WO2007097341A1

WO2007097341A1 - 光合成サンプルの評価方法、光合成サンプルの評価システム及び光合成サンプルの評価プログラム

Info

Publication number: WO2007097341A1
Application number: PCT/JP2007/053103
Authority: WO
Inventors: Masakazu Katsumata; Ryosuke Mochizuki; Hiroshi Satozono; Kimiko Kazumura; Ayano Takeuchi
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2006-02-20
Filing date: 2007-02-20
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2008-08-20
Also published as: EP1998166A4; EP1998166B1; EP2315006A1; EP2315006B1; US20100159496A1; US8798931B2; EP1998166A1

Abstract

評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切かつ簡易に評価すること。光合成機能を有する光合成サンプルから発生する遅延発光の発光量の経時データに基づいて、前記光合成サンプルの状態を評価する光合成サンプルの評価方法であって、まず、経時データにおける複数の時間帯に対して特徴を示す特徴値を算出する。次に、特徴値を重み付けすることにより評価値を算出する。そして、評価値に基づいて光合成サンプルの状態を評価する

Description

明細書

光合成サンプルの評価方法、光合成サンプルの評価システム及び光合成サンプルの評価プログラム

技術分野

[0001] 本発明は、光合成サンプルの評価方法、光合成サンプルの評価システム及び光合成サンプルの評価プログラムに関するものである。

背景技術

[0002] 従来から、評価試料に含まれる光合成サンプルを評価する方法 (生物の生長等に影響を及ぼす環境要因 (例えば、化学物質)の影響の程度を評価する方法など)として、植物や藻類等の植物性の細胞の生長を用いて評価する化学物質生態リスク評価手法がある。この評価方法としては、化学物質生態リスク評価のためのノィォアツセィである藻類生長阻害試験が最も一般的である。藻類生長阻害試験は、経済協力開発機構 (OECD)のガイドラインに沿って進められている。藻類生長阻害試験は、化学物質を曝露した状態で藻類を 72時間培養し、生長阻害を測定することによりィ匕学物質の有害性を評価するものである。

[0003] 上記の藻類生長阻害試験は、生物の増殖能を試験対象とするため操作が煩雑になるとともに試験結果を得るまで 72時間という長時間を要する。これに対して、例えば特許文献 1に記載されて!ヽるように、藻類から発せられる遅延発光を計測することにより、化学物質の環境への影響を評価する方法がある。遅延発光とは、光合成機能を有する生物に対して光を照射した際に、当該光によるエネルギーにより光合成色素から蛍光発光が生じる現象である。この方法によれば、短時間で化学物質の環境への評価を行うことができる。

[0004] また、下記非特許文献 1及び 2には、遅延発光が、光合成電子伝達系の主要な反応である、光化学系 II、プラストキノンプール及び光化学系 Iから発光することを示すために、光合成電子伝達系の反応方程式から発光モデル式を導出することが記載されている。このモデル式は、複数の指数関数力も成る。これら非特許文献には、そのモデル式が実験結果に近!ヽ形状を示すことが開示されて！ヽる。 [0005] 更に、下記非特許文献 3にも、複数の指数関数から成る発光モデル式が記載されている。カロえて、そのモデル式に適当な係数を代入することで、実験結果と類似の変化が見られることが記載されて、る。

特許文献 1：国際公開第 2005Z062027号パンフレット

非特許文献 1 : Von G. KRETSCH and V. GERHARDT, "Numerical analysis of delaye dfluorescence Kinetics of algae," E. Schweizerbart ' sche Verlagsbuchhandlung,1987, 29, p.47-54

非特許文献 2 : Hans KRAUSE, Gerd KRETSCH, and Volkmar GERHARDT, "DIFFE RENTIALEQUATIONS FOR DELAYED FLUORESCENCE KINETICS IN LIVING P LANTb, Journal ofLuminescence, Elsevier Science Publishers B.V., 1984, 31 & 32( 1984),p.885-887

非特許文献 3 : Werner Schmidt and Horst Senger, "Long-term delayed luminescence in Scenedesmus obliquus II Influenceof exogeneous factors, Biochimica etBiophysic a Acta, Elsevier Science Publishers, 1987, 891(1987), p.22-27

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 特許文献 1に記載された方法では、藻類等の光合成機能を有する植物性サンプルをィ匕学物質に曝露して、当該植物性サンプル力も発生する遅延発光の発光量の時間変化を計測する。その減衰曲線の形状及び特徴点に注目し、化学物質の曝露による変化を評価することで化学物質の環境への評価を行う。この評価方法の場合、 ( 検査者による)減衰曲線の変化の特徴点の設定が重要であるが、特徴点の設定は任意のため無限の可能性がある。特徴点の設定が十分でな、場合や適切でな!、場合には、その変化を検出することができな力た。また、特徴点を増やせば評価要素が多くなり、解析が煩雑になっていた。そこで、より適切かつ簡易に化学物質の環境への影響を評価できる方法が求められていたが、上記日特許文献 1〜3に記載の手法を用いても、その要求に応えることはできない。

[0007] 本発明は、以上の問題点を解決するために、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切かつ簡易に評価することができる光合成サンプルの評価方法、光合成サンプルの評価システム及び光合成サンプルの評価プログラムを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明の光合成サンプルの評価方法は、光合成機能を有する光合成サンプルから発生する遅延発光の発光量の経時データに基づ!/、て、光合成サンプルの状態を評価する光合成サンプルの評価方法であって、経時データにおける複数の時間帯に対して特徴を示す特徴値を算出する特徴値算出ステップと、特徴値を重み付けすることにより評価値を算出する評価値算出ステップと、評価値に基づいて光合成サンプルの状態を評価する評価ステップとを備えることを特徴とする。

[0009] また、本発明の光合成サンプルの評価システムは、光合成機能を有する光合成サンプルカ発生する遅延発光の発光量の経時データに基づ、て、光合成サンプルの状態を評価する光合成サンプルの評価システムであって、経時データにおける複数の時間帯に対して特徴を示す特徴値を算出する特徴値算出手段と、特徴値を重み付けすることにより評価値を算出する評価値算出手段と、評価値に基づいて光合成サンプルの状態を評価する評価手段とを備えることを特徴とする。

[0010] また、光合成サンプルの評価プログラムは、コンピュータに、光合成機能を有する光合成サンプルから発生する遅延発光の発光量の経時データに基づ、て、光合成サンプルの状態を評価させるための光合成サンプルの評価プログラムであって、経時データにおける複数の時間帯に対して特徴を示す特徴値を算出する特徴値算出処理と、特徴値を重み付けすることにより評価値を算出する評価値算出処理と、評価値に基づいて光合成サンプルの状態を評価する評価処理とを実行させることを特徴とする。

[0011] このような光合成サンプルの評価方法、光合成サンプルの評価システム及び光合成サンプルの評価プログラムによれば、光合成サンプルから発生する遅延発光の発光量の経時データにおける複数の時間帯に対して特徴を示す特徴値が算出され、算出された特徴値が重み付けされる。そして、算出された評価値に基づいて光合成サンプルの状態が評価される。これにより、評価に有効な特徴値のみを採用することが可能になり、その結果、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切かつ簡易に評価することができる。

[0012] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、特徴値算出ステップは、経時データが、予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように、当該複数の関数の係数値を特徴値として決定するフィッティングステップを含み、評価値算出ステップでは、フィッティングステップにお、て決定された係数値に基づ、て評価値を算出する、ことが好ましい。

[0013] また、本発明の光合成サンプルの評価システムでは、特徴値算出手段は、経時データが、予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように、当該複数の関数の係数値を特徴値として決定するフィッティング手段を含み、評価値算出手段は、フィッティング手段により決定された係数値に基づいて評価値を算出する、ことが好ましい。

[0014] また、本発明の光合成サンプルの評価プログラムでは、特徴値算出処理は、経時データが、予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように、当該複数の関数の係数値を特徴値として決定するフィッティング処理を含み、評価値算出処理は、フィッティング処理により決定された係数値に基づいて評価値を算出する、ことが好ましい。

[0015] これらの場合、予め設定された複数の関数の和が遅延発光の発光量の経時データにフィッティングするように決定された、当該関数の係数値に基づ、て評価が行われる。従って、上記の関数に従った客観的かつ機械的な評価が可能となる。また、遅延発光の発光量の経時データを、複数の関数の和にフィッティングさせているので、遅延発光のメカニズムに基づいた評価が可能である。即ち、本発明に係る光合成サンプルの評価方法によれば、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切かつ簡易に評価することができる。

[0016] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、評価値算出ステップにおいて算出される評価値が、複数の関数のうち少なくとも 1つの関数の係数値に基づ、て算出される面積値であることが好ましい。この構成によれば、より簡易に評価を行うことができる。

[0017] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、関数が、山型の関数であることが好ましい。この構成によれば、更に遅延発光のメカニズムに近いフィッティングが可能となるので、更に適切な評価を行うことができる。

[0018] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、関数が、ローレンツ関数であることが好ましい。この構成〖こよれば、当該具体的な評価基準で確実に評価を行うことができる

[0019] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、 a , b , c (i= l, 2, 3)を複数の関数の係数値、 tを基準時刻からの経過時間を示す変数としたときに、複数の関数が、それぞれ、

[数 1]

であることが好ましい。この構成によれば、当該具体的な評価基準で確実に評価を行うことができる。

[0020] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、評価値算出ステップおいて算出される評価値が、複数の関数うち少なくとも 2以上の関数の係数を含む演算式に基づいて算出されることが好ましい。この構成によれば、遅延発光のメカニズムを考慮した評価を行うことができる。

[0021] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、 a , b , c (i= l, 2, 3)を複数

の関数の係数値、 tを基準時刻からの経過時間を示す変数とし、 b < b < bとしたと

1 2 3 きに、複数の関数が、それぞれ、

[数 2]

10 I ) lQ ^+a2 ^hl ) 1 (J ^{l + a}3 3 ) であり、

m (j = l 9)を定数としたとき、評価値が、演算式

[数 3] 評価値 =

· x m₉ - Cj ) により算出されることが好ましい。この構成によれば、当該具体的な評価基準で確実に評価を行うことができる。 [0022] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、光合成サンプルから発生する遅延発光の経時的な発光量を計測して、当該計測データを経時データとする計測ステップを更に含むことが好ましい。

[0023] また、本発明の光合成サンプルの評価システムでは、光合成サンプルから発生する遅延発光の経時的な発光量を計測して、当該計測データを経時データとする計測手段を更に含むことが好まし、。

[0024] また、本発明の光合成サンプルの評価プログラムでは、光合成サンプルから発生する遅延発光の経時的な発光量を計測して、計測されたデータを経時データとする計測処理を更に含むことが好ま、。

[0025] これらの構成によれば、実測データ力も評価を行うことができ、より適切な評価を行うことができる。

[0026] 本発明の光合成サンプルの評価システムでは、光合成サンプルに対して、照射条件を変更して励起光を照射するよう光源を制御する光源制御手段を更に含むことが好ましい。この場合、システム内で光源を制御することで、照射条件をより簡易に変更することができる。

[0027] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、計測ステップは、光合成サンプルに第 1の励起光を所定の第 1の照射条件で照射する第 1励起ステップと、第 1励起ステツプの後、光合成サンプルに第 2の励起光を第 1の照射条件と比較して光エネルギー積算値が小さい第 2の照射条件で照射する第 2励起ステップと、を備え、特徴値算出ステップでは、第 2励起ステップの後に得られた経時データに基づ!/、て特徴値が算出される、ことが好ましい。

[0028] また、本発明の光合成サンプルの評価プログラムでは、計測処理は、光合成サンプルに第 1の励起光を所定の第 1の照射条件で照射する第 1励起処理と、第 1励起処理の後、光合成サンプルに第 2の励起光を第 1の照射条件と比較して光エネルギー積算値が小さい第 2の照射条件で照射する第 2励起処理と、を実行し、特徴値算出処理は、第 2励起処理の後に得られた経時データに基づいて特徴値を算出する、ことが好ましい。

[0029] これらの場合、評価試料に対して、まず、第 1の励起光が照射される。その後、この評価試料に、第 1の励起光よりもエネルギー積算値が小さくなるように設定された照射条件で第 2の励起光が照射される。そして、第 2の励起光の照射が終了すると、評価試料からの遅延発光の発光量が測定される。そのため、遅延発光の発光量の測定条件を一定にすることが可能となり、その結果、遅延発光の発光量をより精度高く測定することができる。なお、エネルギー積算値とは、光合成サンプルにとっての光エネルギー積算値のことを!、う。

[0030] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、測定ステップでは、第 2の照射条件を変更して、発光量を複数回繰り返し測定することにより、複数の経時データを取得することが好ましい。

[0031] また、本発明の光合成サンプルの評価プログラムでは、計測処理では、第 2の照射条件を変更して、発光量を複数回繰り返し測定することにより、複数の経時データを取得することが好ましい。

[0032] これらの場合、第 1の励起光の照射から遅延発光の発光量の測定までの処理は、第 2の照射条件を変更しながら複数回繰り返される。そして、測定された各発光量に対応した評価値が導出され、この評価値に基づいて評価試料が評価される。このように、比較的短い時間内で第 2の照射条件を変更しながら遅延発光の発光量の測定を複数回行うことで、外的要因に影響されることなぐ評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することが可能となる。

[0033] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、第 2の照射条件は、第 1の励起光の照射終了時力も第 2の励起光の照射開始時までの待機時間であることが好ましい。

[0034] この場合、第 2の励起光の照射開始時期を変更して、第 1の励起光の照射から遅延発光の発光量の測定までの処理が行われる。第 2の励起光の照射をいつ開始する力 (待機時間をどのくらい設ける力ということは、光合成サンプルの酸化還元状態の変化と密接に関係する。そのため、第 2の励起光の照射開始時期を変更して得た遅延発光の発光量に基づ!、て評価値を導出することで、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することができる。また、第 2の照射条件を変更するためには、待機時間を変更すれば足り励起光自体を変える必要がな、ので、光合成サンプルの酸化還元状態が異なる状況を容易に設定することができる。 [0035] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、第 2の照射条件は、第 2の励起光の光量、波長、パルス幅及び照射時間のうち少なくとも一つであることが好ましい。

[0036] この場合、第 2の励起光の光量、波長、パルス幅及び照射時間のうち少なくとも一つを変更して、第 1の励起光の照射力遅延発光の発光量の測定までの処理が行われる。変更されるこれらの条件は、光合成サンプルの酸ィ匕還元状態の変化と密接に関係するものである。そのため、これらの要素のうち少なくとも一つを変更して得た遅延発光の発光量に基づ、て評価値を導出することで、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することができる。

[0037] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、評価ステップは、評価値算出ステップにおいて算出された評価値と当該評価値の参照データとを比較する比較ステップを含むことが好ましい。この構成によれば、評価に適した評価値を設定して、それを参照データと比較することにより、より明確に評価を行うことができる。

[0038] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、第 2の光合成サンプルから発生する遅延発光の経時的な発光量を計測して、当該計測データ力比較ステップにおける参照データを導出する参照データ生成ステップを更に含むことが好ましい。この構成によれば、参照データに関しても実測データ力も評価を行うことができ、更に適切な評価を行うことができる。

[0039] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、特徴値は、時間帯毎に積算した積算値であることが好ましい。

[0040] この場合、ある測定時間帯における遅延発光の発光量の積算値が算出され、その積算値に基づいて評価値が導出される。このような積算値を用いることで、遅延発光の発光量の経時変化に現れる、ある測定時間帯における光合成サンプルの酸ィ匕還元状態を簡易かつ適切に抽出することが可能となる。その結果、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能をより適切に評価することができる。また、測定時間帯を複数設け各測定時間帯の積算値を算出した場合には、遅延発光の発光量の経時変化を適切に把握することが可能となる。そのため、この複数の測定時間帯にわたる経時変化を利用して、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することができる。 [0041] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、評価ステップでは、光合成サンプルに供された環境要因を評価することが好ま U、。

[0042] また、本発明の光合成サンプルの評価システムでは、評価手段は、光合成サンプルに供された環境要因を評価することが好ま、。

[0043] また、本発明の光合成サンプルの評価プログラムでは、評価処理は、光合成サンプルに供された環境要因を評価することが好ま、。

[0044] これらの場合、環境要因が評価試料中の光合成サンプルに与える影響を適切に評価することができる。

[0045] 本発明の光合成サンプルの評価方法では、環境要因が、植物性細胞の生長阻害物質であることが好ましい。この構成によれば、植物性細胞の生長阻害物質に対して、生長の阻害度合等の有害度を評価することができる。

発明の効果

[0046] 本発明によれば、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切かつ簡易に評価することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0047] (第 1実施形態）

以下、図面とともに、本発明の第 1実施形態を詳細に説明する。本実施形態では、本発明に係る光合成サンプルの評価方法、評価システム及び評価プログラムの一実施態様として、環境要因の評価方法、評価システム及び評価プログラムについて説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。

[0048] 本発明は、評価対象の環境要因に曝露された光合成機能を有する植物性サンプルから発生する遅延発光の発光量の経時データに基づ、て、環境要因の環境への影響を評価するものである。環境要因としては、主に、生物の生育に対して影響を与え得る物質を評価対象とする。例えば、評価対象物質を含むと推定される河川水、井戸水、工場排出物などが挙げられる。遅延発光は以下のようにして生じる。つまり、光合成機能を有する生物に対して光を照射した際の反応において、同化色素 (光合成色素）に吸収された光エネルギーが電子伝達経路により化学的エネルギーとして生物反応中に伝達される。その伝達過程で、化学エネルギーの一部が逆反応を起こし、光合成色素がその化学エネルギーにより再励起される。このようにして再励起された光合成色素から蛍光発光が生じる。この蛍光発光が遅延発光とされる。なお、遅延発光は、遅延蛍光と呼ばれることもあり以下総称して遅延発光とする。

[0049] まず、本発明に係る環境要因の評価方法の理論的背景について説明する。なお、以下に示す理論的背景は、本願発明者の鋭意研究により得られたものであり、本願にお!/、て初めて開示されるものである。

[0050] 環境要因の 1つである化学物質を曝露した藻類の遅延発光の発光量の時間変化を解析した結果、遅延発光は、異なるエネルギーに由来するフオトンが、異なるタイミングで重複して発光しているという結果が得られた。更に、これらの異なるエネルギー源は、藻類の代謝における化学反応の影響によりその関係が変化することが判った。異なるエネルギー源は、藻類の代謝における化学反応の中心 (光化学系、プラストキノンプール等の電子貯蔵部)であると推測される。

[0051] このことを、遅延発光のメカニズムを示す図 1を用いて説明する。藻類は、光を受けて光合成代謝を行い、細胞を生長させる。光合成反応では、光合成色素により吸収された光エネルギーが、複数の化学反応により伝達され細胞生長に必要なエネルギ一に変換される。その過程で、図 1に示すように酵素発生、光一化学エネルギー変換、及び C02吸収等の遅延発光のエネルギー源となる反応が順次発生する。これらによるフオトンの発光が異なるタイミングで発生し、それらの発光の和が藻類全体の遅延発光として、計測される。

[0052] これらのフオトンの発光各々を関数として表し、遅延発光 (全体)の発光量の時間変化をそれらの関数の和としてフィッティングできることが判った。フィッティングは、後述するように係数値を変数とした関数を予め設定しておき、係数値を決定することにより行う。このことにより、一見複雑な遅延発光の計測結果を、フィッティングした関数の係数値として簡略ィ匕して表現することが可能になる。フィッティングには複数の関数の和となるものを用いる。関数の数を増やすほど正確にフィッティングすることができる。

[0053] また、フィッティングするための関数としては、山型の関数を用いることが好ましい。

山型の関数とは、形状が山型になる関数のことで、所定の変数値において関数値が最大値となり、当該所定の変数値以下の変数値では単調非減少、当該所定の変数値以上の変数値では単調非増加な関数である。具体的には、ローレンツ関数 (コーシー分布)、二次関数、正規分布関数等により構成することができる。図 1に示すように、各々のエネルギー源に対応した遅延発光の発光量の時間変化が山型になっており、それに対応し、より正確なフィッティングが可能になるからである。より正確なフィッティングは、より正確な評価を可能にする。なお、山型の関数の頂点力時間軸にお!、て 0以下になる場合、指数関数や対数関数等の単調非増加な関数で代替することとしてもよい。本実施形態では、このような関数も山型の関数に含まれる（最大値をとる変数値が—∞の山型の関数と解釈できる)。

