WO2006129628A1 - 光学活性２－置換プロパナール誘導体の製造法 - Google Patents

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WO2006129628A1
WO2006129628A1 PCT/JP2006/310715 JP2006310715W WO2006129628A1 WO 2006129628 A1 WO2006129628 A1 WO 2006129628A1 JP 2006310715 W JP2006310715 W JP 2006310715W WO 2006129628 A1 WO2006129628 A1 WO 2006129628A1
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carbon
enzyme
candida
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PCT/JP2006/310715
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English (en)
French (fr)
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Takashi Yoshida
Naoaki Taoka
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Kaneka Corp
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Kaneka Corp
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing optically active disubstituted propanal derivatives, particularly optically active 2-alkyl propanal derivatives useful as intermediates for pharmaceuticals or sweeteners. More specifically, it is characterized in that an inexpensively available 2-substituted acrolein derivative is stereoselectively reduced using an enzyme source capable of stereoselectively reducing the carbon-carbon double bond. And an optically active 2-substituted propanal derivative, particularly an optically active 2 -alkyl propaneal derivative.
  • Non-Patent Document 2 New Journal of Chemistry, 24 (12), 973-975 (2000)
  • Non-Patent Document 2 Tetrahedron, 37 (22), 3825-3829 (1981)
  • the object of the present invention is to provide an optically active 2-substituted propanal derivative useful as an intermediate for pharmaceuticals, sweeteners, etc., particularly an optically active 2-alkyl propanal derivative, which is an inexpensive and readily available raw material. It is in providing the method of manufacturing simply from.
  • the present inventors have used an enzyme source capable of stereoselectively reducing the carbon-carbon double bond of a 2-substituted acrolein derivative that is available at low cost.
  • the present inventors have found a method for simply producing an optically active 2-substituted propanal derivative by stereoselective reduction.
  • R is a methyl group having a substituent, an optionally substituted carbon group having 2 to: an LO alkyl group, or an optionally substituted carbon group having 5 to 15 carbon atoms.
  • An enzyme source capable of stereoselectively reducing the carbon-carbon double bond of the 2-substituted acrolein derivative (1) is allowed to act on the 2-substituted acrolein derivative represented by Characteristic general formula (2):
  • a method for producing an optically active 2-substituted propanal derivative represented by the formula (wherein R is as defined above, * represents an asymmetric carbon) is provided.
  • an optically active 2-substituted propanal derivative useful as an intermediate for pharmaceuticals, sweeteners and the like can be easily produced at low cost.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the production method and structure of a recombinant vector PTSYE2G1.
  • the starting material in the production method as an embodiment of the present invention is a 2-substituted acrolein compound represented by the formula (1).
  • the substituent R in the formula (1) may have a methyl group having a substituent, a substituent, or may have a C2-CLO alkyl group or a substituent. Examples thereof include aralkyl groups having 5 to 15 carbon atoms.
  • the substituent in the case of having a substituent is not particularly limited as long as it does not adversely affect the reaction by the enzyme source, and for example, a halogen atom, a hydroxyl group, an aldehyde group, a carboxy group, a cyano group, an amino group or- And substituents such as a tro group.
  • examples of the methyl group having a substituent include a chloromethyl group, a bromomethyl group, a odomethyl group, a hydroxymethyl group, an aminomethyl group, and a cyanomethyl group.
  • alkyl group having 2 to 10 carbon atoms which may have a substituent include a substituted or unsubstituted ethyl group, n-propyl group, iso-propyl group, n-butyl group, sec-butyl group Tert-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group and the like.
  • substituents include a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, and a cyan group, but the substituent is not limited to these unless it adversely affects the reduction reaction of the present invention.
  • the aralkyl group having 5 to 15 carbon atoms which may have a substituent includes a benzyl group, an o-chlorobenzyl group, an m-bromobenzyl group, a p-fluorobenzyl group, and a p-trobenzyl group.
  • a benzyl group an o-chlorobenzyl group, an m-bromobenzyl group, a p-fluorobenzyl group, and a p-trobenzyl group.
  • R is preferably an alkyl group having 2 to 10 carbon atoms which may have a substituent, and more preferably an alkyl group having 2 to 4 carbon atoms which may have a substituent. More preferably an ethyl group, an n-propyl group or an n-butyl group, and most preferably an n-butynole group.
  • the compound represented by the formula (1) is industrially available or can be easily synthesized with industrially available raw material power.
  • 2-ptylacrolein can be easily synthesized by stirring a mixture of n-hexanal, dimethylamine hydrochloride, and 37% formalin solution at 70 ° C. for 24 hours (Journal of chemical research, Synopses 7, 262-3 (1978)).
  • the product in the production method as an embodiment is an optically active 2-substituted propanal derivative represented by the formula (2).
  • R is the same as in the formula (1), and * represents an asymmetric carbon.
  • the 2-substituted acrolein derivative is present in the presence of an enzyme source having an activity of stereoselectively reducing the carbon-carbon double bond of the disubstituted acrolein derivative represented by the formula (1).
  • the optically active 2-substituted propanal derivative represented by the above formula (2) is produced by stereoselectively reducing the double bond of (1).
  • the “enzyme source” includes not only the enzyme having the reducing activity itself, but also a culture of microorganisms having the reducing activity and processed products thereof.
  • the “microorganism culture” means a culture solution or culture containing microbial cells, and may be a processed product thereof.
  • the “processed product” means, for example, a crude extract, freeze-dried cells, acetone-dried cells, or a crushed product of these cells.
  • the enzyme source is immobilized by a known means. It can also be used as a fixed enzyme or a fixed bacterial cell. The immobilization can be performed by a method well known to those skilled in the art (for example, a crosslinking method, a physical adsorption method, a comprehensive method, etc.).
  • the enzyme source having the activity of stereoselectively reducing the carbon-carbon double bond of the compound represented by the formula (1) includes Candida, Kluweromvces Genus, Pichia genus, Rhodotorula genus, Saccharomyces genus, Sporidiobolus genus, Spolobolomvces genus, Trigonopsis genus, Zigo saccharomyces vc , Achromobacter genus, Acidiphilium genus, Alcaligenes genus, Arthrobacter genus, Bacillus genus, Corvnebacterium genus, Escherichia ( Escheri chia), Micrococcus spp., Pseudomonas rot, Noen-Bacillus (Paenibacillus) , Or Xanthomonas (Xanthomonas) fine cattle belonging to the genus. MonoYukari come enzyme source, and the like.
  • examples of the enzyme source having an activity of selectively reducing the carbon-carbon double bond of the compound represented by the formula (1) include Candida cantarellii and Candida.
  • Achromobacter xvlosoxiaans subsp. Denitrincans / Nore 7 Rikunes' Fuecharis (Alcaligenes faecalis), Alkigenes * Alcaligenes sp., Arthrobacter crvstallopoietes (Arthrobacter crvstallopoietes)
  • Achromobacter xvlosoxiaans subsp. Denitrincans / Nore 7 Rikunes' Fuecharis (Alcaligenes faecalis), Alkigenes * Alcaligenes sp.
  • Arthrobacter crvstallopoietes Arthrobacter crvstallopoietes
  • Preferable enzyme sources derived from microorganisms such as Terumum 'Ammonia Guess (Corvnebacterium ammoniagenes) or [3 ⁇ Escherichia coli].
  • the microorganism from which the reductase is derived may be a wild strain or a mutant strain! / ⁇ .
  • microorganisms derived by genetic techniques such as cell fusion or genetic manipulation can also be used.
  • it may be a recombinant microorganism having the ability to produce a reductase derived from these microorganisms.
  • Recombinant microorganisms that produce the enzyme for example, isolate and
  • a step of obtaining a microorganism, and culturing the recombinant microorganism to It can be obtained by a method comprising a step of obtaining (see the method described in International Publication No. WO98Z35025).
  • Examples of the recombinant microorganism as described above include a transformed microorganism obtained by transforming a host microorganism with a vector having a DNA encoding the reductase.
  • the host microorganism is preferably Escherichia coli, more preferably the NADPH dehydrogenase (Old Yellow Enzyme 2) gene (The Journal of Biological chemistry, 268, 6097-6106) derived from the above Saccharomvces cerevisiae. (See (1993)) and Escherichia coli HB101 (pTSYE2) and the like transformed with a vector.
  • the method for obtaining Escherichia coli HB101 (pTSYE2) is described in Example 7 described later.
  • an oxidoreductase classified as EC 1.6.99 by the enzyme classification method of International Biochemistry 'Molecular Biology Union may be used.
  • EC 1.6.99.5 NA DH dehydrogenase (quinone) or
  • EC 1.6.99.6 NADPH dehydrogenase (quinone) is listed as an enzyme, and NADPH dehydrogenase (aka Old Yellow Enzyme) classified as EC 1.6.99.1 is preferred. Better!/,.
  • NADPH dehydrogenases include Candida and Kluyveromyces.
  • yeast (Kluweromvces), Saccharomvces, or Schizosaccharomvces are reported to be widely distributed in yeast, especially from Saccharomvces cerevisiae. NADPH dehydrogenase (Old Yellow Enzyme 2) is preferred.
  • the culture medium for the microorganism used as the enzyme source is not particularly limited as long as the microorganism can grow.
  • a carbon source sugars such as glucose and sucrose, alcohols such as ethanol and glycerol, fatty acids such as oleic acid and stearic acid and esters thereof, oils such as rapeseed oil and soybean oil, and nitrogen sources
  • Inorganic salts such as ammonium sulfate, sodium nitrate, peptone, casamino acid, corn steep liquor, bran, yeast ex.
