WO2007060725A1 - 組換え多価ワクチン - Google Patents

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varicella
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virus
seq
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Yasuko Mori
Pranee Somboonthum
Hironori Yoshii
Yasuyuki Gomi
Michiaki Takahashi
Koichi Yamanishi
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National Institutes of Biomedical Innovation Health and Nutrition
Original Assignee
Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
National Institutes of Biomedical Innovation Health and Nutrition
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant varicella-zoster virus, particularly a recombinant varicella-zoster virus prepared using BAC (Escherichia coli artificial chromosome), and a pharmaceutical composition containing such a virus. Furthermore, the present invention relates to a vector comprising a varicella-zoster virus genomic gene and a BAC vector sequence, and a cell comprising such a vector. Furthermore, the present invention relates to a method for producing recombinant varicella-zoster virus. The present invention also relates to a nucleic acid cassette comprising a fragment capable of homologous recombination with the varicella-zoster virus genome and a BAC vector sequence.
  • VZV Varicella-zoster virus
  • the initial infection with this virus causes chickenpox. After that, the virus latently infects the ganglion, and after a long period of time, it is reactivated by some kind of trigger, and herpes zoster (a virus particle is formed, propagates through the nerve to reach the epidermis cell, Cause symptoms of chickenpox formation.
  • VZV genome is a double-stranded DNA, which has about 125,000 base strength.
  • the entire nucleotide sequence has been determined by Davison et al., And it is known that there are at least 72 genes on the genome.
  • VZV vaccine Oka strain is the world's only vaccine for varicella-zoster virus developed by Takahashi et al. (Japanese Patent Publication No. 53-41202).
  • the current live attenuated varicella vaccine is manufactured using seeds derived from the attenuated varicella virus Oka strain, and is widely used in countries around the world (Requirements for Variable Vaccine (Live) Adopted 1984; Revised 1993). : WHO Technical Report Series, No. 848, pp. 22-38, 1994).
  • This Oka strain is a virus that was isolated from a child with typical varicella (original Oka strain) using human fetal lung cells at 34 ° C for 12 generations.
  • Viral vaccines have the potential to change genotype with their subculture.
  • the Oka strain itself may have genetic diversity.
  • the number of passages of the varicella seed virus approved for production i.e., A seed lot system has been enacted in which the number of passages at the time of seed approval is zero and the virus is used for vaccines with a total passage number of less than ten.
  • the technology of deviation is also Although the varicella virus Oka strain (strongly toxic parent strain), a vaccine strain derived from it (attenuated Oka strain), and the varicella virus strain other than the Oka strain can be tested for differences, the attenuated live chickenpox vaccine It is not necessarily sufficient as a formulation standard for quality control and quality assurance.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 53-41202
  • Patent Document 2 US Patent No. 6, 093,535
  • Patent Document 3 International Publication Number WO 00/50603
  • Non-Patent Document 1 Requirements for Varicella Vaccine (Live) Adopted 1984; Rev ised 1993: WHO Technical Report Series, No. 848, pp. 22—38, 1994
  • Non-Patent Document 2 Journal of General Virology, 59, 660-668, 1986
  • Non-Patent Literature 3 Journal of General Virology, 67, 1759-1816, 1986
  • Non-Patent Literature 4 Japanese Journal of Experimental Medicine, 59, 233-237, 1 989
  • Non-Patent Literature 5 Journal of Virology, 66, 1016— 1020, 1992
  • Non-Patent Literature 6 Journal of Clinical Microbiology, 33, 658-660, 1995 Disclosure of Invention
  • An object of the present invention is to improve the quality control and quality assurance accuracy of the varicella-zoster virus vaccine, and to ensure and guarantee the effectiveness, safety, and homogeneity of the attenuated live varicella vaccine.
  • the object of the present invention is to establish a method for producing a recombinant varicella-zoster virus by mutagenesis and provide such a virus in order to develop a modified varicella-zoster virus vaccine superior to the Oka strain. There is.
  • an object of the present invention is to provide a multivalent vaccine having the above advantages.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a multivalent vaccine using a BAC betater without causing problems such as a reduction in virus production.
  • the present inventors have completed the present invention by developing a method for producing recombinant varicella-zoster virus using a specific gene of the varicella-zoster virus genome as an insertion sequence of a BAC vector sequence.
  • the present invention provides the following.
  • Non-essential region is selected from the group consisting of the following regions: within the ORF of gene 13 The region within the ORF of gene 56, the region within the ORF of gene 58, the region adjacent to the ORF of gene 13, the region adjacent to the ORF of gene 56, the region adjacent to the ORF of gene 57, and the gene 58 The area adjacent to the ORF.
  • (Item 2) The recombinant varicella-zoster virus described in item 1, wherein the varicella-zoster virus lacks at least two genes selected from the group consisting of gene 13, gene 56, gene 57, and gene 58. Herpes virus.
  • the recombinant varicella-zoster virus according to item 1, comprising a gene of a virus selected from the group consisting of the BAC vector sequencing ability mumps virus, measles virus, and rubella virus.
  • the recombinant varicella-zoster virus according to item 6, comprising the BAC vector sequence ability mumps virus gene, measles virus gene, and rubella virus gene.
  • the gene 6 is a base substitution in which at least the 5745th base is G in the base sequence of SEQ ID NO: 4,
  • the recombinant varicella-zoster virus according to item 9, comprising:
  • (Item 25) A pharmaceutical composition comprising the virus according to item 24.
  • (Item 26) A method for producing recombinant varicella-zoster virus, comprising the steps of: introducing the vector of item 18 into a mammalian host cell; and culturing the mammalian host cell, Producing varicella-zoster virus
  • plasmid vector comprising a fragment of the varicella-zoster virus genome, wherein the fragment has at least one mutation
  • a first plasmid vector comprising a first fragment that is part of the varicella-zoster virus genome, wherein the first fragment has at least one mutation
  • a second plasmid vector comprising a second fragment that is part of the varicella-zoster virus genome, wherein the second fragment has at least one mutation. And wherein the second fragment is different from the first fragment;
  • a vector having a BAC vector sequence is isolated from the cultured bacterial host cell.
  • a nucleic acid cassette comprising fragments, wherein each end of the BAC sequence is linked to a first fragment and a second fragment, respectively, and wherein the first and second fragments are Nucleic acid cassettes derived from a selected region, each of which is independently a group power of the following regions of the varicella-zoster virus genome:
  • the varicella-zoster virus genome is derived from a wild strain, Nucleic acid cassette.
  • the present invention provides a recombinant varicella-zoster virus and a method for producing the same.
  • a method for producing a recombinant varicella-zoster virus using a BAC (E. coli artificial chromosome) and using a specific gene of the virus as an insertion part of a BAC vector is provided.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising recombinant varicella-zoster virus.
  • a vector comprising a varicella-zoster virus genomic gene and a BAC vector sequence, a cell comprising such a vector, a fragment capable of homologous recombination with the varicella-zoster virus genome, and a BAC vector A nucleic acid force set comprising the sequence is provided.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of a CMV promoter Z enhancer.
  • FIG. 2 schematically shows a method for inserting a mumps virus antigen into the ORF region of gene 13 by homologous recombination.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleic acid sequence of gene 62
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of gene 62
  • SEQ ID NO: 3 Sequence of plasmid PHA-2
  • SEQ ID NO: 4 Varicella zoster virus Dumas strain
  • SEQ ID NO: 5 amino acid encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 1134 to 1850 of SEQ ID NO: 4 Sequence (gene 2)
  • SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction from positions 8607 to 9386 of SEQ ID NO: 4 (gene 7)
  • SEQ ID NO: 7 amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 10642 to 10902 of SEQ ID NO: 4 (gene 9A)
  • SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence (gene 9) encoded in the 5 ' ⁇ 3' direction at positions 11009 to 11917 of SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 9 amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 12160 to 13392 of SEQ ID NO: 4 (gene 10)
  • SEQ ID NO: 10 amino acid sequence (gene 11) encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 13590 to 16049 of SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 11 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction from position 16214 to position 18199 of SEQ ID NO: 4 (gene 12)
  • SEQ ID NO: 12 Amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction from positions 18441 to 19346 of SEQ ID NO: 4 (gene 13)
  • SEQ ID NO: 13 Amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 24149 to 25516 of SEQ ID NO: 4 (gene 17)
  • SEQ ID NO: 14 amino acid sequence encoded by 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 30759 to 33875 of SEQ ID NO: 4 (gene 21)
  • SEQ ID NO: 15 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 34083 to 42374 of SEQ ID NO: 4 (gene 22)
  • SEQ ID NO: 16 amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 44506 to 46263 of SEQ ID NO: 4 (gene 26)
  • SEQ ID NO: 17 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 50857 to 54471 of SEQ ID NO: 4 (gene 29)
  • SEQ ID NO: 18 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 54651 to 56963 of SEQ ID NO: 4 (gene 30)
  • SEQ ID NO: 19 amino acid encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 57008 to 59614 in SEQ ID NO: 4 Acid sequence (gene 31)
  • SEQ ID NO: 20 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 59766 to 60197 in SEQ ID NO: 4 (gene 32)
  • SEQ ID NO: 21 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 64807 to 65832 of SEQ ID NO: 4 (gene 36)
  • SEQ ID NO: 22 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 66074 to 68599 of SEQ ID NO: 4 (gene 37)
  • SEQ ID NO: 23 Amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 70633 to 71355 of SEQ ID NO: 4 (gene 39)
  • SEQ ID NO: 24 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 71540 to 75730 of SEQ ID NO: 4 (gene 40)
  • SEQ ID NO: 25 amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 75847 to 76797 of SEQ ID NO: 4 (gene 41)
  • SEQ ID NO: 26 amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 78170 to 80200 of SEQ ID NO: 4 (gene 43)
  • SEQ ID NO: 27 amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 80360 to 81451 of SEQ ID NO: 4 (gene 44)
  • SEQ ID NO: 28 amino acid sequence encoded by 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 82719 to 83318 of SEQ ID NO: 4 (gene 46)
  • SEQ ID NO: 29 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 84667 to 86322 of SEQ ID NO: 4 (gene 48)
  • SEQ ID NO: 30 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 87881 to 90388 of SEQ ID NO: 4 (gene 51)
  • SEQ ID NO: 31 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 90493 to 92808 of SEQ ID NO: 4 (gene 52)
  • SEQ ID NO: 32 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 95996 to 98641 of SEQ ID NO: 4 (gene 55)
  • SEQ ID NO: 33 A code encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 110581 to 111417 of SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 34 amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 111565 to 112107 of SEQ ID NO: 4 (gene 64)
  • SEQ ID NO: 35 amino acid sequence encoded in 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 113037 to 114218 of SEQ ID NO: 4 (gene 66)
  • SEQ ID NO: 36 amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 114496 to 115560 of SEQ ID NO: 4 (gene 67)
  • SEQ ID NO: 37 amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 115808 to 117679 of SEQ ID NO: 4 (gene 68)
  • SEQ ID NO: 38 amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction from positions 120764 to 124696 of SEQ ID NO: 4 (gene 71)
  • SEQ ID NO: 39 partial sequence of SEQ ID NO: 4 (gene 27)
  • SEQ ID NO: 40 amino acid sequence encoded in the 5 ' ⁇ 3' direction from position 1 to position 999 of SEQ ID NO: 39 (gene 27)
  • SEQ ID NO: 41 partial sequence of SEQ ID NO: 4 (gene 47)
  • SEQ ID NO: 42 Amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 1 to 1530 of SEQ ID NO: 41 (gene 47)
  • SEQ ID NO: 43 partial sequence of SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 44 Amino acid sequence encoded in the 5 ' ⁇ 3' direction at positions 1 to 243 of SEQ ID NO: 43 (gene 49)
  • SEQ ID NO: 45 partial sequence of SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 46 Amino acid sequence encoded in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction at positions 1 to 732 of SEQ ID NO: 45 (gene 56)
  • SEQ ID NO: 47 complementary strand sequence of the sequence of SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 48 amino acid sequence encoded in the sequence 3,5 ⁇ 5 from 118480 to 119316 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 5569 to 6405 of SEQ ID NO: 47) (gene 70)
  • SEQ ID NO: 49 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 117790 to 118332 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 6553 to 7095 of SEQ ID NO: 47) (gene 69)
  • SEQ ID NO: 50 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 112332 to 112640 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 12245 to 12553 of SEQ ID NO: 47) (gene 65)
  • SEQ ID NO: 55 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 92855 to 93850 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 31035 to 32030 of SEQ ID NO: 47) (gene 53)
  • SEQ ID NO: 56 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 68668 to 70293 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 54592 to 56217 of SEQ ID NO: 47) (gene 38)
  • SEQ ID NO: 57 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 63977 to 64753 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 60132 to 60908 of SEQ ID NO: 47) (gene 35)
  • SEQ ID NO: 58 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 62171 to 63910 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 60975 to 62714 of SEQ ID NO: 47) (gene 34)
  • SEQ ID NO: 59 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 60321 to 62138 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 62747 to 64564 of SEQ ID NO: 47) (gene 33)
  • SEQ ID NO: 60 an amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 47052 to 50636 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 74249 to 77833 of SEQ ID NO: 47) (gene 28)
  • SEQ ID NO: 61 Amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 44148 to 44618 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 80267 to 80737 of SEQ ID NO: 47) (gene 25)
  • SEQ ID NO: 62 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 43212 to 44021 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 80864 to 81673 of SEQ ID NO: 47) (gene 24)
  • SEQ ID NO: 63 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 42431 to 43138 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 81747 to 82454 of SEQ ID NO: 47) (gene 23)
  • SEQ ID NO: 64 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 29024 to 30475 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 94410 to 95861 of SEQ ID NO: 47) (gene 20)
  • SEQ ID NO: 65 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 26518 to 28845 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 96040 to 98367 of SEQ ID NO: 47) (gene 19)
  • SEQ ID NO: 66 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 25573 to 26493 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 98392 to 99312 of SEQ ID NO: 47) (gene 18)
  • SEQ ID NO: 67 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 22568 to 23794 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 101091 to 102317 of SEQ ID NO: 47) (gene 16)
  • SEQ ID NO: 68 sequence Amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction from position 21258 to position 22478 of number 4 (corresponding to position 102407 to position 103627 of SEQ ID NO: 47) (gene 15)
  • SEQ ID NO: 72 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 4252 to 5274 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 119611 to 120633 of SEQ ID NO: 47) (gene 5)
  • SEQ ID NO: 73 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 2783 to 4141 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 120744 to 122102 of SEQ ID NO: 47) (gene 4)
  • SEQ ID NO: 74 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 1908 to 2447 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 122438 to 122977 of SEQ ID NO: 47) (gene 3)
  • SEQ ID NO: 75 Amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 589 to 915 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to positions 123970 to 124296 of SEQ ID NO: 47) (gene 1)
  • SEQ ID NO: 76 partial sequence of SEQ ID NO: 47
  • SEQ ID NO: 77 An amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 1 to 1056 and 4556 to 5740 of SEQ ID NO: 76 (positions 46847 to 48034 and 42292 to 43347 of SEQ ID NO: 47) (Corresponding) (gene 42 and gene 45)
  • SEQ ID NO: 78 Partial sequence of SEQ ID NO: 47
  • SEQ ID NO: 79 Amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 1 to 1305 of SEQ ID NO: 78 (corresponding to positions 123580 to 124884 of SEQ ID NO: 47) (gene 50)
  • SEQ ID NO: 80 partial sequence of SEQ ID NO: 47
  • SEQ ID NO: 81 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 1 to 2307 of SEQ ID NO: 80 (corresponding to positions 122578 to 124884 of SEQ ID NO: 47) (gene 54)
  • SEQ ID NO: 82 Partial sequence of SEQ ID NO: 47
  • SEQ ID NO: 83 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 1 to 663 of SEQ ID NO: 82 (corresponding to positions 124222 to 124884 of SEQ ID NO: 47) (gene 58)
  • SEQ ID NO: 84 Partial sequence of SEQ ID NO: 47
  • SEQ ID NO: 85 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 1 to 427 of SEQ ID NO: 84 (corresponding to positions 124458 to 124884 of SEQ ID NO: 47) (gene 60)
  • SEQ ID NO: 86 Partial sequence of SEQ ID NO: 47
  • SEQ ID NO: 87 amino acid sequence encoded in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction at positions 1 to 903 of SEQ ID NO: 86 (corresponding to positions 60321 to 61229 of SEQ ID NO: 47) (gene 33.5)
  • the "essential gene” of varicella-zoster virus refers to a gene essential for the growth of varicella-zoster virus.
  • the “non-essential gene” of varicella-zoster virus is not essential for the growth of varicella-zoster virus.
  • Non-essential genes for varicella-zoster virus include, but are not limited to, for example, the following: gene 11, gene 12, gene 13, gene 56, and gene 58.
  • suitable genes for insertion of the BAC vector include, but are not limited to, for example, gene 13, gene 56, and gene 58.
  • wild strain of varicella-zoster virus refers to a varicella-zoster virus strain that has not been artificially modified and has been isolated from nature.
  • wild strains include, but are not limited to, Dumas strains identified by Davison, A. J. and Scott, J. E. (J. Gen. Virol. 67 (Pt 9), 1759-1816 (1986)).
  • the nucleic acid sequence of this Dumas strain is set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the number and position of the ORF of this Dumas strain is as follows.
  • ORF53 3 —> 5 'direction to 92855 -93850 amino acids 1-331
  • the "mutant strain” refers to a varicella-zoster virus strain that has been mutagenized by mutagenesis, multiple subcultures, or the like on a virus strain that is a wild strain.
  • the mutagenesis may be random or site-directed mutagenesis.
  • Attenuated virus refers to a type of virus mutant that has a reduced virulence than a wild strain. Two methods have been established for determining whether a virus variant is less toxic than the wild type, ie, testing the virulence of varicella-zoster virus.
  • SCID severe combined immunodeficiency
  • the pathogenicity can also be indirectly evaluated by examining the proliferation of cell-to-cell by the infectius center assay.
  • varicella-zoster virus having at least the 5745th base as G in gene 6 described in SEQ ID NO: 4 can be used as an attenuated virus.
  • Base 1251 is G;
  • a virus having at least one base substitution selected from the group consisting of the following in gene 62 may be used as the “attenuating virus”:
  • Base 4006 is G;
  • Base 1251 is G;
  • protein protein
  • polypeptide oligopeptide
  • peptide a polymer of amino acids of any length.
  • nucleotide As used herein, the terms "polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to nucleotide polymers of any length. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence may also be conservatively modified (e.g., degenerate codon substitutes) and complementary sequences, as well as those explicitly indicated. Is contemplated. Specifically, a degenerate codon substitute is a mixed base in the third position of one or more selected (or all) codons. And / or by creating sequences substituted with deoxyinosine residues (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 ( 1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91—98 (1994)).
  • gene refers to a factor that defines a genetic trait. Usually arranged on a chromosome in a certain order. A gene that defines the primary structure of a protein is called a structural gene, and a regulatory gene that affects its expression. As used herein, “gene” may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” and Z or “protein” “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide”.
  • V the ⁇ open reading frame '' or ⁇ ORF '' of a gene is one of three frameworks when the base sequence of a gene is divided into 3 bases each, and the start codon is It is a reading frame that has a certain length and does not appear as a stop codon in the middle and may actually encode a protein.
  • the varicella-zoster virus genome has its entire base sequence determined, and at least 71 genes have been identified, and each of the genes is known to have an open reading frame (ORF).
  • the “region in ORF” of a gene in the varicella-zoster virus genome refers to a region in which a base that forms an ORF is present in a gene in the varicella-zoster virus genome.
  • the "region adjacent to the ORF" of a gene in the varicella-zoster virus genome is a region where a base in the vicinity of the ORF is present in a gene in the varicella-zoster virus genome. A region that does not fall within the ORF region of the gene or another gene.
  • homology of a gene refers to the degree of identity of two or more gene sequences with each other. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity.
  • the ability of two genes to have homology can be determined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions.
  • the DNA sequence power between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least If they are 70% identical, more preferably they are homologous if they are at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical.
  • expression of a gene, polynucleotide, polypeptide or the like means that the gene or the like is subjected to a certain action in vivo and takes another form. Preferably, it refers to force transcription and translation of genes, polynucleotides, and the like to form a polypeptide, but transcription and production of mRNA may also be an embodiment of expression. More preferably, such polypeptide forms may be post-translationally processed.
  • Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one letter symbols recommended by the IUPAC — IUB Biochemica 1 Nomenclature Commission. Nucleotides can also be referred to by the generally accepted single letter code.
  • fragment refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n-1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length n). Say Chido.
  • the length of the fragment can be changed as appropriate according to its purpose. For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 in the case of a polypeptide. , 15, 2, 0, 25, 30, 40, 50 and more, and lengths expressed in integers not specifically listed here (for example, 11 etc.) are also suitable as lower limits. It can be.
  • nucleotides 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 600, 700, 800 900, 1000 and more nucleotides, and lengths expressed in integers, such as those specifically listed here (eg, 11 etc.) may also be appropriate as lower limits.
  • sugar chain refers to a compound obtained by linking one or more unit sugars (monosaccharide and Z or a derivative thereof). When two or more unit sugars are connected, each unit sugar is bonded by dehydration condensation using a glycosidic bond.
  • sugar chains include, for example, polysaccharides (glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylyldarcosamine, N-acetylgalatatosamine, sialic acid, and those contained in the living body.
  • Complex and derivatives as well as a wide range of sugar chains that are decomposed or derived from complex biomolecules such as degraded polysaccharides, glycoproteins, proteodaricans, glycosaminodarlicans, glycolipids, etc. Not limited to them. Therefore, in the present specification, the sugar chain can be used interchangeably with “polysaccharide”, “carbohydrate”, and “carbohydrate”. Further, unless otherwise specified, the “sugar chain” in the present specification includes both sugar chains and sugar chain-containing substances.
  • One amino acid can be replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still result in a protein having a similar biological function (eg, a protein equivalent in enzyme activity).
  • the hydrophobicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5. It is understood in the art that such substitution of amino acids based on hydrophobicity is efficient.
  • the hydrophilicity index is also considered in the production of variants. As described in US Pat. No.
  • hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid ( + 3.00 ⁇ ); glutamic acid (+ 3.0 ⁇ 1); serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (one 0.4); proline (one 0.5 ⁇ 1); alanine (one 0.5); histidine (one 0.5); cysteine (one 1.0); methionine (one 1.3); valine (-1.5); leucine (-1.8); isoleucine (1.8); tyrosine (-2. 3); ferrolanine (1-2. 5); and tryptophan (1-3.4).
  • an amino acid can be replaced with another that has a similar hydrophilicity index and can still provide a biological equivalent.
  • the hydrophilicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • conservative substitution means that the amino acid substitution is similar in the hydrophilicity index or Z and hydrophobicity index to the amino acid substituted with the original amino acid as described above. This refers to substitution.
  • conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within the following groups: arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; and palin, leucine, and isoleucine However, it is not limited to these.
  • variant refers to a substance in which a part of the original substance such as a polypeptide or polynucleotide has been changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. Alleles are genetic variants that belong to the same locus and are distinguished from each other. Therefore, an “allelic variant” refers to a variant that has an allelic relationship with a gene.
  • a “species homologue or homolog” is a homology (preferably at least 60% homology, more preferably at least 80%, at a certain amino acid level or nucleotide level within a species.
  • ortholog also called orthologous gene, refers to a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes. For example, taking the hemoglobin gene family with multiple gene structures as an example, human and mouse ⁇ -hemoglobin genes are orthologs. Human ⁇ -hemoglobin genes and / 3 hemoglobin genes are paralogs (genes generated by gene duplication). It is. Since orthologs are useful for the estimation of molecular phylogenetic trees, the orthologs of the present invention may also be useful in the present invention.
  • Constant (modified) variants applies to both amino acid and nucleic acid sequences.
  • Conservatively modified variants with respect to a particular nucleic acid sequence refer to nucleic acids that encode the same or essentially the same amino acid sequence, and are essential if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence. Refers to the same sequence.
  • the codons GCA, GCC, GCG, and GCU all encode the amino acid alanine. Therefore, alanine is At every position specified by a codon, the codon can be changed to any of the corresponding codons described without altering the encoded polypeptide.
  • This variation in nuclear acid is a “silent modification (mutation)” which is one species of conservatively modified mutations.
  • Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of that nucleic acid.
  • each codon in a nucleic acid except AUG, which is usually the only codon for methionine, and TGG, which is usually the only codon for tryptophan, produces a functionally identical molecule. It is understood that it can be modified.
  • each silent variation of a nucleic acid that encodes a polypeptide is implicit in each described sequence.
  • such modifications can be made to avoid substitution of cysteine, an amino acid that significantly affects the conformation of the polypeptide.
  • amino acid additions, deletions, or modifications are also made in order to produce a BAC vector containing a gene encoding a functionally equivalent polypeptide. It can be carried out.
  • Amino acid substitution refers to the substitution of one or more, for example, 1-10, preferably 1-5, more preferably 1-3 amino acids of the original peptide.
  • Addition of amino acids means adding one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids to the original peptide chain.
  • Deletion of amino acids refers to deletion of one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids from the original peptide.
  • Amino acid modifications include, but are not limited to, forces including amidation, carboxylation, sulfation, halogenation, alkylation, glycosylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation) and the like.
  • the amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid, an unnatural amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.
  • a nucleic acid form of a polypeptide refers to a nucleic acid molecule capable of expressing the protein form of the polypeptide. As long as the expressed polypeptide has substantially the same activity as the native polypeptide, a part of the nucleic acid sequence is deleted or substituted with other bases as described above. Alternatively, a part of other nucleic acid sequence may be inserted. Or other at the 5 'end and Z or 3' end Nucleic acids may be bound. Alternatively, it may be a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions to a gene encoding a polypeptide and encodes a polypeptide having substantially the same function as the polypeptide. Such genes are known in the art and can be used in the present invention.
  • Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method or chemically synthesized.
  • a site-specific displacement induction method, a hybridization method, or the like may be combined with these methods.
  • substitution, addition or deletion of a polypeptide or polynucleotide refers to an amino acid or its substitute, or nucleotide, respectively, relative to the original polypeptide or polynucleotide. Or its substitute power is replaced, added or removed.
  • substitution, addition, or deletion techniques are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques.
  • the number of substitutions, additions or deletions should be one or more, and any number will be sufficient as long as the desired function is maintained in the variant having the substitution, addition or deletion. be able to. For example, such a number can be 1 or several and preferably can be within 20%, within 10%, or less than 100, less than 50, less than 25, etc. of the total length .
  • Macromolecular structures can be described in terms of various levels of organization.
  • Alberts et al. Molecular Biology of the Cell (3rd edition, 1994), and Cantor and Schimmel, Biophysi cal Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980).
  • General molecular biology techniques that can be used in the present invention include Ausubel FA et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J et al. (1987) Molecular Cloning: A A person skilled in the art can easily carry out the operation with reference to Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, etc.
  • vector means the target polynucleotide. This refers to those capable of transferring a leotide sequence into a target cell. Examples of such vectors include prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, forces capable of autonomous replication in host cells such as individual animals and individual plants, or integration into chromosomes. And those containing a promoter at a position suitable for transcription of the polynucleotide of the present invention are exemplified.
  • a "BAC vector” is a plasmid created based on the F plasmid of E. coli, which stably holds and proliferates DNA fragments with a large size of about 3 OOkb or more in bacteria such as E. coli. Is a possible vector.
  • the BAC vector contains at least a region essential for replication of the BAC vector. Examples of the region essential for replication include oriS, which is the replication origin of F plasmid, or a variant thereof.
  • the “BAC vector sequence” refers to a sequence containing a sequence essential for the function as a BAC vector.
  • the BAC vector sequence may further comprise a “recombinant protein dependent recombination sequence” and a Z or “selectable marker”.
  • homologous recombination includes both “recombinant protein dependent recombination” and “recombinant protein independent recombination”. “Recombinant protein-dependent recombination” refers to homologous recombination that occurs in the presence of a recombinant protein but does not occur in the absence of the recombinant protein.
  • Recombinant protein-independent recombination refers to homologous recombination that occurs regardless of the presence or absence of a recombinant protein.
  • recombinant protein-dependent recombination sequence refers to a sequence that causes recombination protein-dependent recombination
  • recombinant protein-independent recombination sequence refers to a recombination protein-independent recombination sequence. This refers to a sequence that causes recombination.
  • Recombinant protein-dependent recombination sequences cause recombination in the presence of the recombinant protein, but not in the absence of the recombinant protein.
  • the recombinant protein preferably acts specifically on recombinant protein dependent recombinant sequences and does not act on sequences other than recombinant protein dependent recombinant sequences.
  • CM Control of directionality in the site-specific recombinatio n system of the Streptomyces phage C31., Molecular Microbiology (2000), 38 (2), 232—241.), Lysonorenase and res ⁇ M J. Bacteriol., February 1986; 165 (2) 341— 7) (Generally Sauer w. P., Site—specific recombinases: changing partners and doing the twist.
  • selection marker refers to a gene that functions as an indicator for selecting a host cell containing a BAC vector.
  • Selectable markers include, but are not limited to, fluorescent markers, luminescent markers, and drug selectable markers.
  • Fluorescent markers include, but are not limited to, the ability to include a gene encoding a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP).
  • Luminescent marker includes, but is not limited to, a gene encoding a photoprotein such as luciferase.
  • Drug selection markers include, but are not limited to, genes that encode proteins that are also selected for the following group forces: dihydrofolate reductase gene, glutamine synthetase gene, aspartate transaminase, Tarotonein (MT), adenosine deaminase (ADA), adenosine deaminase (A MPD1, 2), xanthine-guanine monophosphoribosyltransferase, UMP synthase, P-glycoprotein, asparagine synthetase, and or-tin decarboxylase.
  • DHFR dihydrofolate reductase gene
  • MTX methotrexate
  • GS glutamine synthetase
  • CAD aspartate transaminase
  • ADA adenosine deaminase
  • AMPD1 adenosine deaminase
  • an "expression vector” refers to a structural gene and a promoter that regulates its expression, in which various regulatory elements are ligated in such a way that they can operate in a host cell.
  • the regulatory element may preferably include a terminator, a selectable marker such as a drug resistance gene (eg, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, etc.) and an enhancer.
  • a drug resistance gene eg, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, etc.
  • an enhancer e.g, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, etc.
  • the type of expression vector of an organism eg, a plant
  • the type of regulatory elements used can vary depending on the host cell.
  • the plant expression vector used in the present invention may further have a T-DNA region. The T-DNA region increases the efficiency of gene transfer, especially when transforming the plant with agrobacterium.
  • recombinant vector refers to a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence into a target cell.
  • Such vectors can be autonomously replicated in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, individual animals and individual plants, or can be integrated into chromosomes. Examples include those containing a promoter at a position suitable for polynucleotide transcription.
  • Terminator 1 is a sequence that is located downstream of a region encoding a protein of a gene, and is involved in termination of transcription when DNA is transcribed into mRNA and addition of a poly A sequence. Terminator is involved in mRNA stability and affects gene expression level. It has been known. Examples of the terminator include, but are not limited to, a CaMV35S terminator, a nopaline synthase gene terminator (Tnos), and a tobacco PRla gene terminator.
  • promoter refers to a region in the ORF of DNA that determines the initiation site of gene transcription and directly regulates its frequency, and to which RNA polymerase binds.
  • the putative promoter region varies for each structural gene, but is usually upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be downstream of the structural gene. Preferably, the putative promoter region is present within about 2 kbp upstream from the first exon translation start point.
  • expression of the promoter of the present invention as "constitutive” means that all the yarns and weaves of a living organism are in the stage of development of the living organism! However, it refers to a property that is expressed in an almost constant amount. Specifically, when Northern plot analysis is performed under the same conditions as in the examples of the present specification, for example, it is the same at any point in time (for example, two or more points (for example, day 5 and day 15)). Alternatively, when almost the same level of expression is observed in any of the corresponding sites, the expression is constitutive by the definition of the present invention. Constitutive promoters are thought to play a role in maintaining homeostasis of organisms in normal growth environments. These properties can be determined by extracting any partial RNA of the organism and analyzing the expression level by Northern plot analysis or quantifying the expressed protein by Western plot.
  • Ennno, nsaichi can be used to increase the expression efficiency of a target gene.
  • the enzyme sequence is preferably an enzyme sequence region containing an upstream sequence in the SV40 promoter.
  • a plurality of sensors can be used, but one may or may not be used.
  • operably linked refers to a transcriptional translational regulatory sequence (eg, promoter, enhancer, etc.) that has expression (operation) of a desired sequence. Alternatively, it is arranged under the control of a translational regulatory sequence.
  • a transcriptional translational regulatory sequence eg, promoter, enhancer, etc.
  • the force with which the promoter is usually placed immediately upstream of the gene does not necessarily have to be placed adjacent.
  • transformation When used in the present invention, the terms “transformation”, “transduction” and “transfusion” are used interchangeably unless otherwise stated, and mean the introduction of a nucleic acid into a host cell. Any transformation method can be used as long as it is a method for introducing DNA into a host cell. For example, various well-known methods such as an electopore method, a method using a particle gun (gene gun), a calcium phosphate method, etc. Technology.
  • Transformant refers to all or part of a living organism such as a cell produced by transformation. Examples of the transformant include prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells and the like. A transformant is also referred to as a transformed cell, a transformed tissue, a transformed host, etc., depending on the subject, and encompasses all of these forms in this specification, but is specific in a particular context. Can refer to form.
  • prokaryotic cells include prokaryotic cells belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Syudomonas, etc., such as Escherichia coll XL 1-Blue, Escherichia coll XL2—Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY327
  • Animal cells include human 'MRC-5 cells, human' HEL cells, human 'WI-38 cells, mouse' myeloma cells, rat 'myeloma cells, human' myeloma cells, mouse 'cells, hybridoma cells, and Chinese.
  • Examples include CHO cells, BHK cells, African green kidney cells, human leukemia cells, HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299), and human colorectal cancer cell lines.
  • Mouse 'myeloma cells such as ps20, NSO, rat' myeloma cells such as YB2Z0, human fetal kidney cells such as HEK293 (ATCC: CRL-1573), human leukemia cells such as BALL-1 and Africa
  • human monkey kidney cells include COS-1, COS-7, and Vero cells
  • human colon cancer cell lines include HCT-15.
  • animal is used in the broadest sense in the art, and includes vertebrates and invertebrates. Examples of animals include, but are not limited to, mammals, birds, reptiles, amphibians, fishes, worms and worms.
  • tissue of an organism refers to a population of cells having a certain similar action in the population.
  • a tissue can be a part of an organ.
  • organ organ
  • cells there are many cells having the same function, but there are also cases where slightly different functions are mixed, so in this specification, as long as the tissue shares certain characteristics, You can have a mix of cells.
  • organ means a structure having one independent form, and a structure having one or more kinds of tissues combined to perform a specific function.
  • the plant include, but are not limited to, callus, root, stem, stem, leaf, flower, seed, germ, embryo, and fruit.
  • animals include stomach, liver, intestine, spleen, lung, trachea, nose, heart, artery, vein, lymph node (lymphatic system), thymus, ovary, eye, ear, tongue, and skin. It is not limited.
  • transgene refers to an organism that incorporates a specific gene into an organism or an organism (eg, a plant or animal (such as a mouse)) into which such a gene has been incorporated. Say.
  • the transgenic organism is a microinjection method (microinjection method), a viral vector method, an ES cell method (embryonic stem cell method), or a sperm vector method. It can be produced using a technique for producing a transgenic animal using a method for introducing a chromosome fragment (transzomic method), an episome method, or the like. Techniques for producing such transgenic animals are well known in the art.
  • screening refers to a number of candidates for a substance having a specific property of interest, or a host cell or virus, etc., in a specific operation and Z or evaluation method. It means selecting power. In the present invention, it is understood that viruses obtained by screening having a desired activity are also included within the scope of the present invention.
  • chip or “microchip” is used interchangeably and refers to a micro integrated circuit that has various functions and becomes a part of a system.
  • the chip include, but are not limited to, a DNA chip, a protein chip, and a cell chip.
  • the term "array” refers to a pattern or pattern in which a composition (eg, DNA, protein, cell) containing one or more (eg, 1000 or more) target substances is arranged and arranged.
  • a substrate for example, a chip
  • An array that is patterned on a small substrate eg, 10 ⁇ 10 mm
  • a microarray and an array are used interchangeably. Therefore, even a pattern that is larger than the above-mentioned substrate is sometimes called a microarray.
  • an array is composed of a desired set of cells that are themselves immobilized on a solid surface or membrane.
  • the array preferably comprises at least 10 2 cells containing the same or different viruses, more preferably at least 10 3 , and even more preferably at least 10 4 , even more preferably at least 10 5 . These cells are preferably placed on a surface of 125 ⁇ 80 mm, more preferably 10 ⁇ 10 mm. Formats from the size of microtiter plates such as 96-well microtiter plates and 384-well microtiter plates to sizes as large as glass slides are contemplated.
  • the composition containing the target substance to be immobilized may be one kind or plural kinds. The number of such types can be any number from 1 to the number of spots. For example, a composition containing about 10, about 100, about 500, and about 1000 target substances can be immobilized.
  • target substances eg, biomolecules such as cells
  • a solid surface or membrane such as a substrate as described above, but typically 10 8 per substrate.
  • up to 10 biomolecules in other embodiments up to 10 7 biomolecules, up to 10 6 biomolecules, up to 10 5 biomolecules, up to 10 4 biomolecules, up to 10 3 biomolecules
  • up to 10 2 biomolecules can be arranged, but a composition containing a target substance exceeding 10 8 biomolecules may be arranged. In these cases, the size of the substrate is preferably smaller.
  • the spot size of a composition (eg, a cell) containing a target substance can be as small as the size of a single biomolecule (this can be on the order of l-2 nm).
  • the minimum substrate area is determined in some cases by the number of biomolecules on the substrate.
  • spots of biomolecules may be placed on the array.
  • spot refers to a certain set of compositions containing a target substance.
  • spotting refers to producing a spot of a composition containing a certain target substance on a certain substrate or plate. Spotting can be done by any method, for example, it can be accomplished by pipetting or the like, or it can be done by automated equipment, such methods are well known in the art.
  • the term "address” refers to a unique location on a substrate and may be distinguishable from other unique locations.
  • the address is suitable for associating with a spot with that address, and the entity at every address can take an arbitrary shape so that the entity forces at other addresses can also be identified (eg, optical). obtain.
  • the shape defining the address can be, for example, a force that can be circular, elliptical, square, rectangular, or an irregular shape. Therefore, “address” indicates an abstract concept, and “spot” can be used to indicate a specific concept, but when it is not necessary to distinguish between the two, And “spot” can be used interchangeably.
  • the size defining each address includes, among other things, the size of the substrate, the number of addresses on a particular substrate, the amount of the composition containing the target substance and z or the available reagents, the size of the microparticles and the It depends on the degree of resolution required for any method in which the array is used.
  • the magnitude can be, for example, a force of 1-2 nm force in the range of several centimeters. Any size that matches can be used.
  • the spatial arrangement and shape defining the address is designed to suit the particular application in which the microarray is used. Addresses can be densely arranged, can be widely distributed, or can be subgrouped into a desired pattern appropriate for a particular type of analyte.
  • support refers to a substance capable of carrying cells, bacteria, viruses, polynucleotides or polypeptides.
  • the support material can be either covalently bonded or non-covalently bonded, and can be derivatized to have such a property that has the property of binding to cells etc. used in the present invention. Solid materials.
  • the material for use as a support may be any material that can form a solid surface.
  • Natural and synthetic polymers eg, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon
  • the support includes a moiety that performs hydrophobic bonding.
  • the support may be formed of a plurality of layers of different materials.
  • inorganic materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride can be used.
  • Organic materials such as silicone resin, polyphenylene oxide, and polysulfone can be used.
  • a membrane used for blotting such as a nitrocellulose membrane or PVDF membrane, can also be used as the support.
  • the varicella-zoster virus of the present invention can also be used as a component of a pharmaceutical composition for the treatment, prevention, and Z or treatment of infectious diseases.
  • an "effective amount" of a drug means that the drug exhibits the intended drug effect.
  • the minimum concentration may be referred to as the minimum effective amount.
  • Such minimum effective amounts are well known in the art, and usually the minimum effective amount of a drug can be determined by those skilled in the art or determined by those skilled in the art. In order to determine such an effective amount, in addition to actual administration, an animal model or the like can be used. The present invention is also useful in determining such effective amounts.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to a substance that is used in the production of agricultural chemicals such as pharmaceuticals or veterinary drugs, and does not adversely affect active ingredients.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers include, for example, but are not limited to: antioxidants, preservatives, colorants, flavors, and diluents, emulsifying agents, suspending agents, Solvents, fillers, bulking agents, buffers, delivery vehicles, excipients, and Z or agricultural or pharmaceutical adjuvants.
  • the type and amount of the drug used in the treatment method of the present invention is determined based on the information obtained by the method of the present invention (for example, information on a disease), the purpose of use, the target disease (type, It can be easily determined by those skilled in the art in view of the patient's age, weight, sex, medical history, the shape or type of the site of the subject to be administered, and the like.
  • the frequency with which the monitoring method of the present invention is applied to a subject (or patient) also depends on the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, sex, medical history, and treatment course. This can be easily determined by those skilled in the art.
  • the frequency of monitoring the disease state includes, for example, monitoring once every few months every day (for example, once a week, once a month). It is preferable to perform monitoring once a week, once a month, while monitoring the progress.
  • instruction describes the treatment method of the present invention to a person who administers a doctor or patient.
  • This instruction describes a word indicating that the medicine of the present invention is administered, for example, immediately after radiation therapy or immediately before (for example, within 24 hours).
  • This instruction is prepared in accordance with the format prescribed by the national regulatory authority (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan and the Food and Drug Administration (FDA) in the United States) in the country where the present invention is implemented. It will be clearly stated that it has been approved.
  • the instructions are Iw A package insert, usually provided in paper, but not limited to it, for example, in the form of electronic media (for example, a homepage or e-mail provided on the Internet) Can be done.
  • two or more drugs may be used in the treatment of the present invention.
  • drugs of similar nature or origin may be used, or drugs of different nature or origin may be used.
  • Information regarding disease levels for methods of administering two or more such drugs can also be obtained by the methods of the present invention.
  • the analysis results of a specific sugar chain structure and the disease level are correlated with respect to V, an organism of a similar kind (for example, mouse against human), cultured cells, tissues, and the like.
  • V an organism of a similar kind
  • cultured cells for example, mouse against human
  • tissues for example, cultured cells
  • the analysis result of the corresponding sugar chain structure can be correlated with the disease level.
  • Such matters are described and supported by, for example, animal cell culture manual, edited by Seno et al., Kyoritsu Shuppan, 1993, etc., and this description is incorporated herein by reference in its entirety.
  • the present invention provides a recombinant varicella-zoster virus.
  • the varicella-zoster virus contains a BAC vector sequence in its genomic sequence.
  • the BAC vector sequence used is preferably a force containing a replication origin derived from the F plasmid.
  • a sequence other than the replication origin derived from the F plasmid may be a sequence of 300 kb or more as a bacterial artificial chromosome in bacterial cells. Any origin of replication can be used as long as it can be maintained and propagated.
  • the BAC vectors of the invention can be maintained and Z or amplified in bacterial host cells, preferably E. coli cells.
  • a portion of this BAC vector is inserted into a non-essential region of the varicella-zoster virus genome, allowing manipulation as a BAC containing the varicella-zoster virus genome.
  • BAC containing this varicella-zoster virus genome can produce and propagate recombinant varicella-zoster virus when introduced into mammalian cells.
  • a recombinant varicella-zoster virus host cell any mammalian cell capable of growing a wild-type varicella-zoster virus strain can be used.
  • the host cell is derived from a human and includes, but is not limited to, human 'MRC-5 cells, human' HEL cells, and human 'WI-38 cells.
  • the BAC of the present invention may contain a gene encoding any antigen protein other than the protein encoded by the varicella-zoster virus genome.
  • the antigenic protein is not limited, but is preferably a protein of a virus other than varicella-zoster virus.
  • viruses other than the varicella-zoster virus from which the antigenic protein is derived include, for example, mumps virus, measles virus, rubella virus, West Nile virus, influenza virus, SARS coronal virus, and Japanese encephalitis virus group. But is not limited to these.
  • the virus other than varicella-zoster virus includes, but is not limited to, a virus selected from the group force consisting of mumps virus, measles virus, and rubella virus.
  • a single BAC vector containing the varicella-zoster virus genome includes the mumps virus gene, the measles virus gene, and the rubella virus gene.
  • mumps The viral gene is selected from the group consisting of HN gene, F gene, and N gene.
  • the measles virus gene is selected from the group consisting of the H gene, the F gene, and the N gene.
  • the rubella virus gene is selected from the group consisting of C gene, E1 gene, and E2 gene.
  • the influenza virus gene is the HA gene.
  • the SARS coronavirus gene is the S (spike) gene.
  • the West Nile virus gene is selected from the group consisting of Pr gene and E gene.
  • the Japanese encephalitis virus gene is selected from the group consisting of Pr gene and E gene. Since the genes of these viruses are known, those skilled in the art can isolate the genes of these viruses using well-known techniques such as the PCR method and the hybridization method.
  • BAC vector containing the varicella-zoster virus genome using the varicella-zoster virus genome and the BAC vector
  • various well-known methods such as a method using homologous recombination can be used. .
  • Examples of the method using homologous recombination include a method using a nucleic acid having a circular BAC vector sequence linked to a sequence homologous to the varicella-zoster virus genome.
  • a method for producing a BAC vector containing a varicella-zoster virus genome using a nucleic acid having a circular BAC vector sequence linked to a sequence homologous to the varicella-zoster virus genome is typically (1) the nucleic acid. Together with the varicella-zoster virus genome, and (2) culturing the host cell, homologous sequence linked to the circular BAC vector sequence, and varicella-zoster (3) Select a host cell containing the varicella-zoster virus genomic sequence incorporating the BAC vector sequence generated by this homologous recombination, and (4) the host It includes the step of culturing the cells and extracting the circular viral DNA.
  • a restriction enzyme fragment of a nucleic acid without using homologous recombination is used.
  • Various known methods can also be used.
  • Non-introduction to introduce BAC vector sequences in the varicella-zoster virus genome The mandatory area is selected from the group consisting of the following areas:
  • the region within the ORF of gene 13, the region within the ORF of gene 56, the region within the ORF of gene 57, the region within the ORF of gene 58, the region adjacent to the ORF of gene 11, and the ORF of gene 12 The region, the region adjacent to the ORF of gene 13, the region adjacent to the ORF of gene 56, the region adjacent to the ORF of gene 57, the region adjacent to the ORF of gene 58, and the continuous region of genes 56, 57, 58 .
  • the non-essential region includes a region within the ORF of gene 13, a region within the ORF of gene 56, a region within the ORF of gene 57, a region within the ORF of gene 58, and an OR F of gene 13.
  • the continuous region of gene 13, gene 56 and gene 58, gene 56, 57, 58 does not affect the growth of the virus even if it is deleted on the varicella-zoster virus genome. It is the power that became.
  • BAC vector sequence is inserted into a region within the ORF of gene 62 of the varicella-zoster virus genome!
  • the BAC vector sequence used in the present invention preferably comprises a recombinant protein dependent recombinant sequence and a Z or selectable marker.
  • the selectable marker sequence is a drug selectable marker and a gene encoding Z or green fluorescent protein. This is because the presence of a desired gene can be easily confirmed.
  • the varicella-zoster virus used as a starting material in the present invention may be derived from a wild strain or a mutant strain.
  • the varicella-zoster virus as a starting material is an attenuated virus, such as the Oka vaccine strain or the varicella-zoster virus having a mutation in gene 62.
  • Attenuated varicella-zoster virus includes viruses with one or more mutations of gene 62 selected from the following group power selection:
  • Base 1251 is G;
  • a vector used for producing the virus and a method for producing the virus are also provided.
  • pharmaceutical compositions comprising the above viruses and pharmaceutical compositions in the form of vaccines.
  • the recombinant varicella-zoster virus of the present specification is useful as a vaccine. This is because it has the power to include many proteins having the same structure as the wild-type virus.
  • a method for introducing a mutation into a vector for producing the vaccine of the present invention comprises the following steps: introducing the vector into a bacterial host cell; introducing a plasmid vector containing a fragment of the varicella-zoster virus genome into the bacterial host cell. Wherein the fragment has at least one mutation; culturing the bacterial host cell; isolating a vector having a BAC vector sequence from the cultured bacterial host cell.
  • homologous recombination occurs between a vector for producing the vaccine of the present invention and a plasmid vector containing a fragment consisting of a portion of the varicella-zoster virus genome in a bacterial host cell.
  • the vector force for producing the vaccine of the present invention a change on the fragment that is part of the varicella-zoster virus genome. Have a difference.
  • various well-known methods such as electoporation can be used as the step of introducing a vector into a bacterial host cell.
  • a plasmid vector containing a fragment that is a part of the varicella-zoster virus genome can be introduced into a bacterial host cell.
  • a method for introducing mutation into this fragment a method of introducing mutation using PCR is well known.
  • a thermostable polymerase that does not have a proofreading function and uses one of four nucleotides under a condition is used. It is possible to introduce mutations at random. It is also possible to introduce a desired mutation at a desired position by performing PCR using a primer having a mutated base sequence.
  • BAC vector sequences By culturing these bacterial cells, homologous recombination occurs between the vector for producing the vaccine of the present invention and a plasmid vector containing a fragment consisting of a portion of the varicella-zoster virus genome, and as a result, the present invention.
  • Bacterial Host Cell Power Various well-known methods such as the alkaline method and commercially available kits can be used to prepare BAC vector sequences.
  • a further method for introducing a mutation into the vector for producing the vaccine of the present invention comprises the following steps: introducing the vector into a bacterial host cell; introducing a first plasmid vector comprising a first fragment that is a part of the varicella-zoster virus genome into the bacterial host cell. Wherein the first fragment has at least one mutation; a step; a second plasmid vector comprising a second fragment that is part of the varicella-zoster virus genome is introduced into the bacterial host cell. Introducing the step, wherein the second fragment has at least one variation, and the second fragment is different from the first fragment; culturing the bacterial host cell A step; isolating a vector having a BAC vector sequence from the cultured bacterial host cell.
  • nucleic acid cassette that can be used to produce the vaccine of the present invention.
  • This nucleic acid cassette is preferably the first fragment capable of homologous recombination with the varicella-zoster virus genome in bacterial cells, the BAC vector sequence And a nucleic acid cassette comprising a second fragment capable of homologous recombination with the varicella-zoster virus genome in a bacterial cell, wherein each end of the BAC sequence is a first fragment, respectively. And is linked to the second fragment.
  • the first fragment and the second fragment are preferably at least lkb, at least 1.5 kb and at least 2 kb.
  • the first and second fragments are preferably at least 80% identical, at least 85% identical, at least 90% identical, at least 95% identical to the sequence of the varicella-zoster virus genome.
  • the first and second fragments are each independently derived from a region selected from the group consisting of the following regions of the varicella-zoster virus genome, or a group force consisting of the following regions is also selected: Is at least 80%, 85%, 90%, 95% identical to the region to be expressed: the region within the ORF of gene 13, the region within the ORF of gene 56, the region within the ORF of gene 57, and within the ORF of gene 58 A region adjacent to the ORF of gene 11, a region adjacent to the ORF of gene 12, a region adjacent to the ORF of gene 13, a region adjacent to the ORF of gene 56, a region adjacent to the ORF of gene 57, and , The region adjacent to the ORF of gene 58.
  • the first and second fragments are derived from different regions of the varicella-zoster virus genome.
  • the first and second fragments are each independently a region within the ORF of gene 13, a region within the ORF of gene 56, a region within the ORF of gene 57, a region within the ORF of gene 58, and the region of gene 11.
  • the region adjacent to the ORF, the region adjacent to the ORF of gene 12, the region adjacent to the ORF of gene 13, the region adjacent to the ORF of gene 56, the region adjacent to the ORF of gene 57, and the ORF of gene 58 It may be derived from the area to be.
  • the BAC vector sequence includes a recombinant protein dependent recombination sequence and a Z or selectable marker.
  • This selectable marker may be a drug selectable marker or a gene encoding a fluorescent protein such as Darin fluorescent protein.
  • this BAC vector sequence has the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • Type varicella-zoster virus can be easily prepared.
  • Such mutagenesis can be performed, for example, using the following method:
  • a VZV-BAC-DNA plasmid Into E. coli, (a) a VZV-BAC-DNA plasmid, and (b) a shuttle vector or PCR product having a partial sequence of the varicella-zoster virus genome having any mutation as a mutant nucleic acid are introduced. Mutations can be introduced into the VZV-BAC-DNA plasmid by recombination between the VZV-BAC-DNA plasmid and its mutant nucleic acid. It is also possible to introduce mutations at random by using a transposon. The VZV-BAC-DNA plasmid into which the mutation has been introduced can be easily selected and amplified in E. coli. Recombinant varicella-zoster virus can be obtained by producing a virus from VZV-BAC-DNA having a mutation (Markus Wagner TRENDS in Microbilogy Vol. 10, No. 7, 2002 7 Moon). Specific examples are listed below:
  • the shuttle vector and the VZV-BAC-DNA plasmid are recombined via the first homologous region, resulting in a co-insert with the shuttle vector and the VZV-BAC-DNA plasmid linked.
  • the shuttle plasmid is then removed because the replication origin of the shuttle vector is temperature sensitive.
  • the co-inserted part is removed. If the second recombination event occurs through the first homologous region, a plasmid is generated having the same sequence as the VZV-BAC DNA used for recombination.
  • a mutant VZV-BAC-DNA plasmid having a mutation on the shuttle vector is obtained. It is done. If the first homologous region and the second homologous region are approximately the same length, the probability that the second recombination event will occur in the second homologous region is that the second recombination event is the first homologous Probability that occurs in the region is almost the same. Therefore, about one-half of the VZV-BAC-DNA plasmid obtained has the same sequence as the one used for thread replacement, and about one-half of the plasmid has the mutation introduced into the shuttle vector. It is.
  • Circular VZV BAC— Introduces mutations into DNA molecules. Specifically, a linear DNA fragment containing a selectable marker adjacent to the target sequence and a homologous sequence is introduced into E. coli capable of causing homologous recombination together with VZV-BAC-DNA. In order to avoid degradation of linear DNA in E. coli, it is necessary to use E. coli deficient in E.
  • Linear DNA has regions homologous to the VZV-BAC-DNA plasmid at both ends. By producing homologous recombination through the homologous region, the desired sequence within the linear DNA fragment can be introduced into VZV-BAC DNA. When using recET or red8 j8 recombination functions, these recombination functions result in homologous recombination with homologous sequences as long as 25-50 nucleotides, which is more than recA-mediated homologous recombination. Can be used conveniently.
  • the transposon element is used to insert randomly into nucleic acids in E. coli. For example, by introducing a transposon element and VZV—BAC—DNA into E. coli, and inserting the transposon element randomly into VZV—BAC DNA, an insertion mutation is generated.
  • host cells with a thread-and-change varicella-zoster virus such as VZV-BAC-DNA itself can be treated by treatment with a mutagen (eg, nitrosoguanidine). It is also possible to introduce random mutations in the varicella-zoster virus genome.
  • a mutagen eg, nitrosoguanidine
  • the invention also provides a method for the treatment and Z or prevention of a disease or disorder (eg, infection) by inoculation with an effective amount of a therapeutic agent 'administration of a prophylactic agent to a subject'.
  • Therapeutic agent'prevention agent means a composition of the present invention in combination with a pharmaceutically acceptable carrier type (eg, a sterile carrier).
  • Therapeutic agent 'prophylactic agent is applied to the clinical status of the individual patient (especially the therapeutic agent Effects), delivery site, administration method, dosing schedule, and other factors known to those of skill in the art, and are formulated and administered in a manner that complies with good medical practice (GMP). Therefore, the target “effective amount” in this specification is determined based on such consideration.
  • the total pharmaceutically effective amount of therapeutic and prophylactic agents administered parenterally per dose is in the range of about 1 g / kg / day to LOmgZkgZ days of patient weight However, as noted above, this is left to therapeutic discretion. More preferably, for the cell bioactive agent of the present invention, this dose is at least 0. OlmgZkgZ days, most preferably between about 0. OlmgZkgZ days and about lmgZkgZ days for humans.
  • the therapeutic agent 'preventive agent When administered continuously, typically the therapeutic agent 'preventive agent is injected 1 to 4 times a day at a dosage rate of about 1 ⁇ g ZkgZ time to about 50; ⁇ gZkgZ time or continuous subcutaneous infusion (e.g., using a minipump). To be administered). Intravenous bag solutions may also be used. The duration of treatment required to observe the change and the post-treatment interval at which a response occurs will vary depending on the desired effect.
  • Therapeutic agents Preventive agents, oral, rectal, parenteral, intmcistemally, vaginal, intraperitoneal, topical (such as by powders, ointments, gels, drops, or transdermal patches) ), Administered by mouth or as an oral or nasal spray.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to a non-toxic solid, semi-solid or liquid filler, diluent, encapsulant or any type of formulation adjuvant.
  • parenteral refers to modes of administration including intravenous and intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intraarticular injections and infusions.
  • the therapeutic / prophylactic agent of the present invention is also appropriately administered by a sustained release system.
  • Sustained release therapeutics • Suitable examples of preventives are oral, rectal, parenteral, intmcistemally, vaginal, intraperitoneal, topical (powder, ointment, gel, infusion, or transdermal Can be administered by mouth, orally or as a nasal spray.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to a non-toxic solid, semi-solid or liquid filler, diluent, encapsulant or any type of formulation adjuvant.
  • the term “parenteral” refers to modes of administration including intravenous and intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intraarticular injections and infusions.
  • the therapeutic agent'preventive agent is generally a pharmaceutically acceptable carrier, ie, dosage and concentration used, in the desired degree of purity.
  • a unit dosage form of an injectable form solution, suspension or emulsion
  • the formulation preferably contains no other compounds known to be harmful to oxidation and therapeutic / preventive agents.
  • a formulation is prepared by contacting the therapeutic / prophylactic agent uniformly and intimately with a liquid carrier or a finely divided solid carrier or both.
  • the product is then shaped into the desired formulation, if necessary.
  • the carrier is a parenteral carrier, more preferably a solution that is isotonic with the blood of the recipient.
  • carrier vehicles include water, saline, Ringer's solution, and dextrose solution.
  • Non-aqueous vehicles such as non-volatile oils and ethyl oleate are also useful herein as well as ribosomes.
  • the carrier suitably contains minor amounts of additives such as substances that enhance isotonicity and chemical stability. Such substances are not toxic to recipients at the dosages and concentrations used, such as phosphates, succinates, succinates, acetic acid and other organic acids or their salts.
  • a buffer such as ascorbic acid; a low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide (eg, polyarginine or tripeptide); a protein such as serum albumin, gelatin or immunoglobulin; Hydrophilic polymers such as: amino acids such as glycine, glutamic acid, aspartic acid or arginine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including cellulose or its derivatives, glucose, mannose or dextrin; chelating agents such as EDTA Sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; Counterions such as sodium; and Z or polysorbate, nonionic surfactants such as poloxamers or PEG is exemplified et be.
  • an antioxidant such as ascorbic acid
  • a low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide eg, polyarginine or tripeptide
  • a protein such as serum albumin, gelatin or immunoglobulin
  • Hydrophilic polymers such as
  • Any drug to be used for therapeutic administration may be in a state free of organisms other than viruses as active ingredients, ie, in a sterile state. Aseptic conditions are easily achieved by filtration through sterile filtration membranes (eg, 0.2 micron membranes).
  • the therapeutic agent 'preventive agent is placed in a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial with a stopper that can be punctured with a hypodermic needle.
  • Therapeutic agents-Preventive agents are usually stored in unit dose or multi-dose containers, such as sealed ampoules or vials, as aqueous solutions or lyophilized formulations for reconstitution.
  • a lyophilized formulation a 10 ml vial is filled with sterile filtered 1% (WZV) therapeutic agent • 5 ml of an aqueous prophylactic agent solution and the resulting mixture is lyophilized. Reconstitute the freeze-dried therapeutic / preventive agent with bacteriostatic water for injection to prepare an infusion solution.
  • WZV sterile filtered 1%
  • the present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the therapeutic agent / prophylactic agent of the present invention.
  • a notice in the form of a government agency that regulates the manufacture, use or sale of a pharmaceutical or biological product may be attached to such a container, which notice relates to the manufacture, use or sale for human administration. Represents approval by a government agency.
  • therapeutic / prophylactic agents may be used in combination with other therapeutic compounds.
  • the therapeutic agent / prophylactic agent of the present invention can be administered alone or in combination with other therapeutic agents / prophylactic agents.
  • Preventive agents include chemotherapeutic agents, antibiotics, steroids and non-steroidal anti-inflammatory agents, conventional immune therapeutic agents' preventive agents, etc. Site power in and Z or growth factors, but are not limited to these.
  • the combination can be administered, for example, simultaneously as a mixture; simultaneously or concurrently but separately; or over time. This presents the indication that the combined drugs are administered together as a therapeutic mixture, and also the procedure in which the combined drugs are administered separately but simultaneously, for example through separate intravenous lines to the same individual.
  • Including. Administration in combination further includes separate administration of one of the compounds or agents given first, followed by the second.
  • the therapeutic agent 'preventive agent of the invention is administered in combination with an antiretroviral agent, a nucleoside reverse transcriptase inhibitor, a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor, and Z or a protease inhibitor. Is done.
  • the therapeutic agent 'prophylactic agent of the invention is administered in combination with an antibiotic.
  • Antibiotics that can be used include aminoglycoside antibiotics and polyenes Examples include, but are not limited to, antibiotics, penicillin antibiotics, cefme antibiotics, peptide antibiotics, macrolide antibiotics, and tetracycline antibiotics.
  • the therapeutic agent 'preventive agent of the invention is administered alone or in combination with an anti-inflammatory agent.
  • Anti-inflammatory agents that can be administered together with the therapeutic agent / preventive agent of the present invention include darcocorticoids and non-steroidal anti-inflammatory agents, aminoarylcarboxylic acid derivatives, allylacetic acid derivatives, allylbutyric acid derivatives, allylcarboxylic acid, allylpropionic acid.
  • Derivatives pyrazoles, pyrazolones, salicylic acid derivatives, thiazinecarboxamides, e-acetamidocaproic acid, S-adenosylmethionine, 3-amino-4-hydroxybutyric acid, amixetrine, bendazac, benzidoamine, bucolome, difenpi Powers including ramid, ditazole, emorfazone, guaiazulene, nabumetone, nimesulide, orgothein, oxaseprol, paradiline, perizoxal, pifoxime, prochiazone, proxazole, and tenidap It is not limited to these.
  • the therapeutic agents' prophylactic agents of the invention are administered in combination with other therapeutic or prophylactic regimes (eg, radiation therapy).
  • Example 1 Selection of region (gene) to insert BAC vector
  • the knockout vector was constructed by ligating the sequence of the gene targeted for knockout to both ends of the kanamycin gene in the same direction as the orientation of the target gene in the genome. This knockout vector was introduced into the E. coli that retained the P—Oka strain VZV—BAC—DNA, and homologous recombination was caused between the knockout vector and the P-Oka strain VZV—BAC-DNA. The target gene was knocked out.
  • plaque size of gene 56-deficient P-Oka was compared with that of P-Oka. Plaque size when 5 cells were infected was slightly smaller than when other non-essential genes were deleted, but there was no significant difference.
  • genes 13 and 57 which were considered to be essential genes
  • genes 56 and 58 were non-essential genes, and it was found that virus propagation was not affected by knockout. .
  • gene 58 was not affected by virus growth, even if it was deleted.
  • gene 56, and gene 58 especially 56 to gene 58, continuous region force knockout and insertion sites for foreign sequences (eg, gene sequences encoding BAC vector sequences and other antigens) It turned out to be a suitable gene.
  • Example 1 since it was found that gene 13 is an appropriate gene for knockout and insertion of Z or foreign sequences, the multivalent gene by inserting the Mumps virus HN gene into the ORF of gene 13 The vaccine was manufactured.
  • the HN gene and F gene of Mumbus virus were amplified from the Iwasaki strain, which is an epidemic strain, using PCR. Analysis of the amino acid sequences of the F gene and HN gene of the clawed Iwasaki strain showed that the F gene showed a relatively high degree of homology with field strains and vaccine strains (> 98.5%), but the HN gene was 1990. It was highly homologous to field strains in the latter half of the 1990s and low in homology with field strains and vaccine strains before the early 1990s (approximately 96%).
  • a human cytomegalovirus (CMV) promoter Z enhancer sequence was operably linked upstream of the cloned gene. Plasmids using the HN gene and the F gene were named pDEST26ZMeV—HN and pDEST26ZMeV—F, respectively.
  • the human cytomegalovirus promoter Z enhancer sequence has an NF- ⁇ B binding site, an AP-1 binding site, and a TATA box ( Figure 1).
  • pDEST26ZMeV-F and pDEST26ZMeV-HN were transfected into 293 cells and reacted with several types of anti-MeV antibodies by the fluorescent antibody method. As a result, 293 cells transfected with pDEST2 6ZMeV-F did not react with any antibody. P DEST26ZMeV-HN transfected cells contained several anti-MeV antibodies (including antibodies with neutralizing activity). ).
  • Nucleus combining this mumps virus HN gene and CMV promoter Z-enhancer A vector was prepared by linking upstream and downstream of gene 13 at both ends of the acid sequence (base number is the base number in P-Oka. In the case of the Dumas strain shown in SEQ ID NO: 4, 17037 ⁇ Corresponding to 18440 and 19347-20350;). This vector was introduced into Escherichia coli holding P—Oka strain VZV—BAC—DNA, causing homologous recombination between the vector and P—Oka strain VZV—BAC—DNA, and the ORF of gene 13 Then, the homologous thread was replaced with the linking sequence of the mumps HN gene and the CMV promoter Zenhansa (Fig. 2). The occurrence of homologous recombination was confirmed by PCR and restriction enzyme digestion.
  • the BAC vector produced by homologous recombination was transfected into MRC-5 cells by electoporation.
  • the plaque size of the transfected cells was the same as when the virus was used without disrupting gene 13.
  • FITC-labeled anti-mumps virus HN protein antibody mouse immunoglobulin ZFITC cap F (ab,) 2, DakoCy tomation Denmark A / S, neurosciencesvej 42, DK— 2600 Glostrup, Denmark
  • Alexa594-labeled anti-mumps virus HN protein antibody Alexa Flour® 594, F (ab,) 2 fragment of goat anti-mouse IgG (H + L)
  • Molec ular Probes mvitrogen detection technologies Eugene, Oregon, U.S.A.
  • a multivalent vaccine against both varicella-zoster virus and mumps virus could be easily produced without inhibiting the growth of the virus.
  • a mutant recombinant varicella-zoster virus can be prepared, and a pathogenic weakly varicella-zoster virus strain can be obtained from the mutant virus.
  • Examples of methods for preparing mutant recombinant varicella-zoster virus include mutant genes A method of preparing a mutant recombinant varicella-zoster virus by causing homologous recombination between the nucleic acid contained and the VZV-BAC-DNA plasmid. VZV-BAC
  • Mutant genes used for homologous recombination with DNA plasmids may have random mutations or site-specific mutations. By using each of these, a population of mutant recombinant varicella-zoster virus having a random mutation and a mutant recombinant varicella-zoster virus having a site-specific mutation can be obtained. Hereinafter, each of them will be described in more detail.
  • gene 62 into which mutations are randomly introduced is prepared using PCR.
  • Mutation introduction methods using PCR are well known. For example, mutation can be introduced at random by using a thermostable polymerase that does not have a proofreading function under the condition that one of four nucleotides is small. If necessary, a marker gene such as a drug resistance gene may be linked to the mutant 62 gene.
  • the mutant gene 62 prepared in this manner was introduced into E. coli along with the VZV-BAC-DNA plasmid according to the electopore polarization method. Then, the mutant sequence 62 is subjected to homologous recombination with VZV-BAC-DNA. Subsequently, the varicella-zoster virus DNA that has produced homologous recombination is isolated and introduced into Escherichia coli to obtain E. coli containing VZV-BAC DNA that has undergone homologous recombination.
  • the obtained plurality of Escherichia coli contains VZV— BAC each containing gene 62 having a different mutation.
  • a method for introducing a desired site-specific mutation is also well known in the art. For example, PCR is performed using a primer having a desired mutation, a gene fragment having the desired mutation is prepared, and then further PCR is performed using the mutant gene fragment. A full-length gene having a desired mutation is prepared by applying a force or an enzyme treatment such as a restriction enzyme.
  • mutant gene thus prepared, a mutant recombinant varicella-zoster virus having a site-specific mutation is prepared using the procedure described in (1. 1.) above.
  • SCID severe combined immunodeficiency
  • Example 2 Inoculate the recombinant varicella-zoster virus obtained in Example 2 into 20 MRC-5 cell cultures in a roux bottle with a culture area of 210 cm 2 and then culture. After completion of the culture, discard the culture medium and wash the infected cells in each bottle twice with 200 ml of PBS (—). Next, 20 ml of 0.03% (w / v) EDTA 3Na is layered on the infected cells in each roux bottle, and the cells are detached from the inner wall of the roux bottle and allowed to float. Pool the infected cell suspensions in each bottle and centrifuge at 2, OOOrpm for 10 minutes at 4 ° C to collect the infected cell pellet.
  • the remaining Balta is dispensed in 0.5 ml portions into a 3 ml vial, freeze-dried, filled with nitrogen gas, sealed with a rubber stopper, and the inside of the vial is sealed. Seal hermetically.
  • This live vaccine subsection is stored at 4 ° C, and 0.5 ml of distilled water for injection is added immediately before use to completely dissolve the dry contents before use.
  • the sampled stock solution of the above-mentioned cutin, final balta, and 20 small parts are subjected to a verification test.
  • the immunogenicity of the recombinant varicella-zoster virus vaccine strain produced in Example 4 is measured using guinea pigs.
  • the Oka strain live vaccine is used as a comparative control.
  • Each of these pups is inoculated subcutaneously into 3 guinea pigs with an average weight of 250 g at 3 weeks of age.
  • Vaccination is carried out by diluting each vaccine with PBS (—) so that the inoculum is 3,000 PFU or 2,000 P FUZ guinea pigs for recombinant and Oka live vaccines.
  • a blood sample is also collected from the femoral vein of each inoculated guinea pig and the antibody titer in the blood is measured.
  • the neutralization test method (Journal of General Virology, 61, 255-269, 1982) is adopted for the measurement of antibody titer. Confirm that recombinant varicella-zoster virus-inducible induces VZV antibodies to the same extent as the Oka strain. From these results Select a recombinant varicella-zoster virus vaccine with good immunogenicity.
  • a method for producing a vaccine containing a recombinant varicella-zoster virus antigen and other virus antigens using BAC (E. coli artificial chromosome), and a recombinant varicella-zoster produced by the method Herpes virus is provided.
  • the present invention also provides a multivalent vaccine containing an antigen such as recombinant varicella-zoster virus.
  • a vector comprising a varicella-zoster virus genomic gene and a BAC vector sequence, a cell comprising such a vector, a fragment capable of homologous recombination with the varicella-zoster virus genome, and a BAC vector A nucleic acid force set comprising the sequence is provided.

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Abstract

　組換え水痘帯状疱疹ウイルス、およびその製造方法、ならびに組換え水痘帯状疱疹ウイルスを含む薬学的組成物を提供すること、さらに、水痘帯状疱疹ウイルスゲノム遺伝子の特定の遺伝子にＢＡＣベクター配列を含むベクター、およびそのようなベクターを含む細胞、ならびに水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同組換えし得るフラグメント、およびＢＡＣベクター配列を含む核酸カセット、ならびに多価ワクチンを提供することが課題である。 　特定のウイルス遺伝子にＢＡＣベクター配列挿入した組換え水痘帯状疱疹ウイルス製造方法を開発することによって上記課題を解決した。

Description

明 細 書
組換え多価ワクチン
技術分野
[0001] 本発明は、組換え水痘帯状疱疹ウィルス、特に BAC (大腸菌人工染色体)を用い て調製した組換え水痘帯状疱疹ウィルス、およびそのようなウィルスを含む薬学的組 成物に関する。さらに、本発明は、水痘帯状疱疹ウィルスゲノム遺伝子と BACベクタ 一配列とを含むベクター、ならびにそのようなベクターを含む細胞に関する。さらに、 本発明は、組換え水痘帯状疱疹ウィルスを製造する方法に関する。また、本発明は 、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムと相同組換えし得るフラグメント、および BACベクター 配列を含む核酸カセットに関する。
背景技術
[0002] 水痘帯状疱疹ウィルス（varicella— zoster virus ;VZV)は、ヒトヘルぺス科に属 するウィルスであり、二つの異なる臨床像を呈する疾患 (水痘および帯状疱疹）の原 因である。このウィルスの初期感染は水痘 (水疱瘡）を引き起こす。その後、ウィルス は、神経節に潜伏感染し、長い年月を経た後、何らかの誘因によって再活性ィ匕され、 帯状疱疹（ウィルス粒子が形成され、神経を伝わって表皮細胞に達し、神経分布領 域に水痘を形成する症状)を引き起こす。
[0003] VZVのゲノムは、二本鎖 DNAであって、約 125000塩基力らなる。全塩基配列は 、 Davisonらによって決定されており、ゲノム上には少なくとも 72の遺伝子が存在す ることが知られている。
[0004] VZVのワクチンの開発は困難であり、 VZVワクチン Oka株は、高橋ら（特公昭 53— 41202号）によって開発された世界で唯一の水痘帯状疱疹ウィルス用ワクチンであ る。現行の弱毒生水痘ワクチンは、弱毒水痘ウィルス Oka株に由来のウィルスをシー ドに用いて製造され、世界の諸国で広く実用に供されている（Requirementsfor Va ricella Vaccine (Live) Adopted 1984 ; Revised 1993 : WHO Technical Repo rt Series, No. 848, pp. 22— 38, 1994)。この Oka株は、典型的な水痘を呈した 患児から、分離されたウィルス (Oka原株)を、ヒト胎児肺細胞を用いて 34°Cで 12代、 モルモット胎児細胞を用いて 11代継代した後、ヒト二倍体細胞で数代継代して得ら れたものである。 Oka原株は、強い病原性を有するのに対して、 Okaワクチン株（Ok a株）は、健常児に接種してもほとんど副作用は認められない。そのため、 Oka株は、 病原性のほとんどないワクチン株として有用である。
[0005] ウィルスワクチンは、その継代培養とともに、遺伝子型が変化する可能性を有する。
また、 Oka株自体の調製過程において多数の継代培養がされていることから、 Oka 株自体も遺伝的に多様性を有する可能性がある。実際に、ワクチンの安全性と有効 性とを確保するために、ワクチン製造工程での継代によるウィルスの遺伝的変異を考 慮し、製造承認された水痘シードウィルスの継代数の制限、即ち、シード承認時の継 代数を 0代としてそこ力も総継代数 10代以内のウィルスをワクチンに用いるとするシ ードロットシステムが制定されて 、る。
[0006] 一方、水痘ワクチンの効果の追跡ゃ巿販後調查（PMS : Post— MarketingSurve illance)、また、疫学の観点から、自然感染による水痘患者から分離した水痘ウィル ス新鮮野外株と上記 Oka株に由来のワクチン株との間のウィルス学的相違の解析が 必要となり、免疫学および遺伝子工学等を駆使した解析が、既に種々試みられてい る。例えば、水痘ウィルス株間での遺伝子構造や DNA塩基配列の違い (Journalof General Virology, 59, 660— 668, 1986 ;同前， 67, 1759— 1816, 1986)、制 限酵素 Pst Iサイトの有無 (Japanesejournal of Experimental Medicine, 59, 2 33 - 237, 1989)、 PCR (Polymerase Chain Reaction)を用いる RFLP (Restri ctionFragment Length Polymorphism)に基づく判疋 Oournal of Virology, 6 6, 1016- 1020, 1992)、上記 Pstlサイトの有無と RFLPとの組合わせ (Journal o f Clinical Microbiology, 33, 658— 660, 1995)等による試行力 ^報告されて!ヽる 。しかし、これらはいずれも、新鮮野外株と Oka株に由来のワクチン株とを鑑別するた めの条件を提起しているものである力 Oka株自体の遺伝的多様性の問題から、信 頼性に欠け、確定的ではなぐそのため、ワクチンの品質管理において問題がある。 更に、水痘ウィルスの genel4領域を用いる水痘ウィルス Oka株の同定方法 (米国特 許第 6, 093, 535号)や、 gene62領域を用いる弱毒生水痘ワクチン用ウィルス株の 同定方法（国際公開番号 WO00Z50603)等も知られて 、るが、 、ずれの技術も、 水痘ウィルス Oka株（強毒親株）、これより派生したワクチン株（弱毒 Oka株）、及び O ka株以外の水痘ウィルス株の三者間の相違の検定を可能にしたものの、弱毒生水 痘ワクチンの品質管理及び品質保証のための製剤基準としては必ずしも十分ではな い。
[0007] 現状では、ワクチンの品質を評価および確認するための方法、例えば、シードウイ ルスやワクチンウィルスのゲノム DNAの直接的ないしは定量的な遺伝子解析による 品質管理は行われていないので、生ワクチン用の弱毒株の品質管理及び品質保証 の精度は算出不能であり曖昧である。従って、品質管理及び品質保証の精度を高め ることは、弱毒生水痘ワクチンの有効性 '安全性'均質性を確保し保証する上で極め て重要である。しかし、上述の通り、未だその方法は確立されておらず、解決すべき 急務の課題として残されて 、た。
[0008] また、 Oka株よりも優れた改変体水痘帯状疱疹ウィルスワクチンを開発するために、 変異導入による組換え水痘帯状疱疹ウィルスおよびその作製方法も求められていた
[0009] さらに、 BACベクター配列を用いるウィルスワクチンの製造方法においては、 BAC ベクター配列を導入するための非必須遺伝子の同定が必要である。さらに、 BAC クタ一を用いて多価ワクチンを製造する場合には、多数の抗原をウィルスゲノム上に 挿入することが必要であるという問題も存在する。
[0010] 従って、多価ワクチンの製造のための BACベクター由来のベクターの開発が求め られている。
特許文献 1：特公昭 53—41202号
特許文献 2 :米国特許第 6, 093, 535号
特許文献 3：国際公開番号 WO 00/50603
非特許文献 1： Requirements for Varicella Vaccine (Live) Adopted 1984 ; Rev ised 1993 : WHO Technical Report Series, No. 848, pp. 22— 38, 1994 非特許文献 2 Journal of General Virology, 59, 660 - 668, 1986
非特許文献 3 Journal of General Virology, 67, 1759 - 1816, 1986 非特許文献 4 Japanese Journal of ExperimentalMedicine, 59, 233 - 237, 1 989
非特許文献 5 Journal of Virology, 66, 1016— 1020, 1992
非特許文献 6 Journal of Clinical Microbiology, 33, 658-660, 1995 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 本発明の課題は、水痘帯状疱疹ウィルスワクチンの品質管理及び品質保証の精度 を高め、弱毒生水痘ワクチンの有効性 ·安全性 ·均質性を確保し保証することにある 。本発明の課題は、 Oka株よりも優れた改変体水痘帯状疱疹ウィルスワクチンを開発 するために、変異導入による組換え水痘帯状疱疹ウィルスを作製する方法を確立し て、そのようなウィルスを提供することにある。さら〖こ、本発明の課題は、上記利点を 有する多価ワクチンを提供することにある。
[0012] BACベクターを用いて多価ワクチンを製造する場合には、ウィルスゲノム配列中に 多種の抗原をコードする遺伝子を挿入する必要がある。しかし、外来遺伝子の挿入 によってゲノムサイズが大きくなりすぎると、ゲノム DNAが力プシドにパッケージされ ず、組換えウィルスが作製できないことが知られている。そこで、多数の抗原遺伝子 を Okaワクチン株に挿入するためには、 Okaワクチン株の非必須遺伝子をノックアウト して、ゲノム DNAサイズを減少させる必要があると考えられる。
[0013] その一方で、従来、非必須遺伝子であると予測された遺伝子の中には、ノックアウト するとウィルスの増殖に影響を与える遺伝子があることが、本発明において、予想外 に見出された。
[0014] 従って、本発明の課題は、ウィルス産生量の減少などの問題を生じな 、、 BACベタ ターを用いた多価ワクチンの製造方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0015] 本発明者らは、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの特定の遺伝子を BACベクター配列 の挿入配列として用いる組換え水痘帯状疱疹ウィルス製造方法を開発することによ つて、本発明を完成した。
[0016] 従って、本発明は、以下を提供する。
(項目 1)水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの非必須領域内に BACベクター配列の少なく とも一部が挿入されている、組換え水痘帯状疱疹ウィルスであって、ここで該非必須 領域が、以下の領域からなる群から選択される、組換え水痘帯状疱疹ウィルス： 遺伝子 13の ORF内の領域、遺伝子 56の ORF内の領域、遺伝子 58の ORF内の 領域、遺伝子 13の ORFに隣接する領域、遺伝子 56の ORFに隣接する領域、遺伝 子 57の ORFに隣接する領域および、遺伝子 58の ORFに隣接する領域。
(項目 2)項目 1に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルスであって、遺伝子 13、遺伝子 56、遺伝子 57、および遺伝子 58からなる群から選択される遺伝子を少なくとも 2つ 欠損する、組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 3)項目 1に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルスであって、遺伝子 13、遺伝子 56、遺伝子 57、および遺伝子 58からなる群から選択される遺伝子を少なくとも 3つ 欠損する、組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 4)前記 BACベクター配列が組換えタンパク質依存性組換え配列を含む、項 目 1に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 5)前記 BACベクター配列力 ムンプスウィルス、麻疹ウィルス、風疹ウィルス、 ウェストナイルウィルス、インフルエンザウイルス、 SARSコロナウィルス、および日本 脳炎ウィルス力 なる群力 選択されるウィルスの遺伝子を含む、項目 1に記載の組 換え水痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 6)前記 BACベクター配列力 ムンプスウィルス、麻疹ウィルス、および風疹ゥ ィルスカゝらなる群カゝら選択されるウィルスの遺伝子を含む、項目 1に記載の組換え水 痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 7)前記 BACベクター配列力 ムンプスウィルスの遺伝子、麻疹ウィルスの遺伝 子、および風疹ウィルスの遺伝子を含む、項目 6に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイ ノレス。
(項目 8)前記ムンプスウィルスの遺伝子力 HN遺伝子、 F遺伝子、および、 N遺伝 子からなる群から選択される、項目 6に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 9)前記麻疹ウィルスの遺伝子力 H遺伝子、 F遺伝子、および、 N遺伝子から なる群力も選択される、項目 6に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 10)前記風疹ウィルスの遺伝子力 C遺伝子、 E1遺伝子、および、 E2遺伝子 からなる群カゝら選択される、項目 6に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 11)前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが野生株由来である、項目 1に記載の組 換え水痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 12)前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが変異株由来である、項目 1に記載の組 換え水痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 13)前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが Okaワクチン株由来である、項目 1に 記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 14)前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが遺伝子 62および遺伝子 6に変異を有 する、項目 1に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 15)前記遺伝子 62が、配列番号 1の塩基配列において、少なくとも以下 (a)〜 (d)の塩基置換：
(a) 2110番塩基が G ;
(b) 3100番塩基が G ;
(c) 3818番塩基が C；および
(d) 4006番塩基が G、
ならびに前記遺伝子 6が、配列番号 4の塩基配列において、少なくとも 5745番塩基 が Gである塩基置換、
を有する、項目 9に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
(項目 16)項目 1に記載のウィルスを含有する薬学的組成物。
(項目 17)ワクチンの形態である、項目 16に記載の薬学的組成物。
(項目 18)項目 1に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルスから単離される、ベクター。
(項目 19)項目 18に記載のベクターを含む、細胞。
(項目 20)細菌である、項目 19に記載の細胞。
(項目 21) E. coliである、項目 20に記載の細菌。
(項目 22)哺乳動物細胞である、項目 19に記載の細胞。
(項目 23)ヒト由来の細胞である、項目 22に記載の哺乳動物細胞。
(項目 24)項目 22に記載の哺乳動物細胞によって産生された、ウィルス。
(項目 25)項目 24に記載のウィルスを含有する薬学的組成物。 (項目 26)組換え水痘帯状疱疹ウィルスの製造方法であって、以下の工程： 項目 18に記載のベクターを、哺乳動物宿主細胞に導入する工程;および 該哺乳動物宿主細胞を培養して、組換え水痘帯状疱疹ウィルスを産生させる工程
を包含する、方法。
(項目 27)前記哺乳動物宿主細胞がヒト由来の細胞である、項目 26に記載の方法。 (項目 28)項目 26に記載の方法であって、前記 2つの組換えタンパク質依存性組換 え配列間での組換えを起こす工程をさらに包含する、方法。
(項目 29)項目 18に記載のベクターに変異を導入する方法であって、以下の工程： 該ベクターを細菌宿主細胞に導入する工程；
水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部力 なるフラグメントを含むプラスミドベクターを 該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該フラグメントは少なくとも 1つの 変異を有する、工程；
該細菌宿主細胞を培養する工程；
該培養した細菌宿主細胞から、 BACベクター配列を有するベクターを単離するェ 程、
を包含する、方法。
(項目 30)項目 18に記載のベクターに変異を導入する方法であって、以下の工程： 該ベクターを細菌宿主細胞に導入する工程；
水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部力 なる第 1のフラグメントを含む第 1のプラスミ ドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該第 1のフラグメント は少なくとも 1つの変異を有する、工程；
水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部力 なる第 2のフラグメントを含む第 2のプラスミ ドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該第 2のフラグメント は少なくとも 1つの変異を有し、そして該第 2のフラグメントは該第 1のフラグメントとは 異なる、工程；
該細菌宿主細胞を培養する工程；
該培養した細菌宿主細胞から、 BACベクター配列を有するベクターを単離するェ 程、
を包含する、方法。
(項目 31 )細菌細胞内にぉ ヽて水痘帯状疱疹ウィルスゲノムと相同組換えし得る第 1 のフラグメント、 BACベクター配列、および細菌細胞内において水痘帯状疱疹ウィル スゲノムと相同組換えし得る第 2のフラグメントを含む核酸カセットであって、ここで、 該 BAC配列の両端の各々がそれぞれ第 1のフラグメントおよび第 2のフラグメントと連 結し、そして、ここで、前記第 1および第 2のフラグメントが、各々独立して水痘帯状疱 疹ウィルスゲノムの以下の領域力 なる群力 選択される領域由来である、核酸カセ ッ卜：
遺伝子 13の ORF内の領域、遺伝子 56の ORF内の領域、遺伝子 58の ORF内の 領域、遺伝子 13の ORFに隣接する領域、遺伝子 56の ORFに隣接する領域、遺伝 子 57の ORFに隣接する領域および、遺伝子 58の ORFに隣接する領域、遺伝子 56 , 57, 58の連続する領域。
(項目 32)前記第 1のフラグメントおよび第 2のフラグメントが少なくとも lkbである、項 目 31に記載の核酸カセット。
(項目 33)前記第 1のフラグメントおよび第 2のフラグメントが少なくとも 1. 5kbである、 項目 31に記載の核酸カセット。
(項目 34)前記第 1のフラグメントおよび第 2のフラグメントが少なくとも 2kbである、項 目 31に記載の核酸カセット。
(項目 35)前記第 1のフラグメントおよび第 2のフラグメントが、水痘帯状疱疹ウィルス ゲノムの配列に対して、少なくとも 80%同一である、項目 31に記載の核酸カセット。 (項目 36)項目 31に記載の核酸カセットであって、ここで、前記第 1および第 2のフラ グメントが異なる領域に由来する、核酸カセット。
(項目 37)前記 BACベクター配列が組換えタンパク質依存性組換え配列を含む、項 目 31に記載の核酸カセット。
(項目 38)前記 BACベクター配列が選択マーカーを含む、項目 31に記載の核酸力 セット。
(項目 39)前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが野生株由来である、項目 31に記載の 核酸カセット。
(項目 40)前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが変異株由来である、項目 31に記載の 核酸カセット。
(項目 41)前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが Okaワクチン株由来である、項目 31に 記載の核酸カセット。
(項目 42)前記 BACベクター配列が配列番号 3に記載の核酸配列を有する、項目 3 1に記載の核酸カセット。
発明の効果
[0017] 本発明によって、組換え水痘帯状疱疹ウィルス、およびその製造方法が提供される 。例えば、本発明によって、 BAC (大腸菌人工染色体)を用い、ウィルスの特定の遺 伝子を BACベクターの挿入部分として、単一のウィルス株力ゝら組換え水痘帯状疱疹 ウィルスを作製する方法、およびその方法によって作製された組換え水痘帯状疱疹 ウィルスが提供される。また、本発明によって、組換え水痘帯状疱疹ウィルスを含む 薬学的組成物がまた提供される。
[0018] さらに、本発明によって、水痘帯状疱疹ウィルスゲノム遺伝子と BACベクター配列 とを含むベクター、およびそのようなベクターを含む細胞、ならびに水痘帯状疱疹ウイ ルスゲノムと相同組換えし得るフラグメント、および BACベクター配列を含む核酸力 セットが提供される。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]図 1は、 CMVプロモーター Zェンハンサ一の構造を模式的に示す図である。
[図 2]図 2は、相同組換えによって、遺伝子 13の ORF領域にムンプスウィルス抗原を 挿入する方法を模式的に示す。
配列表フリーテキスト
[0020] 配列番号 1：遺伝子 62の核酸配列
配列番号 2：遺伝子 62のアミノ酸配列
配列番号 3：プラスミド PHA— 2の配列
配列番号 4：水痘帯状疱疹ウィルス Dumas株
配列番号 5 :配列番号 4の 1134位〜 1850位に 5'→3 '方向でコードされるアミノ酸 配列 (遺伝子 2)
配列番号 6 :配列番号 4の 8607位〜 9386位に 5'→3 '方向でコードされるアミノ酸 配列 (遺伝子 7)
配列番号 7：配列番号 4の 10642位〜 10902位に 5 '→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 9A)
配列番号 8 :配列番号 4の 11009位〜 11917位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 9)
配列番号 9 :配列番号 4の 12160位〜 13392位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 10)
配列番号 10 :配列番号 4の 13590位〜 16049位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 11)
配列番号 11 :配列番号 4の 16214位〜 18199位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 12)
配列番号 12 :配列番号 4の 18441位〜 19346位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 13)
配列番号 13 :配列番号 4の 24149位〜 25516位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 17)
配列番号 14 :配列番号 4の 30759位〜 33875位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 21)
配列番号 15 :配列番号 4の 34083位〜 42374位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 22)
配列番号 16 :配列番号 4の 44506位〜 46263位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 26)
配列番号 17 :配列番号 4の 50857位〜 54471位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 29)
配列番号 18 :配列番号 4の 54651位〜 56963位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 30)
配列番号 19 :配列番号 4の 57008位〜 59614位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 31)
配列番号 20 :配列番号 4の 59766位〜 60197位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 32)
配列番号 21 :配列番号 4の 64807位〜 65832位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 36)
配列番号 22 :配列番号 4の 66074位〜 68599位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 37)
配列番号 23 :配列番号 4の 70633位〜 71355位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 39)
配列番号 24 :配列番号 4の 71540位〜 75730位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 40)
配列番号 25 :配列番号 4の 75847位〜 76797位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 41)
配列番号 26 :配列番号 4の 78170位〜 80200位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 43)
配列番号 27 :配列番号 4の 80360位〜 81451位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 44)
配列番号 28 :配列番号 4の 82719位〜 83318位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 46)
配列番号 29 :配列番号 4の 84667位〜 86322位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 48)
配列番号 30 :配列番号 4の 87881位〜 90388位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 51)
配列番号 31 :配列番号 4の 90493位〜 92808位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 52)
配列番号 32 :配列番号 4の 95996位〜 98641位に 5'→3 '方向でコードされるァミノ 酸配列（遺伝子 55)
配列番号 33 :配列番号 4の 110581位〜 111417位に 5'→3 '方向でコードされるァ ミノ酸配列（遺伝子 63)
配列番号 34：配列番号 4の 111565位〜 112107位に 5 '→3 '方向でコードされるァ ミノ酸配列（遺伝子 64)
配列番号 35 :配列番号 4の 113037位〜 114218位に 5'→3 '方向でコードされるァ ミノ酸配列（遺伝子 66)
配列番号 36：配列番号 4の 114496位〜 115560位に 5 '→3 '方向でコードされるァ ミノ酸配列（遺伝子 67)
配列番号 37：配列番号 4の 115808位〜 117679位に 5 '→3 '方向でコードされるァ ミノ酸配列（遺伝子 68)
配列番号 38 :配列番号 4の 120764位〜 124696位に 5'→3 '方向でコードされるァ ミノ酸配列（遺伝子 71)
配列番号 39：配列番号 4の部分配列（遺伝子 27)
配列番号 40 :配列番号 39の 1位〜 999位に 5'→3 '方向でコードされるアミノ酸配列 (遺伝子 27)
配列番号 41：配列番号 4の部分配列（遺伝子 47)
配列番号 42 :配列番号 41の 1位〜 1530位に 5'→3 '方向でコードされるアミノ酸配 列 (遺伝子 47)
配列番号 43：配列番号 4の部分配列
配列番号 44 :配列番号 43の 1位〜 243位に 5'→3 '方向でコードされるアミノ酸配列 (遺伝子 49)
配列番号 45：配列番号 4の部分配列
配列番号 46 :配列番号 45の 1位〜 732位に 5'→3 '方向でコードされるアミノ酸配列 (遺伝子 56)
配列番号 47：配列番号 4の配列の相補鎖配列
配列番号 48：配列番号 4の 118480位〜 119316位に 3，→5，方向でコードされるァ ミノ酸配列（配列番号 47の 5569位〜 6405位に対応する）（遺伝子 70)
配列番号 49 :配列番号 4の 117790位〜 118332位に 3'→5 '方向でコードされるァ ミノ酸配列（配列番号 47の 6553位〜 7095位に対応する）（遺伝子 69) 配列番号 50：配列番号 4の 112332位〜 112640位に 3 '→5 '方向でコードされるァ ミノ酸配列（配列番号 47の 12245位〜 12553位に対応する）（遺伝子 65) 配列番号 51 :配列番号 4の 105201位〜 109133位に 3'→5 '方向でコードされるァ ミノ酸配列（配列番号 47の 15752位〜 19684位に対応する）（遺伝子 62) 配列番号 52 :配列番号 4の 103082位〜 104485位に 3'→5 '方向でコードされるァ ミノ酸配列（配列番号 47の 20400位〜 21803位に対応する）（遺伝子 61) 配列番号 53 :配列番号 4の 100302位〜 101219位に 3'→5 '方向でコードされるァ ミノ酸配列（配列番号 47の 23666位〜 24583位に対応する）（遺伝子 59) 配列番号 54：配列番号 4の 99411位〜 99626位に 3 '→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 25259位〜 25474位に対応する）（遺伝子 57)
配列番号 55 :配列番号 4の 92855位〜 93850位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 31035位〜 32030位に対応する）（遺伝子 53)
配列番号 56 :配列番号 4の 68668位〜 70293位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 54592位〜 56217位に対応する）（遺伝子 38)
配列番号 57 :配列番号 4の 63977位〜 64753位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 60132位〜 60908位に対応する）（遺伝子 35)
配列番号 58 :配列番号 4の 62171位〜 63910位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 60975位〜 62714位に対応する）（遺伝子 34)
配列番号 59 :配列番号 4の 60321位〜 62138位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 62747位〜 64564位に対応する）（遺伝子 33)
配列番号 60 :配列番号 4の 47052位〜 50636位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 74249位〜 77833位に対応する）（遺伝子 28)
配列番号 61 :配列番号 4の 44148位〜 44618位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 80267位〜 80737位に対応する）（遺伝子 25)
配列番号 62 :配列番号 4の 43212位〜 44021位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 80864位〜 81673位に対応する）（遺伝子 24)
配列番号 63：配列番号 4の 42431位〜 43138位に 3 '→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 81747位〜 82454位に対応する）（遺伝子 23) 配列番号 64 :配列番号 4の 29024位〜 30475位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 94410位〜 95861位に対応する）（遺伝子 20)
配列番号 65 :配列番号 4の 26518位〜 28845位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 96040位〜 98367位に対応する）（遺伝子 19)
配列番号 66 :配列番号 4の 25573位〜 26493位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 98392位〜 99312位に対応する）（遺伝子 18)
配列番号 67 :配列番号 4の 22568位〜 23794位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 101091位〜 102317位に対応する）（遺伝子 16) 配列番号 68 :配列番号 4の 21258位〜 22478位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 102407位〜 103627位に対応する）（遺伝子 15) 配列番号 69 :配列番号 4の 19431位〜 21113位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 103772位〜 105454位に対応する）（遺伝子 14) 配列番号 70 :配列番号 4の 9477位〜 10667位に 3'→5 '方向でコードされるァミノ 酸配列（配列番号 47の 114218位〜 115408位に対応する）（遺伝子 8) 配列番号 71 :配列番号 4の 5326位〜 8577位に 3'→5 '方向でコードされるアミノ酸 配列（配列番号 47の 116308位〜 119559位に対応する）（遺伝子 6)
配列番号 72 :配列番号 4の 4252位〜 5274位に 3'→5 '方向でコードされるアミノ酸 配列（配列番号 47の 119611位〜 120633位に対応する）（遺伝子 5)
配列番号 73 :配列番号 4の 2783位〜 4141位に 3'→5 '方向でコードされるアミノ酸 配列（配列番号 47の 120744位〜 122102位に対応する）（遺伝子 4)
配列番号 74 :配列番号 4の 1908位〜 2447位に 3'→5 '方向でコードされるアミノ酸 配列（配列番号 47の 122438位〜 122977位に対応する）（遺伝子 3)
配列番号 75 :配列番号 4の 589位〜 915位に 3'→5 '方向でコードされるアミノ酸配 列（配列番号 47の 123970位〜 124296位に対応する）（遺伝子 1)
配列番号 76：配列番号 47の部分配列
配列番号 77 :配列番号 76の 1位〜 1056位および 4556位〜 5740位に 3'→5 '方 向でコードされるアミノ酸配列（配列番号 47の 46847位〜 48034位および 42292位 〜43347位に対応する）（遺伝子 42および遺伝子 45) 配列番号 78：配列番号 47の部分配列
配列番号 79 :配列番号 78の 1位〜 1305位に 3'→5 '方向でコードされるアミノ酸配 列（配列番号 47の 123580位〜 124884位に対応する）（遺伝子 50)
配列番号 80：配列番号 47の部分配列
配列番号 81 :配列番号 80の 1位〜 2307位に 3'→5 '方向でコードされるアミノ酸配 列（配列番号 47の 122578位〜 124884位に対応する）（遺伝子 54)
配列番号 82：配列番号 47の部分配列
配列番号 83 :配列番号 82の 1位〜 663位に 3'→5 '方向でコードされるアミノ酸配列 (配列番号 47の 124222位〜 124884位に対応する）（遺伝子 58)
配列番号 84：配列番号 47の部分配列
配列番号 85 :配列番号 84の 1位〜 427位に 3'→5 '方向でコードされるアミノ酸配列 (配列番号 47の 124458位〜 124884位に対応する）（遺伝子 60)
配列番号 86：配列番号 47の部分配列
配列番号 87 :配列番号 86の 1位〜 903位に 3'→5 '方向でコードされるアミノ酸配列 (配列番号 47の 60321位〜 61229位に対応する）（遺伝子 33. 5)
発明を実施するための最良の形態
[0021] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及 しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書 において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味 で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明 細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野 の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明 細書 (定義を含めて)が優先する。
[0022] (用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
[0023] 本明細書において使用される場合、水痘帯状疱疹ウィルスの「必須遺伝子」とは、 水痘帯状疱疹ウィルスが増殖するために必須の遺伝子をいう。また、水痘帯状疱疹 ウィルスの「非必須遺伝子」とは、水痘帯状疱疹ウィルスが増殖するために必須では ない遺伝子であり、たとえ欠損したとしても、水痘帯状疱疹ウィルスが増殖し得る遺伝 子をいう。水痘帯状疱疹ウィルスの非必須遺伝子としては、例えば、以下が挙げられ る力 これらに限定されない：遺伝子 11、遺伝子 12、遺伝子 13、遺伝子 56、および 、遺伝子 58。これら遺伝子の中で BACベクターの挿入に適切な遺伝子は、例えば、 遺伝子 13、遺伝子 56、および、遺伝子 58が挙げられる力 これらに限定されない。
[0024] ウィルスゲノム中の遺伝子が必須遺伝子である場合、その遺伝子の破壊によってゥ ィルスは増殖できなくなる。従って、ウィルスゲノム中の任意の遺伝子を破壊して、そ のウィルスの増殖を検出することによって、その遺伝子が必須遺伝子か非必須遺伝 子かを決定することができる。
[0025] 本明細書にお!、て水痘帯状疱疹ウィルスの「野生株」とは、人工的な改変を受けて いない、天然より単離された水痘帯状疱疹ウィルス株をいう。野生株の例としては、 D avison, A. J.および Scott, J. E. (J. Gen. Virol. 67 (Pt 9) , 1759— 1816 (19 86) )が同定した Dumas株が挙げられる力 これに限定されない。この Dumas株の 核酸配列を配列番号 4に記載する。この Dumas株の ORFの番号および位置は、以 下のとおりである。
ORF番号 読み枠の方向 ゲノム上の位置 アミノ酸残基数
ORF1 3，- →5 '方向 589〜915 アミノ酸 1 - 108
ORF2 5，- →3，方向 1134へ 1850 アミノ酸 1 - 238
ORF3 3，- →5 '方向 1908へ -2447 アミノ酸 1 - 179
ORF4 3，- →5 '方向 2783へ -4141 アミノ酸 1 -452
ORF5 3，- →5 '方向 4252へ -5274 アミノ酸 1 - 340
ORF6 3，- →5 '方向 5326へ -8577 アミノ酸 1 - 1083
ORF7 5，- →3，方向 8607へ 9386 アミノ酸 1 - 259
ORF8 3，- →5 '方向 9477へ 10667 アミノ酸 1 - 396
ORF9 5，- →3，方向 11009- -11917 アミノ酸 1 - - 302
ORF9A 5，- →3 '方向 10642 〜10902 アミノ酸 1 -87
ORF10 5，- 3，方向 12160- -13392 ア 酸 1 - -410
ORF11 5，— 3，方向 13590- -16049 ア 酸 1 - -819 ORF12 5，→3 '方向 16214- -18199 ア 酸 1 -661
ORF13 5， →3 '方向 18441- -19346 ア 酸 1 - 301
ORF14 3， →5 '方向 19431- -21113 ア 酸 1 - 560
ORF15 3， →5 '方向 21258- -22478 ア 酸 1 -406
ORF16 3， →5 '方向 22568- -23794 ア 酸 1 -408
ORF17 5， →3 '方向 24149- -25516 ア 酸 1 -455
ORF18 3， →5 '方向 25573- -26493 ア 酸 1 - 306
ORF19 3， →5 '方向 26518- -28845 ア 酸 1 - 775
ORF20 3， →5 '方向 29024- -30475 ア 酸 1 -483
ORF21 5， →3 '方向 30759- -33875 ア 酸 1 - 1038
ORF22 5， →3 '方向 34083- -42374 ア 酸 1 - 2763
ORF23 3， →5 '方向 42431- -43138 ア 酸 1 - 235
ORF24 3， →5 '方向 43212- -44021 ア 酸 1 - 269
ORF25 3， →5 '方向 44148- -44618 ア 酸 1 - 156
ORF26 5， →3 '方向 44506- -46263 ア 酸 1 - 585
ORF27 5， →3 '方向 46127- -47128 ア 酸 1 - 333
ORF28 3， →5 '方向 47052- -50636 ア 酸 1 - 1194
ORF29 5， →3 '方向 50857- -54471 ア 酸 1 - 1204
ORF30 5， →3 '方向 54651- -56963 ア 酸 1 - 770
ORF31 5， →3 '方向 57008- -59614 ア 酸 1 -868
ORF32 5， →3 '方向 59766- -60197 ア 酸 1 - 143
ORF33 3， →5 '方向 60321- -62138 ア 酸 1 -605
ORF33. 5 3'→5 '方向 [ 60321〜61229 ア 酸 1 - 301
ORF34 3， →5 '方向 62171- -63910 ア 酸 1 - 579
ORF35 3， →5 '方向 63977- -64753 ア 酸 1 - 258
ORF36 5， →3 '方向 64807- -65832 ア 酸 1 - 341
ORF37 5， →3 '方向 66074- -68599 ア 酸 1 -841
ORF38 3， →5 '方向 68668- -70293 ア 酸 1 - 541 ORF39 5，— >3，方向 70633へ -71355 アミノ酸 1 - 240
ORF40 5，— >3，方向 71540へ -75730 アミノ酸 1 - 1396
ORF41 5，— >3，方向 75847へ -76797 アミノ酸 1 - 316
ORF42-ト 45 3'→5 '方向
76851へ '78038および 81538〜82593 ア 酸 1 - 747
ORF43 5，— >3，方向 78170へ '80200 アミノ酸 1 -676
ORF44 5，— >3，方向 80360へ -81451 アミノ酸 1 - 363
ORF46 5，— >3，方向 82719へ -83318 アミノ酸 1 - 199
ORF47 5，— >3，方向 83168へ '84700 アミノ酸 1 - 510
ORF48 5，— >3，方向 84667へ -86322 アミノ酸 1 - 551
ORF49 5，— >3，方向 86226へ -86471 アミノ酸 1 -81
ORF50 3，— >5 '方向 86575へ -87882 アミノ酸 1 -435
ORF51 5，— >3，方向 87881へ '90388 アミノ酸 1 -835
ORF52 5，— >3，方向 90493へ '92808 アミノ酸 1 - 771
ORF53 3，— >5 '方向 92855へ -93850 アミノ酸 1 - 331
ORF54 3，— >5 '方向 93675へ -95984 アミノ酸 1 - 769
ORF55 5，— >3，方向 95996へ '98641 アミノ酸 1 -881
ORF56 5，— >3，方向 98568へ -99302 アミノ酸 1 - 244
ORF57 3，— >5 '方向 99411へ -99626 アミノ酸 1 - 71
ORF58 3，— >5 '方向 99607へ 100272 ア 酸 1 - 221
ORF59 3，— >5 '方向 100302' -101219 ア 酸 1 - 305
ORF60 3，— >5 '方向 101170' -101649 ア 酸 1 - 159
ORF61 3，— >5 '方向 103082' -104485 ア 酸 1 -467
ORF62 3，— >5 '方向 105201- -109133 ア 酸 1 - 1310
ORF63 5，— >3，方向 110581' -111417 ア 酸 1 - 278
ORF64 5，— >3，方向 111565- -112107 ア 酸 1 - 180
ORF65 3，— >5 '方向 112332- -112640 ア 酸 1 - 102
ORF66 5，— >3，方向 113037' -114218 ア 酸 1 - 393 ORF67 5，-→3，方向 114496- -115560 ア 酸 1 - 354
ORF68 5，- →3，方向 115808- -117679 ア 酸 1 -623
ORF69 3，- →5 '方向 117790- -118332 ア 酸 1 - 180
ORF70 3，- →5 '方向 118480- -119316 ア 酸 1 - 278
ORF71 5，- →3，方向 120764- -124696 ア 酸 1 - 1310
上記の表で、「5'→3 '方向」とは、 ORFが配列番号 4の核酸配列と同一の方向にあ ることを示し、「3'→5 '方向」とは、 ORFが配列番号 4の核酸配列と逆の方向にあるこ とを示す。上記 ORFの核酸配列および Zまたはアミノ酸配列と相同な配列を同定す ることによって、当業者は、 Dumas株以外の株由来のゲノム中の ORFを同定するこ とを容易になし得る。
[0026] 本明細書において「変異株」とは、野生株であるウィルス株に、変異誘発、多数回 の継代培養などによって変異誘発をした水痘帯状疱疹ウィルス株を!、う。水痘帯状 疱疹ウィルス株に変異誘発する場合、この変異誘発は、ランダムな変異導入であつ ても、部位特異的変異導入であってもよい。
[0027] 本明細書において使用する場合、「弱毒化ウィルス」とは、ウィルス変異株の一種で あって毒性が野生株より減弱化されて 、るものを!、う。ウィルス変異株が毒性が野生 株より減弱化されているか否かを決定する方法、すなわち、水痘帯状疱疹ウィルスの 病原性を試験する方法にっ 、て、 2つの方法が確立されて 、る。
[0028] 動物モデルを用いる方法として、ヒトの皮膚を移植した重症複合免疫不全 (SCID) マウスを作製し、これに水痘帯状庖疹ウィルスを感染させることによって、病原性につ いての評価をする方法が周知である (J. Virol. 1998Feb ; 72 (2) : 965- 74, )。
[0029] これに対し試験管内で病原性の評価を行う方法としては、ポアサイズが 3 μ mのトラ ンスゥエルで仕切られた二層のゥエルの下側に単層培養のヒトメラノーマ細胞を入れ 、上側に水痘帯状疱疹ウィルスを感染させた臍帯血単核球 (CBMC)をそれぞれ入 れ、 7〜8日培養した後のメラノーマ細胞の CPE (細胞変性効果)の程度を観察する 方法もまた周知である（J. Virol. 2000 Feb ; 74 (4) : 1864— 70)。
[0030] また、病原性を直接確認する方法ではないが、本発明者らのこれまでの結果 Ci Vi rol. 2002 Nov; 76 (22) : 11447— 59)力ら、ウイノレスの病原'性と増殖'性には密接 な関連があることが理解されているため、 infectius center assayによって cell— t o— cel lの増殖性を調べることによつても間接的に病原性について評価を行うことが できる。
[0031] 人工的にウィルスを弱毒化する方法は、公知である。例えば、配列番号 1に記載の 遺伝子 62において、少なくとも以下 (a)〜（d)の塩基置換：
(a) 2110番塩基が G ;
(b) 3100番塩基が G ;
(c) 3818番塩基が C ;および
(d) 4006番塩基が G、
ならびに配列番号 4に記載の遺伝子 6において、少なくとも 5745番塩基が Gである を有する水痘帯状疱疹ウィルスを、弱毒化ウィルスとして使用可能である。
[0032] 上記水痘帯状疱疹ウィルスを用いる代わりに、（a)〜（d)の塩基置換に加え、以下 の（e)〜（g)の少なくとも 1以上の塩基置換：
(e) 1251番塩基が G ;
(f) 2226番塩基が G；および
(g) 3657番塩基が G
を有する弱毒水痘ウィルス株を使用することが可能である。
[0033] さらに、本発明において、上記水痘帯状疱疹ウィルスを用いる代わりに、（a)〜(g) の少なくとも 1以上の塩基置換にカ卩え、以下の（h)〜（o)の少なくとも 1以上の塩基置 換：
(h) 162番塩基が C ;
(i) 225番塩基が C ;
(j) 523番塩基が C ;
(k) 1565番塩基が C ;
(1) 1763番塩基が C ;
(m) 2652番塩基が C ;
(n) 4052番塩基が C；および (0) 4193番塩基が C
を有する弱毒水痘ウィルス株を使用することが可能である。
[0034] あるいは、「弱毒化ウィルス」として、例えば、遺伝子 62に、以下からなる群から選択 される塩基置換の少なくとも 1つを有するウィルスを使用し得る：
(a) 2110番塩基が G ;
(b) 3100番塩基が G ;
(c) 3818番塩基が C ;
(d) 4006番塩基が G ;
(e) 1251番塩基が G ;
(f) 2226番塩基が G ;
(g) 3657番塩基が G ;
(h) 162番塩基が C ;
(1) 225番塩基が C ;
(j) 523番塩基が C ;
(k) 1565番塩基が C ;
(1) 1763番塩基が C ;
(m) 2652番塩基が C ;
(n) 4052番塩基が C；および
(o) 4193番塩基が C。
[0035] 本明細書において使用される用語「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」 および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸 のポリマーをいう。
[0036] 本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「 核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリ マーをいう。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に 示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体 (例えば、縮重コドン置換体 )および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、 1 またはそれ以上の選択された (または、すべての）コドンの 3番目の位置が混合塩基 および/またはデォキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成さ れ得る（Batzerら、 Nucleic Acid Res. 19： 5081 (1991) ;Ohtsukaら、 J. Biol. Chem. 260 : 2605— 2608 (1985) ;Rossoliniら、 Mol. Cell. Probes 8 : 91— 9 8 (1994) )。
[0037] 本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上 に一定の順序に配列して ヽる。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝 子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポ リヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに Zあるいは「タンパク質」 「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。本明細書にお V、て遺伝子の「オープンリーディングフレーム」または「ORF」とは、遺伝子の塩基配 列を 3塩基ずつに区切った時の 3通りの枠組の 1つであって、開始コドンを有し、そし て途中に終止コドンが出現せずある程度の長さを持ち、実際にタンパク質をコードす る可能性のある読み枠をいう。水痘帯状疱疹ウィルスゲノムは、その全塩基配列が決 定されており、少なくとも 71個の遺伝子が同定されており、その遺伝子の各々がォー プンリーディングフレーム（ORF)を有することが公知である。
[0038] 本明細書において、水痘帯状疱疹ウィルスゲノム内の遺伝子の「ORF内の領域」と は、水痘帯状疱疹ウィルスゲノム内にある遺伝子において ORFを形成する塩基の存 在する領域をいう。
[0039] 本明細書において、水痘帯状疱疹ウィルスゲノム内の遺伝子の「ORFに隣接する 領域」とは、水痘帯状疱疹ウィルスゲノム内にある遺伝子において ORFの近傍にある 塩基の存在する領域であって、その遺伝子または他の遺伝子の ORF内の領域に該 当しない領域をいう。
[0040] 本明細書において遺伝子の「相同性」とは、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する 同一性の程度をいう。従って、ある 2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列 の同一性または類似性は高い。 2種類の遺伝子が相同性を有する力否かは、配列の 直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダィゼーシヨン 法によって調べられ得る。 2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列 間で DNA配列力 代表的には少なくとも 50%同一である場合、好ましくは少なくとも 70%同一である場合、より好ましくは少なくとも 80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98 %または 99%同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
[0041] 本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツー ルである BLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
[0042] 本明細書にぉ 、て遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その 遺伝子など力 Sインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは 、遺伝子、ポリヌクレオチドなど力 転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態にな ることをいうが、転写されて mRNAが作製されることもまた発現の一態様であり得る。 より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもので あり得る。
[0043] アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号力、または IUPAC— IUB Biochemica 1 Nomenclature Commissionにより推奨される 1文字記号のいずれかにより、本 明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた 1文字コー ドにより言及され得る。
[0044] 本明細書にぉ 、て、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（ 長さが n)に対して、 l〜n— 1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオ チドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例え ば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 2 0、 25、 30、 40、 50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙して いない整数で表される長さ (例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。また 、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 20、 25、 30、 40、 50、 75、 100 、 200、 300、 400、 500、 600、 600、 700、 800、 900、 1000およびそれ以上のヌ クレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙して ヽな 、整数で表される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。
[0045] BACベクター内の遺伝子がコードするポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実 質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の 1以上 (例えば、 1または数個）の アミノ酸が置換、付加および Zまたは欠失していてもよぐ糖鎖が置換、付加および Zまたは欠失して 、てもよ 、。 [0046] 本明細書において使用する場合、「糖鎖」とは、単位糖 (単糖および Zまたはその 誘導体）が 1つ以上連なってできたィ匕合物をいう。単位糖が 2つ以上連なる場合は、 各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このよ うな糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類 (グルコース、ガラクトース、マ ンノース、フコース、キシロース、 N—ァセチルダルコサミン、 N—ァセチルガラタトサミ ン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体)の他、分解された多糖、糖タン パク質、プロテオダリカン、グリコサミノダリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解 または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されな 、。した がって、本明細書では、糖鎖は、「多糖 (ポリサッカリド)」、「糖質」、「炭水化物」と互 換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、 糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含する。
[0047] あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依 然として同様の生物学的機能を有するタンパク質 (例えば、酵素活性において等価 なタンパク質)を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換に おいて、疎水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好まし ぐおよび ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなァミノ 酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。親水性指標もまた、 改変体作製において考慮される。米国特許第 4、 554、 101号に記載されるように、 以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（ + 3. 0)；リジン ( + 3. 0)；ァスパラギン酸（ + 3. 0± 1)；グルタミン酸（ + 3. 0± 1)；セリン（ + 0. 3)； ァスパラギン（ + 0. 2)；グルタミン（ + 0. 2)；グリシン（0)；スレオニン（一0. 4)；プロリ ン（一0. 5± 1)；ァラニン（一0. 5)；ヒスチジン（一0. 5)；システィン（一1. 0)；メチォ ニン（一1. 3) ;バリン（ー1. 5) ;ロィシン（ー1. 8)；イソロイシン（一1. 8) ;チロシン（ - 2. 3)；フエ-ルァラニン（一2. 5)；およびトリプトファン（一3. 4)。アミノ酸が同様の 親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得 ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が ± 2以内である ことが好ましぐ ± 1以内であることがより好ましぐおよび ±0. 5以内であることがさら により好ましい。 [0048] 本発明にお 、て、「保存的置換」とは、アミノ酸置換にぉ 、て、元のアミノ酸と置換さ れるアミノ酸との親水性指数または Zおよび疎水性指数が上記のように類似して 、る 置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内 での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびァスパラギン酸；セリンおよび スレオニン；グルタミンおよびァスパラギン；ならびにパリン、ロイシン、およびイソロイ シン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
[0049] 本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの 物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改 変体、付加改変体、欠失改変体、短縮 (truncated)改変体、対立遺伝子変異体な どが挙げられる。対立遺伝子 (allele)とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される 遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して 、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ (homolog)」と は、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（ 好ましくは、 60%以上の相同性、より好ましくは、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95%以上の相同性)を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本 明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ortholog)」とは、オルソロガス遺伝子 (orthologous gene)ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来 する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを 例にとると、ヒトとマウスの αヘモグロビン遺伝子はオルソログである力 ヒトの αへモ グロビン遺伝子と /3ヘモグロビン遺伝子はパラログ (遺伝子重複で生じた遺伝子)で ある。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のオルソログも また、本発明において有用であり得る。
[0050] 「保存的（に改変された)改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用さ れる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本 質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしな い場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的 に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドン GCA、 GCC、 GCG、および GCUはすべて、アミノ酸ァラニンをコードする。したがって、ァラニンが コドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更 することなぐ記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核 酸の変動は、保存的に改変された変異の 1つの種である「サイレント改変（変異）」で ある。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の 可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（ 通常メチォニンのための唯一のコドンである AUG、および通常トリプトファンのための 唯一のコドンである TGGを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され 得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異 は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリ ペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシスティンの置換を回避す るようになされ得る。
[0051] 本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドをコードする遺伝子を含む BA Cベクターを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、また は修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを 1つ以上、例え ば、 1〜10個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸で置換することを いう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に 1つ以上、例えば、 1〜10個、好ましく は 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは 、もとのペプチドから 1つ以上、例えば、 1〜10個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシルイ匕 、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、ァシル化（例え ば、ァセチル化)などを含む力 これらに限定されない。置換、または付加されるァミノ 酸は、天然のアミノ酸であってもよぐ非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよ い。天然のアミノ酸が好ましい。
[0052] 本明細書において使用されるポリペプチドの核酸形態は、そのポリペプチドのタン パク質形態を発現し得る核酸分子をいう。この核酸分子は、発現されるポリペプチド が天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸 の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよぐあるいは他の核酸 配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、 5'末端および Zまたは 3'末端に他の 核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェント な条件下でハイブリダィズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリ ペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公 知であり、本発明にお 、て利用することができる。
[0053] このような核酸は、周知の PCR法により得ることができ、化学的に合成することもで きる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダィゼーシヨン法な どを組み合わせてもよい。
[0054] 本明細書にぉ 、て、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」 とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはそ の代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物力 置き換わること、付け加わること または取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野 において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが 挙げられる。置換、付加または欠失は、 1つ以上であれば任意の数でよぐそのような 数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能が保持さ れる限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、 1または数個であり得、そし て好ましくは、全体の長さの 20%以内、 10%以内、または 100個以下、 50個以下、 25個以下などであり得る。
[0055] 高分子構造 (例えば、ポリペプチド構造）は種々のレベルの構成に関して記述され 得る。この構成の一般的な議論については、例えば、 Albertsら、 Molecular Biolo gy of the Cell (第 3版、 1994)、ならびに、 Cantorおよび Schimmel、 Biophysi cal Chemistry Part I : The Conformation of Biological Macromolecul es (1980)を参照。本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法として は、 Ausubel F. A.ら編（1988)、 Current Protocols in Molecular Biolog y、 Wiley, New York, NY; Sambrook Jら （1987) Molecular Clonin g : A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYなどを参酌して当業者であれば容易に実施を することができる。
[0056] 本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌク レオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクター としては、原核生物細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および 植物個体等の宿主細胞にぉ 、て自律複製が可能である力、または染色体中への組 込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有 しているものが例示される。
[0057] 「BACベクター」とは、大腸菌の Fプラスミドをもとにして作製されたプラスミドで、約 3 OOkb以上の巨大なサイズの DNA断片を大腸菌などの細菌内で安定に保持し増殖 させることが可能なベクターである。 BACベクターは、少なくとも BACベクターの複製 に必須の領域を含む。その複製に必須の領域としては、例えば、 Fプラスミドの複製 開始点である oriSまたはその改変体が挙げられる。
[0058] 本明細書において「BACベクター配列」とは、 BACベクターとしての機能に必須の 配列を含む配列をいう。必要に応じて、 BACベクター配列は、「組換えタンパク質依 存性組換え配列」および Zまたは「選択マーカー」をさらに含み得る。
[0059] 本明細書において核酸の「組換え」とは、用語「相同組換え」と互換可能に使用され 、 2つの異なる相同な核酸分子の会合によって開始し、乗り換えが起こり、核酸の新 しい組み合わせが生じることをいう。本明細書において使用する場合、相同組換えに は、「組換えタンパク質依存的組換え」および「組換えタンパク質非依存的組換え」の 両方が含まれる。「組換えタンパク質依存的組換え」とは、組換えタンパク質存在下に おいて生じるが、組換えタンパク質非存在下では生じない、相同組換えをいう。「組 換えタンパク質非依存的組換え」とは、組換えタンパク質の存在の有無に関わらずに 生じる、相同組換えをいう。本明細書において「組換えタンパク質依存性組換え配列 」とは、組換えタンパク質依存的組換えを生じる配列をいい、「組換えタンパク質非依 存性組換え配列」とは、組換えタンパク質非依存的組換えを生じる配列をいう。組換 えタンパク質依存性組換え配列は、組換えタンパク質存在下では、組換えを生じるが 、組換えタンパク質非存在下では、組換えを生じない。組換えタンパク質は、好ましく は、組換えタンパク質依存性組換え配列に特異的に作用し、組換えタンパク質依存 性組換え配列以外の配列には作用しな 、。
[0060] 代表的な組換えタンパク質依存性組換え配列と、組換えタンパク質との対としては 、以下が挙げられる力 これらに限定されない:バタテリオファージ PI由来の 1οχΡ (1ο cus of crossover oi PiJ目歹 [Jと Cre (cyclization recombination)タンノヽク質 との組み合わせ、 Flpタンパク質と FRT部位との組み合わせ、 φ 031と attB, attPと の糸且み合わせ（Thorpe, Helena M. ； Wilson, Stuart E. ； Smith, Margaret
C. M.、 Control of directionality in the site― specific recombinatio n system of the Streptomyces phage C31.、 Molecular Microbiolo gy (2000) , 38 (2) , 232— 241. )、リソノレノ ーゼと res咅 M立との糸且み合わせ（Sado wski P. , Site— specific recombinases： changing partners and doing the twist. J. Bacteriol. , 1986年 2月； 165 (2) 341— 7) (一般的には、 Sauer
B. Site— specific recombination： developments and applications. , し urr Opin Biotechnol. 1994 Oct ; 5 (5) : 521— 7.を参照のこと）。
本明細書において使用する場合、「選択マーカー」とは、 BACベクターを含む宿主 細胞を選択する指標として機能する遺伝子をいう。選択マーカーとしては、蛍光マー カー、発光マーカー、および薬剤選択マーカーが挙げられるが、これらに限定されな い。「蛍光マーカー」としては、グリーン蛍光タンパク質 (GFP)のような蛍光タンパク質 をコードする遺伝子が挙げられる力 これらに限定されない。「発光マーカー」として は、ルシフェラーゼのような発光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる力 これ らに限定されない。「薬剤選択マーカー」としては、以下力もなる群力も選択されるタ ンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない:ジヒドロ葉酸還 元酵素遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ァスパラギン酸トランスアミナーゼ、メ タロチォネイン（MT)、アデノシンデアミナーゼ (ADA)、アデノシンデアミナーゼ（A MPD1, 2)、キサンチンーグァニン一ホスホリボシルトランスフェラーゼ、 UMPシンタ ーゼ、 P—グリコプロテイン、ァスパラギンシンテターゼ、およびオル-チンデカルボキ シラーゼ。これら薬剤選択マーカーと使用される薬剤との組み合わせは、例えば、以 下のとおりである：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 (DHFR)とメソトレキセート（MTX)と の組み合わせ、グルタミンシンセターゼ (GS)遺伝子とメチォニンスルホキシミン（Ms X)との組み合わせ、ァスパラギン酸トランスアミナーゼ（CAD)遺伝子と N—ホスホン ァセチノレ -L-ァスノ ラギン酸（N - phosphonacetyl— L— aspartate) (PALA)と の組み合わせ、 MT遺伝子とカドミウム（Cd2+)との組み合わせ、アデノシンデァミナ ーゼ（ADA)遺伝子とアデノシン、ァラノシン、 2'ーデォキシコホルマイシンとの組み 合わせ、アデノシンデアミナーゼ (AMPD1, 2)遺伝子とアデニン、ァザセリン、コホ ルマイシンとの組み合わせ、キサンチン一グァニン一ホスホリボシルトランスフェラー ゼ遺伝子と、マイコフェノール酸との組み合わせ、 UMPシンターゼ遺伝子と 6—ァザ ゥリジン、ピラゾフラン（pyrazofuran)との組み合わせ、 P—グリコプロテイン（P—gp , MDR)遺伝子と多剤薬剤との組み合わせ、ァスパラギンシンテターゼ (AS)遺伝子 と 13—ァスパルチルヒドロキサム酸またはアルビジイン（albizziinn)との組み合わせ、 オル-チンデカルボキシラーゼ（ODC)遺伝子と α—ジフルォロメチルーオル-チン (DFMO) 0
[0062] 本明細書において使用する場合、「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現 を調節するプロモーターにカ卩えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得 る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネータ 一、薬剤耐性遺伝子 (例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝 子など）のような選択マーカーおよび、ェンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物 )の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類力 宿主細胞に応じ て変わり得ることは、当業者に周知の事項である。植物の場合、本発明に用いる植物 の発現ベクターはさらに T—DNA領域を有し得る。 T— DNA領域は、特にァグロバ クテリゥムを用いてその植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
[0063] 本明細書において使用する場合、「組換えベクター」とは、 目的のポリヌクレオチド 配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとし ては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体 等の宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本 発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例 示される。
[0064] 「ターミネータ一」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、 DNA が mRNAに転写される際の転写の終結、ポリ A配列の付加に関与する配列である。 ターミネータ一は、 mRNAの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすこと が知られている。ターミネータ一としては、 CaMV35Sターミネータ一、ノパリン合成 酵素遺伝子のターミネータ一（Tnos)、タバコ PRla遺伝子のターミネータ一が挙げら れるが、これに限定されない。
[0065] 本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決 定し、またその頻度を直接的に調節する DNAの ORF内の領域をいい、 RNAポリメ ラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定 タンパク質コード領域の第 1ェキソンの上流約 2kbp以内の領域であることが多いの で、 DNA解析用ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予 測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構 造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず 、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一ェキソ ン翻訳開始点から上流約 2kbp以内に存在する。
[0066] 本明細書において、本発明のプロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物の すべての糸且織にお!、て、その生物の発生の!/、ずれの段階にあってもほぼ一定の量 で発現される性質をいう。具体的には、本明細書の実施例と同様の条件でノーザン プロット分析したとき、例えば、任意の時点で (例えば、 2点以上 (例えば、 5日目およ び 15日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量 がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーター は、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。こ れらの性質は、生物の任意の部分力 RNAを抽出してノーザンプロット分析で発現 量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンプロットにより定量すること により決定することができる。
[0067] 「ェンノ、ンサ一」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。動物細 胞において使用する場合、ェンノヽンサ一としては、 SV40プロモーター内の上流側の 配列を含むェンノヽンサ一領域が好ましい。ェンノヽンサ一は複数個用いられ得るが 1 個用いられてもよいし、用いなくともよい。
[0068] 本明細書において使用する場合、「作動可能に連結された (る）」とは、所望の配列 の発現 (作動）がある転写翻訳調節配列 (例えば、プロモーター、ェンハンサーなど） または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作 動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置 される力 必ずしも隣接して配置される必要はない。
[0069] 本発明において使用する場合、用語「形質転換」、「形質導入」および「トランスフエ クシヨン」は、特に言及しない限り互換可能に使用され、宿主細胞への核酸の導入を 意味する。形質転換方法としては、宿主細胞に DNAを導入する方法であればいず れも用いることができ、例えば、エレクト口ポーレーシヨン法、パーティクルガン (遺伝 子銃）を用いる方法、リン酸カルシウム法などの種々の周知の技術が挙げられる。
[0070] 「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または 一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞 等が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組 織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすベて包含す るが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
[0071] 原核細胞としては、ェシエリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、 コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シユードモナス属等に属する原核細胞、 例 ば、 Escherichia coll XL 1— Blue、 Escherichia coll XL2— Blue、 Esch erichia coli DH1、 Escherichia coli MC1000、 Escherichia coli KY327
6、 Eschericnia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB101、 Escherichia coli No. 49、 Escherichia coli W3110、 Escherich ia coli NY49、 Escherichia coli BL21 (DE3) , Escherichia coli BL21 (D E3) pLysSゝ Escherichia coli HMS 174 (DE3)、 Escherichia coli HMS 17 4 (DE3) pLysS、 Serratia ficaria、 Serratia fonticola、 Serratia liquefacien s、 Serratia marcescens、 Bacillus subtilis、 Bacillus amyloliquefaciens、 B revibacterium ammmoniagenes、 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068、 Brevibacterium saccharolyticumATCCl4066、 Corynebacterium glutamicum ATCし丄 3032、 Corynebacterium glutamicum ATCC 1406
7、 Corynebacterium glutamicum ATCし 13869、 Corynebacterium aceto acidophilum ATCし 13870、 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 153 54、 Pseudomonas sp. D— 0110など力例示される。
[0072] 動物細胞としては、ヒト 'MRC— 5細胞、ヒト 'HEL細胞、ヒト 'WI— 38細胞、マウス' ミエローマ細胞、ラット 'ミエローマ細胞、ヒト'ミエローマ細胞、マウス'ノ、イブリドーマ 細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO細胞、 BHK細胞、アフリカミドリザ ル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、 HBT5637 (特開昭 63— 299)、ヒト大腸癌細胞株な どを挙げることができる。マウス'ミエローマ細胞としては、 ps20、 NSOなど、ラット 'ミ エローマ細胞としては YB2Z0など、ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293 (ATCC : C RL— 1573)など、ヒト白血病細胞としては BALL— 1など、アフリカミドリザル腎臓細 胞としては COS— 1、 COS— 7、 Vero細胞、ヒト大腸癌細胞株としては HCT— 15な どが例示される。
[0073] 本明細書において「動物」は、当該分野において最も広義で用いられ、脊椎動物 および無脊椎動物を含む。動物としては、哺乳綱、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆 虫綱、蠕虫綱などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0074] 本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において 一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、臓器 (器官）の一部であり得 る。臓器 (器官）内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる 働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の 特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有して ヽてもよ ヽ。
[0075] 本明細書において、「器官 (臓器)」とは、 1つ独立した形態をもち、 1種以上の組織 が組み合わさって特定の機能を営む構造体を形成したものをいう。植物では、カルス 、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実などが挙げられるがそれらに限定されな い。動物では、胃、肝臓、腸、脾臓、肺、気管、鼻、心臓、動脈、静脈、リンパ節 (リン パ管系）、胸腺、卵巣、眼、耳、舌、皮膚等が挙げられるがそれらに限定されない。
[0076] 本明細書において、「トランスジ ニック」とは、特定の遺伝子をある生物に組み込 むことまたはそのような遺伝子が組み込まれた生物（例えば、植物または動物（マウス など）を含む）をいう。
[0077] 本発明の生物が、動物の場合、トランスジヱニック生物は、マイクロインジェクション 法 (微量注入法）、ウィルスベクター法、 ES細胞法 (胚性幹細胞法）、精子ベクター法 、染色体断片を導入する方法 (トランスゾミック法)、ェピゾーム法などを利用したトラン スジエニック動物の作製技術を使用して作製することができる。そのようなトランスジェ ニック動物の作成技術は当該分野において周知である。
[0078] 本明細書において使用される場合、「スクリーニング」とは、 目的とするある特定の性 質をもつ物質、あるいは宿主細胞またはウィルスなどを、特定の操作および Zまたは 評価方法で多数の候補力も選抜することをいう。本発明では、所望の活性を有するス クリーニングによって得られたウィルスもまた、本発明の範囲内に包含されることが理 解される。
[0079] 本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様 の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。チップとしては、例えば 、 DNAチップ、プロテインチップ、細胞チップなどが挙げられるがそれらに限定され ない。
[0080] 本明細書において「アレイ」とは、 1以上 (例えば、 1000以上）の標的物質を含む組 成物（例えば、 DNA、タンパク質、細胞）が整列されて配置されたパターンまたはパ ターンを有する基板 (例えば、チップ)そのものをいう。アレイの中で、小さな基板 (例 えば、 10 X 10mm上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、 本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基 板より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば 、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望の細胞のセットで構成さ れる。アレイは好ましくは同一のまたは異なるウィルスを含む細胞を少なくとも 102個、 より好ましくは少なくとも 103個、およびさらに好ましくは少なくとも 104個、さらにより好 ましくは少なくとも 105個を含む。これらの細胞は、好ましくは表面が 125 X 80mm、よ り好ましくは 10 X 10mm上に配置される。形式としては、 96ウェルマイクロタイタープ レート、 384ウェルマイクロタイタ一プレートなどのマイクロタイタープレートの大きさの ものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定される標的物質を含 む組成物は、 1種類であっても複数種類であってもよい。そのような種類の数は、 1個 〜スポット数までの任意の数であり得る。例えば、約 10種類、約 100種類、約 500種 類、約 1000種類の標的物質を含む組成物が固定され得る。 [0081] 基板のような固相表面または膜には、上述のように任意の数の標的物質 (例えば、 細胞のような生体分子）が配置され得るが、通常、基板 1つあたり、 108個の生体分子 まで、他の実施形態において 107個の生体分子まで、 106個の生体分子まで、 105個 の生体分子まで、 104個の生体分子まで、 103個の生体分子まで、または 102個の生 体分子までの個の生体分子が配置され得るが、 108個の生体分子を超える標的物質 を含む組成物が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはより 小さいことが好ましい。特に、標的物質を含む組成物（例えば、細胞）のスポットの大 きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、 l— 2nmの桁であり得 る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によ つて決定される。
[0082] アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」 とは、標的物質を含む組成物の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティン グ」とは、ある標的物質を含む組成物のスポットをある基板またはプレートに作製する ことをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピぺッティン グなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当 該分野にお 、て周知である。
[0083] 本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい 、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを 伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすベての各々のアドレスにおける存在 物が他のアドレスにおける存在物力も識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状 を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得 る力、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し 、 「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がな い場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。
[0084] 各々のアドレスを定めるサイズは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のァ ドレスの数、標的物質を含む組成物の量および zまたは利用可能な試薬、微粒子の サイズおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依 存する。大きさは、例えば、 1— 2nm力 数 cmの範囲であり得る力 そのアレイの適 用に一致した任意の大きさが可能である。
[0085] アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の 適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得 る力、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループィ匕され得 る。
[0086] 本明細書において使用される場合、「支持体」とは、細胞、細菌、ウィルス、ポリヌク レオチドまたはポリペプチドを担持することができる物質を 、う。支持体の材料として は、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される細胞な どに結合する特性を有する力またはそのような特性を有するように誘導体化され得る 、任意の固体材料が挙げられる。
[0087] 支持体として使用するための材料には、固体表面を形成し得る任意の物質が使用 され得る力 例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、 金属 (合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロー ス、キトサン、デキストラン、およびナイロン)以下が挙げられるがそれらに限定されな い。好ましくは、支持体は、疎水性結合を行う部分を含む。支持体は、複数の異なる 材料の層カゝら形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サフアイ ァ、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機材料を使用できる。 また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタ レート、不飽和ポリエステル、含フッ素榭脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩ィ匕ビユリデン、ポ リ酢酸ビュル、ポリビュルアルコール、ポリビュルァセタール、アクリル榭脂、ポリアタリ 口-トリル、ポリスチレン、ァセタール榭脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フエノール榭 脂、尿素樹脂、エポキシ榭脂、メラミン榭脂、スチレン'アクリロニトリル共重合体、ァク リロ-トリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン榭脂、ポリフエ-レンオキサイド、 ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。あるいは、支持体として、ニトロセル ロース膜、 PVDF膜など、ブロッテイングに使用される膜を用いることもできる。
[0088] 本発明の水痘帯状疱疹ウィルスは、感染症の処置、予防、および Zまたは治療の ための薬学的組成物の成分としても使用することが可能である。
[0089] 本明細書にぉ 、て薬剤の「有効量」とは、その薬剤が目的とする薬効が発揮するこ とができる量をいう。本明細書において、そのような有効量のうち、最小の濃度を最小 有効量ということがある。そのような最小有効量は、当該分野において周知であり、通 常、薬剤の最小有効量は当業者によって決定されている力 または当業者は適宜決 定することができる。そのような有効量の決定には、実際の投与のほか、動物モデル などを用いることも可能である。本発明はまた、このような有効量を決定する際に有用 である。
[0090] 本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような 農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないもの をいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられる がそれらに限定されない:抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化 剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および Zまた は農学的もしくは薬学的アジュバント。
[0091] 本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法に よって得られた情報 (例えば、疾患に関する情報)を元に、使用目的、対象疾患 (種 類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形 態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモ- タリング方法を被検体 (または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（ 種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮 して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度として は、例えば、毎日 数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1回 1ヶ月に 1回）のモニタリン グが挙げられる。 1週間一 1ヶ月に 1回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好 ましい。
[0092] 本明細書において「指示書」は、本発明の治療方法などを医師、患者など投与を行 う人に対して記載したものである。この指示書は、本発明の医薬などを例えば、放射 線治療直後または直前 (例えば、 24時間以内など）に投与することを指示する文言 が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁 (例えば、日本 であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局 (FDA)など)が規定した様式に 従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわ ゆる添付文書 (package insert)であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限 定されず、例えば、電子媒体 (例えば、インターネットで提供されるホームページ、電 子メール)のような形態でも提供され得る。
[0093] 必要に応じて、本発明の治療では、 2種類以上の薬剤が使用され得る。 2種類以上 の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよぐ異なる性質 または由来の薬剤を使用してもよい。このような 2種類以上の薬剤を投与する方法の ための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。
[0094] 本発明では、 V、つたん類似の種類 (例えば、ヒトに対するマウスなど）の生物、培養 細胞、組織などに関し、ある特定の糖鎖構造の分析結果と、疾患レベルとが相関付 けられた場合、対応する糖鎖構造の分析結果と、疾患レベルとが相関付けることがで きることは、当業者は容易に理解する。そのような事項は、例えば、動物培養細胞マ -ュアル、瀬野ら編著、共立出版、 1993年などに記載され支持されており、本明細 書にぉ 、てこのすべての記載を援用する。
[0095] (本明細書にぉ 、て用いられる一般的技術）
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当 該分野の技術範囲内にある、糖鎖科学、マイクロフルイデイクス、微細加工、有機化 学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野にお ける周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献およ び本明細書にぉ 、て他の場所お 、て引用した文献にぉ 、ても十分に説明されて ヽ る。
[0096] 微糸田カロェについては、伊えば、 Campbell, S. A. (1996) . The Science and
Engineering of Microelectronic Fabrication, Oxford University Pres s ;Zaut, P. V. (,1996) . Micromicroarray Fabrication： a Practical Guide to Semiconductor Processing, Semiconductor Services ; Madou, M. J. ( 1997) . Fundamentals of Microfabrication, CRC1 5 Press ;Rai—Choud hury, P. (1997) . Handbook of Microlithography, Micromachining , & Microfabrication: Microlithographyなどに記載されており、これらは本明細書に おいて関連する部分が参考として援用される。 [0097] 本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手 法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば 、 Maniatis, T. et al. (1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual , Cold Spring Harborおよびその 3rd Ed. (2001)； Ausubel, F. M. , et al. eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. , NY, 10158 (2000) ;Innis, M. A. (1990) . PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Academic Press ;Innis, M. A. et al. ( 1995) . PCR Strategies, Academic Press ; Sninsky, J. J. et al. (1999) . P CR Applications： Protocols for Functional Genomics, Academic Press ； Gait, M. J. (1985) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach , IRL Press ; Gait, M. J. (1990) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical
Approach, IRL Press ; Eckstein, F. (1991) . Oligonucleotides and Ana logues : A Practical Approac , IRL Press ; Adams, R. L. et al. (1992) . The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarov a, Z. et al. (1994) . Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim ; Blackburn, G. M. et al. (1996) . Nucleic Acids in Chemistr y and Biology, Oxford University Press； Hermanson, G. T. (1996) . Bi oconjugate Techniques, Academic Press ; Method in Enzymology 230 、 242、 247、 Academic Press, 1994 ;別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実 験法」羊土社、 1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部 分 (全部であり得る）が参考として援用される。
[0098] (好ま 、実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であ り、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべ きである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲 内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
[0099] 1つの局面において、本発明は、組換え水痘帯状疱疹ウィルスを提供する。好まし くは、この水痘帯状疱疹ウィルスは、そのゲノム配列中に BACベクター配列を含む。 BACベクター配列を含む水痘帯状疱疹ウィルスゲノムを構築することによって、 BA C分子として細菌内において水痘帯状疱疹ウィルスゲノムを取り扱うことが可能となる 。使用される BACベクター配列は、好ましくは、 Fプラスミド由来の複製開始点を含む 力 Fプラスミド由来の複製開始点以外の配列であってもよぐ 300kb以上の配列を 細菌人工染色体として細菌細胞内において保持および増殖が可能である限り、任意 の複製開始点を利用することができる。本発明の BACベクターは、細菌宿主細胞、 好ましくは、大腸菌細胞において保持、および Zまたは増幅することが可能である。 好ましくは、この BACベクターの一部は、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの非必須領域 内に挿入され、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムを含む BACとして操作が可能になる。こ の水痘帯状疱疹ウィルスゲノムを含む BACは、哺乳動物細胞に導入された場合、組 換え水痘帯状疱疹ウィルスを産生、増殖することが可能である。組換え水痘帯状疱 疹ウィルスの宿主細胞としては、野生型水痘帯状疱疹ウィルス株が増殖し得る任意 の哺乳動物細胞を使用することができる。好ましくは、この宿主細胞は、ヒト由来であ り、限定されることはないが、例えば、ヒト 'MRC— 5細胞、ヒト 'HEL細胞、ヒト 'WI— 38細胞である。
(多価ワクチン）
本発明の BACは、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムにコードされるタンパク質以外の任 意の抗原タンパク質をコードする遺伝子を含み得る。抗原タンパク質は、限定される ことはないが、好ましくは、水痘帯状疱疹ウィルス以外のウィルスのタンパク質であり、 その結果、本発明に従って、多価ワクチンが提供される。抗原タンパク質が由来する 水痘帯状疱疹ウィルス以外のウィルスとしては、例えば、ムンプスウィルス、麻疹ウイ ルス、風疹ウィルス、ウェストナイルウィルス、インフルエンザウイルス、 SARSコロナゥ ィルス、および日本脳炎ウィルスカゝらなる群カゝら選択されるウィルスが挙げられるが、 これらに限定されない。一つの局面においては、水痘帯状疱疹ウィルス以外のウイ ルスとしては、ムンプスウィルス、麻疹ウィルス、および風疹ウィルスからなる群力ゝら選 択されるウィルスが挙げられる力 これに限定されない。一つの局面においては、水 痘帯状疱疹ウィルスゲノムを含む単一の BACベクター力 ムンプスウィルスの遺伝子 、麻疹ウィルスの遺伝子、および風疹ウィルスの遺伝子を含む。好ましくは、ムンプス ウィルスの遺伝子は、 HN遺伝子、 F遺伝子、および、 N遺伝子からなる群から選択さ れる。好ましくは、麻疹ウィルスの遺伝子は、 H遺伝子、 F遺伝子、および、 N遺伝子 カゝらなる群カゝら選択される。好ましくは、風疹ウィルスの遺伝子は、 C遺伝子、 E1遺伝 子、および、 E2遺伝子からなる群から選択される。好ましくは、インフルエンザウィル スの遺伝子は、 HA遺伝子である。好ましくは、 SARSコロナウィルスの遺伝子は、 S ( スパイク)遺伝子である。好ましくは、ウェストナイルウィルスの遺伝子は、 Pr遺伝子、 および、 E遺伝子からなる群から選択される。好ましくは、 日本脳炎ウィルスの遺伝子 は、 Pr遺伝子、および、 E遺伝子からなる群から選択される。これらウィルスの遺伝子 は公知であるので、 PCR法およびハイブリダィゼーシヨン法などの周知技術を用いて 、当業者は、これらウィルスの遺伝子を単離することが可能である。
[0101] (水痘帯状疱疹ウィルスゲノムを含む BACベクターの作製方法）
水痘帯状疱疹ウィルスゲノムと、 BACベクターを用いて、水痘帯状疱疹ウィルスゲ ノムを含む BACベクターを作製するためには、相同組換えを用いる方法など、種々 の周知の方法を使用することが可能である。
[0102] 相同組換えを用いる方法としては、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムと相同な配列を連 結した環状 BACベクター配列を有する核酸を用いる方法が挙げられる。
[0103] 水痘帯状疱疹ウィルスゲノムと相同な配列を連結した環状 BACベクター配列を有 する核酸を用いる、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムを含む BACベクターの作製方法は 、代表的には、（1)その核酸を、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムとともに、宿主内（例え ば、ヒト株化細胞内）に導入し、（2)宿主細胞を培養して、環状 BACベクター配列に 連結された相同配列と、水痘帯状疱疹ウィルスゲノム配列との間で相同組換えを起 こし、 （3)この相同組換えによって生じた、 BACベクター配列を組み込んだ水痘帯状 疱疹ウィルスゲノム配列を含む宿主細胞を選択し、（4)その宿主細胞を培養して、環 状ウィルス DNAを抽出する、という工程を包含する。
[0104] また、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムと、 BAC配列を用いて、水痘帯状疱疹ウィルス ゲノムを含む BACを作製するためには、相同組換えを用いることなぐ核酸の制限酵 素断片を用いるなどの、種々の周知の方法を使用することも可能である。
[0105] 水痘帯状疱疹ウィルスゲノム内において、 BACベクター配列を導入するための非 必須領域は、以下の領域からなる群から選択される：
遺伝子 13の ORF内の領域、遺伝子 56の ORF内の領域、遺伝子 57の ORF内の領 域、遺伝子 58の ORF内の領域、遺伝子 11の ORFに隣接する領域、遺伝子 12の O RFに隣接する領域、遺伝子 13の ORFに隣接する領域、遺伝子 56の ORFに隣接 する領域、遺伝子 57の ORFに隣接する領域、遺伝子 58の ORFに隣接する領域、 および、遺伝子 56, 57, 58の連続する領域。
[0106] 好ましくは、この非必須領域は、遺伝子 13の ORF内の領域、遺伝子 56の ORF内 の領域、遺伝子 57の ORF内の領域、遺伝子 58の ORF内の領域、遺伝子 13の OR Fに隣接する領域、遺伝子 56の ORFに隣接する領域、遺伝子 57の ORFに隣接す る領域、および、遺伝子 58の ORFに隣接する領域、遺伝子 56, 57, 58の連続する 領域である。なぜなら、遺伝子 13、遺伝子 56と遺伝子 58、遺伝子 56, 57, 58の連 続する領域は、水痘帯状疱疹ウィルスゲノム上で欠損したとしても、ウィルスの増殖 に影響しないことが本発明によって明ら力となった力 である。
あるいは、 BACベクター配列の一部は、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの遺伝子 62の ORF内の領域に挿入されて!、てもよ!/、。
[0107] 本発明において使用される BACベクター配列は、好ましくは、組換えタンパク質依 存性組換え配列、および Zまたは選択マーカーを含む。好ましくは、選択マーカー 配列は薬剤選択マーカー、および Zまたはグリーン蛍光タンパク質をコードする遺伝 子である。なぜなら、簡便に所望の遺伝子の存在を確認できるからである。
[0108] 本発明において出発物質として使用される水痘帯状疱疹ウィルスは、野生株由来 であっても、変異株由来であってもよい。好ましくは、出発物資としての水痘帯状疱疹 ウィルスは、弱毒化されたウィルス、例えば、 Okaワクチン株または遺伝子 62に変異 を有する水痘帯状疱疹ウィルスを用いる。弱毒化した水痘帯状疱疹ウィルスとしては 、以下力 なる群力 選択される遺伝子 62の変異の 1つ、または 2つ以上の変異の組 み合わせを有するウィルスが挙げられる：
(a) 2110番塩基が G ;
(b) 3100番塩基が G ;
(c) 3818番塩基が C ; (d) 4006番塩基が G ;
(e) 1251番塩基が G ;
(f) 2226番塩基が G ;
(g) 3657番塩基が G ;
(h) 162番塩基が C ;
(i) 225番塩基が C ;
(j) 523番塩基が C ;
(k) 1565番塩基が C ;
(1) 1763番塩基が C ;
(m) 2652番塩基が C ;
(n) 4052番塩基が C；および
(o) 4193番塩基が C。
[0109] 本発明のさらなる局面において、上記ウィルスを製造するために使用されるべクタ 一、および上記ウィルスの製造方法もまた提供される。本発明の別の局面において、 上記ウィルスを含む薬学的組成物、およびワクチンの形態である薬学的組成物が提 供される。
[0110] 本明細書の組換え水痘帯状疱疹ウィルスは、ワクチンとして有用である。なぜなら、 野生型ウィルスと同様の構造を有するタンパク質を多数含む力もである。
[0111] 本発明のさらなる局面において、本発明のワクチンを産生するためのベクターに変 異を導入する方法が提供される。この方法は、以下の工程:該ベクターを細菌宿主細 胞に導入する工程;水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部カゝらなるフラグメントを含むプ ラスミドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該フラグメント は少なくとも 1つの変異を有する、工程；該細菌宿主細胞を培養する工程；該培養し た細菌宿主細胞から、 BACベクター配列を有するベクターを単離する工程、を包含 する。上記方法においては、細菌宿主細胞内において、本発明のワクチンを産生す るためのベクターと水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部からなるフラグメントを含むプ ラスミドベクターとの間で相同組換えが起こり、その結果、本発明のワクチンを産生す るためのベクター力、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部力 なるフラグメント上の変 異を有する。
[0112] 上記の方法において、ベクターを細菌宿主細胞に導入する工程としては、エレクト 口ポーレーシヨンなどの種々の周知の方法を使用することが可能である。同様にして 、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部力 なるフラグメントを含むプラスミドベクターを 細菌宿主細胞に導入することができる。また、このフラグメントに変異を導入する方法 としては、 PCRを用いる変異導入方法が周知であり、例えば、プルーフリーディング 機能を有さな 、耐熱性ポリメラーゼを 4つのヌクレオチドの 1つが少な 、条件で用いる ことによって、ランダムに変異を導入することが可能である。また、変異塩基配列を有 するプライマーを用いて PCRを行うことによって、所望の位置に所望の変異を導入す ることも可能である。この細菌細胞を培養することによって、本発明のワクチンを産生 するためのベクターと水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部からなるフラグメントを含む プラスミドベクターとの間で相同組換えが起こり、その結果、本発明のワクチンを産生 するためのベクター力 水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部力 なるフラグメント上の 変異を有する。細菌宿主細胞力 BACベクター配列を調製するためには、アルカリ 法のような種々の周知の方法および市販のキットを使用することが可能である。
[0113] 本発明の別の局面において、本発明のワクチンを産生するためのベクターに変異 を導入するさらなる方法が提供される。この方法は、以下の工程:該ベクターを細菌 宿主細胞に導入する工程；水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部力 なる第 1のフラグ メントを含む第 1のプラスミドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、こ こで、該第 1のフラグメントは少なくとも 1つの変異を有する、工程;水痘帯状疱疹ウイ ルスゲノムの一部力 なる第 2のフラグメントを含む第 2のプラスミドベクターを該細菌 宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該第 2のフラグメントは少なくとも 1つの変 異を有し、そして該第 2のフラグメントは該第 1のフラグメントとは異なる、工程;該細菌 宿主細胞を培養する工程;該培養した細菌宿主細胞から、 BACベクター配列を有す るベクターを単離する工程、を包含する。
[0114] 本発明の一つの局面において、本発明のワクチンを製造するために使用され得る 核酸カセットが提供される。この核酸カセットは、好ましくは、細菌細胞内において水 痘帯状疱疹ウィルスゲノムと相同組換えし得る第 1のフラグメント、 BACベクター配列 、および細菌細胞内にぉ 、て水痘帯状疱疹ウィルスゲノムと相同組換えし得る第 2の フラグメントを含む核酸カセットであって、ここで、該 BAC配列の両端の各々がそれぞ れ第 1のフラグメントおよび第 2のフラグメントと連結している。ここで、第 1のフラグメン トおよび第 2のフラグメントは、好ましくは、少なくとも lkb、少なくとも 1. 5kb、少なくと も 2kbである。この第 1のフラグメントおよび第 2のフラグメントは、水痘帯状疱疹ウィル スゲノムの配列に対して、好ましくは、少なくとも 80%同一、少なくとも 85%同一、少 なくとも 90%同一、少なくとも 95 %同一である。
[0115] 好ましくは、この第 1および第 2のフラグメントが、各々独立して水痘帯状疱疹ウィル スゲノムの以下の領域からなる群から選択される領域由来であるか、以下の領域から なる群力も選択される領域と少なくとも 80%、 85%、 90%、 95%同一である： 遺伝子 13の ORF内の領域、遺伝子 56の ORF内の領域、遺伝子 57の ORF内の領 域、遺伝子 58の ORF内の領域、遺伝子 11の ORFに隣接する領域、遺伝子 12の O RFに隣接する領域、遺伝子 13の ORFに隣接する領域、遺伝子 56の ORFに隣接 する領域、遺伝子 57の ORFに隣接する領域、および、遺伝子 58の ORFに隣接する 領域。
[0116] 好ましくは、この第 1および第 2のフラグメントは、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの異 なる領域に由来する。この第 1および第 2のフラグメントは、各々独立して、遺伝子 13 の ORF内の領域、遺伝子 56の ORF内の領域、遺伝子 57の ORF内の領域、遺伝子 58の ORF内の領域、遺伝子 11の ORFに隣接する領域、遺伝子 12の ORFに隣接 する領域、遺伝子 13の ORFに隣接する領域、遺伝子 56の ORFに隣接する領域、 遺伝子 57の ORFに隣接する領域、および、遺伝子 58の ORFに隣接する領域由来 であってもよい。好ましくは、相同組換えを制御し、そして所望の遺伝子を簡便に検 出するために、 BACベクター配列は組換えタンパク質依存性組換え配列、および Z または選択マーカーを含む。この選択マーカーは薬剤選択マーカーであっても、ダリ ーン蛍光タンパク質のような蛍光タンパク質をコードする遺伝子であってもよ 、。代表 的には、この BACベクター配列は、配列番号 3に記載の核酸配列を有する。
[0117] (変異型組換え水痘帯状疱疹ウィルスの調製）
本発明の方法を用いて、変異導入した水痘帯状疱疹ウィルスゲノムを有する変異 型水痘帯状疱疹ウィルスを、簡便に調製することが可能である。
そのような変異導入は、例えば、以下の方法を用いて行うことができる：
大腸菌内に、（a)VZV— BAC— DNAプラスミド、および (b)変異核酸として、任意の 変異を有する水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの部分配列を持つシャトルベクターまたは PCR産物、を導入する。 VZV— BAC— DNAプラスミドと、その変異核酸との間で組 換えを起こすことによって、 VZV— BAC— DNAプラスミドに変異を導入することがで きる。また、トランスポゾンを用いることによつても、ランダムに変異を導入することが可 能である。そして変異が導入された VZV— BAC— DNAプラスミドは、大腸菌内で容 易に選択および増幅させることができる。そして、変異を持っVZV—BAC— DNAか らウィルスを産出させることによって、組換え水痘帯状疱疹ウィルスを得ることができ る（Markus Wagnerゝ TRENDS in Microbilogyゝ Vol. 10、 No. 7、 2002年 7 月）。その具体例を以下に列挙する：
(1)変異核酸として、変異水痘帯状疱疹ウィルス遺伝子を含む温度感受性シャトル ベクターを用いる場合；
第 1に、シャトルベクターと VZV— BAC— DNAプラスミドを、第 1の相同的領域を 介して、組換えさせ、シャトルベクターと VZV—BAC— DNAプラスミドとが連結した、 共挿入体を生じる。次に、シャトルベクターの複製オリジンが温度感受性であることか ら、シャトルプラスミドが除かれる。第 2の組換え事象において、共挿入された部分が 取り除かれる。第 2の組換え事象が、第 1の相同的領域を介して生じる場合、組換え に使用した VZV— BAC DNAと同一の配列を有するプラスミドが生成される。これ に対して、第 2の組換え事象が、第 1の相同領域とは異なる第 2の相同領域を介して 生じる場合、シャトルベクター上の変異を有する変異型 VZV—BAC— DNAプラスミ ドが得られる。第 1の相同領域と、第 2の相同領域とがほぼ同じ長さである場合、第 2 の組換え事象が第 2の相同領域で起こる確率は、第 2の組換え事象が第 1の相同領 域で起こる確率とほぼ同じである。そのため、得られる VZV— BAC— DNAプラスミド の、約 2分の 1が糸且換えに用いた配列と同一の配列を有するプラスミドであり、約 2分 の 1がシャトルベクターに導入した変異を有するプラスミドである。
(2)直鎖状 DNAフラグメントを用いる場合； この方法では、例えば、プロファージ Rac由来の recETの組換え機能を用いるか、 またはバタテリオファージ λ由来の red o; |8の組換え機能を利用し、直鎖状 DNAフ ラグメントを用いて、環状 VZV— BAC— DNA分子に変異を導入する。具体的には、 標的配列に隣接する選択マーカーおよび相同配列を含む直鎖状 DNAフラグメント を、 VZV— BAC— DNAとともに、相同組換えを生じ得る大腸菌に導入する。大腸菌 内での直鎖状 DNAの分解を避けるために、エタソヌクレアーゼ欠損の大腸菌を使用 するか、またはバタテリオファージ由来のエタソヌクレアーゼ阻害剤である red γ (ga m)を発現させることが好ましい。直鎖状 DNAは、その両端に VZV— BAC— DNA プラスミドと相同な領域を有する。その相同な領域を介して相同組換えを生じることに よって、直鎖状 DNAフラグメント内の所望の配列を VZV— BAC DNA内に導入す ることができる。 recET、または redひ j8組換え機能を使用する場合、これらの組換え 機能は、 25〜50ヌクレオチド程度の長さの相同配列によって相同組換えを生じるこ とから、 recA媒介性相同組換えよりも、簡便に使用することができる。
(3)トランスポゾンを用いる場合；
トランスポゾンエレメントが大腸菌内の核酸にランダムに挿入する機能を用いる。例 えば、トランスポゾンエレメントと VZV— BAC— DN Aを大腸菌に導入し、 VZV— BA C DNA内にランダムにトランスポゾンエレメントを挿入することによって、挿入変異 を生じる。
[0119] さらに、例えば、 VZV— BAC— DNAのような糸且換え水痘帯状疱疹ウィルスを有す る宿主細胞自体を、変異剤（例えば、ニトロソグァ-ジン）によって処置をすることによ つて、組換え水痘帯状疱疹ウィルスゲノム内にランダムな変異を導入することも可能 である。
[0120] (処方）
本発明はまた、有効量の治療剤'予防剤の被験体への投与'接種による、疾患また は障害 (例えば、感染症)の処置および Zまたは予防の方法を提供する。治療剤'予 防剤は、薬学的に受容可能なキャリア型 (例えば、滅菌キャリア）と組み合せた、本発 明の組成物を意味する。
[0121] 治療剤'予防剤を、個々の患者の臨床状態 (特に、治療剤'予防剤単独処置の副 作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入 れ、医療実施基準（GMP = good medical practice)を遵守する方式で処方およ び投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行 つて決定される。
[0122] 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤 ·予防剤の合計薬学的 有効量は、患者体重の、約 1 g/kg/日〜： LOmgZkgZ日の範囲にあるが、上記 のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、本発明の細胞生理活性 物質について、この用量は、少なくとも 0. OlmgZkgZ日、最も好ましくはヒトに対し て約 0. OlmgZkgZ日と約 lmgZkgZ日との間である。連続投与する場合、代表 的には、治療剤'予防剤を約 1 μ gZkgZ時間〜約 50 ;ζ gZkgZ時間の投薬速度 で 1日に 1〜4回の注射かまたは連続皮下注入 (例えばミニポンプを用いる）のいず れかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために 必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化す るよつである。
[0123] 治療剤 ·予防剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（intmcistemally)、膣内、 腹腔内、局所的 (粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あ るいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。「薬学的に受容可能なキャリア」と は、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の 処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔 内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
[0124] 本発明の治療剤 ·予防剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性 治療剤 ·予防剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内（intmcistemally )、膣内、腹腔内、局所的 (粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど） 、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能な キャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または 任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋 肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式を いう。 [0125] 非経口投与のために、 1つの実施態様において、一般に、治療剤'予防剤は、それ を所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量およ び濃度でレシピエントに対して毒性がなぐかつ処方物の他の成分と適合するものと 、単位投薬量の注射可能な形態 (溶液、懸濁液または乳濁液)で混合することにより 処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化、および治療剤 ·予防剤に対し て有害であることが知られて 、る他の化合物を含まな 、。
[0126] 一般に、治療剤 ·予防剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその 両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成 物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より好まし くはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例として は、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発 性油およびォレイン酸ェチルのような非水性ビヒクルもまた、リボソームと同様に本明 細書において有用である。
[0127] キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に 含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性 がなぐこのような物質としては、リン酸塩、クェン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の 有機酸またはその塩類のような緩衝剤；ァスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（ 約 10残基より少ない）ポリペプチド (例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清 アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビュルピロリドンの ような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、ァスパラギン酸またはアルギニンのよう なアミノ酸;セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを 含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物; EDTAのようなキレート剤；マン-トー ルまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および Zまた はポリソルベート、ポロキサマーもしくは PEGのような非イオン性界面活性剤が挙げら れる。
[0128] 治療的投与に用いられるべき任意の薬剤は、有効成分としてのウィルス以外の生 物 ·ウィルスを含まない状態、すなわち、無菌状態であり得る。滅菌濾過膜 (例えば 0 . 2ミクロンメンブレン)で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、 治療剤'予防剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺 可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。
[0129] 治療剤 ·予防剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルま たはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される 。凍結乾燥処方物の例として、 10mlのバイアルに、滅菌濾過した 1% (WZV)治療剤 •予防剤水溶液 5mlを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥した 治療剤 ·予防剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
[0130] 本発明はまた、本発明の治療剤'予防剤の 1つ以上の成分を満たした一つ以上の 容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製 造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に 付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機 関による承認を表す。さらに、治療剤 ·予防剤を他の治療用化合物と組み合わせて 使用し得る。
[0131] 本発明の治療剤 ·予防剤は、単独または他の治療剤 ·予防剤と組み合わせて投与 され得る。本発明の治療剤 ·予防剤と組み合わせて投与され得る治療剤 ·予防剤とし ては、化学療法剤、抗生物質、ステロイドおよび非ステロイドの抗炎症剤、従来の免 疫治療剤'予防剤、他のサイト力インおよび Zまたは増殖因子が挙げられるが、これ らに限定されない。組み合わせは、例えば、混合物として同時に；同時にまたは並行 してだが別々に；あるいは経時的のいずれかで投与され得る。これは、組み合わされ た薬剤が、治療用混合物として共に投与されるという提示、およびまた、組み合わさ れた薬剤が、別々にしかし同時に、例えば、同じ個体に別々の静脈ラインを通じて投 与される手順を含む。「組み合わせて」の投与は、一番目、続いて二番目に与えられ る化合物または薬剤のうち 1つの別々の投与をさらに含む。
[0132] 特定の実施態様において、本発明の治療剤'予防剤は、抗レトロウイルス薬剤、ヌク レオシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、および Z またはプロテーアーゼインヒビターとの組み合わせで投与される。
[0133] さらなる実施態様において、本発明の治療剤'予防剤は、抗生物質と組合わせて 投与される。使用され得る抗生物質としては、アミノグリコシド系抗生物質、ポリェン系 抗生物質、ペニシリン系抗生物質、セフエム系抗生物質、ペプチド系抗生物質、マク 口ライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質が挙げられるが、これらに限定され ない。
[0134] さらなる実施態様において、本発明の治療剤'予防剤は、単独または抗炎症剤と組 合わせて投与される。本発明の治療剤 ·予防剤とともに投与され得る抗炎症剤として は、ダルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸誘導 体、ァリール酢酸誘導体、ァリール酪酸誘導体、ァリールカルボン酸、ァリールプロピ オン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、 e—ァセトアミドカプロン酸、 S—アデノシルメチォニン、 3—アミノー 4—ヒドロキシ酪酸 、アミキセトリン（amixetrine)、ベンダザック、ベンジドアミン、ブコローム、ジフェンピ ラミド、ジタゾール、ェモル ファゾン、グアイァズレン、ナブメトン、二メスリド、オルゴテ イン、ォキサセプロール、パラ二リン、ペリゾキサル、ピフォキシム、プロキアゾン、プロ キサゾール、およびテニダップが挙げられる力 これらに限定されない。
[0135] さらなる実施形態において、本発明の治療剤'予防剤は、他の治療レジメまたは予 防レジメ (例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。
[0136] 以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるも のではない。
実施例
[0137] (実施例 1： BACベクターを挿入する領域 (遺伝子）の選択）
BACベクターを利用して、外来抗原遺伝子を挿入した組換えウィルスを作製する 場合、多数の外来遺伝子を挿入することによってゲノムサイズが大きくなる。ゲノムサ ィズが大きくなりすぎると、ゲノム DNAが力プシドにパッケージされず、組換えウィル スが作製できないことが知られている。そこで、多数の抗原遺伝子を Okaワクチン株 に挿入するためには、 Okaワクチン株の非必須遺伝子をノックアウトして、ゲノム DN Aサイズを減少させる必要があると考えられる。また、ノックアウトしてもウィルスが増殖 できる非必須遺伝子は、 BACベクター配列または他のウィルス由来の抗原タンパク 質をコードする遺伝子などのような外来配列を挿入する部位としても適切である。
[0138] そこで、水痘ウィルス Oka原株ゲノムを BACベクターに挿入した組換え DNA(P— Oka株 VZV— BAC— DNA)を用いて、遺伝子 7の ORF (HSV UL51ホモログ）、 遺伝子 13の ORF (チミジンシンセターゼ）、遺伝子 21の ORF (ヌクレオカプシド）、遺 伝子 48の ORF (プロテインキナーゼ）、遺伝子 46の ORF (HSV UL16ホモログ）、 遺伝子 56の ORF (HSV UL4ホモログ）、遺伝子 58の ORF (HSV— 1 UL3ホモ ログ）、遺伝子 66の ORF (プロテインキナーゼ)遺伝子力 それぞれ非必須遺伝子な のか必須遺伝子なのかを調べた。
[0139] (方法）
カナマイシン遺伝子の両端に、ノックアウトの標的となる遺伝子の配列を、標的とな る遺伝子のゲノム内での配向と同一方向になるように連結し、ノックアウトベクターを 作製した。このノックアウトベクターを、 P— Oka株 VZV— BAC— DNAを保持した大 腸菌内に導入し、ノックァゥトベクターと P - Oka株 VZV— BAC - DNAとの間で相 同組換えを起こさせ、標的遺伝子をノックアウトした。
[0140] (結果）
遺伝子 13の ORF、遺伝子 56の ORF、遺伝子 58の ORF、および、遺伝子 560RF -遺伝子 570RF -遺伝子 580RFの連続した領域を欠損させた P - Oka株 VZV— BAC— DNAを MRC— 5細胞にトランスフエクシヨンしたところ組換えウィルスが発生 した。従って、これらの遺伝子は、非必須遺伝子であることが判明した。遺伝子 13お よび 57の ORFに関しては、非必須遺伝子であると考えられていたが、今回に実験に よって確認された。従来、必須遺伝子であると考えられていた遺伝子 21をノックアウト したところ、組換えウィルスを得ることはできな力つた。これに対して、従来、非必須遺 伝子であると考えられていた遺伝子 7、遺伝子 46、遺伝子 48、および遺伝子 66を欠 損したところ、組換えウィルスを得ることができな力つた。
[0141] 今回の実験によって非必須遺伝子であることが実証された遺伝子の中で、遺伝子 5 6欠損 P - Okaのプラークサイズを P - Okaと比較したところ、遺伝子 56欠損 P - Oka を MRC— 5細胞に感染させた場合のプラークサイズは、他の非必須遺伝子を欠損し た場合よりもやや小さかったが、有意差はなかった。
[0142] 以上の結果より、構造のみから、水痘帯状疱疹ウィルス遺伝子がウィルス増殖に必 須か否かを判断することは、困難であることが判明した。今回の結果から、従来、非 必須遺伝子であると考えられていた遺伝子 13、遺伝子 57に加えて、遺伝子 56、お よび遺伝子 58が、非必須遺伝子であり、ノックアウトしても、ウィルス増殖が影響を受 けないことが判明した。特に、遺伝子 58は、欠損したとしても、ウィルス増殖が何ら影 響を受けな力つた。従って、遺伝子 13および 57に加えて、遺伝子 56、および遺伝子 58、特に 56から遺伝子 58の連続した領域力 ノックアウトおよび外来配列（例えば、 BACベクター配列およびその他の抗原をコードする遺伝子配列）の挿入部位として 好適な遺伝子であることが判明した。
[0143] (実施例 2：遺伝子 13の ORF中にムンプスウィルス HN遺伝子を挿入することによる 、多価ワクチンの製造）
実施例 1において、遺伝子 13が、ノックアウト、および Zまたは外来配列の挿入に 適切な遺伝子であることが判明したので、この遺伝子 13の ORF中にムンプスウィル ス HN遺伝子を挿入することによる、多価ワクチンの製造を行つた。
[0144] ムンブスウィルスの HN遺伝子および F遺伝子を、野外流行株である岩崎株から、 P CRを用いて増幅した。クローユングした岩崎株の F遺伝子および HN遺伝子のァミノ 酸配列を解析したところ、 F遺伝子は野外株やワクチン株と比較的高 ヽ相同性を示し たが（> 98. 5%)、 HN遺伝子は 1990年代後半以降の野外株とは相同性が高く 19 90年代前半以前の野外株やワクチン株とは相同性が低力つた (約 96%)。
[0145] 次に、クローユングした遺伝子の上流に作動可能にヒトサイトメガロウィルス（CMV) のプロモーター Zェンハンサー配列を連結した。 HN遺伝子および F遺伝子を用い たプラスミドを、それぞれ、 pDEST26ZMeV— HNおよび pDEST26ZMeV— Fと 命名した。ヒトサイトメガロウィルスのプロモーター Zェンハンサー配列は、 NF— κ B 結合部位、 AP— 1結合部位、および TATAボックスを有する（図 1)。
[0146] pDEST26ZMeV— Fおよび pDEST26ZMeV— HNを 293細胞にトランスフエ クシヨンし、数種類の抗 Me V抗体と蛍光抗体法で反応させた。その結果、 pDEST2 6ZMeV—Fをトランスフエクシヨンした 293細胞はどの抗体とも反応しなかった力 p DEST26ZMeV—HNをトランスフエクシヨンした細胞は幾つかの抗 MeV抗体（中 和活性を持つ抗体も含まれる)と反応した。
[0147] このムンプスウィルス HN遺伝子と CMVプロモーター Zェンハンサーを結合した核 酸配列の両端に、遺伝子 13の上流および下流を連結したベクターを作製した (塩基 番号は、 P— Okaでの塩基番号である。配列番号 4に示される Dumas株の場合は、 それぞれ、 17037~18440,および、 19347〜20350に対応する。；)。このベクター を、 P— Oka株 VZV— BAC— DNAを保持した大腸菌内に導入し、ベクターと P— O ka株 VZV— BAC— DNAとの間で相同組換えを起こさせ、遺伝子 13の ORFと、ム ンプス HN遺伝子と CMVプロモーター Zェンハンサ一との連結配列とを相同糸且換え した（図 2)。相同組換えが生じたことを、 PCRおよび制限酵素消化によって、確認し た。
[0148] 次に、相同組換えによって作製された BACベクターを、エレクト口ポーレーシヨンに よって MRC— 5細胞にトランスフエクシヨンした。トランスフエクシヨンした細胞のプラー クサイズは、遺伝子 13を破壊して 、な 、ウィルスを用いた場合と同様であった。
[0149] ムンプスウィルスの HN遺伝子産物を検出するために、 FITC標識した抗ムンプスゥ ィルス HNタンパク質抗体（マウス免疫グロブリン ZFITC ャギ F (ab，）2、 DakoCy tomation Denmark A/S, Produktionsvej 42, DK— 2600 Glostrup, De nmark)および Alexa594標識した抗ムンプスウィルス HNタンパク質抗体 (Alexa Flour (登録商標） 594、ャギの抗マウス IgG (H + L)の F (ab，） 2フラグメント、 Molec ular Probes mvitrogen detection technologies Eugene, Oregon, U. S . A. )の各々を用いて、トランスフエクシヨン細胞中での HN遺伝子の発現を確認した 。その結果、いずれの標識抗体を用いても、 HNタンパク質の発現が確認された。
[0150] 本実施例によって、ウィルスの増殖を阻害することなぐ簡便に、水痘帯状疱疹ウイ ルスおよびムンプスウィルスの両方に対する多価ワクチンが製造できた。
[0151] (実施例 3)