[0054] 遅延発光の発光量の時間変化をフィッティングするために必要な複数の関数は、最大値の現れる順に左から 1番目、 2番目…と識別することができる。図 1にもあるように、最大値の現れる順が遅くなる（時間軸上の値が大きくなる）につれ、そのフオトン成分は細胞力放出されるタイミングが遅くなつていることを表し、細胞中でより進んだ代謝反応に由来すると考えられる。

[0055] 有害な環境要因が藻類に作用すると細胞内の代謝が変化し、遅延発光の発光量の時間変化が、環境要因が作用しない場合と比較して異なるものとなる。植物性サンプルに有害な環境要因を曝露しない場合とした場合の遅延発光の発光量の変化を、図 2に示す。図 2 (a)、（b)は、それぞれ環境要因として無機水銀及び除草剤を用いた場合の遅延発光の時間変化を示したグラフである。これらに示すように、環境要因は遅延発光に影響を及ぼし、また、環境要因ごとに遅延発光に対する影響は異なる

[0056] 図 2 (a)及び (b)にそれぞれ対応する、模式的なグラフを図 2 (c)及び (d)に示す。

図 2 (c)及び (d)に示すグラフでは、発光量をエネルギー源ごとに表して、る（グラフにおける一つの山が一つのエネルギー源に対応している）。これらに示すように、環境要因の影響は、エネルギー源それぞれに異なって及ぼされる。その発光量の変化としてフィッティングした各関数の係数値が変化する。このうち、環境要因により藻類の生長が阻害される場合は、主として 2番目以降の関数の係数値に変化が現れる。このことから、細胞生長は代謝の中でもより進んだ反応に関連するため、最大値の現れる順が遅い関数に注目することにより、評価することができると考えられる。

[0057] 遅延発光に含まれるフオトンは、図 1に示すようにその発生源に相互作用があるため、異なる関数の関係を評価することにより、より正確に代謝の状態を知ることができる。この為、異なる関数の係数値を演算した演算値を用いると、細胞内の情報を評価する上で役に立つ。詳細には後述する。

[0058] なお、遅延発光の発光量を関数にフィッティングする方法は、例えば、 Journal of Ph otocnemistry ana Photobiology B:

Biology 78 (2005)235-244 Further analysis of delayed luminescence of plantsに載されている。し力しながら、この文献に記載された方法は、本発明のように複数の関数にフィッティングさせるものではなぐ一つの関数にフィッティングさせるものである。一つの関数では、図 1に示すような複数のエネルギー源が存在するような、遅延発光の発光量の時間変化を正確にフィッティングすることができない。即ち、上記の従来技術の方法では、正確な評価を行うことが難しい。以上が、本発明の理論的背景である。

[0059] 引き続き、本実施形態に係る環境要因の評価方法及び評価システムを説明する。

図 3に、本実施形態に係る当該評価システム 1の構成を示す。図 3に示すように、本実施形態に係る環境要因の評価システム 1は、計測装置 10と、評価装置 12と、制御装置 14とを備えて構成される。計測装置 10と評価装置 12とは、ケーブルにより接続されており互いに情報の送受信を行うことが可能になっている。評価装置 12と制御装置 14とは、ケーブルにより接続されており互いに情報の送受信を行うことが可能になっている。また、計測装置 10と制御装置 14とは、評価装置 12を介して、互いに情報の送受信を行うことが可能になっている。

[0060] 計測装置 10は、光合成機能を有する植物性サンプル力も発生する遅延発光の経時的な発光量を計測する装置である。ここで、植物性サンプルには、評価対象の環境要因に曝露されたものを含む。計測装置 10は、計測した遅延発光の発光量の経時データを評価装置 12に入力する。なお、図 3に示す計測装置 10は、計測装置 10 の断面を示したものである。計測装置 10の具体的な構成については後述する。

[0061] 評価装置 12は、計測装置 10からの遅延発光の発光量の経時データの入力を受け付けて、当該経時データに基づ、て環境要因の環境への影響を評価するものである。ここで、環境への影響は、具体的には例えば、藻類の生長に対する阻害の影響等である。評価装置 12は、具体的には PC (Personal

Computer)等が相当し、 CPU (Central Processing Unit)やメモリ等のハードウェアにより構成されている。評価装置 12は、これらのハードウェアの構成要素がプログラム等により動作することにより、後述する各機能が発揮される。なお、図 3に示す評価装置 12は、評価装置 12の機能を示したものである。

[0062] 制御装置 14は、 CPU (Central Processing Unit)やメモリ等のハードウェアを備えており、計測装置 10に対して制御信号を送信して計測装置 10の動作の制御を行う。続いて、計測装置 10と評価装置 12とをより詳細に説明する。

[0063] 図 3に示すように、計測装置 10は、設置部 16と、光源 18と、光検出器 20と、フィルタ 22と、集光光学系 24と、シャツタ 26とを備えている。また、計測装置 10は、筐体 28 を有しており、当該筐体 28内に上記の各構成要素が配置されている。筐体 28は、内部に光が入り込まなヽように、それ自体が光を遮断する遮光部材で形成されてヽる力光を遮断する塗料等を塗布した部材で形成される。筐体 28は、その一端に導入口 30が形成された本体部 32と、当該導入口 30を閉塞することが可能な蓋部 34とからなる。蓋部 34の開閉は、制御装置 14により監視 '制御されており、シャツタ 26が開いた状況にあっては、光センサ 20に筐体 28の外部からの光が入射しないように、蓋部 34は開閉できな!/、ようにロックされる。

[0064] 設置部 16は、計測対象の環境要因及び植物性サンプル (例えば、化学物質及び植物性サンプルが含まれる溶液)を入れた容器を設置するためのものである。設置部 16は、上記の導入口 30から容器を設置することができる位置に設けられる。設置部 16は、例えば、容器固定用の固定爪を有し、この固定爪で容器を固定する。

[0065] 光源 18は、遅延発光を発生させるために、設置部 16に設置された容器中の植物性サンプルに所定波長の光を照射するものであり、植物性サンプルに対し光が照射できる位置及び方向に設けられる。光源 18から照射される光の波長は、 280ηπ！〜 8 OOnmである。ここで、光源は、単色光源であっても、複数の光源を組み合わせたものであってもよい。光源 18からの光の照射は、任意の所定時間連続させてもよいし、任意のパターンでパルス点灯させてもよい。また、同一又は異なる波長特性を有する複数の光源を順番に発光させたり、複数の光源を同時に発光させたりしてもよい。光源 18による光の照射は、制御装置 14により制御される。

[0066] 光検出器 20は、光源 18から光が照射されたことにより、植物性サンプル力も発生する遅延発光の発光量を計測するものである。光検出器 20は、遅延発光を検知する光センサ 20aと、光センサ 20aが検知して出力する信号に基づ、て遅延発光の発光量を算出して出力する遅延発光量算出部 20bとを有している。光検出器 20は、遅延発光が検出することができる位置及び方向に設けられる。光検出器 20は、具体的には、光電子増倍管ゃフオトンカウンタ等により構成される。遅延発光量算出部 20bから逐次、出力される発光量の情報は経時データとして、評価装置 12に入力される。

[0067] フィルタ 22と、集光光学系 24と、シャツタ 26とは、設置部 16と光検出器 20との間に、設置部 16側カゝら順番に設けられている。フィルタ 22は、筐体 28の内壁面に接するように設けられ遅延発光を透過するものである。集光光学系 24は、微弱な遅延発光を集光、反射及び透過して、光検出器 20に入力させるものである。シャツタ 26は、開閉自在にされており、閉じているときには遅延発光を遮断するようになっている。必要なときのみ、光検出器 20により遅延発光が検出されるようにするためである。シャツタ 26の開閉は、制御装置 14により制御される。以上が、計測装置 10の構成である。

[0068] 図 3に示すように、評価装置 12は、受付部 36と、フィッティング部 38と、評価部 40と、出力部 42とを備えている。受付部 36は、植物性サンプル力も発生する遅延発光の発光量の経時データの入力を受け付ける受付手段である。当該入力は、計測装置 1 0 (の遅延発光量算出部 20b)力もの入力である。ここで、発光量の経時データは、植物性サンプルが評価対象の環境要因に曝露されたもの (評価対象の化学物質が溶液に含まれるもの）と曝露されてヽなヽもの (評価対象の化学物質が溶液に含まれていないもの）との両方のデータが入力される。受け付けられたデータは、フイツティング部 38に送信される。

[0069] フィッティング部 38は、受付部 36により入力が受け付けられた経時データ力予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように、当該複数の関数の係数値を決定するフィッティング手段である。フィッティング部 38には、関数の情報を予め記憶させておく。関数としては、上述したように山型の関数を用いることが好ましい。複数の関数としては、具体的には例えば、 ai, bi, ci (i= l, 2, 3)を複数の関数の係数値、 tを基準時刻からの経過時間 (励起後時間）を示す変数としたときに、それぞれ画

A

1 (J ¹ 、 Q - 10 のようなローレンツ関数 (コーシ一分布）を用いることが好まし、。フィッティングに用いる複数の関数の和としては、

[数 5] ( )= io¹⁺。'"⁾² + ιο¹⁺ (' + 10^ι+α"'— ' ...(1)

となる。ここで、 tの基準時刻としては例えば、光源 18からの光の照射が終了した時刻力も予め設定した所定の時間が経過した時刻とする。図 4に示したように、上記の各関数における、 aiは時間方向への広がり、 biは発光量が最大値を取る t (励起後時間 )、 ciは最大値の極大値に影響する。なお、式（1)において右辺の第 1項、第 2項、第 3項を、それぞれ時間軸上で最大値の現れる順番で、第 1関数、第 2関数、第 3関数というように表す。即ち、複数の関数の係数において、 bl < b2く b3の関係が成立する。上記のように 3つの関数の和とするのは、図 1等に示すように、異なる 3つのフォトンのエネルギー源となる反応が存在すると考えられる力もである。なお、フオトンのェネルギ一源となる反応が 3つ以外になるような場合は、それに合わせた数にするのがよい。また、フィッティングに用いる複数の関数は、上記の関数以外でも、二次関数、正規分布関数等の山型の関数を用いてもょ、。

但し、山型の関数を用いなくても、よくフィッティングする関数であれば、その関数を用いることとしてもよい。例えば式（1)の関数に更に係数 di (i= l, 2, 3)を加えた、以下の式で表される関数を用いてもよ!ヽ。

[数 6]

このように係数を増加させることにより、フィッティングの自由度を広げることができる。 [0071] また、フィッティング部 38には、フィッティングを行うためのアルゴリズムについても予め記憶させておく。フィッティングのアルゴリズムとしては、具体的には、非線形解析法の一種であるシンプレックス法や、 Gauss- Newton法、 Davidon

Fletcher Powell法、 Brent法等、モンテカルロ法及びシミュレ一テッド 'アニーリング法等を用いることができる。なお、フィッティングの条件は、植物性サンプルの種類や計測条件に合わせて設定することもできる。フィッティング部 38で決定された係数値は、評価部 40に送信される。

[0072] 評価部 40は、フィッティング部 38により決定された係数値に基づいて、環境要因の環境への影響を評価する評価手段である。ここでの評価は、具体的には影響の度合 (有害性)を数値ィ匕したり、当該数値化された値を用いて有害か無害力の判定を行つたりすることである。

[0073] 図 3に示すように、評価部 40は、上記の評価を行うために評価値算出部 44と、比較部 46とを含む。評価値算出部 44は、フィッティング部 38により決定された係数値から影響を評価するための評価値を算出する評価値算出手段である。評価値の算出は、例えば、評価値算出部 44が予め記憶している評価値を算出するための式に基づいて行われる。

[0074] 上述したように、遅延発光の原因となるフォトンは、その発生源が複数でありそれらの間に相互作用があるため、異なる関数の関係を評価することにより、より正確に代謝の状態を知ることができる。このため、異なる関数の係数値力算出した評価値を用いると、細胞内の情報を評価する上で役に立つ。評価値は、具体的には、演算式 [数 7] ィ面ィ ϊ££" = (i m · a₃ x mつ · b₃ m^ - c^ )/(m_A - a₂ x m= ' b₂ x m c₂ ))/ (?w， · x m^■ x m₉ · c ) - - - iz) に基づいて導出されることが好ましい。ここで mj (j = l〜9)は、予めあるいは評価処理において適宜、設定される定数である。図 5に示すように、フオトンのエネルギー源の相互作用を表現したものであるからである。このように、算出される評価値は、複数の関数うち少なくとも 2以上の関数の係数を含む演算式に基づいて算出されることが好ましい。関数により表される、フオトンのエネルギー源の相互作用を考慮した評価が可能となるからである。なお、評価値は必ずしも演算式に基づいて演算されたものでなくてもよぐ係数値そのものを評価値とすることとしてもよい。

[0075] 比較部 46は、評価値算出部 44により算出された評価値と当該評価値の基準データとを比較する比較手段である。ここで、基準データとは、例えば、評価対象の環境要因に曝露されて、な、植物性サンプルからの遅延発光に基づ!/、て、上記の各処理により導出されたデータである。評価部 40は、比較部 46による比較結果に基づいて、評価を行う。具体的には後述する。評価結果の情報は出力部 42に送信される。

[0076] 出力部 42は、評価部 40による評価の情報を出力する出力手段である。具体的には、例えば、評価装置 12が備えるディスプレイへの出力を行う。出力部 42による出力により、ユーザは評価内容を確認することができる。出力部 42による出力は、上記のような画面出力に限られず、例えば別の装置への出力であってもよい。

[0077] 引き続いて、図 6及び 7のフローチャートを用いて、本実施形態に係る環境要因の評価方法 (環境要因の評価システム 1にお、て実行される処理)を、環境要因の 1つである化学物質を例示しながら説明する。

[0078] まず、評価対象の化学物質と、遅延発光を発生させるための植物性サンプルとを含む溶液である試料 (以下、曝露試料と呼ぶ)を調製する（SO 1、試料調製ステップ）。調製は具体的には、以下のように行われる。

[0079] 植物性サンプルを用意する（SOla)。植物性サンプルとしては、例えば、藍藻 Spirul ina platensis- 緑藻 Psudokircneneriella

subcapitata等の藻類を用いることが好ましい。吸光度を調整するため、植物性サンプルは、 685nmの波長の光の吸光度（OD685)を 1にしておく等、予め定めた吸光度にした懸濁液にしておく。また、評価対象の化学物質を用意する（S01b)。評価対象となる化学物質としては、例えば、除草剤シマジン (CAT)や無機水銀等の植物性細胞の生長阻害物質を用いる。これらの化学物質は、試料を調製しやすいように、藻類培養液体培地 (C培地）に含ませておく。これら用意した植物性サンプルと化学物質とを混合させ、試料を調製する（SOlc)。例えば、上記の懸濁液 0. 5mlに対して、化学物質が含まれる藻類培養液体培地 2mlを混合することにより、 OD685 = 0. 2の曝露試料を得ることができる。なお、試料の調製には、必ずしも本実施形態に係る化学物質の評価システム 1を用いる必要はな、が、上記の処理を行う機構を評価システム 1に備えさせておき自動的に行わせてもよ、。

[0080] 続、て、調整された曝露試料に遅延発光を発生させ、化学物質の評価システム 1 の計測装置 10を用いて当該遅延発光の経時的な発光量を計測する（S02、計測ステツプ)。計測は具体的には、以下のように行われる。

[0081] 調整された曝露試料を、計測装置 10の中又は外において、光条件及び温度が所定の条件に管理された環境で一定時間待機させる（S02a)。この待機は、化学物質を植物性サンプルに作用させるため、また、植物性サンプルと化学物質とを混合することによる条件の変化、例えば光環境や細胞密度の変化などに植物性サンプルを適応させるためである。待機の条件としては、具体的には例えば、光量 5 /ζ πιο1·πι—2 • s— 1の白色蛍光灯下で 15分間等であることが好ま、。

[0082] 続いて、待機させた曝露試料を、計測装置 10の中の設置部 16に配置して、光源 1 8からの光の照射を行う（S02b)。上述したように当該光の照射は、植物性サンプルに光合成を行わせるための光であり、植物性サンプルが光合成可能なスペクトルを含む必要がある。具体的には、例えば、約 300 /z mol'm— 2' s— 1の赤色光（波長： 660nm)を 10秒照射する。なお、光を照射する時間は、予め設定しておく。また、光の照射を行っている間は、計測装置 10の蓋部 34及びシャツタ 26を閉じた状態にして、外部力もの光が入り込まないようにしておく。

[0083] 予め設定された照射する時間が経過したら、光源 18による発光を停止させ (S02c) 、シャツタ 26を開く（S02d)。光が照射された曝露試料からは遅延発光が発生する。集光光学系 24は、曝露試料力様々な方向に放出される遅延発光を、集光、反射及び透過により光検出器 20に入射するように導く。光検出器 20は、集光光学系 24 により入射された遅延発光の発光量を計測する（S02e)。計測は、予め設定された時間の間連続的に行われ、経時的な発光量が計測される。具体的には、例えば、 0 . 1秒間隔で 50秒間、発光量が計測される。なお、光検出器 20は、光源 18から光が照射されて、る間は、シャツタ 26及び筐体 28により外部力も光が入射しな、ように保護されている。

[0084] 予め設定された計測する時間が経過したら、シャツタ 26が閉じられ (S02f)、光検出器 20による計測が終了する。計測装置 10 (に備えられる光検出器 20の遅延発光量算出部 20b)から、遅延発光の計測データを評価装置 12に入力する（S02g)。入力される評価データは、例えば、励起後時間の情報と発光量の情報とが対応付けられたものである。グラフに表すと、例えば、図 10に示すようなものとなる。

[0085] 遅延発光の発光量の経時データである計測データが入力された評価装置 12では、受付部 36が当該入力を受け付ける（S03 (S03a)、受付ステップ)。入力された遅延発光の発光量の経時データは、フィッティング部 38に送信される。

[0086] 続いて、評価装置 12では、フィッティング部 38が、入力された遅延発光の発光量の経時データが、複数の関数の和としてフィッティングするように、当該複数の関数の係数値を決定する（S04、フィッティングステップ)。フィッティングは具体的には、以下のように行われる。

[0087] まず、フィッティング部 38は、フィッティングの条件を設定する（S04a)。フイツティングの条件の設定とは具体的には、例えば、フィッティングに用いる関数の種類を決定すること、関数の係数値の一部を予め設定した固定値に設定（固定されていない係数値は、フィッティングステップにおいて決定される）すること、後述するフィッティング終了条件で用いる誤差の許容範囲を設定すること等である。この設定は、計測に用 Vヽた植物性サンプルの種類や計測条件に合わせて行われることが好まヽ。条件の設定は、ユーザにより予め入力された情報に基づいて行われてもよいし、予めフイツティング部 38が保持して!/、るルールに基づ、て行われてもよ!/、。

[0088] 続!、て、フィッティング部 38は、フィッティングを行う（S04b)。フィッティングは、関数の変数値が励起後時間に、関数値が発光量にそれぞれ対応するように行われる。また、フィッティングは、フィッティング部 38が予め記憶しているアルゴリズムに基づいて行われる。このフィッティングにより、各関数の係数値が決定される。例えば、上記の式（1)で表される関数を用いた場合は、 ai, bi, ci(i= l, 2, 3)のそれぞれの値が決定される。

[0089] 続いて、フィッティング部 38は、フィッティング結果がフィッティング終了条件を満たしている力否かの判定を行う（S04c)。フィッティング終了条件としては、例えば、フィッティング結果と計測結果との間の誤差が所定の許容範囲内にあること、係数値及び係数値同士の関係が所定の許容範囲内にあること等である。フィッティング終了条件を満たしていた場合、フィッティングを終了し、決定した関数値を含むフィッティングに関する情報が評価部 40に送信される。フィッティング終了条件を満たして、な！/、場合は、改めてフィッティングの条件を設定して（S04a)、再度フィッティングを実行する (S04b)。

