WO2007057582A1 - Composition comprenant un vecteur synthetique colloidal bioresorbable et un vecteur viral - Google Patents

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Thierry Delair
Bernard Verrier
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Biomerieux SA
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to the field of prophylactic and therapeutic vaccination.
  • the present invention relates to a vaccine composition comprising a viral vector for expressing protein substances and a synthetic vector having protein substances.
  • the antigens used in vaccines are either living microorganisms with reduced pathogenicity or killed microorganisms.
  • these vaccines often cause undesirable side effects during administration and in rare cases very serious complications.
  • it favors the use of purified fractions of microorganisms in vaccines.
  • Such an immunogen administered alone, may not induce a sufficient immune response.
  • numerous vaccination strategies have been developed to increase or guide the immune response induced by the purified immunogens present in a vaccine.
  • the most direct strategy is to associate the protein substance of interest (immunogen) with an adjuvant.
  • adjuvants many types are in development, aluminum hydroxides (alum) were until recently the only adjuvant authorized for administration to humans.
  • alum is a weak adjuvant for the induction of humoral responses, is not suitable for all antigens and does not provide cellular responses.
  • the adjuvants in development the most effective systems for inducing strong immunity are the microparticle-based synthetic vectors and in particular the microparticles of poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) and poly (lactic acid) (PLA). ).
  • the protein substance can be either encapsulated in the microparticles or adsorbed on the surface. Both approaches can induce both cellular and humoral immune responses, although originally they were mostly used to obtain an answer antibody.
  • encapsulation has two major disadvantages. The first is that it requires a partial or total degradation of the microparticle so that the protein substance becomes available to the immune system, so the establishment of immunity is delayed. The second is that the protein substance can be denatured or degraded during encapsulation and thus lose its immunogenic properties.
  • this method can not be used with any type of protein substance, whereas the adsorption method does not have these disadvantages.
  • the major obstacle to use is their lack of efficiency in generating specific cellular responses. If, compared to alum, the induced cellular responses are much better, they are far below what can be obtained with a viral vector.
  • the recombinant viral vectors make it possible to express in vivo (in animals or in humans) the protein substance of interest. This is an effective strategy that allows a strong mobilization of the immune system. But the induction of a lasting immune response over time requires the use of live attenuated vectors that can replicate in the vaccinated organism. However, for regulatory reasons related to the safe use of vaccines, new generations of vaccines use non-replicating viral vectors in humans, resulting in a decrease in specific immune responses over time. Thus, in the case of prophylactic vaccines, it is still sometimes necessary to resuscitate the specific immunity to keep an efficient memory response. In the field of immunotherapy, restimulation of specific immunity remains useful for maintaining the intensity of immune responses that control the pathogenic organism.
  • the repeated administration of viral vectors seems necessary but is accompanied by a major problem which is that of anti-vector immunity.
  • the viral vector is itself an immunogen and since it is administered repeatedly, there is appearance and increase of specific immunity of the vector.
  • This immune response aimed at eliminating the viral vector also prevents the expression of the gene that it carries thereby causing a decrease in the effectiveness of the immune responses against the protein substance of interest.
  • the anti-vector immunity prevents the use of the vector concerned to vaccinate against another disease.
  • Schagen et al. describe some approaches to mitigate this anti-vector immunity such as changes in the vector or adaptations in vaccinated patients (2004, Critical reviews in Oncology / Hematology 50: 51-70).
  • the implementation of these approaches is difficult and can not be done for all diseases or all patients. The strategy using viral vectors is therefore not optimized.
  • Another way of improving the immune response induced by vaccination is the prime-boost strategy. It consists in increasing the specific immune responses by sequentially administering two different vaccines carrying the same protein substance instead of administering the same vaccine several times. For example, it is possible to use a different viral vector at each injection (Negri DR, et al., 2004, Journal of General Virology, 85: 1191-1201). However, this strategy is unlikely to succeed because the number of viral vectors authorized for use in humans is very limited. In addition, the repeated administration of these viral vectors again comes up against the problem of anti-vector immunity. In order to circumvent this problem, Otten et al.
  • the patent application WO 98/56919A describes a DNA bonus, followed by a boost with a poxvirus.
  • the disadvantage of the use of a DNA premium is its low efficiency, especially in primates and also when it is a low immunogenic gene such as for example the HIV-1 tat gene.
  • the patent application WO 98 / 56919A also describes the use of a premium by VLPs ("virus-like particles"), followed by a boost by a poxvirus. VLPs are defective viral particles that do not incorporate the viral genome and can not replicate.
  • VLPs are often formed by self-assembly of the structural proteins of a virus or retrotransposon (endogenous element similar to a retrovirus) such as the Pr55 Gag precursor of HIV-1 or the proteins L1 and L2 of HPV-16. (human papillomavirus).
  • retrotransposon endogenous element similar to a retrovirus
  • the structure of the VLP may be more or less similar to that of the native virion, so that the VPLs are comparable to a virus.
  • the disadvantage of these VLPs is that they come from biotechnology and that their manufacture according to regulatory standards is very difficult.
  • a first subject of the invention consists of a pharmaceutical composition comprising or consisting of:
  • bioresorbable colloidal synthetic vector comprising at least one protein substance
  • a viral vector comprising at least one nucleotide sequence coding for a protein substance corresponding to at least one protein substance of the synthetic vector
  • Another object of the invention is the use of said composition for the preparation of a medicament, preferably a vaccine. It can also be used for the in vitro diagnosis of disease states relating to the protein substances of the composition of the invention.
  • the present invention therefore proposes a novel composition comprising a bioabsorbable synthetic colloidal vector having at least one protein substance.
  • bioabsorbable compound is intended to mean a compound which is not toxic, that is to say the administration of which in the body does not cause any physiological or metabolic modification that is lethal, disabling or troublesome in everyday life, and which may to be eliminated by the natural ways of the body after administration.
  • the colloidal and colloidal terms (aux) define any dispersion of a substance (dispersed phase) within an aqueous continuous phase of which at least one of the three dimensions is less than or equal to 10 ⁇ m and preferably less than or equal to 1 ⁇ m.
  • An aqueous continuous phase is a phase whose composition is predominantly water, such as for example a buffer or a water / water-miscible organic solvent mixture.
  • an aqueous continuous phase suitable for the purposes of the invention is a non-toxic phase.
  • the dispersed phase may be a liquid that is insoluble in the continuous phase, for example an oil or a mixture of oils, or organic fats, or may be a solid of a polymeric or mineral nature.
  • the dispersed phase is always bioabsorbable.
  • dispersed phase examples include olive oil, sunflower oil, peanut oil, rapeseed oil, or mixtures thereof; triglycerides; synthetic polymers such as hydroxy acid polymers such as, for example, lactic acid, glycolic acid, hydroxybutyroic acid or compounds derived from caprolactone; polypeptides such as compounds derived from the polymerization of caprolactam; natural polymers such as, for example, polysaccharides such as hyaluronic acid, chitosan, dextran.
  • synthetic polymers such as hydroxy acid polymers such as, for example, lactic acid, glycolic acid, hydroxybutyroic acid or compounds derived from caprolactone
  • polypeptides such as compounds derived from the polymerization of caprolactam
  • natural polymers such as, for example, polysaccharides such as hyaluronic acid, chitosan, dextran.
  • the form of the synthetic colloidal vector is given by the dispersed phase which may be spherical or non-spherical, homogeneous or constituted by a stack of lamellae.
  • the synthetic vector of the invention is spherical in nature. More preferably the vector is composed of microspheres.
  • microsphere and microparticle are used interchangeably in the following description.
  • microparticle or microsphere particles of size at most micron for their allow entry into the antigen presenting cells.
  • size at most micron means a dimension less than or equal to 999 microns.
  • the microparticles have a particle diameter of less than or equal to 3 ⁇ m. More preferably, the particles of the invention are of submicron size, preferably with a diameter between 150 and 900 nm, more preferably between 250 and 700 nm. Particle size is easily determined by techniques known to those skilled in the art such as, for example, using scanning electron microscopy, quasi-elastic light scattering, transmission electron microscopy.
  • the synthetic colloidal vectors are polymer-based vectors.
  • these synthetic vectors based on polymers include vectors comprising microparticles based on polymers such as poly ( ⁇ -hydroxylated acids), poly (hydroxybutyric acids), polycaprolactones, polyorthoesters and polyanhydrides.
  • the synthetic vector comprises at least one bioresorbable polymer chosen from a poly ( ⁇ -hydroxylated acid) such as poly (D-lactic acid), poly (Lactic acid) (called PLA), poly (glycolic acid).
  • PLG poly ( ⁇ -hydroxylated acids)
  • the proportion of each component can be easily determined by those skilled in the art.
  • a racemic mixture of poly (D- and L-lactic acid) or a PLA / PLG mixture can be used at various percentages known to those skilled in the art.
  • the colloidal synthetic vector according to the invention is prepared from at least one polymer chosen from poly ( ⁇ -hydroxylated acids). More preferably, the particles of the invention are devoid of stabilizer and surfactant so that they are not toxic.
  • toxic microparticle is meant a microparticle comprising at least one compound capable of causing biological disorders, such as disturbances of metabolism, in the organism which has received the microparticle.
  • non-toxic particles can be prepared according to the protocol described in the patent application WO2005 / 027871.
  • the synthetic colloidal vector is prepared from at least one natural polymer such as those mentioned above.
  • composition of the invention is useful for stimulating both a cell-mediated response and a humoral response. It is useful both in prophylactic and therapeutic as in diagnosis.
  • the protein substances suitable for the purpose of the invention carried by the synthetic vector may be any protein substances against which an immune response is to be triggered.
  • immune response is meant a cell-mediated response, a humoral response or both.
  • cell-mediated response a response mediated by T-cells and / or other leukocytes. This response results in the induction of lytic activity by cytotoxic T lymphocytes and / or the production of cytokines by CD8 + T lymphocytes or by helper T cells.
  • humoral response we mean a response mediated by the antibody molecules secreted by the B lymphocytes.
  • Protein substance means any protein substance having an antigenic role after addition to the appropriate vectors for the purpose of the invention, such as peptides, proteins, protein fragments, polyproteins, glycoproteins and glycoproteins, it being understood that the protein fragments have kept the structure of interest.
  • Antigens are molecules that can be recognized by an antibody whose synthesis has been induced by an immune response and containing at least one epitope.
  • protein fragments include, for example, peptides, polypeptides and epitopes.
  • the epitopes are peptides comprising between 3 and 15 and generally between 5 and 15 amino acids, consisting of the minimal peptide fragment against which an immune response is triggered.
  • the synthetic vector presents the protein substances in multiple copies.
  • at least one protein substance is meant at least several protein substances of the same type.
  • type of protein substance is meant a set of protein substances triggering the same immune response by producing the same antibodies (ie having the same immunity).
  • the synthetic vector can therefore comprise:
  • the synthetic vector may comprise as protein substance the p24 protein in the form of rative protein and / or mutated protein and / or protein fragment, it being understood that the mutated protein and the fragment have retained their immunity;
  • the synthetic vector may comprise several human immunodeficiency virus (HIV) proteins such as Gag protein, the mutated Gag protein not having the same immunity, the Tat protein, the Rev protein, the protein Nef, the Env protein;
  • HIV human immunodeficiency virus
  • the synthetic vector may comprise at least one type of HIV protein, such as p24 proteins, Tat, Rev, and at least one type of hepatitis C virus (HCV) protein such as proteins.
  • HIV protein such as p24 proteins, Tat, Rev
  • HCV hepatitis C virus
  • the synthetic vector comprises protein substances of different types and constituting antigens associated with the same disease.
  • Protein substances can be of several origins such as of viral, bacterial origin or pathology of non-infectious origin (such as cancer or a metabolic disease).
  • the protein substance is an antigen of viral origin.
  • the viruses used are all viruses for which substances capable of an immune response are known.
  • herpes viruses such as hepatitis B virus (HBV) or hepatitis C virus (HCV), papillomas virus ( HPV), Human Immunodeficiency Virus (HIV), such as HIV-I and HIV-2, various strains of human influenza and avian influenza viruses.
  • HBV hepatitis B virus
  • HCV hepatitis C virus
  • HPV papillomas virus
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • HIV-I and HIV-2 various strains of human influenza and avian influenza viruses.
  • nucleic acid sequences of the viruses suitable for the purposes of the invention, as well as the proteins encoded by said sequences are widely known to those skilled in the art and are available for example in databases such as GenBank.
  • the HIV virus has genes that encode structural proteins of the virus.
  • the gag gene codes for the protein that forms the core of the virion, including the p24 antigen.
  • the pol gene codes for the enzymes responsible for reverse transcription (reverse transcriptase), cleavage (protease) and integration (integrase).
  • the env gene encodes the envelope glycoproteins. It contains six other genes (tat, rev, nef, alive, vpr and vpu (HIV-I) or vpx (HIV-2)) that code for proteins involved in the regulation of virus gene expression ( regulation).
  • the HIV genome also includes the 5 'and 3' LTRs (Long Terminal Repeat) which include regulatory elements involved in the expression of viral genes.
  • the protein substance used in the method of the invention is a protein of the HIV virus.
  • an antigen of the HIV virus mention may be made of the regulatory proteins or the gag protein or the Env glycoprotein, the preferred regulatory proteins being the Tat, Rev or Nef protein.
  • the 5 'end of its genome corresponds to an untranslated region adjacent to the genes that encode the structural proteins, the core protein of the core, the two envelope glycoproteins, E1 and E2, and a small protein called p7.
  • the 5 'untranslated region and the core gene are relatively well conserved in the different genotypes.
  • the envelope proteins E1 and E2 are encoded by more variable regions from one isolate to another.
  • the p7 protein is an extremely hydrophobic protein that would constitute an ion channel.
  • the 3 'end of the HCV genome contains the genes that code for nonstructural proteins (NS2, NS3, NS4, NS5) and for a 3 'non-coding region having a well conserved domain (Major ME, Feinstone SM, Hepatology, June 1997, 25 (6): 1527-1538).
  • HCV NS3 non-structural protein is a 630 amino acid protein that comprises two distinct structural domains: an 81-amino acid N-terminal domain with active serine protease activity involved in the processing of the viral protein (domain called NS3 protease), and a C-terminal domain, of 549 amino acids, comprising a helicase activity associated with a NTPase activity that plays a role in the replication of the viral genome (domain called NS3 helicase).
  • This NS3 protein is relatively well conserved among the different genotypes of the virus, so that this protein is a "vaccine candidate" antigen of choice.
  • the protein substance is a tumor-associated antigen.
  • AAT tumor-associated antigens
  • tumor markers Houghton AN, 1994, J Exp Med 180: 1.
  • Protein substances of interest when small in size, may also be prepared by standard peptide syntheses well known to those skilled in the art.
  • the protein substance is associated with the colloidal vectors according to the techniques known to those skilled in the art, such as inclusion or binding to the surface.
  • encapsulation can be mentioned (Tamber H, et al., 2005, Adv Drug Deliv Rev, 57 (3): 357-76.).
  • binding of the colloidal substance to the colloidal synthetic vector mention may be made of adsorption, as described in patent application WO2005 / 027871, or covalent grafting involving the formation of a chemical bond between a reactive group of the colloidal vector. and another of the proteinaceous material as described, for example, in 'Protein immobilization-Fundamentals and Applications' by Taylor Ed, Marcel Dekker Inc., New York, 1991.
  • the protein substances are added to synthetic vectors by bonding and most preferably by adsorption, for example by mixing the microparticles with the protein substances and incubating with stirring, for example at room temperature or at 37 0 vs.
  • the composition according to the invention also comprises a viral vector.
  • the viral vector comprises at least one nucleotide sequence coding for a protein substance corresponding to at least one protein substance of the synthetic vector.
  • protein substance of the viral vector corresponding to a protein substance of the synthetic vector it is meant that the protein substance of the viral vector constitutes an antigen associated with the same disease as the protein substance of the synthetic vector, whether of the same type or type different, as previously stated.
  • the protein substances are of different type, they must have at least one epitope in common, such as for example the Gag and p24 proteins.
  • the genome of the viral vector is modified to insert one or more nucleotide sequences encoding one or more protein substances constituting antigens of the same disease or different diseases.
  • these protein substances at least one corresponds to a protein substance of the synthetic vector, these protein substances constituting antigens associated with the same disease.
  • the viral vector comprises a nucleotide sequence coding for an HIV protein.
  • the viral vector In addition to the nucleotide sequence (s) coding for at least one protein substance constituting an antigen associated with the same disease as the protein substance of the synthetic vector, the viral vector also comprises the means necessary for the expression of said protein substance.
  • a protein substance By means necessary for the expression of a protein substance is meant any means that makes it possible to obtain the protein substance, such as in particular a promoter, a transcription terminator, an origin of replication and preferably a selection marker.
  • operably linked is meant a juxtaposition of said elements necessary for expression and the gene encoding the protein substance, which are in a relationship such that it allows them to function in an expected manner. For example, they can exist bases between the promoter and the gene of interest as long as their functional relationship is preserved.
  • the means necessary for the expression of the protein substance may be homologous means, that is to say included in the genome of the vector used, or else be heterologous. In the latter case, said means are cloned with the protein of interest to be expressed.
  • heterologous promoters include (i) viral promoters such as SV40 promoter (Simian Virus 40), Herpes simplex virus thymidine kinase gene promoter (TK-HSV-I), LTR Rous sarcoma virus (RSV), the early intermediate promoter of human cytomegolovirus (CMV) and the late major adenoviral promoter (MLP), as well as (ii) any cellular promoter that controls transcription of genes encoding proteins in eukaryotes such as the promoter of the constitutive phosphoglycerate kinase (PGK) gene (Adra et al., 1987, Gene, 60: 65-74), the promoter of the liver-specific genes alphal-antitrypsin and FIX and the specific SM22 promoter smooth muscle cells (Moessler et al., 1996, Development, 122: 2415-2425).
  • viral promoters such as SV40 promoter (Simian Virus 40), Herpe
  • Said sequences contained in the viral vector may be linked directly to each other under the control of a single promoter and / or a single expression regulator element, or they may be separated while being dependent on each promoter and and / or independent, identical or different expression regulators.
  • viral vector which are suitable for the purposes of the invention, mention may be made, for example, of viral vectors such as adenovirus, pxvirus, baculovirus, herpesvirus, togavirus, retro virus.
  • Adenoviruses have been detected in many animal species. They do not integrate and are not very pathogenic. They are able to infect a variety of cell types, dividing cells and resting cells. They have a natural tropism for bronchial epithelia. In addition, they have been used as live enteric vaccines for many years with an excellent safety profile. Finally, they can be grown easily and purified in large quantities. These features have made adenoviruses are particularly suitable for use as expression vectors and especially as gene therapy vectors for therapeutic and vaccine purposes.
  • the vector of the invention is an adenovirus.