  • Magnesium sulfate, sodium chloride, calcium carbonate, phosphoric acid 1 As other nutrient sources such as potassium hydrogen and potassium dihydrogen phosphate, a normal liquid medium containing malt extract, meat extract and the like can be used. Cultivation is carried out aerobically. Usually, the cultivation time is about 1 to 5 days, the pH of the medium is 3 to 9, and the cultivation temperature is 10 to 50 ° C.
  • the reduction reaction of the carbon-carbon double bond of the compound represented by the formula (1) is carried out in a suitable solvent in a 2-substituted acrolein derivative represented by the formula (1) serving as a substrate. It can be carried out by adding the enzyme NAD (P) H and the culture or treated product of the microorganism and stirring under pH adjustment.
  • the above reduction reaction conditions vary depending on the enzyme, microorganism or processed product thereof, substrate concentration, etc., but the substrate concentration is usually about 0.1 to: LOO wt%, preferably 1 to 60 wt%.
  • the enzyme NAD (P) H is 0.0001 to 100 mol%, preferably 0.0001 to 0.1 mol%, the reaction temperature is 10 to 60 ° C, preferably 20 to 50 ° C, based on the substrate.
  • the pH of the reaction is 4 to 9, preferably 5 to 8, and the reaction time is 1 to 120 hours, preferably 1 to 72 hours.
  • an organic solvent may be mixed and used.
  • organic solvent examples include toluene, ethyl acetate, n-butyl acetate, hexane, isopropanol, methanol, diisopropyl ether, acetone, dimethyl sulfoxide and the like.
  • the substrate can be added all at once or continuously.
  • the reaction can be carried out batchwise or continuously.
  • a commonly used coenzyme NAD (P) H regeneration system may be used in combination with the reduction step of the embodiment. As a result, the amount of expensive coenzyme used can be greatly reduced.
  • a typical NAD (P) H regeneration system includes, for example, a method using glucose dehydrogenase and glucose.
  • a transformed microorganism in which a gene of a reductase gene and an enzyme (for example, glucose dehydrogenase) having an ability to regenerate a coenzyme on which the enzyme depends is introduced into the same host microorganism, that is, the reduction of the embodiment
  • the same gene for the enzyme-encoding DNA and the enzyme that has the ability to regenerate the coenzyme on which it depends eg, glucose dehydrogenase
  • the transformed microorganism as described above is transformed with a plasmid having both the DNA encoding the reductase and the DNA encoding an enzyme capable of regenerating the coenzyme on which the enzyme depends.
  • Transformed microorganisms As the enzyme having the ability to regenerate the coenzyme, glucose dehydrogenase derived from Bacillus megaterium, which is preferable to glucose dehydrogenase, is more preferable.
  • Escherichia coli is preferred as the host microorganism.
  • An example of such a preferred transformed microorganism is Escherichia coli HB101 (pTSYE2Gl), which will be described later in Examples of the i-art.
  • Culture of transformed microorganisms can be performed using a normal liquid nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients and the like as long as they grow.
  • the activity of an enzyme having a coenzyme regeneration ability in a transformed microorganism can be measured by a conventional method.
  • the activity of glucose dehydrogenase is determined by adding lOO mM glucose, 2 mM coenzyme NADP or NAD, and an enzyme to 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) and reacting at 25 ° C for 1 minute. And calculated from the rate of increase in absorbance at a wavelength of 340 nm.
  • the method for purifying the optically active 2-substituted propanal derivative produced by the reduction reaction is not particularly limited, but it can be isolated directly from the reaction solution or after separating the cells, etc., and then ethyl acetate, toluene, t-butyl methyl ether, hexane, methylene chloride, etc. After extraction with an organic solvent, dehydration, concentration, and purification by distillation, chromatography, and the like. When separating bacterial cells from the reaction solution, it can be performed by a conventional method such as centrifugation or filtration. [0045] 9. Conversion to other derivatives
  • An optically active 2-substituted propionic acid derivative can be produced by obtaining the optically active 2-substituted propanal derivative represented by the formula (2) by the above-described method and then oxidizing the aldehyde group of the compound. . Further, an optically active 2-substituted propanol derivative can also be produced by reducing the aldehyde group of the compound of the formula (2).
  • a liquid medium consisting of 5% glucose, 1% peptone, and 1% yeast extract was prepared, dispensed in 50 ml portions into 500 ml Sakaro flasks, and sterilized with steam at 120 ° C. for 20 minutes.
  • One platinum ear of each of the microorganisms shown in Table 1 was inoculated into each of these liquid media, and cultured with shaking at 30 ° C for 2 to 3 days. Bacteria were collected from the culture by centrifugation, washed with water, added with ice-cold acetone, and dried under reduced pressure to prepare acetone-dried cells.
  • reaction solution is centrifuged, and the substrate and the product in the ethyl acetate layer are analyzed by gas chromatography (GC) using a trifluoroacetyl derivative to obtain the reaction conversion rate and the optical properties of the product. Purity was determined. The results are shown in Table 1 (reaction conversion is 10 to 100%). [0050] Analytical conditions, reaction conversion rates, and optical purity calculation methods are as follows.
  • Capillary column Cyclodex— j8 ⁇ . 25mm I. D. X 60m (manufactured by j & W Scientific)
  • Carrier gas He 300kPa
  • Reaction conversion rate (%) product amount Z (base mass + product amount) X 100
  • Meat extract ⁇ Prepare a liquid culture medium ( ⁇ 56.5) consisting of / 0 , 1% peptone, 0.5% yeast extract, and ⁇ % sodium chloride and pour 5 ml into a large test tube. Steam sterilized for a minute. Each of these liquid media was inoculated with 1 platinum ear of each of the microorganisms shown in Table 2, and cultured at 30 ° C for 23 days with shaking. The cells are collected by centrifugation, washed with lml of lOOmM phosphate buffer (PH6.5), resuspended in 5001 of the same buffer, and transferred to a test tube with a stopper. It was.
  • PH6.5 lml of lOOmM phosphate buffer
  • a test tube with a stopper 5 mg of acetone-dried cells prepared in Example 1 or cells separated from the culture solution prepared in Example 2 were suspended in lOOmM phosphate buffer (pH 6.5) 500 1. Made it cloudy. To this solution, glucose 25 mg NAD and NADP 0.5 mg each and glucose dehydrogenase (manufactured by Amano Enzyme) 5 U were added. Thereafter, 2 mg of each substrate shown in Table 3 was dissolved in ethyl acetate 5001, added to a stoppered test tube, and stirred at 30 ° C. for 20 hours. After the reaction, the reaction solution was centrifuged, and the substrate and product amount in the ethyl acetate layer were analyzed by gas chromatography (GC) to determine the reaction conversion rate and the optical purity of the product. The results are shown in Table 3.
  • GC gas chromatography
  • Capillary column Cyclodex— j8 ⁇ . 25mm ID X 60m (j & W Scientific (Made by company)
  • Carrier gas He 300kPa
  • First-class ram TC— WAX ⁇ . 25mm I. D. X 15m (GL Science Co., Ltd.)
  • Carrier gas He 80kPa
  • a test tube with a stopper 5 mg of acetone-dried cells prepared in Example 1 or cells isolated from the culture solution prepared in Example 2 were added to lOOmM phosphate buffer (pH 6.5) 500 1 ⁇ . Made it cloudy. To this solution, 25 mg of Gnolecose and 0.5 mg of NADP and 0.5 U of glucose dehydrogenase (manufactured by Amano Enzyme) 5 U were added. Thereafter, 2 mg of the substrate 2 benzylacrolein was dissolved in ethyl acetate 5001 and added to a stoppered test tube, followed by stirring at 30 ° C. for 20 hours.
  • the reaction solution is centrifuged, and the substrate and the product in the ethyl oxalate layer are analyzed by gas chromatography (GC) using a trifluoroacetyl derivative. And the optical purity of the product was determined. The results are shown in Table 4.
  • Capillary column Cyclodex— j8 ⁇ . 25mm I. D. X 60m (manufactured by j & W Scientific)
  • Carrier gas He 300kPa
  • OYE2 NADPH dehydrogenase derived from Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC26108) (Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC26108)) strain in E. coli
  • OYE2 NADPH dehydrogenase derived from Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC26108) (Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC26108)) strain in E. coli
  • OYE2 NADPH dehydrogenase
  • a DNA fragment containing the OYE2 gene was amplified by first-stage PCR using the chromosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC26108) strain as a cage.
  • a Sacl site is added to the start codon part of the OYE2 gene by the second stage PCR using the DNA fragment obtained by the first stage PCR as a saddle type, and a new end immediately after the end codon.
  • a double-stranded DNA with a codon and Sail site added was obtained. Details are shown below.
  • Primer 1 5, 1 cggtccagatatagaataaatcatcatattaag- 3 '( ⁇ ⁇ ⁇ [J table ⁇ ⁇ ⁇ [J number 1)] and primer 2: 5'-gaaatggtgctacaaagtacggttaacac-3 '(SEQ ID NO: 2) Synthesized.
  • Two primers (primers 1 and 2), 50 pmol each, Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC26108) chromosomal DNA 200 ng, dNTP 10 nmol each, ExTa q (Takara Shuzo) 2. 5 U ExTaq buffer solution 50 / zl Prepared.
  • the PCR reaction was performed under the same conditions as described above. As a result, an E. coli Shine-Dalgarno sequence (SD sequence) is added 5 bases upstream from the start codon of the OYE2 gene, a Sacl recognition site is added immediately before it, and a new stop codon and Sail recognition immediately after the stop codon. Double-stranded DNA with an added site was obtained.
  • SD sequence E. coli Shine-Dalgarno sequence
  • This double-stranded DNA is digested with Sacl and Sail, and the lac promoter of plasmid pUCT in which G in the Ndel site of plasmid pUCNT (obtained by a person skilled in the art by the method described in WO94Z03613) is converted to T
  • a recombinant vector, PTSYE2 was constructed by inserting it into the Sacl and Sail sites downstream of the.
