WO2006126325A1 - 抗肥満活性剤及び肥満抑制方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ワカメから抽出されるフコキサンチンは抗肥満活性剤として有効であるが、褐藻類の成熟体に含まれるフコキサンチンの量は少なく、実用的な量を得るには時間と費用がかかる。また、抗肥満活性剤としての効果も更に強い効果を示すものが要望されていた。従って、本願発明の目的はフコキサンチンより更に強い抗肥満活性を呈するカロテノイドを特定し、それを用いた抗肥満活性剤及び肥満抑制方法を提供することにある。 【解決手段】フコキサンチンより抗肥満活性の作用が強いカロテノイドは何か、また経済的に取得するにはどんな材料を用いればよいか、鋭意研究を重ね、その答えをホヤに見い出した。ホヤ（海鞘、Ascidian）は、脊索動物門尾策動物亜門ホヤ綱に属する海産動物の総称であり、全国的に生息している。本願発明では特にホヤの内臓と殻からフコキサンチノールを抽出し、強い抗肥満活性を呈することを明らかにした。 　 　 　 　

Description

明 細 書

抗肥満活性剤及び肥満抑制方法

技術分野

[0001] 本願発明は、カロテノイドの一種であるフコキサンチノール、特にホヤ力 抽出した フコキサンチノールを有効成分とする抗肥満活性剤及び肥満抑制方法に関するもの である。

背景技術

[0002] フコキサンチノールは、同じカロテノイドの一種であるフコキサンチンの OCOCH 3基を— OH基に置換したものである。フコキサンチンは、海藻類、特に褐藻に特異 的に含まれ、強い抗癌活性を示すことが報告されている (非特許文献 1)。非特許文 献 1によれば、フコキサンチンの抗癌活性は、癌細胞の核内転写因子 (PPAR y： pro xisome proliferator activated receptor γ )の働きの増大と密接な関係を持ち、 ΡΡΑ のリガンドとして知られる薬剤、トログリタゾンよりも遙かに強い増殖抑制作用を呈 する。この場合、トログリタゾンとフコキサンチンとを併用することにより、大腸癌細胞の 増殖がそれぞれ単独で添加するよりもより強く抑制されることとなる。

[0003] さらに、フコキサンチンは抗肥満活性としても強い作用があることが報告されている（ 非特許文献 2)。非特許文献 2によれば、フコキサンチンが脂肪細胞に対する分化抑 制作用を示すことが明らかになり、ワカメ油投与による動物実験での体重及び WAT( 白色脂肪組織)の減少は、フコキサンチンによる脂肪細胞への分ィ匕の抑制と、 WAT 中の PPAR γに支配された UCP1 (脱共役蛋白質)の発現による脂肪燃焼に拠るこ とが明らかになった。

[0004] 以上のようにフコキサンチンは、抗癌活性剤及び抗肥満活性剤として強!ヽ作用を呈 することが明らかになつている。ここで、抗肥満に関する機能性食品素材に議論を絞 ると、特に我が国では力テキンゃフラバンジェノールなどのポリフエノール類がすでに 実用化、製品化され一市場を形成している。また、欧米においても肥満力 生じる健 康障害によってより強く健康志向が高まっており、機能性食品素材の開発が激ィ匕し ている。し力しながら、現在までに抗肥満活性である機能性食品素材の研究は始ま つたば力りで、海藻類以外にも抗肥満活性を呈する機能性食品素材が見い出される 可能性は十分にあり得る。然も、その作用効果がフコキサンチンより強い場合もあり得 る。抗肥満活性剤が、資源的に豊富な物質力 手軽に且つ安価に抽出できることに なれば、機能性食品素材の市場も更なる拡大を実現することが可能である。

[0005] なお、特許文献 1は、フコキサンチンの精製方法に関する発明であり、海藻類から 純度の高いフキコサンチンを得る方法が開示されている。また、特許文献 2は、フコキ サンチンを用いた抗酸化剤及び抗酸ィ匕方法に関する発明であり、珪藻類等の藻類 力 抽出したフコキサンチンの抗酸ィ匕能に着目して、これを食品、化粧品及び医薬 品に用いて抗酸化剤とするものである。特許文献 1、 2共にフコキサンチノールへの 言及はない。