[0090] 続いて、評価装置 12では、評価部 40に含まれる評価値算出部 44が、フイツティング部 38により決定された係数値から、化学物質の環境への影響を評価するための評価値を算出する（S05、評価値算出ステップ、評価ステップ)。評価値には、係数値の一部又は全部を評価値として使用するものと、係数値を所定の演算式に基づいて演算すること〖こより得られるものと、係数値に基づいて算出された、関数の面積値を評価値として使用するものとの少なくとも 1つを含む。ここで、関数の面積値とは、関数のグラフにお、て、関数値と例えば変数の軸 (本実施形態にぉ、ては時間軸)等の基準軸とにより囲まれる領域 (変数の範囲が設定されて、てもよ、）の面積値である。本実施形態においては、関数値は発光量であり、変数の軸は時間軸である。なお、どのような値を評価値として用いるかは、予め設定されて、る。

[0091] 係数値を評価値として使用する場合は、係数値が評価値として記録される (S05a) 。一方、演算値を評価値として使用する場合は、評価値算出部 44は、まず、演算条件の設定を行う（S05b)。演算条件は、例えば、演算に用いる演算式等である。演算条件の設定は、計測に用いた植物性サンプルの種類や計測条件に基づいて行われることが好ましい。続いて、評価値算出部 44は、設定された演算条件に基づいて演算を行い、演算値を算出する (S05c)。演算値は評価値として、評価値算出部 44により記録される（S05d)。

[0092] また、面積値を評価値して使用する場合は、まず面積値を算出する関数及び面積値を算出する時間（t)の範囲を設定する（S05b' )。ここで、面積値はフィッティングに用、る関数の全ての関数にっ、て算出しても良、し、少なくとも 1つの関数を選択して算出しても良い。関数の選択は、計測に用いた植物性サンプルの種類や計測条件に基づいて行われることが好ましい。より具体的には、面積値を算出する関数は、時間軸上で最大値の現れる順番に基づ、て選択されても良、し、また発光量に基づいて関数を選択するようにしても良い。例えば、時間軸上で最大値の現れる順番に基づいて関数を選択する場合、順番が最も遅いものが好ましい。また、別の選択方法として、下記する基準データと比較して、係数値、評価値等の変化量が最も大きくなる関数を選択しても良い。面積を算出する時間 (t)の範囲の設定については、計測に用いた植物性サンプルの種類や計測条件に基づ、て行われることが好まし、。より具体的には、時間 (t)の範囲は、遅延発光の計測時間の全範囲であることが好ましい。また、計測時間の全範囲から一部の時間範囲を選択する場合には、その関数の最大値力その半値幅に相当する時間範囲を選択することができる。さらに、計測時間の範囲内にその関数の最大値からの半値幅に相当する時間範囲が含まれていない場合、つまり、計測時間を超える範囲を選択する場合には、例えば、フイツティングした関数力半値幅に相当する時間範囲を推定し、その時間範囲を選択することができる。続いて、評価値算出部 44は、選択された関数について、その関数に関連付けられる係数値及び選択された時間 (t)の範囲に基づいて、その面積値を区分求積等により算出する（S05c' )。具体的には、式（1)における第 3関数に係数値 a3, b 3, c3の値を代入して、選択された時間 (t)の範囲について区分求積を行う。面積値は評価値として、評価値算出部 44により記録される（S05d' )。面積値による評価は、単に関数に係る面積値を算出するだけであるので、より簡易な評価を可能にする。

[0093] 続いて、評価装置 12では、評価部 40に含まれる比較部 46が、化学物質の環境への影響を評価するために、評価値算出部 44において算出された評価値と当該評価値の基準データとを比較する（S06、比較ステップ、評価ステップ)。基準データとは、化学物質の環境への評価を行うために上述のように算出された評価値の比較対象となりうるデータである。具体的には例えば、化学物質を含まない溶液に混入された光合成サンプル力発生する遅延発光の経時的な発光量を計測して、当該計測データカ導出されるデータである。

[0094] このステップまでに、別途、予め基準データを導出しておく（S10、基準データ生成ステップ）。基準データの生成は、上述した S01〜S05までのステップと同様に行われる。但し、 S01における試料の生成においては、評価対象の化学物質を試料に含まずに行う。なお、各ステップで設定される条件等は、評価対象の化学物質を含む場合に導出したものと同じものを用いる。

[0095] 評価値の比較は、以下のように行われる。比較部 46が、比較値の算出条件を設定する（S06a)。比較値とは、比較結果として算出される値のことであり、化学物質の環境への影響の評価に用いられる。比較値の算出条件は、例えば、算出に用いる演算式等である。算出式としては、例えば、基準データの評価値に対する曝露試料の計測データ力算出された評価値の比率や差分を求めるもの等を用いることができる。比較値の算出条件の設定は、計測に用いた植物性サンプルの種類や計測条件に基づ、て行われることが好まし!/、。

[0096] 続いて、比較部 46は、評価値算出部 44により記録された各評価値を読み出して、設定した条件に従い比較値を算出する（S06b)。算出された比較値は、比較部 46により記録される（S06c)。

[0097] 続いて、評価装置 12では、評価部 40が、上記の比較値に基づいて化学物質の環境への影響を評価する（S07、評価ステップ)。評価は具体的には、以下のように行われる。評価部 40は、評価条件を設定する（S07a)。評価条件は、具体的には評価に用いるルール等であり、計測に用いた植物性サンプルの種類や計測条件に基づいて行われることが好ましい。評価に用いるルールは、予め評価部 40が記憶している。

[0098] 続いて、評価部 40が、比較部 46により記録された比較値を読み出して、設定した条件に従い評価を行う（S07b)。評価は、具体的には例えば、予め用意された比較値を環境への影響に対応させた評価用のテーブルに比較値を照らし合わせて、環境への影響を、例えば生長阻害度等の数値として算出する等により行われる。また、予め閾値を設けておき、比較値が閾値を超えている力否かにより、化学物質の有害性を有害か無害かという二値的な評価をしてもよい。評価により得られた情報は出力部 42に送信される。

[0099] 出力部 42は、評価部 40における評価の情報を出力する（S08 (S08a)、出力ステップ)。出力は、上述したようにディスプレイ等により画面表示をすること等により行われる。出力は、例えば評価に係る数値を表にして出力してもよいし、有害の場合は〇 (マル)を表示し無害の場合は X (バッ)を表示することとしてもよい。また、数値をダラフ化したものを表示することとしてもよい。出力された評価の情報は、ユーザに適宜、参照される。

[0100] 上述したように本実施形態によれば、上記の関数に従った客観的かつ機械的な評価が可能となる。また、遅延発光の発光量の経時データを、複数の関数の和にフイツティングさせているので、遅延発光のメカニズムに基づいた評価が可能である。即ち

、本実施形態に係る環境要因の評価方法によれば、適切かつ簡易に環境要因の環境への影響の評価を行うことができる。

[0101] また、本実施形態のように、遅延発光を計測することとすれば、実測データに基づいて評価を行うことができるので、より適切な評価を行うことができる。但し、実測データが予め用意できている場合等は、必ずしも遅延発光を計測する必要はなぐ遅延発光の発光量の経時データの入力力行うこととしてもよい。

[0102] また、本実施形態のように、評価値を設定してそれらを基準データと比較して評価することとすれば、評価に適した評価値を設定することにより、より明確に評価を行うことができる。

[0103] また、本実施形態では触れては!、な、が、特許文献 1に記載されたように溶液の吸光度を測定して、吸光度を考慮した評価を行ってもよい。

[0104] 本実施形態においては、測定対象物として溶液中の化学物質を例示したが、河川水や井戸水、工場排出物 (汚水、土壌、ガスなど)であっても良い。本発明で評価可能なその他の環境要因としては、光要因、温度要因、酸素要因、炭酸ガス要因、塩分要因など種々の環境要因が挙げられる。例えば、工場排出ガスの環境に及ぼす影響を評価する場合には、植物性サンプルが収容される空間内にパイプ等によりェ場排出ガスを導入すれば良い。また、植物性サンプルに及ぼす温度要因の影響を評価する場合には、植物性サンプルが収容される空間内に温調装置を設ければ良い。

[0105] 引き続いて、上述した一連の環境要因の評価を行う処理をコンピュータに実行させるための環境要因の評価プログラムを説明する。図 8に示すように、環境要因の評価プログラム 52は、コンピュータが備える記録媒体 50に形成されたプログラム格納領域 50a内に格納されている。 [0106] 環境要因の評価プログラム 52は、環境要因の評価処理を統括的に制御するメインモジュール 52aと、環境要因に曝露された光合成機能を有する植物性サンプルから発生する遅延発光の発光量の経時データの入力を受け付ける受付モジュール 52b と、入力が受け付けられた経時データが、予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように、当該複数の関数の係数値を決定するフィッティングモジュール 52cと、決定された係数値に基づいて、環境要因の環境への影響を評価する評価モジュール 52dと、評価の情報を出力する出力モジュール 52eとを備えて構成される。受付モジュール 52b、フィッティングモジュール 52c、評価モジュール 52d及び出力モジュール 52eを実行させることにより実現される機能は、上述した評価装置 12の受付部 36、フィッティング部 38、評価部 40及び出力部 42の機能とそれぞれ同様である。

[0107] なお、環境要因の評価プログラム 52は、その一部若しくは全部が、通信回線等の伝送媒体を介して伝送され、他の機器により受信されて記録 (インストールを含む)される構成としてちよい。

[0108] 上述した実施形態の実施例を以下に説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

[0109] 下記実施例では植物性サンプルとして藻類を用いている力これに限定されるものではなぐ光合成機能を有し、遅延発光を放射可能なものであればよぐ例えば植物性プランクトン、シァノバクテリア、光合成細菌、植物体や葉や又はその細片、カルスなどの植物性培養細胞、植物から抽出された光合成小器官やチラコイド膜、さらには人工的に合成された光合成様機能を持つ膜'タンパク複合体などが挙げられる。好適には、例えば、藍藻類である Spirulina、緑藻類である Selenastrumや、黄色藻類である Isochrysis、また、ホウレンソゥなど力も抽出されたチラコイド膜などが利用できる。

[0110] (実施例 1)

実施例 1では、評価対象の環境要因として除草剤シマジン (CAT)を用いた。遅延発光を発生する植物性サンプルとしては、藻類 Spirulina platensis (藍藻）を用いた。シマジンは、 S.

platensisに対して有害物質となる環境要因である。図 9に、シマジンを、濃度を変えて曝露した場合の S. platensisの生長曲線下面積の変化を示す。図 9のグラフにおいて横軸はシマジンの濃度、縦軸は生長曲線下面積を示して、る。

[0111] 生長曲線下面積は、従来の藻類に対する化学物質影響の評価指標である細胞生長を示すもので、一般的な藻類に対する化学物質の影響評価法 (OECDテストガイドライン 201)に準じて算出される。即ち、生長曲線下面積は、 750nm吸光度を 0. 0 3に調製した S.

platensis細胞懸濁液 6mLに対し、化学物質曝露後 72時間にわたり白色蛍光灯（50 μ mol'm— 2' s— 1)で培養を行い、 24時間毎に細胞密度を 750nm吸光度として計測することにより得られる生長曲線の下面積である。図 9に示すように、シマジンの曝露濃度に応じて曝露から 72時間後の S.

platensisの細胞生長が阻害されているのがわ力る。

[0112] 本実施例における遅延発光の計測は、以下のように行った。一般的な 10 X 10mm の分光計測用のセル内で、 660nm吸光度を 0. 05に調製した S.

platensis細胞懸濁液 2. 5mLに対し、シマジンを、濃度を変えて曝露し、光量 5 mo I'm— 2' s— 1の白色蛍光灯下で 15分放置する。その後、計測装置 10の内部で、遅延発光を発生させるための励起光として光源 18から約 300 /z mol'm— 2' s— 1の赤色光 (660nm)を 10秒照射し、励起光消灯後に発光する遅延発光を 0. 1秒間隔で 5 0秒間記録した。

[0113] 図 10に、シマジン曝露 15分後の S. platensisから発生した遅延発光の発光量の 50 秒間の変化を計測した結果を示す。図 10のグラフにおいて横軸は計測を開始してからの時間（励起後時間）、縦軸は発光量 (カウントされたフオトンの数)を示している。図中の「曝露なし」はシマジンを曝露して、な、状態で藻類から得られる遅延発光の変化を、「曝露あり」はシマジンを曝露した状態の藻類から得られる遅延発光の変化をそれぞれ示している。「曝露なし」の計測結果は、上述した実施形態における基準データを生成するためのものである。「曝露あり」「曝露なし」の違いは、シマジンによる影響の有無だけである。シマジンの影響により「曝露あり」では、励起後時間の早い時間帯 (0秒付近)では発光量が増加し、遅、時間帯 (5秒以降)では発光量が減少していることがわ力る。 [0114] S. platensisの遅延発光の発光量は、励起後 15秒付近まで減少した後に、再び 20 秒付近で再増加し、その後更に減少する。この 20秒付近の発光量の増加は、本実施例の計測条件における、 S.

platensisの細胞内での化学反応によるエネルギーの貯蓄及び再放出によるものである。このように、本実施例の計測条件では、 S. platensisは、励起後の時間経過の遅い時間帯の遅延発光に影響する光合成の後期の段階に多くのエネルギーを貯蓄して、ることを示して、る。

[0115] 本実施例においては、フィッティングには上述した式（1)を用いた。フィッティング結果の説明の一例として、「曝露なし」の計測結果を図 11 (a)に、及び当該計測データに対してフィッティングした結果のグラフを図 11 (b)にそれぞれ示す。図 11 (b)において、 fl (t)、 f2 (t)、 f3 (t)は、それぞれ式（1)における第 1関数、第 2関数、第 3関数である。図 11から、遅延発光の計測データは、複数の山型の関数により、フイツテイングでさることがわかる。

[0116] フィッティングにより、関数の係数である ai, bi, ci (i= l, 2, 3)が決定される。その結果を以下の表に示す。

[表 1] シマジン曝露濃度フィッティング式の値

( U g/L) 3ι b, C1 3₂ b₂ C₂ 3₃ b₃ c₃ 曝露なし 0 0.1 -0.5 3.6 0.009 - 0.5 3.45 0.0038 24 2.5

5 0.2 -0.5 4.5 0.01 - 0.5 3.5 0.006 22 2.2

25 0.2 -0.5 4.8 0.018 - 0.5 3.8 0.005 22 1 .6 曝露あり

50 0.3 -0.5 5 0.02 -0.5 3.8 0.01 21 1 .2

100 0.4 -0.5 5.5 0.024 一 0.5 3.8 0.02 20 0.7 実施例 1では、係数値を評価値として用いる。

[0117] 評価ステップの一例として、上記の表に示した係数のうち、第 3関数 f 3 (t)の係数の一つである c3を用いた場合について説明する。第 3関数は、式（1)において、発光量の最大値をとる時間が最も大きくなる関数であり、本実施例における第 1〜第 3関数の中では、最も長、間細胞内に蓄えられて、るエネルギーを反映すると考えられる。その中でも、係数値 c3は、山型の関数の高さに関係する値であり、第 3関数の表すフオトン成分の発光量と最も関連の深、値である。

[0118] シマジンの曝露濃度による c3の値の変化を図 12に示す。図 12のグラフにおいて、横軸はシマジンの曝露濃度を、縦軸は c3の値をそれぞれ示している。図 12に示すように、 S.

platensisの遅延発光の発光量の経時データに対する評価値は、シマジンの曝露濃度に従い減少し、その減少は図 9に示した 72時間後の細胞生長と相関することがわかる。従って、この比較結果を評価結果とすることができる。

[0119] このように、 S. platensisを植物性サンプルとして用いた場合、フィッティングの結果得られる係数値を用いることにより、環境要因の環境への影響を評価することができる。この実施例において、環境要因の環境への影響とは、シマジンの影響により引き起こされる藻類の生長の阻害である。

[0120] (実施例 2)

実施例 2でも、評価対象の環境要因として除草剤シマジン (CAT)を用いた。遅延発光を発生する植物性サンプルとしては、藻類 Pseudokirchneriella

subcapitata (緑藻）を用いた。シマジンは、 P. subcapitataに対して有害物質となる環境要因である。図 13に、シマジンを、濃度を変えて曝露した場合の P.

subcapitataの生長曲線下面積の変化を示す。図 13のグラフにお!/、て横軸はシマジンの濃度、縦軸は生長曲線下面積を示している。

[0121] 本実施形態において、生長曲線下面積は、 750nm吸光度を 0. 01に調製した P. s ubcapitata細胞懸濁液 6mLに対し、化学物質曝露後 72時間にわたり白色蛍光灯（5 O ^ mol-m- 2 - s - l)で培養を行!、、 24時間毎に細胞密度を 750nm吸光度として計測することにより得られる生長曲線の下面積である。図 13に示すように、シマジンの曝露濃度に応じて曝露から 72時間後の P.

subcapitataの細胞生長が阻害されているのがわかる。

[0122] 本実施例における遅延発光の計測は、以下のように行った。一般的な 10 X 10mm の分光計測用のセル内で、 660nm吸光度を 0. 2に調製した P.

subcapitata細胞懸濁液 2. 5mLに対し、シマジンを、濃度を変えて曝露し、光量 5 mol'm—2 ' s— lの白色蛍光灯下で 15分放置する。その後、計測装置 10の内部で、遅延発光を発生させるための励起光として光源 18から約 300 /z mol'm— 2 ' s— 1 の赤色光（660nm)を 10秒照射し、励起光消灯後に発光する遅延発光を 0. 1秒間隔で 50秒間記録した。

[0123] 図 14に、シマジン曝露 15分後の P. subcapitataから発生した遅延発光の発光量の 50秒間の変化を計測した結果を示す。図 14のグラフにおいて横軸は計測を開始してからの時間 (励起後時間）、縦軸は発光量 (カウントされたフオトンの数)を示している。シマジンの影響により「曝露あり」では、励起後時間の早い時間帯 (0秒付近)では発光量が増加し、遅、時間帯（5秒以降)では発光量が減少して、ることがわ力る。

[0124] 本実施例においては、フィッティングには上述した式（1)を用いた。フィッティング結果の説明の一例として、「曝露なし」の計測結果を図 15 (a)に、及び当該計測データに対してフィッティングした結果のグラフを図 15 (b)にそれぞれ示す。図 15 (b)において、 fl (t)、 f2 (t)、 f3 (t)は、それぞれ式（1)における第 1関数、第 2関数、第 3関数である。図 15から、遅延発光の計測データは、複数の山型の関数により、フイツテイングでさることがわかる。

[0125] フィッティングにより、関数の係数である ai, bi, ci (i= l, 2, 3)が決定される。その結果を以下の表に示す。

[表 2] シマジン曝露濃度フィッティング式の値

( U g/L) 3ι b, C1 32 b₂ c₂ 33 b₃ c₃ 曝露なし 0 0.045 -0.5 5.1 0.003 - 0.5 4.1 0.0005 8 3.1

5 0.05 -0.5 5.2 0.0037 -0.5 4.1 5 0.0005 6 3

25 0.05 -0.5 5.2 0.0035 - 0.5 4.1 0.0004 5 2.9 曝露あり

50 0.08 -0.5 5.4 0.0044 -0.5 4.1 0.0005 3 2.9

100 0.1 -0.5 5.6 0.005 一 0.5 4.1 0.005 3 2.7 実施例 1では、係数値及び係数値カゝら算出される演算値を評価値として用いる。

[0126] 評価ステップの一例として、上記の表に示した係数のうち、第 3関数 f 3 (t)の係数の一つである c3を用いた場合について説明する。第 3関数は、式（1)において、発光量の最大値をとる時間が最も大きくなる関数であり、本実施例における第 1〜第 3関数の中では、最も長、間細胞内に蓄えられて、るエネルギーを反映すると考えられる。その中でも、係数値 c3は、山型の関数の高さに関係する値であり、第 3関数の表すフオトン成分の発光量と最も関連の深、値である。

[0127] シマジンの曝露濃度による c3の値の変化を図 16に示す。図 16のグラフにおいて、横軸はシマジンの曝露濃度を、縦軸は c3の値をそれぞれ示している。図 16に示すように、 P.

subcapitataの遅延発光の発光量の経時データに対する評価値は、シマジンの曝露濃度に従い減少し、その減少は図 13に示した 72時間後の細胞生長と相関することがわかる。従って、この比較結果を評価結果とすることができる。

[0128] このように、 P. subcapitataを植物性サンプルとして用いた場合でも、フィッティングの結果得られる係数値を用いることにより、環境要因の環境への影響を評価することができる。この実施例において、環境要因の環境への影響とは、シマジンの影響により引き起こされる藻類の生長の阻害である。

