WO2007062568A1 - Compounds used as mammalian cell amp-activated protein kinase(ampk) activators and their preparation methods and usages - Google Patents

Compounds used as mammalian cell amp-activated protein kinase(ampk) activators and their preparation methods and usages Download PDF

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Fajun Nan
Jia Li
Bing Liu
Tao Pang
Lifang Yu
Jingya Li
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Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a small molecule organic compound useful as a human adenosine mononucleotide activating protein kinase (AMPK) activator. Such compounds are useful for preventing, delaying, or treating AMPK-mediated disorders, particularly type II diabetes, obesity, and tumors.
  • the invention also relates to a process for the preparation of this compound.
  • the present invention relates to the use of the compound for activating adenosine mononucleotide-activated protein kinase and for promoting intracellular glucose uptake and for the preparation of a medicament for treating a metabolic disease.
  • BACKGROUND OF THE INVENTION Diabetes has become one of the three major diseases that endanger human health.
  • Diabetes is a general term for a group of heterogeneous endocrine and metabolic diseases characterized by different causes and pathogenesis of insulin deficiency or insulin in the body, and clinically characterized by abnormal glucose metabolism.
  • Diabetes is a general term for a group of heterogeneous endocrine and metabolic diseases characterized by different causes and pathogenesis of insulin deficiency or insulin in the body, and clinically characterized by abnormal glucose metabolism.
  • AMPK adenosine mononucleotide-activated protein kinase
  • AMPK is a heterotrimer comprising an alpha catalytic subunit, two regulatory subunits, beta and gamma.
  • each subunit is encoded by 2-3 genes ( ⁇ 1, ⁇ 2; ⁇ 1, ⁇ 2; ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3), respectively.
  • the ⁇ -subunit contains a kinase catalytically active region at the terminus of the ⁇ -subunit, the C-terminal is an active regulatory region, and contains a self-inhibiting region and a binding region of a regulatory subunit; the ⁇ subunit acts as a scaffold for linking the ⁇ and ⁇ subunits.
  • AMPK in the body muscle tissue and other major Tissue enhances glucose uptake, enhances insulin sensitivity and plays a key role in glucose metabolism and lipid metabolism, making it an effective way to treat type 2 diabetes and obesity. Therefore, the use of human AMPK-al (aa 1-394) inactive fragments to screen AMPK's highly active, highly selective activators may provide an important basis for the study of AMPK molecular mechanisms and the development of new drugs for type II diabetes. . At present, there is no invention of AMPK activator, and currently used AICAR is only a non-specific AMPK activator.
  • the present invention contemplates and synthesizes a novel compound which can be used as a human AMPK activator and can effectively activate the activity of human AMPK-al (aa 1-394) to promote intracellular glucose uptake. Therefore, it can be used to prevent, delay or treat AMPK-mediated disorders, particularly type II diabetes, obesity and tumors.
  • the compounds of the present invention are relatively simple in structure and easy to prepare.
  • the novel compound of the present invention has a structure represented by the following formula 1: [Formula 1]
  • X is NH, O or S; is O or S;
  • Y 2 is NR 5 , O or S, wherein R 5 is H;
  • Ri is H, phenyl or a benzyl group, or a substituted or unsubstituted C1-C10 alkyl group or a cycloalkyl group; wherein R 9 and Ru) are each independently H; F; C1; trifluoromethyl; ethynyl, propynyl; a carboxyl group, a C1-C4 alkyl group of a carboxylate group, and the like.
  • R 3 each independently H, F, Cl, pyrrolyl, pyridyl, thiosalt,
  • R 7 > R 8 are each independently H, F, Cl, trifluoromethyl, trifluoromethoxy, nitro, amine, benzoylamide, C2-C6 alkanoamide, and C3 a cycloalkyl-substituted amide group of C6, a C1-C4 alkyl group or the like.
  • the unsubstituted C1-C10 alkyl or cycloalkyl group is cyclopropyl, cyclobutane, decyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl, cyclopentanyl a substituent of a substituted C1-C10 alkyl or cycloalkyl group, including one or more alkoxy groups selected from the group consisting of F, Cl, C1-C10, a nitrile group, a carboxyl group, and a formic acid. a methyl ester group, a decanoic acid group or a substituent group of a hydroxyl group, and the like.
  • the novel human AMPK activator of the present invention is prepared by the following three steps: Step a: The carboxyl group in Compound 1 is reduced to an alcohol group according to the following chemical reaction formula 1.
  • compound 1 is reacted with lithium aluminum hydride to reduce the carboxyl group to an alcoholic hydroxyl group, and after quenching with water, extraction, drying, concentration, etc., to obtain compound 2;
  • the alcoholic hydroxyl group of the compound 2 is oxidized to the aldehyde group with active manganese dioxide at room temperature by using chloroform as a solvent, and after treatment with concentration and concentration, the compound 3 is obtained;
  • the compound 3, 4 is coupled with water acetic acid as a solvent and sodium acetate or with anhydrous ethanol as a solvent under the action of piperidine, and subjected to extraction, drying, concentration, silica gel column chromatography and the like, and obtained.
  • the final compound 5 .
  • X is ⁇ , 0 or S; ⁇ or S;
  • Y 2 is NR 5 , O or S; wherein R 5 is phenyl, Wait
  • ⁇ is phenyl or a benzyl group, or an alkyl or cycloalkyl group of a substituted or unsubstituted Cl-ClO;
  • R 9 and R 10 are each independently H; F; CI; trifluoromethyl; ethynyl, propynyl; CI-C4 alkyl having a carboxyl group or a carboxylate group.
  • R 2 , R 3 and R 4 are each independently H, F, Cl, pyrrolyl, pyridyl, thioenyl,
  • R 7 and R 8 are each independently H, F, Cl, trifluoromethyl, trifluoromethoxy, nitro, amine, benzamide, C2-C6 alkanoamide, and C3- a cycloalkyl-substituted amide group of C6, a C1-C4 alkyl group or the like.
