化が進行していた。一方、コラーゲン膜 で処理した創傷 (B)では、創傷周辺組織力 の上皮化は観察されるものの、コラーゲ ン膜が残存していた。また、（A)では、紫外線硬化させたキトサンゲルをガーゼ等の 被覆材で覆う必要はないが、（B)ではコラーゲン膜の固定に縫合が必要であり、抜糸 を行う際に再度創傷が生じるという問題が伴った。
[0049] (実施例 6)
ラットの背部に人為的に ΠΙ度熱傷を形成させ、壊死組織を切除した（図 6A)。次い で、当該部位をサポート材としての本発明の組成物（図 6A)又はコラーゲンスポンジ ( テルダーミス;テルモネ土製）（図 6C)で処理した。即ち、本発明の組成物（DMEM/F12 含有 PRC水溶液)を創傷部分に充填して光硬化させた例と、コラーゲンスポンジを用 V、て処理した例とを比較した。
[0050] 本発明の組成物で処理した場合では、移植後 6日目頃力 新生血管の発現が認 められた。それに対して、コラーゲンスポンジを用いた場合には、 6日目では血流量 が少なぐ新生血管の発現は移植後 12日以降にピークに達した。創傷部位における 肉芽組織の厚み及び顕微鏡観察したときの毛細血管数の変化を図 7及び 8に示す。 本発明の組成物により、肉芽形成及び血管新生が著しく促進されたことがわ力る。
[0051] 移植後 32日における上皮の厚さは、本発明の糸且成物で処理した例では平均 67. 1 μ mに達したのに対し、コラーゲンスポンジで処理した例では 55. 8 μ mであった。 即ち、本実施例の結果から、本発明の医療用組成物を用いることにより、 自家皮膚 移植片を使用しなくても、キトサンゲル層への顆粒球の浸潤に続いて新生血管の増 カロ、さらには上皮形成が誘導されるという驚くべき結果が得られた。

Claims

請求の範囲
[1] 基材と、アミノ酸及び,又は糖類とを含有することを特徴とする医療用組成物。
[2] 基材が、ハイド口ゲル、ノ、イド口コロイド、コラーゲン、ゼラチン製剤から選択される ことを特徴とする請求項 1に記載の組成物。
[3] 基材が、光架橋性キトサン誘導体から形成されたものであることを特徴とする請求項
1に記載の組成物。
[4] 前記糖類が、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコースカも選択される中性糖で あることを特徴とする、請求項 1に記載の組成物。
[5] 前記アミノ酸が必須アミノ酸であることを特徴とする、請求項 1に記載の組成物。
[6] 前記光架橋性キトサン誘導体が、下記式（1)及び (2)：
[化 1]
Figure imgf000022_0001
(1) (2) で表される構成単位を含んでなるキチン'キトサン類のダルコサミン単位（1)の 2位ァ ミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖鎖を導入し、他の少なくとも一部に 光反応性基を導入してなる高分子であることを特徴とする、請求項 3に記載の組成物 光架橋性キトサン誘導体を、少なくとも lmgZml含有することを特徴とする、請求項 3 に記載の組成物。
創傷治癒促進薬をさらに含有することを特徴とする、請求項 1から 7のいずれか一項 に記載の組成物。
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