  • Pfima ' ⁇ 5 5 ⁇
  • primer 6 5'-gcgctgcagttatccgcgtcctgcttgga-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • plasmid pGDKl Eur. Biochem., 186, 389 (1989)
  • coli Shine-Dalgarno sequence (SD sequence) strength was 5 bases upstream from the start codon of the glucose dehydrogenase (hereinafter referred to as GDH) gene derived from Bacillus megaterium IAM1030 strain.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • a sail recognition site was attached, and a double-stranded DNA with a new stop codon and Pstl recognition site added immediately after the stop codon was obtained.
  • the resulting double-stranded DNA was digested with Sail and Pstl. This was inserted between the Sail recognition site and Pstl recognition site of the above recombinant vector PTSYE2 to construct a recombinant vector pTS YE2G1.
  • Fig. 1 shows the production method and structure of pTSYE2G1.
  • Escherichia coli HB101 (pTSYE2) was obtained by transforming Escherichia coli HB101 (Takara Shuzo) using the recombinant vector pTSYE2 constructed in Example 5.
  • Escherichia coli HB101 (pTSYE2Gl) was obtained by transforming E. coli (Escherichia coH) HB101 (Takara Shuzo) using the recombinant vector pTSYE2Gl constructed in Example 6. .
  • Example 7 Each of the two transformants obtained in Example 7 and the transformant Escherichia coli HB101 (pUCT) derived from only the vector plasmid pUCT (see Example 5) were treated with 100 / zg Zml of ampicillin. Inoculated into 2 XYT liquid medium (Batato 'tryptone 1.6%, Bacto' yeast extract 1.0%, sodium chloride 0.5%, ⁇ 7.0) and incubated at 37 ° C for 24 hours with shaking. Bacterial force is also collected by centrifugation, suspended in lOOmM phosphate buffer (pH 6.5), sonicated using UH-50 ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and centrifuged. The cell residue was removed by separation to obtain a cell-free extract. Table 5 shows the measured OY E2 activity and GDH activity of this cell-free extract.
  • the OYE2 activity was determined by adding l-OmM phosphate buffer (pH 6.5) to the substrate 2-cyclohexenone lmM, coenzyme NADPH 0.2 mM and the crude enzyme solution at 30 ° C. Reaction for minutes This was calculated from the rate of decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm. Under these reaction conditions, lunit was defined as the enzyme activity that acidifies 1 ⁇ mol NADPH to NADP + in 1 minute.
  • GDH activity was determined by adding 0.1M glucose, coenzyme NAD P2mM, and crude enzyme solution to 1M Tris-HCl buffer (pH 8.0) and reacting at 25 ° C for 1 minute. It was calculated from the rate of increase in absorbance at 340 nm. Under these reaction conditions, the enzyme activity for reducing 1 / z mol of NA DP to NADPH per minute was defined as lunit.
  • the transformant Escherichia coii HB101 (pTSYE2) obtained in Example 7 was sterilized in a 500 ml volume roscula.
  • 50 ml2 XYT medium bathato 'tryptone 1.6%, bact' yeast extract 1.0%, salt Sodium 0.5%, pH 7.0
  • the obtained culture solution was concentrated, subjected to ultrasonic disruption using a UH-50 type ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • Example 10 (R) -2 Methyl 3-phenylpropanal using transformant Cell-free extract of transformant Escherichia coli HB101 (pTSYE2) prepared in the same manner as Example 9 50 ⁇ 1, glucose 25 mg, NAD and NADP 0.5 mg each, glucose dehydrating enzyme (manufactured by Amano Enzyme) 5 U was dissolved in 450 ⁇ 1 of lOOmM phosphate buffer (pH 6.5) and transferred to a stoppered test tube. . Thereafter, 2 mg of the substrate 2-benzylacrolein was dissolved in ethyl acetate 5001 and added to a test tube with a stopper, followed by stirring at 30 ° C. for 2 hours.
  • glucose dehydrating enzyme manufactured by Amano Enzyme
  • the transformant Escherichia coli HB101 (pTSYE2Gl) obtained in Example 7 was sterilized in a 500 ml volumetric flask. 50 ml2 XYT medium (batato 'tryptone 1.6%, bacto' yeastex 1.0%, salt Ii sodium 0.5%, pH 7.0), and cultured with shaking at 30 ° C for 2 days. The obtained culture solution was concentrated, subjected to ultrasonic disruption using a UH-50 type ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • a UH-50 type ultrasonic homogenizer manufactured by SMT
  • Example 12 of 5 hydroxy 2 methyl 1 pentanal using a transformant Culture medium of transformant Escherichia coli HB101 (pTSYE2Gl) prepared in the same manner as in Example 11, 500 ⁇ 1, 55% gnolecose solution 30 ⁇ 1, NADPO. 5 mg was added to lOOmM phosphate buffer ( ⁇ ⁇ 6.5) 100 1 And transferred to a stoppered test tube. Thereafter, 10 mg of substrate 2- (3-hydroxypropyl) acrolein was added and stirred for 2 hours. After the reaction, the reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the substrate and product amount of the ethyl acetate layer were analyzed by GC under the analysis conditions shown below. As a result, 5hydroxy-2-methyl-1-pentanal was obtained with a reaction conversion rate of 96.9%.
  • pTSYE2Gl transformant Culture medium of transformant Escherichia coli HB101
  • Example 11 Cultured Escherichia coli HB101 (pTSYE2Gl) prepared in the same manner 500 ⁇ l, 55% gnolecose solution 30 ⁇ 1, NADPO. 5 mg was added to lOOmM phosphate buffer (pH 6.5) 100 1 And transferred to a stoppered test tube. Thereafter, 10 mg of substrate 2- (3 benzyloxypropyl) acrolein was added and stirred for 2 hours. After the reaction, the reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the GC and the amount of substrate and product in the ethyl acetate layer were analyzed under the following analytical conditions.