[0006] なお、抗酸化剤としての作用とは、次のような作用を言う。体内で必要な酸素の一 部は、体内に取り入れられた後に、酸化力の強い活性酸素となる。この活性酸素は 細胞を傷つけたり、体内の脂肪を酸ィ匕して有害な過酸ィ匕脂質に変えたりする。この過 酸化脂質が血液をどろどろにして動脈硬化や高血圧を引き起こす。このような活性酸 素の働きを抑制する物質を抗酸化剤と ヽぅ。

[0007] 非特千文献 1 : Masashi Hosokawa, Masashiro Kudo, Hayato Maeda, Hiroyuki Kohno,

Takuji fanaka, Kazuo Miyashita," Fucoxanthin induces apoptosis and enhances the antiproliferative effect of the PPAR y ligand, troglitazone, on colon cancer cells , Biochimica et Biophysica Acta, 1675, 113—119 (2004).

非特許文献 2 :今野賢亮、前多隼人、細川雅史、宫下和夫、船山桂、仲野隆久、「ヮ カメ油による抗肥満作用」、 2005年度日本水産学会大会講演要旨集、 pl30.

特許文献 1：特開 2004— 75634号公報

特許文献 2：特開平 7— 224278号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 前述したように、フコキサンチンは抗肥満活性剤として有効である力 褐藻類の成 熟体に含まれるフコキサンチンの量は少なぐ実用的な量を得るには時間と費用がか 力るという問題点があった。また、抗肥満活性剤としての効果も更に強い効果を示す ものが要望されていた。従って、本願発明の目的は従来技術の欠点を解消し、フコキ サンチンより更に強!ヽ抗肥満活性を呈するカロテノイドを用いた抗肥満活性剤及び 肥満抑制方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0009] 本願発明の抗肥満活性剤は、フコキサンチノールを有効成分として成ることを特徴 とする。本発明者らは、フコキサンチンより抗肥満活性の作用が強いカロテノイドは何 力 また経済的に取得するにはどんな材料を用いればよいか、鋭意研究を重ね、そ の答えをフコキサンチノールに見い出した。多くの実験によりフコキサンチノールの杭 肥満活性の効果はフコキサンチンより強いことを確認した。従って、フコキサンチンよ り少ない量で、或いは同量ならばフコキサンチンより効果が大なる抗肥満活性剤を実 現することが可能となった。

[0010] また、本願発明の抗肥満活性剤は、フコキサンチノールを食品、肥料、農薬、化粧 品又は医薬品に添加して成ることを特徴とする。フコキサンチノールそれ自体で抗肥 満活性剤であることは前述の通りである。このフコキサンチノールを食品、肥料、農薬 、化粧品又は医薬品に添加することで、抗肥満活性の機能性食品素材、抗肥満活 性の肥料、抗肥満活性の医薬品などを構成することが出来る。この場合、含有するフ コキサンチノールの量により抗肥満活性の作用の強さを制御することが出来るので、 目的に応じてその量を適宜調整することが可能である。本願発明では、フコキサンチ ノールを添加した食品、肥料、農薬、化粧品又は医薬品もフコキサンチノール抗活性 肥満剤と称している。

[0011] 本願発明の抗肥満活性剤は、前記フコキサンチノールは生体力 抽出したことを特 徴とする。前記生体はホヤが望ましい。ホヤ (海鞘、 Ascidian)は、脊索動物門尾策動 物亜門ホヤ綱に属する海産動物の総称であり、全国的に生息している。このようにホ ャは資源としては豊富に存在する。本願発明では特にホヤの内臓と殻からフコキサ ンチノールを抽出する。従って、食料としての身は身で利用し、残った殻と内臓より抽 出するので、実用的なフコキサンチノールの量を得るのに時間と費用がそれ程力から ず、従来技術の問題点を解決することが出来る。