  • the unsubstituted C1-C10 alkyl or cycloalkyl group is cyclopropyl, cyclobutane, decyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl, cyclopentane a substituent, a n-hexane group, a cyclohexyl group or the like; a substituted C1-C10 alkyl or cycloalkyl substituent including one or more alkoxy groups selected from the group consisting of F, Cl, C1-C10, a nitrile group, a carboxyl group, and a formic acid a methyl ester group, a decanoic acid group or a substituent group of a hydroxyl group, and the like.
  • TLC Thin layer chromatography
  • the post-treatment methods generally employed after the completion of the reaction include cooling, concentration of the reaction solution to remove the solvent, extraction, column chromatography separation, and the like.
  • the final product was detected by NMR.
  • the novel compound of the present invention can be used as a human AMPK activator and can effectively activate the activity of human AMPK-al (aa 1-394), thereby preventing, delaying or treating AMPK-mediated disorders, especially II. Type 2 diabetes, obesity and cancer.
  • the present invention will be more specifically described by way of examples and comparative examples. However, the following examples are provided for the purpose of illustration only, and thus the invention is not limited to the embodiments.
  • DRAWINGS Fig. 1 shows the measurement of AMPK activity without adding the compound of the present invention and adding the compounds 5f, 5r, 5s, 5t, and 5u of the present invention, respectively.
  • (-) indicates that the compound was not treated with the compound, (+) indicates that the compound was treated with the compound;
  • pAMPK indicates the phosphorylation level of the AMPK catalytic subunit ⁇ -threonine (Thr) 172;
  • AMPK indicates the expression level of intracellular AMPK catalytic subunit ⁇ ;
  • pACC indicates the phosphorylation level of intracellular AMPK substrate ACC;
  • ACC indicates the expression level of intracellular ACC;
  • (-Actin) indicates intracellular actin To show the total amount of intracellular protein.
  • NMR was measured by a Mercury-Vx 300M instrument manufactured by Varian, NMR calibration: ⁇ H/C 7.26/77.0 ppm (CDC1 3 ); reagents were mainly supplied by Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd. Column chromatography, silica gel (200-300 mesh), the silica gel model used for column chromatography is coarse air (ZLX-II), produced by Qingdao Ocean Chemical Plant.
  • Example 1 Preparation of Compound 5a
  • First step Add 28 mg of AlLi to a 25 ml round bottom flask, disperse it in 10 ml of freshly steamed THF, and add 101 mg of compound 3a (0.37 mmol) in 3 ml of freshly steamed THF solution at room temperature. (24-26 V) The reaction was stirred for 30 minutes, and the completion degree of the reaction was measured by TLC. After the reaction was completed, 0.5 ml of water was carefully added, stirring was continued for 10 minutes, diluted with water, extracted with ethyl acetate. The organic phase was dried over anhydrous Na 2 SO 4 and concentrated to remove solvent to afford 2b.
  • Step 2 Add 68 mg of compound 2a, 20 ml of chloroform to a 50 ml round bottom flask, add active Mn0 2 122 mg with stirring, stir the reaction at room temperature (24-26 ° C) for 5 hours, and use TLC to track the completion of the reaction. . After completion of the reaction, the insoluble matter was removed by filtration, and the solvent was concentrated to give 3a 38 mg.
  • Step 3 In a 5 ml round bottom flask, add 38 mg of compound 3a (0.16 mmol), 60 mg of compound 4a (0.16 mmol), 27 mg of piperidine, 3 ml of absolute ethanol, reflux with nitrogen (80"C to 120 °C) After 3 hours, the completion degree of the reaction was measured by TLC. After the completion of the reaction, the reaction mixture was cooled, and the reaction mixture was concentrated to remove the solvent and purified by column chromatography to give the product 5a 30 mg.
  • Compound 5a ! H NMR (CDC13, 300 MHz) ⁇ 6.78 (dd , 2H), 7.11 (m, 4H), 7.43 (m, 3H), 7.69 (t, lH).
  • Example 2 Preparation of compound 5b:
  • First step Compound 2b was prepared in the same manner as in the first step of Example 1, except that the starting material lb was used instead of the starting material in the first step of Example 1.
  • Second step Compound 3b was prepared in the same manner as in the second step of Example 1 except that the starting material 2b was used instead of the starting material 2a in the second step of Example 1.
  • Step 3 In a 5 ml round bottom flask, add 34 mg of compound 3b (0.28 mmol), 60 mg of compound 4b (0.28 mmol), 100 mg of AcONa, 2 ml of glacial acetic acid, and reflux with nitrogen (100 ° C to 120 ° C) 2 Hours, TLC tracks the response.
  • Example 7 Preparation of Compound 5g: Compound 5g was prepared in the same manner as in Example 1 except that a carboxylic acid or a carboxylic acid ester corresponding to compound 5g and a carbonyl compound were used. Structural formula of compound 5g:
  • Example 8 Preparation of Compound 5h: Compound 5h was obtained in the same manner as in Example 1 except that a carboxylic acid or a carboxylic acid ester corresponding to compound 5h and a carbonyl compound were used as a starting material.
  • Example 12 Preparation of Compound 51: Compound 51 was obtained in the same manner as in Example 1 except that a carboxylic acid or a carboxylic acid ester corresponding to Compound 51 and a carbonyl compound were used.
  • Example 14 Preparation of Compound 5 ⁇ : Compound 5n was produced in the same manner as in Example 1 except that a carboxylic acid or a carboxylic acid ester corresponding to Compound 5n and a base compound were used as a starting material. Structural formula of compound 5 ⁇ :
  • ruthenium catalytic subunit ⁇ inactive fragment cdd-394 amino acid A gene sequence encoding the human AMPK catalytic subunit ⁇ inactive fragment al (l-394 amino acid) was constructed in the pGEMEX- ⁇ vector.
  • the correctly identified pGEMEX-AMPK-1 (1 -394) recombinant plasmid was transformed into the expression type Escherichia coli BL21-Codon-Plus (DE3)-RIL strain, and the monoclonal colony was picked at 1 L containing 50 g/mL ampicillin and LB rich medium of 25 g/mL chloramphenicol, 180 to 37 per minute.
  • the above lysate containing the protein of interest was centrifuged at 12000 x g for 15 minutes at 4 ° C, centrifuged twice, and the precipitate was discarded, and the supernatant protein solution was passed through a Q column. It was carried out using a HiTrap-5ml QHP anion exchange column and an FPLC system.