[0129] 続いて、評価ステップの別の例として、演算式に基づいて算出された評価値により評価をする場合について説明する。評価値を、決定された係数値である ai, bi, ci (i = 1, 2, 3)から、上述した式 (2)に基づいて評価値 Eを算出する。ここで、設定される定数 mj (j = l〜9)は、例えば、 ml = lZa3, m2= l, m3 = l, m4= l/a2, m5 = l/b2, m6 = l/c2, m7= l, m8 = l/al, m9 = lZclとする。なお、定数 mjは、計測条件や藻類種により適切なものを設定することができる。上記のようにすベての係数値を使用せずに、その一部のみを使用する場合には、無視する係数値については対応する mj (j = 1〜9)に l/a3など係数値の逆数を設定する。

[0130] この演算式により求められた評価値を以下の表及び図 17に示す。

[表 3] シマジン曝露濃度

( g/L) 演算値 E

曝露なし 0 551.1 1

5 360

25 290

曝露あり

50

108.75

100 81 図 17のグラフにおいて、横軸はシマジンの曝露濃度を、縦軸は演算値 Eの値をそれぞれ示している。図 17に示すように、 P. subcapitataの遅延発光の発光量の経時データに対する評価値は、シマジンの曝露濃度に従い減少し、その減少は図 12に示した 72時間後の細胞生長と相関することがわかる。従って、この比較結果を評価結果とすることができる。

[0131] 続、て、評価ステップの別の例として、関数の係数値に基づ、て算出された面積値により評価をする場合について説明する。面積値は、上述したように、関数のグラフにおヽて、関数値を示す線と当該関数値を示す線の下側に位置する時間軸の線とにより囲まれる領域の面積値である。関数の面積値は、それぞれの関数が表すフォトン成分の発光量と関連の深い値である。本実施例では、表 2に示した P.

subcapitataに対するシマジン曝露結果力得られる係数値をもとに、式（1)における第 3関数 f 3 (t)について、 t = 0〜90の範囲で、 tの間隔 A t=0. 1として区分求積を行い、面積値を求めた。

[0132] このようにして求めた面積値を以下の表及び図 18に示す。

[表 4] シマジン曝露濃度

( U g/L) 面積値（区分求積）

曝露なし 0 29226.4

5 241 12.1

25 19665.7

曝露あり

50 16520.1

100 4435.7 図 18のグラフにおいて、横軸はシマジンの曝露濃度を、縦軸は面積値をそれぞれ示している。図 18に示すように P. subcapitataの遅延発光の発光量の経時データに対する面積値は、シマジンの曝露濃度に従い減少し、その減少は図 12に示した 72時間後の細胞生長と相関することがわかる。従って、この比較結果を評価結果とすることがでさる。

また、このような算出方法とは別に、式（1)における第 1関数 fl (t)の係数値よりも、同式の第 2関数 f 2 (t)の係数値及び第 3関数 f 3 (t)の係数値が評価値により大きく反映されるように、式（1)の各関数の係数値を重み付けしてもよい。例えば、第 2関数 f 2 (t)の係数値及び第 3関数 f3 (t)の係数値のみによって評価値が算出されるように、各関数の係数値を重み付けすることが可能である。すなわち、経時データにおける複数の時間帯のそれぞれに対応する特徴値のうち、励起直後の時間（例えば、 t=0 〜0. 5の範囲)を含む時間帯に対応する特徴値よりも、当該時間帯以外の時間帯に対応する各特徴値が評価値により大きく反映されるように重み付けすることで評価試料を評価してもよい。

[0134] ここで、特徴値とは、経時データにおける複数の時間帯の各々についての特徴を示す値のことをいう。また、遅延発光の経時データを複数の関数の和としてフイツティングする場合、それぞれの関数の係数値は、経時データの時間帯の特徴を表す。

[0135] 遅延発光の経時データを複数の関数の和としてフィッティングすると、特定の関数が経時データに及ぼす影響の大きい時間帯が現れる。そこで、このような時間帯では、経時データに及ぼす影響の大きい関数の係数値がその時間帯の特徴を表してヽると考えられる。一例として、図 15に示した P.

subcapitataのフィッティング例にぉ、ては、励起直後の時間帯 (0〜1秒付近)では第 1関数 f 1 (t)が経時データに及ぼす影響が大きぐ励起後 1〜15秒付近では第 2関数 f2 (t)が経時データに及ぼす影響が大きぐ励起後 15〜50秒付近では第 3関数 f 3 (t)が経時データに及ぼす影響が大きくなつている。このため、それぞれの関数の係数値を各時間帯の特徴値とすることができる。なお、フィッティングによる特徴値の算出方法はこれに限定されず、経時データの形状及びフィッティングに用いる関数の種類によって様々な方法が考えられる。

[0136] 本発明の発明者らは、経時データに対する複数の特徴値のうち、励起直後の時間を含む時間帯以外の時間帯に対応する各特徴値が評価値により大きく反映されるように重み付けすることで、評価試料を評価するための評価値と基準データとの差がより明確に現れるという知見を得た。そして、当該発明者らは、これにより、例えば、化学物質の環境への影響をより明確に把握できるという知見も得た。すなわち、このように重み付けを行うことで、より適切に光合成サンプルを評価することが可能となる。なお、この重み付けの方法は一例であり、光合成サンプルの状態によってどの時間帯の特徴値を評価値に大きく反映させるかは任意である。

[0137] (第 2実施形態）

以下、添付図面を参照しながら本発明の第 2実施形態について説明する。

[0138] (理論的背景）

まず、図 19を用いて、本発明に係る光合成サンプルの評価方法の理論的背景である光合成電子伝達について説明する。図 19は、光合成電子伝達を示す模式図である。

[0139] 一般に、光合成機能を有する光合成サンプルは、光エネルギーを多く吸収すると、光合成電子伝達系の個々の反応で律速が生じるため、光合成電子伝達が円滑に進まなくなる。言い換えれば、光合成サンプルの酸ィ匕還元状態が通常とは異なる状態になる。このような状態は、光合成サンプルに与える光条件を変更することで得ることが可能である。ここで、光条件とは、例えば、光合成サンプルに与える光の光量、波長、パルス幅及び照射時間である。本明細書では、光合成電子伝達が円滑に進まな Vヽ状態 (光合成サンプルの酸化還元状態が通常と異なる状態)を光合成電子伝達系の「飽和」という。これに対し、光合成電子伝達が円滑に進む状態 (光合成サンプルの酸ィ匕還元状態が通常の状態)を「飽和なし」という。

[0140] 図 19に示すように、光合成サンプルの光合成反応は、主として、葉緑体チラコイド膜に存在する光化学系 II複合体 (PSII)、シトクロム b6f複合体 (cytb6f)、光化学系 I 複合体 (PSI)、及び ATP合成酵素 (ATPsynthase)により生産させる還元物質 (N ADPH)と、 ATP合成酵素を利用した二酸ィ匕炭素固定反応 (Calvin— Benson cy cle)により行われる。

[0141] まず、 PSII及び PSIが光を吸収し電子伝達反応を行う。具体的には、光が照射されると PSIIにおいて水分子 (H20)が分解され、電子 (e-)が取り出される。この電子は、 PSII反応中心（P680)力も QA電子受容体 (QA)を経て、 QB電子受容体 (QB) 部位に結合している酸ィ匕型プラストキノン (PQOX)に伝達される。そして、これにより還元型プラストキノン (pQred)が生じる。

[0142] 還元型プラストキノンは、 QB部位から遊離してプラストキノンプール (pQpool)に移動した後、 cytb6fにより再酸ィ匕され、酸ィ匕型プラストキノンに戻る。この際、 cytb6fを介して水素イオン (H + )がチラコイド膜内に流入し、プロトン勾配を形成する。プロトン勾配を形成した水素イオンは、 ATP合成酵素による ATP合成に利用される。一方、還元型プラストキノンの再酸ィ匕の際に抜き取られた電子は、 PSI反応中心 (P700) へ伝達される。この電子は、 PSI内で P700からフェレドキシン（Fd)に伝達され、 NA DPHの生産に寄与する。 PSI以降の過剰な電子 (還元力）は、循環型電子伝達により Fdを介して cytb6fに伝えられ、酸化型プラストキノンを還元する。この結果、還元型プラストキノンが生じる (循環的電子伝達)。

[0143] 遅延発光は、上記の光合成電子伝達反応の逆反応の結果、主に PSIIの反応中心クロロフィルが化学的に再励起されることで起こる発光であるとされている力 psiも同様に発光に関与しているとする報告もある。また、 PSII内部、 pQpool、 PSI以降のそれぞれに分布する電子がクロロフィルの再励起に寄与する主要な成分であると理解されている。従って、上記の光合成電子伝達反応が環境要因（例えば有害物質）の影響により変化すると、遅延発光に変化が現れる。

[0144] 一般的に、 pQpool、 cytb6f、 PSIの電子伝達能力は、 PSIIの電子伝達能力に比ベて低い。そのため、光照射により PSIIが過剰に還元されると、 PSIIからの電子伝達により pQpoolが過剰に還元されるので、 PSIIから電子を受け取る酸ィ匕型プラストキノンが減少し、 PSIIからの光合成電子伝達の効率が低下することが知られている。このような現象は、光合成電子伝達の飽和の一つである。より具体的には、 PSIIが過剰に光吸収を行った場合、まず始めに cytb6fによる還元型プラストキノンの再酸化が律速となり、 PSIIから電子を受け取ることができる酸ィ匕型プラストキノンが不足する。そのため、 PSIIから cytb6fへの電子伝達が停滞する。その結果、 PSII内に過剰に電子が蓄積し、 PSIIの反応中心が破壊されるなど、光合成反応に種々の影響を及ぼす。なお、このような影響を光阻害という。

[0145] このような光阻害を回避するために、本来 PSIIに電子を供給するための集光性色素タンパク複合体 (LHC2)が PSIに移動する (ステート遷移)など、種々の代謝変化を引き起こすことが知られている。このような光阻害により引き起こされる代謝変化は、過剰な光照射を停止することで徐々に回復する。 [0146] 本発明は、上記のような光合成電子伝達の酸化還元状態の変化に注目し、励起光の照射を制御して遅延発光を計測することにより、光合成サンプルに与えた環境要因を評価するものである。

[0147] (遅延発光計測装置）

まず、図 20及び 21を用いて、本発明による光合成サンプルの評価方法を実施するための遅延発光計測装置について説明する。図 20は、実施形態に係る遅延発光計測装置 1を模式的に示す図である。図 21は、図 20に示す遅延発光計測装置 1を部分的に示すブロック図である。

[0148] 遅延発光計測装置 1は、計測ユニット 10、解析ユニット 20及び制御ユニット 30を備えている。計測ユニット 10と解析ユニット 20とは、第 1ケーブル 41で接続されており、解析ユニット 20と制御ユニット 30とは、第 2ケーブル 42で接続されている。

[0149] 計測ユニット 10は、試料設置部 11、光源 12、フィルタ 13、集光光学系 14、シャツタ 15及び検出部 16を備え、これらの構成要素は筐体 17に収容されている。筐体 17は、本体部 17aと蓋部 17bとを有している。

[0150] 試料設置部 11は、測定対象である試料を設置するための部分である。試料設置部 11は、試料を入れた容器を設置可能なように構成され、蓋部 17bを開くことで試料の交換を行うことができる。なお、試料設置部 11は、筐体 17外力も送液ポンプ等により試料を導入することができるように構成されてもよ、。

[0151] 光源 12は、試料設置部 11に設置された試料に光 (励起光）を照射する。光源 12は、植物の光合成に有効な光波長（280〜800nm)を放射可能であればよぐ例えば、発光ダイオード、半導体レーザー素子又は電球が用いられる。光源 12は、単色光源であっても、複数の光源を組み合せた光源であってもよい。光源 12の発光方法は限定されず、例えば、所定時間連続して発光し続ける方法、任意のパターンでパルス点灯させる方法、同一又は異なる波長特性を有する複数の光源を順番に発光させる方法、複数の光源を同時に発光させる方法などが考えられる。

[0152] フィルタ 13は、遅延発光を透過するものであり、筐体 17の内壁面に接するように設けられている。

[0153] 集光光学系 14は、フィルタ 13を透過してきた微弱な遅延発光を集光する。集光光学系 14は、これにより集光された遅延発光が検出部 16に進むように設けられて、る

[0154] シャツタ 15は、開閉自在なように設けられている。シャツタ 15が閉じている場合には、集光光学系 14から検出部 16に進む遅延発光が遮断される。なお、シャツタ 15はフィルタ 13及び集光光学系 14よりも光源 12に近い位置に設けてもよい。この場合、光源 12からの光がフィルタ 13及び集光光学系 14に直接入射することによる、集光光学系等の構成部品の発光 (残光)を防ぐことができる。

[0155] 検出部 16は、光源 12から照射された光によって試料内の光合成サンプルから生じる遅延発光の光量を測定し、測定結果を解析ユニット 20に送信する。検出部 16は、遅延発光を検知する光センサ 16aと、光センサ 16aが検知した信号に基づいて遅延発光の光量を算出する光量算出部 16bとを有する。検出部 16は、例えば、電子増倍管を用いたフオトンカウンタや、アバランシェフオトダイオードを用いた微弱光計測装置などにより構成される。

[0156] 解析ユニット 20は、記録部 21、演算部 22、表示部 23及び入力部 24を備える。記録部 21は、検出部 16から送信されてきた測定結果と解析又は評価に必要なデータとを記録する。演算部 22は、記録部 21に記録されている測定結果及びデータに基づいて演算解析と評価を行う。表示部 23は、演算部 22により解析，評価された結果の表示を行う。入力部 24は、解析に必要なデータを入力することが可能なインタフエースである。

[0157] 制御ユニット 30は、計測ユニット 10及び解析ユニット 20の動作を制御可能であり、例えば、コンピュータ、タイマ及びリレーなどを組み合わせて構成される。特に、制御ユニット 30は、光源制御部 31と検出制御部 32とを有している。光源制御部 31は、光源 12から照射される励起光の光条件 (例えば、照射時期、光量、波長、パルス幅及び照射時間）を制御することが可能である。検出制御部 32は、所定時間における遅延発光の発光量の検出（測定)を制御することが可能であり、例えば、検出時期、検出時間などを制御する。

[0158] なお、解析ユニット 20及び制御ユニット 30の構成はこれに限定されず、例えば、 1 台のコンピュータが解析ユニット 20及び制御ユニット 30の機能を併せ持つていてもよい。

[0159] (光合成サンプルの評価方法）

次に、図 22を用いて、上記遅延発光計測装置 1による光合成サンプルの評価方法の手順について説明する。図 22は、光合成サンプルの評価方法の手順を示すフロ一チャートである。

[0160] まず、光合成サンプルを含む試料を 2種類調製する。このうちの一方は、光合成サンプルの量、光合成サンプルに照射する光の光量又は波長、温度、緩衝液の組成、化学物質の曝露などの環境を所定の条件に設定した標準試料である (ステップ S11 b)。もう一方は、その標準試料に対して環境条件 (有害物質の付加や温度など)又は光合成サンプルそのものの条件（生育条件など）のうち少なくとも一つが異なる評価試料である (ステップ S 11a)。調製された標準試料及び評価試料は、キュベット等の容器内に格納され、光合成サンプルに対する比較条件の影響が十分に現れるまで、必要に応じて、温度や光などが管理された条件下で放置又は培養される。

[0161] 続いて、光合成サンプルに対する比較条件の影響が十分に現れるに至った評価試料に対して第 1の励起光を所定の第 1の照射条件で照射する (ステップ S12a、第 1 励起ステップ)。光源制御部 31は、光源 12から照射される励起光が第 1の照射条件を満たすように、光源 12に制御信号を出力する。第 1の照射条件とは、光合成サンプルで行われる光合成電子伝達が飽和するような所定光量及び所定波長の光を所定時間だけ照射させることである。光源 12から照射された励起光は、試料設置部 11に設置してある容器に至る。このような第 1の励起光の照射は、標準試料に対しても同様に行われる (ステップ S12b、第 1励起ステップ)。

[0162] 続、て、第 1の励起光を照射した評価試料を所定の光条件の中で所定時間 (0秒以上)だけ待機させる (ステップ S13a、第 2励起ステップ)。具体的には、評価試料に照射される光の光エネルギーが後述する第 2の励起光のそれよりも小さいような環境下で評価試料を待機させる。例えば、計測ユニット 10の外部からその内部に光が漏洩しないようにし、試料設置部 11に設置した評価試料を暗中で待機させる。このような待機は、標準試料に対しても同様に行われる (ステップ S13b、第 2励起ステップ)。

[0163] 続いて、光源 12を用いて、所定の光条件の中で待機させた評価試料に対して第 2 の励起光を第 2の照射条件で照射する (ステップ S14a、第 2励起ステップ)。第 2の照射条件とは、第 1の照射条件と比較して光エネルギー積算値が小さくなるような条件を含む。光源制御部 31は、光源 12から照射される励起光が第 2の照射条件を満たすように、光源 12に制御信号を出力する。ここで、エネルギー積算値とは、光合成サンプルにとっての光エネルギー積算値のことを、、、光量子束密度（ mol · m— 2 · s - 1)と光合成サンプルの光合成有効放射吸収率 (％)と照射時間 (秒)との積で表される。このような第 2の励起光の照射は、標準試料に対しても同様に行われる (ステツプ S 14b、第 2励起ステップ)。

[0164] 続、て、第 2の励起光を照射した評価試料力発生する遅延発光の発光量を測定する (ステップ S15a、測定ステップ)。評価試料から発生する遅延発光は、フィルタ 1 3を透過し、集光光学系 14で集光される。そして、集光された遅延発光が検出部 16 に送られ、この検出部 16で遅延発光の発光量が測定される。かかる測定は、検出制御部 32から光量算出部 16bに出力される制御信号に基づいて、所定時間毎 (例えば 0. 1秒毎）に行われる。測定された遅延発光の発光量は測定時刻又は測定時間と対応付けられた上で、検出部 16から解析ユニット 20に出力され、記録部 21に記録される。このような測定は、標準試料に対しても同様に行われる (ステップ S15b、測定ステップ)。

[0165] 上述した第 1の励起光の照射から遅延発光の発光量の測定までの処理は、第 2の照射条件を変更しながら複数回繰り返される (ステップ S16a ;YES、ステップ S16b ; YES)。ここで、第 2の照射条件とは、例えば、第 2の励起光の照射開始時期、言い換えれば、第 1の励起光の照射終了時力第 2の励起光の照射開始時までの時間（以下「待機時間」という）を含む。このような第 2の照射条件は、光源制御部 31で設定される。第 2の照射条件を変更すると酸ィ匕還元状態が変わるので、このような測定方法を採用することで、酸化還元状態が異なる条件における遅延発光の発光量を測定することができる。

[0166] なお、第 1の励起光の照射から遅延発光の発光量の測定までの処理を繰り返す回数は限定されず、任意の回数を設定することができる。また、同一条件の比較試料を複数用意しておき、それぞれに対して第 2の照射条件を変更して遅延発光を測定することもできる。この場合、試料に前回の測定の影響が出ず、より精確な測定を行うことができる。更に、第 2の照射条件を変えて測定された遅延発光の発光量の経時データ、又はそれに基づく評価値を予め記憶部に格納していてもよい。この場合、遅延発光の測定は必ずしも繰り返し行わなくてもよ、。

[0167] 第 1の励起光の照射から遅延発光の発光量の測定までの処理を複数回繰り返した後（ステップ S16a ;NO、ステップ S16b ;NO)、得られた測定結果から光合成サンプルの光合成電子伝達やその他の代謝を反映する解析値を算出する (ステップ S 17a 及びステップ S17b、評価ステップ)。この算出は、評価試料及び標準試料のそれぞれについて行われる。具体的には、演算部 22が所定の算出プログラムに記録部 21 カゝら読み出された測定結果を当てはめることで解析値を算出する。解析値としては、例えば、 1以上の測定時間帯毎に積算した遅延発光の発光量の積算値、遅延発光の発光量が減衰する過程で特定の変化が現れる測定時間（測定時刻）、及び、遅延発光の発光量の経時変化を関数の和としてフィッティングして得られる係数が挙げられる。