[0012] また、ホヤ力 抽出したフコキサンチノールは、これまでのワカメより分取されるフコ キサンチンより強い抗肥満活性を示すことが研究により明らかになった。従って、従来 の課題であつたより強い抗肥満活性を示すカロテノイドを見つけることが出来た。

[0013] 本願発明の抗肥満活性剤は、ワカメ力も分取したフコキサンチンを添加したことを 特徴とする。即ち、本願発明のフコキサンチノールに従来力も得られているフコキサ ンチンをカ卩えた抗肥満活性剤である。このように構成することで、フコキサンチンの抗 肥満活性とフコキサンチノールの抗肥満活性の作用とが重なり合って更なる抗肥満 活性を呈することとなる。添加するフコキサンチン及びフコキサンチノールは適宜その 量を調整することが出来ることは言うまでも無い。

[0014] 本願発明の肥満抑制方法は、肥満の抑制にフコキサンチノールを用いることを特 徴とする。前記フコキサンチノールを、食品、肥料、農薬、化粧品又は医薬品に添カロ して肥満を抑制しても良い。

[0015] 本願発明の肥満抑制方法において、前記フコキサンチノールは生体力 抽出した ことを特徴とする。前記生体はホヤであることが望ましい。また、ワカメ力も分取したフ コキサンチンを添加しても良い。

[0016] ホヤ (海鞘、 Ascidian)は、脊索動物門尾策動物亜門ホヤ綱に属する海産動物の総 称であり、全国的に豊富に生息している。本願発明では特にホヤの内臓と殻からフコ キサンチノールを抽出する。従って、実用的なフコキサンチノールの量を得るのに時 間と費用がそれ程かからない。また、ホヤ力 抽出したフコキサンチノールは、これま でのワカメより分取されるフコキサンチンより強い肥満抑制の効果を示すことが研究に より明らかであり、更に、ワカメ力も分取したフコキサンチンを添加することでフコキサ ンチンの肥満抑制効果とフコキサンチノールの肥満抑制効果が相まって、本願発明 の肥満抑制方法は絶大なる効果を発揮する。

発明の効果

[0017] これまでのワカメ力 抽出されるフコキサンチンより強い抗肥満活性を示すフコキサ ンチノールをホヤ力 抽出することが可能となった。これにより、抗肥満活性剤を今ま で以上に安価で大量に取得することが可能となった。また、安価で効果が絶大な肥 満抑制方法を提供することが可能になった。このフコキサンチノールを食品、肥料、 農薬、化粧品又は医薬品に添加することで、抗肥満活性の機能性食品素材、抗肥 満活性の肥料、抗肥満活性の医薬品などを構成することが出来るので、とりわけ機能 性食品素材の市場を拡大することに大きく寄与することが予想される。

発明を実施するための最良の形態

[0018] 以下、本願発明のフコキサンチノール及びそれを用いた抗肥満活性剤の実施の形 態について図を参照しながら説明する。但し、本願発明はこの実施の形態だけに限 定されるものではない。

[0019] 本願発明のフコキサンチノールの抽出方法を説明する。ホヤ中に含まれるカルテノ イドを全て抽出し、そして分離する方法を採用した。まず、ホヤの内臓と殻を取り出し 、その内臓と殻の全重量に対して 2倍量のアセトンを用いて 4日間抽出する。この操 作を 2回繰り返す。

[0020] ホヤのアセトン抽出物をシリカゲルカラムに供し、 n-へキサンとジェチルエーテルを 体積比で 95： 5で混合したものを使って中性脂質、主にトリァシルグリセロールを除去 した後、アセトンを用いて粗カロテノイド画分を溶出する。

[0021] 粗カロテノイド画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィープレートにスポットし、アセトン と n-へキサンを体積比で 4： 6に混合したもので展開し、黄色や橙色を呈したスポット を目印に、大まかに 5つの画分に分け、アセトンを用いてシリカゲル力も溶出した。

[0022] 図 1に、ホヤ抽出物の薄相クロマトグラムを示す。写真撮影した薄相クロマトグラムを 模式的に描写した。 Fractionlから 5に、各種カロテノイドが抽出されている。具体的 には、 Fraction3にハロシンチアキサンチン、 Fraction4にフコキサンチノールが含まれ ていた。それ故、細胞試験及び構造分析をするために、更に下記の精製を行った。

