WO2007112731A1 - Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler aktivität - Google Patents

Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler aktivität Download PDF

Info

Publication number
WO2007112731A1
WO2007112731A1 PCT/DE2007/000580 DE2007000580W WO2007112731A1 WO 2007112731 A1 WO2007112731 A1 WO 2007112731A1 DE 2007000580 W DE2007000580 W DE 2007000580W WO 2007112731 A1 WO2007112731 A1 WO 2007112731A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fractions
active substance
ethyl acetate
virus
variant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/DE2007/000580
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kathrin Kabrodt
Ingo Schellenberg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ESA Patentverwertungsagentur Sachsen Anhalt GmbH
Anhalt University of Applied Sciences
Original Assignee
ESA Patentverwertungsagentur Sachsen Anhalt GmbH
Anhalt University of Applied Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ESA Patentverwertungsagentur Sachsen Anhalt GmbH, Anhalt University of Applied Sciences filed Critical ESA Patentverwertungsagentur Sachsen Anhalt GmbH
Priority to US12/225,942 priority Critical patent/US20090136603A1/en
Priority to DE502007002678T priority patent/DE502007002678D1/de
Priority to AT07722138T priority patent/ATE455551T1/de
Priority to PL07722138T priority patent/PL2001494T3/pl
Priority to EP07722138A priority patent/EP2001494B1/de
Publication of WO2007112731A1 publication Critical patent/WO2007112731A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/70—Polygonaceae (Buckwheat family), e.g. spineflower or dock
    • A61K36/708—Rheum (rhubarb)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals

Definitions

  • Porcine parvovirus was used as a model virus for the human pathogenic parvovirus B19.
  • the porcine parvovirus belongs to the family Parvoviridae and has a size of 18-25 nm.
  • the virus capsids have an icosahedral composition.
  • the virus particles consist of 60 capsomeres and have about 7 nm protein protrusions at the corners.
  • the virions are not covered by a membrane. Inside the capside is the single-stranded, linear, viral DNA genome.
  • tannins have an antiviral effect on the reaction with membrane proteins, on the other hand their toxicity is attributed to the inhibition of the glucosidases and, as a result, to a change in the intact surface structure of the virus required for the infection. This would also explain why enveloped viruses such as herpes simplex are more sensitive to tannins than envelopeless viruses.
  • FIG. 3 The chromatographic separation of the obtained ethyl acetate fraction 5 from Rheum-spec. Country type Tru 1976 (fraction 5- variant 25), absorption at 280 nm.
  • Model viruses for human pathogenic viruses PPV, BVDV, SFV, PRV
  • the cell lines used are adherent, ie cells growing in monolayers.
  • the cells undergo contact inhibition and stop growing as soon as they become confluent, ie a dense cell lawn has grown. Therefore, the cells were subcultured when the culture was 70% confluent.
  • the cultivation of the cells was carried out in an incubator at 37 0 C, 5% carbon dioxide and 95% relative humidity. All work took place under sterile conditions.
  • the media were provided with the appropriate additives before use (see Table 2). All additions were at - 20 0C maintains them safe.
  • the fetal calf serum (FCS) was additionally inactivated for 30 min at 56 ° C. in a water bath to destroy existing complement factors.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler Aktivität zur Virusinaktivierung und Desinfektion aus Rheum-species-Arten, wobei die Wirkstofffraktionen durch Extraktion der getrockneten und gemahlenen Wurzelproben mit Methanol erhalten, unter vollständiger Methanolentfernung die gebildete wässrige Phase von lipophilen Begleitstoffen befreit, die gereinigte wässrige Phase mit Ethylacetat ausgeschüttelt und die vereinigte Ethylacetatphase in eine begrenzte Anzahl von Wirkstofffraktionen säulenchromatografisch aufgetrennt und die Wirkstofffraktionen mit gleichem Inhaltsspektrum zusammengefasst werden.

Description

Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler Aktivität
Die Erfindung betrifft Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler Aktivität zur Virusinakti- vierung und Desinfektion. Die antivirale Wirkung kondensierter Gerbstoffe wurde bereits beschrieben und auch therapeutisch genutzt. Esquenazi, D., Wigg, M. D. u.a. (2002), Research in Microbio- logy 153: 647-652 untersuchten die antivirale Wirkung kondensierter Gerbstoffe, die aus den getrockneten Fasern der reifen Kokosnuss (Cocos nucifera L.) extrahiert wurden, an infizierten HEp-2 (Kehlkopfkrebszelllinie) und VERO-Zellkulturen. Sie konnten nachweisen, dass aus Catechinen aufgebaute Polyphenole die Aktivität eines Acyclovir resistenten Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV-1 -ACVr) hemmen. Es wurden sowohl ein Gesamtextrakt als auch mehrere chromatografisch vorgetrennte Fraktionen eingesetzt. