WO2007085624A1 - Polymergerüste zur herstellung künstlicher gewebe - Google Patents

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WO2007085624A1
WO2007085624A1 PCT/EP2007/050707 EP2007050707W WO2007085624A1 WO 2007085624 A1 WO2007085624 A1 WO 2007085624A1 EP 2007050707 W EP2007050707 W EP 2007050707W WO 2007085624 A1 WO2007085624 A1 WO 2007085624A1
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polymer
alkyl
alkoxy
cannula
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Simon Champ
Matthias Maase
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BASF SE
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    • B29L—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASS B29C, RELATING TO PARTICULAR ARTICLES
    • B29L2028/00—Nets or the like

Definitions

  • the invention relates to polymer frameworks suitable for the production of artificial tissue, in particular polysaccharide frameworks, processes for their preparation, their use for the production of artificial tissue, and artificial tissues produced on the basis of such polymer frameworks.
  • transplantation and mechanical prosthetics, the latter being currently limited to biochemically and electrophysiologically largely inert body parts (eg, joints, ophthalmic lenses, heart valves).
  • inert body parts eg, joints, ophthalmic lenses, heart valves.
  • tissues or organs with biochemical activity eg, heart, lung, liver, kidney
  • transplantation is currently the only possible restorative treatment.
  • extracellular matrix refers to the totality of all the structures deposited by the cells but still in contact with them. Both as an attachment point for the cells of the tissue and because of their intrinsic properties, e.g.
  • tissue organization Permeability and mechanical stability, the extracellular matrix is important for the stability and functionality of many tissues, and its specificity for specific cell types makes it important for maintenance of tissue organization (morphostasis) and homeostasis.
  • tissue organization As a tissue organization here the correct spatial arrangement of the cells is referred to as homeostasis their retention over time, even with changing loads.
  • a colonization of preformed synthetic structures with living cells can basically be done in vitro, but post-implantation processes are also possible, eg.
  • tissue engineering The production of tissues and organs in vitro is often referred to as "tissue engineering” (see, for example, PL Pabst, "Tissue engineering: a historical review as seen through the United States Patent Office", Expert Opinion Ther. Patents 13 (2003): Griffith and G. Vaughton, "Tissue Engineering - Current Challenges and Expanding Opportunities," Science 295 (2002): 1009-1012; E. Pennisi, “Tending Tender Tenons,” Science 295 (2002): 1011).
  • the substance must not induce an inflammatory or rejection reaction, which precludes many of the versatilen proteinaceous materials from the outset.
  • the substance should be biodegradable, ideally at a rate equivalent to replacement by biogenic structures in the organ. This should allow subtle replacement of the synthetic matrix by natural tissues / structures while maintaining the shape without critical phases of reduced mechanical stability.
  • the degradation should not be swelling / bursting, but eroding, so that the mechanical stability of the synthetic structure remains as long as possible.
  • no toxic mono- or oligomers should be formed during this degradation. This places particular demands on both the three-dimensional structure of the preformed synthetic matrix and the material of which it is composed.
  • polymeric biomaterials see e.g. B. L. G. Griffith, "Polymeric Biomaterials", Acta mater. 48 (2000), 263-277. Both natural materials such as collagen and fibrin, as well as synthetic polymers such as polyglycolides and polylactide are mentioned.
  • a polyglycolide is dipped in a polylactide solution in CHCl 3 and the wetted material is molded in a mold.
  • this type of production of three-dimensional frameworks is not very precise and also not applicable to the production of arbitrarily small or complex shaped frameworks.
  • the process is limited to materials that have a relatively low softening point or melting point.
  • No. 5,328,603 describes a method for the production of cellulose beads in the submillimeter range ("beads") which are to be used in chromatographic methods. In this case, first cellulose is solubilized by chaotropic salts and then the atomized solution is added to a non-cellulose medium.
  • WO 03/029329 describes the preparation of a cellulase strand by solubilization of cellulose in an ionic liquid and subsequent extrusion of the solution into an aqueous medium. The production of two-dimensional or three-dimensional cell structure is not described.
  • a degree of control over the forming process in the field of precision mechanics enables the miniaturization of CAD / CAM ("computer aided manufacturing” / “computer aided manufacturing”) techniques, today often referred to as “desktop manufacturing” or "rapid prototyping".
  • CAD / CAM computer aided manufacturing
  • computer aided manufacturing / "computer aided manufacturing”
  • rapid prototyping a three-dimensional model of the object to be manufactured is created in the computer, which is then produced without further intermediate stages by an automated tool controlled by the computer.
  • the computer typically implements an algorithm which automatically decomposes the three-dimensional model into a number of finite elements suitable for execution and processes them one after the other.
  • construction methods are those in which not void spaces are cut out of an originally coherent block of material, but the material is applied stepwise during the shaping process.
  • the cavities provided either remain empty, d. H. with the working medium (air or a liquid medium in which the material is not soluble) are filled, or filled with a placeholder substance, which can be removed after completion of the molding process, for example by solvent or heating.
  • the working medium air or a liquid medium in which the material is not soluble
  • a placeholder substance which can be removed after completion of the molding process, for example by solvent or heating.
  • the explanations of the constructive methods can basically be classified in the two categories “printing” (discontinuous) and “plotting” (continuous).
  • printing preferably from a phalanx of nozzles
  • the material is applied in rasters, while plotting a substantially uninterrupted strand of material is extruded.
  • Plotting requires more time, plotting techniques, and control algorithms, but results in more consistent and predictable results.
  • Both plotting and printing and their application in the field of tissue enginering are described in the prior art (eg BVL Tsang and SN Bhatia, "Three-dimensional tissue fabrication", Advanced Drug Delivery Reviews 56 (2004): 1635-1647 A.
  • the object of the present invention was to provide a process which makes it possible to use two- and / or three-dimensional structures which serve as scaffolds in the formation of reimplantable or researchable models, for example as scaffolding in the field of "
  • the method should also allow the use of scaffolds that are beneficial from a biological-medical point of view, but due to their physico-chemical properties, such as melting point, ductility or solubility, conventional processes for scaffolding are not trivial to edit.
  • the object has been achieved by a method for producing two- or three-dimensional frameworks from biodegradable and biocompatible polymers, which comprises the following steps:
  • Cannula wherein the cannula and the resulting framework move relative to each other in two or preferably three dimensions during the extrusion process;
  • the material is basically any biodegradable and biocompatible polymer suitable.
  • biodegradable is a polymer which, under the conditions prevailing in the organism, chemically or enzymatically to mono- or oligomers soluble in body fluids within a suitable period of time, eg within one year, preferably within weeks or Months, can be reduced.
  • biocompatible in the context of the present invention, a polymer is referred to, if neither the polymer nor its mono- or oligomeric degradation products harmful, z. B.
  • the term "scaffold” is understood to mean a spatial structure which comprises at least two straight, bent and / or bent rods or strands, as a rule at least one strand or rod overlap or contact being present. Overlapping here means that the angle between the strands is not equal to 0, while touching also includes the angle 0 (e.g., with strands lying parallel to each other).
  • z. B. surface, spiral or circular elements to be included In the framework and non-rod-shaped, z. B. surface, spiral or circular elements to be included.
  • rod or "strand” is meant a substantially linear structure in the stretched state (“straight rod / strand”), ie, a three-dimensional shape whose extent is in one dimension
  • a "strand” is a rod obtained by extrusion Kinked or bent rods / strands have an overall dimension in two dimensions.
  • a structure fulfills a certain dimension if its extent in this dimension is more than one, preferably more than two, strand or bar diameter.
  • "beads” according to US 5,328,603 are zero-dimensional and elongated single strands one-dimensional.
  • a "three-dimensional framework” is a framework that fulfills three dimensions.
  • a "two-dimensional framework” has an extension in two dimensions. Although individual bent or kinked strands are also two-dimensional according to the above definition, in the context of the present invention a two-dimensional framework should be understood as comprising at least two rods / strands which overlap or touch each other in at least one point and their common extension is limited to two dimensions.
  • the multi-dimensional structures also include forms without strand overlapping, such as, for example, B. loops or spirals. These do not correspond to those in the frame
  • the term "scaffold" used in the present invention may be part of the frameworks according to the invention.
  • the term "solubilization" in the context of the present invention refers to a conversion of the framework material (polymer) which can be achieved without significant heating in a flowable, pourable or extrudable state.
  • the polymer is converted into a solvated state in which, however, the individual polymer molecules do not have to be completely surrounded by a solvate shell. It is essential that the polymer changes into a liquid state or at least a softening state as a result of the solubilization.
  • the term "without significant heating” means that for solubilization temperatures of at most 200 ° C., preferably at most 150 ° C., more preferably at most 120 ° C. and in particular at most 100 ° C. are used.
  • Chaotropic refers to substances that are able to dissolve supermolecular associates of macromolecules by disrupting or influencing the intermolecular interactions, without affecting the intramolecular covalent bonds.
  • extrusion in the context of the present application is not limited to a specific production technique, but generally refers to the substantially continuous pressing out of a flowable substance through a relatively narrow opening (ie a nozzle in the broadest sense), eg through a cannula.
  • Essentially continuous means that the extrusion process can also be interrupted again and again, eg to generate individual polymer strands (for example according to step (ii-b)) or to transfer to another spatial plane in step (ii-a) However, it does not take place with such periodic interruptions that only zero-dimensional structures, such as spheres, arise.
  • a "substantially continuous" polymer rod is a one-dimensional polymer structure in the stretched state, that is, a structure that is not formed by joining and / or fusing zero-dimensional structures in a particular arrangement. It is preferable here if the rod is substantially uniform in thickness, especially if it does not show a rhythmic sequence of thicker and thinner portions, and if the molecular structure is substantially uniform in the dimension direction, especially if the molecular structure in the dimension direction does not undergo rhythmic changes shows. Furthermore, it is preferred if the polymer chains in the rod are substantially parallel to each other and to the longitudinal direction of the rod, and in particular if parallel polymer chains overlap in the length dimension, so that contact surfaces between the Molecules are formed.
  • the extent of the overlap over the entire length of the rod is substantially uniform.
  • the intersection of the polymer chains leads to the formation of partially crystalline regions.
  • stabilization by covalent cross-linking in the overlap region is subsequently possible.
  • substantially means that usual deviations caused, for example, by the extrusion step are tolerated.
  • cannula refers to any type of nozzle through which a solution produced in the first step can be continuously pressed.
  • the "relative movement of the cannula and scaffold or polymer strand relative to one another” means that during the extrusion step (ii) both the cannula alone and the framework or the polymer strand or the container which contains the liquid medium into which the polymer extrudes
  • the movement takes place over the entire step (ii-a) as viewed in two spatial directions (two-dimensional movement) or preferably in all three spatial directions (three-dimensional movement) or over the entire step (ii-b)
  • Moving in one spatial direction produces straight polymer strands, while a two-dimensional relative movement leads to bent or kinked strands.
  • a three-dimensional relative movement of the cannula and polymer strand is possible of spiral or circular elements, which may also be part of the framework, but vorzu be built to a minor extent.
  • step (ii-a) means that the position of the cannula opening can be varied relative to the framework previously formed in all three space dimensions.
  • the extrusion mechanism is displaceable in all three spatial dimensions.
  • the extrusion mechanism is displaceable in at least two spatial dimensions, and the framework so far formed is displaceable in at least one spatial dimension, so that the missing space dimensions (degrees of freedom) of the extrusion mechanism are supplemented by displacement of the framework previously formed .
  • the extrusion mechanism is displaceable in at least one dimension and the framework so far formed in at least two dimensions, so that the missing degrees of freedom of the extrusion mechanism are complemented by the displaceability of the framework previously formed.
  • the extrusion mechanism is in the process of considerably immovable, while the framework thus far formed is displaceable in all three spatial dimensions.
  • step (ii-a) or (ii-b) ie either the extrusion mechanism or the resulting polymer strand (or more precisely the container into which it is extruded) is movable.
  • the extrusion mechanism moves in one spatial direction and the polymer strand moves in a different spatial direction.
  • substantially insoluble means that the polymer has a solubility in the liquid medium of less than 5 g / l, preferably less than 0.5 g / l, and more preferably less than 0.05 g / l.
  • a “liquid medium” refers to a medium whose physicochemical properties are mainly determined by those of a liquid solvent.
  • the liquid medium may also have a gel-like consistency due to the presence of soluble or swellable macromolecules.
  • alkyl is a linear or branched alkyl radical
  • alkyl is C 1 -C 6 -alkyl
  • C 1 -C 6 -alkyl is a linear or branched alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, examples of which are methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n- Butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, n-hexyl and constitutional isomers thereof
  • C 1 -C 4 -alkyl is a linear or branched alkyl radical having 1 to 4 carbon atoms, examples being methyl, ethyl, propyl, isopropyl , n-butyl, sec-butyl, isobutyl and tert-butyl.
  • C- ⁇ -C 6 -alkoxy 6 alkyl group for a bonded via an oxygen atom dC examples thereof are methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, n-butoxy, sec-butoxy, isobutoxy, tert-butoxy, pentoxy, hexoxy and constitutional isomers thereof.
  • -C 4 -alkoxy 4 alkyl group for a bonded via an oxygen atom dC examples of these are methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, n-butoxy, sec-butoxy, isobutoxy and tert-butoxy.
  • C 1 -C 6 -alkoxy-C 1 -C 6 -alkyl is a C 1 -C 6 -alkyl radical in which one or more
  • Hydrogen atoms are substituted by a dC 6 alkoxy. Examples of these are methoxymethyl, ethoxymethyl, propoxymethyl, 1- and 2-methoxyethyl, 1- and 2-ethoxyethyl, 1- and 2-propoxyethyl and the like.
  • C 1 -C 4 -alkoxy-C 1 -C 4 -alkyl is a C 1 -C 4 -alkyl radical in which one or more hydrogen atoms are substituted by a C 1 -C 4 -alkoxy radical. Examples of these are the abovementioned radicals.
  • Aryl is a carboaromatic radical having preferably 6 to 14 carbon atoms.
  • Suitable substituents are, for example, halogen, C 1 -C 6 -alkyl, NO 2 , OH and CN.
  • Aryl is preferably phenyl or substituted phenyl, such as ToIyI, XyIyI, nitrophenyl or chlorophenyl.
  • Aryl-C 1 -C 6 -alkyl is an aryl radical bonded via C 1 -C 6 -alkyl, preferably C 1 -C 2 -alkyl, such as benzyl or 2-phenylethyl.
  • Aryloxy is an oxygen-bonded aryl radical, such as phenoxy.
  • Aryl-C 1 -C 6 -alkoxy represents a C 1 -C 6 -alkoxy radical, preferably C 1 -C 2 -alkoxy radical in which a hydrogen atom is substituted by an aryl group, for example benzoxy.
  • Aryloxy-C 1 -C 6 -alkyl is a C 1 -C 6 -alkyl radical, preferably C 1 -C 2 -alkyl radical, in which a hydrogen atom is substituted by an aryloxy group.
  • Halogen is fluorine, chlorine, bromine or iodine, in particular fluorine or chlorine.
  • Acid anions of CrC ⁇ monocarboxylic acids are the acid anions of aliphatic C-i-Ce monocarboxylic acids. Examples of these are acetate, propionate, butyrate, isobutyrate, pentanoate, hexanoate and the like.
  • Mono- and dianions of C 2 -C 6 -dicarboxylic acids are the simple anions or the dianions of aliphatic C 2 -C 6 -dicarboxylic acids, for example the mono- or dianions of oxalic acid, malonic acid, succinic acid, adipic acid and the like.
  • the polymeric framework material is an organic polymer.
  • An organic polymer is understood here to mean a polymer whose monomers are essentially organic molecules, eg. As alcohols, in particular di- and polyalcohols, carboxylic acids, in particular hydroxydicarboxylic acids and amino acids, amines, in particular di- and polyamines and amino acids, and saccharides, in particular glucose and Fructo- sevenezen. "Substantially organic molecules” means that they are also anor- may contain ganic components, eg metal cations or halide ions, but the nature of the molecule is overall organic.
  • the polymer is a biopolymer.
  • a biopolymer is here understood a polymer whose monomers occur in nature, for. As saccharides and amino acids, and in particular a polymer whose total structure occurs in nature.
  • examples of biopolymers are proteins, e.g. Silk protein, and polysaccharides, e.g. Cellulose, cellulose derivatives, chitin, chitosan, dextran, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, xylan and starch.
  • the polymer is selected from polysaccharides and modified polysaccharides, and more particularly from polysaccharides. These not only meet the chemical and mechanical requirements of suitable materials in the area of "tissue engineering", but are also immunologically harmless, in contrast to many other proteins.
  • suitable polysaccharides are, for example, cellulose, cellulose derivatives, chitin, Chitosan, dextran, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, xylan and starch.
  • cellulose or a cellulose derivative is used in the process according to the invention.
  • Suitable cellulose derivatives are, for. Methylcellulose, ethylcellulose, propylcellulose, hydroxyethylcellulose and
  • Hydroxypropyl cellulose In particular, cellulose is used. As cellulose any known form of cellulose can be used, for. As cellulose, cotton, paper-derived cellulose or bacterial cellulose.
  • the polymer is mechanically comminuted prior to solubilization, e.g. B. by grinding and / or shredding.
  • the polymer can be used in step (i) as such or together with further components.
  • Preferred additional components are those which advantageously influence the framework construction and / or the subsequent use of the framework.
  • suitable components are inorganic particles, eg. Hydroxyapatite particles, and non-structural, d. H. different from the scaffold polymer, biopolymers, eg. As proteins, protein fragments, peptides or certain carbohydrates.
  • biopolymers eg. As proteins, protein fragments, peptides or certain carbohydrates.
  • non-structural biopolymers are additional
  • suitable non-structural biopolymers are matrix proteins, e.g. Fibronectin, vitronectin, collagen, laminin, lectins, tissue extracts, growth factors, e.g. As VEGF, or fusion proteins or other derivatives of said proteins.
  • suitable biopolymers are Proteins or peptides containing the amino acid motif RGD, further adhesion promoting carbohydrates such as sialyl Lewis x or fragments thereof or otherwise bioactive carbohydrates such as heparin or fragments thereof.
  • the corresponding molecules can each be covalently or noncovalently linked to polymer molecules.
  • step (i) contains one or more of said biopolymers, these are present in an amount of preferably 0.1% by weight to 5% by weight, in particular from 1% by weight to 2% by weight. %, based on the total weight of the backbone polymer.
  • the backbone polymer contains inorganic particles such as hydroxyapatite, they are contained in an amount of preferably 1 to 20% by weight, more preferably 5 to 10% by weight, based on the weight of the backbone polymer.
  • the chaotropic liquid is substantially anhydrous.
  • “Substantially anhydrous” means that the chaotropic liquid contains less than 5% by weight of water, preferably less than 2% by weight of water, more preferably less than 1% by weight of water, based on the total weight of the chaotropic liquid , contains.
  • the chaotropic liquid is substantially free of nitrogenous bases.
  • “Substantially free of nitrogenous bases” means that the chaotropic liquid is less than 5% by weight, preferably less than 2% by weight, more preferably less than 1% by weight of nitrogenous bases, based on the total weight of the Nitrogen-containing bases are, for example, ammonia, amines and aromatic or nonaromatic heterocycles having at least one basic nitrogen atom as ring member.
  • the chaotropic liquid is at a temperature of at most 150 ° C, e.g. in the temperature range from -100 ° C to +150 ° C or from 0 to +150 ° C or from 50 to +150 ° C, more preferably from at most 120 ° C, z.
  • the solubilization process can also be supported by ultrasound.
  • the heating is effected by microwave irradiation.
  • the solubilization occurs at temperatures of at most 200 ° C, e.g. from 0 to 200 ° C, or preferably from 20 to 200 ° C, or more preferably from 50 to 200 ° C, or more preferably from 100 to 200 ° C, more preferably at most 150 ° C, e.g. from 0 ° C to +150 ° C or preferably from 20 to 150 ° C or more preferably from 50 to 150 ° C or more preferably from 100 to 150 ° C, more preferably from at most 120 ° C, e.g.
  • the chaotropic liquid is selected from liquid salts.
  • Liquid salts are also referred to as "ionic liquids.”
  • ionic liquids are understood to mean salts in which the ions are only weakly coordinated, so that these salts are stable at relatively low temperatures, for example below 150 ° C. or below 100 ° C. or even at room temperature, in which case the charge is delocalized in at least one of the ions and at least one of the ions is organic, preventing the formation of stable crystal lattices.
  • the liquid salt has the formula Het + A x " 1 / X.
  • Het + is a positively charged N-alkylated, N-arylated, N-arylalkylated, N-alkoxylated, N-aryloxylated, N-arylalkoxylated, N-alkoxyalkylated and / or N-aryloxyalkylated nitrogen-containing heterocycle.
  • Het + stands for a positively charged nitrogen-containing heterocycle in which formally a ring nitrogen atom carries an alkyl radical, aryl radical, arylalkyl radical, alkoxy radical, aryloxy radical, arylalkoxy radical, alkoxyalkyl radical and / or an aryloxyalkyl radical via its free electron pair
  • a positive charge is generated, ie, the positive charge of the heterocycle is due to the substitution of the free electron pair of a ring nitrogen atom.
  • Alkyl in the radicals mentioned is preferably C 1 -C 6 -alkyl.
  • Alkoxy in the radicals mentioned is preferably C 1 -C 6 -alkoxy.
  • Aryl in the radicals mentioned is preferably phenyl.
  • Arylalkyl in the radicals mentioned preferably represents aryl-C 1 -C 6 -alkyl, such as benzyl or phenylethyl.
  • Aryloxy is in the radicals mentioned preferably for an oxygen-bonded phenyl radical, for example phenoxy.
  • Arylalkoxy in the radicals mentioned preferably represents an aryl-C 1 -C 6 -alkoxy radical, for example benzoxy.
  • Alkoxyalkyl in said radicals preferably for a -C 6 - alkoxy-C- ⁇ -C6 alkyl.
  • Aryloxyalkyl in the radicals mentioned preferably represents an aryloxy-C 1 -C 6 -alkyl radical, in particular a phenoxy-C 1 -C 6 -alkyl radical.
  • Het + is an aromatic heterocycle or an alicyclic heterocycle in which the ring nitrogen atom is not part of a double bond
  • the nitrogen atom which formally generates the positive charge is either monosubstituted or disubstituted by the above-mentioned radicals.
  • a x " 1 / X represents an anion in which x is 1, 2 or 3.
  • Het + is selected under
  • R a and R a independently of one another are C 1 -C 6 -alkyl, aryl, C 1 -C 6 -alkoxy, aryloxy, C 1 -C 6 -
  • R b is hydrogen, C r C 6 alkyl, aryl, C r C 6 alkoxy, aryloxy, Ci-C 6 -alkoxy-CrC 6 - alkyl or aryloxy -C 6 alkyl and preferably -C 6 alkyl or -C 6 -
  • Alkoxy-C 1 -C 6 -alkyl; wherein the alicyclic or aromatic heterocycles or the benzene rings may be at the latter of which is condensed may carry up to 5 substituents 1 are selected from C r C 6 alkyl, C r C 6 alkoxy and Ci-C 6 -alkoxy-C C 6 alkyl.
  • Het + is particularly preferably selected from compounds of the formulas Het.1 to Het.15:
  • R 1 and R 2 are independently dC 6 alkyl or Ci-C 6 alkoxy-CrC 6 alkyl
  • R 3 to R 9 are each independently hydrogen, CrC 6 alkyl, Ci-C 6 alkoxy-C 6 - alkyl or d-C6-alkoxy, with hydrogen being particularly preferred.
  • both R 1 and R 2 for dC 4 alkyl or Ci-C4-alkoxy-Ci-C 4 - alkyl where, it is particularly preferred if one of these groups is methyl.
  • both R 1 and R 2 are C 1 -C 4 -alkyl.
  • one of the radicals R 1 or R 2 is methyl and the other is C r C 4 alkyl, for example ethyl.
  • R 3 to R 9 are preferably H.
  • Het + is monocyclic. Accordingly, Het + is preferably selected from the compounds of formulas Het.1 to Het.13. Het + is more preferably a monocyclic five-membered ring. Accordingly, Het + is particularly preferably selected from the compounds of the formulas Het.5 to Het.1 1 and Het.13.
  • Het + is more preferably an imidazolium ion of the formula Het.5, a pyrazolium ion of the formula Het.6, an oxazolium ion of the formula Het.7, a 1,2,3-triazolium ion of the formula Het.8 or Het.9, a 1,2,4-triazolium ion of the formula Het.10 or a thiazolium ion of the formula Het.11, where R 1 to R 5 are as defined above.
  • both R 1 and R 2 are preferably C 1 -C 4 -alkyl or C 1 -C 4 -alkoxy-C 1 -C 4 -alkyl and particularly preferably C 1 -C 4 - Alkyl, wherein it is particularly preferred if one of these groups is methyl.
  • one of the radicals R 1 or R 2 is methyl and the other is C 1 -C 4 -alkyl, for example ethyl.
  • R 3 to R 5 are preferably H.
  • Het + is an imidazolium ion of the formula Het.5, wherein R 1 to R 5 are as defined above.
  • R 1 to R 5 apply here correspondingly, ie, both R 1 and R 2 preferably upstream for -C 4 -alkyl or Ci-C 4 -alkoxy-CrC 4 -alkyl and particularly preferably -C 4- alkyl, wherein it is particularly preferred if one of these groups is methyl.
  • R 3 to R 5 are preferably H.
  • Het + stands in particular for an imidazolium ion of the formula Het.5 which carries a methyl group on a ring nitrogen atom and on the second ring nitrogen atom a C 1 -C 4 -alkyl group or C 1 -C 4 -alkoxy-C 1 -C 4 -alkyl group
  • R 3 , R 4 and R 5 stand for H.
  • one of the radicals R 1 or R 2 is methyl and the other is C 1 -C 4 -alkyl, for example ethyl.
  • a x " 1 / X is preferably chosen from coordinating anions, ie those which are in principle capable of coordination eg to a metal center.
  • a x " 1 / X is selected from halides, pseudohalides, perchlorate, the acid anions of dC 6 -monocarboxylic acids and the mono- and dianions of C 2 -C 6 - dicarboxylic acids, wherein the mono- and dicarboxylic acids mono-, di-or trihydric Halogen and / or hydroxy may be substituted
  • a preferred acid anion is acetate.
  • a x " 1 / X selected from halides, pseudohalides and acetate.
  • Pseudohalides are z. Cyanide (CN “ ), cyanate (OCN “ ), isocyanate (CNO “ ), thiocyanate (SCN “ ), isothiocyanate (NCS “ ) and azide (N 3 " ).
  • a x " 1 / X is chloride, bromide, cyanate, thiocyanate or acetate.
  • a x" 1 / X is chloride or acetate.
  • Het + A x " 1 / X stands for an imidazolium chloride Het.5-Cl " or an imidazolium acetate Het.5- (CH 3 COO " ), the imidazolium ion preferably being substituted as described above.
  • the chaotropic liquid is selected from solutions of chaotropic salts in polar aprotic solvents.
  • the inorganic salts are preferably selected from alkali halides, alkaline earth halides, ammonium halides, alkali metal pseudohalides, alkaline earth metal halides. halogenides, ammonium pseudohalides, alkali perchlorates, alkaline earth perchlorates and ammonium perchlorates and mixtures thereof.
  • the inorganic salt is particularly preferably selected from lithium chloride, calcium thiocyanate, sodium iodide, sodium perchlorate and mixtures thereof.
  • Preferred polar aprotic solvents are dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide and diethylamine and mixtures thereof.
  • the chaotropic liquid is selected from the ionic liquids described above.
  • the statements made above on the preferred embodiments of the ionic liquid are hereby incorporated by reference.
  • step (i) of the process according to the invention is generally carried out by mechanically mixing the optionally previously comminuted polymer with the chaotropic liquid and stirring until complete dissolution.
  • the mixture is heated to accelerate the dissolution and homogenization process during or after mixing, e.g. B. by microwave irradiation, but preferably not to a temperature of more than 150 ° C, preferably not more than 120 ° C, in particular not more than 100 ° C.
  • the concentration of the solubilized polymer in the chaotropic liquid is 5% by weight to 35% by weight, preferably 5% by weight to 25% by weight and in particular 10% by weight to 25% by weight. %.
  • step (N) Upon introduction of the solubilized polymer into the liquid medium (step (N)), it precipitates within a very short period of time, e.g. In less than 1 s.
  • the introduction takes place by extrusion, d. H. Press out the solubilizate through a cannula.
  • the chaotropic solution is introduced into the liquid medium in which the chaotropic components are soluble but the polymer material is substantially insoluble, the polymer precipitates.
  • the extrusion of the polymer into a liquid medium takes place by means of a movable cannula, which is preferably part of an automated device.
  • the cannula or the container in which the liquid medium is, or both are in this case moved so that the extrudate in variant (ii-a) takes the form of a three-dimensional framework, network or lattice and in variant (ii-b) the Shape of a straight, bent or bent polymer strand.
  • the liquid medium used in step (ii) is on the one hand miscible with the chaotropic liquid of step (i), on the other hand, the polymer used is substantially insoluble therein.
  • Preferred liquid media are protic solvents such as water and alkanols, cyclic ethers such as tetrahydrofuran and dioxane, ketones such as acetone and ethyl methyl ketone, and nitriles such as acetonitrile, and mixtures thereof.
  • Preferred liquid media are protic solvents such as water and alkanols, as well as mixtures thereof.
  • Suitable alkanols are C 1 -C 4 -alkanols, such as, for example, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol and tert-butanol.
  • the liquid medium is aqueous, ie it contains at least 10% by weight of water.
  • the liquid medium particularly preferably contains at least 50% by weight of water, in particular at least 80% by weight of water.
  • the remaining constituent of the aqueous medium is preferably selected from C 1 -C 3 -alkanols, such as methanol, ethanol, n-propanol and isopropanol. Specially used water.
  • the points of intersection between various elements of the scaffold, grid or network are stabilized by polyelectrolytes.
  • Polyelectrolytes refers to polymers whose repeat units carry a group capable of accepting or releasing protons, and which can thus take up and release charges in a protic, in particular aqueous medium, and these can be positive and / or negative within a molecule , A negatively charged in the aqueous medium group is z.
  • the carboxyl group, a group positively charged in the aqueous medium is e.g. the amino group.
  • all common polyelectrolytes are suitable. Suitable polyelectrolytes are, for example, compounds used as additives for increasing the wet strength of paper in papermaking, such as polycarboxylic acids, e.g. Polyacrylic acid, polyamines, e.g.
  • Polyvinylamine, polyimines, copolymers of amide-part unsaturated carboxylic acid amides and unsaturated carboxylic acids e.g. N-vinylformamide / acrylic acid copolymers, polymerizable basic heterocycles, e.g. N-vinylpyrrolidone, reaction products of polyamines with epichlorohydrin, epoxidized polyamides, urea resins, melamine resins, polyurethanes and the like.
  • Such wet strength enhancers are described, for example, in EP 01 1 18 439, to which reference is hereby fully made.
  • polyelectrolytes are polycarboxylic acids, such as. For example, polyacrylic acid, monotone aliphatic polyamines such.
  • polyvinylamine and polymerizable basic heterocycles, ie heterocycles having an exocyclic ethylenic double bond, such as polyvinylpyrrolidone.
  • the polyelectrolytes are part of the liquid medium into which the solubilized polymer is extruded. It is preferred if the liquid medium contains up to 20 wt .-% of polyelectrolyte, in particular from 5 wt .-% to 10 wt .-%, based on the total weight of the liquid medium.
  • single or all parts of the scaffold are provided with signal or growth factors that act on living cells.
  • Corresponding factors eg. As VEGF or NGF, are familiar to the expert. Depending on their individual physical or chemical properties, these factors may preferably be added either to the material to be extruded in step (i) as previously described ("doping") or during the extrusion process in step (ii) or thereafter using a suitable cannula be applied as a layer on the surface of the resulting strand.
  • the resulting polymer backbone may be homogeneous with respect to the distribution of the factors, but preferably a heterogeneous distribution that leads to the formation of signal factor gradients and thus tissue regeneration, z. B. the ingrowth of blood vessels and nerve fibers, an orientation pretending.
  • the heterogeneity of the signal factors is combined in a suitable manner with a structural heterogeneity of the skeleton, lattice or network, for example by B. for blood vessels or nerves larger, heavily doped recesses are kept free or the conditions for the formation of more complex organ structures are created.
  • the extrusion is carried out in such a way that the framework is built up essentially in layers, so that a framework with a layer structure is formed, ie the vast majority of the bars or strands lie in each other parallel planes, wherein the stabilizing contacts between the respective adjacent layers come about mainly by intersections of strands, while the contribution of not extending in a plane bars or strands for interactions between the layers and thus for the three-dimensional stability of the scaffold is irrelevant.
  • Substantially layered construction means that the framework may also contain strand arrangements which do not belong to these layers, but the framework mainly, for example at least 60%, preferably at least 80% and in particular at least 90%, based on the length of the polymer strands that make up the framework as a whole, is composed of stratified polymer strands.
  • each layer consists mainly of extrudate strands running parallel to one another, in particular of bustrophedone, d. H. alternating from neighbor strand to neighbor strand in the direction and opposite direction, extending extrudate strands.
  • bustrophedone d. H.
  • the stabilization of the strands of each individual layer is achieved primarily by the contact with the strands of the neighboring layer or neighboring layers, provided that a grid-like, permeable structure is provided in the relevant area of the plane.
  • planes or parts of planes can also be rendered opaque by placing the parallel strands in the area in question so that they touch each other.
  • the strands of adjacent planes are neither parallel nor antiparallel to each other.
  • the angles of the strands between adjacent layers are 90 °, 60 ° or 45 °.
  • FSS curves, FASS space-filling, self-avoiding, simple and self-similar
  • Substantially means that the layers are at least 60%, preferably at least 80% and especially at least 90%, based on the total length of the polymer strands of which the respective layers are constructed of polymer strands in the form of two-dimensional space-filling curves
  • a FASS curve is a path that leads over a surface made up of a number of uniform fields or through a three- or more-dimensional space made up of a number of "chambers" so that each field or chamber is touched without the path intersecting with itself, resulting in a more uniform structure in both dimensions of the plane than in building the plane of parallel strands.
  • Preferred special forms of FASS curves are Peano curves, Hilbert curves, and Sierpi ⁇ ski. curves.
  • each plane is preferably decomposed into a number of surfaces, each of which is substantially independently filled by the other surfaces of the same plane.
  • adjacent planes are divided into different surface groups.
  • each plane is decomposed in such a way that the largest possible proportion of square surfaces is created, each of which is filled by a FASS curve. It is particularly preferred in this case if the decomposition of the surfaces takes place in such a way that as continuous a extrusion as possible is possible.
  • the decomposition takes place in such a way that the plane essentially, for. B. at least 50%, preferably at least 75%, in particular at least 90% consists of FASS curves.
  • FASS curves can be generated using recursive algorithms. Corresponding methods are familiar to the person skilled in the art and, for example, in V. Batagelj: Logo to PostScript. Paper prepared for Eurologo'97, Ljubljana 1997; AJ. CoIe: A note place filling curves. Software - Practice and Experience, 13 (1983), 181-1189; AJ. CoIe: Note Peano Polygons and Gray Codes. International Journal of Computer Mathematics, 18 (1985), 3-13; C. Davis, D.E. Knuth: Number Repre- sentations and Dragon Curves, / - //. Journal of Adventureal Mathematics, 3 (1970), 66-81; 3 (1970), 133-149; M.
  • the polymer backbone comprises helical, spiral or circular elements, which may be round or angular, continuous or stepwise, single helices or multiple helices.
  • the helical, spiral or circular elements are different from the latticed elements in terms of strand thickness and / or doping.
  • the structure of the polymer skeleton is substantially three-dimensionally homogeneous, ie the strands or rods in all spatial dimensions make quantitatively and qualitatively comparable contributions.
  • the polymer backbone consists essentially of an extrudate strand in the form of a three-dimensional FASS curve and in particular a three-dimensional Peano curve.
  • “Substantially” means that the framework to at least 60%, preferably at least 80% and in particular at least 90%, based on the total length of the polymer strands that make up the skeleton as a whole, of polymer strands in the form of three-dimensional FASS curves is constructed.
  • At least 25% of the total volume of the polymer backbone accounts for through channels.
  • a "through-channel" is a cavity whose length is at least half the length of the dimension of the entire polymer framework parallel to it and which communicates with the outer surface of the framework.
  • step (ii) To isolate the polymer backbone, it is either taken from the container used in step (ii) or first the liquid medium into which it has been extruded is removed.
  • An alternative method of isolation particularly when using water or aqueous mixtures as the liquid medium in step (ii), is to freeze the medium and isolate the framework from the frozen medium by suitable methods, e.g. by mechanical removal of the frozen medium or by its sublimation.
  • the framework can subsequently be freed from residues of the liquid medium, e.g. by drying in air, in a drying oven or in a vacuum oven or by lyophilisation.
  • the solubilizate obtained in step (i) is extruded in such a way that individual straight, bent or bent polymer strands are formed.
  • the desired shape is created by the relative movement of cannula to container and / or by informing the strand after extrusion, e.g. by stretching, bending and / or buckling.
  • all common mechanical aids such as staples, tweezers, rods, etc., or also dipped into the liquid medium matrices with the desired shape, which are subsequently removed, can be used.
  • the polymer strand is isolated from the liquid medium before processing to the scaffold, optionally (after) molded and / or dried. Isolation and drying can be carried out as described above.
  • the (After) molding can be done after or preferably before drying.
  • the (post) molding may include, for example, stretching, bending and / or buckling of the polymer strand, eg with the aid of the abovementioned auxiliaries.
  • the polymer strands can be linked to the desired framework structure.
  • either only identical or different polymer fibers can be linked together.
  • these may differ, for example, in their diameter, in their nature and / or in their production process.
  • polymer fibers may be used which differ in that they have been produced by extrusion with needles of different shape and / or diameter and / or that they have been prepared from various biodegradable and biocompatible polymers and / or that they by means of different methods wherein at least one polymer strand type must have been produced by the process according to the invention.
  • Joining can be accomplished by known techniques for bonding / bonding such polymers, e.g. by means of customary biodegradable and biocompatible adhesives.
  • the linking is preferably carried out by applying a small amount of the obtained in step (i) or another solubilizate from a biocompatible and biodegradable polymer in a chaotropic liquid at the desired linking points and then adding a liquid medium, in which the polymer is not soluble. As the polymer precipitates, it simultaneously bonds the individual polymer strands together.