  • adenoviruses to be used in the present invention may be derived from any source of human or animal origin, in particular of canine origin (for example CAV-I or CAV-2, reference Genbank CAVlGENOM and CAV77082, respectively), avian origina (Genbank AAVEDSDNA reference), of bovine origin (such as BAV3, Seshidhar Reddy et al., 1998, J. Viral., 72: 1394-1402), of ovine, feline, porcine origin, simian origin, or one of their hybrids. Any serotype can be used. However, adenoviruses of human origin are preferred and in particular adenovirus (Ad5).
  • viruses mentioned are available in the ATCC collections and have been the subject of numerous publications describing their sequence, their organization and their biology, which allows the person skilled in the art to apply them easily.
  • sequence of adenovirus type 5 is described in the Genbank database (M73260 and M29978) and is incorporated herein by reference.
  • the adenovirus genome consists of a double-stranded linear DNA molecule of about 36 kb carrying more than about 30 genes needed to complete the viral cycle.
  • the E1, E2 and E4 regions are essential for viral replication.
  • the E3 region is considered a non-essential region on the basis of the observation that naturally occurring mutant viruses or hybrid viruses that have lost this E3 region continue to replicate as wild-type viruses in cultured cells (Kelly and Lewis , 1973, J. Virol., 12: 643-652).
  • the late genes (L1 to L5) predominantly encode the structural proteins constituting the viral capsid.
  • adenoviral genome carries at the two ends of the cis-action regions essential for DNA replication, the 5 'and 3' inverted repeat repeats (ITRs), and a packaging sequence.
  • ITRs inverted repeat repeats
  • Adenoviruses currently used in gene therapy protocols lack the majority of the E1 region, rendering viruses deficient in their replication to prevent their release into the environment and into the host organism.
  • most adenoviruses are also devoid of the E3 region in order to increase their cloning capacity.
  • Another expression vector that is particularly suitable for the purposes of the invention is a poxvirus, which constitutes another embodiment of the invention.
  • Poxviruses are a group of enveloped complex viruses, distinguished primarily by their unusual morphology, large DNA genome, and cytoplasmic replication site.
  • the genome of several elements of poxviridae including the Copenhagen vaccinia viral (VV) strain (Goebel et al., 1990, Viral 179: 247-266 and 517-563) and the modified vaccinia virus strain of Ankara (MVA) (Antoine et al., 1998, Viral., 244: 635-396), was mapped and sequenced.
  • the VV strain has a double-stranded DNA genome of about 192 kb encoding about 200 proteins of which approximately 100 are involved in the assembly of the virus.
  • MVA is a highly attenuated vaccinia virus strain generated by more than 500 serial passages of vaccinia virus (CVA) Ankara strain on chicken embryo fibroblasts (Mayr et al. 1975, Infection, 3: 6-16).
  • CVA vaccinia virus
  • Ankara strain on chicken embryo fibroblasts Mayr et al. 1975, Infection, 3: 6-16.
  • the MVA virus was deposited in front of the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) under the number 1-721.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • the determination of the complete sequence of the MVA genome and the comparison with that of the W allows precise identification of the alterations that have appeared in the viral genome and the definition of seven deletions (I to Vu) and numerous mutations leading to frames fragmented open reading (Antoine et al., 1998, Virology, 244: 365-396).
  • poxviruses suitable for the purpose of the invention include canary pox, poultry pox, cow pox, entomopox, monkey pox, pox pox and penguin pox.
  • the poxvirus is found in two morphologically distinct forms, called intracellular mature virus (IMV) and enveloped extracellular virus (EEV).
  • IMV intracellular mature virus
  • EEV enveloped extracellular virus
  • the poxvirus used for the purposes of the invention is a Modified Vaccinia Virus Ankara.
  • nucleotide sequence inserted into the viral vector encodes an HIV virus protein.
  • compositions according to the invention are particularly effective for the inhibition, prevention and treatment of a disease whose protein substance of the composition constitutes an antigen, such as an infection with a virus. They are therefore particularly useful for the preparation of a medicament, and in particular a vaccine, whether therapeutic or prophylactic.
  • the invention also relates to a method of prophylactic or therapeutic treatment, in particular vaccination, comprising the administration to a patient of an effective dose of the composition according to the invention.
  • compositions of the invention are suitable for oral, sublingual, subcutaneous, intramuscular, intravenous, topical, local, intratracheal, intranasal, transdermal, rectal, vaginal, intraocular, intra-auricular administration, said active ingredient being administered in unit dosage form.
  • the unit dosage forms may be, for example, tablets, capsules, granules, powders, injectable oral solutions or suspensions, transdermal patches, sublingual, oral, intratracheal, intraocular forms of administration. , intranasal, intra- auricular, by inhalation, topical administration forms, such as rectal or vaginal, transdermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous, or implants.
  • topical administration one can consider creams, gels, ointments, lotions or eye drops.
  • galenic forms are prepared according to the usual methods of the fields considered. Said unit forms are dosed to allow a daily administration of 0.001 to 10 mg of active ingredient per kg of body weight, according to the dosage form.
  • the dosage appropriate to each patient is determined by the physician according to the mode of administration, the weight and the response of the patient.
  • the amount and nature of the excipient can be readily determined by those skilled in the art. They are chosen according to the pharmaceutical form and the mode of administration desired.
  • composition according to the invention may be contained in a pharmaceutical kit.
  • administration of the composition according to the invention may be simultaneous, separate or staggered over time.
  • simultaneous administration is meant administration at the same time and in the same place of the composition.
  • staggered administration is meant the administration of the viral vector or the synthetic vector at deferred times.
  • the time between each administration may range from a few minutes to several years, preferably from several weeks to several months and preferably it may be 3 or 4 weeks.
  • separate administration is meant the administration of the viral vector and the synthetic vector to different body locations.
  • the viral vector and the synthetic vector may be in the same excipient or preferably in different suitable excipients.
  • composition according to the invention is administered in a staggered manner. More preferably, the synthetic vector is administered before the viral vector.
  • the composition of the invention comprises: i) a premium component consisting of the bioresorbable colloidal synthetic vector comprising at least one protein substance and ii) a boost component consisting of the viral vector comprising at least one nucleotide sequence coding for a protein substance corresponding to at least one protein substance of the synthetic vector.
  • the invention also has a diagnostic application.
  • the invention also relates to the use of the composition of the invention for the in vitro diagnosis of the pathological state of which the protein substance (s) of the synthetic vector and of the synthetic vector constitute the antigens, and in particular of a Viral infection or cancer.
  • FIG. 1 represents the CTL responses during the N 0 I immunization experiment with different vaccine compositions whose compositions according to the invention comprising a synthetic vector based on poly (D, L-lactic acid) microparticles associated with the p24 protein (hereinafter referred to as PLA / p24) and an MVA viral vector comprising the gag sequence (hereinafter referred to as MVA gag virus).
  • a synthetic vector based on poly (D, L-lactic acid) microparticles associated with the p24 protein hereinafter referred to as PLA / p24
  • MVA viral vector comprising the gag sequence
  • FIG. 2 represents the ELISPOT IFN- ⁇ responses specific for the Gag AMQ peptide during the 3 immunization experiments with different vaccine compositions, the compositions of which according to the invention comprise the synthetic vector PLA / p24 and the viral vector MVA gag.
  • FIG. 3 represents the specific IFN- ⁇ ELISPOT responses of the p24 protein during the 3 immunization experiments with various vaccine compositions, the compositions of which according to the invention comprise the PLA / p24 synthetic vector and the viral MVA gag vector.
  • FIG. 4 represents the ELISPOT IL-4 responses specific for the p24 protein during the 3 immunization experiments with different vaccine compositions, the compositions of which according to the invention comprise the synthetic vector PLA / p24 and the viral vector MVA gag.
  • FIG. 5 represents the secretion of the cytokine GM-CSF specific for the p24 protein during the 3 immunization experiments with different vaccine compositions, the compositions according to the invention comprising the synthetic vector PLA / p24 and the viral vector MVA gag.
  • FIG. 6 represents the secretion of the cytokine IL-5 specific for the p24 protein during the 3 immunization experiments with different vaccine compositions, the compositions of which according to the invention comprise the synthetic vector PLA / p24 and the viral vector MVA gag.
  • FIG. 7 represents the secretion of the cytokine IL-2 specific for the p24 protein during the 3 immunization experiments with different vaccine compositions, the compositions of which according to the invention comprise the synthetic vector PLA / p24 and the viral vector MVA gag.
  • FIG. 8 represents the kinetics of appearance of the specific humoral responses of the p24 protein during the 3 immunization experiments with different vaccine compositions, the compositions of which according to the invention comprise the PLA / p24 synthetic vector and the viral MVA gag vector.
  • FIG. 9 represents the CTL responses during the immunization experiment No. 2 with different vaccine compositions, the compositions according to the invention comprising the synthetic vector PLA / p24 and the viral vector Adenovirus Gag.
  • FIG. 10 represents the ELISPOT IFN- ⁇ responses specific for the Gag AMQ peptide after immunization with various vaccine compositions, the compositions according to the invention comprising the PLA / p24 synthetic vector and the Adenovirus Gag viral vector.
  • FIG. 11 represents the specific secretion of the p24 protein of cytokines IL-2, IL-4, IL-10 after immunization with various vaccine compositions, the compositions according to the invention comprising the synthetic vector PLA / p24 and the viral vector Adenovirus Gag .
  • FIG. 12 represents the kinetics of the appearance of the specific humoral responses of the protein p24 (12A) or of the adenovirus (12B) after immunization with various vaccine compositions, the compositions according to the invention comprising the synthetic vector PLA / p24 and the Adenovirus Gag viral vector.
  • FIG. 13 compares the ELISPOT IFN- ⁇ responses specific for the Gag AMQ peptide after immunization with various vaccine compositions, the compositions comprising PLA / p24 and MVA gag or comprising Alum / p24 and MVA gag.
  • Figure 14 compares ELISPOT IL-4 responses specific for p24 protein after immunization with different vaccine compositions including compositions comprising PLA / p24 and MVA gag or comprising Alum / p24 and MVA gag.
  • FIG. 15 compares the kinetics of appearance of the specific humoral responses of the p24 protein after immunization with different vaccine compositions whose compositions comprising PLA / p24 and MVA gag or comprising Alum / p24 and MVA gag.
  • FIG. 16 compares the kinetics of appearance of the humoral specific responses of the MVA virus after immunization with different vaccine compositions whose compositions comprising PLA / p24 and MVA gag or comprising Alum / p24 and MVA gag.
  • FIG. 17 represents the ELISPOT IFN- ⁇ responses specific for the beta-gal TPH peptide after immunization of mice with various vaccine compositions, the compositions of the invention comprising the PLA-beta-gal synthetic vector and the MVA betagal viral vector.
  • FIG. 18 compares the kinetics of the appearance of specific humoral responses of beta-gal after immunization of mice with different vaccine compositions, the compositions of the invention comprising the synthetic vector PLA-beta-gal and the viral vector MVA beta-gal. .
  • FIG. 19 represents the IFN- ⁇ ELISPOT responses specific for p24 AMQ peptide after immunization of mice with various vaccine compositions, the compositions of the invention comprising the synthetic vector CPL-p24 and the viral vector MVA gag.
  • FIG. 20 compares the kinetics of appearance of the specific humoral responses of the p24 AMQ peptide after immunization of mice with different vaccine compositions, the compositions of the invention comprising the synthetic vector CPL-p24 and the viral vector MVA gag.
  • the vaccine composition used comprises a synthetic vector based on poly (D, L-lactic acid) microparticles associated with the p24 protein (hereinafter referred to as PLA / p24) and an MVA viral vector comprising the gag sequence of SEQ ID. N 0 I (hereinafter called MVA virus gag) 1.
  • PLA / p24 poly (D, L-lactic acid) microparticles associated with the p24 protein
  • MVA viral vector comprising the gag sequence of SEQ ID. N 0 I (hereinafter called MVA virus gag) 1.
  • MVA gag virus Modified Vaccinia Virus Ankara, attenuated vaccinia virus, Ankara strain
  • the recombinant virus was constructed at Transgene from the wild-type strain (MVATGN33) as described in Antoine G., et al., 1998, "The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses", Virology , 244: 365-396.
  • This recombinant virus was then produced and purified as follows: MVA is replicated on embryonic chicken cells. After 48 to 72 hours of infection, the cells are harvested, then lysed by freezing / thawing and sonication. The lysate is purified / concentrated by 2 cushions of sucrose followed optionally by 2 sucrose gradients.
  • wild MVATGN33 MVA virus This is a negative control that measures whether the viral vector induces a nonspecific immune response during immunizations.
  • gag DNA The gag gene (of SEQ ID NO : 1) was cloned into the eukaryotic expression plasmid phCMV (contains the intermediate / early promoter of human cytomegalovirus and splicing and polyadenylation signals derived from the rabbit beta-globin gene ( JK Yee, et al., 1994, Proc Natl Acad Sci US A, 91 (20): 9564-9568.) DNA preparations without endotoxin and in large amounts were made with Macherey's Gigaprep endotoxin-free kit.
  • -Nagel DNA serves as a positive control because it is known only in mice the intramuscular administration of naked DNA makes it possible to induce a good cytotoxic response (CTL).
  • CTL cytotoxic response
  • mice received 2 doses of the immunogens described in 2 above at 0 and 3 weeks.
  • the vaccine compositions received by each group of mice are shown in Table 1 below. All injections were subcutaneous except for DNA which was administered intramuscularly.
  • Pfu plate forming units, this is the unit of measurement for the MVA dose used.
  • the viral titer is expressed in pfu according to the assay technique of the viral stock used, as indicated in Current Protocols in Molecular Biology, supra.
  • the animals were sacrificed 6 weeks after the first injection and blood and spleen were taken for immunoassays.
  • mice received 2 or 3 doses of the immunogens described in 2 above at 0, 3 and 6 weeks.
  • the vaccine compositions received by each group of mice are shown in Table 2 below. All injections were performed subcutaneously. Table 2
  • the animals were sacrificed 3 weeks after the last injection and the blood and spleen were taken for immunological analyzes.
  • mice received 2 or 3 doses of the immunogens described in 2 above at 0, 3 and 6 weeks.
  • the vaccine compositions received by each group of mice are shown in Table 3 below. All injections were done subcutaneously.
  • a blood sample was taken from the mice before their sacrifice.
  • the presence of anti-p24 antibodies was determined by ELISA.
  • the p24 protein (produced with Escherichia coli and purified by metalchelate affinity chromatography according to Cheynet V. et al., 1993, Protein Expr Purif, 4 (5): 367-72) was used in capture and the specific antibodies present in the serum were revealed by a polyclonal anti-mouse antibody as a detection antibody which is a horseradish peroxidase-conjugated horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (H + L, Jackson Immunoresearch, Cat No. 115 -035 to 062).
  • the titre is the inverse of the dilution for which an absorbance of 0.1 OD unit is obtained with the ELISA protocol used.
  • CTL Test The cell suspension was cultured in the presence of a peptide of the 9-mer p24 protein (AMQMLKE ⁇ - SEQ ID No. 2) which corresponds to a CTL H-2K J -restricted immunodominant epitope. , and IL-2. Five days later, the effector population was restimulated by irradiated na ⁇ ve cells loaded with the peptide. The cytotoxic effector population was harvested at the end of the 7th day, and CTL activity was measured using as target P815 cells (ATCC TIB-64) labeled with 51 Cr.
  • ELISPOT makes it possible to determine the number of cells secreting a given cytokine in response to a specific stimulus.
  • 96 well ELISPOT plates with PVDF membranes Multiscreen IP, Millipore) were coated with anti-IFN-? or anti-IL-4.
  • splenocyte suspensions were incubated in these plates in order to capture cytokines secreted by each cell.
  • the spots corresponding to each cell secreting the cytokine of interest were revealed by a biotinylated detection antibody specific for the cytokine of interest.
  • Cytokine secretion The splenocytes were stimulated for 3 days in complete culture medium (medium essential minimum alpha medium ⁇ cMEM) containing 10% fetal calf serum, 10 mM HEPES, 5 x 10 5 M ⁇ - mercaptoethanol, 4 mM L-glutamine, 80 U / ml penicillin, 80 mg / ml streptomycin, non-essential amino acids Ix (cat # 11140-035), sodium pyruvate Ix (cat # 11360-039) (components of Invitrogen , Cergy Pontoise, France)) in the presence or absence of the antigen of interest p24, then the secreted cytokines in the culture supernatant were assayed by the Bender Medsystems FlowCytomix Thl / Th2 lOplex mouse kit (Cat No. BMS720FF). .
  • FIG. 1 shows the CTL responses obtained in the immunization experiment No. 1.
  • Each group consists of 5 mice, the rats were pooled before performing the CTL assay. Since nonspecific (peptide-free) stimulation in all groups is 0, it is not shown. Similarly, the CTL responses obtained with the compositions A, D and E being 0, they are not represented.
  • the abscissa corresponds to the ratio effector cells (CTL) on target cells (to be lysed).
  • the y-axis corresponds to the average lysis percentage.
  • Induced CTL responses are of low intensity with all the immunogens used (MVA, PLA or combinations), with the exception of the G group of experiment 1 which received DNA last ( Figure 1).
  • the induction of CTL in the DNA groups is normal: the DNA is optimized for this purpose, it is a positive control in the mouse but which does not work as well well in primates.
  • Interferon gamma or type II is also called immune interferon because it is secreted by CD4 + T cells, CD8 + T cells and NK cells.
  • H protects cells against viral infections. H stimulates the phagocytic activity of macrophages, allowing them to kill tumor cells. H stimulates the maturation of T and B cells and increases the production of antibodies. H increases the expression of HLA class I and II molecules by macrophages. This is a ThI type cytokine. It is possible to classify the vaccine compositions into several categories depending on the ELISPOT IFN- ⁇ responses obtained. The best responses are induced by the PLA + MVA (C) and MVA + MVA (A) compositions.
  • the third injection provides either no improvement (MVA + MVA composition) (A '), or may decrease the observed response (composition PLA + MVA) (C).
  • the compositions MVA + PLA (B and B ') and DNA + PLA (F) make it possible to generate intermediate intensity responses, whereas the strategy using only PLA (D and D') induces only weak responses.
  • PLA + MVA (C) vaccine composition was at least as good, if not better than the MVA + MVA (A) combination for inducing a specific IFN- ⁇ secretion of the AMQ peptide.
  • compositions are classified into several categories depending on the ELISPOT IFN- ⁇ responses obtained.
  • the best responses are induced by PLA + MVA (C and C) and DNA + PLA (F) compositions.
  • the third injection further reduces the response observed in the case of the composition PLA + MVA (C).
  • the compositions MVA + PLA (B and B ') and MVA + MVA (A and A') make it possible to generate intermediate intensity responses, whereas the strategy using only PLA (D and D ') only induces responses. low.
  • PLA + MVA vaccine composition was the best choice to induce secretion of IFN- ⁇ specific for the p24 protein.