[0168] なお、試料に第 2の励起光のみを照射して遅延発光の発光量を計測し、その発光量を解析値を算出する際に用いることが好ましい。この場合、試料が飽和していない場合の遅延発光の発光量が解析値に反映されるため、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能をより適切に評価することができる。解析値を算出する際には、測定結果をすベて用いてもよいし、測定結果の一部のみを用いてもよい。

[0169] 特に、測定された遅延発光の発光量を 1以上の測定時間帯毎に積算した積算値を解析値とすることが好ましい。これにより、遅延発光の発光量の経時変化に現れる、ある測定時間帯における光合成サンプルの酸ィヒ還元状態を簡易かつ適切に抽出することが可能となる。また、測定時間帯を複数設け各測定時間帯の積算値を算出することで遅延発光の発光量の経時変化を適切に把握することが可能となるので、光合成サンプルの酸化還元状態をより適切に評価することができる。

[0170] また、測定された遅延発光の発光量の経時変化が予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように導出した複数の関数の係数値を解析値とすることも好ましい。このような数学的手法を用いることで、客観的に評価値を導出することが可能となる。また、遅延発光の発光量の経時変化を複数の関数の和にフィッティングさせて、るので、遅延発光のメカニズムに基づ、た評価が可能となる。

[0171] なお、上述した調製カゝら解析までの処理は、評価試料及び標準試料にっヽて同時に行ってもよいし、それぞれ別の時期に行ってもよい。また、後述する標準データが得られて!/ヽる場合には、標準試料の測定を必ずしも行わなくてもよ、。

[0172] 続いて、評価試料の解析値と標準試料の解析値とに基づいて評価値を算出 (導出 )する (ステップ S18、評価ステップ)。評価値の算出は、解析値の算出と同様、演算部 22において実行される。評価値の算出方法は一つに限定されない。例えば、評価試料及び標準試料のそれぞれにつヽて、酸化還元状態が異なる条件における解析値を比較したり、評価試料の解析値と標準試料の解析値とを比較したりすることで評価値を算出することなどが挙げられる。また、これらのように算出された評価値同士を比較して更に評価値を算出してもよい。更に、解析値をそのまま評価値とする手法、解析値を加減乗除した結果を評価値とする手法、解析値を所定の関数に代入して演算した結果を評価値とする手法を採用してもよい。算出される評価値の種類及び個数は限定されない。

[0173] 最後に、算出して得られた評価値に基づいて光合成サンプルの状態を評価する（ステップ S19、評価ステップ)。具体的には、算出して得られた評価値と標準データとを照らし合わせることにより評価する。標準データとしては、例えば、標準試料の測定データに基づいて得られた評価値が挙げられる。また、標準試料の評価値から基準値を算出し評価試料を評価してもよい。基準値としては、閾値及び範囲などが挙げられる。ここで得られた光合成サンプルの状態についての評価結果は、表示部 23に表示されるなどして評価者に提示される。なお、評価者への提示方法はこれに限られず、例えば、評価値を算出した時点でその評価値を評価者に提示してもよい。

[0174] (本実施形態の背景）

従来から、環境中に存在する未知化学物質の生物に対する影響を評価する方法として、細菌、藻類等の生物個体に対する生育阻害を検査する生物学的な毒性検査「バイオアツセィ」が用いられている。このバイオアツセィの一つとして、遅延蛍光を用いる手法が知られている。例えば、上記非特許文献 3 (Schmidt et al.)には、遅延発光計測前に暗中で 2時間放置した試料と放置しない試料とで遅延発光の発光パターンが変化すること、及び、遅延発光計測前に照射する光の波長を変更した場合に遅延発光の発光パターンが変化することが開示されている。

[0175] また、上記特許文献 1 (国際公開第 2005Z062027号パンフレット）には、遅延蛍光を用いた有害物質の評価方法が開示されている。この有害物質の評価方法は、まず、有害物質を含む水溶液サンプルからの遅延蛍光 (遅延発光）の光量と比較サンプル力の遅延蛍光の光量とをそれぞれ計測する。そして、計測した各遅延蛍光の光量に基づいて、遅延蛍光の光量の時間的変化の特徴点における経過時間を算出し、当該経過時間の比較値を求めることにより、水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する。上記特許文献においても、対象物に照射する光の光強度又は光波長を変更した場合に遅延発光のパターンが変化することが開示されている。

[0176] し力しながら、上述した従来の評価方法においては、光合成サンプルの光合成機能の反応過程における影響が適切に評価されていない。すなわち、光合成サンプルの光合成機能全体への影響は分力つても、その各反応過程への影響を評価するのは困難である。

[0177] 本発明は、上記課題を解決する為になされたものであり、評価試料に含まれる光合成サンプルの光合成機能を適切に評価することが可能な光合成サンプルの評価方法及び光合成サンプルの評価プログラムを提供することを目的とする。

[0178] そして、このような光合成サンプルの評価方法によれば、異なった待機時間毎に遅延発光の発光量を測定することができるので、より詳細な評価値を導出することができ、その結果、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に評価することができる。

[0179] (遅延発光の測定例）

次に、測定例を示しつつ、酸化還元状態を変えながら行う遅延発光の測定について説明する。

[0180] ここでは、光合成サンプルとして緑藻（Pseudokirchneriella subcapitata)を用いる。

緑藻は、標準的な C (75)培地 (ph7. 5)を用い、気温 25°C ± 1°Cの環境下で 50 mol · m— 2 · s— 1の白色光を照射しつつ旋回培養 ( 120rpm)で生育させたものである。計測試料は、 C (75)培地を希釈液として 685nm吸光度 OD685 = 0. 05に調製した後に、気温 25°C± 1°Cの環境下で 50 /z mol'm— 2' s— 1の白色光を照射しつつ 1時間培養した細胞懸濁液 2. 5mLである。そして、この計測試料を、励起光を照射して遅延発光を測定する前に予め 60秒間暗中に静置する。これは、光合成サンプル内の光合成電子伝達を円滑に進む状態にさせるため（光合成サンプルの酸ィ匕還元状態を一定の状態に保っため）である。通常、計測を 60秒間暗中に静置することにより、 PSII、 pQpool、 PSIが十分酸化された状態になる。

[0181] 遅延発光の計測は、光源 12による励起光照射後に計測試料力も発せられる遅延発光を検出部 16により検出し、検出された信号を 0. 1秒毎に積算して、遅延発光の発光量と相関する値 (count)として出力する手法により行う。この計測は、励起光消灯後、例えば 50秒間継続して行う。一般的に、励起光消灯後の遅延発光の発光量は、励起光の照射終了時点からの経過時間（励起後時間）が経過するとともに減衰していく。

[0182] まず、図 23を用いて、待機時間と遅延発光の経時変化との関係について説明する。図 23は、待機時間と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。このグラフの横軸は、励起後時間 (第 2の励起光の照射終了時点力の経過時間）（秒)を表し、縦軸は、遅延発光の強度 (counts)を表す。なお、遅延発光の強度は、遅延発光の発光量と相関するものであるから、以下において遅延発光の強度に基づいて評価するということは、遅延発光の発光量に基づいて評価することと同等である。また、以下では、励起後時間と遅延発光の強度との関係をグラフ化したものを減衰曲線という

[0183] 待機時間と遅延発光の経時変化との関係を求めるにあたり、まず、計測試料に、光合成電子伝達を飽和させる第 1の励起光として、 500 11101'111—2' 3— 1の白色光を 10秒間照射した (第 1の照射条件)。その後、計測試料に光を照射しないステップ ( 以下「待機」と、う）を設け、更にその後、第 2の励起光として、 50 mol · m— 2 · s— 1 の赤色光を 2秒間照射した。この第 2の励起光は、光合成サンプルの酸化還元状態をほとんど変化させずに遅延発光を発生させることができるものである。このような処理は、待機時間を 0、 2、 10、 30及び 60秒と変更しながら繰り返し行われる。また、これらに加えて、第 1の励起光の照射及び待機を実施せずに第 2の励起光の照射のみを実施した場合、すなわち、光合成電子伝達が飽和しない場合についても測定する

[0184] 図 23に示すグラフは、これらの各場合における待機時間と遅延発光の経時変化との関係を表している。このグラフに示されるように、第 1の励起光の照射、待機及び第 2の励起光の照射を組み合わせることにより、光合成サンプルの酸ィ匕還元状態が異なる状態を段階的に作り出し、その酸ィ匕還元状態を反映する遅延発光を測定することができる。第 1の励起光を照射していない「飽和なし」の場合には、光合成電子伝達が最も円滑に進む。これに対し、第 1の励起光を照射した直後に第 2の励起光を照射した場合 (待機時間が 0秒の場合）には、光合成電子伝達が飽和に最も近くなる。そして、待機時間が長くなるにつれて、光合成電子伝達の飽和が解消されていく（光合成サンプルの光合成電子伝達系が回復して!/ヽく）。

[0185] 図 23に示す、待機時間が 0秒の場合の減衰曲線を見ると、励起後 0. 1秒力 0. 5 秒付近の発光量が飽和なしの場合よりも増力 tlしており、逆に励起後 0. 5秒付近から 1 0秒付近では、飽和なしの場合よりも発光量が減少している。また、励起後 10秒付近力 50秒までは、飽和なしの場合よりも発光量がやや増加している。飽和なしの場合と比較した励起後 10秒付近力も 50秒までの発光量の減少は、待機時間を 2秒とした場合にやや低減している。このような減衰曲線の変化は、待機時間が長くなるにつれて飽和なしの場合に近づき、待機時間を 60秒とした場合の減衰曲線と飽和なしの場合の減衰曲線との相違は、ほとんど認められない。このことから、第 1の励起光による光合成電子伝達系の飽和は、 60秒の待機時間の間に解消されていると考えられる。

[0186] 上述の測定結果が光合成サンプルの酸ィ匕還元状態の変化を表して、ると考えられる根拠について説明する。上述のように、光合成サンプルの酸化還元状態は、照射される励起光の光条件、より具体的には、励起光の光エネルギー量により決まる。そして、この光エネルギー量を決める要素として、例えば照射光量及び照射時間がある。そこで、説明のため、まず、照射光量及び照射時間と遅延発光の経時変化との関係を示す。

[0187] 図 24は、励起光の照射光量と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。このグラフの横軸及び縦軸が表すものは、図 23の場合と同様である。励起光の照射光量と遅延発光の経時変化との関係を求めるにあたっては、第 1の励起光の照射光量を 50、 100、 200及び500 11101'111—2 ' 5— 1と変更しながら上記の測定（待機時間は 0秒とした。）を繰り返し行った。なお、第 1の励起光の照射光量が 50 mol'm 2 ' s 1の場合、光合成電子伝達系の飽和は発生しない。図 24を見ると、第 1の励起光の照射光量が少なくなるにつれて、減衰曲線が飽和なしの場合 (励起光の照射光量が 50 /z mol'm— 2 ' s— 1の場合）に近づく。

[0188] 図 25は、励起光の照射時間と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。

このグラフの横軸及び縦軸が表すものは、図 23の場合と同様である。励起光の照射時間と遅延発光の経時変化との関係を求めるにあたっては、第 1の励起光の照射時間を 5、 10及び 30秒と変更しながら上記の測定 (待機時間は 0秒とした。）を繰り返し行った。図 25を見ると、第 1の励起光の照射時間が少なくなるにつれて、減衰曲線が飽和なしの場合 (励起光を照射しない場合）に近づく。

[0189] 図 24及び 25で示したように、減衰曲線の変化は、第 1の励起光の照射光量及び照射時間に依存する。すなわち、図 23に示すような、待機時間の長さにより生じる特定の測定時間帯の発光量の増減は、光照射による光合成電子伝達系の飽和及び回復を直接又は間接的に反映していると考えられる。

[0190] この点につき、図 26〜28を用いて、酸化還元状態と遅延発光の発生とを対比しつつ光合成電子伝達に関わる分子の動きも踏まえて詳細に説明する。図 26は、飽和なしの状態における酸ィ匕還元状態と遅延発光との対比を示す模式図である。図 27 は、第 1の励起光照射後に待機時間を設けな力た (待機時間 0秒)場合の、酸ィ匕還元状態と遅延発光との対比を示す模式図である。図 28は、第 1の励起光照射後に待機時間を 2秒設けた場合の、酸ィ匕還元状態と遅延発光との対比を示す模式図である

[0191] 飽和なしのときには、計測試料に対して光合成サンプル (緑藻)の培養時と同じ光強度の励起光が照射されているため、光合成電子伝達にはほとんど影響がないと考えられる。この場合、図 26〖こ示すよう〖こ、 PSIIから pQpoolを経て PSIに電子が伝達される過程で飽和は生じず、 pQpoolには酸ィ匕型プラストキノンと還元型プラストキノンとがバランス良く存在する。遅延発光に影響する 3つの主要な電子蓄積部分 (PSII 、 pQpool、 PSI)の電子が逆反応により最終的に P680をィ匕学的に再励起するため、遅延発光が生じる。なお、測定される遅延発光は、これら 3つの電子蓄積部分のそれぞれ力発生する遅延発光の総和である。

[0192] 待機時間 0秒の場合には、第 1の励起光を照射した後直ちに第 2の励起光を照射した上で遅延発光を計測している。そのため、光合成電子伝達系が最も飽和した状態であるといえる。この場合、図 27に示すように、 pQpoolでは、強光を照射したことにより生成された還元型プラストキノンが多くなる一方で、酸ィ匕型プラストキノンが少なくなる。このような状況では、 cytb6fによる還元型プラストキノンの再酸ィ匕が律速となり、 PSIIから電子を受け取ることができる酸ィ匕型プラストキノンが不足する。このため、 P SII内部力の電子伝達の取り出しが低下し、 PSII内部の電子の蓄積が多くなる。その結果、 PSII内部の電子蓄積を反映する遅延発光が増加する。このような PSII内部の電子蓄積を反映した遅延発光の増加は、図 23に示すように、待機時間が 0秒の場合の減衰曲線における励起後 0. 1秒力 0. 5秒付近の発光量の増加として現れる。

[0193] なお、励起後それほど時間が経過していない場合における遅延発光が PSIIの電子を反映することは、 Kretsch, G. and Gerhardt, V.ゝ "Numerical

analysis of delayed fluorescence kinetics or algae 、 Archiv

furHydrobiologie— Beiheft Ergebnisse der Limnologie、 1987、 29、 p.47— 54. (以下「参考文献 1」とする）、及び、 Schmidt,W.

and ¾enger, H.ゝ Long-term delayed luminescence in Scenedesmus obliquus I. ¾pect ral and

kinetics properties 、 Biochemica et BiophysicaActa、 1987、 890、 p.15-22. (以下「参考文献 2」とする）に記載されて、る。

[0194] また、 pQpoolから PSIIの P680に電子が逆流する経路としては、 PSIIの QB部位に結合した酸ィ匕型プラストキノンを介する経路と、 QB部位力も解離し pQpoolに移動した還元型プラストキノンの平衡状態を反映した経路との二つが考えられる。これら予想される二つの経路は、 PSII内部にある QB部位を介した反応ではある力 pQpool の酸化還元状態を反映した遅延発光であるため、 pQpoolの電子蓄積を反映する遅延発光として扱う。光合成電子伝達が飽和し還元型プラストキノンが多く存在する状況では、酸ィヒ型プラストキノンを反映する遅延発光が減少する一方で、還元型プラストキノンを反映する遅延発光が増加する。

[0195] 図 23の待機時間 0秒の減衰曲線が示すように、酸ィ匕型プラストキノンの減少を反映した遅延発光の減少は、励起後 0. 5秒付近から 10秒付近における発光量の減少として現れていると考えられる。また、還元型プラストキノンの増加に伴う発光量の増加は、励起後 10秒付近から 50秒までの発光量の増加として現れていると考えられる。還元型プラストキノンを反映する発光量の減少が還元型プラストキノンを反映する発光量の増加よりも時間的に早く現れるのは、 PSII内部の QB部位に結合した酸ィ匕型プラストキノンの方が、 PSIIとチラコイド膜内を移動して平衡状態を作っている還元型プラストキノンよりも短時間で反応が進行するためであると考えられる。 pQpoolを反映する遅延発光が PSIIを反映する遅延発光よりも遅れて発光することは、参考文献 1に記載されている。

[0196] さらに、 PSI以降に蓄積された電子が P680へ逆流する経路としては、 P700から cy tb6fにおける還元型プラストキノンの酸化反応を介した平衡状態の逆反応を反映する経路と、 PSIのフェレドキシン（Fd)を経由して cytb6f内の酸化型プラストキノンへ電子が伝達され還元型プラストキノンを生じる循環的電子伝達による経路とが考えられる。この場合、どちらの経路においても、 PSIの電子が還元型プラストキノンを介して P680に逆流することになる。図 23の待機時間 0秒の減衰曲線が示すように、 PSI 力も還元型プラストキノンを介した遅延発光の増加は、励起後 10秒付近から 50秒までの発光量の増加として現れて!/ヽると考えられる。 PSIを反映する遅延発光が励起後数十秒の範囲で発光することは、参考文献 1及び参考文献 2に記載されている。

[0197] すなわち、励起後 10秒付近から 50秒までの発光量の増加は、光照射に伴う pQpo olの還元、及び、 PSIからの循環的電子伝達と P700との平衡状態を反映した pQpo olの還元の双方による還元型プラストキノンを反映する。本明細書では、主として、励起後 10秒から 50秒までの間に測定される遅延発光を、 PSIからの循環的電子伝達と P700との平衡状態を反映したものとして扱う。

[0198] 待機時間 2秒の場合には、第 1の励起光を照射後、待機時間を 2秒間設けた上で第 2の励起光を照射し遅延発光を測定している。そのため、この測定結果は、待機時間を 0秒とした場合と比較して、光合成電子伝達系の飽和がやや回復した時点のものであるといえる。この場合、図 28に示すように、待機時間の間に酸化型プラストキノンが生成されるために PSIIからの電子取出しが可能となり、待機時間 0秒で観察された励起後 0. 1秒力も 0. 5秒付近の発光量の増加は認められない。また、酸化型ブラストキノンの QB部位への移動も可能となるため、励起後 0. 5秒付近から 10秒付近までの発光量の減少の度合!、もやや低減する。

[0199] このことからすれば、還元型プラストキノンを反映する励起後 10秒付近から 50秒までの遅延発光の増加の程度も同様に低減するはずである。しかし、待機時間を 2秒間設けた場合には、励起後 10秒付近力も 50秒までの遅延発光が待機時間を 0秒とした場合よりも増加している。これは、 PSI以降の電子の逆流によるものであると考えられる。すなわち、待機時間を長くすることで増加する励起後 10秒付近力も 50秒までの遅延発光は、主として PSI以降の電子を反映して、ると、える。

[0200] 以上のように、図 23に示すような、互いに酸ィ匕還元状態が異なる各計測試料から得られる遅延発光の減衰曲線に基づいて、光合成電子伝達の飽和とその回復に伴う PSII、 pQpool, PSIにおける電子蓄積を評価することができる。例えば、励起後時間のうち、特徴的に発光量の増減が観察される時間帯として、励起後 0. 1〜0. 5秒、励起後 0. 6〜10秒及び励起後 10. 1〜50秒のそれぞれの時間帯の発光量の変化に注目すれば、力かる電子蓄積を明確に評価することができる。

[0201] このように、評価試料にっ、て、第 2の励起光の照射開始時期を変更しながら得た各遅延発光の発光量に基づ、て評価値を導出することで、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に評価することができる。また、第 1の励起光よりもエネルギー積算値が低くなるように第 2の励起光を照射した上で遅延発光の発光量が測定される。そのため、第 1の励起光の照射による酸化還元状態の変化を第 2の励起光の照射により妨げることなぐ且つ、遅延発光の減衰を防止することができる。その結果、遅延発光の発光量をより精度高く測定することが可能となる。

[0202] (積算値による試料の評価）

このように PSII、 pQpool、 PSIにおける電子蓄積を評価することは、光合成サンプルを含む試料を評価する上で有用である。具体的には、光合成サンプルを含む評価試料中に存在する環境要因を評価する上で有用である。より具体的には、光合成サンプルの光合成電子伝達の効率の評価、光合成反応を阻害する化学物質の評価、植物の生育診断、植物に対する有害物質の影響、農薬の機能解析及び光合成の研究に対して有用である。そこで測定された遅延発光の発光量 (遅延発光の強度)の積算値に基づ!、て試料を評価する手法につ!、て説明する。