  • reaction conversion rate was 99.1% and 5 benzyloxy-2-methyl 1-Pentanal was obtained.
  • 5 benzyloxy-2-methyl-1-pentanal was reduced with sodium borohydride (NaBH) and analyzed by HPLC under the following analytical conditions.
  • the optical purity was 90.0% ee (R).
  • the analysis conditions are as follows. [GC analysis conditions]
  • First-class ram TC— WAX ⁇ . 25mm I. D. X 15m (GL Science Co., Ltd.)
  • Carrier gas He 80kPa
  • First-class ram G—PN ⁇ . 25mm I. D. X 30m (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)
  • Carrier gas He 150kPa

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Abstract

　本発明は、光学活性２－置換プロパナール誘導体の製造方法、より詳細には、２－置換アクロレイン誘導体の炭素－炭素二重結合を、その炭素－炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて立体選択的に還元することにより、光学活性２－置換プロパナール誘導体を製造する方法に関する。 　本発明によれば、医薬品や甘味料等の中間体として有用な光学活性２－置換プロパナール誘導体、とりわけ光学活性２－アルキルプロパナール誘導体を、安価で入手容易な原料から簡便な方法で製造することができる。                                                                                     

Description

明 細 書
光学活性 2—置換プロパナール誘導体の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、医薬品または甘味料等の中間体として有用な、光学活性 2 置換プロ パナール誘導体、中でも光学活性 2—アルキルプ口パナール誘導体の製法に関す る。より詳細には、安価に入手可能な 2—置換ァクロレイン誘導体を、その炭素-炭 素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて立体選択的に還 元することを特徴とする、光学活性 2—置換プロパナール誘導体、中でも光学活性 2 —アルキルプ口パナール誘導体の製法に関する。
関連出願の相互参照
[0002] 曰本国特許 2005— 158393号（2005年 5月 31曰出願）の明細書、請求の範囲、 図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本 出願に合体される。
背景技術
[0003] 光学活性 2 置換プロパナール誘導体の製造法として、以下の様な方法が知られ ている。
1)プロリン誘導体を不斉補助基として用い、プロパナールを不斉アルキルィ匕すること により、光学純度 94%eeの (R)— 2—メチルペンタナールを合成する方法 (非特許 文献 1)。
2)ベアウベリア'スルフレセンス (Beauveria Sullurescens)を用いて 2—メチル 2—ぺ ンテナールを微生物還元して光学活性 2—メチルー 1 ペンタノールを取得し、これ を酸化して光学活性 2—メチルペンタナールを合成する方法 (非特許文献 2)。 非特許文献 1 : New Journal of Chemistry, 24(12), 973-975 (2000)
非特許文献 2 : Tetrahedron, 37(22), 3825-3829 (1981)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 上記 1)の方法では、不斉アルキル化反応に高価な不斉補助基が必要である。上 記 2)の方法では、副生物である 2—メチルー 2—ペンテン 1 オールが多量に生 成する。
[0005] 上記に鑑み、本発明の目的は、医薬品や甘味料等の中間体として有用な光学活 性 2—置換プロパナール誘導体、中でも光学活性 2—アルキルプ口パナール誘導体 を安価で入手容易な原料から簡便に製造する方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者等は上記課題につき鋭意検討を行った結果、安価に入手可能な 2 置 換ァクロレイン誘導体を、その炭素 炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を 有する酵素源を用 ヽて立体選択的に還元することにより、光学活性 2—置換プロパ ナール誘導体を簡便に製造する方法を見出した。
[0007] 即ち、本発明の特徴の 1つは、一般式（1)：
[0008] [化 3]
Figure imgf000003_0001
[0009] (式中、 Rは置換基を有するメチル基、置換基を有しても良い炭素数 2〜： LOのアルキ ル基、又は置換基を有しても良い炭素数 5〜 15のァラルキル基を表す。）で表される 2—置換ァクロレイン誘導体に、当該 2—置換ァクロレイン誘導体（1)の炭素—炭素 二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることを特徴とす る、一般式 (2) :
[0010] [化 4]
Figure imgf000003_0002
[0011] (式中、 Rは前記と同じ。 *は不斉炭素を表す。）で表される光学活性 2—置換プロパ ナール誘導体の製造法を提供する。
[0012] 本発明のその他の特徴およびそれらの効果は、以下の実施形態および図面によつ て明らかにされる。
発明の効果
[0013] 本発明の上記方法により、医薬品や甘味料等の中間体として有用な光学活性 2— 置換プロパナール誘導体を安価な原料力 簡便に製造することができる。 図面の簡単な説明
[0014] [図 1]図 1は、組換えベクター PTSYE2G1の作製法及び構造を示す概略図である。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 1. 2—置橼ァクロレイン謙導体 (出 物皙)
まず、本発明の実施形態に関わる化合物について説明する。本発明の実施形態と しての製造方法における出発物質は、前記式（1)で表される 2—置換ァクロレインィ匕 合物である。前記式（1)における置換基 Rとしては、置換基を有するメチル基、置換 基を有して 、ても良 、炭素数 2〜： LOのアルキル基、又は置換基を有しても良 、炭素 数 5〜 15のァラルキル基が挙げられる。
[0016] 置換基を有する場合の置換基としては、酵素源による反応に悪影響を及ぼさない 限り特に制限されず、例えばハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボキ シル基、シァノ基、アミノ基または-トロ基等の置換基が挙げられる。
[0017] 例えば、置換基を有するメチル基としては、クロロメチル基、ブロムメチル基、ョード メチル基、ヒドロキシメチル基、アミノメチル基、又はシァノメチル基等が挙げられる。
[0018] 置換基を有しても良い炭素数 2〜 10のアルキル基としては、置換又は無置換のェ チル基、 n—プロピル基、 iso—プロピル基、 n—ブチル基、 sec—ブチル基、 tert— ブチル基、 n—ペンチル基、又は n—へキシル基等が挙げられる。置換基を有する場 合の置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、シァノ基等が挙げられるが、 本発明の還元反応に悪影響を及ぼさない限りこれらに限定されるものではない。
[0019] 置換基を有しても良い炭素数 5〜 15のァラルキル基としては、ベンジル基、 o—クロ 口べンジル基、 m—ブロモベンジル基、 p—フルォロベンジル基、 p— -トロベンジル 基、 p シァノベンジル基、 m—メトキシベンジル基、フエネチル基、ナフチルメチル 基、又はピリジルメチル基等が挙げられる。
[0020] 上記のなかでも Rとして好ましくは、置換基を有しても良い炭素数 2〜 10のアルキル 基であり、より好ましくは置換基を有しても良い炭素数 2〜4のアルキル基であり、更 に好ましくはェチル基、 n—プロピル基または n—ブチル基であり、最も好ましくは n— ブチノレ基である。
[0021] 前記式（1)で表される化合物は、工業的に入手可能、あるいは工業的に入手可能 な原料力も容易に合成することができる。例えば、 2—プチルァクロレインは、 n—へ キサナール、ジメチルァミン塩酸塩、及び 37%ホルマリン溶液の混合物を、 70°Cで 2 4時間攪拌することにより容易に合成することができる（Journal of chemical research, Synopses 7, 262-3 (1978)参照）。
[0022] 2. 光学活件 2—置橼プロパナール謙導体 (牛成物)
実施形態としての製造方法における生成物は、前記式 (2)で表される光学活性 2 —置換プロパナール誘導体である。前記式（2)において、 Rは前記式（1)の場合と 同じであり、 *は不斉炭素を表す。
[0023] 3. 光学活件 2 置橼プロパナール謙導体の製浩法
次に、本発明の実施形態としての光学活性 2—置換プロパナール誘導体の製造法 について説明する。
[0024] 実施形態においては、前記式（1)で表される 2 置換ァクロレイン誘導体の炭素 炭素二重結合を立体選択的に還元する活性を有する酵素源の存在下、当該 2—置 換ァクロレイン誘導体（1)の二重結合を立体選択的に還元することにより、前記式（2 )で表される光学活性 2—置換プロパナール誘導体を製造する。
[0025] 4.酵素源
ここで、「酵素源」とは、上記還元活性を有する酵素自体はもちろんのこと、上記還 元活性を有する微生物の培養物およびその処理物も含まれる。「微生物の培養物」と は、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、また、その処理物であってもよい 。「その処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、または それら菌体の破砕物等を意味する。さらに上記酵素源は、公知の手段で固定化して 、固定ィ匕酵素又は固定ィ匕菌体として用いることもできる。固定ィ匕は、当業者に周知の 方法 (例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等)で行うことができる。