  • step (i) it is in principle also possible to link the polymer strands together in the liquid medium, for example by applying a small amount of the solubilizate obtained in step (i) to the desired attachment points.
  • the scaffolds prepared in the liquid medium can then be isolated as described above and, if desired, dried.
  • the first approach i. however, isolation of the polymer strands and subsequent linking to a scaffold is preferred, but is more easily feasible.
  • step (ii) especially when only small amounts of the liquid medium are used, gel-shaped products often form, which can be isolated relatively easily.
  • the conversion into the solid state takes place by drying. It can also be convenient to leave the scaffolds formed in gelled form until their use, to increase their shelf life, and to dry them just before use.
  • the scaffolds are not yet (completely) dry, they may, if desired, be formed (post), which may be done as described above.
  • variant (N-a) is preferred for step (ii).
  • this variant allows a simple and reproducible access to otherwise not trivially produced three-dimensional frameworks.
  • a method according to variant (ii-b) is also suitable for meshes which are sufficient, for example, for the construction of flat tissue such as skin.
  • the resulting scaffolds may then be treated as described further below, e.g. by coating or doping with living cell effective signal and / or growth factors or by colonization with living cells.
  • two- and three-dimensional scaffolds from biodegradable and biocompatible polymers which are generally difficult to process, such as cellulose or cellulose derivatives, are easy to prepare.
  • These frameworks which can also take on highly complex forms, can be used as shaping structures in the construction of artificial tissue.
  • Another object of the present invention is a polymer backbone obtainable by the process according to the invention.
  • the polymer skeleton With regard to the preferred embodiments of the polymer skeleton, reference is also made to the above statements.
  • a "negative scaffold” is formed by pouring the voids of the final primary scaffold with another, meltable or gellable polymer that differs in degradability in vitro from the first polymer, followed by degradation of the first polymer.
  • living cells are bound to it. These are preferably eukaryotic cells, in particular mammalian cells, eg. B. human cells.
  • the living cells are preferably prokaryotic cells, in particular the cells of socially organized bacteria, e.g. B. biofilm-forming or mycelium-growing bacteria.
  • the preparation of the finished polymer backbone on the colonization by living cells for example by washing one or more times with an aqueous medium, eg.
  • physiological saline solution As water, physiological saline solution ("Ringer solution”) or phosphate-buffered saline (“phosphate buffered saline", PBS) take place. Multiple washes are particularly appropriate if the polymer used and / or the polyelectrolyte used contain a significant proportion of low molecular weight substances.
  • the polymer backbone may be dried by live cells prior to colonization, e.g. By rapid freezing followed by freeze-drying. In this case, it is preferable if the drying parameters are selected such that the dried polymer backbone is storable. Shelf life in this context means that the polymer backbone does not show damage to the structure which can be detected by light or electron microscopy over a period of preferably at least one week, more preferably at least one month.
  • the dried scaffold is equilibrated with an aqueous medium prior to colonization by living cells, wherein the equilibration step may be a washing step or may be followed by one or more washing steps.
  • the equilibration may further comprise impregnation of the polymer backbone with substances which specifically or non-specifically bind to the surface of the polymer strands. Such impregnation can also take place without preceding drying steps.
  • Preferred molecules for soaking are those which modulate or affect the colonization and / or function of the living cells, but are not compatible with the extrusion process of the present invention, e.g. due to lack of stability to the chaotropic substances used.
  • either the desired distribution of the substance to be grown on the polymer strands is substantially homogeneous or the various polymer strands are designed so that they have a different affinity for the substance to be absorbed, so that there is a differential distribution of the substance to be absorbed results.
  • the equilibration / tendrils are suitably carried out especially when molecules bound to the surface of the polymer strands are to be activated, e.g. By cleavage of protective groups, activating proteolytic cleavage of proenzymes and / or renaturation of polypeptide chains denatured as a result of treatment with chaotropic substances, for example by treatment of the backbone with proteins or protein mixtures with chaperone activity under slightly reducing conditions. conditions, eg B. by incubation with a 10 wt .-% serum albumin and 1 mM ß-mercaptoethanol containing physiological saline buffer at + 37 ° C.
  • a mechanical preparation of the polymer backbone can be carried out, for. B. by stretching or biasing.
  • Such processes are familiar from polymer engineering; without wishing to be bound by theory, it is believed that application of low mechanical forces to a polymer strand results in an improvement in the supermolecular ordering, and thus enhancement of intermolecular interactions and increase in the mechanical stability of the strand.
  • the colonization of the prepared polymer scaffold by living cells is basically in vitro, whereby degradation of the polymer scaffold, formation of extracellular matrix, etc. may possibly continue beyond the implantation.
  • adherent or adhesive cells are used, which have been previously removed from their natural association, z. B. by treatment with proteases, preferably trypsin, and / or chelating agents such.
  • proteases preferably trypsin
  • chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the colonization is conveniently carried out by incubation of the prepared and optionally equilibrated with the cell growth medium polymer backbone with the cells in a growth medium under generally permissive conditions.
  • Typical conditions for colonization by human cells are z.
  • DMEM Dulbecco's Modification of Eagle's Medium
  • fetal calf serum and appropriate antibiotics at + 37 ° C under an atmosphere of 5% CO 2 .
  • Such media and conditions are familiar to those skilled in the art.
  • Control of colonization and tissue buildup can be done in several ways, e.g. B. in situ by light microscopy. Prior to use, further washes as well as adjustment of the medium to more body-like conditions can be made.
  • Preformed structures suitable for biochemically-physiologically active tissues must have a three-dimensional fine structure that allows them to be colonized by cells in vitro, allows these cells sufficient oxygen and nutrient supply, and later allows blood vessels to enter (vascularization) and possibly nerves from the organism , For this purpose and to build up a complex structured organ or organ part (eg of a nephron) It is further desirable to be able to "dope" individual portions of the preformed synthetic structure with suitable growth and signaling factors to thereby organize the self-assembly of cells into functional bandages.
  • a complex structured organ or organ part eg of a nephron
  • Another object of the invention relates to the use of a polymer backbone to which living cells are bound as described above for the preparation of an implant for restoring, measuring or altering biological functions in the organism to be treated.
  • the implant is selected from artificial bone tissue, artificial skin, artificial blood vessels and hollow organs.
  • the implant serves as a carrier in a "drug delivery" system or an implantable sustained release formulation.
  • Another object of the invention is an artificial tissue, which is constructed on a polymer scaffold according to the invention.
  • the polymer scaffold at the time of implantation or other use may still be substantially completely preserved, partially degraded and / or replaced by extracellular matrix or substantially completely degraded and / or replaced by extracellular matrix.
  • the implant serves as a "nerve guide" for the restoration of broken nerve fibers. It is preferred in this case if, at the time of implantation, the polymer scaffold has not yet completely degraded.
  • the tissue is selected from artificial bone tissue, artificial skin, artificial blood vessels and hollow organs. If the tissue is an artificial blood vessel or hollow organ, it is preferred if it comprises helical elements, since these have a geometry suitable for producing the inner and outer surfaces.
  • Another object of the present invention relates to the use of an artificial tissue based on a polymer scaffold according to the invention for the diagnosis ex vivo and in vitro.
  • Another object of the invention relates to the use of a polymer scaffold according to the invention, in which living cells have bound to the scaffold, in a bioreactor.
  • cells are kept under "steady state" conditions, for. B. using a countercurrent exchange.
  • the cells secrete soluble products, and particularly preferred are hybridomas or stable transfectants which form a soluble protein.
  • three-dimensional polymer scaffolds provide a more robust alternative to the hollow-fiber systems known in the art (see, e.g., BTL Evans and RA Miller, "Large-scale production of murine monoclonal antibodies using hollow fiber bioreactors” Biotechniques 1988, Sep. 6 (US Pat. 8): 762-767).
  • eukaryotic cells are used according to the invention in a bioreactor, so are hybridomas and other antibody-forming cells, eg. As quadromas, preferred. Also preferred are stable transfected cells, e.g. CHO or NIH3T3 cells, e.g. With a transgene integrated into the genome, it being particularly preferred if the cells secrete a soluble protein.
  • prokaryotic cells are used according to the invention in a bioreactor, socially organized formers of low molecular weight metabolites are preferred, in particular formers of antibiotics, eg. B. Streptomycetes, z. B. Streptomyces caelicolor.
  • Another object of the present invention relates to an apparatus for carrying out the method according to the invention, in particular for producing a polymer skeleton by extrusion.
  • the device comprises a relative to the resulting grid three-dimensionally movable extrusion onskanüle, a mechanical positioning mechanism and a computer unit suitable for controlling the positioning mechanism. It is particularly preferred if the computer unit comprises a program for the automatic generation of the structures.
  • the extrusion mechanism and / or the framework so far formed can be rotated about a fixed or variable axis.
  • Corresponding mechanical devices for relative three-dimensional positioning of the cannula are generally known to the person skilled in the art (see, for example, BTH Ang et al., "Fabrication of 3D chitosan-hydroxyapatite scaffolds using a robotic dispensing system", Materials Science and Engineering C 20 (2000). : 35-42), as well as the principles of extrusion of polymers.
  • the three-dimensional movement takes place mainly in parallel to the three axes of the resulting framework extending steps.
  • the cannula is held parallel to none of the three axes, and in particular if it forms a maximum angle to all three axes (arctan ⁇ / 2 ⁇ 55 °, corresponds to point 11 in the Cartesian coordinate system).
  • the cannula is parallel to one of the axes of the framework.
  • the framework can be moved in one dimension, the extrusion mechanism in the other two, and the cannula is kept parallel to the movement dimension of the framework ("Z-axis").
  • the cross section of the cannula is round.
  • the cannula is oval in cross-section, polygonal, serrated or irregular shaped.
  • multiple needles with the same or different diameter and cross-section similar or different geometry can be used.
  • the device according to the invention basically comprises three component groups:
  • the first component comprises those parts which come into direct contact with the solution of the polymer in a chaotropic solvent.
  • the corresponding parts are therefore expediently made of materials which are resistant to the chaotropic agents used, which, inter alia, have a corrosive effect.
  • the parts of the first component can be handled aseptically, e.g. B. by being sterilized by strained steam ("autoclavable").
  • the reservoir consists of silicate materials or corrosion-resistant metal, for. As glass, ceramic or stainless steel.
  • the cannula is made of corrosion resistant metal, e.g. B. stainless steel.
  • the line leading from the reservoir to the movable cannula usually comprises flexible as well as in a particular embodiment also rigid parts.
  • the flexible parts of the conduit are made of corrosion resistant polymeric material, e.g. As silicone. If rigid parts are used as line elements, these can basically be made out the same materials as the reservoir or made of the same materials as the flexible parts.
  • the storage container serves to receive the polymer dissolved in a chaotropic agent according to the invention.
  • it is provided with an agitator to ensure the homogeneity of the polymer solution.
  • the storage container is tempered, it being preferred if the contents of the storage container can be kept at a temperature at which the solution of polymer in chaotropic solution is liquid. Both agitator and tempering device can be independently connected to the control system of the second component or independent thereof.
  • the reservoir can basically have any suitable shape.
  • the second component comprises mechanical components and preferably software for controlling the relative movement between cannula and extrudate.
  • the mechanical components are known in principle.
  • the second component group comprises a number of stepper motors, which drive mutually orthogonally arranged precision drives, which serve to adjust the cannula.
  • the second component preferably comprises as many stepper motors / precision drives as the cannula has degrees of freedom of lateral movement.
  • the second component group further comprises a device for adjusting the angle of the cannula.
  • the second component group comprises a device for rotating the cannula.
  • the second component group comprises a device for automatically changing between different cannulas of different diameters and / or different geometry, for. B. after the turret principle.
  • the stepper motors and optional components of the second group are controlled from a computer by means of a D / A converter.
  • the valves or pumps of the first group and in particular the agitator and temperature control of the first group are controlled accordingly.
  • the computer uses commercially available hardware as well as software suitable for three-dimensional control of the cannula.
  • the software is able to automatically convert a given spatial form into an arrangement of extrudate strands according to the invention, in particular a FASS curve, arrangement of extrudate strands comprising especially peano curves and to guide the cannula accordingly.
  • the control computer also controls the pump associated with the first group of components which regulates the flow of dissolved polymer to the cannula, in accordance with the movement of the cannula.
  • stepper motors fine-drive systems, D / A converters and suitable computer hardware components are generally familiar to the person skilled in the art.
  • the third group of components comprises the container for the liquid medium in which the extrusion of the dissolved polymer material takes place.
  • the water basin is made of glass or ceramic.
  • the water basin is also mounted on a system of stepping motors and fine drives, which can supplement the missing degrees of freedom of the cannula in lateral displacement and / or rotation.
  • the stepper motors and precision drives of the third group of components are controlled by the same hardware and software as the second, so that a uniform control of all movements within the system for precise shaping is possible.
  • the parts of the third component can be handled aseptically, for. B. by being sterilized by strained steam ("autoclavable").
  • the figure shows a cellulose net generated according to the example from two viewing directions.
  • the pictured 1 cent coin illustrates the size of the net. example
  • Cellulose was added to i-ethyl-3-methylimidazolium acetate and dissolved by stirring at 90 ° C for 2 hours.
  • the cellulose content of the solution was 1% by weight of cellulose, based on the total weight of the solution.
  • This solution was injected by means of a surgical needle into a water bath at a rate of 70 ml / hr and with stretching of the resulting polymer fiber.
  • a gel was obtained which shrank on drying and formed free fibers.
  • the dry fibers had a diameter of 70 ⁇ m on average.

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Abstract

Die Erfindung betrifft zur Herstellung künstlicher Gewebe geeignete Polymergerüste, insbesondere Polysaccharidgerüste, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Herstellung künstlicher Gewebe sowie auf der Basis solcher Polymergerüste hergestellte künstliche Gewebe.

Description

Beschreibung
Polymergerüste zur Herstellung künstlicher Gewebe
Die Erfindung betrifft zur Herstellung künstlicher Gewebe geeignete Polymergerüste, insbesondere Polysaccharidgerüste, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Herstellung künstlicher Gewebe sowie auf der Basis solcher Polymergerüste hergestellte künstliche Gewebe.
Während manche niedere Wirbeltiere (z. B. Molche) ausgedehnte Körper- und Organschäden reparieren können, ist bei den meisten Säugetieren einschließlich des Menschen die Fähigkeit zur Regeneration gering. In den meisten Geweben und Organen des Menschen und anderer Säuger werden Läsionen unterschiedlicher Genese (z. B. durch Verletzung, durch Pathogene oder durch Autoimmunreaktionen) nach Beseiti- gung der Noxe nicht durch die Neubildung funktionalen Gewebes ausgeheilt, sondern lediglich durch Ausfüllen mit einem besonderen Bindegewebe geflickt (Vernarbung), wodurch die weitere Funktionalität des jeweiligen Organs in Mitleidenschaft gezogen werden kann. Auch in denjenigen Geweben, welche eine vergleichsweise gute Regenerationsfähigkeit zeigen (vor allem Haut, Bindegewebe und ihre Derivate, z. B. Kno- chen) ist die Wiederherstellung der ursprünglichen Funktion langwierig und für den Patienten unangenehm, insbesondere bei ausgedehnten Läsionen (z. B. bei großflächigen Verbrennungen). Die Medizin konzentriert sich daher auf erhaltende oder minimal schädigende Behandlungsweisen, in welchem Zusammenhang die minimal invasive Chirurgie (Laparoskopie) zu nennen ist. Doch auch bei maximaler Optimierung der medizinischen und chirurgischen Behandlungsmethoden lassen sich weder iatrogene noch durch die oben genannten Faktoren verursachte Gewebeschäden größeren Maßstabs gänzlich ausschließen. Es wird daher nach Möglichkeiten gesucht, die Funktion zerstörter oder entfernter Organe wiederherzustellen.
Gebräuchliche Ansätze sind hierzu Transplantation und mechanische Prothetik, wobei letztere gegenwärtig auf biochemisch und elektrophysiologisch weitgehend inerte Körperteile (z. B. Gelenke, Augenlinsen, Herzklappen) beschränkt ist. Bei Geweben bzw. Organen mit biochemischer Aktivität (z. B. Herz, Lunge, Leber, Niere) ist zur Zeit die Transplantation die einzige mögliche wiederherstellende Behandlung. Auch wenn sie in vielen Fällen zu einem vollständigen funktionalen Ersatz führt, sind die bekannten
Nachteile doch gravierend; in erster Linie sind hier der Mangel an Spenderorganen, die Notwendigkeit der lebenslangen Immunsuppression zur Vermeidung von Abstoßungsreaktionen und die Gefahr der Übertragung von Pathogenen, insbesondere Viren, zu nennen. Der Gedanke, funktionale Gewebe und eventuell sogar ganze Organe wieder- herstellen zu können, ist daher von hohem medizinischen Interesse. Ein derzeit viel beachteter Ansatz ist, pluripotente Stammzellen, die sich zu verschiedenen Geweben differenzieren können, zu regenerativen Zwecken einzusetzen. Ursprünglich ging man davon aus, dass sich Stammzellen von selbst in Läsionen (z. B. infarziertes Herzmuskelgewebe) einfügen und von sich aus funktionales Gewebe aufbauen bzw. regenerieren, wie sie dies während der natürlichen Ontogenese ja auch tun. Es zeichnet sich jedoch bereits ab, dass dies weniger trivial als angenommen ist und großflächige Läsionen sich auf diese Weise nicht ohne Weiteres behandeln lassen. Insbesondere ist eine Wiederherstellung von komplex strukturiertem Gewebe bis hin zu ganzen Organen auf diese Weise offenbar nicht möglich.
Wie inzwischen bekannt ist, ist für das Wachstum von Gewebe bzw. Organen das Vorliegen organisatorischer Signale ein wesentlicher Faktor. Während der natürlichen Ontogenese werden diese durch ein komplexes und erst teilweise verstandenes Netzwerk diffundibler Faktoren und Zell-Zell-Interaktionen vermittelt (sogenannte Spemann'sche Induktoren). Bei Regenerationsprozessen im fertigen Organismus spielt hierbei die Einordnung der Zellen in präformierte Strukturen, insbesondere in das Grundgerüst der "extrazellulären Matrix" eine wesentliche Rolle. Als "extrazelluläre Matrix" wird die Gesamtheit aller von den Zellen abgeschiedenen, jedoch immer noch mit diesen in Kon- takt stehenden Strukturen bezeichnet. Sowohl als Anheftungspunkt für die Zellen des Gewebes als auch auf Grund ihrer eigenen intrinsischen Eigenschaften, wie z.B. Durchlässigkeit und mechanischer Stabilität, ist die extrazelluläre Matrix für die Stabilität und Funktionalität vieler Gewebe wichtig, ferner ist sie durch ihre Spezifität für bestimmte Zelltypen für Aufrechterhaltung der Gewebsorganisation (Morphostase) und Homöostase von Bedeutung. Als Gewebsorganisation wird hierbei die korrekte räumliche Anordnung der Zellen bezeichnet, als Homöostase deren Beibehaltung über die Zeit hinweg, auch bei sich ändernden Belastungen.
Die Entnahme, Vermehrung und Stimulation lebender Zellen verschiedener Gewebsty- pen aus einem lebenden Organismus einschließlich dem eines Patienten sind dem Fachmann allgemein geläufig. Ein wesentliches Problem besteht jedoch nach wie vor bei der Bereitstellung synthetischer präformierter Strukturen (Matrizen), in welche sich Zellen auf eine solche Weise einfügen bzw. an welche sich Zellen auf ein solche Weise anlagern können, dass zur Reimplantation geeignete, funktionsfähige Gewebe, im Ide- alfall ganze Organe, gebildet werden können.