[0023] Fraction3 (ノヽ口シンチアキサンチン）の精製: RP— 8逆相薄層クロマトグラフィープ レート（RP— 8 :ォクチルシランという分離用の担体）にスポットし、メタノールと水を体 積比で 9 : 1に混合したもので展開後、橙色の画分を分離し、アセトンで溶出した。

[0024] Fraction 4 (フコキサンチノール）の精製： RP— 8逆相薄層クロマトグラフィープレー ト（RP— 18 :ォクタデシルシランという分離用の担体）にスポットし、メタノールとァセト ンと水を体積比で 4 : 6 : 2で混合したもので展開後、橙色の画分を分離し、アセトンで 溶出した。

[0025] ハロシンチアキサンチン及びフコキサンチノールの構造は、質量分析及び NMR分 析により同定した。図 2は、同定したフコキサンチノールの構造式を示す。

[0026] 次いで、ホヤ力も抽出したフコキサンチノールとフコキサンチンの抗肥満活性につ いて説明する。実験方法は下の通りである。

[0027] 細胞培養： 3T3— L1前駆脂肪細胞は FBSを 10% (体積比)含む DMEM培地を用 いて 37°C、 CO (5%)存在下で培養した。なお、 FBSは 56°Cで 30分間非働化した

2

ものを用いた。また、細胞は実験ごとに液体窒素中に保存した新しい細胞を使用した

。 96穴マイクロプレートに lwellに対して、 3丁3—1^1前駆脂肪細胞を5 10⁴

、 48時間前培養した。

[0028] 次に、培地を wellから取り除き、 Insulin (10 μ g/mL)、 Dexametazone (0. 25 μ gZ mL)、 IBMX(0. 5mM)を含む DMEM培地をカ卩え、さらに 48時間培養した。その後 、 Insulinのみを 5 μ gZmL含む DMEM培地を用いて培地交換を 4日間隔で培地交換 を繰り返しながら、脂肪細胞への分化誘導を行った。その際、培地にフコキサンチノ ールを添加し分化誘導に及ぼす影響を調べた。

[0029] オイルレッド 0による細胞内脂質の定量： 96穴マイクロプレート中で培養した細胞を ホルマリンにより固定後、オイルレッド 0液を加え、細胞内の脂質を染色した。染色後 、蒸留水で 3回洗浄し、細胞観察を行った。次いで、イソプロパノ—ルを各 wellに加え 、色素を溶出させマイクロプレートリーダーを用いて 490nmの吸光値を測定した。

[0030] GPDH活性測定： GPDH (glycero卜 3- phosphate- dehydro- genase )活性の測定 には GPDH活性測定キット (ホクドー (株》を用いた。即ち、 3T3— L1前駆脂肪細胞を 48時間、 24wellプレートにて前培養後、上記と同様の方法で脂肪細胞への分ィ匕誘 導を行った。培養後培地を取り除き、 PBSにて wellを洗浄後、酵素抽出溶液を wellに 加え細胞を回収した。次に細胞を超音波破砕機にて破砕後、 12800gで遠心分離し 、上清を回収し、酵素活性を測定した。

[0031] 以下、得られた結果について図 3〜5を用いて詳述する。

脂肪蓄積抑制効果:図 3は、 3T3—L1脂肪細胞の分ィ匕に伴う脂肪蓄積に及ぼすフ コキサンチノールの影響を示した説明図である。縦軸は、オイルレッド 0による細胞内 脂質の定量の際のマイクロプレートリーダーを用いて測定される 490nmの吸光値で あり、この値が高いほど脂肪細胞が多いことを意味する。図 3から明らかなように、前 駆脂肪細胞（3T3— LI)は分ィ匕することより細胞内には多くの脂肪が蓄積されている 。これに対して、フコキサンチノール添カ卩によりその蓄積は顕著に抑制されていること が解かる。フコキサンチノールの添加量に比例して、その抑制効果が如実に現れて いる。この結果は、細胞レベルでのフコキサンチノールの抗肥満作用を示すものであ る。従って、フコキサンチノールを添加することは、フコキサンチノールを抗肥満活性 剤として添加していることと同じ意味を有する。