  • PLA + MVA vaccine composition was the best choice to induce secretion of IL-4 specific for the p24 protein.
  • cytokines The study of the secretion of cytokines makes it possible to draw a table of the state of immune activation of the animal which has received the vaccine composition.
  • the cytokines can be divided into four groups according to their properties:
  • IL-2 Activators of lymphocyte activation, growth and differentiation (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TGF- ⁇ )
  • Non-specific activators of inflammation IFN- ⁇ , IL-5, IL-8
  • cytokines are: IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , GM-CSF, IL-4, IL-17, IL-1 ⁇ , IL-2, IL-5, IL-6, IL- 10.
  • FIG. 5 represents the secretion of the cytokine GM-CSF specific for the p24 protein. All the animals immunized during the 3 successive experiments were included in the analysis, when the quantity of available cells allowed it. For each vaccine composition, the number of animals that received this composition is indicated in parentheses. The cells obtained from the mice of the same group were pooled before culturing for the secretion test. The axis of ordinates represents the concentration of GM-CSF (in pg / ml) secreted in the culture medium in response to a 3-day stimulation by the p24 protein.
  • the cytokine GM-CSF (granulocyte-macrohage colony stimulating factor) is a powerful immunostimulator that activates immune functions such as adhesion, phagocytosis, etc. macrophages, neutrophils and eosinophils.
  • GM-CSF granulocyte-macrohage colony stimulating factor
  • Figure 6 shows the secretion of the cytokine IL-5 specific for the p24 protein. All the animals immunized during the 3 successive experiments were included in the analysis, when the quantity of available cells allowed it. For each vaccine composition, the number of animals that received this composition is indicated in parentheses. The cells obtained from the mice of the same group were pooled before culturing for the secretion test. The ordinate axis represents the concentration of IL-5 (in ⁇ g / ml) secreted in the culture medium in response to a 3-day stimulation by the p24 protein.
  • Th2-type cytokines The secretion of cytokines is therefore oriented more or less towards Th2-type cytokines as a function of the vaccine composition: a predominantly Th2-type response is observed for the groups immunized solely with PLA (the secretion of IFN-gamma from IL-2, Th1 type cytokines is weak ( Figure 7), we observe a non-polarized response, both ThI and Th2 for groups immunized with PLA and MVA combinations for MVA groups, the secretion of cytokines type Th2 is weak.
  • Interleukin 4 is secreted by CD4 + T cells. It increases the growth and differentiation of previously activated B lymphocytes, promotes the production of IgE which plays an important role in immediate hypersensitivity reactions. It also activates macrophages.
  • Interleukin 5 stimulates the growth, differentiation and activity of eosinophils that play an important role in the fight against parasitic infections.
  • the increase in the number of eosinophils is not only a sign of parasitic attack but also a defense.
  • IL-5 induces the proliferation of B lymphocytes and their secretion of immunoglobulins. It activates cytotoxic T lymphocytes. Its use in the treatment of certain parasitic diseases may be considered.
  • Interleukin 6 stimulates growth and differentiation of B cells and increases platelet generation. It causes, by activation of hepatocytes, the secretion of inflammatory proteins such as fibrinogen and C-reactive protein. It has a proinflammatory role. It has a cytotoxic effect vis-à-vis certain tumors.
  • Figure 7 shows the secretion of the cytokine IL-2 specific for the p24 protein. All the animals immunized during the 3 successive experiments were included in the analysis, when the quantity of available cells allowed it. For each vaccine composition, the number of animals that received this composition is indicated in parentheses. The cells obtained from the mice of the same group were pooled before culturing for the secretion test. The ordinate axis represents the concentration of IL-2 (in ⁇ g / ml) secreted in the culture medium in response to a 3-day stimulation by the p24 protein.
  • LIL-2 is a growth factor for T cells. It activates their transformation into cytotoxic T lymphocytes of the CD8 + type that secrete interferon ⁇ , which stimulates macrophages to release TNF ⁇ and TGF ⁇ (transforming growth factor ⁇ ). LIL-2 stimulates the growth and cytolytic activity of NK (natural killer) cells. It stimulates the maturation of B lymphocytes and the synthesis of antibodies. It is a ThI type cytokine.
  • compositions containing MVA and PLA or PLA alone induce a high titre, one log higher than the titre induced by MVA alone.
  • compositions specifically obtaining very good answers.
  • PLA + MVA composition the best composition is PLA + MVA composition.
  • Adenovirus type Gag which is recombinant for the gag gene of the virus
  • HIV-I encoding the p24 protein.
  • Adenovirus type 5 eGFP which is recombinant for the gene encoding the enhanced Green Fluorescent Protein (Genethon). This is a negative control that is used to measure whether the viral vector induces a nonspecific immune response during immunizations.
  • gag DNA The gag gene (SEQ ID NO : 1) was cloned into the eukaryotic expression plasmid phCMV (non-commercial plasmid). DNA preparations without endotoxin and in large amounts were made with Macherey-Nagel's Gigaprep endotoxin-free kit.
  • DNA serves as a positive control because it is known that in mice the intramuscular administration of naked DNA makes it possible to induce a good cytotoxic response (CTL).
  • CTL cytotoxic response
  • mice received 2 doses of the immunogens described in 2 above at 0 and 3 weeks.
  • the vaccine compositions received by each group of mice are shown in Table 6 below. All injections were made intramuscularly for adenovirus and DNA and subcutaneously for PLA. Table 6
  • the animals were sacrificed 3 weeks after the last injection and the blood and spleen were taken for immunological analyzes.
  • Example 2 Performed following the same protocols as in Example 1.
  • the protocol is identical to that used for the anti-p24 ELISA, except that an adenovirus lysate is used in capture.
  • FIG. 9 shows the CTL responses obtained in immunization experiment # 2.
  • Each group consists of 5 mice, analyzed individually. Since nonspecific (peptide-free) stimulation in all groups is 0, it is not shown.
  • the abscissa corresponds to the ratio effector cells (CTL) on target cells (to be lysed).
  • mice developed a CTL response, except one mouse from the Ad5gag 10 7 + PLA group.
  • Ad + combinations Ad (H and H ') and PLA + Ad (J and J') induce better CTL responses than the Ad + PLA combination (I and F).
  • Figure 10 shows the ELISPOT IFN- ⁇ responses specific for Gag AMQ peptide.
  • the ordinate axis represents the average number of IFN- ⁇ secreting cells specifically in response to 18h stimulation by the Gag AMQ peptide on one million stimulated cells. This response was determined individually for each mouse (numbered from 1 to 5 for each mouse, thus H1 corresponds to the mouse 1 having received the composition H Ad5 gag 10 8 ip and Ad5 gag 10 8 ip, etc.
  • the number presented on this graph is an average of triplicates.
  • the response Ad + Ad> or PLA + Ad> Ad + PLA.
  • the difference between the Ad + Ad and PLA + Ad compositions is not very obvious.
  • the IFN-gamma ELISPOT response is in agreement with the CTL test: The PLA + Ad and Ad + Ad compositions are more effective than Ad + PLA.
  • Example 1 we tested the secretion of cytokines in the supernatant. Of these, IL-5, IL-6, IL-17 and IFN- ⁇ were not secreted or secreted at infinitesimal concentrations. As for GM-CSF, TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ , their secretion was not specific for the p24 protein by the assay technique used. It is very likely that it is the immunization with adenovirus that causes the secretion of these cytokines. If a specific secretion of the p24 protein exists, it is embedded in that caused by the adenovirus.
  • FIG 11 shows the secretion of cytokines IL-2, IL-4 and IL-10 specific for the p24 protein.
  • Each vaccine composition was administered to 5 mice. Cells obtained from the mice of the same group were pooled before culturing for the secretion test.
  • the ordinate axis represents the concentration of each cytokine (in ⁇ g / ml) secreted in the culture medium in response to a 3-day stimulation by the p24 protein.
  • Ad5 gag + Ad5 gag gives no secretion of IL-2, IL-4 or IL-10.
  • compositions PLA + Ad5 gag (J and J ') and Ad5 gag + PLA (I and F) allow secretion of IL-10.
  • Ad + Ad composition (H and H ') induces a rather polarized cytokine ThI response (measured by ELISPOT IFN-gamma)
  • the PLA + Ad 5 composition (J and J ') induces a non-polarized cytokine response, since both Th1 cytokines like IFN-gamma (by ELISPOT) and IL-2, and Th2 cytokines like IL-2. 4 and IL-10 are detected.
  • Figure 12 shows the kinetics of appearance of humoral responses.
  • Figure 12 (A) shows the antibody response directed against the p24 protein and
  • Figure 12 (B) represents the antibody response directed against the adeno virus.
  • Each vaccine composition was administered to 5 mice.
  • the y-axis represents the IgG titer measured by ELISA; the scale of this axis is logarithmic.
  • S3 week 3
  • S6 week 6.
  • the anti-adenovirus response (or anti-vector response) is about 1 log less in the groups that received Ad + PLA (I and F) and PLA + Ad (J and J ') compositions than Ad + Ad ( H and H ').
  • compositions according to the invention therefore make it possible to reduce the anti-adenovirus immunity.
  • Example 3 Comparison of the PLA / p24 + MVAgag and Alum / p24 + MVAgag Vaccine Composition in the Mouse
  • alum / p24 alum (Imject Alum, Pierce, Cat. No. 77161) is mixed volume for volume (1: 1) with p24 protein diluted in PBS. A dose of 40 ⁇ g of p24 is administered by injection and per animal.
  • the MVA gag virus Modified Vaccinia Virus Ankara, attenuated vaccinia virus, Ankara strain
  • the gag gene of the HIV-1 virus encoding the p24 protein.
  • the recombinant virus was constructed at Transgene, as shown in Example 1. gag DNA.
  • the gag gene sequence SEQ ID N 0 I was cloned into the eukaryotic expression plasmid phCMV. DNA preparations without endotoxin and in large amounts were made with Macherey-Nagel's Gigaprep endotoxin-free kit. DNA serves as a positive control because it is known that in mice the intramuscular administration of naked DNA makes it possible to induce a good cytotoxic response (CTL).
  • CTL cytotoxic response
  • mice received 2 doses of the immunogens described in 2 above at 0 and 3 weeks.
  • the vaccine compositions received by each group of mice are shown in Table 7 below. All injections were done subcutaneously except for DNA which was administered intramuscularly. Table 7
  • Pfu plate forming units, this is the unit of measurement for the MVA dose used.
  • the viral titre is expressed in pfu according to the assay technique of the viral stock used.
  • the animals were sacrificed 6 weeks after the first injection and blood and spleen were taken for immunoassays.
  • Example 2 Performed following the same protocols as in Example 1. In addition, we measured the humoral responses directed against the MVA using an ELISA technique. The protocol is identical to that used for the anti-p24 ELISA, except that an MVA lysate is used in capture.
  • FIG. 13 represents the ELISPOT IFN- ⁇ responses specific for the Gag AMQ peptide.
  • the IFN- ⁇ ELISPOT responses obtained during this experiment are weaker than usual. This decrease is observed both for the groups tested and the groups controls, and is linked to the progress of the experiment. Therefore, as we seek to compare the different combinations between it, this experiment remains interpretable and clearly shows that the composition PLA / p24 + MVA gag (C) induces a better secretion of IFN- ⁇ measured by ELISPOT than the other groups. tested, namely MVA gag + PLA / p24 (B), MVA gag + Alum / p24 (K), Alum / p24 + MVA gag (L).
  • Figure 14 shows the ELISPOT IL-4 responses specific for the p24 protein.
  • the best immunogen consists of the combination MVAgag and PLA / p24 (B and C). Whatever the order of administration of this composition, the IL-4 responses obtained are greater than those induced by the MVA gag + Alum / p24 compositions (whatever the order) (K and L), PLA / p24 + DNAgag (G) and Alum / p24 + DNAgag (M). If we are interested now in the order of administration of the products, it is always the composition PLA / p24 + MVAgag (C) which gives better results than the inverse combination, MVAgag + PLA / p24 (B) .
  • FIG. 15 represents the kinetics of appearance of the specific humoral responses of the p24 protein.
  • the best immunogen is again constituted by the combination MVAgag and PLA / p24 (B and C).
  • the anti-P4 IgG titers obtained were 0.6 to 1.2 log higher at week 6 than those induced by MVA gag + Alum / p24 combinations (regardless of order) (K and L), PLA / p24 + gagDNA (G), and Alum / p24 + DNAgag (M).
  • FIG. 16 represents the kinetics of appearance of the specific humoral responses of the MVA virus.
  • the y-axis represents the anti-MVA IgG titre measured by MVA capture ELISA.
  • the MVA was administered at week 3.
  • the anti-MVA response did not occur.
  • the anti-MVA response is much lower in the MVAgag + PLA / p24 (B) group than in the MVAgag + Alum / p24 (K) group.
  • the anti-MVA titre does not increase in time, which is not the case with the combination MVAgag + Alum / p24.
  • PLA In combination with MVA, PLA can limit the anti-MVA antibody response while this is not the case with the MVA + Alum combination. This is a very interesting property and very useful for immunization and vaccination applications.
  • compositions according to the invention PLA / p24 and MVAgag make it possible to induce better cellular and humoral responses than the Alum / p24 and MVAgag compositions. In addition, they make it possible to limit the anti-vector response.
  • EXAMPLE 4 Administration of PLA / p24 and MVAgag Vaccine Compositions Intranasally
  • the following immunogens were used alone or in combination: the PLA / p24 microparticles prepared according to the solvent displacement and adsorption protocol of the patent application WO2005 / 027871.
  • the MVA gag virus Modified Vaccinia Virus Ankara, attenuated vaccinia virus, Ankara strain
  • the recombinant virus was constructed at Transgene, as previously indicated.
  • mice received 3 doses of the immunogens described in 2 above at 0, 10 and 20 days.
  • the vaccine compositions received by each group of mice are shown in Table 8 below. All injections were made intranasally.
  • Pfu plate forming units, this is the unit of measurement for the MVA dose used.
  • the viral titre is expressed in pfu according to the assay technique of the viral stock used.
  • vagina The animals were sacrificed 32 days after the first injection. Blood, vaginal secretions, feces, spleen and genitalia (vagina) were collected for immunological analyzes.
  • mice that developed a CTL response 2/5 2/5% average lysis of CTL + mice 50% 45%
  • the ELISPOT measures the number of cells secreting the cytokine by 10 E 6 cells analyzed
  • Anti-p24 IgA in the feces (450 bcm absorbance 0.20 J20 0.18 nm, as determined by ELISA) J32 0.02 J32 0.03
  • mice received 2 doses of the immunogens described in 2 above at 0 and 3 weeks.
  • the vaccine combinations received by each group of mice are shown in the following Table 10. All injections were done subcutaneously. Table 10
  • Pfu plate forming units, this is the unit of measurement for the MVA dose used.
  • the viral titre is expressed in pfu according to the assay technique of the viral stock used.
  • the animals were sacrificed 6 weeks after the first injection and blood and spleen were taken for immunoassays.
  • the ELISPOT makes it possible to determine the number of cells secreting a given cytokine in response to a specific stimulus.
  • the cell suspensions obtained from the spleens were restimulated in vitro by the peptide TPH (TPHPARIGL-SEQ ID NO: 3) for 20 h to analyze the CD8 type responses.
  • the 96-well ELISPOT plates with PVDF membranes (Multiscreen IP, Millipore) were coated with an anti-IFN-gamma antibody.
  • splenocyte suspensions were incubated in these plates in order to capture cytokines secreted by each cell.
  • the spots corresponding to each cell secreting the cytokine of interest were revealed by a biotinylated detection antibody specific for the cytokine of interest.
  • - Humoral response a blood sample was taken from the mice before their sacrifice. The presence of anti-beta-gal antibodies was determined by ELISA. The beta-gal protein was used in capture and bs specific antibodies present in the serum were disclosed by an anti-mouse polyclonal antibody as a detection antibody which is a horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG anti-IgG antibody (H + L, Jackson Immunoresearch, Cat No. 115-035-062). The titre is the inverse of the dilution for which an absorbance of 0.1 OD unit is obtained with the ELISA protocol used. 5. Results
  • FIG. 17 gives the ELISPOT IFN- ⁇ responses specific for the beta-gal TPH peptide.
  • FIG. 18 compares the kinetics of appearance of the specific humoral responses of the beta-gal protein.
  • the y-axis represents the anti-beta-gal IgCr titre measured by beta-gal capture ELISA; the scale of this axis is logarithmic.
  • PLA + MVA (S) immunization does not allow to induce the best immune response according to each type of response analyzed, on the whole it is the group for which we observe the largest and most intense responses.
  • the CPL microparticles used in this work are formed by coprecipitation of two polysaccharides; chitosan (Mahtani chitosan PVT Batch 124) and dextran sulfate (Sigma: 31404).
  • the two polymers are first dissolved in water at pH 4 containing 50 mM NaCl. The solutions are left under magnetic stirring for 12 hours before preparing the particles. Then, 20 ml of the 0.1% chitosan solution (molar mass of 105000 g / mol and a degree of acetylation 9) are mixed with 9.35 ml of the dextran sulfate solution at 0.1 %.
  • the solution in default is poured quickly on the excess solution placed under magnetic stirring at 1000 rpm.
  • the mixture is left on the stirrer for 30 seconds at 500 rpm and then centrifuged for 30 minutes at 7800 g.
  • the supernatant is removed by inversion, the pellet is taken up in water and then again centrifuged for 30 minutes at 8000 g.
  • the pellets thus obtained are taken up in water and stored at room temperature with constant stirring.
  • the particles obtained are characterized by a size measurement (Coulter granulometer), and load (Zetasizer Malvern).
  • the p24 at 1 g / l in 10 mM phosphate buffer pH 5.7 is mixed volume for volume with CPL particles at 1% solids level, ie 0.5% final. .
  • the samples are stirred on a wheel at room temperature for 20 hours. After incubation, the tubes are recovered and centrifuged for 10 minutes at 1800 g at 20 ° C. The supernatants are recovered and centrifuged for 15 minutes at 3000 g at 20 ° C. to remove the particles that can remain in suspension, and then the protein concentration is determined. using a BCA assay (BCA Protein Assay Kit, Pierce: 23225). The pellets are taken up in 400 ⁇ l of 10 mM phosphate buffer. The particles obtained are characterized by a measurement of size and charge.
  • the MVA gag virus (Modified Vaccinia Virus Ankara, attenuated vaccinia virus, Ankara strain) which is recombinant for the gag gene of the HIV-1 virus, encoding the p24 protein.
  • the recombinant virus was constructed at Transgene, and produced and purified as previously described.
  • mice received 2 doses of the immunogens described in 2 above at 0 and 3 weeks.
  • the vaccine combinations received by each group of mice are shown in the following Table 11. All injections were performed subcutaneously. Table 11
  • Pfu plate forming units, this is the unit of measurement for the MVA dose used.