[0026] 実施形態において、前記式（1)で表される化合物の炭素 炭素二重結合を立体 選択的に還元する活性を有する酵素源としては、キャンディダ (Candida)属、クルイ ベロマイセス (Kluweromvces)属、ピキア（Pichia)属、ロドトノレラ（Rhodotorula)属、サ ッカロマイセス (Saccharomyces)属、スポリディオボルス (Sporidiobolus)属、スポロボ口 マイセス（Spolobolomvces)属、トリゴノプシス (Trigonopsis)属、チゴサッカロマイセス（ Zveosaccharomvces)属、ァクロモノ クタ一 (Achromobacter)属、ァシディフイリゥム (A cidiphilium)属、ァノレカリゲネス (Alcaligenes)属、アースロバクタ一（Arthrobacter)属、 バシラス（Bacillus)属、コリネパクテリゥム（Corvnebacterium)属、ェシエリヒア (Escheri chia)腐、ミクロコッカス (Micrococcus)鼠、シユードモナス (Pseudomonas)腐、ノヽェ- バシラス (Paenibacillus)属、またはザントモナス (Xanthomonas)属に属する微牛.物由 来の酵素源が挙げられる。
[0027] 4- 1. m (RM^ ^に する活件 する ま原の ί列)
上記酵素源のうち、前記式（1)で表される化合物の炭素 炭素二重結合を R選択 的に還元する活性を有する酵素源としては、キャンディダ 'カンタレリ (Candida cantar ellii)、キャンディダ .ェチェルシー (Candida etchellsii)、キャンディダ .ケフィル (Candi da kefvr)、キャンディダ ·ムサェ (Candida musae)、キャンディダ ·ニトラトフイラ (Candid a nitratophila)、キャンディダ ·サケ（Candida sake)、キャンディダ*ステラータ（Candida stellata)、キャンディダ ·ジラノイデス (Candida zevlanoides)、クライべロマイセス ·ラタ アイス'ノヽ ~~ ·ドロソフィフノレム (Kluweromvces lactis var. drosphilarum 、ピキゾ 'メン ブラナエファシエンス (Pichia membranaefaciens)、ピキア ·ヒーディー (Pichia heedii)、 ロドトノレラ ·ミヌタ (Rhodotorula minuta)サッカロマイセス ·ユニスポラス (Saccharomyces unisporus)、サッカロマイセス ·ノ ャナス (Saccharomyces bavanus)サッカロマイセス · セルピンェ (Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス ·カスァリ (aaccharomvces c astellii)、サッカロマイセス 'ノ ストリアヌス (Saccharomyces pastorianus)、スポリディ才 ボノレス ·ジョンソニー (Sporidiobolus iohnsonii)、スポリディオボノレス ·サノレモニコラ (SPO ndiobolus salmonicolor)、スホロ 3ヽロマイセス，サノレモニコフ (¾D_olobolomvces salmoni color)、トリゴノプシス'バリアビリス (Trieonopsis variabilis)、チゴサッカロマイセス 'バ イリ ~~ Zygosaccharomvces bailn)、 7 ~~スロノクタ1 ~~ 'ニコチ-グ■ ~~ネ (Arthrobacter nic otianae)、ァシディフイリゥム ·クリプタム（Acidiphilium crvptum)、バシラス ·セレウス（B acillus cereus)、ノ シラス ·コアグランス (Bacillus coagulans)、ノ シラス ·リへ-ホノレミス (Bacillus licheniformis)、バシラス ·プミラス (Bacillus pumilus)バシラス ·パディウス（ cillus badius)、ノ シラス'ファエリクス（Bacillus sphaericus)、ミクロコッカス *ルテウス（ Micrococcus luteus)、シュ ~~トモナス ·ンュッツエリ (Pseudomonas stutzen)、シュ ~~ト モナス ·フフ3 r 1, Pseudomonas fragi)、ンュ ~~トモナス ·フチダ (, Pseudomonas putida)、 バエ-バシラス .アルべィ (Paenibacillus alvei)又はザントモナス'スピーシーズ (Xanth omonas sp.)等の微生物由来の酵素源が好ましい。
[0028] 4- 2. ま原 (S に する活件 する ま原の ί列)
また、前記式（1)で表される化合物の炭素 炭素二重結合を S選択的に還元する 活性を有する酵素源としては、ァクロモバクタ一'キシロキダンス ·サブスピーシーズ' ァ-トリフィカンス Achromobacter xvlosoxiaans subsp. denitrincans)、 /ノレ 7リクネス 'フエカリス（Alcaligenes faecalis)、アルカリゲネス *スピーシーズ（Alcaligenes sp.)、ァ ースロノくクタ一 ·クリスタロポェテス (Arthrobacter crvstallopoietes)、アースロノくクタ一 •プロトフォロマイス（Arthrobacter protophormise)、コリネバタテリゥム 'アンモニアゲ ス (Corvnebacterium ammoniagenes)又【3~ェンエリヒフ 'コリ (Escherichia coli)等の 微生物由来の酵素源が好ま U、。
[0029] 5.微生物
また、上記還元酵素の由来となる微生物としては、野生株または変異株のいずれで もよ！/ヽ。あるいは細胞融合または遺伝子操作等の遺伝学的手法により誘導される微 生物も用いることができる。
[0030] さらにはこれら微生物由来の還元酵素を生産する能力を有する組換え微生物であ つてもよい。該酵素を生産する組換え微生物は、例えば、これらの酵素を単離及び
Zまたは精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ 酸配列に基づ 、て酵素をコードする DNA配列を得る工程、この DNAを他の微生物 に導入して組換え微生物を得る工程、及びこの組換え微生物を培養して、本酵素を 得る工程を含有する方法により得ることができる（国際公開第 WO98Z35025号公 報に記載の方法参照)。
[0031] 上記のような組換え微生物としては、上記還元酵素をコードする DNAを有するベタ ターで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換微生物が挙げられる。また、宿 主微生物としては大腸菌（Escherichia coli)が好ましい より好ましくは、上記サッカロ マイセス ·セレビシェ (Saccharomvces cerevisiae)由来の NADPHデヒドロゲナーゼ（ Old Yellow Enzyme 2)遺伝子（The Journal of Biological chemistry, 268, 6097-6106 (1993)参照）を有するベクターで形質転換された Escherichia coli HB101 (pTSYE2)等 が挙げられる。この Escherichia coli HB101(pTSYE2)の取得方法は、後述の実施例 7 に己載し 7こ。
[0032] また、上記酵素源として、国際生化学'分子生物学連合の酵素分類法により EC 1.6 .99に分類される酸化還元酵素を用いることもできる。 EC 1.6.99に分類される酸化還 元酵素としては、 EC 1.6.99.1 : NADPHデヒドロゲナーゼ、 EC 1.6.99.2 : NAD(P)H デヒドロゲナーゼ（キノン）、 EC 1.6.99.3 : NADHデヒドロゲナーゼ、 EC 1.6.99.5 : NA DHデヒドロゲナーゼ（キノン）、または EC 1.6.99.6 : NADPHデヒドロゲナーゼ（キノン )に分類される酵素が挙げられ、なかでも EC 1.6.99.1に分類される NADPHデヒドロ ゲナーゼ（別名： Old Yellow Enzyme)が好まし!/、。
[0033] NADPHデヒドロゲナーゼとしては、キャンディダ (Candida)属、クルイべロマイセス
(Kluweromvces)属、サッカロマイセス（Saccharomvces)属、又はシゾサッカロマイセ ス (Schizosaccharomvces)属等の酵母に広く分布して ヽることが報告されており、とり わけ、サッカロマイセス ·セレビシェ (Saccharomvces cerevisiae)由来の NADPHデヒ ドロゲナーゼ（Old Yellow Enzyme 2)が好ましい。
[0034] 酵素源として用いる微生物のための培養培地は、その微生物が増殖し得るもので ある限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シユークロース等の 糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、ォレイン酸、ステアリン酸等の脂 肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモ-ゥ ム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ一、ふすま、酵母ェキ スなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸 1 水素カリウム、燐酸 2水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を 含有する通常の液体培地が使用することができる。培養は好気的に行い、通常、培 養時間は 1〜5日間程度、培地の pHが 3〜9、培養温度は 10〜50°Cで行うことがで きる。
[0035] 6.還元反応
実施形態において、前記式（1)で表される化合物の炭素 炭素二重結合の還元 反応は、適当な溶媒に、基質となる前記式（1)で表される 2—置換ァクロレイン誘導 体、補酵素 NAD (P) H及び前記微生物の培養物またはその処理物等を添加し、 pH 調整下攪拌することにより行うことができる。
[0036] 上記還元反応条件は用いる酵素、微生物またはその処理物、基質濃度等によって 異なるが、通常、基質濃度は約 0. 1〜： LOO重量％、好ましくは 1〜60重量％であり、 補酵素 NAD (P) Hは基質に対して 0. 0001〜100モル％、好ましくは 0. 0001〜0 . 1モル％、反応温度は 10〜60°C、好ましくは 20〜50°Cであり、反応の pHは 4〜9 、好ましくは 5〜8であり、反応時間は 1〜120時間、好ましくは 1〜72時間で行うこと 力 Sできる。また、反応には有機系の溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒として は、例えば、トルエン、酢酸ェチル、酢酸 n—ブチル、へキサン、イソプロパノール、メ タノール、ジイソプロピルエーテル、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
[0037] 基質は一括または連続的に添加することができる。また、反応はバッチ方式または 連続方式で行うことができる。
[0038] 7. ]^ (捕 牛 を用いる例)
実施形態の還元工程にぉ ヽて、一般に用いられる補酵素 NAD (P) H再生系を組 み合わせて用いてもよい。これにより、高価な補酵素の使用量を大幅に減少させるこ とができる。代表的な NAD (P) H再生系としては、例えば、グルコース脱水素酵素及 びグルコースを用いる方法が挙げられる。
[0039] 還元酵素遺伝子及びこの酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素 (例 えばグルコース脱水素酵素）の遺伝子を同一宿主微生物内に導入した形質転換微 生物、すなわち、実施形態の還元酵素をコードする DNA及び該酵素が依存する補 酵素を再生する能力を有する酵素 (例えばグルコース脱水素酵素）の遺伝子を同一 宿主微生物内に導入した形質転換微生物の培養物またはその処理物等を用いて、 上記と同様の反応を行えば、別途に補酵素の再生に必要な酵素源を調整する必要 がな 、ため、より低コストで光学活性 2—置換プロパナール誘導体を製造することが できる。