[0032] 図 4は、 3T3— L1脂肪細胞の分ィ匕に伴う脂肪蓄積に及ぼすフコキサンチンとフコ キサンチノールの影響を示した説明図である。図 3にワカメ力も分取したフコキサンチ ンの活性を示した図になっている。図 4から明らかなように、ワカメ力も分取したフコキ サンチンの活性の効果はフコキサンチノールよりも明らかに低い。なお、図示しては Vヽな 、が、ワカメ力も分取したフコキサンチンとホヤ力も抽出したフコキサンチノール を同時に添加すれば、それぞれの効果が重畳されるので、更なる抗肥満活性が期待 できる。ホヤ力も抽出されたフコキサンチノールにワカメ力も分取されたフコキサンチ ンを添加することは必要に応じて行えば良いことである。

[0033] 図 5は、 3T3—L1脂肪細胞の分ィ匕に伴う GPDH活性増大に及ぼすフコキサンチン とフコキサンチノールの影響を示した説明図である。縦軸は、前駆脂肪細胞を 1とした 時の相対 GPDH活性であり、その値が大きい程活性が高いことを意味する。図 5より 、細胞内での脂肪蓄積に関与する酵素（GPDH)活性は、フコキサンチノール添カロ によりこの酵素活性が低下していることが明らかである。この結果は、フコキサンチノ ールの脂肪蓄積抑制効果の少なくとも一部が、こうした脂肪合成酵素活性の阻害に よることを示すものである。一方、ワカメ力 分取したフコキサンチンでは有意な差は 認められなかった。

[0034] 次に動物実験を行った結果について説明する。

動物と飼料：動物実験には KK Ayマウス (雌； 3週齢)を用いた。試験餌料は AIN — 93G組成に従って調製した。飼料中の脂質は動物 13. 5%にした。フコキサンチノ ール添加群では飼料油脂の 0. 2%をフコキサンチノールに置換した。飼料は、調製 後直ちに真空パックして給餌まで— 20°C以下に保存した。

[0035] 飼育と分析： 1週間対照群用の飼料により予備飼育を行い、成長に異常のない固 体を各群 6匹ずつ体重にばらつきがな 、ように群分けした。滅菌ウッドチップ床敷を 入れたプラスチックゲージに群ごとに 2匹ずつ入れて飼育した。飼育室の温度は 23 士 1°C、湿度 50%、明暗を 12時間周期とした。飼料及び水は自由摂取とし、 24日間 実験試料による飼育を行った。

[0036] 給餌期間終了後、 12時間の絶食を行った。ついで、エーテル麻酔下で首より EDT A下採血を行った。臓器は採血後直ちに摘出し、生理食塩水でよく洗い充分に脱血 した。肝臓は秤量の後、分析に供するまで— 40°C以下に保存した。血液中のレプチ ンの濃度および血糖値濃度は市販のキットを用いて測定した。

[0037] 飼育期間中および飼育終了後の動物の状態：対照群 (コントロール)とフコキサンチ ン投与群で体重増加と摂餌量に各群間に有意差は認められず、また摂餌状態、毛 艷、行動にも異常がないことを確認した。また、肝臓重量、小腸重量、肝臓脂質重量 にも両群で差は認められな力つた。

[0038] フコキサンチノールの内臓脂肪軽減作用：図 6は、体重 lOOgあたりの内臓脂肪重 量 (g)を対照群とフコキサンチノール投与群とで比較したものである。図 6に示したよ うに、フコキサンチノール投与により、内臓脂肪重量の有意な減少が認められた。こ のことより、フキサンチノールが脂肪減少作用を有することが分力つた。

[0039] フコキサンチノールによるレプチン及び血糖値低下作用：図 7は、血中のレプチン 濃度 (pgZml)を対照群とフコキサンチノール投与群とで比較したものである。実験 に用いた KK Ayマウスは肥満 ·糖尿病病態マウスであり、内臓脂肪の増大と血糖 値の増加が起こる。内臓脂肪の増大により血中のレブチン濃度が増加するが、フコキ サンチノールによりレブチン濃度が有意に減少することが認められた。