Eine Besiedlung präformierter synthetischer Strukturen mit lebenden Zellen kann grundsätzlich in vitro erfolgen, jedoch sind auch postimplantive Prozesse möglich, z. B. Verwachsen eines künstlichen Knochengewebes mit dem natürlichen Knochen. Neben der Anwendung in der regenerativen Medizin ist die Verwendung künstlicher Gewebe oder Organe als Modell in der medizinisch-pharmazeutischen Forschung, namentlich auf dem Gebiet des "Drug Targeting", eine attraktive Alternative zu den bislang regelmäßig verwendeten Tierorganen, da nicht nur unmittelbar mit menschli- chen Geweben gearbeitet werden kann, sondern auch die Möglichkeit einer besseren Standardisierung und damit Reproduzierbarkeit besteht.
Die Herstellung von Geweben und Organen in vitro wird häufig als "tissue engineering" bezeichnet (siehe z. B. P. L. Pabst, "Tissue engineering: a historical review as seen through the US Patent Office", Expert Opin. Ther. Patents 13 (2003): 347-352; L. G. Griffith und G. Vaughton, "Tissue Engineering - Current Challenges and Expanding Opportunities", Science 295 (2002): 1009-1012; E. Pennisi, "Tending Tender Ten- dons", Science 295 (2002): 1011 ).
Erste Versuche betreffend die Herstellung künstlicher Gewebe wurden mit Knorpel gemacht, einem an extrazellulärer Matrix reichen, metabolisch und biochemisch wenig aktiven und daher schlecht regenerierenden Gewebe. In US 5,041 ,138 und US 5,736,372 wird beschrieben, dass die räumliche Form künstlicher Gewebestücke auch nach dem Abbau der synthetisch präformierten Struktur erhalten bleibt und sol- che künstlichen Gewebestücke gegebenenfalls sogar im richtigen Maß mitwachsen können, was z.B. in der pädiatrischen Anwendung wichtig ist. Man kann hierbei daher schon von einer vollständigen Restitution sprechen und nicht nur von einer Prothese. Allerdings betreffen US 5,041 ,138 und US 5,736,372 ausschließlich die Herstellung von knorpeligen Strukturen (z. B. Ohren, Nase, Ösophagus), die zwar makroskopisch komplex geformt sind, jedoch nur wenig differenzierte Feinstruktur und geringe metabolische Aktivität aufweisen.
Als Material für solche synthetische präformierte Strukturen sind verschiedene Klassen organischer Polymere geeignet. Ein wesentlicher Aspekt ist hierbei, dass die Substanz keine Entzündungs- oder Abstoßungsreaktion induzieren darf, was viele der versatilen proteinartigen Materialien von vornherein ausschließt. Darüber hinaus sollte die Substanz biologisch abbaubar sein, idealerweise mit einer Rate, die der des Ersatzes durch biogene Strukturen im jeweiligen Organ entspricht. Dadurch sollte ein unmerklicher Ersatz der synthetischen Matrix durch natürliche Gewebe/Strukturen unter Beibe- haltung der Form ohne kritische Phasen verringerter mechanischer Stabilität möglich sein. Vorzugsweise sollte der Abbau nicht quellend/sprengend, sondern erodierend verlaufen, so dass die mechanische Stabilität der synthetischen Struktur möglichst lange erhalten bleibt. Bei diesem Abbau sollten ferner keine toxischen Mono- oder Oligo- mere gebildet werden. Dies stellt bestimmte Anforderungen sowohl an die dreidimensionale Struktur der präformierten synthetischen Matrix als auch an das Material, aus dem sie aufgebaut ist.
Einen allgemeinen Überblick über polymere Biomaterialien gibt z. B. L. G. Griffith, "Po- lymeric Biomaterials", Acta mater. 48 (2000), 263-277. Genannt werden sowohl natürliche Materialien, wie Kollagen und Fibrin, als auch synthetische Polymere, wie Polygly- colide und Polylactid. Zur Formgebung wird z.B. ein Polyglycolid in eine Polylactidlö- sung in CHCI3 getunkt und das benetzte Material wird in einer Form geformt. Diese Art der Erzeugung dreidimensionaler Gerüste ist jedoch nicht sehr präzise und auch nicht auf die Herstellung beliebig kleiner oder komplex geformter Gerüste anwendbar. Außerdem ist das Verfahren auf Materialien, die einen relativ niedrigen Erweichungspunkt oder Schmelzpunkt haben, beschränkt.
Die US 5,328,603 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Cellulosekügelchen im Submillimeterbereich ("beads"), die in chromatographischen Verfahren eingesetzt werden sollen. Dabei wird zuerst Cellulose durch chaotropische Salze solubilisiert und anschließend wird die zerstäubte Lösung in ein Cellulose nicht lösendes Medium gegeben.
Die WO 03/029329 beschreibt die Herstellung eines Cellulosestranges durch Solubili- sierung von Cellulose in einer ionischen Flüssigkeit und anschließende Extrusion der Lösung in ein wässriges Medium. Die Herstellung zwei- oder dreidimensionaler CeIIu- losestrukturen wird nicht beschrieben.
Die zuerst zur dreidimensionalen Formgebung von Biopolymeren eingesetzten sto- chastischen Verfahren, die letztlich alle über eine Schaumbildung des Polymers wirken, führen zu ungenügenden Ergebnissen, da aus physikalischen Gründen eine Blasenstruktur mit zahlreichen unverbundenen, durch Polymermaterial voneinander getrennten Hohlräumen anstelle der anzustrebenden im Wesentlichen durchgängigen, vorzugsweise verzweigten Kanalstruktur erreicht wird. Auf Gießformen basierende Ansätze führen hingegen aus praktischen Gründen zu einer ausschließlichen Kanalstruktur, die Zellen nur in begrenztem Maße Anhaftungs- und Anlagerungsmöglichkeiten bietet. Überdies ist ihre Übertragung auf nicht schmelzbare Werkstoffe wie die meisten Polysaccharide schwierig. Die Verwendung nativer biogener Polymere kann zur Aus- bildung schwammartiger Strukturen führen, in denen Kanal- und Hohlraumformen existieren, die jedoch meist von begrenzter mechanischer Stabilität sind. In allen drei genannten Fällen besteht keine Möglichkeit einer differenzierten strukturellen Gestaltung oder einer Dotierung mit Wachstums- oder Signalfaktoren. Dies gilt insbesondere auch für bakterielle Cellulose (A. Svensson et al., Biomaterials 26 (2005), 419-431 ), die sich daher trotz ihrer ansonsten günstigen Eigenschaften nur für räumlich und grundstrukturell einfache Gewebestücke, z. B. künstliche Gelenkknorpel, eignet.
Ein entsprechendes Maß an Kontrolle über den Formgebungsprozess ermöglicht im Feinmechanikbereich die Miniaturisierung von Verfahren aus dem Bereich CAD/CAM ("Computer aided design" / "Computer aided manufacturing"), heute oft als "Desktop Manufacturing" oder "Rapid Prototyping" bezeichnet. Bei diesen Verfahren wird im Computer ein dreidimensionales Modell des zu fertigenden Objektes erstellt, das dann ohne weitere Zwischenstufen durch ein von dem Computer gesteuertes automatisier- tes Werkzeug hergestellt wird. Typischerweise implementiert der Computer hierbei einen Algorithmus, der das dreidimensionale Modell selbsttätig in eine Anzahl von zur Ausführung geeigneten finiten Elementen zerlegt und diese nacheinander abarbeitet.
Als aufbauende Verfahren werden hierbei solche bezeichnet, bei denen nicht Leerräu- me aus einem ursprünglich kohärenten Materialblock herausgeschnitten werden, sondern das Material während des Formgebungsprozesses schrittweise aufgetragen wird. Hierbei können die vorgesehenen Hohlräume entweder leer bleiben, d. h. mit dem Arbeitsmedium (Luft oder ein Flüssigmedium, in dem das Material nicht löslich ist) gefüllt werden, oder mit einer Platzhaltersubstanz gefüllt werden, die nach Abschluss des Formgebungsverfahrens zum Beispiel durch Lösungsmittel oder Erwärmung entfernt werden kann. Es sind verschiedene Variationen aufbauender Verfahren unter Einbeziehung chemischer und/oder photochemischer Reaktionen möglich.
Die Ausführungen der aufbauenden Verfahren lassen sich grundsätzlich in die beiden Kategorien "Printing" (diskontinuierlich) und "Plotting" (kontinuierlich) einordnen. Beim Printing wird, bevorzugt aus einer Phalanx von Düsen, das Material rasterweise aufgetragen, während beim Plotting ein im Wesentlichen ununterbrochener Materialstrang extrudiert wird. Das Plotting erfordert einen größeren Aufwand an Zeit, Auftragungstechnik und Steuerungsalgorithmen, führt aber zu gleichmäßigeren und vorhersagbare- ren Ergebnissen. Sowohl Plotting als auch Printing und ihre Anwendung im Bereich des „tissue enginering" sind im Stand der Technik beschrieben (z. B. V. L. Tsang und S. N. Bhatia, "Three-dimensional tissue fabrication", Advanced Drug Delivery Reviews 56 (2004): 1635-1647; A. Pfister u.a., "Biofunctional Rapid Prototyping for Tissue- Engineering Applications; 3D Bioplotting versus 3D Printing", Journal of Polymer Sci- ence [Part A: Polymer Chemistry], Bd. 42 (2004), 624-638); E. Sachlos und J. T. Czer- nuszka, "Making Tissue Engineering Scaffolds Work", Europ. CeIIs and Materials 5 (2003): 29-40; D. W. Hutmacher, "Scaffold design and fabrication technologies for en- gineering tissues", J. Biomater. Sei. Polymer Edn. 12 (2001 ): 107-124). Allerdings werden in den genannten Dokumenten nur solche Polymere eingesetzt, die einen niedri- gen Erweichungs- oder Schmelzpunkt haben und damit überhaupt extrudierbar sind. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren bereit zu stellen, das es ermöglicht, zwei- und/oder insbesondere dreidimensionale Strukturen, die als Gerüst bei der Bildung reimplantierbarer oder in der Forschung als Modelle geeigneter Gewebe, beispielsweise als Gerüst auf dem Gebiet des „tissue engineering", verwendet werden können, präzise zu erzeugen. Das Verfahren sollte insbesondere auch den Einsatz von Gerüstmaterialien erlauben, die zwar vom biologisch-medizinischen Standpunkt her vorteilhaft sind, aber auf Grund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie Schmelzpunkt, Verformbarkeit oder Löslichkeit, mit herkömmlichen Ver- fahren zur Gerüstbildung nicht trivial zu bearbeiten sind.
Die Aufgabe wurde gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von zwei- oder dreidimensionalen Gerüsten aus bioabbaubaren und biokompatiblen Polymeren, das die folgenden Schritte umfasst:
(i) Solubilisierung eines bioabbaubaren und biokompatiblen Polymers in einer cha- otropischen Flüssigkeit; und
(ii-a) im Wesentlichen kontinuierliche Extrusion der im ersten Schritt erhaltenen Lösung in ein flüssiges Medium, das mit der chaotropischen Flüssigkeit mischbar ist, in welchem das Polymer jedoch im Wesentlichen unlöslich ist, mittels einer
Kanüle, wobei sich die Kanüle und das entstehende Gerüst während des Extru- sionsvorgangs relativ zueinander in zwei oder vorzugsweise drei Dimensionen bewegen; oder
(ii-b) Extrusion der im ersten Schritt erhaltenen Lösung in ein flüssiges Medium, das mit der chaotropischen Flüssigkeit mischbar ist, in welchem das Polymer jedoch im Wesentlichen unlöslich ist, mittels einer Kanüle unter Ausbildung einzelner gerader, gebogener oder geknickter Polymerstränge, wobei sich die Kanüle und der entstehende Polymerstrang während des Extrusionsvorgangs relativ zueinander bewegen, gegebenenfalls Isolieren der Polymerstränge aus dem flüssigen Medi- um und Verknüpfen der Polymerstränge unter Ausbildung eines zwei- oder dreidimensionalen Gerüsts.
Als Material ist grundsätzlich jedes bioabbaubare und biokompatible Polymer geeignet.
Als "bioabbaubar" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Polymer bezeichnet, das unter den im Organismus herrschenden Bedingungen chemisch oder enzyma- tisch zu in Körperflüssigkeiten löslichen Mono- oder Oligomeren innerhalb eines geeigneten Zeitraums, z.B. innerhalb eines Jahrs, vorzugsweise im Laufe von Wochen oder Monaten, abgebaut werden kann. Als "biokompatibel" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Polymer bezeichnet, wenn weder das Polymer noch seine mono- oder oligomeren Abbauprodukte eine schädliche, z. B. toxische und/oder entzündungsfördernde Wirkung auf den Organismus ausüben, und insbesondere, wenn die Abbauprodukte entweder als solche oder nach im Organismus üblicher Umwandlung (Spaltung, Kopplung usw.) ausgeschieden und/oder im Stoffwechsel verwertet werden können, ohne dass eine toxische, immunologische (z. B. entzündungsfördernde), mutagene, carcinogene, cocarcinogene oder morphogene (z. B. teratogene) Wirkung eintritt.
Einen Überblick über geeignete Polymere gibt z. B. Toshio Hayashi, "Biodegradable Polymers for Biomedical Ilses", Prog. Polym. Sei., Vol. 19, 663-702, (1994).
Unter dem Begriff "Gerüst" versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Raumstruktur, die wenigstens zwei gerade, gebogene und/oder geknickte Stäbe oder Stränge umfasst, wobei in der Regel mindestens eine Strang- bzw. Stabüberschneidung oder -berührung vorliegt. Überschneiden bedeutet hierbei, dass der Winkel zwischen den Strängen ungleich 0 ist, während Berühren auch den Winkel 0 umfasst (z.B. bei zueinander parallel liegenden Strängen). In das Gerüst können auch nicht- stabförmige, z. B. flächige, spiralförmige oder kreisförmige, Elemente mit einbezogen sein.
Unter "Stab" oder "Strang" versteht man ein im gestreckten Zustand („gerader Stab/Strang") im Wesentlichen lineares Gebilde, d. h. eine Raumform, deren Ausdehnung in einer Dimension vorliegt. Ein "Strang" ist ein Stab, der durch Extrusion erhält- lieh ist. Geknickte oder gebogene Stäbe/Stränge haben als Gesamtgebilde betrachtet eine Ausdehnung in zwei Dimensionen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfüllt eine Struktur eine bestimmte Dimension, wenn ihre Ausdehnung in dieser Dimension mehr als einen, vorzugsweise mehr als zwei Strang- bzw. Stabdurchmesser beträgt. Somit sind "beads" nach US 5,328,603 nulldimensional und gestreckte Einzelstränge eindimensional. Ein "dreidimensionales Gerüst" ist ein Gerüst, das drei Dimensionen erfüllt. Ein "zweidimensionales Gerüst" besitzt eine Ausdehnung in zwei Dimensionen. Einzelne gebogene oder geknickte Stränge sind zwar gemäß obiger Definition auch zweidimensional, jedoch soll im Rah- men der vorliegenden Erfindung unter einem zweidimensionalen Gerüst ein solches verstanden werden, welches wenigstens zwei Stäbe/Stränge umfasst, die sich in wenigstens einem Punkt überschneiden oder berühren und deren gemeinsame Ausdehnung auf zwei Dimensionen beschränkt ist. Zu den mehrdimensionalen Strukturen zählen neben den erfindungsgemäßen Gerüsten auch Formen ohne Strangüberschnei- düng, wie z. B. Schleifen oder Spiralen. Diese entsprechen zwar nicht dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriff „Gerüst", sie können jedoch Bestandteil erfindungsgemäßer Gerüste sein.
Der Begriff "Solubilisierung" bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine ohne erhebliche Erwärmung erreichbare Überführung des Gerüstmaterials (Polymers) in einen fließ-, gieß- oder extrudierbaren Zustand. Dabei wird das Polymer in einen solvatisierten Zustand überführt, bei dem jedoch die einzelnen Polymermoleküle nicht vollständig von einer Solvathülle umgeben sein müssen. Wesentlich ist, dass das Polymer durch die Solubilisierung in einen Flüssigzustand oder zumindest einen Erwei- chungszustand übergeht. Unter dem Begriff „ohne erhebliche Erwärmung" versteht man, dass man zur Solubilisierung Temperaturen von höchstens 200 °C, bevorzugt höchstens 150 °C, besonders bevorzugt höchstens 120 °C und insbesondere höchstens 100 °C einsetzt.
Als "chaotropisch" werden Substanzen bezeichnet, die imstande sind, supermolekulare Assoziate von Makromolekülen durch Störung oder Beeinflussung der intermolekularen Wechselwirkungen aufzulösen, ohne hierbei die intramolekularen kovalenten Bindungen zu beeinflussen.
Der Begriff „Extrusion" ist im Rahmen der vorliegenden Anmeldung nicht auf eine bestimmte Fertigungstechnik beschränkt, sonder bezeichnet ganz allgemein das im Wesentlichen kontinuierliche Herauspressen eines fließfähigen Stoffes durch eine relativ schmale Öffnung (d.h. eine Düse im weitesten Sinn), z.B. durch eine Kanüle. „Im Wesentlichen kontinuierlich" bedeutet dabei, dass der Extrusionsvorgang auch immer wie- der unterbrochen werden kann, z.B. zur Erzeugung einzelner Polymerstränge (beispielsweise gemäß Schritt (ii-b)) oder zum Übergang in eine andere Raumebene in Schritt (ii-a) Er erfolgt jedoch nicht mit solchen periodischen Unterbrechungen, dass nur nulldimensionale Gebilde, wie beispielsweise Kugeln, entstehen.
Ein "im Wesentlichen kontinuierlicher" Polymerstab ist eine im gestreckten Zustand eindimensionale Polymerstruktur, d. h. eine Struktur, die nicht durch Aneinanderfügen und/oder Verschmelzen von nulldimensionalen Strukturen in einer bestimmten Anordnung entstanden ist. Es ist hierbei bevorzugt, wenn der Stab im Wesentlichen von gleichförmiger Dicke ist, insbesondere, wenn er keine rhythmische Abfolge dickerer und dünnerer Abschnitte zeigt, und wenn die molekulare Struktur in Dimensionsrichtung im Wesentlichen gleichförmig ist, insbesondere, wenn die Molekülstruktur in Dimensionsrichtung keine rhythmischen Veränderungen zeigt. Weiterhin ist es bevorzugt, wenn im Stab die Polymerketten im Wesentlichen parallel zueinander und zur Längsrichtung des Stabes liegen, und insbesondere, wenn parallel liegende Polymerketten sich in der Längendimension überschneiden, so dass Kontaktflächen zwischen den Molekülen entstehen. Besonders bevorzugt ist hierbei, wenn das Ausmaß der Überschneidung über die gesamte Länge des Stabes im Wesentlichen gleichförmig ist. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens führt die Überschneidung der Polymerketten zur Bildung teilweise kristalliner Bereiche. In einer weiteren Ausführungs- form ist nachträglich Stabilisierung durch kovalente Quervernetzung im Überschneidungsbereich möglich. Der Ausdruck „im Wesentlichen" bedeutet, dass übliche Abweichungen, die beispielsweise durch den Extrusionsschritt bedingt sind, toleriert werden.
Der Begriff "Kanüle" bezeichnet jede Art von Düse, durch die eine im ersten Schritt erzeugte Lösung kontinuierlich gepresst werden kann.
Die „relative Bewegung von Kanüle und Gerüst bzw. Polymerstrang zueinander" bedeutet, dass sich während des Extrusionsschrittes (ii) sowohl die Kanüle allein als auch das Gerüst bzw. der Polymerstrang oder der Behälter, der das flüssige Medium enthält, in welches das Polymer extrudiert wird, als auch beide bewegen können. Die Bewegung erfolgt über den gesamten Schritt (ii-a) betrachtet in zwei Raumrichtungen (zweidimensionale Bewegung) oder vorzugsweise in alle drei Raumrichtungen (dreidimensionale Bewegung) bzw. über den gesamten Schritt (ii-b) betrachtet in eine oder zwei Raumrichtungen. Bei Bewegung in einer Raumrichtung erhält man gerade Polymer- stränge, während eine zweidimensionale Relativbewegung zu gebogenen oder geknickten Strängen führt. Möglich ist in Schritt (ii-b) auch eine dreidimensionale Relativbewegung von Kanüle und Polymerstrang, z.B. unter Ausbildung von spiral- oder kreisförmigen Elementen, die auch Teil des Gerüsts sein können, jedoch vorzugsweise in einem nur untergeordneten Ausmaß eingebaut werden.
"Dreidimensionale Bewegung" bzw. "Bewegung in drei Raumrichtungen" bedeutet, dass die Position der Kanülenöffnung relativ zum bislang gebildeten Gerüst in allen drei Raumdimensionen variiert werden kann. In einer besonderen Ausführungsform von Schritt (ii-a) ist der Extrusionsmechanismus in allen drei Raumdimensionen ver- schiebbar. In einer alternativen Ausführungsform von Schritt (ii-a) ist der Extrusionsmechanismus in mindestens zwei Raumdimensionen verschiebbar, und das bislang gebildete Gerüst ist in mindestens einer Raumdimension verschiebbar, so dass durch Verschiebung des bislang gebildeten Gerüsts die fehlenden Raumdimensionen (Freiheitsgrade) des Extrusionsmechanismus ergänzt werden. In einer weiteren alternativen Ausführungsform von Schritt (ii-a) ist der Extrusionsmechanismus in mindestens einer Dimension verschiebbar und das bislang gebildete Gerüst in mindestens zwei Dimensionen, so dass die fehlenden Freiheitsgrade des Extrusionsmechanismus durch die Verschiebbarkeit des bislang gebildeten Gerüsts ergänzt werden. In einer weiteren alternativen Ausführungsform von Schritt (ii-a) ist der Extrusionsmechanismus im We- sentlichen unbeweglich, während das bislang gebildete Gerüst in allen drei Raumdimensionen verschiebbar ist.
Analoges gilt für die „ein- oder zweidimensionale Bewegung" in Schritt (ii-a) oder (ii-b), d.h. entweder der Extrusionsmechanismus oder der entstehende Polymerstrang (bzw. genauer gesagt das Behältnis, in das dieser extrudiert wird) ist beweglich. Bei der zweidimensionaler Relativbewegung ist es auch möglich, dass sich der Extrusionsmechanismus in einer Raumrichtung bewegt und der Polymerstrang in einer davon verschiedenen Raumrichtung.
"Im Wesentlichen unlöslich" bedeutet, dass das Polymer im flüssigen Medium eine Löslichkeit von weniger als 5 g/l, bevorzugt weniger als 0,5 g/l und besonders bevorzugt weniger als 0,05 g/l aufweist.
Ein "flüssiges Medium" bezeichnet ein Milieu, dessen physikochemische Eigenschaften hauptsächlich von denen eines flüssigen Lösungsmittels bestimmt werden. Das Flüssigmedium kann in Folge der Anwesenheit von löslichen oder quellbaren Makromolekülen auch eine gelartige Konsistenz besitzen.
„Alkyl" steht für einen linearen oder verzweigten Alkylrest. Vorzugsweise steht Alkyl für CrC6-Alkyl. CrC6-Alkyl steht für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele hierfür sind Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec- Butyl, Isobutyl, tert-Butyl, n-Pentyl, n-Hexyl und Konstitutionsisomere davon. CrC4- Alkyl steht für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele hierfür sind Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, Isobutyl und tert-Butyl.
C-ι-C6-Alkoxy steht für einen über ein Sauerstoffatom gebundenen d-C6-Alkylrest. Beispiele hierfür sind Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy, sec-Butoxy, Isobu- toxy, tert-Butoxy, Pentoxy, Hexoxy und Konstitutionsisomere davon. CrC4-Alkoxy steht für einen über ein Sauerstoffatom gebundenen d-C4-Alkylrest. Beispiele hierfür sind Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy, sec-Butoxy, Isobutoxy und tert- Butoxy.
Ci-C6-Alkoxy-Ci-C6-alkyl steht für einen d-C6-Alkylrest, bei dem ein oder mehrere
Wasserstoffatome durch einen d-C6-Alkoxyrest substituiert sind. Beispiele hierfür sind Methoxymethyl, Ethoxymethyl, Propoxymethyl, 1- und 2-Methoxyethyl, 1- und 2- Ethoxyethyl, 1- und 2-Propoxyethyl und dergleichen. Ci-C4-Alkoxy-d-C4-alkyl steht für einen d-C4-Alkylrest, bei dem ein oder mehrere Wasserstoffatome durch einen CrC4- Alkoxyrest substituiert sind. Beispiele hierfür sind die oben genannten Reste. Aryl steht für einen carboaromatischen Rest mit vorzugsweise 6 bis 14 Kohlenstoffatomen. Beispiele hierfür sind gegebenenfalls substituiertes Phenyl, gegebenenfalls substituiertes Naphthyl, gegebenenfalls substituiertes Anthracenyl und gegebenenfalls substituiertes Phenanthrenyl. Geeignete Substituenten sind z.B. Halogen, Ci-Cβ-Alkyl, NO2, OH und CN. Bevorzugt steht Aryl für Phenyl oder substituiertes Phenyl, wie ToIyI, XyIyI, Nitrophenyl oder Chlorphenyl.
Aryl-CrC6-alkyl steht für einen über d-C6-Alkyl, vorzugsweise CrC2-Alkyl gebundenen Arylrest, wie Benzyl oder 2-Phenylethyl.
Aryloxy steht für einen über Sauerstoff gebundenen Arylrest, wie Phenoxy.
Aryl-CrC6-alkoxy steht für einen CrC6-Alkoxyrest, vorzugsweise CrC2-Alkoxyrest, bei dem ein Wasserstoffatom durch eine Arylgruppe substituiert ist, z.B. für Benzoxy.
Aryloxy-CrC6-alkyl steht für einen CrC6-Alkylrest, vorzugsweise d-C2-Alkylrest, bei dem ein Wasserstoffatom durch eine Aryloxygruppe substituiert ist.
Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom oder lod, insbesondere für Fluor oder Chlor.
Säureanionen von CrCβ-Monocarbonsäuren sind die Säureanionen von aliphatischen C-i-Ce-Monocarbonsäuren. Beispiele hierfür sind, Acetat, Propionat, Butyrat, Isobutyrat, Pentanoat, Hexanoat und dergleichen.
Mono- und Dianionen von C2-C6-Dicarbonsäuren sind die einfachen Anionen oder die Dianionen von aliphatischen C2-C6-Dicarbonsäuren, z.B. die Mono- oder Dianionen von Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure und dergleichen.
Die nachfolgend gemachten Ausführungen zu den bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindungsgegenstände gelten sowohl für sich allein genommen als auch in Kombination miteinander.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das po- lymere Gerüstmaterial ein organisches Polymer. Unter einem organischen Polymer wird hierbei ein Polymer verstanden, dessen Monomere im Wesentlichen organische Moleküle sind, z. B. Alkohole, insbesondere Di- und Polyalkohole, Carbonsäuren, insbesondere Hydroxydicarbonsäuren und Aminosäuren, Amine, insbesondere Di- und Polyamine sowie Aminosäuren, und Saccharide, insbesondere Glucose- und Fructo- seeinheiten. „Im Wesentlichen organische Moleküle" bedeutet, dass diese auch anor- ganische Komponenten, z.B. Metallkationen oder Halogenidionen, enthalten können, die Natur des Moleküls aber insgesamt organisch ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer ein Biopolymer. Un- ter einem Biopolymer wird hierbei ein Polymer verstanden, dessen Monomere in der Natur vorkommen, z. B. Saccharide und Aminosäuren, und insbesondere ein Polymer, dessen Gesamtstruktur in der Natur vorkommt. Beispiele für Biopolymere sind Proteine, z. B. Seidenprotein, und Polysaccharide, z. B. Cellulose, Cellulosederivate, Chitin, Chitosan, Dextran, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Xylan und Stärke.
Stärker bevorzugt ist das Polymer ausgewählt unter Polysacchariden und modifizierten Polysacchariden und insbesondere unter Polysacchariden. Diese erfüllen nicht nur in chemischer und mechanischer Hinsicht die Anforderungen, die auf dem Gebiet des „tissue engineering" an geeignete Materialien gestellt werden; sie sind zudem im Ge- gensatz zu vielen Proteinen immunologisch unbedenklich. Geeignete Polysaccharide sind z.B. Cellulose, Cellulosederivate, Chitin, Chitosan, Dextran, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Xylan und Stärke.
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform setzt man in das erfindungsgemä- ße Verfahren Cellulose oder ein Cellulosederivat ein. Geeignete Cellulosederivate sind z. B. Methylcellulose, Ethylcellulose, Propylcellulose, Hydroxyethylcellulose und
Hydroxypropylcellulose. Insbesondere verwendet man Cellulose. Als Cellulose kann jede bekannte Form von Cellulose eingesetzt werden, z. B. aus Zellstoff, Baumwolle, aus Papier gewonnene Cellulose oder bakterielle Cellulose.
Geeigneterweise wird das Polymer vor der Solubilisierung mechanisch zerkleinert, z. B. durch Mahlen und/oder Schreddern.
Das Polymer kann in Schritt (i) als solches oder gemeinsam mit weiteren Komponenten eingesetzt werden. Bevorzugte zusätzliche Komponenten sind solche, die den Gerüstaufbau und/oder den anschließenden Einsatz des Gerüsts vorteilhaft beeinflussen. Beispiele für geeignete Komponenten sind anorganische Partikel, z. B. Hydroxylapatit- partikel, und nicht-strukturelle, d. h. vom Gerüstpolymer verschiedene, Biopolymere, z. B. Proteine, Proteinfragmente, Peptide oder bestimmte Kohlenhydrate. In einer be- vorzugten Ausführungsform werden nicht-strukturelle Biopolymere als zusätzliche
Komponenten verwendet, die die Anheftung von Zellen und/oder die Ausbildung organisierter superzellulärer Strukturen begünstigen. Beispiele für geeignete nicht-strukturelle Biopolymere sind Matrixproteine, z. B. Fibronectin, Vitronectin, Collagen, Lami- nin, Lectine, Gewebsextrakte, Wachstumsfaktoren, z. B. VEGF, oder Fusionsproteine oder andere Derivate der genannten Proteine. Weitere geeignete Biopolymere sind Proteine oder Peptide, die das Aminosäurenmotiv R-G-D enthalten, ferner adhäsions- begünstigende Kohlenhydrate wie Sialyl-Lewisx oder Fragmente davon oder anderweitig bioaktive Kohlenhydrate wie Heparin oder Fragmente davon. Die entsprechenden Moleküle können jeweils kovalent oder nichtkovalent mit Polymermolekülen verbunden sein.
Wenn das in Schritt (i) eingesetzte Polymer eines oder mehrere der genannten Biopolymere enthält, so sind diese in einer Menge von vorzugsweise 0,1 Gew.-% bis 5 Gew.- %, insbesondere von 1 Gew.-% bis 2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Gerüstpolymers, enthalten.
Wenn das Gerüstpolymer anorganische Partikel wie Hydroxylapatit enthält, sind diese in einer Menge von vorzugsweise 1 bis 20 Gew.-%, insbesondere von 5 bis 10 Gew.- %, bezogen auf das Gewicht des Gerüstpolymers, enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die chaotropische Flüssigkeit im Wesentlichen wasserfrei. „Im Wesentlichen wasserfrei" bedeutet, dass die chaotropische Flüssigkeit weniger als 5 Gew.-% Wasser, vorzugsweise weniger als 2 Gew.-% Wasser, besonders bevorzugt weniger als 1 Gew.-% Wasser, bezogen auf das Ge- samtgewicht der chaotropischen Flüssigkeit, enthält.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist die chaotropische Flüssigkeit im Wesentlichen frei von stickstoffhaltigen Basen. „Im Wesentlichen frei von stickstoffhaltigen Basen" bedeutet, dass die chaotropische Flüssigkeit weniger als 5 Gew.-%, vor- zugsweise weniger als 2 Gew.-%, besonders bevorzugt weniger als 1 Gew.-% stickstoffhaltige Basen, bezogen auf das Gesamtgewicht der chaotropischen Flüssigkeit, enthält. Stickstoffhaltige Basen sind beispielsweise Ammoniak, Amine und aromatische oder nichtaromatische Heterocyclen mit wenigstens einem basischen Stickstoffatom als Ringglied.
Bevorzugt ist die chaotropische Flüssigkeit bei einer Temperatur von höchstens 150 °C, z.B. im Temperaturbereich von -100 °C bis +150 °C oder von 0 bis +150 °C oder von 50 bis +150 °C, besonders bevorzugt von höchstens 120 °C, z. B. im Temperaturbereich von -50 °C bis +120 °C oder von 0 bis +120 °C oder von 50 bis +120 °C, und insbesondere von höchstens 100 °C, z.B. im Temperaturbereich von -10 °C bis +100 °C oder von 0 bis +100 °C oder von 50 bis +100 °C, flüssig. Das heißt, die chaotropische Flüssigkeit besitzt einen Schmelzpunkt von vorzugsweise höchstens 150 °C, besonders bevorzugt von höchstens 120 °C und insbesondere von höchstens 100 °C.
Der Solubilisierungsvorgang kann auch durch Ultraschall unterstützt werden. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung erfolgt das Erwärmen durch Mikrowellenbestrahlung.
Vorzugsweise erfolgt die Solubilisierung bei Temperaturen von höchstens 200 °C, z.B. von 0 bis 200 °C oder vorzugsweise von 20 bis 200 °C oder besonders bevorzugt von 50 bis 200 °C oder insbesondere von 100 bis 200 °C, besonders bevorzugt von höchstens 150 °C, z.B. von 0 °C bis +150 °C oder vorzugsweise von 20 bis 150 °C oder besonders bevorzugt von 50 bis 150 °C oder insbesondere von 100 bis 150 °C, stärker bevorzugt von höchstens 120 °C, z.B. von 0 °C bis 120 °C oder vorzugsweise von 20 bis 120 °C oder besonders bevorzugt von 50 bis 120 °C oder stärker bevorzugt von 80 bis 120 °C oder insbesondere von 100 bis 120 °C, und insbesondere von höchstens 100 °C, z.B. von 0 °C bis +100 °C oder vorzugsweise von 20 bis 100 °C oder besonders bevorzugt von 50 bis 100 °C oder insbesondere von 80 bis 100 °C.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die chaotropische Flüssigkeit ausgewählt unter flüssigen Salzen. Flüssige Salze werden auch als „ionic liquids" (ionische Flüssigkeiten) bezeichnet. Generell versteht man unter ionischen Flüssigkeiten Salze, in denen die Ionen nur schwach koordiniert sind, so dass diese Salze bei relativ niedrigen Temperaturen, z.B. unterhalb von 150 °C oder unterhalb von 100 °C oder sogar bei Raumtemperatur, flüssig sind. Dabei ist in wenigstens einem der Ionen die Ladung delokalisiert und wenigstens eines der Ionen ist organischer Natur, wodurch die Bildung von stabilen Kristallgittern verhindert wird.
Vorzugsweise weist das flüssige Salz die Formel Het+Ax" 1/X auf.
Hierbei steht Het+ für einen positiv geladenen N-alkylierten, N-arylierten, N- arylalkylierten, N-alkoxylierten, N-aryloxylierten, N-arylalkoxylierten, N-alkoxyalkylierten und/oder N-aryloxyalkylierten stickstoffhaltigen Heterocyclus. Mit anderen Worten steht Het+ für einen positiv geladenen stickstoffhaltigen Heterocyclus, bei dem formal ein Ringstickstoffatom über sein freies Elektronenpaar einen Alkylrest, Arylrest, Arylalkyl- rest, Alkoxyrest, Aryloxyrest, Arylalkoxyrest, Alkoxyalkylrest und/oder einen Aryloxyal- kylrest gebunden trägt, so dass im Heterocyclus eine positive Ladung entsteht, d.h. die positive Ladung des Heterocyclus ist auf die Substitution am freien Elektronenpaar eines Ringstickstoffatoms zurückzuführen.
Alkyl steht in den genannten Resten vorzugsweise für d-C6-Alkyl. Alkoxy steht in den genannten Resten vorzugsweise für CrC6-Alkoxy. Aryl steht in den genannten Resten vorzugsweise für Phenyl. Arylalkyl steht in den genannten Resten vorzugsweise für Aryl-CrC6-Alkyl, wie Benzyl oder Phenylethyl. Aryloxy steht in den genannten Resten vorzugsweise für einen über Sauerstoff gebundenen Phenylrest, z.B. Phenoxy. Arylal- koxy steht in den genannten Resten vorzugsweise für einen Aryl-Ci-C6-Alkoxyrest, z.B. für Benzoxy. Alkoxyalkyl steht in den genannten Resten vorzugsweise für einen CrC6- Alkoxy-C-ι-C6-Alkylrest. Aryloxyalkyl steht in den genannten Resten vorzugsweise für einen Aryloxy-CrC6-Alkylrest, insbesondere für einen Phenyloxy-CrC6-Alkylrest.
Je nachdem, ob Het+ für einen aromatischen Heterocyclus oder für einen alicyclischen Heterocyclus, in dem das Ringstickstoffatom nicht Teil einer Doppelbindung ist, steht, ist das Stickstoffatom, das formal die positive Ladung erzeugt, entweder einfach oder zweifach mit den oben genannten Resten substituiert.
Ax" 1/X steht für ein Anion, worin x für 1 , 2 oder 3 steht.
Vorzugsweise ist Het+ ausgewählt unter
- positiv geladenen 5- oder 6-gliedrigen aromatischen Heterocyclen, die als Ringglied eine Gruppe NRa und gegebenenfalls ein bis drei Heteroatome oder heteroatomhaltige Gruppen, die ausgewählt sind unter N, O, S, NRb, SO und SO2, enthalten,
- positiv geladenen 5- oder 6-gliedrigen aromatischen Heterocyclen, die als Ringglied eine Gruppe NRa und gegebenenfalls ein oder zwei Heteroatome oder heteroatomhaltige Gruppen, die ausgewählt sind unter N, O, S, NRb, SO und SO2, enthalten, und die an einen Benzolring kondensiert sind, und
- positiv geladenen 5- oder 6-gliedrigen gesättigten alicyclischen Heterocyclen, die als Ringglied eine Gruppe NRaRa und gegebenenfalls ein oder zwei Heteroatome oder heteroatomhaltige Gruppen, die ausgewählt sind unter O, S, NRb, SO und SO2, enthalten,
worin
Ra und Ra unabhängig voneinander für d-C6-Alkyl, Aryl, d-C6-Alkoxy, Aryloxy, CrC6-
Alkoxy-CrC6-alkyl oder Aryloxy-CrC6-alkyl und vorzugsweise für d-C6-Alkyl o- der Ci-C6-Alkoxy-Ci-C6-alkyl stehen; und
Rb für Wasserstoff, CrC6-Alkyl, Aryl, CrC6-Alkoxy, Aryloxy, Ci-C6-Alkoxy-CrC6- alkyl oder Aryloxy-CrC6-alkyl und vorzugsweise für CrC6-Alkyl oder CrC6-
Alkoxy-Ci-C6-alkyl steht; wobei die alicyclischen oder aromatischen Heterocyclen oder die Benzolringe, an welche letztere kondensiert sein können, 1 bis 5 Substituenten tragen können, die ausgewählt sind unter CrC6-Alkyl, CrC6-Alkoxy und Ci-C6-Alkoxy-Ci-C6-alkyl.
Besonders bevorzugt ist Het+ ausgewählt unter Verbindungen der Formeln Het.1 bis Het.15:
Figure imgf000018_0001
Het.1 Het.2 Het.3 Het.4
Figure imgf000018_0002
Het.5 Het.6 Het.7
Figure imgf000018_0003
Het.8 Het.9 Het.10 Het.1 1
Figure imgf000018_0004
Het.12 Het.13 +
Figure imgf000019_0001
Het. 14 Het. 15
worin
R1 und R2 unabhängig voneinander für d-C6-Alkyl oder Ci-C6-Alkoxy-CrC6-alkyl stehen; und
R3 bis R9 unabhängig voneinander für Wasserstoff, CrC6-Alkyl, Ci-C6-Alkoxy-Ci-C6- alkyl oder d-C6-Alkoxy stehen, wobei Wasserstoff besonders bevorzugt ist.
Vorzugsweise stehen sowohl R1 als auch R2 für d-C4-Alkyl oder Ci-C4-Alkoxy-Ci-C4- alkyl, wobei es besonders bevorzugt ist, wenn eine dieser Gruppen Methyl ist. Beson- ders bevorzugt stehen sowohl R1 als auch R2 für d-C4-Alkyl. Insbesondere steht einer der Reste R1 oder R2 für Methyl und der andere für CrC4-Alkyl, z.B. Ethyl.
R3 bis R9 stehen vorzugsweise für H.
Bevorzugt ist Het+ monocyclisch. Dementsprechend ist Het+ vorzugsweise unter den Verbindungen der Formeln Het.1 bis Het.13 ausgewählt. Besonders bevorzugt ist Het+ ein monocyclischer Fünfring. Dementsprechend ist Het+ besonders bevorzugt unter den Verbindungen der Formeln Het.5 bis Het.1 1 und Het.13 ausgewählt.
Stärker bevorzugt steht Het+ für ein Imidazoliumion der Formel Het.5, ein Pyrazoliumi- on der Formel Het.6, ein Oxazoliumion der Formel Het.7, ein 1 ,2,3-Triazoliumion der Formeln Het.8 oder Het.9, ein 1 ,2,4-Triazoliumion der Formel Het.10 oder ein Thiazoli- umion der Formel Het.11 , wobei R1 bis R5 wie oben definiert sind. Die oben gemachten Aussagen zu bevorzugten Resten R1 bis R5 gelten hier entsprechend, d.h. sowohl R1 als auch R2 stehen vorzugsweise für d-C4-Alkyl oder Ci-C4-Alkoxy-CrC4-alkyl und besonders bevorzugt für d-C4-Alkyl, wobei es besonders bevorzugt ist, wenn eine dieser Gruppen Methyl ist. Insbesondere steht einer der Reste R1 oder R2 für Methyl und der andere für d-C4-Alkyl, z.B. für Ethyl. R3 bis R5 stehen vorzugsweise für H. Noch stärker bevorzugt steht Het+ für ein Imidazoliumion der Formel Het.5, wobei R1 bis R5 wie vorstehend definiert sind. Die oben gemachten Aussagen zu bevorzugten Resten R1 bis R5 gelten hier entsprechend, d.h. sowohl R1 als auch R2 stehen vor- zugsweise für CrC4-AIkVl oder Ci-C4-Alkoxy-CrC4-alkyl und besonders bevorzugt für CrC4-Alkyl, wobei es besonders bevorzugt ist, wenn eine dieser Gruppen Methyl ist. R3 bis R5 stehen vorzugsweise für H. Dementsprechend Het+ steht insbesondere für ein Imidazoliumion der Formel Het.5, das an einem Ringstickstoffatom eine Methylgruppe trägt und am zweiten Ringstickstoffatom eine CrC4-Alkylgruppe oder CrC4- Alkoxy-CrC4-alkylgruppe. Speziell stehen dabei R3, R4 und R5 für H. Insbesondere steht einer der Reste R1 oder R2 für Methyl und der andere für CrC4-Alkyl, z.B. Ethyl.
Ax" 1/X ist vorzugsweise unter koordinierenden Anionen ausgewählt, d.h. unter solchen, die grundsätzlich zur Koordination z.B. an ein Metallzentrum befähigt sind.
Bevorzugt ist Ax" 1/X ausgewählt unter Halogeniden, Pseudohalogeniden, Perchlorat, den Säureanionen von d-C6-Monocarbonsäuren und den Mono- und Dianionen von C2-C6- Dicarbonsäuren, wobei die Mono- und Dicarbonsäuren einfach, zweifach oder dreifach mit Halogen und/oder Hydroxy substituiert sein können. Ein bevorzugtes Säureanion ist Acetat.
Besonders bevorzugt ist Ax" 1/X ausgewählt unter Halogeniden, Pseudohalogeniden und Acetat.
Pseudohalogenide sind z. B. Cyanid (CN"), Cyanat (OCN"), Isocyanat (CNO"), Thiocya- nat (SCN"), lsothiocyanat (NCS") und Azid (N3 ").
Insbesondere steht Ax" 1/X für Chlorid, Bromid, Cyanat, Thiocyanat oder Acetat. Speziell steht Ax" 1/X für Chlorid oder Acetat.
Speziell steht Het+Ax" 1/X für ein Imidazoliumchlorid Het.5-Cl" oder ein Imidazoilumacetat Het.5-(CH3COO"), wobei das Imidazoliumion vorzugsweise wie oben beschreieben substituiert ist.
In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform ist die chaotropische Flüssigkeit ausgewählt unter Lösungen von chaotropischen Salzen in polar-aprotischen Lösungsmitteln.
Bevorzugt sind die anorganischen Salze ausgewählt unter Alkalihalogeniden, Erdalka- lihalogeniden, Ammoniumhalogeniden, Alkalipseudohalogeniden, Erdalkalipseudoha- logeniden, Ammoniumpseudohalogeniden, Alkaliperchloraten, Erdalkaliperchloraten und Ammoniumperchlorate sowie Gemischen davon.
Besonders bevorzugt ist das anorganische Salz ausgewählt unter Lithiumchlorid, CaI- ciumthiocyanat, Natriumiodid, Natriumperchlorat und Gemischen davon.
Bevorzugte polar-aprotische Lösungsmittel sind Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid und Diethylamin sowie Gemische davon.
Besonders bevorzugt ist die chaotropische Flüssigkeit ausgewählt unter den oben beschriebenen ionischen Flüssigkeiten. Auf die oben gemachten Ausführungen zu den bevorzugten Ausgestaltungen der ionischen Flüssigkeit wird hiermit Bezug genommen.
Die Durchführung des Schritts (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in der Regel so, dass man das gegebenenfalls zuvor zerkleinerte Polymer mit der chaotropi- schen Flüssigkeit mechanisch mischt und bis zur vollständigen Lösung rührt. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das Gemisch zur Beschleunigung des Lösungs- und Homogenisierungsvorgangs während oder nach dem Mischen erwärmt, z. B. durch Mikrowellenbestrahlung, vorzugsweise jedoch nicht auf eine Temperatur von mehr als 150 °C, bevorzugt nicht mehr als 120 °C, insbesondere nicht mehr als 100 °C.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration des solubilisierten Polymers in der chaotropischen Flüssigkeit 5 Gew.-% bis 35 Gew.-%, bevorzugt 5 Gew.-% bis 25 Gew.-% und insbesondere 10 Gew.-% bis 25 Gew.-%.
Bei der Einführung des solubilisierten Polymers in das flüssige Medium (Schritt (N)) präzipitiert dieses innerhalb einer sehr kurzen Zeitspanne, z. B. in weniger als 1 s. Die Einführung erfolgt durch Extrusion, d. h. Herausdrücken des Solubilisats durch eine Kanüle. Beim Einbringen der chaotropischen Lösung in das flüssige Medium, in dem die chaotropen Komponenten löslich sind, das Polymermaterial hingegen im Wesentlichen unlöslich ist, präzipitiert das Polymer.
Die Extrusion des Polymers in ein Flüssigmedium erfolgt mittels einer beweglichen Kanüle, die vorzugsweise Bestandteil einer automatisierten Vorrichtung ist. Die Kanüle oder der Behälter, in dem sich das flüssige Medium befindet, oder beide werden hierbei so bewegt, dass das Extrudat bei Variante (ii-a) die Form eines dreidimensionalen Gerüsts, Netzwerks oder Gitters annimmt und bei Variante (ii-b) die Form eines geraden, gebogenen oder geknickten Polymerstrangs. Das in Schritt (ii) eingesetzte flüssige Medium ist einerseits mit der chaotropischen Flüssigkeit aus Schritt (i) mischbar, andererseits ist das eingesetzte Polymer im Wesentlichen unlöslich darin. Bevorzugte flüssige Medien sind protische Lösungsmittel wie Wasser und Alkanole, cyclische Ether, wie Tetrahydrofuran und Dioxan, Ketone, wie Aceton und Ethylmethylketon, und Nitrile, wie Acetonitril, sowie Gemische davon. Bevorzugte flüssige Medien sind protische Lösungsmittel wie Wasser und Alkanole sowie Gemische davon. Geeignete Alkanole sind CrC4-Alkanole, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol und tert-Butanol. Vorzugsweise ist das flüssige Medium wässrig, d. h. es enthält mindestens 10 Gew.-% Wasser. Besonders bevorzugt enthält das flüssige Medium wenigstens 50 Gew.-% Wasser, insbesondere wenigstens 80 Gew.-% Wasser. Der übrige Bestandteil des wässrigen Mediums ist vorzugsweise unter d-C3-Alkanolen, wie Methanol, Ethanol, n- Propanol und Isopropanol, ausgewählt. Speziell verwendet man Wasser.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die Kontakt- bzw. Überschneidungsstellen zwischen verschiedenen Elementen des Gerüsts, Gitters oder Netzwerks durch Polyelektrolyte stabilisiert.
Als "Polyelektrolyte" werden Polymere bezeichnet, deren Wiederholungseinheiten eine zur Aufnahme oder Abgabe von Protonen befähigte Gruppe tragen, und die somit in einem protischen, insbesondere wässrigem Medium Ladungen aufnehmen und wieder abgeben können, wobei diese innerhalb eines Moleküls positiv und/oder negativ sein können. Eine im wässrigen Medium negativ geladene Gruppe ist z. B. die Carbo- xylgruppe, eine im wässrigen Medium positiv geladene Gruppe ist z.B. die Aminogrup- pe. Grundsätzlich sind alle gängigen Polyelektrolyte geeignet. Geeignete Polyelektrolyte sind beispielsweise Verbindungen, die als Additive zur Erhöhung der Nassfestigkeit von Papier bei der Papierherstellung eingesetzt werden, wie Polycarbonsäuren, z.B. Polyacrylsäure, Polyamine, z.B. Polyvinylamin, Polyimine, Copolymere von im Amidteil ungesättigten Carbonsäureamiden und ungesättigten Carbonsäuren, z.B. N- Vinylformamid/Acrylsäure-Copolymere, polymerisierbare basische Heterocyclen, z.B. N-Vinylpyrrolidon, Umsetzungsprodukte von Polyaminen mit Epichlorhydrin, epoxidier- te Polyamide, Harnstoff harze, Melaminharze, Polyurethane und dergeleichen. Solche Nassfestigkeitserhöher sind beispielsweise in der EP 01 1 18 439 beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Bevorzugte Polyelektrolyte sind jedoch Polycarbonsäuren, wie z. B. Polyacrylsäure, monotone aliphatische Polyamine, wie z. B. Polyvinylamin, sowie polymerisierbare basische Heterocyclen, d.h. Heterocyclen mit einer exocyclischen ethylenischen Doppelbindung, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Polyelektrolyte Bestandteil des Flüssigmediums, in das das solubilisierte Polymer extrudiert wird. Hierbei ist es bevorzugt, wenn das Flüssigmedium bis zu 20 Gew.-% an Polyelektrolyten enthält, insbesondere von 5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des flüssigen Mediums.
Die Kontakt- bzw. Überschneidungsstellen zwischen verschiedenen Elementen des Gerüsts, Gitters oder Netzwerks können jedoch auch wie nachstehend zu Verfahrensvariante (ii-b) beschrieben stabilisiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden einzelne oder alle Teile des Gerüsts mit Signal- oder Wachstumsfaktoren ausgestattet, die auf lebende Zellen wirken. Entsprechende Faktoren, z. B. VEGF oder NGF, sind dem Fachmann geläufig. Je nach ihrem individuellen physikalischen oder chemischen Eigenschaften können diese Faktoren vorzugsweise entweder dem zu extrudierenden Material in Schritt (i) wie zuvor beschrieben zugesetzt werden ("Dotierung") oder während des Extrusi- onsprozesses in Schritt (ii) oder danach unter Verwendung einer geeigneten Kanüle als Schicht auf die Oberfläche des entstehenden Stranges aufgetragen werden.
Das resultierende Polymergerüst kann im Hinblick auf die Verteilung der Faktoren homogen sein, bevorzugt ist jedoch eine heterogene Verteilung, die zur Ausbildung von Signalfaktorgradienten führt und damit der Gewebsneubildung, z. B. dem Einwachsen von Blutgefäßen und Nervenfasern, eine Orientierung vorgibt. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn die Heterogenität der Signalfaktoren in geeigneter Weise mit einer struk- turellen Heterogenität des Gerüsts, Gitters oder Netzwerks kombiniert ist, indem z. B. für Blutgefäße oder Nerven größere, stark dotierte Aussparungen freigehalten werden oder die Voraussetzungen für die Bildung komplexerer Organ strukturen geschaffen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform von Schritt (ii-a) erfolgt die Extrusion in einer solchen Weise, dass das Gerüst im Wesentlichen schichtweise aufgebaut wird, so dass ein Gerüst mit einem Schichtenaufbau gebildet wird, d. h. die überwiegende Anzahl der Stäbe bzw. Stränge liegt in zueinander parallelen Ebenen, wobei die stabilisierenden Kontakte zwischen den jeweils benachbarten Schichten hauptsächlich durch Überschneidungen von Strängen zu Stande kommen, während der Beitrag von nicht in einer Ebene verlaufenden Stäben bzw. Strängen für Interaktionen zwischen den Schichten und damit für die dreidimensionale Stabilität des Gerüsts unerheblich ist. „Im Wesentlichen schichtweiser Aufbau" bedeutet, dass das Gerüst auch Stranganordnungen enthalten kann, die nicht zu diesen Schichten gehören, das Gerüst jedoch haupt- sächlich, z.B. zu wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 80 % und insbesondere wenigstens 90 %, bezogen auf die Länge der Polymerstränge, aus denen das Gerüst insgesamt aufgebaut ist, aus schichtweise angeordneten Polymersträngen aufgebaut ist.
Vorzugsweise besteht jede Schicht hauptsächlich aus parallel zueinander verlaufenden Extrudatsträngen, insbesondere aus bustrophedon, d. h. von Nachbarstrang zu Nachbarstrang in Richtung und Gegenrichtung alternierend, verlaufenden Extrudatsträngen. Der Anteil nicht parallel verlaufender Elemente ist hierbei unerheblich. Die Stabilisierung der Stränge jeder einzelnen Schicht wird in erster Linie durch den Kontakt mit den Strängen der Nachbarschicht oder Nachbarschichten erreicht, sofern im betreffenden Bereich der Ebene eine gitterartige, durchlässige Struktur vorgesehen ist. Ebenen oder Teile von Ebenen können jedoch auch undurchlässig gestaltet werden, indem im betreffenden Bereich die parallel verlaufenden Stränge so nahe zueinander gelegt werden, dass sie sich berühren.
Es ist hierbei zur mechanischen Stabilisierung des Gerüsts bevorzugt, wenn die Stränge benachbarter Ebenen weder parallel noch antiparallel zueinander liegen. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn die Winkel der Stränge zwischen benachbarten Schichten 90°, 60° oder 45° betragen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform von Schritt (ii-a) erfolgt die Extrusion in einer solchen Weise, dass die Schichten im Wesentlichen aus Extrudatsträngen in Form von zweidimensionalen raumfüllenden Kurven (FASS-Kurven; FASS = space- filling, self-avoiding, simple and self-similar) aufgebaut sind. „Im Wesentlichen" bedeu- tet, dass die Schichten zu wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 80 % und insbesondere wenigstens 90 %, bezogen auf die Gesamtlänge der Polymerstränge, aus denen die jeweiligen Schichten aufgebaut sind, aus Polymersträngen in Form von zweidimensionalen raumfüllenden Kurven aufgebaut sind. Eine FASS-Kurve ist ein Weg, der über eine aus einer Anzahl von gleichförmigen Feldern aufgebaute Fläche bzw. durch einen aus einer Anzahl von "Kammern" aufgebauten drei- oder mehrdimensionalen Raum führt, so dass jedes Feld bzw. jede Kammer berührt wird, ohne dass der Weg sich mit sich selbst schneidet. Hierdurch wird eine in beiden Dimensionen der Ebene gleichförmigere Struktur erreicht als beim Aufbau der Ebene aus parallelen Strängen. Bevorzugte Sonderformen von FASS-Kurven sind Peano-Kurven, HiI- bert-Kurven und Sierpiήski-Kurven.
In dieser Ausführungsform wird zur Herstellung vorzugsweise jede Ebene in eine Anzahl von Flächen zerlegt, die jeweils von den anderen Flächen derselben Ebene im Wesentlichen unabhängig ausgefüllt wird. Hierbei ist es bevorzugt, wenn benachbarte Ebenen in unterschiedliche Flächengruppen zerlegt werden. Besonders bevorzugt wird jede Ebene so zerlegt, dass ein möglichst großer Anteil von quadratischen Flächen entsteht, die jeweils durch eine FASS-Kurve ausgefüllt werden. Besonders bevorzugt ist es hierbei, wenn die Zerlegung der Flächen so erfolgt, dass eine möglichst kontinuierliche Extrusion möglich ist.
Ebenfalls besonders bevorzugt ist es hierbei, wenn die Zerlegung so erfolgt, dass die Ebene im Wesentlichen, z. B. zu mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 75 %, insbesondere zu mindestens 90 % aus FASS-Kurven besteht.
Für ein gegebenes Feld können FASS-Kurven mittels rekursiver Algorithmen erzeugt werden. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann geläufig und beispielsweise in V. Batagelj: Logo to PostScript. Paper prepared for Eurologo'97, Ljubljana 1997; AJ. CoIe: A note ort space filling curves. Software - Practice and Experience, 13(1983), 1 181-1 189; AJ. CoIe: A note ort Peano Polygons and Gray Codes. International Jour- nal of Computer Mathematics, 18(1985), 3-13; C. Davis, D.E. Knuth: Number Repre- sentations and Dragon Curves, /-//. Journal of Recreational Mathematics, 3(1970), 66- 81 ; 3(1970), 133-149; F. M. Dekking, M. Mendes France, A. van der Poorten: Folds !. The Mathematical Intelligencer, 4(1982), 130-138; 4(1982), 173-181 ; 4(1982), 190-195; F. M. Dekking: Recurrent Sets. Advances in Mathematics, 44(1982), 78-104; AJ. Fisher: A new algorithm for generating Hubert curves. Software - Practice and Experience, 16(1986), 5-12; WJ. Gilbert: Fractal Geometry Derived from Complex Bases. The Mathematical Intelligencer, 4(1982), 78-86; J. Giles, Jr.: Construction of Replicat- ing Superfigures. Journal of Combinatorial Theory, Series A, 26(1979), 328-334; L. M. Goldschlager: Short algorithm s for space-filling curves. Software - Practice and Experi- ence, 1 1 (1981 ), 99; A. Null: Space-filling curves, or how to waste time with a plotter. Software - Practice and Experience, 1 (1971 ), 403-410; P. Prusinkiewicz, A. Lindenmayer: The algorithmic beauty of plants. Springer, New York, 1990; N. Wirth; Algo- rithms + Data Structures = Programs. Prentice-Hall, 1976; LH. Witten und B. Wyvill: On the generation and use of space-filling curves. Software - Practice and Experience, 13(1983), 519-525 beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polymergerüst helikale, spiralige oder kreisförmige Elemente, wobei diese rund oder eckig, kontinuierlich oder stufenweise, Einfachhelices oder Mehrfachhelices sein können. In einer besonderen Ausführungsform sind die helikalen, spiraligen oder kreisförmigen Elemente bezüglich der Strangdicke und/oder Dotierung von den gitterförmigen Elementen verschieden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Aufbau des Polymergerüsts im Wesentlichen dreidimensional homogen, d.h. die Stränge bzw. Stäbe in allen Raumdimensionen leisten quantitativ und qualitativ vergleichbare Beiträge.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Schritts (ii-a) besteht das Polymergerüst im Wesentlichen aus einem Extrudatstrang in der Form einer dreidimensionalen FASS-Kurve und insbesondere einer dreidimensionalen Peano-Kurve. „Im Wesentlichen" bedeutet, dass das Gerüst zu wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 80 % und insbesondere wenigstens 90 %, bezogen auf die Gesamtlänge der Polymer- stränge, aus denen das Gerüst insgesamt aufgebaut ist, aus Polymersträngen in Form von dreidimensionalen FASS-Kurven aufgebaut ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform entfallen mindestens 25 % des Gesamtvolumens des Polymergerüsts auf durchgehende Kanäle. Ein "durchgehender Kanal" ist ein Hohlraum, dessen Länge mindestens die Hälfte der Länge der zu ihm parallelen Abmessung des gesamten Polymergerüsts beträgt, und der mit der Außenfläche des Gerüsts kommuniziert.
Zur Isolierung des Polymergerüsts wird dieses entweder aus dem in Schritt (ii) verwen- deten Behälter entnommen oder es wird zuerst das flüssige Medium, in das extrudiert wurde, entfernt. Ein alternative Methode zur Isolierung, die insbesondere bei Verwendung von Wasser oder wässrigen Gemischen als flüssiges Medium in Schritt (ii) in Betracht kommt, ist das Einfrieren des Mediums und Isolierung des Gerüsts aus dem gefrorenen Medium durch geeignete Methoden, z.B. durch mechanisches Entfernen des gefrorenen Mediums oder durch dessen Sublimation. Das Gerüst kann anschlißend noch von Resten des flüssigen Mediums befreit werden, z.B. durch Trocknen an der Luft, in einem Trockenschrank oder einem Vakuumschrank oder durch Lyophilisieren.
In Variante (ii-b) erfolgt die Extrusion des in Schritt (i) erhaltenen Solubilisats in der Weise, dass einzelne gerade, gebogene oder geknickte Polymerstränge entstehen. Die gewünschte Form entsteht durch die Relativbewegung von Kanüle zu Behälter und/oder durch Informbringen des Strangs nach der Extrusion, z.B. durch Strecken, Biegen und/oder Knicken. Hierzu können alle gängigen mechanischen Hilfsmittel, wie Klammern, Pinzetten, Stäbe etc. oder auch in das flüssige Medium getauchte Matrizen mit der gewünschten Form, die anschließend wieder entfernt werden, verwendet werden.
Vorzugsweise wird der Polymerstrang vor der Verarbeitung zum Gerüst aus dem flüssigen Medium isoliert, gegebenenfalls (nach)geformt und/oder getrocknet. Die Isolie- rung und das Trocknen können wie vorbeschrieben durchgeführt werden. Das (Nach)Formen kann nach oder vorzugsweise vor dem Trocknen erfolgen. Das (Nach)Formen kann z.B. das Strecken, Biegen und/oder Knicken des Polymerstrangs umfassen, z.B. mit Hilfe der vorgenannten Hilfsmittel.
Anschließend können die Polymerstränge (Fasern) zur gewünschten Gerüststruktur verknüpft werden. Dabei können entweder nur gleichartige oder verschiedene Polymerfasern miteinander verknüpft werden. Bei Verwendung verschiedener Polymerfasern können sich diese beispielsweise in ihrem Durchmesser, in ihrer Natur und/oder in ihrem Herstellungsprozess unterscheiden. So können Polymerfasern verwendet wer- den, die sich dadurch unterscheiden, dass sie durch Extrusion mit Kanülen unterschiedlicher Form und/oder unterschiedlichen Durchmessers erzeugt wurden und/oder dass sie ausgehend von verschiedenen bioabbaubaren und biokompatiblen Polymeren hergestellt wurden und/oder dass sie mittels unterschiedlicher Verfahren hergestellt wurden, wobei wenigstens eine Polymerstrangart durch das erfindungsgemäße Verfah- ren hergestellt worden sein muss. Als vom erfindungsgemäßen Verfahren abweichende Verfahren können alle dem Fachmann gängigen und für die jeweilige Polymerart geeigneten Verfahren zur Herstellung von Polymerfasern, wie Spinnverfahren, E- lectrospinning etc., eingesetzt werden.
Das Verknüpfen kann mittels bekannter Techniken zum Verbinden/Verkleben von derartigen Polymeren erfolgen, z.B. mittels hierfür üblicher bioabbaubarer und biokompatibler Klebstoffe. Die Verknüpfung erfolgt jedoch bevorzugt in der Weise, dass man an den gewünschten Verknüpfungspunkten eine kleine Menge des in Schritt (i) erhaltenen oder eines anderen Solubilisats aus einem biokompatiblen und bioabbaubaren PoIy- mer in einer chaotropischen Flüssigkeit aufträgt und anschließend mit einem flüssigen Medium versetzt, in welchem das Polymer nicht löslich ist. Beim Präzipitieren des Polymers verbindet dieses gleichzeitig die einzelnen Polymerstränge miteinander.
Es ist prinzipiell auch möglich, die Polymerstränge im flüssigen Medium miteinander zu verknüpfen, beispielsweise durch Auftragen einer kleinen Menge des in Schritt (i) erhaltenen Solubilisats an die gewünschten Verknüpfungspunkte. Die im flüssigen Medium hergestellten Gerüste können dann wie oben beschrieben isoliert und gewünsch- tenfalls getrocknet werden. Die erste Vorgehensweise, d.h. zuerst Isolierung der Polymerstränge und erst anschließendes Verknüpfen zu einem Gerüst, ist jedoch aufgrung der leichteren Ausführbarkeit bevorzugt.
In Schritt (ii) bilden sich, vor allem wenn nur geringe Mengen des flüssigen Mediums verwendet werden, häufig gelförmige Produkte, die relativ leicht isoliert werden können. Die Überführung in den festen Zustand erfolgt durch Trocknen. Es kann auch günstig sein, die gebildeten Gerüste bis zu ihrem Einsatz in gelierter Form zu belassen, um ihre Lagerfähigkeit zu erhöhen, und sie erst kurz vor ihrer Verwendung zu trocknen.
Wenn die Gerüste noch nicht (vollständig) trocken sind, können sie gewünschtenfalls (nach)geformt werden, was wie vorstehend beschrieben erfolgen kann.
Besonders für die Herstellung komplex geformter Gerüste ist für Schritt (ii) Variante (N- a) bevorzugt. Diese Variante erlaubt insbesondere einen einfachen und reproduzierbaren Zugang zu ansonsten nicht trivial herzustellenden dreidimensionalen Gerüsten. Für die Herstellung einfacher, vor allem zweidimensionaler Gerüste, z.B. von Netzen, wie sie beispielsweise für den Aufbau von flächigem Gewebe, wie Haut, ausreichend sind, ist jedoch auch ein Vorgehen gemäß Variante (ii-b) geeignet.
Die erhaltenen Gerüste können anschließend wie oben weiter unten beschrieben be- handelt werden, z.B. durch Beschichtung oder Dotierung mit auf lebende Zellen wirksame Signal- und/oder Wachstumsfaktoren oder durch Besiedlung mit lebenden Zellen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren sind zwei- und dreidimensionale Gerüste aus in der Regel nur schwer zu verarbeitenden bioabbaubaren und biokompatiblen Polymeren, wie Cellulose oder Cellulosederivate, leicht herstellbar. Diese Gerüste, die auch hochkomplexe Formen einnehmen können, können als formgebende Strukturen in den Aufbau von künstlichem Gewebe eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polymergerüst, das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist. Bezüglich der bevorzugten Ausgestaltungen des Polymergerüsts wird auch auf die vorstehenden Ausführungen verwiesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein "negatives Gerüst" gebildet, indem die Leerräume des fertigen primären Gerüsts mit einem anderen, schmelz- oder gelierbaren Polymer ausgegossen werden, der sich in seiner Abbaubarkeit in vitro vom ersten Polymer unterscheidet, gefolgt vom Abbau des ersten Polymers.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Polymergerüsts sind lebende Zellen an dieses gebunden. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um eukary- ontische Zellen, insbesondere Säugerzellen, z. B. menschliche Zellen. Alternativ handelt es sich bei den lebenden Zellen vorzugsweise um prokaryontische Zellen, insbesondere um die Zellen sozial organisierter Bakterien, z. B. Biofilm-bildender oder im Mycelium wachsender Bakterien. Vor der Besiedelung des Polymergerüsts durch lebende Zellen kann dieses in geeigneter Weise vorbereitet werden. So kann die Vorbereitung des fertigen Polymergerüsts auf die Besiedelung durch lebende Zellen beispielsweise durch ein- oder mehrmaliges Waschen mit einem wässrigen Medium, z. B. Wasser, physiologische Kochsalzlösung ("Ringer-Lösung") oder Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung ("phos- phate buffered saline", PBS) erfolgen. Mehrfache Waschungen sind insbesondere dann angebracht, wenn das verwendete Polymer und/oder die verwendeten Polyelekt- rolyte einen signifikanten Anteil an niedermolekularen Substanzen enthalten.
Des Weiteren kann das Polymergerüst vor der Besiedelung durch lebende Zellen getrocknet werden, z. B. durch rasches Einfrieren gefolgt von Gefriertrocknung. Hierbei ist es bevorzugt, wenn die Trocknungsparameter so gewählt werden, dass das getrocknete Polymergerüst lagerfähig ist. In diesem Zusammenhang bedeutet Lagerfähigkeit, dass das Polymergerüst in einem Zeitraum von vorzugsweise wenigstens einer Woche, besonders bevorzugt wenigstens einem Monat keine licht- oder elektronenmikroskopisch erkennbare Schädigung der Struktur zeigt.
Vorzugsweise wird das getrocknete Gerüst vor der Besiedelung durch lebende Zellen mit einem wässerigen Medium äquilibriert, wobei der Äquilibrierungsschritt als Wasch- schritt gestaltet oder von einem oder mehreren Waschschritten gefolgt sein kann. Die Äquilibrierung kann weiterhin erst Durchtränken des Polymergerüsts mit spezifisch oder unspezifisch an die Oberfläche der Polymerstränge bindenden Substanzen umfassen. Ein solches Durchtränken kann auch ohne vorhergehende Trocknungsschritte erfolgen. Bevorzugte Moleküle für ein Durchtränken sind solche, die Besiedelung und/oder Funktion der lebenden Zellen modulieren oder beeinflussen, jedoch mit dem erfindungsgemäßen Extrusionsverfahren nicht kompatibel sind, z.B. auf Grund mangelnder Stabilität gegenüber den verwendeten chaotropen Substanzen. Hierbei ist es bevorzugt, wenn entweder die angestrebte Verteilung der auf die Polymerstränge aufzuziehenden Substanz im Wesentlichen homogen ist oder die verschiedenen Polymer- stränge so gestaltet sind, dass sie eine unterschiedliche Affinität zu der aufzuziehenden Substanz besitzen, so dass sich eine differenzielle Verteilung der aufzuziehenden Substanz ergibt.
Das Äquilibrieren/T ranken wird geeigneterweise vor allem dann durchgeführt, wenn an die Oberfläche der Polymerstränge gebundene Moleküle aktiviert werden sollen, z. B. durch Abspaltung von Schutzgruppen, aktivierende proteolytische Spaltung von Proenzymen und/oder Renaturierung von in Folge der Behandlung mit chaotropen Substanzen denaturierten Polypeptidketten, etwa durch Behandlung des Gerüsts mit Proteinen oder Proteingemischen mit Chaperone-Aktivität unter schwach reduzierenden Bedin- gungen, z. B. durch Inkubation mit einem 10 Gew.-% Serumalbumin und 1 mM ß- Mercaptoethanol enthaltenden physiologischen Kochsalzpuffer bei + 37 °C.
Weiterhin kann vor der Besiedelung des Polymergerüsts durch lebende Zellen eine mechanische Vorbereitung des Polymergerüsts erfolgen, z. B. durch Strecken oder Vorspannen. Solche Verfahren sind aus der Polymertechnik geläufig; ohne Beschränkung auf die Theorie wird angenommen, dass Anwendung geringer mechanischer Kräfte auf einen Polymerstrang zu einer Verbesserung der supermolekularen Ordnung und damit zur Verstärkung der intermolekularen Wechselwirkungen und Erhöhung der mechanischen Stabilität des Stranges führt.
Gewünschtenfalls sind weitere mechanische, chemische, thermische und radiative Behandlungen des Polymergerüsts vor der Besiedelung durch lebende Zellen möglich.
Die Besiedelung des vorbereiteten Polymergerüsts durch lebende Zellen erfolgt grundsätzlich in vitro, wobei Abbau des Polymergerüsts, Bildung extrazellulärer Matrix usw. sich gegebenenfalls über die Implantation hinaus fortsetzen kann. Zur Besiedelung werden in erster Linie adhärente bzw. adhäsionsfähige Zellen verwendet, die zuvor aus ihrem natürlichen Verband herausgelöst worden sind, z. B. durch Behandlung mit Pro- teasen, bevorzugt Trypsin, und/oder Chelatbildnern wie z. B. Ethylendiamintetraessig- säure (EDTA). Entsprechende Verfahren zum Herauslösen von Zellen aus ihren Verbänden sind dem Fachmann geläufig.
Die Besiedelung erfolgt zweckmäßigerweise durch Inkubation des vorbereiteten und gegebenenfalls mit dem Zellwachstumsmedium äquilibrierten Polymergerüsts mit den Zellen in einem Wachstumsmedium unter allgemein permissiven Bedingungen. Typische Bedingungen für die Besiedelung durch menschliche Zellen sind z. B.: DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und geeigneten Antibiotika, bei + 37 °C unter einer Atmosphäre mit 5 % CO2. Solche Medien und Bedingungen sind dem Fachmann geläufig. Kontrolle der Besiedelung und des Gewebeaufbaus kann auf verschiedene Weisen erfolgen, z. B. in situ durch Lichtmikroskopie. Vor der Verwendung können weitere Waschungen sowie eine Einstellung des Mediums auf körperähnlichere Bedingungen erfolgen.
Für biochemisch-physiologisch aktive Gewebe geeignete präformierte Strukturen müssen eine dreidimensionale Feinstruktur aufweisen, die eine Besiedlung durch Zellen in vitro ermöglicht, diesen Zellen eine genügende Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen erlaubt und später das Einwachsen von Blutgefäßen (Vaskularisierung) und gegebenenfalls Nerven aus dem Organismus gestattet. Zu diesem Zweck und zum Aufbau eines komplexer strukturierten Organs oder Organteils (z. B. eines Nephrons) ist ferner wünschenswert, einzelne Teile der präformierten synthetischen Struktur mit geeigneten Wachstums- und Signalfaktoren "dotieren" zu können, um auf diese Weise die Selbstorganisation der Zellen zu funktionsfähigen Verbänden zu organisieren. Wachstumsfaktoren, die zum Beispiel das Einwachsen von Blutgefäßen oder Nerven in einen Gewebebereich stimulieren, und für die Etablierung und Aufrechterhaltung von Strukturen im Organismus wichtige Signalstoffe sind dem Fachmann zumindest grundsätzlich geläufig. Einen Überblick gibt z.B. Bukovsky, "Cell-mediated and neural control of morphostasis", Med. Hypotheses 36 (1991 ), 261-268.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines Polymergerüsts, an das lebende Zellen wie vorstehend beschrieben gebunden sind, zur Herstellung eines Implantats zur Wiederherstellung, Messung oder Veränderung biologischer Funktionen im zu behandelnden Organismus. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Implantat ausgewählt unter künstlichem Knochengewebe, künstlicher Haut, künstlichen Blutgefäßen und Hohlorganen. In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform dient das Implantat als Träger in einem "drug delivery"-System bzw. einer implantierbaren Retardformulierung.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein künstliches Gewebe, das auf einem er- findungsgemäßen Polymergerüst aufgebaut ist. Hierbei kann das Polymergerüst zum Zeitpunkt der Implantation oder anderweitigen Verwendung noch im Wesentlichen vollständig erhalten sein, teilweise abgebaut und/oder durch extrazelluläre Matrix ersetzt oder im Wesentlichen vollständig abgebaut und/oder durch extrazelluläre Matrix ersetzt sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform dient das Implantat als "nerve guide" zur Wiederherstellung durchbrochener Nervenfasern. Hierbei ist es bevorzugt, wenn zum Zeitpunkt der Implantation das Polymergerüst noch nicht vollständig abgebaut ist.
In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform ist das Gewebe ausgewählt unter künstlichem Knochengewebe, künstlicher Haut, künstlichen Blutgefäßen und Hohlorganen. Ist das Gewebe ein künstliches Blutgefäß oder Hohlorgan, so ist es bevorzugt, wenn es helikale Elemente umfasst, da diese eine zur Herstellung der Innen- und Außenoberfläche geeignete Geometrie aufweisen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines künstlichen Gewebes aufgebaut auf einem erfindungsgemäßen Polymergerüst zur Diagnostik ex vivo und in vitro. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polymergerüsts, in welchem lebende Zellen sich an das Gerüst gebunden haben, in einem Bioreaktor. In einer besonderen Ausführungsform werden hierbei Zellen unter "steady state"-Bedingungen gehalten, z. B. unter Verwendung eines Gegenstromaus- tauschs. Hierbei ist es bevorzugt, wenn die Zellen lösliche Produkte sezernieren, und insbesondere bevorzugt sind Hybridome oder stabile Transfektanden, die ein lösliches Protein bilden. In dieser Ausführung bilden dreidimensionale Polymergerüste eine robustere Alternative zu den aus dem Stand der Technik bekannten Hohlfasersystemen (siehe z. B. T. L. Evans und R. A. Miller, "Large-scale production of murine monoclonal antibodies using hollow fiber bioreactors", Biotechniques 1988, Sep. 6 (8): 762-767).
Werden eukaryontische Zellen erfindungsgemäß in einem Bioreaktor verwendet, so sind Hybridome und andere Antikörper-bildende Zellen, z. B. Quadrome, bevorzugt. Ebenfalls bevorzugt sind stabil transfizierte Zellen, z. B. CHO- oder NIH3T3-Zellen, z. B. mit einem in das Genom integrierten Transgen, wobei es besonders bevorzugt ist, wenn die Zellen ein lösliches Protein sezernieren.
Werden prokaryontische Zellen erfindungsgemäß in einem Bioreaktor verwendet, so sind sozial organisierte Bildner von niedermolekularen Metaboliten bevorzugt, insbe- sondere Bildner von Antibiotika, z. B. Streptomyceten, z. B. Streptomyces caelicolor.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere zur Herstellung eines Polymergerüsts durch Extrusion. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung eine relativ zum entstehenden Gitter dreidimensional bewegliche Extrusi- onskanüle, ein mechanisches Positionierungswerk und eine zur Steuerung des Positionierungswerkes geeignete Computereinheit. Insbesondere bevorzugt ist es, wenn die Computereinheit ein Programm zur automatischen Generierung der Strukturen umfasst.
In einer besonderen Ausführungsform können der Extrusionsmechanismus und/oder das bislang gebildete Gerüst um eine feststehende oder variable Achse rotiert werden.
Entsprechende mechanische Vorrichtungen zur relativen dreidimensionalen Positionie- rung der Kanüle sind dem Fachmann grundsätzlich geläufig (siehe z. B. T. H. Ang u.a., "Fabrication of 3D chitosan-hydroxyapatite scaffolds using a robotic dispensing sys- tem", Materials Science and Engineering C 20 (2000): 35-42), ebenso die Prinzipien der Extrusion von Polymeren. In einer besonderen Ausführungsform erfolgt die dreidimensionale Bewegung hauptsächlich in parallel zu den drei Achsen des entstehenden Gerüsts verlaufenden Schritten. Hierbei ist es bevorzugt, wenn die Kanüle zu keiner der drei Achsen parallel gehalten wird, und insbesondere, wenn sie zu allen drei Achsen einen maximalen Winkel bildet (arctan Λ/2 ~ 55°; entspricht im kartesischen Koordinatensystem dem Punkt 1 11 ).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Kanüle zu einer der Achsen des Gerüsts parallel. Hierbei ist es bevorzugt, wenn das Gerüst in einer Dimension bewegt werden kann, der Extrusionsmechanismus in den beiden anderen, und die Kanüle pa- rallel zur Bewegungsdimension des Gerüstes ("Z-Achse") gehalten wird.
In einer besonderen Ausführungsform ist der Querschnitt der Kanüle rund. In einer anderen besonderen Ausführungsform ist die Kanüle im Querschnitt oval, polygonal, gezackt oder irregulär geformt. Hierbei können in der vorliegenden Erfindung zur Her- Stellung eines Gerüsts gleichzeitig oder nacheinander mehrere Kanülen mit gleichem oder verschiedenem Durchmesser und im Querschnitt gleichartiger oder verschiedener Geometrie eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst grundsätzlich drei Komponentengruppen:
1. Vorratsbehälter, Leitungssystem und Kanüle für chaotrope Lösungen,
2. Positionierungssystem für die Kanüle,
3. Behälter für das flüssige Medium.
Die erste Komponente umfasst diejenigen Teile, die mit der Lösung des Polymers in einem chaotropen Lösungsmittel in unmittelbaren Kontakt kommen. Die entsprechenden Teile werden daher zweckmäßigerweise aus Materialien gefertigt, die gegenüber den verwendeten chaotropen Agenzien, die unter anderem korrosiv wirken, widerstandsfähig sind. Mit Hinblick auf die spätere Verwendung der fertigen Gerüste ist es bevorzugt, wenn die Teile der ersten Komponente aseptisch gehandhabt werden können, z. B., indem sie durch gespannten Wasserdampf sterilisierbar („autoklavierbar") sind.
Vorzugsweise besteht der Vorratsbehälter aus Silikatmaterialien oder korrosionsbe- ständigem Metall, z. B. Glas, Keramik oder Edelstahl. Vorzugsweise besteht die Kanüle aus korrosionsbeständigem Metall, z. B. Edelstahl. Die Leitung, die vom Vorratsbehälter zu der beweglichen Kanüle führt, umfasst in der Regel flexible sowie in einer besonderen Ausführungsform auch starre Teile. Geeigneterweise werden die flexiblen Teile der Leitung aus korrosionsbeständigem Polymermaterial, z. B. Silikon, gefertigt. Werden starre Teile als Leitungselemente verwendet, können diese grundsätzlich aus den gleichen Materialien wie der Vorratsbehälter oder aus den gleichen Materialien wie die flexiblen Teile gefertigt werden.
Der Vorratsbehälter dient dazu, das in einem erfindungsgemäßen chaotropischen A- gens gelöste Polymer aufzunehmen. In einer besonderen Ausführung der Erfindung ist er mit einem Rührwerk versehen, um die Homogenität der Polymerlösung zu gewährleisten. In einer weiteren besonderen Ausführungsform ist der Vorratsbehälter temperiert, wobei es bevorzugt ist, wenn der Inhalt des Vorratsbehälters auf einer Temperatur gehalten werden kann, bei der die Lösung aus Polymer in chaotropischer Lösung flüssig ist. Sowohl Rührwerk als auch Temperierungseinrichtung können unabhängig voneinander mit dem Steuerungssystem der zweiten Komponente verbunden oder davon unabhängig sein.
Der Vorratsbehälter kann grundsätzlich jede geeignete Form besitzen.
Die Entnahme des gelösten Polymers aus dem Vorratsbehälter erfolgt über die mit dem Vorratsbehälter verbundene Leitung, entweder der Schwerkraft folgend, z. B. mit einer Ventilsteuerung, oder, bevorzugt, über ein gesteuertes Pumpwerk. Hierbei sind Pumpmechanismen bevorzugt, die keinen unmittelbaren Kontakt beweglicher Bestand- teile mit dem zu pumpenden Lösungsgut erfordern, z. B. peristaltische Schlauchpumpen. Hierbei ist es bevorzugt, wenn die der Steuerung des Durchflusses dienenden Teile (Ventile und/oder Pumpen) mit dem Steuerungssystem der zweiten Komponente verbunden sind.
Die zweite Komponente umfasst mechanische Bestandteile sowie vorzugsweise Software zur Steuerung der Relativbewegung zwischen Kanüle und Extrudat. Die mechanischen Bestandteile sind hierbei grundsätzlich bekannt. In einer bevorzugten Ausführung umfasst die zweite Komponentengruppe eine Anzahl von Schrittmotoren, die zueinander rechtwinklig angeordnete Feintriebe treiben, welche der Verstellung der Ka- nüle dienen. Hierbei umfasst die zweite Komponente bevorzugt so viele Schrittmotoren/Feintriebe, wie die Kanüle Freiheitsgrade der lateralen Bewegung besitzt.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst die zweite Komponentengruppe ferner eine Vorrichtung zum Verstellen des Winkels der Kanüle. In einer weite- ren besonderen Ausführungsform umfasst die zweite Komponentengruppe eine Vorrichtung zum Drehen der Kanüle. In einer weiteren besonderen Ausführungsform umfasst die zweite Komponentengruppe eine Vorrichtung zum automatischen Wechsel zwischen verschiedenen Kanülen unterschiedlichen Durchmessers und/oder unterschiedlicher Geometrie, z. B. nach dem Revolver-Prinzip. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Schrittmotoren und optionalen Komponenten der zweiten Gruppe mittels eines D/A-Umsetzers von einem Computer aus gesteuert. Besonders bevorzugt werden auch die Ventile bzw. Pumpen der ersten Gruppe und insbesondere auch Rührwerk und Temperierungseinrichtung der ersten Gruppe entsprechend gesteuert.
In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet der Computer handelsübliche Hardware sowie zur dreidimensionalen Steuerung der Kanüle geeignete Software. Insbesondere ist es dabei bevorzugt, wenn die Software imstande ist, eine vorgegebene Raumform selbsttätig in ein erfindungsgemäßes Arrangement von Extrudatsträngen, insbesondere ein FASS-Kurven, speziell Peano-Kurven umfassendes Arrangement von Extrudatsträngen, umzurechnen und die Kanüle entsprechend zu leiten. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kontrolliert der Steuerungscomputer auch die zur ersten Komponentengruppe gehörende Pumpe, die den Zustrom von gelöstem Polymer zur Kanüle reguliert, entsprechend der Bewegung der Kanüle.
Entsprechende Schrittmotoren, Feintriebsysteme, D/A-Umsetzer und geeignete Rechner-Hardware-Komponenten sind dem Fachmann grundsätzlich geläufig.
Die dritte Komponentengruppe umfasst das Behältnis für das Flüssigmedium, in welchem die Extrusion des gelösten Polymermaterials erfolgt. Hierfür ist grundsätzlich jede Art von Behältnis geeignet. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung besteht das Wasserbecken aus Glas oder Keramik. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Wasserbecken ebenfalls auf einem System von Schrittmoto- ren und Feintrieben gelagert, welche die fehlenden Freiheitsgrade der Kanüle in seitlicher Verschiebung und/oder Drehung ergänzen können. Zweckmäßigerweise werden die Schrittmotoren und Feintriebe der dritten Komponentengruppe von derselben Hard- und Software wie die der zweiten gesteuert, so dass eine einheitliche Kontrolle aller Bewegungen innerhalb des Systems zur präzisen Formgebung möglich ist.
Mit Hinblick auf die spätere Verwendung der fertigen Gerüste ist es bevorzugt, wenn auch die Teile der dritten Komponente aseptisch gehandhabt werden können, z. B., indem sie durch gespannten Wasserdampf sterilisierbar („autoklavierbar") sind.
Die Erfindung wird durch das folgende, nichtlimitierende Beispiel und die Figur veranschaulicht.
Die Figur zeigt ein gemäß dem Beispiel erzeugtes Cellulosenetz aus zwei Blickrichtungen. Die abgebildete 1 Cent Münze veranschaulicht die Größe des Netzes. Beispiel
Cellulose wurde in i-Ethyl-3-methylimidazoliumacetat eingetragen und durch zweistündiges Rühren bei 90 °C darin gelöst. Der Cellulosegehalt der Lösung betrug 1 Gew.-% Cellulose, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung.
Diese Lösung wurde mittels einer chirurgischen Nadel in ein Wasserbad mit einer Geschwindigkeit von 70 ml/h und unter Strecken der entstehenden Polymerfaser gespritzt. Man erhielt ein Gel, das beim Trocknen schrumpfte und freie Fasern formte. Die trockenen Fasern hatten im Schnitt einen Durchmesser von 70 μm. Durch Aufeinanderlegen der Gele und Verknüpfen der Verbindungspunkte zwischen den Fasern durch Auftragen eines Tropfens der oben hergestellten Celluloselösung und anschließend eines Tropfens Wasser erhielt man netzförmige Strukturen (siehe Figur).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von zwei- oder dreidimensionalen Gerüsten aus bio- abbaubaren und biokompatiblen Polymeren, das die folgenden Schritte umfasst:
(i) Solubilisierung des bioabbaubaren und biokompatiblen Polymers in einer chaotropischen Flüssigkeit; und
(ii-a) im Wesentlichen kontinuierliche Extrusion der im Schritt (i) erhaltenen Lö- sung in ein flüssiges Medium, das mit der chaotropischen Flüssigkeit mischbar ist, in welchem das Polymer jedoch im Wesentlichen unlöslich ist, mittels einer Kanüle, wobei sich die Kanüle und das entstehende Gerüst während der Extrusion relativ zueinander bewegen; oder
(ii-b) Extrusion der im ersten Schritt erhaltenen Lösung in ein flüssiges Medium, das mit der chaotropischen Flüssigkeit mischbar ist, in welchem das Polymer jedoch im Wesentlichen unlöslich ist, mittels einer Kanüle unter Ausbildung einzelner gerader, gebogener oder geknickter Polymerstränge, wobei sich die Kanüle und der entstehende Polymerstrang während des Extrusi- onsvorgangs relativ zueinander bewegen, gegebenenfalls Isolieren der Polymerstränge aus dem flüssigen Medium und Verknüpfen der Polymerstränge unter Ausbildung eines zwei- oder dreidimensionalen Gerüsts.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Polymer ein Polysaccharid oder modifi- ziertes Polysaccharid ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Polysaccharid Cellulose oder ein CeIIuIo- sederivat ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chaotropische Flüssigkeit einen Schmelzpunkt von kleiner oder gleich 150 °C hat.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chaotropische
Flüssigkeit ausgewählt ist unter Salzen der Formel Het+Ax" 1/X, worin
Het+ für einen positiv geladenen N-alkylierten, N-arylierten, N-arylalkylierten, N- alkoxylierten, N-aryloxylierten, N-arylalkoxylierten, N-alkoxyalkylierten und/oder N-aryloxyalkylierten stickstoffhaltigen Heterocyclus steht;
Ax" 1/X für ein Anion steht; und x für 1 , 2 oder 3 steht.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei Het+ ausgewählt ist unter
- positiv geladenen 5- oder 6-gliedrigen aromatischen Heterocyclen, die als Ringglied eine Gruppe NRa und gegebenenfalls ein bis drei Heteroatome oder hete- roatomhaltige Gruppen, die ausgewählt sind unter N, O, S, NRb, SO und SO2, enthalten;
- positiv geladenen 5- oder 6-gliedrigen aromatischen Heterocyclen, die als Ringglied eine Gruppe NRa und gegebenenfalls ein oder zwei Heteroatome oder heteroatomhaltige Gruppen, die ausgewählt sind unter N, O, S, NRb, SO und SO2, enthalten, und die an einen Benzolring kondensiert sind; und
- positiv geladenen 5- oder 6-gliedrigen gesättigten alicyclischen Heterocyclen, die als Ringglied eine Gruppe NRaRa und gegebenenfalls ein oder zwei Heteroatome oder heteroatomhaltige Gruppen, die ausgewählt sind unter O, S, NRb, SO und SO2, enthalten,
worin
Ra und Ra unabhängig voneinander für d-C6-Alkyl, Aryl, d-C6-Alkoxy, Aryloxy,
Ci-C6-Alkoxy-Ci-C6-alkyl oder Aryloxy-CrC6-alkyl stehen; und
Rb für Wasserstoff, CrC6-Alkyl, Aryl, CrC6-Alkoxy, Aryloxy, Ci-C6-Alkoxy-Cr Cβ-alkyl oder Aryloxy-CrC6-alkyl steht;
wobei die alicyclischen oder aromatischen Heterocyclen oder die Benzolringe, an welche diese kondensiert sind, 1 bis 5 Substituenten tragen können, die ausgewählt sind unter CrC6-Alkyl, CrC6-Alkoxy und Ci-C6-Alkoxy-Ci-C6-alkyl.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei Het+ ausgewählt ist unter Verbindungen der Formeln Het.1 bis Het.15
Figure imgf000039_0001
Het.1 I Het.2 Het.3 Het.4
Figure imgf000039_0002
Het.5 Het.6 Het.7
Figure imgf000039_0003
Het.8 Het.9 Het.1O Het.11
Figure imgf000039_0004
Het.12 Het.13
Figure imgf000040_0001
worin
R1 und R2 unabhängig voneinander für d-C6-Alkyl oder Ci-C6-Alkoxy-CrC6-alkyl stehen; und
R3 bis R9 unabhängig voneinander für Wasserstoff, CrC6-Alkyl, Ci-C6-AIkOXy o- der Ci-C6-Alkoxy-Ci-C6-alkyl stehen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei Het+ ausgewählt ist unter Imidazoliumionen der Formel Het.5, Pyrazoliumionen der Formel Het.6, Oxazoliumionen der Formel Het.7, 1 ,2,3-Triazoliumionen der Formeln Het.
8 oder Het.
9, 1 ,2,4-Triazoliumionen der Formel Het.1O und Thiazoliumionen der Formel Het.11.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei Ax" 1/X ausgewählt ist unter Halogeniden, Pseudohalogeniden, Perchlorat, den Säureanionen von C1-C6- Monocarbonsäuren und den Mono- oder Dianionen von C2-C6-Dicarbonsäuren, wobei die Mono- und Dicarbonsäuren einfach, zweifach oder dreifach mit Halogen und/oder Hydroxy substituiert sein können.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei Ax" 1/X ausgewählt ist unter Halogeniden und Pseudohalogeniden.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die chaotropische Flüssigkeit ausgewählt ist unter Lösungen von anorganischen Salzen in polar- aprotischen Lösungsmitteln.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , wobei die anorganischen Salze ausgewählt sind unter Alkalihalogeniden, Erdalkalihalogeniden, Ammoniumhalogeniden, Alkali- pseudohalogeniden, Erdalkalipseudohalogeniden, Ammoniumpseudohalo- geniden, Alkaliperchloraten, Erdalkaliperchloraten, Ammoniumperchloraten und Gemischen davon.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei das polar-aprotische Lösungsmittel ausgewählt ist unter Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Di- methylsulfoxid, Diethylamin und Gemischen davon.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das im Schritt (ii-a) oder (ii-b) eingesetzte flüssige Medium wässrig ist.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kanüle ein Bestandteil einer automatisierten Vorrichtung ist.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei einzelne oder alle Teile des Gerüsts mit auf lebende Zellen wirksamen Signal- oder Wachstumsfak- toren beschichtet oder dotiert werden.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gerüst in Schritt (ii-a) im Wesentlichen schichtweise aufgebaut wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Schichten des Gerüsts im Wesentlichen aus parallel verlaufenden Extrudatsträngen aufgebaut werden.
19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Schichten des Gerüsts im Wesentlichen aus Extrudatsträngen in Form von FASS-Kurven aufgebaut werden.
20. Verfahren nach nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Gerüst in Schritt (ii-a) im Wesentlichen aus einem Extrudatstrang in Form einer dreidimensionalen FASS-Kurve aufgebaut wird.
21. Polymergerüst, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.
22. Polymergerüst nach Anspruch 21 , welches an das Polymergerüst gebundene lebende Zellen enthält.
23. Verwendung eines Polymergerüsts nach einem der Ansprüche 21 oder 22 zur Herstellung eines Implantats zur Wiederherstellung, Veränderung oder Messung biologischer Funktionen.
24. Verwendung eines Polymergerüstes nach einem der Ansprüche 21 oder 22 in einem Bioreaktor.
25. Künstliches Gewebe, enthaltend ein Polymergerüst nach einem der Ansprüche 21 oder 22.
26. Verwendung eines künstlichen Gewebes nach Anspruch 25 zur Ex-vivo- und In- vitro-Diagnostik.
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