  • the viral titre is expressed in pfu according to the assay technique of the viral stock used.
  • the animals were sacrificed 6 weeks after the first injection and blood and spleen were taken for immunoassays.
  • the CPL + MVA combination is effective in inducing a specific IFN- ⁇ secretion of the AMQ peptide.
  • the simultaneous injection of the two immunogens does not make it possible to improve the performance compared with the 3 weeks separate administration (Z vs V).
  • FIG. 20 The results are shown in Figure 20 which compares the kinetics of occurrence of specific humoral responses of the p24 protein.
  • the y-axis represents the anti-p24 IgG titer measured by p24 capture ELISA; the scale of this axis is logarithmic.
  • S3 week 3
  • S6 week 6.
  • bioresorbable synthetic colloidal vector such as PLA, CPL
  • a viral vector such as MVA and adeno virus
  • the combination should be administered in the order synthetic vector, then viral vector.

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Abstract

La présente invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant - un vecteur synthétique colloïdal biorésorbable comprenant au moins une substance protéique et - un vecteur viral comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour une substance protéique correspondant à au moins une substance protéique du vecteur synthétique, ainsi que leur application prophylactique, thérapeutique et diagnostique.

Description

COMPOSITION COMPRENANT UN VECTEUR SYNTHETIQUE COLLOIDiU. BIORESORBABLE ET UN VECTEUR VIRAL
La présente invention concerne le domaine de la vaccination prophylactique et thérapeutique. En particulier, la présente invention a pour objet une composition vaccinale comprenant un vecteur viral permettant d'exprimer des substances protéiques et un vecteur synthétique présentant des substances protéiques.
Historiquement, les antigènes utilisés dans les vaccins sont, soit des microorganismes vivants dont le pouvoir pathogène a été atténué, soit des microorganismes tués. Cependant ces vaccins provoquent souvent des effets secondaires non désirables lors de l'administration et dans de rares cas des complications très graves. Ainsi, depuis de nombreuses années, pour assurer la sécurité vaccinale, on privilégie l'utilisation des fractions purifiées des microorganismes dans les vaccins. Un tel immunogène, administré seul, peut ne pas induire de réponse immune suffisante. Selon l'art antérieur, de nombreuses stratégies vaccinales ont été développées pour augmenter ou orienter la réponse immunitaire induite par les immunogènes purifiés présents dans un vaccin.
La stratégie la plus directe consiste à associer la substance protéique d'intérêt (immunogène) à un adjuvant. Bien que de nombreux types d'adjuvants soient en développement, les hydroxydes d'aluminium (alum) étaient jusqu'à récemment le seul adjuvant autorisé pour une administration à l'homme. Or l'alum est un adjuvant faible pour l'induction des réponses humorales, il n'est pas approprié pour tous les antigènes et ne permet pas d'obtenir des réponses cellulaires. Parmi les adjuvants en développement, les systèmes les plus efficaces pour induire une immunité forte sont les vecteurs synthétiques à base de microparticules et en particulier les microparticules de poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) et de poly(acide lactique) (PLA). De par leur taille, ces particules permettent de cibler des cellules présentatrices d'antigène comme les macrophages ou les cellules dendritiques et améliorent la prise en charge de l' immunogène par le système immunitaire. La substance protéique peut être soit encapsulée dans les microparticules, soit adsorbée à la surface. Les deux approches permettent d'induire à la fois des réponses immunes cellulaires et humorales, même si à l'origine elles étaient surtout utilisées pour obtenir une réponse anticorps. Cependant, l'encapsulation présente deux inconvénients majeurs. Le premier c'est qu'il faut une dégradation partielle ou totale de la microparticule pour que la substance protéique devienne disponible pour le système immunitaire, ainsi la mise en place de l'immunité est retardée. Le second c'est que la substance protéique peut être dénaturée ou dégradée lors de l'encapsulation et ainsi perdre ses propriétés immunogéniques. Pour ces raisons ce procédé ne peut pas être utilisé avec tout type de substance protéique, alors que le procédé par adsorption ne présente pas ces inconvénients. Dans les deux cas, l'obstacle majeur à l'utilisation est leur manque d'efficacité pour générer des réponses cellulaires spécifiques. Si par rapport à l'alum les réponses cellulaires induites sont bien meilleures, elles sont bien en deçà de ce que l'on peut obtenir avec un vecteur viral.
Les vecteurs viraux recombinants permettent de faire exprimer in vivo (chez ranimai ou chez l'homme) la substance protéique d'intérêt. H s'agit d'une stratégie efficace qui permet une forte mobilisation du système immunitaire. Mais l'induction d'une réponse immune durable dans le temps nécessite l'utilisation de vecteurs vivants atténués qui peuvent se répliquer dans l'organisme vacciné. Or, pour des raisons réglementaires liées à la sécurité d'utilisation des vaccins, les nouvelles générations de vaccins utilisent des vecteurs viraux non réplicatifs chez l'homme, entraînant une diminution des réponses immunes spécifiques dans le temps. Ainsi, dans le cas de vaccins prophylactiques, il est encore parfois nécessaire de restimuler l'immunité spécifique pour garder une réponse mémoire efficace. Dans le domaine de l'immunothérapie, la restimulation de l'immunité spécifique reste utile pour maintenir l'intensité des réponses immunes qui permettent de contrôler l'organisme pathogène. Ainsi, l'administration répétée de vecteurs viraux semble nécessaire mais s'accompagne d'un problème majeur qui est celui de l'immunité anti- vecteur. En effet, le vecteur viral est lui- même un immunogène et dès lors qu'il est administré à plusieurs reprises, il y a apparition puis augmentation de rimmunité spécifique du vecteur. Cette réponse immune visant à éliminer le vecteur viral empêche aussi l'expression du gène qu'il véhicule entraînant ainsi une diminution de l'efficacité des réponses immunes contre la substance protéique d'intérêt. De plus, l'immunité anti- vecteur empêche l'utilisation du vecteur concerné pour vacciner contre une autre maladie. Schagen et al. décrivent certaines approches permettant de pallier cette immunité anti- vecteur telles que des modifications au niveau du vecteur ou encore des adaptations au niveau des patients vaccinés (2004, Critical reviews in Oncology/Hematology 50 :51-70). Toutefois la mise en œuvre de ces approches est difficile et ne peut pas être réalisée pour toutes les maladies ou tous les patients. La stratégie utilisant des vecteurs viraux n'est donc pas optimisée.
Une autre voie d'amélioration de la réponse immune induite par vaccination est la stratégie de prime-boost. Elle consiste à augmenter les réponses immunes pécifiques en administrant séquentiellement deux vaccins différents véhiculant une même substance protéique au lieu d'administrer le même vaccin plusieurs fois. Par exemple, il est possible d'utiliser un vecteur viral différent à chaque injection (Negri DR, et al., 2004, Journal of General Virology, 85 :1191- 1201). Cependant cette stratégie n'a que peu de chances de succès car le nombre de vecteurs viraux dont l'emploi est autorisé chez l'homme est très restreint. De plus, l'administration répétée de ces vecteurs viraux se heurte encore une fois au problème de l'immunité anti- vecteur. Afin de contourner ce problème, Otten et al. décrivent l'utilisation d'un prime ADN suivi d'un boost de microparticules de PLGA en surface desquelles des antigènes protéiques sant adsorbés (2003, Journal of Virology, 77 :6087- 6092). Sharpe et al. ont proposé un prime ADN en encapsulant l'ADN dans des microparticules à base de PLGA et un boost par un vecteur viral MVA (2003, Virology, 313 :13-21). O'hagan et al. décrivent l'utilisation d'un prime par de l'ADN adsorbé sur des microparticules de PLGA, suivi d'un boost par un vecteur vaccine (2001, Journal of Virology, 75 :9037-9043). La demande de brevet WO 98/56919A décrit un prime ADN, suivi d'un boost par un poxvirus. L'inconvénient de l'utilisation d'un prime ADN est sa faible efficacité notamment chez les primates et aussi lorsqu'il s'agit de gène peu immunogène comme par exemple le gène tat du VIH- I. La demande de brevet WO 98/56919A décrit également l'utilisation d'un prime par des VLP (« virus-like particles »), suivi d'un boost par un poxvirus. Les VLP sont des particules virales défectives qui n'incorporent pas le génome viral et qui ne peuvent pas se répliquer. Elles sont souvent formées par autoassemblage des protéines structurales d'un virus ou d'un rétrotransposon (élément endogène semblable à un rétrovirus) telles que le précurseur Pr55 Gag du HIV- 1 ou les protéines Ll et L2 du HPV- 16 (papillomavirus humain). En fonction des protéines virales exprimées, la structure du VLP peut se rapprocher plus ou moins de celle du virion natif, de sorte que les VPL sont comparables à un virus. L'inconvénient de ces VLP est qu'elles sont issues de la biotechnologie et que leur fabrication selon les normes réglementaires est très difficile.
Les Demanderesses ont maintenant mis en évidence, contre tout attente, que l'association particulière d'un vecteur synthétique colloïdal biorésorbable comprenant des substances protéiques et d'un vecteur viral comprenant les séquences nucléotidiques codant pour les substances protéiques correspondantes, permet d'augmenter l'efficacité de la vaccination liée à l'utilisation d'une substance protéique, tout en diminuant l'immunité antivecteur.
Ainsi un premier objet de l'invention consiste en une composition pharmaceutique comprenant ou consistant en :
- un vecteur synthétique colloïdal biorésorbable comprenant au moins une substance protéique,
- un vecteur viral comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour une substance protéique correspondant à au moins une substance protéique du vecteur synthétique
- éventuellement en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation de ladite composition pour la préparation d'un médicament, de préférence un vaccin. Elle peut également être utilisée pour le diagnostic in vitro d'états pathologiques relatifs aux substances protéiques de la composition de l'invention.
La présente invention propose donc une nouvelle composition comprenant un vecteur synthétique colloïdal biorésorbable présentant au moins une substance protéique.
On entend par composé biorésorbable un composé qui n'est pas toxique, c'est-à- dire dont l'administration dans l'organisme ne provoque pas de modification physiologique ou métabolique létale, invalidante ou gênante dans la vie quotidienne, et qui peut être éliminé par les voies naturelles de l'organisme après administration. Les termes colloïdes et colloïdal(aux) définissent toute dispersion d'une substance (phase dispersée) au sein d'une phase continue aqueuse dont au moins une des trois dimension est inférieure ou égale à lOμm et préférentiellement inférieure ou égale à lμm.
Une phase continue aqueuse est une phase dont la composition est majoritairement de l'eau, comme par exemple un tampon ou un mélange eau/solvant organique miscible à l'eau. Bien entendu, une phase continue aqueuse appropriée aux fins de l'invention est une phase non toxique.
La phase dispersée peut être un liquide insoluble dans la phase continue comme par exemple une huile ou un mélange d'huiles, ou bien des matières grasses organiques, ou encore être un solide de nature polymère ou minérale. La phase dispersée est toujours biorésorbable.
Des exemples de phase dispersée comprennent l'huile d'olive, l'huile de tournesol, l'huile d'arachide, l'huile de colza, ou leurs mélanges ; des triglycérides ; les polymères synthétiques tels que les polymères d'hydroxyacide comme par exemple l'acide lactique, l'acide glycolique, l'aide hydroxybutyroique, ou les composés issus de la caprolactone ; des polypeptides comme les composés issus de la polymérisation du caprolactame ; les polymères naturels tels que, à titre d'exemple, les polysaccharides comme l'acide hyaluronique, le chitosane, le dextrane.
Des exemples de tels colloïdes biorésorbables sont donnés dans Benita S. et Levy M. Y., 1993, Journal of Pharmaceutical Sciences, 82(11) : 1069- 1079 (émulsions liquide/liquide), Trotta M., et al., 2003, International Journal of Pharmeaceutics, 257 : 153- 160 (émulsions lipide solide/liquide) et Jiang W., et al., 2005, Biodégradable poly(lactic-co- glycolic) acid microparticles for injectable delivery of vaccine antigens Advanced Drug Delivery Reviews, 57 : 391-410.
La forme du vecteur synthétique colloïdal est donnée par la phase dispersée qui peut être sphérique ou non, homogène ou constituée d'un empilement de lamelles.
De préférence, le vecteur synthétique de l'invention est de nature sphérique. De préférence encore le vecteur est composé de microsphères. Les termes microsphère et microparticule sont employés indifféremment dans la suite de la description. Par microparticule ou microsphère on entend des particules de taille au plus micronique pour leur permettre d'entrer dans les cellules présentatrices d'antigènes. Par taille au plus micronique, on entend une dimension inférieure ou égale à 999 μm. De préférence, les microparticules ont un diamètre de particule inférieure ou égale à 3 μm. De façon davantage préférée, les particules de l'invention sont de taille submicronique, avec, de préférence, un diamètre compris entre 150 et 900 nm, de préférence encore entre 250 et 700 nm. La taille des particules est facilement déterminée par des techniques connues de l'homme du métier telles que, par exemple, en utilisant la microscopie à balayage électronique, la diffusion quasi- élastique de la lumière, la microscopie électronique à transmission.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les vecteurs synthétiques colloïdaux sont des vecteurs à base de polymère.
A titre d'exemple ce vecteurs synthétique à base de polymère, on peut citer des vecteurs comprenant des microparticules à base de polymères tels que les poly(acides α- hydroxylés), les poly(acides hydroxybutyriques), les polycaprolactones, les polyorthoesters et les polyanhydrides. De préférence, le vecteur synthétique comprend au moins un polymère biorésorbable choisi parmi un poly(acide α-hydroxylé) tel que le poly(acide D- lactique), le poly(acide L lactique) (appelés PLA), le poly(acide glycolique) (appelé PLG), ou bien un mélange de poly(acides α-hydroxylés) tels qu'un mélange de poly(acides D- et L- lactiques), un mélange de poly(acide L- lactique) et de poly(acide glycolique), un mélange de poly(acide D- lactique) et de poly(acide glycolique), ou un mélange de poly(acides D- et L-lactiques) et de poly(acide glycolique). Lorsque le polymère est un mélange de poly(acides α-hydroxylés), la proportion de chaque constituant peut être facilement déterminée par l'homme du métier. Ainsi, par exemple, on peut utiliser un mélange racémique de poly (acides D- et L-lactiques) ou un mélange PLA/PLG à divers pourcentages connus de l'homme du métier. De préférence, le vecteur synthétique colloïdal selon l'invention est préparé à partir d'au moins un polymère choisi parmi les poly(acides α-hydroxylés). De préférence encore, les particules de l'invention sont dénuées d'agent stabilisant et d'agent tensioactif de sorte qu'elles ne sont pas toxiques. Par microparticule toxique, on entend une microparticule comportant au moins un composé susceptible de provoquer des troubles biologiques, tels que des perturbations du métabolisme, dans l'organisme ayant reçu la microparticule. De telles particules non toxiques peuvent être préparées selon le protocole décrit dans la demande de brevet WO2005/027871.
Selon un autre mode de réalisation, le vecteur synthétique colloïdal est préparé à partir d'au moins un polymère naturel tel que ceux cités précédemment.
La composition de l'invention est utile pour stimuler tant une réponse à médiation cellulaire qu'une réponse humorale. Elle est utile tant en prophylactique et thérapeutique qu'en diagnostic.
Ainsi, les substances protéiques appropriées aux fins de l'invention portées par le vecteur synthétique peuvent être toutes substances protéiques contre lesquelles on cherche à déclencher une réponse immunitaire.
Par réponse immunitaire, on entend une réponse à médiation cellulaire, une réponse humorale ou les deux.
Par réponse à médiation cellulaire, on entend une réponse médiée par les lymphocytes T et/ou d'autres leucocytes. Cette réponse se traduit par l'induction d'une activité lytique par les lymphocytes T cytotoxiques et/ou par la production de cytokines par les lymphocytes T CD8+ ou par les cellules T auxiliaires (helper).
Par réponse humorale, on entend une réponse médiée par les molécules anticorps sécrétés par les lymphocytes B.
Par substance protéique, on entend toute substance protéique ayant un rôle d'antigène après addition aux vecteurs appropriés aux fins de l'invention tels que peptides, protéines, fragments de protéine, polyprotéines, glycoprotéines et glycoprotéines, étant entendu que les fragments de protéine ont conservé la structure d'intérêt.
Les antigènes sont des molécules susceptibles d'être reconnues par un anticorps dont ils ont induit la synthèse par une réponse immunitaire et contenant au moins un épitope.
Des exemples de fragments de protéine comprennent par exemple les peptides, les polypeptides et les épitopes.
Les épitopes sont des peptides comprenant entre 3 et 15 et généralement entre 5 et 15 acides aminés, consistant en le fragment peptidique minimal contre lequel est déclanché une réponse immunitaire. Le vecteur synthétique présente les substances protéiques en de multiples copies. Par au moins une substance protéique, on entend au moins plusieurs substances protéiques de même type. Par type de substance protéique, on entend un ensemble de substances protéiques déclanchant la même réponse immunitaire par production des mêmes anticorps (i.e. ayant la même immunité).
Le vecteur synthétique peut donc comprendre :
- soit des substances protéiques de même type et donc constituant des antigènes associé à la même maladie. Ainsi, par exemple, le vecteur synthétique peut comprendre comme substance protéique la protéine p24 sous forme de protéine rative et/ou de protéine mutée et/ou de fragment de protéine, étant entendu que la protéine mutée et le fragment ont conservé leur immunité ;
- soit des substances protéiques de types différents et constituant des antigènes associé à la même maladie. Ainsi, par exemple, le vecteur synthétique peut comprendre plusieurs protéines du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) telles que la protéine Gag, la protéine Gag mutée n'ayant pas la même immunité, la protéine Tat, la protéine Rev, la protéine Nef, la protéine Env ;
- soit des substances protéiques de types différents et constituant des antigènes associé à des maladies différentes. Ainsi, par exemple, le vecteur synthétique peut comprendre au moins un type de protéine du VIH, telles que les protéines p24, Tat, Rev, et au moins un type de protéine du virus de l'hépatite C (VHC) telles que les protéines NS2, NS3, NS4.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le vecteur synthétique comprend des substances protéiques de types différents et constituant des antigènes associés à la même maladie.
Les substances protéiques peuvent être de plusieurs origines telles que d'origine virale, bactérienne ou de pathologie d'origine non infectieuse (comme le cancer ou une maladie métabolique).
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la substance protéique est un antigène d'origine virale. Lorsque la substance protéique est d'origine virale, les virus utilisés sont tous virus pour lesquels on connaît des substances capables d'une réponse immunitaire.
A titre d'exemple, on peut citer, sans aucune limitation, les herpès virus, les virus des hépatites tels que le virus de l'hépatite B (VHB) ou le virus de l'hépatite C (VHC), les papillomas virus (HPV),les virus de l'immunodéficience humaine (VIH), tels que VIH-I et VIH- 2, différentes souches des virus de grippe humaine et de grippe aviaire.