  • the solution passing through the Q column was Buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT) and Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 1 M NaCl).
  • the supernatant protein sample was injected, first equilibrated with Buffer A, and then eluted with a linear NaCl gradient consisting of Buffer A and 100% Buffei' B.
  • the protein composition and purity of the collected fractions were verified by SDS-PAGE - and the purer fractions were combined according to the results and protein concentrations.
  • the eluted target protein AMPK-ocl (l-394) was identified by 12% SDS-PAGE: the purity of the purified protein was about 95%.
  • mice AMPK-al (aa 1-392), which is identified by its size and enzymatic properties, corresponds to the amino acid sequence reported in the literature.
  • AMP-activated protein kinase kinase detection with recombinant AMPK al subunit (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 293, 892-898; Crute et al, Functional domains of the al catalytic subunit of the AMP-activated protein kinase, (199S) J. Biol. Chem. 273, 35347-35354 ).
  • the inactive fragment al(l-394) of the catalytic subunit ⁇ of human ⁇ was purified, and the fragment contained its own self-inhibitory sequence for screening experiments.
  • the activated hydrazine can phosphorylate the substrate SAMS (MW: 1779), and the ⁇ -33 ⁇ on the [ ⁇ - 33P]-ATP in the solution is covalently bonded to the substrate SAMS to make its Ser residue.
  • Acidification, production of the isotope-labeled substrate 33P-SAMS, and finally the scintillation fluid was counted by liquid scintillation counter to quantify the enzyme activity. The activity of the compound was initially evaluated by observing the activation of its activity by different compounds.
  • HsAMPK-al (aa 1-394) was prephosphorylated by the upstream kinase CaM Kp for 4 hours, and then added to the substrate-containing assay reaction solution (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM) in a volume ratio of 1:4.
  • the substrate-containing assay reaction solution (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM) in a volume ratio of 1:4.
  • DTT 5 mM MgC12, 50 ⁇ [ ⁇ -33 ⁇ ]- ⁇ (0.4 ⁇ /assay), 50 ⁇ SAMS)
  • the total activity was 50 ⁇ at 30.
  • C was incubated for 10 min.
  • the protein reaction solution was adsorbed on P30 filter paper by Harvester, washed three times with 0.1% H3P04, dried, added with scintillation liquid, and sealed, and counted by a 96-well microplate scintillation counter.
  • the reaction rate obtained by the above measurement system is the reaction rate of the enzyme activity; DMSO (2 ⁇ l) in which the above compound is dissolved is substituted for DMSO (2 ⁇ 1) in the above system, and the reaction rate is determined as the reaction rate under the action of the compound.
  • Fig. 1 shows the measurement of AMPK activity without adding the compound of the present invention and adding the compounds 5f, 5r, 5s, 5t, and 5u of the present invention, respectively.
  • Figure 2 is a graph showing the catalytic activity of the compound 5r prepared in the examples of the present invention at various concentrations.