[0203] 以下では、励起後時間 0. 1〜0. 5秒の積算範囲 (測定時間帯)、励起後 0. 6〜10 秒の積算範囲及び励起後 10. 1秒〜 50秒の積算範囲についてそれぞれ積算値を算出する場合について説明する。なお、積算範囲の設定はこれに限定されない。積算範囲の個数は、 1以上であれば何個でも構わない。また、積算範囲を複数設けた場合に、各積算範囲の時間幅を等しくする力しないかは任意である。更に、本実施形態のように積算範囲同士を互いに所定の時間だけ離すだけでなぐ積算範囲同士を接するように設けてもよいし (例えば、励起後時間 0. 1〜0. 5秒の積算範囲と励起後時間 0. 5秒〜 10秒の積算範囲を設ける）、積算範囲同士が所定の時間帯において重なり合うように設けてもよい (例えば、励起後時間 0. 1〜0. 5秒の積算範囲と励起後時間 0. 4秒〜 10秒の積算範囲を設ける)。

[0204] 図 29は、図 23に示した遅延発光の強度の減衰曲線について、上記 3つの積算範囲毎に積算値を算出した結果を示すグラフである。図 29の各グラフにおいて、横軸は測定条件を表し、縦軸は遅延発光の強度の積算値 (counts)を表す。なお、以下では、励起後時間 0. 1〜0. 5秒の積算範囲における積算値、励起後 0. 6〜10秒の積算範囲における積算値及び励起後 10. 1秒〜 50秒の積算範囲における積算値を、それぞれ積算値 1、積算値 2及び積算値 3という。図 29 (a)、図 29 (b)及び図 29 (c )は、それぞれ積算値 1、積算値 2及び積算値 3についてのグラフである。

[0205] まず、積算値 1に基づいて検討する。図 29 (a)に示すように、待機時間 0秒の場合の積算値 1は、飽和なしの場合のそれと比較して高い値となっている。これに対し、待機時間 2秒の場合の積算値 1と飽和なしの場合のそれとの差は大きくない。待機時間 0秒の場合の変化は、第 1の励起光の照射により、還元型プラストキノンが過剰に形成され、 PSII内の QB部位に結合し PSII内部から電子を受容可能な酸ィ匕型プラストキノンが不足することで、 PSII内の電子蓄積が増加した結果である。これに対し、待機時間を 2秒以上に設定した場合は、その待機時間中に酸ィ匕型プラストキノンが生成され、 PSII内の電子が取り出されたためである。すなわち、積算値 1は、 PSII内部の電子蓄積を反映する。積算値 1が高い場合は、 PSII内部に蓄積される電子が多く

、還元状態にあることを示している。

[0206] これを光合成サンプルの酸化還元状態の違!、による変化と!/、う観点力も検討する。

光合成電子伝達が通常の状態では、電子伝達を飽和させるような励起光の照射 (例えば第 1の励起光の照射）直後に pQpoolが還元状態になり、 QB部位に結合可能な酸化型プラストキノンが不足する。そのため、一過的に積算値 1が増加するが、飽和状態が回復する条件 (例えば、所定時間の待機）により解消する。したがって、飽和なしの場合の積算値 1と比較した、待機時間 0秒 (最も飽和に近い状態)の積算値 1 の増分が、電子伝達の飽和によって PSII内に蓄積された電子を表しているといえる。すなわち、飽和が回復する条件 (例えば、所定時間の待機）においてその増分が減少する過程が酸ィ匕型プラストキノンによる PSIIからの電子取出しを反映して、る。したがって、互いに光合成サンプルの酸化還元状態が異なる積算値 1同士の違いに注目することで、 PSII内部の電子蓄積、及び、電子の取り出しに対する環境要因（例えば有害物質)の作用を評価することができる。

[0207] 次に、積算値 2に基づいて検討する。図 29 (b)に示すように、積算値 2は、待機時間 0秒の場合に、飽和なしの場合の値と比較して最も値が減少している。待機時間が長くなるに従いその差は減少し、待機時間 60秒の場合では、積算値 2が飽和なしの場合と同等になる程度まで回復している。すなわち、積算値 2は、 PSIIの QB部位に結合して電子を受け取ることのできる酸ィ匕型プラストキノンを反映して、る。待機時間 0秒の場合には、第 1の励起光の照射により還元型プラストキノンが過剰に形成され、 PSII内の QB部位に結合して PSII内部から電子を受容可能な酸ィ匕型プラストキノンが不足する。このため、 QB部位に結合したプラストキノンの電子蓄積を反映した遅延発光が減少する。しかし、待機時間が長くなるに従って酸ィ匕型プラストキノンの生成が進み、 QB部位を介した遅延発光の量が回復する。

[0208] すなわち、飽和なしの場合の積算値 2と比較した、待機時間 0秒 (最も飽和に近!、状態）の積算値 2の差分が、強光照射による pQpoolの還元を表している。また、飽和が回復する条件下 (例えば、所定時間の待機)でその差分が減少する過程が、還元型プラストキノンカ^ ytb6fなどにより再酸ィ匕される過程を表している。したがって、互 Vヽに酸化還元状態の異なる積算値 2同士の違、に注目することで、 pQpoolの還元状態、及び、再酸化の過程に対する環境要因の作用を評価することができる。

[0209] 次に、積算値 3に基づいて検討する。図 29 (c)に示すように、積算値 3は、待機時間 2秒の場合に、飽和なしの場合の値と比較して最も値が増加し、待機時間 60秒の場合では飽和なしと同等になる程度まで減少して、る。待機時間を 2秒以上設けた場合の積算値 3は、主として PSI以降の電子蓄積を反映した還元型プラストキノンに相当するものといえる。すなわち、飽和なしの場合の積算値 3と比較した、待機時間 0 〜60秒のそれぞれの条件における積算値 3の増分力 PSI以降力循環的電子伝達や P700を介した逆反応により PSIIに到達する電子の流れを表して、る。したがつて、互いに酸ィ匕還元状態の異なる積算値 3同士の違いに注目することで、 PSI以降の電子蓄積、及び、循環的電子伝達に対する環境要因の作用を評価することができる。

[0210] このような積算値を用いることで、遅延発光の発光量の経時変化に現れる、光合成サンプルの酸ィ匕還元状態をより適切に抽出することが可能となる。その結果、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に評価することができる。また、上記のように、複数の積算値を算出した場合には、遅延発光の発光量の経時変化を把握することができるので、この経時変化を利用することにより酸化還元状態を適切に評価することができる。

[0211] 以上より、光合成電子伝達系の飽和とその回復を評価する方法として、互いに酸化還元状態が異なる状態を複数作り、これら各状態について遅延発光を測定し、 PSII 内部、プラストキノンプール及び PSI以降の電子蓄積を反映する遅延発光を表す指標（例えば、上記積算値 1、 2及び 3)を用いることが有効であることがわかる。

[0212] (環境要因の評価）

次に、光合成電子伝達系の飽和と回復を評価することにより光合成サンプルに対する環境要因の影響を評価する方法について説明する。その際、評価方法として、上記積算値 1、 2、 3を用いた評価手法を用いる。

[0213] ここでは、標準試料 (Cont)及び評価試料を用意する。各試料に含まれる光合成サンプルとして、上述したものと同様の緑藻を用いる。具体的には、 C (75)培地を希釈液として 685nm吸光度 OD685 = 0. 05〖こ調製し、気温 25°C± 1°Cの環境下で 50 μ mol'm— 2' s— 1の白色光を照射しながら 1時間培養した細胞懸濁液 2. 5mLを標準試料として用いる。一方、評価試料は、標準試料と同様の手順で調製した後、気温 25°C± 1°Cの環境下で 50 μ mol'm— 2' s— 1の白色光を照射しながら 1時間培養する際に、環境要因として 365nmの紫外線を 100 μ WZcm2の強度で添カロ（ UV照射)することにより得る。なお、遅延発光の発光量の測定は、標準試料及び評価試料を予め 60秒間暗中に静置して測定前の環境が光合成電子伝達系に与える影響を取り除き、光合成電子伝達系を一定の酸ィ匕還元状態に統一した後に行った。

[0214] 図 30は、標準試料における待機時間と遅延発光の発光量の経時変化との関係を示すグラフである。また、図 31は、評価試料における待機時間と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。各グラフには、飽和なし、待機時間 0秒、待機時間 1 0秒及び待機時間 60秒の各場合の遅延発光の発光量の経時変化が示されている。図 30と図 31とを比較すると、 UV照射により減衰曲線の形状が特徴的に変化していることがゎカゝる。

[0215] 以下、 UV照射が与える影響について詳細に説明する。図 32は、図 30及び 31に示した遅延発光の発光量に基づいて算出した、各試料についての積算値 1、 2及び 3を示すグラフであり、図 32 (a)、図 32 (b)及び図 32 (c)は、それぞれ積算値 1、積算値 2及び積算値 3についてのものである。

[0216] まず、標準試料について見ると、 PSII内部の電子を反映する積算値 1は、待機時間 0秒の場合に最大値を示し、待機時間が 10秒及び 60秒の場合に飽和なしの場合と同程度の値を示している。これは、上述したように、第 1の励起光照射直後 (待機時間 0秒の場合)だと、 pQpoolに還元型プラストキノンが多く存在し PSIIから電子を取り出すことのできる酸ィ匕型プラストキノンが少なくなることで、 PSII内部の電子蓄積が増加するためである。これに対し、待機時間 10秒及び 60秒の場合には、その待機時間の間に酸ィ匕型プラストキノンが生成されるので、光合成電子伝達系が PSIIの電子伝達反応が円滑に進んでいる飽和なしの場合と同等な程度まで回復する。

[0217] これに対し、 pQpoolの電子を反映する積算値 2は、待機時間 0秒で最小値を示し、待機時間が長くなるにつれ徐々に増加して飽和なしの値に近づく。これは、上述したように、第 1の励起光照射直後 (待機時間 0秒の場合)だと、 pQpoolに還元型プラストキノンが多く存在し、 PSII内のプラストキノン結合部位である QB部位に結合可能な酸ィ匕型プラストキノンが不足しているためである。一方、待機時間が所定の時間だけ設けられるとその待機時間の間に酸ィ匕型プラストキノンが生成されるので、光合成電子伝達系が飽和なしの場合と同等な程度まで回復する。

[0218] 更に、 PSI以降の電子を反映する積算値 3は、飽和なし、待機時間 0秒及び待機時間 60秒の場合でほぼ同じ値をとり、待機時間 10秒の場合のみ値が増加する。これは、 PSI以降のフェレドキシンや NADPHに蓄えられた電子がフェレドキシンを介して酸化型プラストキノンに伝達され還元型プラストキノンを生じる循環的電子伝達反応や、 P700を介した逆反応などによる遅延発光を反映するものである。積算値 3に反映される遅延発光は、積算値 1又は積算値 2に反映される遅延発光と比較して多くの反応経路を経由するので、待機時間 0秒の場合よりも待機時間 10秒の場合の方が高い値をとる。この積算値 3は、待機時間 60秒の場合には飽和なしの場合と同等まで回復する。

[0219] 次に、 UV照射を行った評価試料について見ると、 PSII内部の電子を反映する積算値 1は、待機時間 0秒の場合で増加せず、待機時間 10秒及び 60秒の場合でも大きな変化はみられない。これは、紫外線照射により PSIIに何らかの変化が生じていることを示唆する。

[0220] これに対して、 pQpoolの電子を反映する積算値 2は、標準試料のそれと比べてやや減少しているものの、待機時間 0秒で最小値を示し、待機時間が長くなるにつれ徐々に飽和なしの値に近くなつていく傾向は変わらない。これは、紫外線照射が pQpo olの作用にそれほど影響を及ぼさな、ことを示唆する。

[0221] 更に、 PSI以降の電子を反映する積算値 3は、飽和なしの場合と待機時間 60秒の場合とでほぼ同じ値になっている力、待機時間 10秒の場合に加え、待機時間 0秒の場合でも値が増カロしている。これは、紫外線照射により、 PSIを介して酸ィ匕型プラストキノンに伝達され還元型プラストキノンを生じる循環的電子伝達反応や、 P700を介した逆反応が増加したことを示唆する。

[0222] (評価値算出方法）

次に、上記の評価ステップにおける評価値の算出（導出）方法について説明する。この説明は、第 2の照射条件が上述の待機時間 (待機時間 0秒、待機時間 10秒及び待機時間 60秒)であり、評価値が上記積算値 1、 2及び 3に基づくものであることを前提とする。更に、飽和なしの場合についても同様に上記積算値 1、 2及び 3が算出されていることも前提とする。

[0223] まず、光合成サンプルの PSIIの電子蓄積状態を評価するための評価値を算出する方法について説明する。このような評価値の一つとして、例えば、 PSIIの電子蓄積がどのように変化したかを示す PSIIの電子蓄積の変化（ell)がある。この値 ellは、（評価試料の積算値 1)Z (標準試料の積算値 1) X 100によって求めることができる。

PSIIの電子蓄積の変化 (ell)は、飽和なし、待機時間 0秒、待機時間 10秒及び待機時間 60秒の各条件について算出することができる。

[0224] PSIIの電子蓄積の変化（ell)が 100を超えているということは、 PSIIの電子蓄積が増加していることを示す。例えば、飽和なしの条件においてこの ellを算出すれば、強光の影響のない標準的な条件下 (例えば、飽和なしの場合）における PSIIの電子蓄積の変化を評価することができる。

[0225] 上述したように、待機時間 0秒における一過的な積算値 1の増加は、 PSIIからの電子取出しが律速となったことによる PSIIの電子蓄積の増加を反映して、る。この積算値 1の一過的増加は、光を照射しない待機時間を設けることにより飽和なしと同等まで回復する。例えば、ある待機時間での PSIIからの電子取出し能力は、待機時間 0 秒での積算値 1の一過的増加が、その待機時間を設けることでどの程度減少したかにより評価できる。そこで、待機時間 0秒力ある条件までの PSIIの電子取出し能力（ tn)を評価値として算出する。この値 tnは、（(待機時間 0秒の場合の積算値 ι)Ζ (飽和なしの場合の積算値 1)一 (ある待機時間における積算値 ι)Ζ (飽和なしの場合の積算値 1) ) X 100によって求めることができる。

[0226] 待機時間 0秒力ある待機時間までの PSIIの電子取出し能力（til)が大きければ、待機時間 0秒力もある待機時間までに PSIIの一過的な電子蓄積が多く解消されたことを示す。逆に、この値 tnが負の値となった場合には、待機時間 0秒カゝらある待機時間まで PSIIの電子蓄積が何らかの要因により増加したことを示す。

[0227] さらに、環境要因を与えていない標準試料についての、待機時間 0秒力もある条件までの PSIIの電子取出し能力（til)と、ある環境要因を与えた評価試料についてのそれと比較することにより、 PSIIからの電子取出しがどのように変化したかを知ることができる。そこで、この変化を示す値として、待機時間 0秒力もある条件までの PSIIの電子取出しの変化 (vll)を評価値として算出する。この値 vllは、（評価試料の tn) Z ( 標準試料の til) X 100によって求めることができる。この値 vllが 100であれば、 PSII 力の電子取出し能力が環境要因により変化していないことを示す。これに対し、この値 vllが小さい場合には PSIIからの電子取出し能力が低下していることを示し、負の値になった場合は PSIIに電子が流入していることを示す。

[0228] また、本実施形態に係る光合成サンプルの評価方法によれば、光合成サンプルの pQpoolの酸ィ匕還元状態を評価することができる。例えば、 pQpoolの酸化還元状態を反映する積算値 2を用いて評価値を導出することが可能である。

[0229] 本実施形態では、予め光合成サンプルを 60秒間暗中に静置して、るため、飽和なしの場合には、光照射により生成される還元型プラストキノンが再酸化され、 pQpool がほぼ酸化された状態になる。また、第 1の励起光を照射した直後である待機時間 0 秒では、 pQpoolがほぼ全て還元され、酸ィ匕型プラストキノンがほとんど存在しない状態である。すなわち、飽和なしの場合の積算値 2と待機時間 0秒の場合の積算値 2との差分は、光照射による酸ィ匕還元反応の大きさを表している。そこで、この大きさを示す値として、酸化還元反応の大きさ（sQ)を評価値として算出する。この値 sQは、（飽和なしの場合の積算値 2)—（待機時間 0秒の場合の積算値 2)によって求めることができる。

[0230] この値 sQを標準試料及び評価試料の双方について算出し、これらを比較することにより、環境要因によって光合成サンプルの酸ィ匕還元反応の大きさがどのように変化したかを知ることができる。そこで、標準試料についての酸ィ匕還元反応の大きさ（sQ) に対する評価試料についての酸化還元反応の大きさ（sQ)の割合を、 sQの環境要因による変化 (vQ)という評価値として算出する。この値 vQは、（評価試料の _SQ)Z( 標準試料の _SQ) X 100によって求めることができる。

[0231] 上述したように、待機時間 0秒にぉ、てほぼ還元状態にある pQpoolは、待機時間を設けることで cytb6fによる再酸ィ匕反応が進み酸ィ匕型プラストキノンが生成されるため、飽和なしの状態に回復していく。つまり、 pQpoolの酸化還元状態を反映する積算値 2について、ある待機時間における積算値 2と待機時間 0秒における積算値 2とを比較することにより、その待機時間での酸ィ匕型プラストキノンの生成量を知ることができる。この酸化型プラストキノンの生成量は、 cytb6fによる再酸化反応が阻害されると減少し、 cytb6fにお、て酸ィ匕型プラストキノンを還元する循環的電子伝達が阻害されると増加する。そこで、ある待機時間での酸ィ匕型プラストキノンの生成量 (oQ) を評価値として算出する。この値 oQは、（ある待機時間での積算値 2) - (待機時間 0 秒での積算値 2)によって求めることができる。

[0232] 更に、 pQpoolの酸ィ匕還元反応の大きさに対する、ある待機時間での酸ィ匕型プラストキノンの割合（％oQ)は、（ある待機時間での oQ) ZsQ X 100によって求めることができる。

[0233] また、本実施形態に係る光合成サンプルの評価方法によれば、光合成サンプルの PSIの電子蓄積の状態を評価することができる。例えば、遅延発光の計測結果から算出した PSIの電子蓄積の状態を反映する積算値 3を用いて評価値を導出することが可能である。

[0234] 具体的には、ある待機時間における標準試料の積算値 3と評価試料の積算値 3とを比較することにより、 PSIの電子蓄積がどのように変化したかを知ることができる。そこで、 PSIの電子蓄積の変化 (el)を評価値として算出する。 PSIの電子蓄積の変化（ el)は、（評価試料の積算値 3) Z (標準試料の積算値 3) X 100によって求めることができる。この値 elは、飽和なし、待機時間 0秒、待機時間 10秒及び待機時間 60秒の各条件において算出することができる。この値 elが 100を超えているということは、 PS Iの電子蓄積が増加していることを示す。例えば、飽和なしの条件において PSIの電子蓄積の変化 (el)を算出すれば、強光の影響のない標準的な条件下での PSIの電子蓄積の変化を評価することができる。 [0235] 上述したような第 1の励起光を照射すると PSIの電子蓄積が増加する。 PSIの電子の一部は、循環的電子伝達経路により pQpoolを還元し、還元型プラストキノンを生じる。還元型プラストキノンに伝えられた電子の多くは、 pQpoolから QB部位及び QA 部位を介して PSII反応中心 (P680)で遅延発光を生じる。飽和なしの場合の積算値 3に対して、待機時間 10秒の場合の積算値 3がー過的に上昇する。すなわち、ある待機時間を設けた場合の積算値 3から飽和なしの場合の積算値 3を減算した差分がその待機時間での PSIからの循環的電子伝達を表している。そこで、この PSIからの循環的電子伝達 (cl)を評価値として算出する。この値は、（ある待機時間での積算値 3) Z (飽和なしでの積算値 3) X 100によって求めることができる。

[0236] 以上のように、本実施形態により酸化還元状態の変化を評価することができる。例えば、上述のように評価試料に環境要因 (例えば、紫外線や化学物質など)を与えれば、その環境要因が光合成サンプルに対して有害力否力また、その環境要因がどのような作用を持っているのかを評価することができる。更に、評価試料を調整する際に河川水や土壌抽出水を用いれば、これらの水に含まれている環境要因（有害もしくは有益な化学物質)を評価することができる。