Les séquences nucléiques des virus appropriées aux fins de l'invention, ainsi que les protéines codées par lesdites séquences sont largement connues de l'homme du métier et sont disponibles par exemple dans des bases de données telles que GenBank.
Ainsi, par exemple, le virus VIH a des gènes qui codent pour des protéines structurelles du virus. Le gène gag code pour la protéine qui forme le core du virion, incluant l'antigène p24. Le gène pol code pour les enzymes responsables de la transcription inverse (transcriptase inverse), du clivage (protéase) et de l'intégration (intégrase). Le gène env code pour les glycoprotéines d'enveloppe. Il contient six autres gènes (tat, rev, nef, vif, vpr et vpu (VIH-I) ou vpx (VIH- 2)) qui codent pour des protéines impliquées dans la régulation de l'expression des gènes du virus (protéines de régulation). Le génome du VIH comprend également les LTR 5' et 3' (Long Terminal Repeat) qui comprennent des éléments de régulation impliqués dans l'expression des gènes du virus.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la substance protéique utilisée dans le procédé de l'invention est une protéine du virus VIH. A titre d'exemple d'antigène du virus VIH, on peut citer les protéines de régulation ou la protéine gag ou la glycoprotéine Env, les protéines de régulation préférées étant la protéine Tat, Rev ou Nef.
S 'agissant du VHC, l'extrémité 5' de son génome correspond à une région non traduite adjacente aux gènes qui codent pour les protéines structurales, la protéine core de la nucléocapside, les deux glycoprotéines d'enveloppe, El et E2, et une petite protéine appelée p7. La région non traduite 5' et le gène core sont relativement bien conservés dans fes différents génotypes. Les protéines d'enveloppe El et E2 sont codées par des régions plus variables d'un isolât à un autre. La protéine p7 est une protéine extrêmement hydrophobe qui constituerait un canal ionique. L'extrémité 3' du génome du VHC contient les gènes qui codent pour les protéines non structurales (NS2, NS3, NS4, NS5) et pour une région 3' non codante possédant un domaine bien conservé (Major ME, Feinstone SM, Hepatology, juin 1997, 25(6) : 1527-1538).
La protéine non structurale NS3 du VHC est une protéine de 630 acides aminés qui comprend deux domaines structuraux distincts : un domaine N- terminal, de 81 acides aminés, doté d'une activité protéasique à serine active intervenant dans la maturation de la protéine virale (domaine appelé NS3 protéase), et un domaine C-terminal, de 549 acides aminés, comprenant une activité hélicase associée à une activité NTPasique qui joue un rôle dans la réplication du génome viral (domaine appelé NS3 hélicase). Cette protéine NS3 est relativement bien conservée parmi les différents génotypes du virus, de sorte que cette protéine constitue un antigène « candidat vaccin » de choix.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la substance protéique est un antigène associé aux tumeurs.
En effet, certaines tumeurs expriment des antigènes qui sont potentiellement reconnus par les lymphocytes T CD8+ même s'ils ne sont pas à l'origine d'une réponse immune intense. H s'agit d'antigènes associés aux tumeurs (AAT) ou marqueurs tumoraux (Houghton AN, 1994, J Exp Med 180 :1). En améliorant la présentation des AAT au système immunitaire, il est possible de les rendre plus immunogéniques, ainsi les AAT peuvent servir de base au développement de vaccins anti- cancéreux sous forme de protéine recombinante ou de peptide de synthèse.
Afin de tester les nouvelles stratégies d'immunothérapie qui visent à augmenter la reconnaissance des AAT, Wang et al. ont développé un modèle expérimental chez la souris (1995, Journal of Immunology, 154 :4685-4692). La lignée tumorale CT26.WT, fond génétique BALB/c, a été transduite par le gène lacZ d'Escherichia coli codant pour l'enzyme beta-galactosidase afin de créer la lignée CT26.CL25. Les deux lignées sont létales chez la souris et leur cinétique de croissance sont similaires. Administrée chez la souris, la lignée CT26.CL25 est à l'origine de formation de tumeurs qui peuvent être ralenties voire inhibées en présence d'une réponse immune contre la beta-galactosidase qui constitue un AAT modèle. Les substances protéiques appropriées aux fins de l'invention peuvent être obtenues par les techniques du génie génétique qui comprend les étapes de :
- culture d'un microorganisme ou de cellules eucaryotes transformé(es) à l'aide d'une séquence nucléotidique codant pour la substance protéique d'intérêt et
- récupération de ladite substance protéique produite par ledit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes.
Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. Pour plus de détail la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci- après : Recombinant DNA Technology I, Editors Aies Prokop, Raskesh K Bajpai ; Armais of the New- York Academy of Sciences, Volume 646, 1991.
Les substances protéiques d'intérêt, lorsqu'elles sont de petites tailles, peuvent également être préparées par les synthèses peptidiques classiques bien connues de l'homme du métier.
La substance protéique est associée aux vecteurs colloïdaux selon les techniques connues de l'homme de l'art, telles que l'inclusion ou la liaison à la surface. A titre d'exemple d'inclusion de la substance protéique dans le vecteur synthétique colloïdal, on peut citer l'encapsulation (Tamber H, et al., 2005, Adv Drug Deliv Rev, 57(3) : 357-76.). A titre de liaison de la substance colloïdale au vecteur synthétique colloïdal, on peut citer l'adsorption, comme décrit dans la demande de brevet WO2005/027871, ou le greffage covalent impliquant la formation d'une liaison chimique entre un groupement réactif du vecteur colloïdal et un autre de la substance protéique de façon décrite par exemple dans 'Protein immobilization-Fundamentals and Applications R.F. Taylor Ed, Marcel Dekker inc, New York, 1991.
Selon un mode de réalisation particulier, les substances protéiques sont ajoutées aux vecteurs synthétiques par liaison et de préférence encore par adsorption, comme par exemple en mélangeant les microparticules avec les substances protéiques et en incubant sous agitation, par exemple à température ambiante ou à 370C.
La composition selon l'invention comprend également un vecteur viral. Le vecteur viral comprend au moins une séquence nucléotidique codant pour une substance protéique correspondant à au moins une substance protéique du vecteur synthétique.
Par substance protéique du vecteur viral correspondant à une substance protéique du vecteur synthétique, on entend que la substance protéique du vecteur viral constitue un antigène associé à la même maladie que la substance protéique du vecteur synthétique, qu'elle soit du même type ou de type différent, comme indiqué précédemment. Quand les substances protéiques sont de type différent, il faut qu'elles aient au moins un épitope en commun, comme par exemple les protéines Gag et p24.
Ainsi, le génome du vecteur viral est modifié de façon à insérer une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant pour une ou plusieurs substances protéiques constituant des antigènes de la même maladie ou des maladies différentes. Parmi ces substances protéiques, au moins une correspond à une substance protéique du vecteur synthétique, ces substances protéiques constituant des antigènes associés à la même maladie.
Selon un mode de réalisation préféré, le vecteur viral comprend une séquence nucléotidique codant pour une protéine du VIH.
Outre la ou les séquences nucléotidiques codant pour au moins une substance protéique constituant un antigène associé à la même maladie que la substance protéique du vecteur synthétique, le vecteur viral comprend également les moyens nécessaires à l'expression de ladite substance protéique.
On entend par moyen nécessaire à l'expression d'une substance protéique, tout moyen qui permet d'obtenir la substance protéique, tel que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection.
Les moyens nécessaires à l'expression d'une substance protéique sont liés de façon opérationnelle à la séquence d'acide nucléique codant pour ladite substance. Par «liés de façon opérationnelle », on entend une juxtaposition desdits éléments nécessaires à l'expression et du gène codant pour la substance protéique, lesquels sont en une relation telle que cela leur permet de fonctionner de façon attendue. Par exemple, ils peut exister des bases supplémentaires entre le promoteur et le gène d'intérêt tant que leur relation fonctionnelle est préservée.
Les moyens nécessaires à l'expression de la substance protéique peuvent être des moyens homologues, c'est-à-dire inclus dans le génome du vecteur utilisé, ou bien être hétérologues. Dans ce dernier cas, lesdits moyens sont clones avec la protéine d'intérêt à exprimer.
Des exemples de promoteurs hétérologues comprennent (i) les promoteurs viraux tels que le promoteur SV40 (Virus simien 40), le promoteur du gène de la thimidine-kinase du virus simplex de l'Herpès (TK-HSV- I), le LTR du virus du sarcome de Rous (RSV), le promoteur intermédiaire précoce du cytomégolovirus humain (CMV) et le promoteur majeur tardif adénoviral (MLP), ainsi que (ii) tout promoteur cellulaire qui contrôle la transcription des gènes codant pour des protéines chez des eucaryotes supérieurs, tel que le promoteur du gène de phosphoglycérate-kinase (PGK) constitutif (Adra et al., 1987, Gène, 60 : 65-74), le promoteur des gènes spécifiques du foie alphal-antitrypsine et FIX et le promoteur SM22 spécifique des cellules du muscle lisse (Moessler et al., 1996, Development, 122 : 2415- 2425).
Lesdites séquences contenues dans le vecteur viral peuvent être liées directement entre elles sous le contrôle d'un seul promoteur et/ou d'un seul élément régulateur de l'expression, ou bien elles peuvent être séparées en étant sous la dépendance chacune de promoteurs et/ou régulateurs de l'expression indépendants, identiques ou différents.
A titre de vecteur viral qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer par exemple les vecteurs viraux type adénovirus, pxvirus, baculovirus, herpesvirus, togavirus, rétro virus.
Les adénovirus ont été détectés dans de nombreuses espèces animales. Ils ne s'intègrent pas et sont peu pathogènes. Hs sont capables d'infecter une variété de types cellulaires, les cellules en division et les cellules en repos. Hs possèdent un tropisme naturel pour les épithéliums bronchiques. De plus, ils ont été utilisés en tant que vaccins entériques vivants pendant de nombreuses années avec un excellent profile de sécurité. Enfin, on peut les faire pousser facilement et les purifiées en grande quantité. Ces caractéristiques ont fait que les adénovirus sont particulièrement appropriés pour une utilisation en tant que vecteurs d'expression et notamment en tant vecteurs de thérapie génique à des fins thérapeutiques et vaccinales.
Selon un mode de réalisation préféré, le vecteur de l'invention est un adénovirus.
Des exemples d' adénovirus à utiliser dans la présente invention peuvent être dérivés de toute source d'origine humaine ou animale, en particulier d'origine canine (par exemple CAV- I ou CAV-2 ; référence Genbank CAVlGENOM et CAV77082, respectivement), d'origina avienne (référence Genbank AAVEDSDNA), d'origine bovine (telle que BAV3, Seshidhar Reddy et al., 1998, J. Viral., 72 : 1394- 1402), d'origine ovine, féline, porcine, d'origine simienne, ou bien d'un de leurs hybrides. Tout sérotype peut être utilisé. Toutefois, les adénovirus d'origine humaine sont préférés et en particulier l' adénovirus 5 (Ad5).
De façon générale, les virus cités sont disponibles dans les collections ATCC et ont fait l'objet de nombreuses publications décrivant leur séquence, leur organisation et leur biologie, ce qui permet à l'homme du métier de les appliquer facilement. Par exemple, la séquence de l' adénovirus type 5 est décrite dans la base de donnée Genbank (M73260 et M29978) et est incorporée ici par référence.
Le génome des adénovirus est constitué d'une molécule d'ADN linéaire double brin d'environ 36 kb portant plus d'environ 30 gènes nécessaires pour terminer le cycle viral. H y a 4 gènes précoces répartis dans le génome de l'adénovirus (El à E4). Les régions El, E2 et E4 sont essentielles pour la réplication virale. La région E3 est considérée comme une région non essentielle sur la base de l'observation que les virus mutants apparaissant naturellement ou les virus hybrides ayant perdu cette région E3 continuent à se répliquer comme les virus de type sauvage dans les cellules cultivées (Kelly et Lewis, 1973, J. Virol., 12 :643-652). Les gènes tardifs (Ll à L5) codent en majorité pour les protéines structurales constituant la capside virale. Hs chevauchent au moins en partie les premiers motifs de transcription et sont transcrits à partir d'un promoteur unique (MLP pour «Major Late Promoter »). De plus, le génome adénoviral porte aux deux extrémités des régions à action en cis essentielles pour la réplication d'ADN, respectivement les motifs de répétition inversés 5' et 3' (ITRs pour « Inverted Terminal Repeats ») et une séquence d'empaquetage. Les adénovirus actuellement utilisés dans les protocoles de thérapie génique sont dénués de la majorité de la région El, ce qui rend les virus déficients au niveau de leur réplication pour éviter leur dissémination dans l'environnement et dans l'organisme hôte. En outre, k plupart des adénovirus sont également dénués de la région E3 afin d'accroître leur capacité de clonage. La faisabilité du transfert de gène en utilisant ces vecteurs a été démontrée dans une variété de tissus in vivo (voir par exemple Yei et al., 1994, Hum. Gène Ther., 5 : 731-744 ; Dai et al., 1995, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 92: 1401-1405 ; US6,099,831 ; et US6,013,638).
Un autre vecteur d'expression particulièrement approprié aux fins de l'invention est un poxvirus, lequel constitue un autre mode de réalisation de l'invention.
Les poxvirus constituent un groupe de virus complexe enveloppés, se distinguant principalement par leur morphologie inhabituelle, leur grand génome d'ADN et leur site cytoplasmique de réplication. Le génome de plusieurs éléments des poxviridae, comprenant la souche virale de la vaccine de Copenhagen (VV) (Goebel et al., 1990, Viral. 179 : 247- 266 et 517-563) et la souche du virus de la vaccine modifié d'Ankara (MVA) (Antoine et al., 1998, Viral., 244 : 635-396), a été cartographie et séquence. La souche VV possède un génome d'ADN double brin d'environ 192 kb codant pour environ 200 protéines dont approximativement 100 sont impliquées dans l'assemblage du virus. La souche MVA est une souche du virus de la vaccine hautement atténuée, générée par plus de 500 passages en série de la souche d'Ankara du virus de la vaccine (CVA) sur des fibroblastes d'embryons de poulet (Mayr et al., 1975, Infection, 3 : 6-16). Le virus MVA a été déposé devant la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro 1-721. La détermination de la séquence complète du génome du MVA et la comparaison avec celui du W permet l'identification précise des altérations qui sont apparues dans le génome viral et la définition de sept délétions (I à Vu) et de nombreuses mutations conduisant à des cadres de lecture ouverts fragmentés (Antoine et al., 1998, Virology, 244 : 365-396).
D'autres exemples de poxvirus appropriés aux fins de l'invention comprennent le pox du canari, le pox de volaille, le pox de vache, l'entomopox, le pox de singe, le pox de porc et le pox de pingouin. Le poxvirus se trouve sous deux formes morphologiquement distinctes, appelées virus mature intracellulaire (IMV) et virus extracellulaire enveloppé (EEV).
De préférence, le poxvirus utilisé aux fins de l'invention est un Modified Vaccinia Virus Ankara.
Les méthodes de suppression et d'insertion de séquences d'ADN dans des vecteurs d'expression sont largement connues de l'homme du métier et consistent notamment en des étapes de digestion enzymatique et ligature. De préférence la séquence nucléotidique insérée dans le vecteur viral code pour une protéine du virus du VIH.
Les compositions à base de vecteurs selon l'invention sont particulièrement efficaces pour l'inhibition, la prévention et le traitement d'une maladie dont la substance protéique de la composition constitue un antigène, telle qu'une infection par un virus. Elles sont donc particulièrement utiles pour la préparation d'un médicament, et en particulier d'un vaccin, qu'il soit thérapeutique ou prophylactique.
Ainsi, l'invention concerne également une méthode de traitement prophylactique ou thérapeutique, en particulier vaccination, comprenant l'administration, à un patient, d'une dose efficace de la composition selon l'invention.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont appropriées pour l'administration orale, sublinguale, sous -cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, vaginale, intraoculaire, intra- auriculaire, ledit principe actif pouvant être administré sous forme unitaire d'administration.
Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales injectables, des timbres transdermiques (« patch »), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra- auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, telles que rectale ou vaginale, transdermique, sous -cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres.
Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes usuelles des domaines considérés. Lesdites formes unitaires sont dosées pour permettre une administration journalière de 0,001 à 10 mg de principe actif par kg de poids corporel, selon la forme galénique.
H peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse du patient.
La quantité et la nature de l'excipient peuvent être facilement déterminées par l'homme du métier. Elles sont choisies selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités.
La composition selon l'invention peut être contenus dans un kit pharmaceutique. L'administration de la composition selon l'invention peut être simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
Par administration simultanée, on entend une administration au même moment et au même endroit de la composition.
Par administration échelonnée, on entend l'administration du vecteur viral ou du vecteur synthétique à des temps différés. Le délai entre chaque administration peut s'étendre de quelques minutes à plusieurs années, de préférence de plusieurs semaines à plusieurs mois et de façon préférée elle peut être de 3 ou 4 semaines.
Par administration séparée, on entend l' administration du vecteur viral et du vecteur synthétique à des endroits corporels différents. Le vecteur viral et le vecteur synthétique peuvent être dans le même excipient ou de préférence dans des excipients différents appropriés.
De préférence, la composition selon l'invention est administrée de façon échelonnée. De préférence encore, le vecteur synthétique est administré avant le vecteur viral.
Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, la composition de l'invention comprend : i) un constituant prime consistant en le vecteur synthétique colloïdal biorésorbable comprenant au moins une substance protéique et ii) un constituant boost consistant en le vecteur viral comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour une substance protéique correspondant à au moins une substance protéique du vecteur synthétique.
Outre une application thérapeutique et prophylactique, l'invention a également une application diagnostique. Ainsi, l'invention concerne également l'utilisation de la composition de l'invention pour le diagnostic in vitro de l'état pathologique dont la ou les substances protéiques du vecteur synthétique et du vecteur synthétique constituent les antigènes, et en particulier d'une infection virale ou un cancer.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés uniquement à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu'à l'aide des figures 1 à 20 annexées, sur lesquelles :
La figure 1 représente les réponses CTL lors de l'expérience d'immunisation N0I avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant un vecteur synthétique à base de microparticules de poly(acide D ,L- lactique) associées à la protéine p24 (appelé ci- après PLA/p24) et d'un vecteur viral MVA comprenant la séquence gag (appelé ci- après virus MVA gag).
La figure 2 représente les réponses ELISPOT IFN- γ spécifiques du peptide Gag AMQ lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag.
La figure 3 représente les réponses ELISPOT IFN- γ spécifiques de la protéine p24 lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag. La figure 4 représente les réponses ELISPOT IL-4 spécifiques de la protéine p24 lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag. La figure 5 représente la sécrétion de la cytokine GM-CSF spécifique de la protéine p24 lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag.