[0040] 上記のような形質転換微生物としては、上記還元酵素をコードする DNA及び該酵 素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素をコードする DNAの両者を有す るプラスミドで形質転換された形質転換微生物が挙げられる。ここで、補酵素を再生 する能力を有する酵素としては、グルコース脱水素酵素が好ましぐバシラス'メガテリ ゥム（Bacillus megaterium)由来のグルコース脱水素酵素がより好ましい。また、宿主 微生物としては大腸菌 (Escherichia coli)が好まし ヽ。そのような好ま ヽ形質転換微 生物として、後 i术の実施例で説明する Escherichia coli HB101 (pTSYE2Gl)が挙げら れる。
[0041] 形質転換微生物の培養は、それらが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機 塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。
[0042] また、形質転換微生物中の補酵素再生能を有する酵素の活性は、常法により測定 することができる。例えば、グルコース脱水素酵素の活性は、 1Mのトリス塩酸緩衝液 (pH8. 0)に、 lOOmMのグルコース、 2mMの補酵素 NADPまたは NAD、および酵 素を添加し、 25°Cで 1分間反応させた際の、波長 340nmにおける吸光度の増加速 度から算出できる。
[0043] なお、本発明の還元工程を、補酵素再生系と組み合わせて実施する、または、酵 素源として上記形質転換微生物の培養物もしくはその処理物を用いる場合は、補酵 素として、より安価な酸化型の NAD (P)を添加して反応を行うことも可能である。
[0044] 8. 光学活件 2 置椽プロパナール誘導体の精製
還元反応で生じた光学活性 2—置換プロパナール誘導体の精製方法は特に限定 されないが、反応液から直接あるいは菌体等を分離後、酢酸ェチル、トルエン、 t ブチルメチルエーテル、へキサン、塩化メチレン等の有機溶媒で抽出し、脱水後、濃 縮した後、蒸留、クロマトグラフィー等の処理を行うことにより精製することができる。反 応液から菌体を分離する場合は、遠心分離や濾過等の常法で行うことができる。 [0045] 9.その他の誘導体への変換
上述の方法により前記式（2)で表される光学活性 2—置換プロパナール誘導体を 得た後、当該化合物のアルデヒド基を酸化すると、光学活性 2—置換プロピオン酸誘 導体を製造することができる。また、前記式 (2)の化合物のアルデヒド基を還元すると 光学活性 2—置換プロパノール誘導体を製造することもできる。
[0046] アルデヒド基の酸化方法としては、過マンガン酸カリウム（KMnO )、クロム酸（CrO
4
)、硝酸等を用いる化学的手法やアルデヒドデヒドロゲナーゼ等を用いる酵素的手法
3
が挙げられ、いずれの方法を用いても良い。
[0047] また、アルデヒド基の還元方法としては、水素化リチウムアルミニウム（L1A1H )、ホ
4 ゥ水素化ナトリウム (NaBH )等の金属水素化物を用いる化学的手法やアルデヒドリ
4
ダクターゼ等を用いる酵素的手法が挙げられ、 、ずれの方法を用いても良!、。
実施例
[0048] 以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例 に限定されるものではない。
[0049] (実施例 1)光学活性 2—メチルー 1一へキサナールの製造法
グルコース 5%、ペプトン 1%、酵母エキス 1%からなる液体培地 (pH6. 5)を調製し 、 500ml容坂ロフラスコに 50mlづっ分注して、 120°Cで 20分間蒸気滅菌した。これ らの液体培地に表 1に示した微生物をそれぞれ 1白金耳植菌し、 30°Cで 2〜3日間 振盪培養した。この培養液から遠心分離により菌体を集め、菌体を水洗し、氷冷ァセ トンを添加した後、減圧乾燥することによりアセトン乾燥菌体を調製した。栓付試験管 に、アセトン乾燥菌体 5mgを量り取り、 lOOmMリン酸緩衝液 (pH6. 5) 500 /z lに懸 濁させた。この溶液に、グルコース 25mg、 NAD及び NADP各 0. 5mg、グルコース 脱水素酵素（天野ェンザィム社製） 5Uを加えた。その後、基質 2—プチルァクロレイ ン 2mgを酢酸ェチル 500 1に溶解させて栓付試験管にカ卩え、 30°Cで 20時間攪拌 した。反応後、反応液を遠心分離し、酢酸ェチル層中の基質及び生成物をトリフルォ ロアセチル誘導体ィ匕してガスクロマトグラフィー（GC)により分析することで、反応変 換率、及び、生成物の光学純度を求めた。その結果を表 1に示す (反応変換率は 10 〜100%)。 [0050] 分析条件、反応変換率及び光学純度の計算方法は以下の通りである。
[GC分析条件]
キヤピラリーカラム： Cyclodex— j8 θ. 25mm I. D. X 60m(j&W Scientific 社製）
キャリアーガス： He 300kPa
検出器: FID
カラム温度： 45°C
検出時間：（R)— 2—メチル—1—へキサナール 49. 9分、（S)— 2—メチル— 1— へキサナール 51. 5分、 2—ブチルァクロレイン 44. 6分
反応変換率 (％) =生成物量 Z (基質量 +生成物量） X 100
光学純度（％ee) = (A-B) / (A+B) X 100 (A及び Bは対応する鏡像異性体量 を表し、 A >Bである）
[0051] [表 1]
Figure imgf000012_0001
[0052] m2)光学活件 2—メチルー ί一へキサナールの觀告法
肉エキス ι。/0、ペプトン 1%、酵母エキス 0. 5%、塩ィ匕ナトリウム ι%からなる液体培 地 (ρΗ6. 5)を調製し、大型試験管に 5mlづっ分注して、 120°Cで 20分間蒸気滅菌 した。これらの液体培地に表 2に示した微生物をそれぞれ 1白金耳植菌し、 30°Cで 2 3日間振盪培養した。この培養液力も遠心分離により菌体を集め、 lOOmMリン酸 緩衝液 (PH6. 5) lmlで洗浄し、同緩衝液 500 1に再懸濁させ、栓付試験管に移し た。この溶液に、グルコース 25mg NAD及び NADP各 0. 5mg、グルコース脱水素 酵素（天野ェンザィム社製） 5Uを加えた。その後、基質 2—プチルァクロレイン 2mg を酢酸ェチル 500 1に溶解させて栓付試験管に加え、 30°Cで 20時間攪拌した。反 応後、反応液を遠心分離し、酢酸ェチル層中の基質及び生成物量を実施例 1と同 様の方法で分析することにより、反応変換率、及び、生成物の光学純度を求めた。そ の結果を表 2に示す (反応変換率は 10 100%)。
[0053] [表 2]
Figure imgf000013_0001
[0054] (実施例 3)光学活性 2 メチルー 1 アルキルプ口パナールの製造法
栓付試験管に、実施例 1で調製したアセトン乾燥菌体 5mg、又は実施例 2で調製し た培養液力も分離した菌体を、 lOOmMリン酸緩衝液 (pH6. 5) 500 1に懸濁させ た。この溶液に、グルコース 25mg NAD及び NADP各 0. 5mg、グルコース脱水素 酵素 (天野ェンザィム社製) 5Uを加えた。その後、表 3に示す各基質 2mgを酢酸ェ チル 500 1に溶解させて栓付試験管に加え、 30°Cで 20時間攪拌した。反応後、反 応液を遠心分離し、酢酸ェチル層中の基質及び生成物量をガスクロマトグラフィー（ GC)により分析することで、反応変換率、及び、生成物の光学純度を求めた。その結 果を表 3に示す。
[0055] 分析条件は以下の通りである。
[GC分析条件（2—メチルブタナール:基質及び生成物をトリフルォロアセチル誘導 体化) ]
キヤピラリーカラム： Cyclodex— j8 θ. 25mm I. D. X 60m(j&W Scientific 社製）
キャリアーガス： He 300kPa
検出器: FID
カラム温度： 40°C
検出時間：（R)— 2—メチル 1—ブタナール 16. 7分、（S)— 2—メチル 1ーブタ ナール 17. 0分、 2 ェチルァクロレイン 15. 0分
[GC分析条件（2—メチルオタタナール) ]
キヤビラリ一力ラム： TC— WAX θ. 25mm I. D. X 15m (GLサイエンス社製） キャリアーガス： He 80kPa
検出器: FID
カラム温度： 80°C
検出時間： 2—メチルー 1—オタタナール 2. 8分、 2 へキシルァクロレイン 3. 6分 [0056] [表 3]
Figure imgf000014_0001
[0057] (実施例 4)光学活件 2 メチルー 3 フエニルプロパナールの製诰法
栓付試験管に、実施例 1で調製したアセトン乾燥菌体 5mg、又は実施例 2で調製し た培養液から分離した菌体を、 lOOmMリン酸緩衝液（pH6. 5) 500 1〖こ懸濁させ た。この溶液に、グノレコース 25mg NAD及び NADP各 0. 5mg、グルコース脱水素 酵素（天野ェンザィム社製） 5Uを加えた。その後、基質 2 ベンジルァクロレイン 2m gを酢酸ェチル 500 1に溶解させて栓付試験管に加え、 30°Cで 20時間攪拌した。 反応後、反応液を遠心分離し、醉酸ェチル層中の基質及び生成物をトリフルォロア セチル誘導体ィ匕してガスクロマトグラフィー (GC)により分析することで、反応変換率、 及び、生成物の光学純度を求めた。その結果を表 4に示す。
[0058] 分析条件は以下の通りである。
[GC分析条件]
キヤピラリーカラム： Cyclodex— j8 θ. 25mm I. D. X 60m(j&W Scientific 社製）
キャリアーガス： He 300kPa
検出器: FID
カラム温度： 80°C
検出時間：（R)— 2—メチル—3—フエ-ルプロパナール 113. 9分、（S)— 2—メチ ルー 3—フエ-ルプロパナール 116. 9分、 2-ベンジルァクロレイン 96. 2分
[0059] [表 4]
Figure imgf000015_0001
[0060] (実施例 5)サッカロマイセス'セレビジェ S288C (ATCC26108)株由来の NAD PHデヒドロゲナーゼ遣伝子（Old Yellow Enzyme 2遣伝子）のクローニング
サッカロマイセス.セレビジェ S288C (ATCC26108) (Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC26108))株由来の NADPHデヒドロゲナーゼ（Old Yellow Enzyme 2, 以後、 OYE2と呼ぶ）を大腸菌で発現させるために、以下に示した方法で発現べクタ を調製した (Appl Environ Microbiol, 69, 933 （2003)参照）。
[0061] 先ず、サッカロマイセス 'セレビジェ S288C (ATCC26108)株の染色体 DNAを 铸型とした 1段階目の PCRにより OYE2遺伝子を含む DNA断片を増幅した。次いで 1段階目の PCRで得られた DNA断片を铸型とした 2段階目の PCRにより、 OYE2 遺伝子の開始コドン部分に Sacl部位を付加し、かつ終始コドンの直後に新たな終始 コドンと Sail部位を付加した二本鎖 DNAを取得した。詳細を以下に示した。