[0040] 図 8は、血糖値濃度 (mgZdl)を対照群とフコキサンチノール投与群とで比較したも のである。図 7から解るように血糖値もフコキサンチノールの投与により減少することが 認められた。これらの結果は、フコキサンチノールによる肥満に伴う関連血中因子の 改善効果を示すものである。

[0041] 以上で説明したように、発明者らは抗肥満活性を示すカロテノイドを種々の分野及 び材料において調査、研究を行うことによって、ホヤ力もフコキサンチノールを抽出し 、その抗肥満活性の作用がワカメ力も分取されるフコキサンチンより強いことを明確に した。これにより、抗肥満活性剤を今まで以上に安価で大量に取得することが可能と なり、効果的な肥満抑制方法を確立することができた。フコキサンチノールを添加し た機能性食品は、機能性食品素材の市場を拡大することに大きく寄与することが予 想される。

産業上の利用可能性

[0042] 本願発明は、フコキサンチノールを有効成分として成る抗肥満活性剤であり、また 肥満の抑制にフコキサンチノールを用いる肥満抑制方法である。フコキサンチノール はホヤ力も抽出したものが望ましい。このフコキサンチノールを添加した食品は機能 性食品として作用する。従って、産業上は食品、とりわけ機能性食品素材の分野で 活用することが可能であり、その他にも医学、農業の分野で応用することが可能であ る。

図面の簡単な説明

[0043] [図 1]本願発明のフコキサンチノールに関わり、ホヤ抽出物の薄相クロマトグラムを示 す。

[図 2]本願発明のフコキサンチノールの構造式を示す。

[図 3]本願発明のフコキサンチノールの 3T3—L1脂肪細胞の分ィ匕に伴う脂肪蓄積に 及ぼす影響を示した説明図である。

[図 4]本願発明のフコキサンチノールの 3T3—L1脂肪細胞の分ィ匕に伴う脂肪蓄積に 及ぼす影響を示した説明図である。但し、フコキサンチンと比較して示している。

[図 5]本願発明のフコキサンチノールの 3T3— L1脂肪細胞の分ィ匕に伴う GPDH活 性増大に及ぼす影響を示した説明図である。但し、フコキサンチンと比較して示して いる。

[図 6]本願発明のフコキサンチノールの動物実験における内臓脂肪重量に及ぼす影 響を示した説明図である。

[図 7]本願発明のフコキサンチノールの動物実験における血糖値濃度に及ぼす影響 を示した説明図である。

[図 8]本願発明のフコキサンチノールの動物実験における血中レブチン濃度に及ぼ す影響を示した説明図である。

Claims

請求の範囲

[1] フコキサンチノールを有効成分として成ることを特徴とする抗肥満活性剤。

[2] フコキサンチノールを食品、肥料、農薬、化粧品又は医薬品に添加して成ることを 特徴とする抗肥満活性剤。

[3] 前記フコキサンチノールは生体力 抽出したことを特徴とする請求項 1又は 2に記 載の抗肥満活性剤。

[4] 前記生体はホヤであることを特徴とする請求項 3に記載の抗肥満活性剤。

[5] ワカメ力 分取したフコキサンチンを添加したことを特徴とする請求項 1乃至 4の何 れか一に記載の抗肥満活性剤。

[6] 肥満の抑制にフコキサンチノールを用いることを特徴とする肥満抑制方法。

[7] 前記フコキサンチノールを、食品、肥料、農薬、化粧品又は医薬品に添加して用い ることを特徴とする請求項 6に記載の肥満抑制方法。

[8] 前記フコキサンチノールは生体力 抽出したことを特徴とする請求項 6又は 7に記 載の肥満抑制方法。

[9] 前記生体はホヤであることを特徴とする請求項 8に記載の肥満抑制方法。

[10] ワカメ力 分取したフコキサンチンを添加したことを特徴とする請求項 6乃至 9の何 れか一に記載の肥満抑制方法。