La figure 6 représente la sécrétion de la cytokine IL- 5 spécifique de la protéine p24 lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag. La figure 7 représente la sécrétion de la cytokine IL- 2 spécifique de la protéine p24 lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag. La figure 8 représente la cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine p24 lors des 3 expériences d'immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral MVA gag.
La figure 9 représente les réponses CTL lors de l'expérience d'immunisation N°2 avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral Adénovirus Gag.
La figure 10 représente les réponses ELISPOT IFN-γ spécifiques du peptide Gag AMQ après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral Adénovirus Gag. La figure 11 représente la sécrétion spécifique de la protéine p24 des cytokines IL- 2, IL-4, IL-IO après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral Adénovirus Gag.
La figure 12 représente la cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine p24 (12A) ou de l'adénovirus (12B) après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions selon l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA/p24 et le vecteur viral Adénovirus Gag.
La figure 13 compare les réponses ELISPOT IFN- γ spécifiques du peptide Gag AMQ après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions comprenant PLA/p24 et MVA gag ou comprenant Alum/p24 et MVA gag. La figure 14 compare les réponses ELISPOT IL- 4 spécifiques de la protéine p24 après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions comprenant PLA/p24 et MVA gag ou comprenant Alum/p24 et MVA gag.
La figure 15 compare les cinétiques d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine p24 après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions comprenant PLA/p24 et MVA gag ou comprenant Alum/p24 et MVA gag. La figure 16 compare les cinétiques d'apparition des réponses humorales spécifiques du virus MVA après immunisation avec différentes compositions vaccinales dont les compositions comprenant PLA/p24 et MVA gag ou comprenant Alum/p24 et MVA gag. La figure 17 représente les réponses ELISPOT IFN- γ spécifiques du peptide beta-gal TPH après immunisation de souris avec différentes compositions vaccinales dont les compositions de l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA- beta-gal et le vecteur viral MVA beta- gal.
La figure 18 compare les cinétiques d'apparition des réponses humorales spécifiques de la beta-gal après immunisation de souris avec différentes compositions vaccinales dont les compositions de l'invention comprenant le vecteur synthétique PLA- beta-gal et le vecteur viral MVA beta-gal.
La figure 19 représente les réponses ELISPOT IFN-γ spécifiques du peptide p24 AMQ après immunisation de souris avec différentes compositions vaccinales dont les compositions de l'invention comprenant le vecteur synthétique CPL- p24 et le vecteur viral MVA gag. La figure 20 compare les cinétiques d'apparition des réponses humorales spécifiques du peptide p24 AMQ après immunisation de souris avec différentes compositions vaccinales dont les compositions de l'invention comprenant le vecteur synthétique CPL- p24 et le vecteur viral MVA gag.
Exemple 1 : Immunisation de souris avec une composition vaccinale selon l'invention
La composition vaccinale utilisée comprend un vecteur synthétique à base de microparticules de poly(acide D ,L- lactique) associées à la protéine p24 (appelé ci- après PLA/p24) et d'un vecteur viral MVA comprenant la séquence gag de SEQ ID N0I (appelé ci- après virus MVA gag) 1. Modèle animal
Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H- 2Kd) femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.
2. Immunogènes administrés
Dans cette série d'expériences on a utilisé les immunogènes suivants seuls ou en combinaison :
- les microparticules PLA/p24 préparées selon le protocole déplacement de solvant et d'adsorption de la demande de brevet WO2005/027871.
- le virus MVA gag (Modified Vaccinia Virus Ankara, virus de la vaccine atténué, souche Ankara) qui est recombinant pour le gène gag du virus VIH- 1, codant pour la protéine p24. Le virus recombinant a été construit à Transgene à partir de la souche sauvage (MVATGN33) telle que décrite dans Antoine G., et al., 1998,«The complète genomic séquence of the modified vaccinia Ankara strain : comparison with other orthopoxviruses», Virology, 244 : 365-396. Ce virus recombinant a ensuite été produit et purifié comme suit : le MVA est répliqué sur les cellules embryonnaires de poulet. Après 48 à 72 h d'infection, les cellules sont récoltées, puis lysées par congélation/décongélation et par sonication. Le lysat est purifié/concentré par 2 coussins de saccharose suivi éventuellement de 2 gradients de saccharose.
Pour des précisions, on pourra se rapporter au livre « Current Protocols in Molecular Biology », Vol 2, chapitre 16.16 éditeurs Ausubel FM, Brent R, Kigston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, John Wiley & Sons, inc, New York. 3 volumes.
- le virus MVA sauvage MVATGN33. Il s'agit d'un témoin négatif qui sert à mesurer si le vecteur viral induit une réponse immune non spécifique lors des immunisations.
- l'ADN gag. Le gène gag (de SEQ ID N0I) a été clone dans le plasmide d'expression eucaryote phCMV (contient le promoteur intermédiaire/précoce du cytomégalovirus humain et des signaux d'épissage et de polyadénylation issus du gène beta-globine du lapin (J K Yee, et al, 1994, Proc Natl Acad Sci U S A., 91(20): 9564-9568). Les préparations d'ADN sans endotoxines et en grande quantité ont été réalisées avec le kit de Gigaprep endotoxine-free de Macherey-Nagel. L'ADN sert de contrôle positif, car il est connu que chez la souris l'administration par voie intramusculaire d'ADN nu permet d'induire une bonne réponse cytotoxique (CTL).
3. Immunisations
Expérience 1
35 souris ont reçu 2 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci- dessus à 0 et 3 semaines. Les compositions vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 1 ci- dessous. Toutes les injections ont été réalisées par voie sous -cutanée sauf pour l'ADN qui a été administré par voie intramusculaire.
Tableau 1
Figure imgf000023_0001
Pfu = plaque forming units, c'est l'unité de mesure de la dose de MVA utilisée. Le titre viral est exprimé en pfu selon la technique de dosage du stock viral utilisée, comme indiqué dans Current Protocols in Molecular Biology, supra.
Les animaux ont été sacrifiés 6 semaines après la première injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
Expérience 2
Dans cette expérience, on a augmenté le nombre d'injections.
30 souris ont reçu 2 ou 3 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci- dessus à 0, 3 et 6 semaines. Les compositions vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 2 ci- dessous. Toutes les injections ont été réalisées par voie sous -cutanée. Tableau 2
Figure imgf000024_0001
Les animaux ont été sacrifiés 3 semaines après la dernière injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
Expérience 3
30 souris ont reçu 2 ou 3 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci- dessus à O, 3 et 6 semaines. Les compositions vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 3 ci- dessous. Toutes les injections ont été réalisées par voie sous- cutanée.
Tableau 3
Figure imgf000024_0002
Les animaux ont été sacrifiés 3 semaines après la dernière injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques. 4. Analyses immunologiques On a recherché la réponse humorale et la réponse cellulaire comme suit :
- Réponse humorale : on a effectué un prélèvement de sang sur les souris avant leur sacrifice. La présence des anticorps anti-p24 a été déterminée par ELISA. La protéine p24 (produite avec Escherichia coli et purifiée par chromatographie d'affinité métal- chélate selon Cheynet V. et al., 1993, Protein Expr Purif, 4(5) : 367-72) a été utilisée en capture et les anticorps spécifiques présents dans le sérum ont été révélés par un anticorps polyclonal anti- souris à titre d'anticorps de détection qui est un anticorps de chèvre anti-IgG de souris AffiniPure conjugué à la peroxydase de raifort (H+L, Jackson Immunoresearch, Cat no 115-035-062). Le titre est l'inverse de la dilution pour laquelle on obtient une absorbance de 0,1 unité DO avec le protocole ELISA utilisé.
- Réponse cellulaire : après sacrifice des souris, les rates ont été prélevées de façon stérile pour préparer une suspension cellulaire. Les analyses suivantes ont été pratiquées sur les suspensions cellulaires obtenues, chaque souris ayant été analysée de manière individuelle ou en pool lorsque la quantité de cellules obtenues n'était pas suffisante pour analyse individuelle.
(i) Test CTL : La suspension cellulaire a été mise en culture en présence d'un peptide de la protéine p24 de 9- mer (AMQMLKEΗ - SEQ ID N°2) qui correspond à un épitope CTL H-2KJ- restreint immunodominant, et d'IL-2. Cinq jours plus tard, la population effectrice a été restimulée par des cellules naïves irradiées, chargées avec le peptide. La population cytotoxique effectrice a été récoltée au bout du 7ème jour et l'activité CTL a été mesurée en utilisant comme cibles les cellules P815 (ATCC TIB- 64) marquées au 51Cr.
(U) ELISPOT : L'ELISPOT permet de déterminer le nombre de cellules sécrétant une cytokine donnée en réponse à un stimulus spécifique. Nous nous sommes intéressés aux cytokines IFN- γ de type ThI et IL-4 de type Th2. Les suspensions cellulaires obtenues à partir des rates ont été restimulées in vitro par le peptide AMQMLKEΗ pendant 2Oh pour analyser les réponses de type CD8. Les suspensions cellulaires obtenues à partir des rates ont été restimulées in vitro par la protéine p24 (sans endotoxines) pendant 42h pour analyser les réponses de type CD4. Les plaques d'ELISPOT 96 puits avec des membranes de PVDF (Multiscreen IP, Millipore) ont été coatées par un anticorps anti-IFN-? ou anti-IL-4. Pendant la restimulation, les suspensions de splénocytes ont été incubées dans ces plaques de manière à capturer les cytokines sécrétées par chaque cellule. Les spots correspondant à chaque cellule sécrétant la cytokine d'intérêt ont été révélés par un anticorps de détection biotinylé spécifique de la cytokine d'intérêt.
(ϋi) Sécrétion des cytokines : Les splénocytes ont été stimulées pendant 3 jours dans du milieu de culture complet (milieu de culture alpha minimal essential médium φcMEM) contenant 10% sérum de veau fœtal, 10 mM HEPES, 5 x 10 5 M β-mercaptoéthanol, 4 mM L-glutamine, 80 U/ml pénicilline, 80 mg/ml streptomycine, acides aminés non- essentiels Ix (cat no. 11140-035), sodium pyruvate Ix (cat no. 11360-039) (constituants de Invitrogen, Cergy Pontoise, France)) en présence ou non de l'antigène d'intérêt p24, puis les cytokines sécrétées dans le surnageant de culture ont été dosées par le kit mouse FlowCytomix Thl/Th2 lOplex de Bender Medsystems (Cat no. BMS720FF).
5. Résultats
5.1. La réponse CTL
Le tableau 4 ci- après récapitule les résultats obtenus lors des 3 expériences successives :
Tableau 4
Figure imgf000027_0001
La Figure 1 représente les réponses CTL obtenues lors de l'expérience d'immunisation n°l. Chaque groupe est constitué de 5 souris, les rates ont été poolées avant la réalisation du dosage CTL. La stimulation non spécifique (sans peptide) dans tous les groupes étant de 0, elle n'est pas représentée. De même, les réponses CTL obtenues avec les compositions A, D et E étant de 0, elles ne sont pas représentées. L'abscisse correspond au ratio cellules effectrices (CTL) sur cellules cibles (à lyser). L'axe des ordonnées correspond au pourcentage de lyse moyenne.
Les réponses CTL induites sont de faible intensité avec tous les immunogènes utilisés (MVA, PLA ou combinaisons), à l'exception du groupe G de l'expérience 1 qui a reçu de l'ADN en dernier (Figure 1). L'induction de CTL dans les groupes ADN est normal : l'ADN est optimisé dans ce but, c'est un témoin positif chez la souris mais qui ne marche pas aussi bien chez les primates.
Même si les réponses restent faibles, les groupes contenant à la fois du MVA et du PLA donnent de meilleures réponses CTL que les groupes ayant reçu du MVA seul ou du PLA seul.
Lorsque 2 injections ont été réalisées, dans les groupes ayant reçu 2 fois du MVA ou 2 fois des PLA, il n'y a pas de CTL détecté lors du sacrifice retenu (A et D), alors que dans les groupes ayant reçu à la fois PLA et MVA (B et C) il y a une faible fréquence de CTL. L'ordre d'injection joue aussi un rôle : PLA + MVA (C) donne de meilleurs résultats que MVA + PLA (B).
Lorsque 3 injections ont été réalisées, la fréquence d'induction des réponses reste encore faible. Les réponses CTL ne sont pas améliorées par rapport à deux injections. La stratégie vaccinale utilisant le MVA nécessite 3 injections pour donner les mêmes résultats que les combinaisons de PLA et de MVA.
5.2. La réponse ELISPOT IFN-J contre le peptide Gag AMQ
La figure 2 représente les réponses ELISPOT IFN-γ spécifiques du peptide Gag AMQ. Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été inclus dans l'analyse. Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN-γ de manière spécifique en réponse à une stimulation de 18h par le peptide Gag AMQ sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5, 10 ou 15 selon les groupes).
L'interféron gamma ou de type II est aussi appelé interféron immunitaire car il est sécrété par les lymphocytes T de type CD4+, par les lymphocytes T de type CD8+ et les cellules NK. H protège les cellules contre les infections virales. H stimule l'activité phagocytaire des macrophages, leur permettant de tuer les cellules tumorales. H stimule la maturation des lymphocytes T et B et augmente la production d'anticorps. H augmente l'expression des molécules HLA de classe I et II par les macrophages. H s'agit d'une cytokine de type ThI. H est possible de classer les compositions vaccinales en plusieurs catégories en fonction des réponses ELISPOT IFN- γ obtenues. Les meilleures réponses sont induites par les compositions PLA + MVA (C) et MVA + MVA (A). Dans ces cas, la troisième injection n'apporte soit aucune amélioration (composition MVA + MVA) (A'), soit peut faire diminuer la réponse observée (composition PLA + MVA) (C). Les compositions MVA + PLA (B et B') et ADN + PLA (F) permettent de générer des réponses d'intensité intermédiaires, alors que la stratégie utilisant uniquement des PLA (D et D') n'induit que des réponses faibles.
Ainsi, nous avons pu montrer que la composition vaccinale PLA + MVA (C) était au moins aussi bonne, sinon meilleure que la combinaison MVA + MVA (A) pour induire une sécrétion d'IFN-γ spécifique du peptide AMQ.
5.3. La réponse ELISPOT IFN-y contre la protéine p24
La Figure 3 représente les réponses ELISPOT IFN-γ spécifiques de la protéine p24. Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été inclus dans l'analyse. Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN-γ de manière spécifique en réponse à une stimulation de 42h par la protéine p24 sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5, 10 ou 15 selon les groupes).
Encore une fois, il est possible de classer les compositions vaccinales en plusieurs catégories en fonction des réponses ELISPOT IFN- γ obtenues. Les meilleures réponses sont induites par les compositions PLA + MVA (C et C) et ADN + PLA (F). La troisième injection fait encore diminuer la réponse observée dans le cas de la composition PLA + MVA (C). Les compositions MVA + PLA (B et B') et MVA+ MVA (A et A') permettent de générer des réponses d'intensité intermédiaires, alors que la stratégie utilisant uniquement des PLA (D et D') n'induit que des réponses faibles.
Ainsi, nous avons pu montrer que la composition vaccinale PLA + MVA était le meilleur choix pour induire une sécrétion d'IFN-γ spécifique de la protéine p24.
5.4. La réponse ELISPOT IL-4 contre la protéine p24 La figure 4 représente les réponses ELISPOT IL- 4 spécifiques de la protéine p24. Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été inclus dans l'analyse. Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IL-4 de manière spécifique en réponse à une stimulation de 42h par la protéine p24 sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5, 10 ou 15 selon les groupes).
Encore une fois, il est possible de dasser les compositions vaccinales en plusieurs catégories en fonction des réponses ELISPOT IL- 4 obtenues. La meilleure réponse est induite par la composition PLA + MVA (C et C). La troisième injection semble encore une fois non nécessaire car elle n'améliore que de très peu la réponse induite par la composition PLA + MVA (C). Les compositions MVA + PLA (B et B') et ADN + PLA (F) et PLA + PLA (D et D') permettent de générer des réponses d'intensité intermédiaires, alors que la stratégie utilisant uniquement des MVA n'induit que des réponses faibles (A et A').
Ainsi, nous avons pu montrer que la composition vaccinale PLA + MVA était le meilleur choix pour induire une sécrétion d'IL-4 spécifique de la protéine p24.
5.5. Sécrétion des cytokines
L'étude de la sécrétion des cytokines permet de tracer un tableau de l'état d'activation immunitaire de l'animal ayant reçu la composition vaccinale. On peut répartir les cytokines en quatre groupes en fonction de leurs propriétés :
1) Les médiateurs de l'immunité naturelle (IFN- γ, IL-I, IL- 6, IL- 8 ...)
2) Les activateurs de l'activation, croissance et différenciation lymphocytaire (IL-2, IL-4, IL- 5, IL-6, IL-10, TGF-β)
3) Les activateurs non spécifiques de l'inflammation (IFN- γ, IL-5, IL- 8)
4) Les activateurs et différenciateurs de leucocytes immatures (IL- 3, GM-CSF)
Grâce à l'utilisation d'un kit multiplex, nous avons pu doser la sécrétion de 10 cytokines différentes dans les surnageants de culture des splénocytes obtenues des animaux sacrifiés. Ces cytokines sont : IFN- γ, TNF-α, GM-CSF, IL-4, IL- 17, IL- la, IL-2, IL-5 , IL-6, IL- 10.
Aucune des compositions vaccinales testées n'induit une sécrétion significative des cytokines IL- la et IL- 17.
Pour tous les autres cytokines testés nous avons pu mettre en évidence des différences parmi les groupes.
La figure 5 représente la sécrétion de la cytokine GM-CSF spécifique de la protéine p24. Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été inclus dans l'analyse, lorsque la quantité de cellules disponibles le permettait. Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses. Les cellules obtenues à partir des souris d'un même groupe ont été poolées avant la mise en culture pour le test de sécrétion. L'axe des ordonnées représente la concentration de GM- CSF (en pg/ml) sécrétée dans le milieu de culture en réponse à une stimulation de 3 jours par la protéine p24.
La cytokine GM-CSF (granulocyte-macrohage colony stimulating factor) est un puissant immunostimulateur qui permet d'activer les fonctions immunitaires telles que l'adhésion, la phagocytose, etc. des macrophages, des neutrophiles et des éosinophiles. Comme nous le pouvons voir sur la figure 5, nous avons montré une importante sécrétion de GM-CSF dans les groupes contenant du PLA en association ou non avec le MVA (sauf lorsque le nombre d'injection est augmenté à 3 pour les PLA) alors que les groupes immunisés exclusivement avec du MVA n'en sécrètent pas ou peu.