[0062] プライマー 1： 5，一 cggtccagatatagaataaatcatcatattaag- 3 ' (酉己歹 [J表の酉己歹 [J番号 1)と 、プライマー 2 : 5 ' - gaaatggtgctacaaagtacggttaacac - 3 ' (配列表の配列番号 2)を合 成した。このプライマー 2種（プライマー 1及び 2)各 50pmol、サッカロマイセス 'セレビ ジェ S288C (ATCC26108)株の染色体 DNA200ng、 dNTP各 10nmol、 ExTa q (宝酒造社製） 2. 5Uを含む ExTaq用緩衝液 50 /z lを調製した。熱変性（97°C、 0 . 5分）、アニーリング（55°C、 1分）、伸長反応（72°C、 1分)の条件にて PCR反応を 行い、 4°Cまで冷却後、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片の増幅を確認し、 増幅断片をゲルから回収した。尚、染色体 DNAは、通常の DNA単離法、例えば酢 酸カリウム法等により調製した。次いで、 OYE2遺伝子の開始コドン上流に大腸菌の Shine-Dalgarno配列（SD配列、 9ヌクレオチド）を、さらにその直前に Sacl認識部位を 付カロしァこフフィマ' ~~ ά： 5 ― atcgagctctaaggaggttaacaatgccatttgttaaggac― a (目 ti列表 の配列番号 3)、及び終始コドンの直後に新たな終始コドンと Sail認識部位を付加し たプライマー 4 : 5， - acgcgtcgacttattaatttttgtcccaaccg - 3 ' (配列表の配列番号 4)を 合成した。このプライマー 2種（プライマー 3及び 4)各 50pmol、先の PCR反応で増 幅した DNA断片 200ng、 dNTP各 10nmol、 ExTaq (宝酒造社製） 2. 5Uを含む E xTaq用緩衝液 50 1を調製し、上記と同じ条件にて PCR反応を行った。その結果、 OYE2遺伝子の開始コドンから 5塩基上流に大腸菌の Shine-Dalgarno配列（SD配列 )が、さらにその直前に Sacl認識部位が付加され、かつ、終始コドンの直後に新たな 終始コドンと Sail認識部位が付加された二本鎖 DNAを取得した。この二本鎖 DNA を Sacl及び Sailで消化し、プラスミド pUCNT (国際公開第 WO94Z03613号公報 に記載の方法で当業者が取得可能）の Ndel部位中の Gを Tに変換したプラスミド pU CTの lacプロモーターの下流の Sacl、 Sail部位に挿入することにより、組換えべクタ 一 PTSYE2を構築した。
[0063] (実施例 6)グルコース脱水素酵素遣伝子を更に含む発現ベクターの構築
プフィマ' ~~ 5： 5 ― acgcgtcgactaaggaggttaacaatgtataaagatttagaagg— 3 (¾歹 IJlkの 配列番号 5)と、プライマー 6 : 5 ' - gcgctgcagttatccgcgtcctgcttgga- 3 ' (配列表の配 列番号 6)を用い、プラスミド pGDKl (Eur. J. Biochem. , 186, 389 (1989)参照）を铸 型として PCRを行 、、バシラス'メガテリゥム (Bacillus megaterium) IAM1030株由来 のグルコース脱水素酵素（以後、 GDHと呼ぶ)遺伝子の開始コドンから 5塩基上流に 大腸菌の Shine-Dalgarno配列（SD配列）力 さらにその直前に Sail認識部位が付カロ され、かつ、終止コドンの直後に新たな終始コドンと Pstl認識部位が付加された二本 鎖 DNAを取得した。得られた二本鎖 DNAを Sailおよび Pstlで消化した。これを上 記の組換えベクター PTSYE2の Sail認識部位と Pstl認識部位の間に挿入して、組 み換えベクター pTS YE2G 1を構築した。 pTSYE2G 1の作製法および構造を図 1に 示す。
[0064] (実施例 7)形皙転椽体の作製
実施例 5で構築した組換えベクター pTSYE2を用いて大腸菌 (Escherichia coH) H B101 (宝酒造社製）を形質転換し、菌形質転換体 Escherichia coli HB101 (pTSYE2) を得た。また、同様に、実施例 6で構築した組換えベクター pTSYE2Glを用いて大 腸菌 (Escherichia coH) HB101 (宝酒造社製）を形質転換し、形皙転椽体 Escherichia coli HB101 (pTSYE2Gl)を得た。
[0065] ms)形皙転橼体における遣伝早の 現
実施例 7で得た 2種類の形質転換体、及びベクタープラスミド pUCT (実施例 5参照 )のみを導人した形皙転椽体 Escherichia coli HB101 (pUCT)のそれぞれを、 100 /z g Zmlのアンピシリンを含む 2 XYT液体培地（バタト 'トリプトン 1. 6%、バクト 'イースト エキス 1. 0%、塩ィ匕ナトリウム 0. 5%、 ρΗ7. 0)に接種し、 37°Cで 24時間振盪培養 した。培養液力も遠心分離により菌体を集め、 lOOmMリン酸緩衝液 (pH6. 5)に懸 濁し、 UH— 50型超音波ホモゲナイザー（SMT社製)を用いて超音波破砕を行!、、 遠心分離により菌体残渣を除去して無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液の OY E2活性、及び GDH活性を測定したものを表 5に示した。
[0066] 実施例 7で得られた 2種類の形質転換体の ヽずれにぉ 、ても、 OYE2活性の発現 が認められた。また、 GDH遣伝子を含む形質転換体 Escherichia coli HB101 (pTSY E2G1)では、 GDH活性の発現も認められた。
[0067] 尚、 OYE2活性は、 lOOmMリン酸緩衝液（pH6. 5)に、基質 2—シクロへキセノン lmM、補酵素 NADPH 0. 2mM及び粗酵素液を添カ卩し、 30°Cで 1分間反応を 行い、波長 340nmの吸光度の減少速度より算出した。この反応条件において、 1分 間に 1 μ molの NADPHを NADP+に酸ィ匕する酵素活性を lunitと定義した。
[0068] GDH活性は、 1Mトリス塩酸緩衝液（pH8. 0)に、グルコース 0. 1M、補酵素 NAD P2mM、および粗酵素液を添カ卩して 25°Cで 1分間反応を行い、波長 340nmにおけ る吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、 1分間に 1 /z molの NA DPを NADPHに還元する酵素活性を lunitと定義した。
[0069] [表 5]
Figure imgf000018_0002
[0070]
Figure imgf000018_0001
実施例 7で得た形質転換体 Escherichia coii HB101 (pTSYE2)を、 500ml容坂ロフ ラスコ中で滅菌した 50ml2 XYT培地（バタト 'トリプトン 1. 6%、バクト 'イーストエキス 1. 0%、塩ィ匕ナトリウム 0. 5%、 pH7. 0)に接種し、 30°Cで 2日間振盪培養した。得 られた培養液を濃縮し、 UH— 50型超音波ホモゲナイザー（SMT社製)を用いて超 音波破砕を行い、遠心分離により菌体残渣を除去して無細胞抽出液を得た。この無 細胞抽出液 50 μ 1、グルコース 25mg、 NAD及び NADP各 0. 5mgゝグルコース脱 水素酵素（天野ェンザィム社製） 5Uを lOOmM燐酸緩衝液 (pH6. 5) 450 μ 1に溶解 させ、栓付試験管に移した。その後、表 6に示す各基質 2mgを酢酸ェチル 500 1に 溶解させて栓付試験管に加え、 30°Cで 2時間攪拌した。反応後、反応液を遠心分離 し、酢酸ェチル層中の基質及び生成物量を実施例 1及び 3と同様の方法で分析する ことにより、反応変換率、及び、生成物の光学純度を求めた。その結果を表 6に示す
[0071] [表 6] 反応変換率 光学純度
基質
(%) (%ee)
2ーェチルァクロレイン 96.7 96.0
2ーブチルァクロレイン 99.7 94.5
2一へキシルァクロレイン 98.6 ―
[0072] (実施例 10)形質転換体を用いた (R)— 2 メチル 3 フエニルプロパナールの 実施例 9と同様に調製した形質転換体 Escherichia coli HB101 (pTSYE2)の無細胞 抽出液液 50 μ 1、グルコース 25mg、 NAD及び NADP各 0. 5mg、グルコース脱水 素酵素（天野ェンザィム社製） 5Uを lOOmM燐酸緩衝液 (pH6. 5) 450 μ 1に溶解さ せ、栓付試験管に移した。その後、基質 2—ベンジルァクロレイン 2mgを酢酸ェチル 500 1に溶解させて栓付試験管に加え、 30°Cで 2時間攪拌した。反応後、反応液を 遠心分離し、酢酸ェチル層中の基質及び生成物量を実施例 4と同様の方法で分析 した。その結果、反応変換率 99. 3%で光学純度 94. 7%eeの (R)—2—メチルー 3 ーフヱ-ルプロパナールが得られた。
[0073] rn D形皙転橼体 用いた (R) 2—メチルー ί一へキサナールの觀告法
実施例 7で得た形皙転椽体 Escherichia coli HB101 (pTSYE2Gl)を、 500ml容坂ロ フラスコ中で滅菌した 50ml2 XYT培地（バタト 'トリプトン 1. 6%、バクト 'イーストェキ ス 1. 0%、塩ィ匕ナトリウム 0. 5%、 pH7. 0)に接種し、 30°Cで 2日間振盪培養した。 得られた培養液を濃縮し、 UH— 50型超音波ホモゲナイザー（SMT社製)を用いて 超音波破砕を行い、遠心分離により菌体残渣を除去して無細胞抽出液を得た。 500 ml4頭フラスコに上記無細胞抽出液 30ml、 lOOmM燐酸緩衝液 (pH6. 5) 195ml、 55%グルコース水溶液 25ml、 NADP25mgを加えた。その後、基質 2 ブチルァク ロレイン lgをへキサン 100mlに溶解させ、 25分間かけて反応系中に滴下した。 pH 調整下、 30°Cで 1時間攪拌した後、へキサン層中の基質及び生成物量を実施例 1と 同様の方法で分析した。その後、反応液を分液し、減圧下にてへキサンを留去して、 収率 80%、光学純度 96. 3%eeの（R)— 2—メチルー 1一へキサナールを取得した
[0074] (実施例 12)形質転換体を用 ヽた 5 ヒドロキシ 2 メチル 1 ペンタナールの 実施例 11と同様に調製した、形質転換体 Escherichia coli HB101 (pTSYE2Gl)の培 養液 500 μ 1、 55%グノレコース溶液 30 μ 1、 NADPO. 5mgを lOOmM燐酸緩衝液（ρ Η6. 5) 100 1と混合して栓付試験管に移した。その後、基質 2— (3 ヒドロキシプ 口ピル)ァクロレイン 10mgをカ卩えて 2時間攪拌した。反応後、反応液を酢酸ェチルで 抽出し、酢酸ェチル層の基質及び生成物量を、以下に示す分析条件にて GC分析し た。その結果、反応変換率 96. 9%で 5 ヒドロキシ— 2—メチル—1—ペンタナール が得られた。
[0075] 分析条件は以下の通りである。
[GC分析条件]
キヤビラリ一力ラム： j8— DEX225 θ. 25mm I. D. X 30m (SUPELCO社製） キャリアーガス： He lOOkPa
検出器: FID
カラム温度： 120°C
検出時間： 5 ヒドロキシー 2—メチルー 1 ペンタナール 7. 1分、 2—（3 ヒドロキ シプロピル）ァクロレイン 14. 8分
[ooze] ( m 13)形皙転橼体 用いた (R) s ベンジルォキシ 2—メチル ί一べ ンタナールの ¾告去
実施例 11 同様に調製した形皙転椽体 Escherichia coli HB101 (pTSYE2Gl)の培 養液 500 μ 1、 55%グノレコース溶液 30 μ 1、 NADPO. 5mgを lOOmM燐酸緩衝液（p H6. 5) 100 1と混合して栓付試験管に移した。その後、基質 2— (3 ベンジルォキ シプロピル)ァクロレイン 10mgを加えて 2時間攪拌した。反応後、反応液を酢酸ェチ ルで抽出し、酢酸ェチル層の基質及び生成物量を、以下に示す分析条件にて GC 分析した結果、反応変換率 99. 1%で 5 ベンジルォキシ一 2—メチル 1—ペンタ ナールが得られた。また、 5 べンジルォキシー2—メチルー 1 ペンタナールをホウ 水素化ナトリウム (NaBH )で還元し、以下に示す分析条件にて HPLC分析した結果