  • (-) indicates that the compound was not treated with the compound, (+) indicates that the compound was treated with the compound;
  • pAMPK indicates the phosphorylation level of the AMPK catalytic subunit ⁇ -threonine (Thr) 172;
  • AMPK indicates the expression level of intracellular AMPK catalytic subunit ⁇ ;
  • pACC indicates the phosphorylation level of intracellular AMPK substrate ACC;
  • ACC indicates the expression level of intracellular ACC;
  • (-Actin) indicates intracellular actin To show the total amount of intracellular protein.
  • the compound 5r prepared in Example 18 has a significant effect on enhancing the phosphorylation level of intracellular AMPK phosphorylation and its downstream target protein ACC at the L6 cell level and exhibits a concentration-dependent manner, indicating that the compound can be at the cellular level. Activate AMPK.

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Description

一种可用作人源腺苷单核苷酸激活蛋白激酶激活剂的化合物 及其制备方法和应用
技术领域 本发明涉及一种可用作人源腺苷单核苷酸激活蛋白激酶 (AMPK) 激活剂的小分子有机化合物。 该类化合物可用于作预防、 延缓展或治 疗由 AMPK介导的病症， 特别是 II型糖尿病、 肥胖症和肿瘤。 本发明 还涉及该化合物的制备方法。 另外本发明还涉及了该化合物在激活人 源腺苷单核苷酸激活蛋白激酶中以及促进胞内葡萄糖吸收的应用和在 制备治疗代谢性疾病的药物中的应用。 背景技术 糖尿病已成为危害人类健康的三大疾病之一， 根据世界卫生组织 的统计， 1997年全世界糖尿病患者已达 1.24亿， 预计到 2025年将上 升至 3亿， 其中 97%为 II型糖尿病患者。 糖尿病是由不同病因与发病 机理弓 1起体内胰岛素缺乏或胰岛素作用降低 , 临床上以糖代谢异常为 主要表现的一组异质性内分泌代谢疾病的总称。 （Ferrarmini, E. Insulin resistance versus insulin deficiency in non-insulin-dependent diabetes mellitus: problems and prospects. Endocr. Rev, 1998, 19: 477-490. Stefan。 The cost of diabetes and diabetes care. Diabetes Research and Clinical Practice 54 Sullppl.l, 2001 : S13-S18。）如果得不到及时有效的治疗， 可 导致失明、 心脑血管疾病、 肾功能衰竭等多种并发症， 严重危害人类 健康。 糖尿病在我国及全世界发病率都很高。 因此， 研究对糖尿病的 有效的预防和治疗方法， 具有重要意义。 尽管已有大量的实验和研究资料去阐明其病因学， 但绝大多数糖 尿病患者体内的基础缺陷目前仍不清楚。 由于其病因学极其复杂， 产 生的综合症也多种多样， 以至于目前市场上没有一种能从根本上完全 治愈糖尿病的药物。 所以近年来的研究多集中在从分子生物学的角度 寻找新的药物作用耙点， 以推动新药的研发。 其中腺苷单核苷酸激活 蛋白激醇 (AMP-activated protein kinase, AMPK)就是近年来在该领域研 究方面的一个热点， 是最新研究发现的治疗 II型糖尿病的新靶点。 (Winder, W. W. AMP-activated protein kinase: possible target for treatment of type 2 diabetes. Diabetes Technol Ther, 2000, 2(3): 441-448。 Nicolas Musi, Nobuharu Fujii, Michael F. Hirshman, et al. AMP-activated protein kinase (AMPK) is activated in muscle of subjects with Type 2 diabetes during exercise. Diabetes, 2001, 50: 921-927。 )
AMPK是一个异源三聚体， 包含一个 α催化亚基， β、 γ两个调节 亚基。对于哺乳动物细胞的 AMPK,每种亚基分别被 2-3个基因 (α1、α2; β1、 β2; γ1、 γ2、 γ3)编码。 在 α亚基的 Ν端含有一激酶催化活性区域， C 端为活性调节区域， 含有一个自我抑制区域和一个调节亚基的结合 区域； β亚基起连接 α和 γ亚基的支架作用。（Hardie, D. G, and D. Carling. The AMP-activated protein kinase. Fuel gauge of the mammalian cell? Eur. J. Biochem, 1997, 246: 259-273。 Kahn， B. B.， Alquier, T" Carling, D.， and Hardie, D. G. AMP-activated protein kinase: Ancient energy gauge provides clues to modern understanding of metabolism. Cell Metabolism. 2005, 1： 15-25)在 II型糖尿病中， 糖代谢和脂代谢过程失调 , 而 AMPK 对这些代 i射途径有一个重要的调节作用。 （Cmte, B. E., Seefeld, K.， Gamle, J., Kemp, B. E.， and Witters, L. A. Functional domain of the al catalytic subunit of the AMP-activated protein kinase. (1998) J.Biol.Chem. 273, 35347-35354)研究证实， AMPK激活后能激活并增强肌细胞中脂肪 酸氧化和葡萄糖吸收， 抑制肝细胞中胆固醇和甘油三酯合成、 脂生成， 调节 β细胞的胰岛素分泌， 增强胰岛素靶组织对胰岛素的敏感性以及激 活肌细胞内葡萄糖的吸收等。 （Winder, W. W., and Hardie, D. G. AMP-activated protein kinase, a metabolic master switch: possible roles in Type 2 diabetes. Am. J. Physiol, 1999, 277:E1-E10) AMPK在体内肌肉组 织中及其它主要组织中增强葡萄糖吸收， 增强胰岛素敏感性和在糖代 谢、 脂代谢中的关键作用， 使之成为治疗 II型糖尿病及肥胖症的一条 有效途径。 因此， 利用人源 AMPK-al(aa 1-394) 无活性片断来筛选 AMPK的高活性、 高选择性的激活剂， 可为 AMPK分子机理的研究和 治疗 II型糖尿病新药的开发提供重要的依据。 目前尚无 AMPK激活剂的发明， 目前所使用的 AICAR也仅为非 特异性 AMPK激活剂，因此研究并开发出新型 AMPK特异性激活剂用 于预防 II型糖尿病及肥胖等， 具有广阔的应用前景和重大的商业意义。 发明内容 考虑到上述问题， 本发明设计并合成了一种新型化合物， 可用作 人源 AMPK激活剂， 并能有效激活人源 AMPK-al (aa 1-394)的活性从 而促进胞内葡萄糖吸收， 因此可用于预防、 延緩或治疗由 AMPK介导 的病症， 特别是 II型糖尿病、 肥胖症和肿瘤。 本发明化合物结构相对 简单， 易于制备。 本发明所述的新型化合物具有如下式 1所示的结构： [式 1]
Figure imgf000005_0001
其中 X为 NH、 O或 S; 为 O或者 S;
Y2为 NR5、 O或者 S, 其中 R5 为 H;
Figure imgf000005_0002
Ri为 H、 苯基或
Figure imgf000005_0003
苄基、 或者取代或未取代的 C1-C10的 烷基或环烷基等； 其中 R9、 Ru)各自独立的为 H; F; C1; 三氟甲基； 乙炔基、 丙炔 基； 含有羧基、 羧酸酯基的 C1 - C4烷基等。
R3、 各自独立地为 H、 F、 Cl、 吡咯基、 吡啶基、 噻唾基、
噻吩基、 苄基、 苯基、 或者
Figure imgf000005_0004
等； 其中 、 R7> R8各自独立 地为 H、 F、 Cl、 三氟曱基、 三氟甲氧基、 硝基、 胺基、 苯曱酰胺基、 C2-C6烷酰胺基、 和 C3-C6的环烷基取代的酰胺基、 C1-C4烷基等。 其中， 所述的未取代的 C1-C10的烷基或环烷基为环丙烷基、 环丁 烷基、 曱基、 乙基、 正丙基、 正丁基、 正戊烷基、 环戊垸基、 正己烷 基、 环己基等； 取代的 C1-C10的烷基或环烷基的取代基包括一个或多 个选自 F、 Cl、 C1-C10的烷氧基、 腈基、 羧基、 甲酸甲酯基、 曱酸乙 酯基或羟基的取代基团等。 本发明所述的新型人源 AMPK激活剂通过下列三个步驟制备得 到： 步骤 a:根据下面的化学反应式 1将化合物 1中的羧基还原为醇基。
[化学反应式 1]
Figure imgf000006_0001
1 2 在 0 ~ 5 °C下， 以四氢呋喃为溶剂， 化合物 1与四氢锂铝反应将羧 基还原为醇羟基， 经过加水淬灭、 萃取、 干燥、 浓缩等后处理， 得到 化合物 2;
[化学反应式 2]
Figure imgf000006_0002
2 3 室温下， 以氯仿为溶剂用活性二氧化锰将化合物 2的醇羟基氧化 为醛基， 经过过虑、 浓缩等后处理， 得到化合物 3；
[化学反应式 3]
Figure imgf000007_0001
以水醋酸为溶剂并醋酸钠作用下或者以无水乙醇为溶剂并在哌啶 作用下， 回流， 将化合物 3、 4偶联， 经过萃取、 干燥、 浓缩、 硅胶柱 层析等后处理， 得到最终的化合物 5。 在以上三个步骤中， 其中 X为 ΝΉ、 0或 S; 为 Ο或者 S;
Y2为 NR5、 O或者 S; 其中 R5 为 苯基、
Figure imgf000007_0002
等
！^为 苯基或
Figure imgf000007_0003
、 苄基、 或者取代或未取代的 Cl-ClO的 烷基或环烷基等； 其中 R9、 R10各自独立的为 H; F; CI; 三氟甲基； 乙炔基、 丙炔 基； 含有羧基、 羧酸酯基的 CI - C4烷基等。
R2、 R3、 R4各自独立地为 H、 F、 Cl、 吡咯基、 吡啶基、 噻峻基、
噻分基、 苄基、 苯基、 或者
Figure imgf000008_0001
； 其中 、 R7、 R8各自独立 地为 H、 F、 Cl、 三氟曱基、 三氟曱氧基、 硝基、 胺基、 苯甲酰胺基、 C2-C6烷酰胺基、 和 C3-C6的环烷基取代的酰胺基、 C1-C4烷基等。 其中， 所述的未取代的 C1-C10的烷基或环烷基为环丙烷基、环丁 烷基、 曱基、 乙基、 正丙基、 正丁基、 正戊烷基、 环戊烷基、 正己烷 基、环己基等； 取代的 C1-C10的烷基或环烷基的取代基包括一个或多 个选自 F、 Cl、 C1-C10的烷氧基、 腈基、 羧基、 甲酸甲酯基、 曱酸乙 酯基或羟基的取代基团等。 通常用薄层层析法 （TLC ) 来跟踪测定反应的完成程度。 反应完 毕后一般采用的后处理方法包括冷却、 浓缩反应液除尽溶剂、 萃取、 柱层析分离等。 用 NMR来检测最终产物。 本发明的新型化合物， 可用作人源 AMPK激活剂， 并能有效激活 人源 AMPK- al (aa 1-394)的活性， 从而可预防、 延緩或治疗由 AMPK 介导的病症， 特别是 II型糖尿病、 肥胖症和肿瘤。 下面， 通过实施例和对比实施例将更具体地描述本发明。 然而， 下面的实施例仅仅是为了说明而提供， 因此本发明不局限于这些实施 例。 附图说明 图 1为不添加本发明的化合物和分别添加本发明的化合物 5f、 5r、 5s、 5t、 5u的情况下， 对 AMPK活性的测定。
在图 2中， （-)表明未加此化合物处理细胞， （+)表明加此化合物处 理细胞； （pAMPK)表示 AMPK催化亚基 α上苏氨酸 (Thr)172的磷酸化 水平； （AMPK)表示胞内 AMPK催化亚基 α的表达水平； （pACC)表示胞 内 AMPK底物 ACC的磷酸化水平；（ACC)表示胞内 ACC的表达水平； (-Actin)表示用胞内肌动蛋白来显示胞内总蛋白量。 具体实施方式 下述实施例中， NMR用 Varian生产的 Mercury- Vx 300M仪器测 定， NMR定标： δ H/C 7.26/77.0 ppm ( CDC13 )； 试剂主要由上海化学 试剂公司提供， 产品纯化主要用柱色谱法， 硅胶（200 - 300目）， 柱色 谱法所用的硅胶型号为粗空（ZLX - II )， 由青岛海洋化工厂分厂生产。 实施例 1 : 化合物 5a的制备
[化学反应式 4]
Figure imgf000009_0001
按照上面的化学反应式 第一步： 在 25ml圓底烧瓶中加入 28 mg的 AlLi , 使其分散在 10 ml新蒸的 THF中， 室温下滴加 101 mg化合物 3a (0.37mmol)的 3ml 新蒸 THF溶液， 滴毕室温（ 24-26V )搅拌反应 30分钟， 用 TLC来跟 踪测定反应的完成程度。 反应完毕后， 小心加入 0.5 ml水， 继续搅拌 10分钟， 加水稀释， 乙酸乙酯萃取， 有机相经无水 Na2S04干燥后浓缩 除尽溶剂， 得到 2b。