La figure 6 représente la sécrétion de la cytokine IL- 5 spécifique de la protéine p24. Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été inclus dans l'analyse, lorsque la quantité de cellules disponibles le permettait. Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses. Les cellules obtenues à partir des souris d'un même groupe ont été poolées avant la mise en culture pour le test de sécrétion. L'axe des ordonnées représente la concentration d'IL-5 (en pg/ml) sécrétée dans le milieu de culture en réponse à une stimulation de 3 jours par la protéine p24.
Pour tous les cytokines de type Th2 testées comme IL- 4, IL- 5, IL- 6 et IL- IO, les profils de sécrétion sont très similaires à celui présenté en figure 6 qui correspond à la sécrétion de l'IL-5. Aucune sécrétion n'est observée dans les groupes ayant reçu du MVA sauvage (c'est normal, c'est un témoin négatif). De faibles concentrations sont obtenues pour les groupes MVA gag, 2 ou 3 injections, et les groupes associant l'ADN et le PLA. Des concentrations moyennes sont obtenues pour les groupes de souris immunisées par les compositions PLA et MVA. Les concentrations les plus fortes sont obtenues dans les groupes ayant reçu uniquement du PLA. La sécrétion de cytokines est donc orientée plus ou moins vers les cytokines de type Th2 en fonction de la composition vaccinale : on observe une réponse majoritairement de type Th2 pour les groupes immunisés uniquement avec les PLA (la sécrétion d' IFN- gamma de d'IL-2, cytokines de type ThI est faible (figure 7), on observe une réponse non polarisée, à la fois ThI et Th2 pour les groupes immunisés avec les combinaisons PLA et MVA. pour les groupes MVA, la sécrétion des cytokines de type Th2 est faible.
Notons aussi que les 4 cytokines Th2 dosées ne sont pas sécrétées à la même concentration. C'est l'IL-4 et l'IL- 10 qui sont sécrétées à des taux élevés. Le tableau suivant récapitule les concentrations moyennes des différentes cytokines observées dans les groupes ayant reçu les compositions PLA et MVA. Tableau 5
Figure imgf000032_0001
L'interleukine 4, IL- 4, est sécrétée par les lymphocytes T de type CD4+. Elle augmente la croissance et la différenciation des lymphocytes B préalablement activés, favorise la production d'IgE qui joue un rôle important dans les réactions d'hypersensibilité immédiate. Elle active aussi les macrophages.
L'interleukine 5, IL-5, stimule la croissance, la différenciation et l'activité des éosinophiles qui jouent un rôle important dans la lutte contre les infections parasitaires. L'augmentation du nombre des éosinophiles n'est pas seulement un signe d'atteinte parasitaire mais aussi un moyen de défense. L'IL-5 induit la prolifération des lymphocytes B et leur sécrétion d'immunoglobulines. Elle active les lymphocytes T cytotoxiques. Son utilisation dans le traitement de certaines maladies parasitaires peut être envisagée.
L'interleukine 6, IL- 6, stimule la croissance et la différenciation des lymphocytes B et augmente la génération des plaquettes. Elle provoque, par activation des hépatocytes, la sécrétion des protéines de rinflammation comme le fibrinogène et la protéine C réactive. Elle a un rôle pro- inflammatoire. Elle a un effet cytotoxique vis-à-vis de certaines tumeurs.
La figure 7 représente la sécrétion de la cytokine IL- 2 spécifique de la protéine p24. Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été inclus dans l'analyse, lorsque la quantité de cellules disponibles le permettait. Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses. Les cellules obtenues à partir des souris d'un même groupe ont été poolées avant la mise en culture pour le test de sécrétion. L'axe des ordonnées représente la concentration d'IL-2 (en pg/ml) sécrétée dans le milieu de culture en réponse à une stimulation de 3 jours par la protéine p24.
LIL- 2 est un facteur de croissance pour les lymphocytes T. Elle active leur transformation en lymphocytes T cytotoxiques de type CD8+ qui sécrètent l'interféron α, lequel stimule les macrophages à libérer le TNFα et le TGFα (transforming growth factor α). LIL- 2 stimule la croissance et l'activité cytolytique des cellules NK (natural killer). Elle stimule la maturation des lymphocytes B et la synthèse d'anticorps. C'est une cytokine de type ThI.
H est possible de classer les compositions vaccinales en plusieurs catégories en fonction de la sécrétion d'IL-2, spécifique de la protéine p24. La meilleure réponse est induite par la combinaison MVA + PLA (B), puis PLA + MVA (C), PLA seul (D) et MVA seul (A).
5.6. La réponse humorale spécifique de la protéine p24
La figure 8 représente une cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine p24. Tous les animaux immunisés lors des 3 expériences successives ont été inclus dans l'analyse. Pour chaque composition vaccinale, le nombre d'animaux ayant reçu cette composition est indiquée entre parenthèses. L'axe des ordonnées représente le titre en IgCr anti-p24 mesuré par ELISA de capture p24 ; l'échelle de cet axe est logarithmique. Le titre en anticorps a été déterminé individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne géométrique calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5, 10 ou 15 selon les groupes). S3 = semaine 3, S6 = semaine 6, S9 = semaine 9.
En ce qui concerne les réponses humorales anti-p24, pour la première fois dans cette série d'expérience, augmenter le nombre d'injections permet d'améliorer de façon significative la réponse immune mesurée. En effet, quel que soit le groupe étudié, passer de 2 à 3 injections d'immunogène augmente environ d'un log la réponse anti-p24 (sauf pour le groupe PLA seul où l'augmentation est moindre mais tout de même significative).
Pour les groupes ayant reçu 3 injections, toutes les combinaisons contenant du MVA et du PLA ou le PLA seul induisent un titre élevé (1(^6), supérieur d'un log au titre induit par du MVA seul.
De façon similaire, pour les groupes ayant reçu 2 injections, toutes les compositions contenant du MVA et du PLA ou le PLA seul induisent un titre élevé, supérieur d'un log au titre induit par du MVA seul.
Changer une injection de PLA en MVA dans un schéma de vaccination ne nuit pas aux titres en anticorps obtenus mais permet d'élargir les réponses cellulaires par rapport à celles qui sont générées uniquement par un vecteur PLA.
Conclusion :
En fonction du type de réponse analysée, la meilleure composition n'est pas toujours la même, certaines compositions obtenant spécifiquement de très bonnes réponses.
Cependant, pour obtenir une réponse immune large et intense, la meilleure composition est la composition PLA + MVA.
Exemple 2: Immunisation de souris avec la composition vaccinale microparticules PLA/p24 et l'Adénovirus Gag
1. Modèle animal
Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H- 2Kd) femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.
2. Immunogènes administrés
Dans cette série d'expériences ont été utilisés seuls ou en combinaison les immunogènes suivants : les microparticules PLA/p24 préparées selon le protocole déplacement de solvant de la demande de brevet WO2005/02787.
L'Adénovirus type 5 Gag qui est recombinant pour le gène gag du virus
VIH- I, codant pour la protéine p24. (Généthon)
L'Adénovirus type 5 eGFP qui est recombinant pour le gène codant pour la enhanced Green Fluorescent Protein (Généthon). H s'agit d'un témoin négatif qui sert à mesurer si le vecteur viral induit une réponse immune non spécifique lors des immunisations. l'ADN gag. Le gène gag (SEQ ID N0I) a été clone dans le plasmide d'expression eucaryote phCMV (plasmide non commercial). Les préparations d'ADN sans endotoxines et en grande quantité ont été réalisées avec le kit de Gigaprep endotoxine-free de Macherey-Nagel.
L'ADN sert de contrôle positif, car il est connu que chez la souris l'administration par voie intramusculaire d'ADN nu permet d'induire une bonne réponse cytotoxique (CTL).
3. Immunisations
30 souris ont reçu 2 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci- dessus à 0 et 3 semaines. Les compositions vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 6 ci- après. Toutes les injections ont été réalisées par voie intramusculaire pour l'adénovirus et l'ADN et par voie sous-cutanée pour les PLA. Tableau 6
Figure imgf000036_0001
Les animaux ont été sacrifiés 3 semaines après la dernière injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
4. Analyses immunologiques
Réalisées suivant les mêmes protocoles que dans l'exemple 1. De plus, nous avons mesuré les réponses humorales dirigées contre I'adénovirus5 en utilisant une technique ELISA. Le protocole est identique à celui utilisé pour l'ELISA anti-p24, sauf qu'un lysat d'adénovirus est utilisé en capture.
5. Résultats
5.2. Réponses CTL
La figure 9 représente les réponses CTL obtenues lors de l'expérience d'immunisation n°2. Chaque groupe est constitué de 5 souris, analysée individuellement. La stimulation non spécifique (sans peptide) dans tous les groupes étant de 0, elle n'est pas représentée. L'abscisse correspond au ratio cellules effectrices (CTL) sur cellules cibles (à lyser). L'axe des ordonnées correspond au pourcentage de lyse moyenne ; il s'agit de la moyenne arithmétique calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5).
Dans tous les groupes 5 souris sur 5 ont développé une réponse CTL, sauf une souris du groupe Ad5gag 107 + PLA.
On observe la même chose pour les 2 doses de virus testées : les combinaisons Ad + Ad (H et H') et PLA + Ad (J et J') induisent de meilleures réponses CTL que la combinaison Ad + PLA (I et F).
5.3. La réponse ELISPOT IFN-J contre lepeptide Gag AMQ
La Figure 10 représente les réponses ELISPOT IFN-γ spécifiques du peptide Gag AMQ. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN-γ de manière spécifique en réponse à une stimulation de 18h par le peptide Gag AMQ sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été déterminée individuellement pour chaque souris (numérotée de 1 à 5 pour chaque souris, ainsi Hl correspond à la souris 1 ayant reçu la composition H Ad5 gag 108 ip et Ad5 gag 108 ip, etc. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à une moyenne de triplicats.
On peut noter d'après la figure 10 que :
- à 108 : la réponse PLA + Ad > Ad + Ad > Ad + PLA
- à 107 : la réponse Ad + Ad > ou = PLA + Ad > Ad + PLA. La différence entre les compositions Ad + Ad et PLA + Ad est peu flagrante. Globalement la réponse ELISPOT IFN- gamma est en concordance avec le test CTL : Les compositions PLA + Ad et Ad + Ad sont plus efficaces que Ad + PLA.
5.4. Sécrétion de cytokines
Comme dans l'exemple 1, nous avons testé la sécrétion de 10 cytokines dans le surnageant. Parmi celles-ci, l'IL-5, l'IL-6, l'IL-17 et l'IFN-γ n'étaient pas sécrétées ou sécrétées à des concentrations infinitésimales. Quant au GM-CSF, TNF- α et IL- la, leur sécrétion n'était pas spécifique de la protéine p24 par la technique de dosage utilisée. Il est très probable que c'est l'immunisation par l'adénovirus qui provoque la sécrétion de ces cytokines. Si une sécrétion spécifique de la protéine p24 existe, elle est noyée dans celle provoquée par l'adénovirus.
Pour 3 autres cytokines, à savoir IL-2 (ThI), ainsi que l'IL-4 et l'IL- 10 (Th2), nous avons pu mesurer la sécrétion spécifique de la protéine p24. Les résultats sont présentés dans la figure 11.
La figure 11 représente la sécrétion des cytokines IL- 2, IL- 4 et IL-IO spécifique de la protéine p24. Chaque composition vaccinale a été administrée à 5 souris. Les cellules obtenues à partir des souris d'un même groupe ont été poolées avant la mise en culture pour le test de sécrétion. L'axe des ordonnées représente la concentration de chaque cytokine (en pg/ml) sécrétée dans le milieu de culture en réponse à une stimulation de 3 jours par la protéine p24.
Les résultats sur la figure 11 montrent que :
- la composition Ad5 gag + Ad5 gag (H et H')ne donne aucune sécrétion d'IL-2, IL- 4 ou IL-IO.
- seule la composition PLA + Ad5 gag (J et J') donne une sécrétion de IL-2 et IL-4.
- les compositions PLA + Ad5 gag (J et J') et Ad5 gag + PLA (I et F) permettent une sécrétion de IL- 10.
La composition Ad + Ad (H et H') induit une réponse cytokine plutôt polarisée ThI (mesurée par ELISPOT IFN- gamma)
La composition PLA + Ad 5 (J et J') induit une réponse cytokine non polarisée, puisque à la fois des cytokines ThI comme IFN-gamma (par ELISPOT) et l'IL-2, et des cytokines Th2 comme l'IL-4 et L'IL-10 sont détectées.
5.5. Réponses humorales
La figure 12 représente la cinétique d'apparition des réponses humorales. La figure 12(A) représente la réponse anticorps dirigée contre la protéine p24 et la figure 12(B) représente la réponse anticorps dirigée contre l'adéno virus. Chaque composition vaccinale a été administrée à 5 souris. L'axe des ordonnées représente le titre en IgG mesuré par ELISA ; l'échelle de cet axe est logarithmique. Le titre en anticorps a été déterminé individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne géométrique calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5). S3 = semaine 3, S6 = semaine 6.
La réponse anti-adénovirus (ou réponse anti- vecteur) est d'environ 1 log de moins dans les groupes ayant reçu les compositions Ad+PLA (I et F) et PLA+ Ad (J et J') que pour Ad+Ad (H et H').
Les compositions selon l'invention permettent donc de diminuer l'immunité anti- adénovirus. Exemple 3 : Comparaison des compositions vaccinales PLA/p24 + MVAgag et Alum/p24 + MVAgag chez la souris
1. Modèle animal
Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H- 2d) femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.
2. Immunogènes administrés
Dans cette série d'expériences ont été utilisés seuls ou en combinaison les immunogènes suivants : les microparticules PLA/p24 préparées selon le protocole déplacement de solvant et d'adsorption de la demande de brevet WO 2005/02787. alum/p24 : l'alum (Imject Alum, Pierce, No de catalogue 77161) est mélangé volume pour volume (1:1) avec la protéine p24 diluée dans du PBS. On administre une dose de 40 μg de p24 par injection et par animal. le virus MVA gag (Modified Vaccinia Virus Ankara, virus de la vaccine atténué, souche Ankara) qui est recombinant pour le gène gag du virus VIH-I, codant pour la protéine p24. Le virus recombinant a été construit à Transgene, comme indiqué dans l'exemple 1. l'ADN gag. Le gène gag de séquence SEQ ID N0I a été clone dans le plasmide d'expression eucaryote phCMV. Les préparations d'ADN sans endotoxines et en grande quantité ont été réalisées avec le kit de Gigaprep endotoxine-free de Macherey-Nagel. L'ADN sert de contrôle positif, car il est connu que chez la souris l'administration par voie intramusculaire d'ADN nu permet d'induire une bonne réponse cytotoxique (CTL).
3. Immunisations
30 souris ont reçu 2 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci- dessus à 0 et 3 semaines. Les compositions vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 7 ci-après. Toutes les injections ont été réalisées par voie sous-cutanée sauf pour l'ADN qui a été administré par voie intramusculaire. Tableau 7
Figure imgf000040_0001
Pfu = plaque forming units, c'est l'unité de mesure de la dose de MVA utilisée. Le titre viral est exprimé en pfu selon la technique de dosage du stock viral utilisée.
Les animaux ont été sacrifiés 6 semaines après la première injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
4. Analyses immunologiques
Réalisées suivant les mêmes protocoles que dans l'exemple 1. De plus, nous avons mesuré les réponses humorales dirigées contre le MVA en utilisant une technique ELISA. Le protocole est identique à celui utilisé pour l'ELISA anti-p24, sauf qu'un lysat de MVA est utilisé en capture.
5. Résultats
5.1. La réponse ELISPOT IFN-J contre le peptide Gag AMQ La figure 13 représentent les réponses ELISPOT IFN- γ spécifiques du peptide Gag AMQ. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN-γ de manière spécifique en réponse à une stimulation de 18h par le peptide Gag AMQ sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5).
Les réponses ELISPOT IFN- γ obtenues lors de cette expérience sont plus faibles que d'habitude. Cette baisse est observée à la fois pour les groupes testés et les groupes contrôles, et est liée au déroulement de l'expérience. De ce fait, comme nous cherchons à comparer les différentes combinaisons entre elle, cette expérience reste interprétable et montre clairement que la composition PLA/p24 + MVA gag (C) induit une meilleure sécrétion d'IFN-γ mesurée par ELISPOT que les autres groupes testées, à savoir MVA gag + PLA/p24 (B), MVA gag + Alum/p24 (K), Alum/p24 + MVA gag (L).
5.2. La réponse ELISPOT IL-4 contre la protéine p24
La figure 14 représente les réponses ELISPOT IL-4 spécifiques de la protéine p24. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN-γ de manière spécifique en réponse à une stimulation de 42h par la protéine p24 sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5).
Pour l'induction d'une réponse ELISPOT de type IL- 4, le meilleur immunogène est constitué par l'association MVAgag et PLA/p24 (B et C). Quelque soit l'ordre d'administration de cette composition, les réponses IL- 4 obtenues sont supérieures à celles induites par les compositions MVA gag + Alum/p24 (quel que soit l'ordre) (K et L), PLA/p24 + ADNgag (G) et Alum/p24 + ADNgag (M). Si l'on s'intéresse maintenant à l'ordre d'administration des produits, c'est toujours la composition PLA/p24 + MVAgag (C) qui donne de meilleurs résultats que la combinaison inverse, MVAgag + PLA/p24 (B).
5.3. La réponse humorale spécifique de la protéine p24
La figure 15 représente la cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine p24. L'axe des ordonnées représente le titre en IgG anti-p24 mesuré par ELISA de capture p24 ; l'échelle de cet axe est logarithmique. Le titre en anticorps a été déterminé individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne géométrique calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5). S2 = semaine 2, S4 = semaine 4, S6 = semaine 6.
Pour l'induction dune réponse anticorps spécifique de la protéine p24, le meilleur immunogène est constitué encore une fois par l'association MVAgag et PLA/p24 (B et C). Quelque soit l'ordre d'administration de cette composition, les titres d'IgG anti-P4 obtenus sont de 0,6 à 1,2 log plus élevées à semaine 6 que celles induites par les combinaisons MVA gag + Alum/p24 (quel que soit l'ordre) (K et L), PLA/p24 + ADNgag (G) et Alum/p24 + ADNgag (M). Si l'on s'intéresse maintenant à l'ordre d'administration des produits, c'est toujours la combinaison PLA/p24 + MVAgag (C) qui donne de meilleurs résultats que la combinaison inverse, MVAgag + PLA/p24 (B), mais seulement de 0,4 log.
5.4. La réponse humorale spécifique du virus MVA
La figure 16 représente la cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques du virus MVA. L'axe des ordonnées représente le titre en IgG anti-MVA mesuré par ELISA de capture MVA. Le titre en anticorps a été déterminé individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne géométrique calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5). S4 = semaine 4, S6 = semaine 6.