4
、光学純度は 90. 0%ee (R)であった。
[0077] 分析条件は以下の通りである。 [GC分析条件]
キヤビラリ一力ラム： TC— WAX θ. 25mm I. D. X 15m (GLサイエンス社製） キャリアーガス： He 80kPa
検出器: FID
カラム温度： 165°C
検出時間： 5 べンジルォキシー2—メチルー 1 ペンタナール 11. 1分、 2—（3— [HPLC分析条件]
キラルカラム： OB— H 4. 6mm I. D. X 250mm (ダイセル化学工業社製） 溶離液：へキサン /2 プロパノール 95/5
検出器： UV 254nm
カラム温度： 25°C
検出時間：（S)— 5 ベンジルォキシ— 2—メチル—1—ペンタノール 12. 2分、（R )—5 ベンジルォキシ一 2—メチル 1—ペンタノール 14. 3分
[0078] (参者例 i) (R) 2 メチルー ί一へキサン酸の觀告法
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（SIGMA社製） 5U、 NAD 13mgを lOOmM燐酸緩衝 液 (pH8. 0) 500 1に溶解させ、栓付試験管に移した。その後、実施例 11で取得し た ）—2—メチル—1—へキサナール 2mgを加えて、 30°Cで 20時間攪拌した。反 応後、 6N塩酸水溶液をカ卩えて反応液を酸性とし、酢酸ェチル lmlをカ卩えて基質及 び生成物を抽出して、以下に示す分析条件にて GC分析した。その結果、反応変換 率 99. 1%で 96. 5%eeの（R)— 2—メチル 1—へキサン酸が得られた。
[0079] 分析条件は以下の通りである。
[GC分析条件]
キヤビラリ一力ラム： G— PN θ. 25mm I. D. X 30m (東京化成社製） キャリアーガス： He 150kPa
検出器: FID
カラム温度： 40°C
検出時間：（R)— 2—メチルへキサン酸 22. 0分、（S)— 2—メチルへキサン酸 23 .4分、 2—メチル 1—へキサナール 15.1分

Claims

請求の範囲 [1] 一般式 (1)
[化 1]
Figure imgf000023_0001
(式中、 Rは置換基を有するメチル基、置換基を有しても良い炭素数 2〜 10のアルキ ル基、又は炭素数 5〜 15の置換基を有しても良いァラルキル基を表す。）で表される 2—置換ァクロレイン誘導体に、当該 2—置換ァクロレイン誘導体の炭素 炭素二重 結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることによる、一般式 ( 2) :
[化 2]
Figure imgf000023_0002
(式中、 Rは前記と同じ。 *は不斉炭素を表す。）で表される光学活性 2—置換プロパ ナール誘導体の製造法。
[2] 尺が、置換基を有しても良い炭素数 2〜 10のアルキル基である請求項 1記載の製 造法。
[3] 尺が、置換基を有しても良い炭素数 2〜4のアルキル基である請求項 1記載の製造 法。
[4] 前記炭素 炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源として、キ ヤンデイダ (Candida)属、クルイべロマイセス (Kluweromvces)属、ピキア (Pichia)属、 ロドトノレラ（Rhodotorula)属、サッカロマイセス (Saccharomvces)属、スポリディオボノレス (Sporidiobolus)属、スポロボロマイセス (Spolobolomvces)属、トリゴノプシス (Trigonop ≤k)属、チゴサッカロマイセス (Zveosaccharomvces)属、 クロモノ^:クタ一 (Achromoba cter)鼠、ァシディフイリゥム (Acidiphilium)属、ァノレカリゲネス (Alcaligenes)属、アース ロバクタ一 (Arthrobacter)属、バシラス (Bacillus)属、コリネバタテリゥム (Corvnebacter ium)属、ェシエリヒア（Escherichia)属、ミクロコッカス (Micrococcus)属、シユードモナ ス（Pseudomonas)属、バエニバシラス (Paenibacillus)属、またはザントモナス（Xantho mem)属に属する微生物由来の酵素源を用いることを特徴とする請求項 ι〜3のい ずれか 1項に記載の製造法。
[5] 前記炭素 炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源として、キ ヤンデイダ (Candida)属、クルイべロマイセス (Kluweromvces)属、ピキア (Pichia)属、 ロドトノレラ（Rhodotorula)属、サッカロマイセス（Saccharomvces)属、スポリディオボノレス (Sporidiobolus)属、スポロボロマイセス (Spolobolomvces)属、トリゴノプシス (Trigonop ≤k)属、チゴサッカロマイセス（Zvgosaccharomvces)属、ァシディフイリゥム（AcidiDhiliu m)属、アースロバクタ一（Arthrobacter)属、バシラス（Bacillus)属、ミクロコッカス (Micr ococcus)属、シユードモナス（Pseudomonas)属、バエニノ シラス（Paenibacillus)属、ま たはザントモナス (Xanthomonas)属に属する微生物に由来し、前記式（1)で表される 化合物の炭素 炭素二重結合を R選択的に還元する能力を有する酵素源を用いる 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の製造法。
[6] 前記 R選択的に還元する能力を有する酵素源力 キャンディダ 'カンタレリ（Candida
cantarellii)、キャンディダ.ェチエノレシ一 (Candida etchellsii)、キャンディダ.ケフィノレ (Candida kelvr)、キャンディダ ·ムサェ (Candida musae)、キャンディダ ·ニトラトフイラ（ Candida nitratophila)、キャンディダ ·サケ（Candida sake)、キャンディダ.ステラータ（ Candida stellata)、キャンテイダ ·ンラノィテス (Candida zevlanoides)、クライベロマイ セス ·フクアイス ·ノ ~~ · rロソフィフノレム (Kluweromvces lactis var. drosphilarum ゝヒ キア ·メンブラナエファシエンス (Pichia membranaefaciens)、ピキア ·ヒーディー (Pichia heedii)、ロドトノレラ .ミヌタ (Rhodotorula minuta)、サッカロマイセス ·ユニスポラス (Sac charomvces unisporus)、サッカロマ でス.ノ ャ "ス (aaccharomvces bavanus)サッカ 口マイセス ·セルビジェ（Saccharomv_ces cerevisiae)、サッカロマイセス ·カステリ (§acc haromvces castellii)、サッカロマイセス'ノ ストリアヌス (Saccharomvces pastorianus)、 スポリディオボノレス ·ジョンソニー (Sporidiobolus iohnsonii)、スポリディオボノレス ·サル モ-コラ (Sporidiobolus salmonicolor)、スポロボ口マイセス ·サノレモニコラ（Spolobolom vces salmonicolor;、トリゴノプンス ·ノ リアビリス、 i rigonopsis variabilis)、テコサッカロ マイセス ·ノ イリ一 (Zveosaccharomvces bailii)、アースロノくクタ一 ·ニコチアーネ (Arth robacter nicotianae)、 ンアイフィリゥム ·クリフ。ヅム (Acidiphnium cryptum)、ノヽンフス •セレウス (Bacillus cereus)、ノ シラス ·コアグランス (Bacillus coagulans)、ノ シラス ·リ へ-ホルミス (Bacillus licheniformis)、ノ シラス .プミラス (Bacillus pumilus)バシラス . ノ ディウス (Bacillus badius)、バシラス'ファエリクス (Bacillus sphaericus)、ミクロコッカ ス 'ルァウス (Micrococcus luteus)、シュ ~~トモナス ·ンュッツエリ (Pseudomonas stutze η 、ンュ ~~ドモナス ·フフ (Pseudomonas fragi)、シュ ~~トモナス ·プナタ (Pseudomon as putida)、バエ-バシラス ·アルべィ (Paenibacillus alvei)及びザントモナス'スピー シーズ (Xanthomonas sp.)力 なる群より選択される 1種以上の微生物由来の酵素源 である請求項 5記載の製造法。
[7] 前記 R選択的に還元する能力を有する酵素源力 サッカロマイセス 'セレピシェ ccharomvces cerevisiae)由来の NADPHデヒドロゲナーゼ (Old Yellow Enzyme 2)遺 伝子を有するベクターで形質転換された形質転換微生物の培養物である請求項 5記 載の製造法。
[8] 前記炭素 炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源として、了 クロモパクター（Achromobacter)属、ァノレカリゲネス (Alcaligenes)属、アースロバクタ 一（Arthrobacter)属、コリネパクテリゥム（Corvnebacterium)属、またはェシエリヒア（E scherichia)属に属する微生物に由来し、前記式（1)で表される化合物の炭素 炭素 二重結合を S選択的に還元する能力を有する酵素源を用いる請求項 1〜3のいずれ 力 1項に記載の製造法。
[9] 前記 S選択的に還元する能力を有する酵素源力 ァクロモパクター 'キシロキダンス
.サブスピ ~~、ン' ~~ズヽァ-トリフィ 7ンス (Achromobacter xvlosoxidans subsp. aemtrmc ans)、アルカリゲネス'フエカリス (Alcaligenes faecalis)、アルカリゲネス 'スピーシーズ (Alcali¾enes sp.)、アースロノくクタ一'クリスタロポェテス（Arthrobacter crystalloDoiete s) ,アースロバクタ一 ·プロトフォロミス (Arthrobacter protophormise)、コリネバクテリウ ム ·アンモニアゲネス (Corvnebacterium ammoniagenes)及びェシエリヒア ·コリ (Escher ichia coH)からなる群より選択される 1種以上の微生物由来の酵素源である請求項 8 記載の製造法。
[10] 前記炭素 炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する酵素源として、 E
C番号（Enzyme Commission Number) 1.6.99に分類される酸化還元酵素を用いる請 求項 1〜3のいずれか 1項に記載の製造法。
[11] 前記 EC 1.6.99に分類される酸化還元酵素として、 EC 1.6.99.1に分類される NAD
PHデヒドロゲナーゼを用い、かつ、前記式（2)で表される化合物の R体を製造する 請求項 10記載の製造法。
[12] 前記 NADPHデヒドロゲナーゼが、サッカロマイセス ·セレビシェ (Saccharomvces c erevisiae)由来の NADPHデヒドロゲナーゼ（Old Yellow Enzyme 2)である請求項 11 記載の製造法。
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