[0237] 本実施形態で示す酸化還元状態の変化の評価の有用性は上述したものに限定されない。例えば、植物の生育診断、植物に対する化学物質の影響、農薬の機能解析-開発及び光合成の研究に利用することも可能であると考えられる。

[0238] (光合成サンプルの評価プログラム）

次に、図 33及び 34を用いて、実施形態に係る光合成サンプルの評価プログラム（以下、単に「評価プログラム」という） 50について説明する。図 33は、実施形態に係る評価プログラム 50の構成を記録媒体 60と共に示す図である。また、図 34は、図 33に示す評価プログラム 50が動作するコンピュータ 70のハードウェア構成を示す図である。

[0239] この評価プログラム 50がコンピュータ 70と協働することで、そのコンピュータ 70が遅延発光計測装置 1として動作することが可能となる。これにより、上述した光合成サンプルの評価をそのコンピュータ 70上で実現することができる。

[0240] 図 33に示すように、評価プログラム 50は、光源制御モジュール 51と、検出制御モジュール 52と、演算モジュール 53を備えている。光源制御モジュール 51は光源制御部 31に対応し、検出制御モジュール 52は検出制御部 32に対応し、演算モジユール 53は演算部 22に対応する。すなわち、光源制御モジュール 51によりコンピュータ 70が第 1励起手段及び第 2励起手段として機能し、検出制御モジュール 52によりコンピュータ 70が測定手段として機能し、演算モジュール 53によりコンピュータ 70が評価手段として機能する。

[0241] 図 34に示すように、コンピュータ 70は、オペレーティングシステムやアプリケーションプログラムなどを実行する CPU71、 ROM及び RAMで構成される主記憶装置 72 、ハードディスクなどで構成される補助記憶装置 73、ネットワークカードなどの通信制御装置 74、モニタやプリンタなどの出力装置 76、キーボードやマウスなどの入力装置 75で構成される。図 33を示して説明した各モジュールは、図 34に示す CPU71や主記憶装置 72の上に所定のソフトウェアを読み込ませ、 CPU71の制御の下で通信制御装置 74を動作させるとともに、主記憶装置 72や補助記憶装置 73におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。

[0242] この評価プログラム 50によれば、異なった第 2の照射条件毎に遅延発光の発光量を測定することができるので、より詳細な評価値を導出することができる。その結果、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に且つ簡便に評価することができる。

実施例 1

[0243] 以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではな、。

[0244] 光合成サンプルとして緑藻を用いた。そして、 C (75)培地を希釈液として 685nm 吸光度 OD685 = 0. 05に調製した後に気温 25°C士 1°Cの環境下で 50 mol · m— 2' s— 1の白色光を照射しつつ 1時間培養した細胞懸濁液 2. 5mLを標準試料とした。一方、評価試料は、 3- (3,4- dichlorophenyl)- 1,1- dimethyHirea (DCMU)を 12ug ZLの度で露した ¾の、 2,5- dibromo- 6- isopropyl- «3- methyト 1,4- benzoquinone ( DBMIB)を 322ugZLの濃度で曝露したもの及び AntimycinA (Ant -A)を 0. 55m gZLの濃度で曝露したものを用意した。これらの化学物質は、いずれも光合成電子伝達の阻害剤である。以下、 DCMU、 DBMIB及び Ant— Aを曝露した試料をそれぞれ DCMU曝露試料、 DBMIB曝露試料及び Ant— A曝露試料という。そして、標準試料及び 3種類の曝露試料のそれぞれについて、飽和なし、待機時間 0秒、待機時間 10秒、待機時間 60秒の各条件で上述の評価方法を実施した。光合成サンプルの酸化還元状態は、これらの各条件で異なる。

[0245] 図 35〜38は、それぞれ、実施例における標準試料、 DCMU曝露試料、 DBMIB 曝露試料及び Ant— A曝露試料につヽての遅延発光の発光量の経時変化 (減衰曲線)を示したグラフである。図 35〜38に示すように、化学物質を曝露したことにより、各曝露試料についての減衰曲線の形状が変化した。

[0246] 以下、積算値を用いてこれら減衰曲線の形状の変化を詳細に説明する。この説明のために、図 39〜図 41を用いる。図 39は、実施例における標準試料の積算値と DC MU曝露試料の積算値とを比較したグラフであり、図 39 (a)、図 39 (b)及び図 39 (c) は、それぞれ積算値 1、積算値 2及び積算値 3についてのグラフである。図 40は、実施例における標準試料の積算値と DBMIB曝露試料の積算値とを比較したグラフであり、図 40 (a)、図 40 (b)及び図 40 (c)は、それぞれ積算値 1、積算値 2及び積算値 3についてのグラフである。図 41は、実施例における標準試料の積算値と Ant— A 曝露試料の積算値とを比較したグラフであり、図 41 (a)、図 41 (b)及び図 41 (c)は、それぞれ積算値 1、積算値 2及び積算値 3についてのグラフである。

[0247] まず、各曝露試料に共通する標準試料の結果について説明する。 PSII内部の電子を反映する積算値 1は、待機時間 0秒の場合に最大値を示したのに対し、待機時間 10秒及び待機時間 60秒の場合には、飽和なしと同程度の値をとつた。これは、上述したように、第 1の励起光照射直後には pQpoolに還元型プラストキノンが多く存在し、 PSIIから電子を取り出すことのできる酸化型プラストキノンが少なくなつて PSII内部の電子蓄積が増加するためである。待機時間 10秒及び 60秒の場合には、その待機時間の間に酸化型プラストキノンが生成されたことで、 PSIIの電子伝達反応が円滑に進む飽和なしの状態と同等まで回復したと理解できる。

[0248] pQpoolの電子を反映する積算値 2は、待機時間 0秒の場合に最小値を示し、待機時間が長くなるにつれ徐々に飽和なしの場合の値に近づいていった。これは、上述したように、第 1の励起光照射直後では pQpoolに還元型プラストキノンが多く存在しており、 PSII内のプラストキノン結合部位である QB部位に結合可能な酸ィ匕型プラストキノンが不足しているためである。酸ィ匕型プラストキノンは待機時間の間に生成されるので、待機時間 60秒の場合には、飽和なしの場合と同等まで回復した。

[0249] PSI以降の電子を反映する積算値 3は、飽和なし、待機時間 0秒及び待機時間 60 秒の場合でほぼ同じ値となり、待機時間 10秒の場合のみ値が増加した。これは、 PS I以降のフェレドキシンや NADPHに蓄えられた電子がフェレドキシンを介して酸化型プラストキノンに伝達され、還元型プラストキノンを生じる循環的電子伝達反応や、 P7 00を介した逆反応などが生じたためである。積算値 3で示される反応は、積算値 1又は積算値 2で示される反応と比較して多くの反応経路を経由するため、待機時間 0秒の場合よりも待機時間 10秒の場合の方が発光量が多くなる。積算値 3は、待機時間 60秒の場合には飽和なしの場合と同等まで回復した。

[0250] 次に、各曝露試料固有の結果について説明する。まず、 DCMU曝露試料の結果について説明する。 DCMUは、 PSIIの中にある QB部位への酸化型プラストキノンの結合を阻害することにより、 PSII内部から pQpoolへの電子の移動を阻害する。したがって、還元型プラストキノンの生成が阻害され、プラストキノンプールでは酸ィ匕型プラストキノンの存在量が多くなる。プラストキノンプールの電子蓄積が減少した結果、 cytb6fによるプロトン勾配の形成、光化学系 I (PSI)への電子供給の低下及び NA DPH合成の減少が発生する。

[0251] DCMU曝露試料の積算値 1は、飽和なし、待機時間 10秒及び待機時間 60秒の各場合で標準試料の値の 2倍近、値を示し、標準試料に関するデータの中で最も飽和に近い状態にある待機時間 0秒の場合よりも高い値となった。標準試料では、飽和なしの場合よりも待機時間 0秒 (飽和状態)の方が積算値 1が大きくなつたのに対し、 DCMU曝露試料では逆の結果となった。また、 DCMU曝露試料では、飽和が回復する場合 (待機時間 10秒及び 60秒の場合）においても値が減少しなカゝつた。これにより、 PSII内部からの電子取出しが強光照射による電子伝達の飽和とは無関係に阻害されていることがわかった。これは、 DCMUが PSIIの電子伝達を阻害する事と一致している。 [0252] なお、標準試料と DCMU曝露試料とで待機時間 0秒の場合に顕著な差は見られな力つたのは、第 1の励起光照射直後では PSII内での循環的電子伝達などの電子消散機構が働、て、るためであると考えられる。

[0253] DCMU曝露試料の積算値 2は、全ての条件において標準試料のそれよりも低くなつた。しかし、待機時間 0秒の場合に最小値を示し、待機時間が長くなるにつれ徐々に飽和なしの場合の値に近づいていく傾向は、標準試料の結果と同じであった。これは、 pQpoolにおける電子蓄積は低下したが、還元型プラストキノンを再酸化する過程は阻害されなかったことを示している。これは、 DCMUが PSII以降への電子伝達を低下させるが、それ以外の反応を阻害しな、ことと一致して、る。

[0254] DCMU曝露試料の積算値 3は、全ての条件において標準試料のそれよりも低くなつた。更に、 DCMU曝露試料の積算値 3は、待機時間 0秒及び 10秒の場合に飽和なしの場合より高、値となった。標準試料では認められな、待機時間 0秒での値の増加の違いがあるものの、基本的には標準試料と同じ傾向であった。これは、 PSI以降からの逆反応による PSIIへの電子流入は減少した力 PSI以降からの電子の逆流は阻害されなかったことを示している。これは、 DCMUが PSII以降への電子伝達を低下させるが、それ以外の反応を阻害しな、ことと一致して、る。

[0255] 次に、 DBMIB曝露試料の結果について説明する。 DBMIBは、 cytb6f複合体のプラストキノン結合部位に結合し還元型プラストキノンの酸ィ匕を阻害する。したがって、 pQpoolでは還元型プラストキノンの存在量が増加し酸化型プラストキノンの存在量が減少する。

[0256] DBMIB曝露試料の積算値 1は、全ての条件で標準試料のそれよりも高くなつた。

しかし、飽和なしの場合と比較して待機時間 0秒で値が増加し、待機時間 10秒及び 60秒の場合に飽和なしの場合と同程度にまで回復したことは、標準試料の場合と同じであった。このことは、 PSII内部の電子蓄積は増加した力 PSIIからの電子の取り出しそのものは阻害されな力つたことを示している。これは、 DBMIBが酸化型プラストキノンの生成を阻害し、 PSIIからの電子の取り出しが低下することと一致する。

[0257] DBMIB曝露試料の積算値 2と標準試料の積算値 2とを比較したところ、最も飽和に近い状態にある待機時間 0秒の場合では大きな差は認められな力つた。しかし、それ以外の条件 (飽和なし、待機時間 10秒及び待機時間 60秒)では、 DBMIB曝露試料の積算値 2の方が標準試料のそれよりも低くなつた。すなわち、 DBMIB曝露試料では、最も飽和に近、状態 (待機時間 0秒)での積算値 2と飽和なしの状態での積算値 2との差が少なくなつた。これは、飽和なしの条件で、強光照射が無いにもかかわらず pQpoolが還元状態になり、 pQpoolの酸ィ匕型プラストキノンの存在量が増加したためである。このことは、 DBMIBが還元型プラストキノンの酸ィ匕を阻害する力それ以外の電子伝達を阻害しな、ことと一致する。

[0258] DBMIB曝露試料の積算値 3と標準試料の積算値 3とを比較したところ、飽和なし、待機時間 0秒及び待機時間 60秒の各場合では、両者の間に大きな差は認められなかった。しかし、待機時間 10秒の場合について比較したところ、標準試料では値が比較的大きく増加したのに対し、 DBMIB曝露試料での増分は標準試料の場合よりも低いものであった。これは、 PSI以降から pQpoolへの電子の流れが低下したことを示している。このことは、 DBMIBが PSIからプラストキノンへの電子の流れの一つである循環的電子伝達の電子受容体となる酸ィヒ型プラストキノンの存在量を低下させることと一致する。

[0259] 次に、 Ant— A曝露試料の結果について説明する。 Ant— Aは、 PSIのフェレドキシン (Fd)を介して cytb6fの酸化型プラストキノンへ電子を伝達し、還元型プラストキノンを生じる循環的電子伝達を阻害する化学物質である。すなわち、 Ant— Aは、 P SIから pQpoolへ電子を循環させる反応を阻害する。

[0260] Ant— A曝露試料の積算値 1と標準試料の積算値 1とを比較したところ、飽和なし、待機時間 0秒及び待機時間 60秒の各場合では大きな差は認められなカゝつた。また、待機時間 0秒の場合には飽和なしの場合よりも積算値 1が増力!]した点も同様であった。しかし、待機時間 10秒の場合に注目すると、標準試料では積算値 1が飽和なしと同じ程度まで減少したのに対して、 Ant— A曝露試料では待機時間 0秒の場合と同様に増加しており、待機時間 60秒の場合に飽和なしと同等まで減少した。本来 PSII 内部の電子蓄積が解消されているはずの待機時間 10秒においても PSII内部の電子蓄積が多い状態にあったことについては、 PSIIからの電子取出しが阻害されたのではなぐ飽和の回復が遅力つた力、又は、異なる経路力も PSIIに電子が流入した可能性が考えられる。

[0261] Ant— A曝露試料の積算値 2は、全ての条件において標準試料の場合よりも発光量が低くなつた。しかし、待機時間 0秒の場合に最小値を示し、待機時間が長くなるにつれ徐々に飽和なしの値に近づく傾向は、標準試料の場合と同じであった。このことは、標準試料に比べて酸ィ匕型プラストキノンが減少しているが（pQpoolが還元状態である） 1S cytb6fにおける酸ィ匕型プラストキノンの生成は阻害されていないことを表している。このことは、 Ant— A力cytb6fにおける酸化型プラストキノンの生成を阻害しないことと一致する。

[0262] Ant— A曝露試料の積算値 3は、全ての条件において標準試料よりも発光量が低くなった。また、標準試料において観察された、待機時間 10秒における積算値 3の増カロも観察されな力つた。上記のように、待機時間 10秒における積算値 3の増加には循環的電子伝達が関与していると考えられるので、この結果は、 PSI以降の電子蓄積が減少し且つ PSIから pQpoolへ至る電子の流れが阻害されたことを表しているといえる。 PSIから pQpoolへの電子の流れが阻害されたことは、 Ant— Aが循環的電子伝達を阻害することと一致する。 PSIIの電子蓄積の減少についても、循環的電子伝達の阻害により pQpoolから再度 PSIに流入する電子が減少したためと考えられる。循環的電子伝達の阻害により行き場を失った電子は何らかの機構により PSIIに移動し、その結果、上述した待機時間 10秒における積算値 1の増加を引き起こしたという可能性も考えられる。

[0263] 次に、図 42〜44を用いて、実施例における標準試料および各曝露試料の測定値に基づいて上述の評価値算出方法を実施して得た値 ell、 vll、 vQ、％oQ、 el及び cl について説明する。図 42は、各試料の飽和なしにおける値 ell及び vllを示す表である。図 43は、各試料の値 vQ及び％oQを示す表である。図 44は、各試料の飽和なしにおける値 el及び clを示す表である。

[0264] 図 42に示すように、 DCMU曝露試料の飽和なしにおける値 ellは 188であったので、標準試料の場合よりも PSIIでの電子蓄積が増加したことがわかる。また、 DCMU 曝露試料の vllが負の値となったことから、 PSIIからの電子取出しはなぐ逆に PSII に電子が流入している状態であったことがわかる。これは、 PSIIからの電子取出しを阻害し、 PSIIの電子蓄積を増加させる DCMUの作用と合致する。

[0265] また、図 43に示すように、 DBMIB曝露試料は値 vQが 30となった。これは、標準試料に比べ光照射による酸ィ匕還元反応が減少したことを示している。また、値％₀<3について見ると、標準試料では、待機時間 10秒で 36、待機時間 60秒で 107であったのに対して、 DBMIB曝露試料では、待機時間 10秒で 4、待機時間 60秒で 22というように、標準試料の場合と比較して減少した。これは、 DBMIB曝露試料では、標準試料と比べて pQpoolの酸ィ匕還元反応が低下し cytb6fでのプラストキノンの再酸ィ匕が低下したことを示す。このことは、 cytb6fでのプラストキノンの再酸化反応を阻害する DBMIBの作用と合致して!/、る。

[0266] また、図 44に示すように、 Ant— A曝露試料の飽和なしにおける値 elは 89であり、 PSIの電子蓄積は標準試料の場合比較してそれほど減少していない。しかし、標準試料の待機時間 10秒における値 clが 38であるのに対して、 Ant— A曝露試料の待機時間 10秒における値 clは— 12となっている。これは、 Ant— A曝露試料では、 PS Iの電子蓄積がそれほど変化しな力つた力 PSIから pQpoolへの循環的電子伝達などによる電子の流入が低下したことを示す。このことは、循環的電子伝達を阻害する Ant— Aの機能と合致して、る。

[0267] 以上、 DCMU、 DBMIB及び Ant— Aを用いた計測結果から、有害物質を曝露しな、標準試料と有害物質を曝露した曝露試料とにつ、て、異なる酸化還元状態の光合成サンプルの遅延発光を計測して計測結果を比較することで、有害物質の有無及びその光合成電子伝達反応への作用の違いを評価することができることがわ力つた。このような特徴は、化学物質生態リスク評価に代表される、藻類などの光合成サンプルに対する有害物質の影響の評価に対して有用である。

[0268] 以上、本発明をその実施形態に基づいて詳細に説明した。しかし、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で以下のような様々な変形が可能である。

[0269] 上記実施形態では、測定された遅延発光の発光量を測定時間帯毎に積算した積算値に基づいて評価値を導出したが、評価値の導出方法はこれに限定されない。例えば、遅延発光の発光量の経時データ (減衰曲線)が予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように当該複数の関数の係数値を決定し、この係数値に基づ、て評価値を導出してもよ、。

[0270] 遅延発光の発光量の経時データを経時データ関数にフィッティングする手法 (以下「フィッティング手法」という）について詳細に説明する。フィッティング手法を利用するために、複数の関数の情報を予め遅延発光計測装置 1の記録部 21に記憶させておく。関数としては、山型の関数を用いることが好ましい。山型の関数とは、形状が山型になる関数のことで、所定の変数値において関数値が最大値となり、当該所定の変数値以下の変数値では単調非減少、当該所定の変数値以上の変数値では単調非増加な関数である。

[0271] 複数の関数としては、例えば、 ai, bi, ci (i= l, 2, 3)を複数の関数の係数値、 tを基準時刻からの経過時間 (励起後時間）を示す変数としたときに、それぞれ

[数 8] . .ノ )

で示されるローレンツ関数 (コーシ一分布）を用いることが考えられる。係数値 aiは時間方向への広がり、係数値 biは発光量が最大値を取る励起後時間 t、係数値 ciは最大値の極大値に、それぞれ影響する。

[0272] この場合、フィッティングに用いる複数の関数の和は、

[数 9] fm (t) = 10^1+a>⁽^⁾² _{+ 10}'+ (' - ¾·)² _{+ 10} ι+",(Ά)² ... (4) となる。ここで、励起後時間 tの基準時刻は、例えば、光源 12からの光の照射が終了した時刻から予め設定した所定の時間が経過した時刻とする。また、上記 (4)の式において、右辺の第 1項、第 2項、第 3項を、それぞれ時間軸上で最大値の現れる順番で、第 1関数、第 2関数、第 3関数というように表す。すなわち、複数の関数の係数において、 bl < b2< b3の関係が成立する。

[0273] なお、フィッティング手法で用いる関数はこれに限定されず、二次関数、正規分布関数等の他の山型の関数を用いてもよい。また、よくフィッティングする関数であれば、山型の関数でなくてもよい。例えば、上記 (4)で示される式に更に係数 di (i= l, 2, 3)を加えた、以下の式で表される関数を用いてもよい。

[数 10] fm i) = 10 ^]+α' '-^"' + ₁₀ ¹⁺。 — ) ' _{+ 10}1+。₃ - . . . _{( 5} )