Dans les groupes PLA/p24 + MVAgag (C) et Alum/p24 + MVAgag (L), le MVA a été administré à semaine 3. Comme nous pouvons le voir sur la figure 16, la réponse anti- MVA n'a pas eu le temps de se mettre en place au moment de l'analyse, à semaine 6. Par contre dans les groupes ayant reçu l'injection de MVA en premier, il est possible de mesurer la réponse anti- vecteur. De façon étonnante, dès 4 semaines, la réponse anti-MVA est bien plus faible dans le groupe MVAgag + PLA/p24 (B) que dans le groupe MVAgag + Alum/p24 (K). De plus avec la combinaison MVAgag + PLA/p24, le titre anti-MVA n'augmente pas dans le temps, ce qui n'est pas le cas avec la combinaison MVAgag + Alum/p24.
En association avec le MVA, les PLA permettent de limiter la réponse anticorps anti- MVA alors que ce n'est pas le cas de l'association MVA + Alum. H s'agit d'une propriété très intéressante et très utile pour des applications d'immunisation et de vaccination.
Conclusion :
Les compositions selon l'invention PLA/p24 et MVAgag permettent d'induire de meilleures réponses cellulaires et humorales que les compositions Alum/p24 et MVAgag. De plus, elles permettent de limiter la réponse anti- vecteur. Exemple 4: Administration des compositions vaccinales PLA/p24 et MVAgag par voie intranasale
1. Modèle animal
Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H- 2d) femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.
2. Immunogènes administrés
Dans cette série d'expériences ont été utilisés seuls ou en combinaison les immunogènes suivants : les microparticules PLA/p24 préparées selon le protocole déplacement de solvant et d'adsorption de la demande de brevet WO2005/027871. le virus MVA gag (Modified Vaccinia Virus Ankara, virus de la vaccine atténué, souche Ankara) qui est recombinant pour le gène gag du virus VIH- I, codant pour la protéine p24. Le virus recombinant a été construit à Transgene, comme indiqué précédemment.
3. Immunisations
10 souris ont reçu 3 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci- dessus à 0, 10 et 20 jours. Les compositions vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 8 ci- après. Toutes les injections ont été réalisées par voie intranasale.
Tableau 8
Figure imgf000043_0001
Pfu = plaque forming units, c'est l'unité de mesure de la dose de MVA utilisée. Le titre viral est exprimé en pfu selon la technique de dosage du stock viral utilisée.
Les animaux ont été sacrifiés 32 jours après la première injection. Le sang, les sécrétions vaginales, les fèces, la rate et l'appareil génital (vagin) ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
4. Analyses immunologiques Réalisées suivant les mêmes protocoles que dans l'exemple 1.
5. Résultats
Récapitulation des données expérimentales
Tableau 9
Combinaisons vaccinales PLA/p24, MVAgag, PLA/p24, MVAgag, MVAgag PLA/p24
Nombre de souris ayant développé une réponse CTL 2/5 2/5 % moyen de lyse des souris CTL+ 50% 45%
L'ELISPOT mesure le nombre de cellules sécrétant la cytokine par 10E6 cellules analysées
ELISPOT IFN- γ, AMQ, sang 155 79
ELISPOT IFN- γ, p24, sang 146 94
ELISPOT IL-4, AMQ, sang 50 10
ELISPOT IL-4, p24, sang 126 32
ELISPOT IFN-γ, AMQ, vaginal 1550 754
ELISPOT IL-4, AMQ, vaginal O O
ELISPOT IL-4, p24, vaginal O O
Titre en IgG anti-p24 du sérum (déterminé par 68 000 200 000
ELISA)
Titre en IgA anti-p24 des sécrétions vaginales 18 8
(déterminé par ELISA)
Titre en IgG anti-p24 des sécrétions vaginales 124 616
(déterminé par ELISA)
IgA anti-p24 dans les fèces (^bsorbance à 450 J20 0,20 J20 0,18 nm, déterminée par ELISA) J32 0,02 J32 0,03
IgG anti-p24 dans les fèces (Absorbance à 450 J20 0,17 J20 0,17 nm, déterminée par ELISA) J32 0,69 J32 0,60 L'administration des combinaisons PLA/p24 et MVAgag par voie intranasale permet d'induire à la fois une réponse immune systémique mesurée dans les prélèvements de sang et de rate, et une réponse immune périphérique au niveau des muqueuses, en particulier au niveau du tractus uro- génital. A chaque fois, les deux bras du système immunitaire sont activés : on a pu mettre en évidence au niveau de ces deux sites des réponses immunes cellulaires et humorales dirigées contre la protéine p24. La capacité à induire une large réponse périphérique au niveau du tractus uro- génital constitue un atout considérable pour les combinaisons PLA/p24 et MVAgag dans les applications vaccinales à but prophylactique ou thérapeutique.
Exemple 5 : Immunisation de souris avec la combinaison vaccinale microparticules PLA/beta-gal et virus MVA beta-gal
1. Modèle animal
Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H- 2d) femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.
2. Immunogènes administrés
Dans cette série d'expériences ont été utilisés seuls ou en combinaison les immunogènes suivants : les microparticules PLA/beta-gal préparées selon le protocole déplacement de solvant décrit dans la demande de brevet WO2005/027871. le virus MVA beta-gal (Modified Vaccinia Virus Ankara, virus de la vaccine atténué, souche Ankara) qui est recombinant pour le gène lacZ de E. coli, codant pour l'enzyme beta- galactosidase (beta-gal). Le virus recombinant a été construit à Transgene, et produit et purifié comme décrit précédemment.
3. Immunisations
35 souris ont reçu 2 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci- dessus à 0 et 3 semaines. Les combinaisons vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 10 suivant. Toutes les injections ont été réalisées par voie sous- cutanée. Tableau 10
Figure imgf000046_0001
Pfu = plaque forming units, c'est l'unité de mesure de la dose de MVA utilisée. Le titre viral est exprimé en pfu selon la technique de dosage du stock viral utilisée.
Les animaux ont été sacrifiés 6 semaines après la première injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
4. Analyses immunologiques On a recherché la réponse humorale et la réponse cellulaire comme suit :
- Réponse cellulaire : après sacrifice des souris, les rates ont été prélevées de façon stérile pour préparer une suspension cellulaire. L'ELISPOT permet de déterminer le nombre de cellules sécrétant une cytokine donnée en réponse à un stimulus spécifique. Nous nous sommes intéressés à la cytokine IFN-γ de type ThI. Les suspensions cellulaires obtenues à partir des rates ont été restimulées in vitro par le peptide TPH (TPHPARIGL- SEQ ID N°3) pendant 2Oh pour analyser les réponses de type CD8. Les plaques d'ELISPOT 96 puits avec des membranes de PVDF (Multiscreen IP, Millipore) ont été coatées par un anticorps anti-IFN-γ. Pendant la restimulation, les suspensions de splénocytes ont été incubées dans ces plaques de manière à capturer les cytokines sécrétées par chaque cellule. Les spots correspondant à chaque cellule sécrétant la cytokine d'intérêt ont été révélés par un anticorps de détection biotinylé spécifique de la cytokine d'intérêt.
- Réponse humorale : on a effectué un prélèvement de sang sur les souris avant leur sacrifice. La présence des anticorps anti-beta-gal a été déterminée par ELISA. La protéine beta-gal a été utilisée en capture et bs anticorps spécifiques présents dans le sérum ont été révélés par un anticorps polyclonal anti- souris à titre d'anticorps de détection qui est un anticorps de chèvre anti- IgG de souris AffiniPure conjugué à la peroxydase de raifort (H+L, Jackson Immunoresearch, Cat no 115-035-062). Le titre est l'inverse de la dilution pour laquelle on obtient une absorbance de 0,1 unité DO avec le protocole ELISA utilisé. 5. Résultats
5.1. La réponse ELISPOT IFN-J contre le peptide beta-gal TPH
Les résultats sont présentés sur la figure 17 qui donne les réponses ELISPOT IFN- γ spécifiques du peptide beta-gal TPH. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN-γ de manière spécifique en réponse à une stimulation de 18h par le peptide beta-gal TPH sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5).
Ces résultats mettent en évidence qu'il est possible de classer les combinaisons vaccinales en plusieurs catégories en fonction des réponses ELISPOT IFN- γ obtenues. Les meilleures réponses sont induites par les combinaisons PLA + MVA, en injection séparée (O) ou en deux injections simultanées (S). Des réponses intermédiaires sont obtenues avec une seule injection de PLA + MVA en même temps (groupes Q et R). Les réponses les plus faibles sont observées avec les groupes ne contenant qu'un seul immunogène PLA uniquement (M) ou MVA uniquement (N).
Ainsi, dans le modèle beta-galactosidase aussi, nous avons pu montrer que la combinaison vaccinale PLA + MVA était meilleure que la combinaison MVA + MVA pour induire une sécrétion d'IFN-γ spécifique du peptide TPH. De plus l'ordre d'injection semble aussi avoir une importance car parmi toutes les combinaisons PLA + MVA testées, c'est le groupe O, PLA puis MVA qui a permis d'obtenir le meilleur résultat. H est à noter que c'est aussi la même combinaison qui s'était révélée la plus efficace dans h modèle p24 (exemple
1).
5.2. La réponse humorale spécifique de la protéine beta-gal
Les résultats sont présentés sur la figure 18 qui compare la cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine beta-gal. L'axe des ordonnées représente le titre en IgCr anti-beta-gal mesuré par ELISA de capture beta-gal ; l'échelle de cet axe est logarithmique. Le titre en anticorps a été déterminé individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5). S3 = semaine 3, S6 = semaine 6.
Ces résultats montrent que les meilleures réponses humorales sont obtenues pour le groupe PLA + PLA (M). Les titres induits chez les souris ayant reçues du PLA et du MVA à chaque injection (S) sont comparables. Dans les groupes O, P, Q et R, les titres sont plus bas d'environ un log. Parmi, toutes les combinaisons testées, le plus mauvais inducteur d'anticorps anti-beta-gal, c'est MVA + MVA. Dans le modèle beta-galactosidase, comme dans le modèle p24, toutes les combinaisons contenant du MVA et du PLA induisent un titre élevé, supérieur d'un log au titre induit par du MVA seul.
Comme dans l'exemple 1 (p24) changer une injection de PLA en MVA dans un schéma de vaccination ne nuit pas beaucoup aux titres en anticorps obtenus mais permet d'élargir les réponses cellulaires par rapport à celles qui sont générées uniquement par un vecteur PLA.
Même si rimmunisation PLA + MVA (S) ne permet pas d'induire la meilleure réponse immune selon chaque type de réponse analysée, dans l'ensemble c'est le groupe pour lequel on observe les réponses les plus larges et les plus intenses.
Exemple 6 : Immunisation de souris avec la combinaison vaccinale microparticules CPL/p24 et virus MVA gag
1. Modèle animal
Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H- 2d) femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.
2. Immunogènes administrés
Dans cette série d'expériences ont été utilisés seuls ou en combinaison les immunogènes suivants : les microparticules CPL utilisées dans ce travail sont formées par coprécipitation de deux polysaccharides ; le chitosane (Mahtani chitosan PVT Batch 124) et le sulfate de dextrane (Sigma : 31404). Les deux polymères sont au préalable mis en solution dans de l'eau à pH 4 contenant 50 mM de NaCl. Les solutions sont laissées sous agitation magnétique pendant 12 heures avant de préparer les particules. Ensuite, 20 ml de la solution de chitosane à 0,1% (masse molaire de 105000 g/mol et d'un degré d'acétylation 9) sont mélangés à 9,35 ml de la solution de sulfate de dextrane à 0,1%. La solution en défaut est versée rapidement sur la solution en excès placée sous agitation magnétique à 1000 rpm. Le mélange est laissé 30 secondes sur l'agitateur à 500 rpm, puis il est centrifugé pendant 30 minutes à 7 800 g. Le surnageant est éliminé par retournement, le culot est repris dans de l'eau puis à nouveau centrifugé pendant 30 minutes à 8000 g. Les culots ainsi obtenus sont repris dans de l'eau et conservés à température ambiante sous agitation constante. Les particules obtenues sont caractérisées par une mesure de taille (granulomètre Coulter), et de charge (Zetasizer Malvern).
Pour l'adsorption de la protéine p24 sur les CPL, la p24 à 1 g/1 en tampon phosphate 10 mM pH 5,7 est mélangée volume pour volume avec des particules CPL à 1% de taux de solide soit 0,5% final. Les échantillons sont mis sous agitation sur une roue à température ambiante pendant 20 heures. Après incubation, les tubes sont récupérés et centrifugés 10 minutes à 1800 g à 2O0C. Les surnageants sont récupérés et centrifugés 15 minutes à 3000 g à 2O0C pour éliminer les particules pouvant rester en suspension, puis la concentration en protéine est déterminée en utilisant un dosage BCA (kit BCA Protein Assay, Pierce : 23225). Les culots sont repris dans 400 μl de tampon phosphate 10 mM. Les particules obtenues sont caractérisées par une mesure de taille et de charge.
Le virus MVA gag (Modified Vaccinia Virus Ankara, virus de la vaccine atténué, souche Ankara) qui est recombinant pour le gène gag du virus VIH- I, codant pour la protéine p24. Le virus recombinant a été construit à Transgene, et produit et purifié comme décrit précédemment.
3. Immunisations
35 souris ont reçu 2 doses des immunogènes décrits dans le point 2 ci- dessus à 0 et 3 semaines. Les combinaisons vaccinales reçues par chaque groupe de souris sont indiquées dans le tableau 11 suivant. Toutes les injections ont été réalisées par voie sous -cutanée. Tableau 11
Figure imgf000050_0001
Pfu = plaque forming units, c'est l'unité de mesure de la dose de MVA utilisée. Le titre viral est exprimé en pfu selon la technique de dosage du stock viral utilisée.
Les animaux ont été sacrifiés 6 semaines après la première injection et le sang et la rate ont été prélevés pour les analyses immunologiques.
4. Analyses immunologiques
Réalisées suivant les mêmes protocoles que dans l'exemple 1.
5. Résultats
5.1. La réponse ELISPOT IFN-J contre le peptide gag AMQ Les résultats sont présentés sur la figure 19 qui donne les réponses ELISPOT IFN- γ spécifiques du peptide p24 AMQ. L'axe des ordonnées représente le nombre moyen de cellules sécrétant de l'IFN-γ de manière spécifique en réponse à une stimulation de 18h par le peptide p24 AMQ sur un million de cellules stimulées. Cette réponse a été déterminée individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5).
Ces résultats montrent qu'il est possible de classer les combinaisons vaccinales en plusieurs catégories en fonction des réponses ELISPOT IFN- γ obtenues. La meilleure réponse est induite par la combinaison MVA + MVA (U). La deuxième catégorie contient les combinaisons CPL + MVA, en injection séparée (V) ou en deux injections simultanées (Z). Une seule injection simultanée de CPL et de MVA (X et Y) n'est pas assez efficace pour induire une réponse ELISPOT IFN- γ élevée. Finalement, la combinaison CPL + CPL (T) est la moins efficace.
Comme pour l'association PLA + MVA, l'association CPL + MVA est efficace pour induire une sécrétion d'IFN-γ spécifique du peptide AMQ. L'injection simultanée des deux immunogènes ne permet pas cependant d'améliorer les performances par rapport à administration séparée de 3 semaines (Z vs V).
5.2. La réponse humorale spécifique de la protéine p24
Les résultats sont présentés sur la figure 20 qui compare la cinétique d'apparition des réponses humorales spécifiques de la protéine p24. L'axe des ordonnées représente le titre en IgG anti-p24 mesuré par ELISA de capture p24 ; l'échelle de cet axe est logarithmique. Le titre en anticorps a été déterminé individuellement pour chaque souris. Le nombre présenté sur ce graphique correspond à la moyenne calculée à partir de toutes les souris d'un groupe (n=5). S3 = semaine 3, S6 = semaine 6.
Les résultats montrent que, pour les groupes ayant reçu 2 injections, toutes les combinaisons contenant du CPL et du MVA (V, W5Z) ou le CPL seul (T) induisent un titre élevé (10E6), supérieur de 2-3 log au titre induit par du MVA seul. Cependant la combinaison CPL + MVA (V) est plus efficace que l'ordre d'injection inverse (W). Dans les groupes n'ayant reçu qu' une seule injection de CPL et MVA (X et Y), les titres en anticorps sont plus faibles, mais quand même supérieurs à ce que l'on obtient avec du MVA seul.
Comme pour l'association PLA + MVA, changer une injection de CPL en MVA dans un schéma de vaccination ne nuit pas aux titres en anticorps obtenus mais permet d'augmenter considérablement les réponses cellulaires par rapport à celles qui sont générées uniquement par un vecteur CPL.
Conclusions :
L'ensemble de ces exemples nous a permis de montrer que la combinaison d'un vecteur synthétique colloïdal biorésorbable, tel que PLA, CPL, et d'un vecteur viral, tel que MVA et adéno virus, permet d'induire des réponses immunes efficaces et larges. De préférence, pour la meilleure efficacité, la combinaison devrait être administrée dans l'ordre vecteur synthétique, puis vecteur viral.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique comprenant
- un vecteur synthétique colloïdal biorésorbable comprenant au moins une substance protéique et
- un vecteur viral comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour une substance protéique correspondant à au moins une substance protéique du vecteur synthétique.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant que vecteur synthétique colloïdal, un vecteur de nature sphérique.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le vecteur synthétique colloïdal est préparé à partir d'au moins un polymère choisi parmi les poly(acides OC- hydroxylés).
4. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le vecteur synthétique colloïdal est préparé à partir d'au moins un polymère naturel.
5. Composition selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le vecteur synthétique colloïdal comprend des substances protéiques de types différents et constituant chacune un antigène associé à la même maladie.
6. Composition selon les revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant que vecteur viral, un adénovirus ou un poxvirus.
7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que le poxvirus est le Modified Vaccinia Virus Ankara.
8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les substances protéiques sont d'origine virale.
9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que les substances protéiques d'origine virale sont des protéines du virus VIH.
10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la substance protéique est un antigène associé aux tumeurs.
11. Utilisation de la composition telle que définie dans les revendications 1 à 10 pour la préparation d'un médicament.
12. Utilisation de la composition telle que définie dans les revendications 1 à 10 pour la préparation d'un vaccin.
13. Utilisation de la composition telle que définie dans les revendications 1 à 10 pour le diagnostic in vitro de l'état pathologique dont la ou les substances protéiques du vecteur synthétique et du vecteur synthétique constituent les antigènes.
14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'état pathologique est une infection virale.
15. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'état pathologique est un cancer.
16. Méthode de traitement prophylactique ou thérapeutique, en particulier vaccination, comprenant l'administration, à un patient, d'une dose efficace de la composition telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 10.
17. Méthode de traitement selon la revendication 16, caractérisée en ce que la composition est administrée de façon échelonnée.
18. Méthode de traitement selon la revendication 17, caractérisée en ce que le vecteur synthétique est administré avant le vecteur viral.
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