第二步： 在 50ml圆底烧瓶中加入 68mg化合物 2a， 20 ml氯仿， 搅拌下加入活性 Mn02 122 mg, 室温（24-26°C )搅拌反应 5小时， 用 TLC 来跟踪测定反应的完成程度。 反应完毕后， 过虑除去不溶物， 浓 缩除尽溶剂、 得到 3a 38 mg。 第三步：在 5ml圆底烧瓶中加入 38 mg化合物 3a (0.16mmol)， 60mg 化合物 4a (0.16mmol)， 27mg哌啶， 3 ml无水乙醇，氮气保护回流（ 80 "C 至 120°C ) 3小时， 用 TLC来跟踪测定反应的完成程度。 反应完毕后， 冷却， 浓缩反应液除尽溶剂、 柱层析分离得产物 5a 30mg。 化合物 5a ： !H NMR (CDC13,300MHz) δ 6.78(dd,2H), 7.11(m,4H)， 7.43(m，3H)， 7.69(t,lH)。 实施例 2: 化合物 5b的制备：
[化学反应式 5]
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
4b 5b 按照上面化学反应式： 第一步： 除以原料 lb代替实施例 1中第一步骤中的原料 la夕卜， 以实施例 1的第一步骤相同的方法制备化合物 2b。 第二步： 除以原料 2b代替实施例 1 中第二步驟中的原料 2a外， 以实施例 1的第二步驟相同的方法制备化合物 3b。 第三步： 在 5ml圆底烧瓶中加入 34 mg化合物 3b (0.28 mmol), 60 mg化合物 4b(0.28 mmol), 100 mg AcONa, 2ml冰醋酸， 氮气保护回流 ( 100°C至 120 °C ) 2小时， TLC跟踪反应。反应完毕后， 冷却， 过滤， 洗涤后真空干燥得得产物 42mg的化合物 5b。 化合物 5b: 1H MR (CDC13,300MHz) δ 1.27-1.43 (m,4H), 1.69(d,4H), 1.87(d,2H), 2.10(s,3H), 2.27(s,3H), 5.10(br,lH)， 5.99(s,lH)， 6.76(s,lH)。 实施例 3: 化合物 5c的制备： 除以与化合物 5c相对应的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物为原料 夕卜， 以实施例 1相同的方法制备化合物 5c。 化合物 5c的结构式：
Figure imgf000012_0001
化合物 5c： Ή NMR (DMSO-d6,300MHz) δ 2.32(s,6H), 3.66(s,3H), 3.75(s,3H), 3.93(s,2H), 6.78(d,lH), 6.93(d,lH), 7.01(s,lH), 7.09(s，lH)， 7，63(s，lH), 7.73(s,lH), 7.83(d,lH)。 实施例 4: 化合物 5d的制备： 除以与化合物 5d相对应的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物为原料 外， 以实施例 1相同的方法制备化合物 5d。 化合物 5d的结构式:
Figure imgf000012_0002
化合物 5d ： !H NMR (CDC13,300MHz) δ 3.11(s，lH)， 6.83(d5lH), 7.02(d,lH), 7.16(s,lH), 7.37(m,6H), 7.51(s,lH), 7.80(s,lH)。 实施例 5: 化合物 5e的制备： 除以与化合物 5e相对应的羧酸或羧酸酯以及薮基化合物为 料 外， 以实施例 2相同的方法制备化合物 5e。 化合物 5e的结构式:
Figure imgf000013_0001
化合物 5e : ιϋ NMR (DMSO-d6,3 0MHz) δ 6.78(d,lH), 7.05(d，lH)， 7.21(m，2H)， 7.40(m,lH), 7.60(m,2H), 7.79(d,lH)， 7.99(d，lH)。 实施例 6: 化合物 5f的制备： 除以与化合物 5f 相对应的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物为原料 外， 以实施例 2相同的方法制备化合物 5f。 化合物 5f的结构式：
Figure imgf000013_0002
化合物 5f： Ή NMR (DMSO-d6,300MHz) δ 1.78,1.94,2.02,2.49,6.85 7.19, 7.28, 7.45, 7.72, 8.03, 8.39, 9.45。 实施例 7: 化合物 5g的制备: 除以与化合物 5g相对应的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物为原料 外， 以实施例 1相同的方法制备化合物 5g。 化合物 5g的结构式:
Figure imgf000014_0001
化合物 5g ： Ή NMR (CDCl3,300MHz) δ 6.74(d), 7.05-7.1 l(m), 7.16(d), 7.31(d), 7.36(s), 7.58(d)。 实施例 8: 化合物 5h的制备： 除以与化合物 5h相对应的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物为原料 外， 以实施例 1相同的方法制备化合物 5h。 化合物 5h的结构式：
Figure imgf000014_0002
化合物 5h： Ή NMR (CDCl3,300MHz) δ 6.85(d), 7.02(d), 7.20(d): 7.33(d), 7.54(s), 7.75(d)。 实施例 9: 化合物 5i的制备: 除以与化合物 5i相对应的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物为原料 外， 以实施例 1相同的方法制备化合物 5i。 化合物 5i的结构式:
Figure imgf000015_0001
化合物 5i ： 'Η NMR (DMSO-d6,300MHz) δ 7.06, 7.18， 7.43, 7.56, 7.74, 8.01。 实施例 10: 化合物 5j的制备： 除以与化合物 5j 相对应的羧酸或羧酸酯以及叛基化合物为原料 外， 以实施例 1相同的方法制备化合物 5j。 化合物 5j的结构式:
Figure imgf000015_0002
化合物 5j ： lR NMR (CDCl3,300MHz) δ 6.77, 6.94, 7.06, 7.27: 7.37, 7.68。 实施例 11 : 化合物 5k的制备： 除以与化合物 5k相对应的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物为原料 外， 以实施例 1相同的方法制备化合物 5k。 化合物 5k的结构式:
Figure imgf000016_0001
化合物 5k： ¾ NMR (CD3OD-d4,300MHz) δ 6.70, 6.82， 7.06, 7.23, 7.43, 7.52，7.60。 实施例 12: 化合物 51的制备： 除以与化合物 51相对应的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物为原料 外， 以实施例 1相同的方法制备化合物 51。 化合物 51的结构式:
Figure imgf000016_0002
化合物 51 ： ¾ NMR (CD3OD-d4;300MHz) δ 7.13, 7.19, 7.32, 7.36 7.46， 7.60, 7.12, 7.81, 8.05。 实施例 13: 化合物 5m的制备： 除以与化合物 5m相对应的羧酸或羧酸酯以及欺基化合物为原料 外， 以实施例 1相同的方法制备化合物 5m。 化合物 5m的结构式:
Figure imgf000017_0001
化合物 5m： Ή NMR (CD3OD-d4,3 0MHz) δ 2.18, 2.26， 2.30, 6.67, 6.72, 7.03, 7.05， 7.34, 7.47。 实施例 14: 化合物 5η的制备： 除以与化合物 5η相对应的羧酸或羧酸酯以及欺基化合物为原料 外， 以实施例 1相同的方法制备化合物 5η。 化合物 5η的结构式：
Figure imgf000017_0002
化合物 5η： Ή NMR (DMSO-d6,300MHz) δ 2.26, 2.31， 2.36, 7.01 7.04, 7.10, 7.29， 7.43, 7.56, 7.69, 7.85。 实施例 15: 化合物 5ο的制备: 除以与化合物 5o相对应的羧酸或羧酸酯以及欺基化合物为原料 外， 以实施例 2相同的方法制备化合物 5o。 化合物 5o的结构式:
Figure imgf000018_0001
化合物 5o： Ή NMR (CD3OD-d4,300MHz) δ 2.14, 2.28， 2.36, 6.87, 6.97, 7.10, 7.18， 7.50, 7.60, 7.95。 实施例 16: 化合物 5ΐ3的制备： 除以与化合物 5ρ相对应的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物为原料 外， 以实施例 2相同的方法制备化合物 5ρ。 化合物 5ρ的结构式:
Figure imgf000018_0002
化合物 5ρ： Ή NMR (DMSO-d6,300MHz) δ 7.19, 7.39, 7.44, 7.54 7.65, 7.81, 7.96, 8.17。 实施例 17: 化合物 5q的制备： 除以与化合物 5q相对应的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物为原料 外， 以实施例 2相同的方法制备化合物 5q。 化合物 5q的结构式:
Figure imgf000019_0001
化合物 5q： Ή NMR (DMSO-d6,300MHz) δ 6.67, 6.71, 6.97, 7.08， 7.24, 7.46, 7.49, 7.77, 8.00。 实施例 18: 化合物 5r的制备： 除以与化合物 5r相对应的羧酸或羧酸酯以及欺基化合物为原料 外， 以实施例 2相同的方法制备化合物 5r。 化合物 5r的结构式：
Figure imgf000019_0002
化合物 5r： ]H NMR (CD3OD-d4,300MHz) δ 2.14, 2.28, 2.36, 6.87, 6.97 7.10, 7.18, 7.35, 7.47, 7.52。 实施例 19: 化合物 5s的制备: 除以与化合物 5s相对应的羧酸或羧酸酯以及欺基化合物为原料 外， 以实施例 2相同的方法制备化合物 5s。 化合物 5s的结构式：
Figure imgf000020_0001
化合物 5s： ]H NMR (CDCl3,300MHz) δ 2.18, 3.91, 6.68, 7.16, 7.19, 7.37, 7.68, 7.84, 7.92, 8.01。 实施例 20: 化合物 5t的制备： 除以与化合物 5t相对应的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物为原料 外 , 以实施例 2相同的方法制备化合物 5t。 化合物 5t的结构式:
Figure imgf000020_0002
化合物 5t： ¾ NMR (DMSO-d6,300MHz) δ 1.06， 2.19, 2.36, 6.99 7.12， 7.28, 7.44, 7.58, 8.04, 8.39。 实施例 21: 化合物 5u的制备: 除以与化合物 5u相对应的羧酸或羧酸酯以及霰基化合物为原料 外， 以实施例 2相同的方法制备化合物 5u。 化合物 5u的结构式:
Figure imgf000021_0001
化合物 5u： !H NMR (DMSO-d6,300MHz) δ 2.36, 6.71， 6.83, 7.22, 7.44, 7.58, 7.98。 实施例 22: 化合物 5ν的制备： 除以与化合物 5ν相对应的羧酸或羧酸酯以及談基化合物为原料 外， 以实施例 2相同的方法制备化合物 5ν。 化合物 5ν的结构式：
Figure imgf000021_0002
化合物 5ν： !H NMR (DMSO-d6,300MHz) δ 7.09， 7.20, 7.40, 7.58 7.98, 8.00,8.31 » 测试实施例 1 : ΑΜΡΚ活性激活测试试驺
ΑΜΡΚ催化亚基 αΐ无活性片断 cdd-394氨基酸)的制备： 将编码人源 AMPK催化亚基 αΐ无活性片断 al(l-394氨基酸)的基 因序列构建于 pGEMEX-Ι 载体中 。 将经鉴定完全正确的 pGEMEX- AMPK- 1 ( 1 -394)重组质粒转化表达型 大肠杆菌 BL21-Codon-Plus (DE3)-RIL菌株，挑单克隆菌落于 1 L含 50 g/mL氨 苄青霉素和 25 g/mL氯霉素的 LB丰富培养基，每分钟 180转于 37。C 培养过夜， 直至菌液 OD600值为 0.4-0.6, 加入 0.1 mM IPTG于 22。C 诱导表达过夜。 4。C采用 6000xg离心 3分钟收获表达细菌（约 2.0 g/L 表达菌）， 用 20 mL Buffer A ( 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT )重 新悬浮细菌并洗菌三次， 然后用裂解液 Buffer A, 1% Triton X- 100重悬 细菌。 在 4。C下用超声波处理菌液三分钟， 充分裂解细胞。 将上述含 有目的蛋白的裂解液于 4°C 12000xg离心 15分钟，两次离心后弃沉淀， 取上清蛋白液过 Q柱。 使用 HiTrap-5ml QHP 阴离子交换柱和 FPLC system进行。 过 Q柱的溶液有 Buffer A ( 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT )和 Buffer B ( 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 1 M NaCl )。 用 Buffer A平衡 HiTrap- 5ml QHP层析柱后， 注入上清蛋白样品， 先用 Buffer A平衡，再用 Buffer A和 100%Buffei' B组成的线性 NaCl梯度洗 脱。 用 SDS- PAGE -检证收集组分的蛋白组成和純度； 并根据结果和蛋 白浓度， 分别合并较纯的组分。 洗脱得到的目的蛋白 AMPK-ocl(l-394) 经 12% SDS-PAGE分离鉴定：纯化得到的目的蛋白纯度约为 95 %左右。 经鉴定， 其大小， 酶学性质均与文献报道的氨基酸序列相对应的重组 鼠源 AMPK-al (aa 1-392)—致 (Hamilton等， AMP-activated protein kinase kinase: detection with recombinant AMPK al subunit, (2002) Biochem.Biophys.Res. Commun. 293, 892-898; Crute 等 , Functional domains of the al catalytic subunit of the AMP-activated protein kinase, (199S) J.Biol. Chem. 273, 35347-35354) 。 ΑΜΡΚ-α 1 (1 -394)激活测试原理：
应用上述大肠杆菌表达系统， 纯化得到了人源 ΑΜΡΚ的催化亚基 αΐ的无活性片断 al(l- 394), 其中该片断含有自身的自我抑制序列， 用 于筛选实验。 基于放射性同位素技术， 激活的 ΑΜΡΚ能够磷酸化底物 SAMS(MW: 1779),将溶液中 [γ- 33P]-ATP上的 γ-33Ρ转移共价结合到底物 SAMS上， 使其 Ser残基碑酸化， 产生具有同位素标记的底物 33P - SAMS, 最后加入闪烁液通过液体闪烁计数仪计数来定量该酶活性。通 过观察不同化合物对其活性的激活情况， 以初步评价化合物的活性。
比较测活体系中存在和不存在化合物样品时， AMPK-al (aa 1-394) 的活性， 判断样品是否具有激活活性； 如果有， 测定不同样品浓度下 AMPK-al (aa 1_394)活性， 计算样品的 EC50, 即半最大激活效应浓度 ( half maximum concentration 50% )。
ΑΜΡΚ-α 1 ( 1 -394)激活测试方法：
HsAMPK-al (aa 1-394)经上游激酶 CaM Kp预磷酸化 4小时后， 按 1 : 4的体积比加入到含底物的测活反应液 (20 mM Tris-HCl， pH 7.5， 1 mM DTT, 5 mM MgC12, 50 μΜ [γ-33Ρ]-ΑΤΡ (0.4 μα/assay), 50 μΜ SAMS)中，总测活体系为 50 μΐ，于 30。C孵育 lO min。反应经 1% H3P04 终止后， 通过 Harvester将蛋白反应液吸附于 P30 滤纸上， 经 0.1% H3P04洗三次， 烘干， 加入闪烁液后封膜， 置 96孔微板闪烁计数仪计 数。
将 35.5 反应混合物 （含 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 5 mM MgC12, 50 μΜ [γ-33Ρ]-ΑΤΡ (0.4 μα/assay), 50 μΜ SAMS )分别加入 到各含有 2 xL实施例 6、 18 ~ 21中的化合物 5f、 5r ~ 5u的待检测的样 品板中， 最后由 12.5μί 已充分磷酸化的 HsAMPK-al (aa 1-394) ( 100 nM ) 的加入而启动反应， 测活温度为 30。C。 在 10 min后终止反应， 吸样， 洗膜， 烘干， 封膜后计数。 样品的激活率通过下列公式求得： 样品的激活率％= [(化合物 CPM值-空白对照) -(阴性对照-空白对照) ]/(阴 性对照 -空白对照） X I 00。
上述测活体系所得反应速度是该酶活性的反应速度； 把溶有上述 化合物的 DMSO (2μ1)代替上述体系中的 DMSO (2μ1),测得反应速度为 化合物作用下的反应速度。
在 30μΜ的初筛浓度下， 发明人发现上述实施例中的 22种化合物 显示从 3%-30%不等的激活率， 选择其中最具有代表性的 5 个化合物 5f、 5r、 5s、 5t、 5u， 测定不同样品浓度下人源 AMPK-al (aa 1-394)活 性， 计算样品的 EC50 , 即半最大激活效应浓度 (half maximum concentration 50%)。 由此可以证明此类化合物能够激活人源 AMPK-al (aa 1-394)的活性。 图 1为不添加本发明的化合物和分别添加本发明的化合物 5f、 5r、 5s、 5t、 5u的情况下， 对 AMPK活性的测定。 图 2为不同浓度下本发明实施例中制备的化合物 5r的催化活性。 在图 2中， （-)表明未加此化合物处理细胞， （+)表明加此化合物处 理细胞； （pAMPK)表示 AMPK催化亚基 α上苏氨酸 (Thr)172的磷酸化 水平； （AMPK)表示胞内 AMPK催化亚基 α的表达水平； （pACC)表示胞 内 AMPK底物 ACC的磷酸化水平；（ACC)表示胞内 ACC的表达水平； (-Actin)表示用胞内肌动蛋白来显示胞内总蛋白量。 实施例 18中制备的化合物 5r在 L6细胞水平上具有明显的增强 胞内 AMPK磷酸化及其下游靶蛋白 ACC的磷酸化水平的作用并呈现 浓度依赖性， 这表明该类化合物能在细胞水平上激活 AMPK。
样品测试结果:
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000025_0001

Claims

权 利 要 求 书
1、 具有如下式 1结构的化合物: [式 1]
Figure imgf000026_0001
其中 X为 NH、 O或 S;
^为 O或者 S;
Y2为 N 、 O或者 S, 其中 为11、 苯基、
Figure imgf000026_0002
为11、 苯基或
Figure imgf000026_0003
、 苄基、 或者取代或未取代的 C1-C10的 烷基或环烷基； 其中 R9、 R1()各自独立地为 H; F; C1; 三氟曱基； 乙 炔基、丙炔基；含有羧基、 曱酸曱酯基、或曱酸乙酯基的 CI - C4烷基;
R2、 R3、 R4各自独立地为 H、 F、 Cl、 吡咯基、 吡啶基、 噻唑基、
噻吩基、 苄基、 苯基、 或者
Figure imgf000026_0004
其中 、 R7、 R8各自独立地为 H、 F、 Cl、三氟曱基、三氟曱氧基、 硝基、 胺基、 苯甲酰胺基、 C2-C6烷酰胺基、 和 C3-C6的环烷基取代 的酰胺基、 C1-C4烷基。
2、根据权利要求 1的化合物，其特征在于所述的未取代的 C1-C10 的烷基或环烷基为环丙烷基、 环丁烷基、 曱基、 乙基、 正丙基、 正丁 基、 正戊烷基、 环戊烷基、 正己烷基、 环己基； 取代的 C1-C10的烷基 或环烷基的取代基包括一个或多个选自 F、 Cl、 C1-C10的浣氧基、 腈 基、 羧基、 曱酸曱酯基、 曱酸乙酯基或羟基的取代基团。
3、 一种制备权利要求 1所述的化合物的制备方法， 该方法包括以 下三个步驟：
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000027_0002
其中， 各种基团的定义与权利要求 1中的相同； 步骤 a. 在 0 ~ 5 °C下， 以四氢呋喃为溶剂， 化合物 1与四氢锂铝反 应将羧基还原为醇羟基， 经过常规后处理步骤， 得到化合物 2; 步骤 b. 室温下， 以氯仿为溶剂用活性二氧化锰将化合物 2的醇羟 基氧化为醛基， 经过常规后处理步驟， 得到化合物 3; 步骤 C. 以水醋酸或无水乙醇为溶剂， 并在醋酸钠或哌啶作用下，
80°C至 120°C回流， 将化合物 3、 4偶联， 经过常规后处理步驟， 得到 最终的化合物 5。
4、根据权利要求 1的化合物在激活人源腺苷单核苷酸激活蛋白激 酶中的应用。
5、根据权利要求 1的化合物在制备治疗代谢性疾病的药物中的应 用。
6、根据权利要求 5的应用 ,其中所述的代谢性疾病为 II型糖尿病、 肥胖症和肿瘤。
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