(病原性の弱い変異型組換え水痘帯状疱疹ウィルス株の作製）
本発明に従い、以下の方法を用いることによって、変異型組換え水痘帯状疱疹ウイ ルスを調製し、変異ウィルスの中から病原性の弱!ヽ変異水痘帯状疱疹ウィルス株を 得ることが可能である。
[0152] (1：変異型組換え水痘帯状疱疹ウィルスの調製）
変異型組換え水痘帯状疱疹ウィルスの調製方法としては、例えば、変異遺伝子を 含む核酸と VZV— BAC - DNAプラスミドとの間で相同組換えを起こすことによって 、変異型組換え水痘帯状疱疹ウィルスを調製する方法が挙げられる。 VZV-BAC
— DNAプラスミドと相同組換えを起こすために用いられる変異遺伝子は、ランダムな 変異を有していても、部位特異的な変異を有していてもよい。これら各々を用いること によって、ランダムな変異を有する変異型組換え水痘帯状疱疹ウィルスの集団、およ び部位特異的な変異を有する変異型組換え水痘帯状疱疹ウィルスを得ることができ る。以下、その各々についてより詳細に説明する。
[0153] (1. 1 :ランダムな変異を有する変異型組換え水痘帯状疱疹ウィルスの調製）
水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの遺伝子 62に変異を有するウィルスのいくつかが弱 毒化ウィルスであることが公知である。そのため、本実施例においては、 PCRを用い てランダムに変異を導入した遺伝子 62を作製する。 PCRを用いる変異導入方法は 周知であり、例えば、プルーフリーディング機能を有さない耐熱性ポリメラーゼを 4つ のヌクレオチドの 1つが少ない条件で用いることによって、ランダムに変異を導入する ことが可能である。必要に応じて、変異型 62遺伝子に薬剤耐性遺伝子のようなマー カー遺伝子を連結させてもょ ヽ。
[0154] このようにして調製された変異型遺伝子 62を、エレクト口ポーレーシヨン法に従って 、 VZV—BAC— DNAプラスミドとともに大腸菌に導入した。そして、変異型配列 62 を VZV— BAC— DNAに対して相同組換えを起こさせる。その後、相同組換えを生 じた水痘帯状疱疹ウィルスの DNAを単離し、大腸菌に導入し、相同組換えを起こし た VZV— BAC DNAを含む大腸菌を得る。
[0155] 得られた複数の大腸菌は、各々異なる変異を有する遺伝子 62を含む VZV— BAC
— DNAを有する。そこで、各大腸菌に含まれる変異型 VZV—BAC— DNAにより産 生される水痘帯状疱疹ウィルスの病原性の程度を、下記の（2：水痘帯状疱疹ウィル スの病原性の試験方法)を用いてスクリーニングする。
[0156] (1. 2 :部位特異的変異を有する変異型組換え水痘帯状疱疹ウィルスの調製） 所望の部位特異的変異を導入する方法も、当該分野において周知である。例えば 、所望の変異を有するプライマーを用いて PCRを行い、その所望の変異を有する遺 伝子断片を調製し、その後、その変異遺伝子断片を用いて、さらに PCRを行うこと〖こ よる力 または制限酵素などの酵素処理を行うことによって、所望の変異を有する遺 伝子全長を調製する。
[0157] このようにして調製された変異遺伝子について、上記（1. 1. )の手順を用いて、部 位特異的変異を有する変異型組換え水痘帯状疱疹ウィルスを調製する。
[0158] (2：水痘帯状疱疹ウィルスの病原性の試験方法）
水痘帯状疱疹ウィルスの病原性を試験する方法にっ ヽて、 2つの方法が確立され ている。
[0159] 動物モデルを用いる方法として、ヒトの皮膚を移植した重症複合免疫不全 (SCID) マウスを作製し、これに水痘帯状庖疹ウィルスを感染させることによって、病原性につ いての評価をする方法が周知である (J. Virol. 1998Feb ; 72 (2) : 965- 74, )。
[0160] これに対し試験管内で病原性の評価を行う方法としては、ポアサイズが 3 μ mのトラ ンスゥエルで仕切られた二層のゥエルの下側に単層培養のヒトメラノーマ細胞を入れ 、上側に水痘帯状疱疹ウィルスを感染させた臍帯血単核球 (CBMC)をそれぞれ入 れ、 7〜8日培養した後のメラノーマ細胞の CPE (細胞変性効果)の程度を観察する 方法もまた周知である（J. Virol. 2000 Feb ; 74 (4) : 1864— 70)。
[0161] また、病原性を直接確認する方法ではないが、本発明者らのこれまでの結果 Ci Vi rol. 2002 Nov; 76 (22) : 11447— 59)力ら、ウイノレスの病原'性と増殖'性には密接 な関連があることが理解されているため、 infectius center assayによって cell— t o— cel lの増殖性を調べることによつても間接的に病原性について評価を行うことが できる。
[0162] (実施例 4)
(ワクチンの製造）
培養面積 210cm2のルー瓶 20本の MRC - 5細胞培養に、実施例 2で得た組換え 水痘帯状疱疹ウィルスを接種の後、培養する。培養終了後、培養液を捨て、各ルー 瓶内の感染細胞を 200mlの PBS (—）にて 2回洗浄する。次いで、 20mlの 0. 03% ( w/v) EDTA 3Naを各ルー瓶内の感染細胞に重層し、細胞をルー瓶内壁面から 剥離させ浮遊させる。各ルー瓶内の感染細胞浮遊液をプールし、 2, OOOrpmにて 1 0分間、 4°Cで遠心し、感染細胞のペレットを採取する。これを 100mlの PBS (―)に 再浮遊の後、凍結融解を 1回、行う。次に、氷水浴中で超音波処理（20KHz、 150m A、 0. 3秒 Zml)後、 3, OOOrpmで 20分間、 4°Cで遠心し、細胞遊離ウィルスを含有 の上清を採取し、これを生ワクチン原液とする。この原液力も検定用として 30mlをサ ンプリングし、残りの原液 70mlに、 PBS (—）に溶解したサッカロース及びゼラチンカロ 水分解物をワクチン安定化剤として最終濃度が 5% (wZv)及び 2. 5% (w/v)にな るよう添加混合し、 140mlの生ワクチン最終バルタを調製する。この最終バルタから 検定用として 30mlをサンプリングの後、残りバルタを 3ml容のバイャル瓶に 0. 5ml ずつ分注し、凍結乾燥の後、窒素ガスを充填しゴム栓で封をしバイャル瓶内部を気 密密閉する。この生ワクチン小分品は、 4°Cで保存し、使用の直前に注射用蒸留水 0 . 5mlを添加し乾燥内容物を完全に溶解し用いる。一方、サンプリングした上記のヮ クチン原液と最終バルタ、及び小分品 20本につき、検定試験を行う。この検定試験 は、安全性、有効性及び均質姓を確認し、生ワクチンとしての適格性を確定するため 、厚生省告示第 195号に規定の生物学的製剤基準（1989年）「乾燥弱毒生水痘 ヮ クチン」に準拠し、かつ、同じく規定の基準「組換え沈降 B型肝炎ワクチン (酵母由来） 」をも考慮し、実施する。この検定試験の結果、上記の小分品は、そのウィルス含量 力 S2 X 104PFU (プラーク形成単位) Z0. 5mlであり、かつ、上記基準に規定の各種 試験に合格した場合、適格性を備えた生ワクチンとしてその後の使用に供する。
(実施例 5)
(組換え水痘帯状疱疹ウィルスワクチンの免疫原性の判定）
実施例 4で製造した組換え水痘帯状疱疹ウィルスワクチン株の免疫原性を、モルモ ットを用いて測定する。比較対照として、 Oka株生ワクチンを使用する。これ等の各ヮ クチンを 3週令の平均体重 250gのモルモット 3匹にそれぞれ皮下接種する。ワクチン 接種は、接種量が組換え株及び Oka株生ワクチンでは、 3, 000PFU又は 2, 000P FUZモルモットになるよう各ワクチンを PBS (—）で希釈調整して行う。ワクチン接種 後、 4、 6及び 8週目に、各被接種モルモットの大腿部静脈力も部分採血し、その血中 抗体価を測定する。抗体価の測定には、中和試験法 （Journal of General Vir ology, 61, 255- 269, 1982)を、採用する。組換え水痘帯状疱疹ウィルスヮ クチンが Oka株と同程度に、 VZV抗体を誘導することを確認する。これらの結果から 、免疫原性が良好な組換え水痘帯状疱疹ウィルスワクチンを選択する。
[0164] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力 本発 明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解され る。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体 的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として 援用されるべきであることが理解される。
産業上の利用可能性
[0165] 本発明によって、例えば、 BAC (大腸菌人工染色体)を用い、組換え水痘帯状疱 疹ウィルス抗原および他のウィルス抗原を含むワクチンを作製する方法、およびその 方法によって作製された組換え水痘帯状疱疹ウィルスが提供される。また、本発明に よって、組換え水痘帯状疱疹ウィルスなどの抗原を含む多価ワクチンがまた提供され る。
[0166] さらに、本発明によって、水痘帯状疱疹ウィルスゲノム遺伝子と BACベクター配列 とを含むベクター、およびそのようなベクターを含む細胞、ならびに水痘帯状疱疹ウイ ルスゲノムと相同組換えし得るフラグメント、および BACベクター配列を含む核酸力 セットが提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの非必須領域内に BACベクター配列の少なくとも一部 が挿入されている、組換え水痘帯状疱疹ウィルスであって、ここで該非必須領域が、 以下の領域からなる群から選択される、組換え水痘帯状疱疹ウィルス：
遺伝子 13の ORF内の領域、遺伝子 56の ORF内の領域、遺伝子 57の ORF内の 領域、遺伝子 58の ORF内の領域、遺伝子 13の ORFに隣接する領域、遺伝子 56の ORFに隣接する領域、遺伝子 57の ORFに隣接する領域および、遺伝子 58の ORF に隣接する領域。
[2] 請求項 1に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルスであって、遺伝子 13、遺伝子 56、遺 伝子 57、および遺伝子 58からなる群力も選択される遺伝子を少なくとも 2つ欠損する
、組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
[3] 請求項 1に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルスであって、遺伝子 13、遺伝子 56、遺 伝子 57、および遺伝子 58からなる群力も選択される遺伝子を少なくとも 3つ欠損する
、組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
[4] 前記 BACベクター配列が組換えタンパク質依存性組換え配列を含む、請求項 1〖こ 記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
[5] 前記 BACベクター配列力 ムンプスウィルス、麻疹ウィルス、風疹ウィルス、ウェスト ナイルウィルス、インフルエンザウイルス、 SARSコロナウィルス、および日本脳炎ウイ ルスカゝらなる群カゝら選択されるウィルスの遺伝子を含む、請求項 1に記載の組換え水 痘帯状疱疹ウィルス。
[6] 前記 BACベクター配列力 ムンプスウィルス、麻疹ウィルス、および風疹ウィルスから なる群から選択されるウィルスの遺伝子を含む、請求項 1に記載の組換え水痘帯状 疱疹ゥイノレス。
[7] 前記 BACベクター配列力 ムンプスウィルスの遺伝子、麻疹ウィルスの遺伝子、およ び風疹ウィルスの遺伝子を含む、請求項 6に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
[8] 前記ムンプスウィルスの遺伝子力 HN遺伝子、 F遺伝子、および、 N遺伝子からなる 群から選択される、請求項 6に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
[9] 前記麻疹ウィルスの遺伝子が、 H遺伝子、 F遺伝子、および、 N遺伝子からなる群か ら選択される、請求項 6に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
[10] 前記風疹ウィルスの遺伝子が、 C遺伝子、 E1遺伝子、および、 E2遺伝子からなる群 から選択される、請求項 6に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
[11] 前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが野生株由来である、請求項 1に記載の組換え水 痘帯状疱疹ウィルス。
[12] 前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが変異株由来である、請求項 1に記載の組換え水 痘帯状疱疹ウィルス。
[13] 前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが Okaワクチン株由来である、請求項 1に記載の組 換え水痘帯状疱疹ウィルス。
[14] 前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが遺伝子 62および遺伝子 6に変異を有する、請求 項 1に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
[15] 前記遺伝子 62が、配列番号 1の塩基配列において、少なくとも以下 (a)〜（d)の塩基
(a) 2110番塩基が G ;
(b) 3100番塩基が G ;
(c) 3818番塩基が C ;および
(d) 4006番塩基が G、
ならびに前記遺伝子 6が、配列番号 4の塩基配列において、少なくとも 5745番塩基 が Gである塩基置換、
を有する、請求項 14に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルス。
[16] 請求項 1に記載のウィルスを含有する薬学的組成物。
[17] ワクチンの形態である、請求項 16に記載の薬学的組成物。
[18] 請求項 1に記載の組換え水痘帯状疱疹ウィルスから単離される、ベクター。
[19] 請求項 18に記載のベクターを含む、細胞。
[20] 細菌である、請求項 19に記載の細胞。
[21] E. coliである、請求項 20に記載の細菌。
[22] 哺乳動物細胞である、請求項 19に記載の細胞。
[23] ヒト由来の細胞である、請求項 22に記載の哺乳動物細胞。
[24] 請求項 22に記載の哺乳動物細胞によって産生された、ウィルス。
[25] 請求項 24に記載のウィルスを含有する薬学的組成物。
[26] 組換え水痘帯状疱疹ウィルスの製造方法であって、以下の工程：
請求項 18に記載のベクターを、哺乳動物宿主細胞に導入する工程;および 該哺乳動物宿主細胞を培養して、組換え水痘帯状疱疹ウィルスを産生させる工程
を包含する、方法。
[27] 前記哺乳動物宿主細胞がヒト由来の細胞である、請求項 26に記載の方法。
[28] 請求項 26に記載の方法であって、前記 2つの組換えタンパク質依存性組換え配列 間での組換えを起こす工程をさらに包含する、方法。
[29] 請求項 18に記載のベクターに変異を導入する方法であって、以下の工程：
該ベクターを細菌宿主細胞に導入する工程；
水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部力 なるフラグメントを含むプラスミドベクターを 該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該フラグメントは少なくとも 1つの 変異を有する、工程；
該細菌宿主細胞を培養する工程；
該培養した細菌宿主細胞から、 BACベクター配列を有するベクターを単離するェ 程、
を包含する、方法。
[30] 請求項 18に記載のベクターに変異を導入する方法であって、以下の工程：
該ベクターを細菌宿主細胞に導入する工程；
水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部力 なる第 1のフラグメントを含む第 1のプラスミ ドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該第 1のフラグメント は少なくとも 1つの変異を有する、工程；
水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの一部力 なる第 2のフラグメントを含む第 2のプラスミ ドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該第 2のフラグメント は少なくとも 1つの変異を有し、そして該第 2のフラグメントは該第 1のフラグメントとは 異なる、工程； 該細菌宿主細胞を培養する工程；
該培養した細菌宿主細胞から、 BACベクター配列を有するベクターを単離するェ 程、
を包含する、方法。
[31] 細菌細胞内において水痘帯状疱疹ウィルスゲノムと相同組換えし得る第 1のフラグメ ント、 BACベクター配列、および細菌細胞内において水痘帯状疱疹ウィルスゲノムと 相同組換えし得る第 2のフラグメントを含む核酸カセットであって、ここで、該 BAC配 列の両端の各々がそれぞれ第 1のフラグメントおよび第 2のフラグメントと連結し、そし て、ここで、前記第 1および第 2のフラグメントが、各々独立して水痘帯状疱疹ウィルス ゲノムの以下の領域力 なる群力 選択される領域由来である、核酸カセット： 遺伝子 13の ORF内の領域、遺伝子 56の ORF内の領域、遺伝子 57の ORF内の 領域、遺伝子 58の ORF内の領域、遺伝子 13の ORFに隣接する領域、遺伝子 56の ORFに隣接する領域、遺伝子 57の ORFに隣接する領域、遺伝子 58の ORFに隣接 する領域、および、遺伝子 56, 57, 58の連続する領域。
[32] 前記第 1のフラグメントおよび第 2のフラグメントが少なくとも lkbである、請求項 31に 記載の核酸カセット。
[33] 前記第 1のフラグメントおよび第 2のフラグメントが少なくとも 1. 5kbである、請求項 31 に記載の核酸カセット。
[34] 前記第 1のフラグメントおよび第 2のフラグメントが少なくとも 2kbである、請求項 31に 記載の核酸カセット。
[35] 前記第 1のフラグメントおよび第 2のフラグメントが、水痘帯状疱疹ウィルスゲノムの配 列に対して、少なくとも 80%同一である、請求項 31に記載の核酸カセット。
[36] 請求項 31に記載の核酸カセットであって、ここで、前記第 1および第 2のフラグメント が異なる領域に由来する、核酸カセット。
[37] 前記 BACベクター配列が組換えタンパク質依存性組換え配列を含む、請求項 31に 記載の核酸カセット。
[38] 前記 BACベクター配列が選択マーカーを含む、請求項 31に記載の核酸カセット。
[39] 前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが野生株由来である、請求項 31に記載の核酸力 セット。
[40] 前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが変異株由来である、請求項 31に記載の核酸力 セット。
[41] 前記水痘帯状疱疹ウィルスゲノムが Okaワクチン株由来である、請求項 31に記載の 核酸カセット。
[42] 前記 BACベクター配列が配列番号 3に記載の核酸配列を有する、請求項 31に記載 の核酸カセット。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12569553B2 (en) 2020-03-09 2026-03-10 Dynavax Technologies Corporation Shingles vaccines comprising a TLR9 agonist

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101967466A (zh) * 2009-07-28 2011-02-09 新泽西医学院 Orf7缺陷型水痘病毒株、含有该毒株的疫苗及其应用
BR112013027247A2 (pt) * 2011-02-24 2017-08-22 Mogam Biotechnology Res Institute Cepas do vírus da varicela-zóster e vacina contra o vírus da catapora e herpes zóster usando as mesmas
CN103185794B (zh) * 2011-12-30 2015-01-07 深圳市亚辉龙生物科技有限公司 一种检测水痘-带状疱疹病毒抗体的试剂装置及其方法
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
MX2018009499A (es) 2016-02-05 2019-05-06 Univ Texas Anticuerpos monoclonales especificos de egfl6 y metodos de su uso.
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN108103097B (zh) * 2017-12-04 2021-01-08 浙江大学 麻疹病毒mRNA甲基转移酶缺陷减毒疫苗株及其应用
CN111676244B (zh) * 2020-06-05 2024-02-23 成都生物制品研究所有限责任公司 以麻疹病毒为载体的麻疹、风疹联合疫苗
CN113293144B (zh) * 2021-02-01 2022-04-05 上海青赛生物科技有限公司 一种重组f基因型腮腺炎病毒活载体麻疹疫苗

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5341202A (en) 1976-09-28 1978-04-14 Fuji Photo Film Co Ltd Novel magnetic recording medium
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
JPS63299A (ja) 1986-04-22 1988-01-05 イミユネツクス・コ−ポレ−シヨン ヒトｇ−ｃｓｆタンパク質の発現
US6093535A (en) 1996-05-15 2000-07-25 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Method for identifying attenuated chickenpox virus Oka strain or strain originating therein and acceptable as attenuated chickenpox vaccine virus
WO2000050603A1 (en) 1999-02-25 2000-08-31 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Attenuated chicken-pox virus oka strain gene 62 and method for identifying virus strain for attenuated live chicken-pox vaccine by using the gene

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0299673A1 (en) * 1987-07-08 1989-01-18 London Biotechnology Limited Rubella E1 glycoprotein antigens
JP3026029B2 (ja) * 1991-04-26 2000-03-27 財団法人阪大微生物病研究会 組換え水痘ウイルスとその作製法
WO1998052603A2 (en) * 1997-05-23 1998-11-26 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern An influenza enveloped dna vaccine
US6277621B1 (en) * 1998-02-26 2001-08-21 Medigene, Inc. Artificial chromosome constructs containing foreign nucleic acid sequences
CA2377084A1 (en) * 1999-06-25 2001-01-04 Doris Apt Methods and compositions for engineering of attenuated vaccines
CN100354425C (zh) * 1999-07-09 2007-12-12 美国政府健康及人类服务部 减毒的人－牛嵌合呼吸道合胞病毒疫苗的生产
CA2475326A1 (en) * 2002-02-06 2003-08-14 Nikolaus Osterrieder A continuous cell line for the production of vaccines
CA2558586A1 (en) * 2004-03-05 2005-09-15 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Recombinant varicella-zoster virus
US20080226677A1 (en) * 2004-05-06 2008-09-18 Yasuko Mori Recombinant virus vector for gene transfer into lymphoid cells

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5341202A (en) 1976-09-28 1978-04-14 Fuji Photo Film Co Ltd Novel magnetic recording medium
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
JPS63299A (ja) 1986-04-22 1988-01-05 イミユネツクス・コ−ポレ−シヨン ヒトｇ−ｃｓｆタンパク質の発現
US6093535A (en) 1996-05-15 2000-07-25 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Method for identifying attenuated chickenpox virus Oka strain or strain originating therein and acceptable as attenuated chickenpox vaccine virus
WO2000050603A1 (en) 1999-02-25 2000-08-31 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Attenuated chicken-pox virus oka strain gene 62 and method for identifying virus strain for attenuated live chicken-pox vaccine by using the gene

Non-Patent Citations (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current Protocols in Molecular Biology", 1988, WILEY
"Current Protocols in Molecular Biology", 2000, JOHN WILEY & SONS INC.
"DoubutsuBaiyosaibo Manual", 1993, KYORITSU SHUPPAN
"Jikken Igaku", 1997, YODO-SHA, article "Idenshi Donyu & Hatsugenkaiseki Jikkenho"
"Method in Enzymology", vol. 230, 1994, ACADEMIC PRESS, pages: 242,247
ADAMS, R.L. ET AL.: "The Biochemistry of the Nucleic Acids", 1992, CHAPMAN & HALL
ALBERTS ET AL., MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, 1994
BATZER ET AL., NUCLEIC ACID RES., vol. 19, 1991, pages 5081
BLACKBURN, G.M. ET AL.: "Nucleic Acids in Chemistry and Biology", 1996, OXFORD UNIVERSITY PRESS
CAMPBELL, S.A.: "The Science and Engineering of Microelectronic Fabrication", 1996, OXFORD UNIVERSITY PRESS
CANTOR; SCHIMMEL, BIOPHYSICAL CHEMISTRY PART I: THE CONFORMATION OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES, 1980
COHEN J. I. ET AL.: "Generation of varicella-zoster virus (VZV) and viral mutants from cosmid DNAs: VZV thymidylate synthetase is not essential for replication in vitro", PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 90, no. 15, 1993, USA, pages 7376 - 7380, XP002997567 *
DAVISON, A.J.; SCOTT, J. E., J. GEN. VIROL., vol. 67, 1986, pages 1759 - 1816
ECKSTEIN, F.: "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach", 1991, IRL PRESS
GAIT, M.J.: "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach", 1985, IRL PRESS
GAIT, M.J.: "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach", 1990, IRL PRESS
GOMI Y. ET AL.: "Comparison of the complete DNA sequences of the Oka varicella vaccine and its parental virus", J. VIROL., vol. 76, no. 22, 2002, pages 11447 - 11459, XP002987965 *
HERMANSON, G.T.: "Bioconjugate Techniques", 1996, ACADEMIC PRESS
INNIS, M.A. ET AL.: "PCR Strategies", 1995, ACADEMIC PRESS
INNIS, M.A.: "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", 1990, ACADEMIC PRESS
J VIROL., vol. 76, no. 22, November 2002 (2002-11-01), pages 11447 - 59
J. VIRO 1., vol. 72, no. 2, February 1998 (1998-02-01), pages 965 - 74
J. VIROL, vol. 74, no. 4, February 2000 (2000-02-01), pages 1864 - 70
J. VIROL., vol. 74, no. 4, February 2000 (2000-02-01), pages 1864 - 70
J. VIROL., vol. 76, no. 22, November 2002 (2002-11-01), pages 11447 - 59
JAPANESE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 59, 1989, pages 233 - 237
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 33, 1995, pages 658 - 660
JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 59, 1986, pages 660 - 668
JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 61, 1982, pages 255 - 269
JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 66, 1992, pages 1016 - 1020
MADOU, M.J.: "Fundamentals of Microfabrication", 1997, CRC15 PRESS
MANIATIS, T. ET AL.: "Molecular Cloning: ALaboratoryManual", 1989, COLD SPRING HARBOR
MARKUS WAGNER, TRENDS IN MICROBILOGY, vol. 10, 7 July 2002 (2002-07-07)
NAGAIKE K. ET AL.: "Cloning of the varicella-zoster virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli", VACCINE, vol. 22, no. 29-30, 2004, pages 4069 - 4074, XP004567487 *
OHTSUKA ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 260, 1985, pages 2605 - 2608
RAI-CHOUDHURY, P.: "Handbook of Microlithography, Micromachining & Microfabrication: Microlithography; and the like", 1997
ROSSOLINI ET AL., MOL. CELL. PROBES, vol. 8, 1994, pages 91 - 98
SADOWSKI P.: "Site-specific recombinases: changing partners and doing the twist", J. BACTERIOL., vol. 165, no. 2, February 1986 (1986-02-01), pages 341 - 7
SAMBROOKJ. ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1987, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
SAUER B.: "Site-specific recombination: developments and applications.", CURR. OPIN. BIOTECHNOL., vol. 5, no. 5, October 1994 (1994-10-01), pages 521 - 7
See also references of EP1961814A4
SHABAROVA, Z. ET AL.: "Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids", 1994, WEINHEIM
SNINSKY, J.J. ET AL.: "PCR Applications: Protocols for Functional Genomics", 1999, ACADEMIC PRESS
THORPE, HELENA M.; WILSON, STUART E.; SMITH, MARGARET C.M.: "Control of directionality in the site-specific recombination systemof the Streptomyces phage TC31.", MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 38, no. 2, 2000, pages 232 - 241
WHO TECHNICAL REPORT SERIES, vol. 848, 1994, pages 22 - 38
ZAUT, P.V.: "Micromicroarray Fabrication: a Practical Guide to Semiconductor Processing", 1996, SEMICONDUCTOR SERVICES

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12569553B2 (en) 2020-03-09 2026-03-10 Dynavax Technologies Corporation Shingles vaccines comprising a TLR9 agonist

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