[0274] フィッティング手法を実施するためには、フィッティングを行うためのアルゴリズムについても予め記録部 21に記憶させておく。例えば、シンプレックス法、 Gauss- Newton 法、 Davidon

Fletcher Powell法、 Brent法、モンテカルロ法及びシミュレ一テッド 'アニーリング法をフィッティングを行うためのアルゴリズムとして用いることができる。

[0275] そして、上記フィッティング手法で算出された係数値に基づいて評価値を導出する。例えば、記録部 21が予め記憶している、評価値を算出するための式に基づいて評価値を算出する。

[0276] このようなフィッティング手法を用いることで、客観的に評価値を導出することが可能となる。また、遅延発光の発光量の経時変化を、例えば上記 (4)で示される式又は上記（5)で示される式にフィッティングさせて、るので、図 19などを用いて説明した遅延発光のメカニズムに基づいた評価が可能になる。したがって、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に評価することができる。

[0277] 上記実施形態では、遅延発光の発光量の測定を複数回繰り返す際に変更する第 2の照射条件として待機時間を採用したが、変更する第 2の照射条件はこれに限定されない。光合成サンプルの酸化還元状態は、光合成サンプルに照射する光のエネルギ一と光合成サンプルの電子伝達の効率とに依存するので、例えば、第 2の励起光の光量、波長、パルス幅及び照射時間のうち少なくとも一つを変更してもよい。第 2 の励起光に関するこれらの条件は、図 19などを用いて説明した光合成サンプルの酸化還元状態の変化と密接に関係する。そのため、これらの要素のうち少なくとも一つを変更しながら第 1の励起光の照射及び第 2の励起光の照射を複数回繰り返し、測定された各発光量に基づく評価値を導出することで、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に評価することができる。

[0278] また、温度や電場など、光合成サンプルの電子伝達効率が変化するような環境要因を負荷条件として採用してもよい。負荷条件としては光照射条件、暗黒条件、温度条件、電場条件、磁場条件、 pH条件などが挙げられ、これらの負荷条件を用いても、複数の酸ィ匕還元状態を発生させることができる。そのため、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態を適切に評価することができる。

[0279] 例えば、上記実施形態における第 1の照射条件及び待機時間に代えて、温度条件を採用することも可能である。温度は電子伝達系の伝達速度に影響するため、温度が高いほど光合成サンプルの電子伝達が促進される。したがって、評価試料に負荷する温度条件を制御することにより、評価試料に含まれる光合成サンプルの酸化還元状態が異なる状態を段階的に作り出すことができる。

[0280] 上記実施形態における第 1の照射条件及び待機時間に代えて、暗黒条件を採用することも可能である。暗黒条件下では、光合成機能が休止状態になり、光合成サンプルの光合成電子伝達効率が低下する。暗黒条件が長くなるにつれて低下量は大きくなるが、ある一定の期間に達すると変化しなくなる。測定条件により異なるが、一例として光合成サンプルを暗中にぉ、て遅延発光を測定すると、励起後約 10秒以降の遅延発光量に低下がみられる。更に、この暗黒条件の長さが一定期間に達すると発光量の低下は止まり、一定となる。

[0281] 上記実施形態における第 1の照射条件及び待機時間に代えて、光照射条件として紫外線を採用することも可能である。紫外線は光合成機能に障害を与えるが、その影響の大きさは、波長および照射量 (照射強度 X照射時間）により変化する。波長が短く照射量が多いほど光合成サンプルに対する負荷 (ストレス）は大きくなり、光合成サンプルの電子伝達効率が低下する。

[0282] 上記実施形態における第 1の照射条件及び待機時間に代えて、 pH条件を採用することも可能である。 pHは、主に細胞内の呼吸鎖に関わるミトコンドリア内膜、および、光合成の電子伝達系に関わる葉緑体のチラコイド膜内の水素イオン濃度が高くなるプロトン勾配の形成に影響する。藻類におけるその影響の大きさは、藻類細胞懸濁液 (培養液)の pHと光合成サンプル (使用藻類)のチラコイド膜内部の pHとの差が少なくなると光合成サンプルに対する負荷 (ストレス）が大きくなる点に表れる。また、極端に高、または低、pHは光合成サンプルに対して物理的なストレスとなる。 [0283] これらの負荷条件は組み合わせて用いることも可能である。光合成サンプルに複数の負荷条件による負荷をかけることにより、光合成サンプルの酸ィ匕還元状態が異なる状態を段階的に作り出すことができる。

[0284] 本発明にお、て、特徴値とは、光合成サンプル力発生する遅延発光の発光量の経時データにおける複数の時間帯に対して特徴を示す値のことをヽぅ。特徴値は各時間帯に一つずつ算出してもよいし、複数算出してもよい。特徴値としては、 1以上の測定時間帯毎に積算した遅延発光の発光量の積算値、遅延発光の発光量の経時変化を関数の和としてフィッティングして得られる係数値などが挙げられる。

[0285] 評価値とは光合成サンプルの状態を評価するための値であり、評価値は特徴値を重み付けすることにより算出される。ここでいう重み付けとは、評価する条件に対して、重要度の高い特徴値が評価値へ与える影響を高くするというものである。評価する条件に対して重要度の低い特徴値がわ力つていれば、その特徴値を評価値の算出に用いないという重み付けをしてもよい。逆に、評価する条件に対して特に重要度の高、特徴値がわ力つて、れば、その他の特徴値を評価値の算出に用いなヽと、う重み付けをしてもよい。

[0286] 参照データとは、上記実施例における基準データ又は標準データのことである。

[0287] 第 2の光合成サンプルとは、参照データを取得するための光合成サンプルであり、評価対象の光合成サンプルに対して、環境条件 (有害物質の付加や温度など)又は光合成サンプルそのものの条件 (生育条件など)のうち少なくとも一つが異なる。第 2 の光合成サンプルとしては、環境要因によって曝露されていない光合成サンプルを用いることが好ましいが、これに限定されない。

図面の簡単な説明

[0288] [図 1]遅延発光のメカニズムを示す図である。

[図 2]遅延発光の発光量に対する環境要因の影響を示すグラフである。

[図 3]実施形態に係る環境要因の評価システムの構成を示す図である。

[図 4]フィッティングを行う関数のグラフと当該関数の係数値の影響とを示した図である。

[図 5]評価値を求めるための評価式と遅延発光のプロセスとの関連を示した図である圆 6]本発明の実施形態に係る環境要因の評価方法を示すフローチャートである。圆 7]本発明の実施形態に係る環境要因の評価方法を示すフローチャートである。圆 8]本発明に係る環境要因の評価プログラムの構成を示す図である。

[図 9]シマジンを、濃度を変えて曝露した場合の S. platensisの生長曲線下面積を示すグラフである。

[図 10]実施例 1における、 S. platensis (植物性サンプル)から発生する遅延発光の発光量のグラフである。

[図 11]実施例 1における、フィッティング結果の一例を示すグラフである。

[図 12]実施例 1における、シマジンの曝露濃度とフィッティングにより決定した係数値である c3の値との関係を示すグラフである。

[図 13]シマジンを、濃度を変えて曝露した場合の P. subcapitataの生長曲線下面積を示すグラフである。

[図 14]実施例 2における、 P. subcapitata (植物性サンプル）から発生する遅延発光の発光量のグラフである。

[図 15]実施例 2における、フィッティング結果の一例を示すグラフである。

[図 16]実施例 2における、シマジンの曝露濃度とフィッティングにより決定した係数値である c3の値との関係を示すグラフである。

[図 17]実施例 2における、シマジンの曝露濃度と評価値 Eの値との関係を示すグラフである。

[図 18]実施例 2における、シマジンの曝露濃度と面積値との関係を示すグラフである圆 19]光合成電子伝達を示す模式図である。

圆 20]実施形態に係る遅延発光計測装置を模式的に示す図である。

圆 21]図 20に示す遅延発光計測装置を部分的に示すブロック図である。

[図 22]光合成サンプルの評価方法の手順を示すフローチャートである。

圆 23]待機時間と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。

圆 24]励起光の照射光量と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。圆 25]励起光の照射時間と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。

圆 26]飽和なしの状態における酸ィ匕還元状態と遅延発光との対比を示す模式図である。

圆 27]第 1の励起光照射後に待機時間を設けな力つた場合の、酸ィ匕還元状態と遅延発光との対比を示す模式図である。

圆 28]第 1の励起光照射後に待機時間を 2秒設けた場合の、酸ィ匕還元状態と遅延発光との対比を示す模式図である。

[図 29]図 23に示した減衰曲線についての積算値を示すグラフであり、 (a)は積算値 1 について、（b)は積算値 2について、（c)積算値 3についてのグラフである。

圆 30]標準試料における待機時間と遅延発光の発光量の経時変化との関係を示すグラフである。

圆 31]評価試料における待機時間と遅延発光の経時変化との関係を示すグラフである。

圆 32]図 30及び 31に示した遅延発光の発光量に基づく積算値を示すグラフであり、 (a)は積算値 1について、（b)は積算値 2について、（c)積算値 3についてのグラフである。

圆 33]実施形態に係る評価プログラムの構成を記録媒体と共に示す図である。

[図 34]図 33に示す評価プログラムが動作するコンピュータのハードウェア構成を示す図である。

[図 35]実施例における標準試料についての遅延発光の発光量の経時変化を示したグラフである。

[図 36]実施例における DCMU曝露試料についての遅延発光の発光量の経時変化を示したグラフである。

[図 37]実施例における DBMIB曝露試料についての遅延発光の発光量の経時変化を示したグラフである。

[図 38]実施例における Ant— A曝露試料についての遅延発光の発光量の経時変化を示したグラフである。

圆 39]実施例における標準試料の積算値と DCMU曝露試料の積算値とを比較したグラフであり、（a)は積算値 1について、（b)は積算値 2について、（c)積算値 3についてのグラフである。

[図 40]実施例における標準試料の積算値と DBMIB曝露試料の積算値とを比較したグラフであり、（a)は積算値 1について、（b)は積算値 2について、（c)積算値 3についてのグラフである。

[図 41]実施例における標準試料の積算値と Ant— A曝露試料の積算値とを比較したグラフであり、（a)は積算値 1について、（b)は積算値 2について、（c)積算値 3についてのグラフである。

[図 42]実施例における標準試料及び各曝露試料の飽和なしにおける値 ell及び vll を示す表である。

[図 43]実施例における標準試料及び各曝露試料の値 vQ及び％oQを示す表である

[図 44]実施例における標準試料及び各曝露試料の飽和なしにおける値 el及び clを示す表である。

符号の説明

[0289] 図 1〜18において、 1…環境要因の評価システム、 10···計測装置、 12···評価装置、 14…制御装置、 16…設置部、 18···光源、 20…光検出器、 20a…光センサ、 20b …遅延発光量算出部、 22···フィルタ、 24…集光光学系、 26···シャツタ、 28···筐体、 30···導入口、 32···本体部、 34…蓋部、 36…受付部、 38···フィッティング部、 40··· 評価部、 42···出力部、 44···評価値算出部、 46…比較部、 50···記録媒体、 50&··· プログラム格納領域、 52···評価プログラム、 52a…メインモジュール、 52b…受付モジュール、 52c…フィッティングモジュール、 52d…評価モジュール、 52e…出力モジユーノレ o

[0290] 図 19〜図 44において、 1…遅延発光計測装置、 10···計測ユニット、 11…試料設置部、 12···光源、 13···フィルタ、 14…集光光学系、 15···シャツタ、 16…検出部、 16 a…光センサ、 16b…光量算出部、 17…筐体、 17a…本体部、 17b…蓋部、 20···解析ユニット、 21···記録部、 22···演算部、 23···表示部、 24…入力部、 30···制御ュ- ット、 31···光源制御部、 32···検出制御部、 41···第 1ケーブル、 42…第 2ケーブル、 50···評価プログラム、 51···光源制御モジュール、 52···検出制御モジュール、 53··· 演算モジュール、 60···記録媒体、 70· "コンピュータ。

Claims

請求の範囲

[1] 光合成機能を有する光合成サンプルから発生する遅延発光の発光量の経時データに基づヽて、前記光合成サンプルの状態を評価する光合成サンプルの評価方法であって、

前記経時データにおける複数の時間帯に対して特徴を示す特徴値を算出する特徴値算出ステップと、

前記特徴値を重み付けすることにより評価値を算出する評価値算出ステップと、前記評価値に基づいて前記光合成サンプルの状態を評価する評価ステップとを備えることを特徴とする光合成サンプルの評価方法。

[2] 前記特徴値算出ステップは、前記経時データが、予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように、当該複数の関数の係数値を前記特徴値として決定するフィッティングステップを含み、

前記評価値算出ステップでは、前記フィッティングステップにお、て決定された係数値に基づいて前記評価値を算出する、ことを特徴とする請求項 1に記載の光合成サンプルの評価方法。

[3] 前記評価値算出ステップにおいて算出される評価値が、前記複数の関数のうち少なくとも 1つの関数の係数値に基づいて算出される面積値である、ことを特徴とする請求項 2に記載の光合成サンプルの評価方法。

[4] 前記関数が、山型の関数である、ことを特徴とする請求項 2又は 3のいずれか一項に記載の光合成サンプルの評価方法。

[5] 前記関数が、ローレンツ関数である、ことを特徴とする請求項 4に記載の光合成サンプルの評価方法。

[6] a , b , c (i= l, 2, 3)を前記複数の関数の係数値、 tを基準時刻からの経過時間を示す変数としたときに、前記複数の関数が、それぞれ、

[数 1]

] ₀ ^1+fli i )² 10¹⁺。³('— ⁶' )² ι ο ¹⁺。' ('一⁶³ )²

である、ことを特徴とする請求項 5に記載の光合成サンプルの評価方法。

[7] 前記評価値算出ステップおいて算出される評価値が、前記複数の関数うち少なくとも 2以上の関数の係数を含む演算式に基づいて算出される、ことを特徴とする請求項 2に記載の光合成サンプルの評価方法。

[8] a , b., c (i= l, 2, 3)を前記複数の関数の係数値、 tを基準時刻からの経過時間を示す変数とし、 b < b < bとしたときに、前記複数の関数が、それぞれ、

1 2 3

[数 2] j Ql+a, (i-i, ) ^ Ι+α, ίί-δ, ) ) Q】+。'('— ¾ f であり、

m (j = l〜9)を定数としたとき、前記評価値が、演算式

[数 3] 平 ί面 = . a x m ' b₃ x m₃ - c₃

. «₂ x _; .りつ x m₆ · c₂ · a_{ x m_s - b x m₉ · c, ) により算出される、ことを特徴とする請求項 7に記載の光合成サンプルの評価方法。

[9] 前記光合成サンプルから発生する遅延発光の経時的な発光量を計測して、当該計測データを前記経時データとする計測ステップを更に含むことを特徴とする請求項 1 に記載の光合成サンプルの評価方法。

[10] 前記計測ステップは、前記光合成サンプルに第 1の励起光を所定の第 1の照射条件で照射する第 1励起ステップと、前記第 1励起ステップの後、前記光合成サンプルに第 2の励起光を前記第 1の照射条件と比較して光エネルギー積算値が小さい第 2 の照射条件で照射する第 2励起ステップと、を備え、

前記特徴値算出ステップでは、前記第 2励起ステップの後に得られた経時データに基づいて前記特徴値が算出される、ことを特徴とする請求項 9に記載の光合成サンプルの評価方法。

[11] 前記測定ステップでは、前記第 2の照射条件を変更して、前記発光量を複数回繰り返し測定することにより、複数の経時データを取得する、ことを特徴とする請求項 10 に記載の光合成サンプルの評価方法。

[12] 前記第 2の照射条件は、前記第 1の励起光の照射終了時から前記第 2の励起光の照射開始時までの待機時間である、ことを特徴とする請求項 11に記載の光合成サンプルの評価方法。

[13] 前記第 2の照射条件は、前記第 2の励起光の光量、波長、パルス幅及び照射時間のうち少なくとも一つであること、を特徴とする請求項 11に記載の光合成サンプルの評価方法。

[14] 前記評価ステップは、

前記評価値算出ステップにおいて算出された評価値と当該評価値の参照データとを比較する比較ステップを含む、ことを特徴とする請求項 1〜13のいずれか一項に記載の光合成サンプルの評価方法。

[15] 第 2の光合成サンプル力発生する遅延発光の経時的な発光量を計測して、当該計測データ力前記比較ステップにおける参照データを導出する参照データ生成ステツプを更に含む請求項 14に記載の光合成サンプルの評価方法。

[16] 前記特徴値は、前記時間帯毎に積算した積算値である、を特徴とする請求項 1に記載の光合成サンプルの評価方法。

[17] 前記評価ステップでは、前記光合成サンプルに供された環境要因を評価する、ことを特徴とする請求項 1〜16のいずれか一項に記載の光合成サンプルの評価方法。

[18] 前記環境要因が、植物性細胞の生長阻害物質である、ことを特徴とする請求項 17 に記載の光合成サンプルの評価方法。

[19] 光合成機能を有する光合成サンプルから発生する遅延発光の発光量の経時データに基づヽて、前記光合成サンプルの状態を評価する光合成サンプルの評価システムであって、

前記経時データにおける複数の時間帯に対して特徴を示す特徴値を算出する特徴値算出手段と、

前記特徴値を重み付けすることにより評価値を算出する評価値算出手段と、前記評価値に基づいて前記光合成サンプルの状態を評価する評価手段とを備えることを特徴とする光合成サンプルの評価システム。

[20] 前記特徴値算出手段は、前記経時データが、予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように、当該複数の関数の係数値を前記特徴値として決定するフィッティング手段を含み、前記評価値算出手段は、前記フィッティング手段により決定された係数値に基づいて前記評価値を算出する、ことを特徴とする請求項 19に記載の光合成サンプルの評価システム。

[21] 前記光合成サンプルから発生する遅延発光の経時的な発光量を計測して、当該計測データを前記経時データとする計測手段を更に含む請求項 20に記載の光合成サンプルの評価システム。

[22] 前記光合成サンプルに対して、照射条件を変更して励起光を照射するよう光源を制御する光源制御手段を更に含む請求項 21に記載の光合成サンプルの評価システム。

[23] 前記評価手段は、前記光合成サンプルに供された環境要因を評価する、ことを特徴とする請求項 19〜21のいずれか一項に記載の光合成サンプルの評価システム。

[24] コンピュータに、光合成機能を有する光合成サンプルから発生する遅延発光の発光量の経時データに基づ、て、前記光合成サンプルの状態を評価させるための光合成サンプルの評価プログラムであって、

前記経時データにおける複数の時間帯に対して特徴を示す特徴値を算出する特徴値算出処理と、

前記特徴値を重み付けすることにより評価値を算出する評価値算出処理と、前記評価値に基づいて前記光合成サンプルの状態を評価する評価処理とを実行させることを特徴とする光合成サンプルの評価プログラム。

[25] 前記特徴値算出処理は、前記経時データが、予め設定された複数の関数の和としてフィッティングするように、当該複数の関数の係数値を前記特徴値として決定するフィッティング処理を含み、

前記評価値算出処理は、前記フィッティング処理により決定された係数値に基づヽて前記評価値を算出する、ことを特徴とする請求項 24に記載の光合成サンプルの評価プログラム。

[26] 前記光合成サンプルから発生する遅延発光の経時的な発光量を計測して、計測されたデータを前記経時データとする計測処理を更に含むことを特徴とする請求項 24 に記載の光合成サンプルの評価プログラム。

[27] 前記計測処理は、

前記光合成サンプルに第 1の励起光を所定の第 1の照射条件で照射する第 1励起処理と、

前記第 1励起処理の後、前記光合成サンプルに第 2の励起光を前記第 1の照射条件と比較して光エネルギー積算値が小さい第 2の照射条件で照射する第 2励起処理と、

を実行し、

前記特徴値算出処理は、前記第 2励起処理の後に得られた経時データに基づいて前記特徴値を算出する、

ことを特徴とする、請求項 26に記載の光合成サンプルの評価プログラム。

[28] 前記計測処理では、前記第 2の照射条件を変更して、前記発光量を複数回繰り返し測定することにより、複数の経時データを取得する、ことを特徴とする請求項 27に記載の光合成サンプルの評価プログラム。

[29] 前記評価処理は、前記光合成サンプルに供された環境要因を評価する、ことを特徴とする請求項 24〜27のいずれか一項に記載の光合成サンプルの評価プログラム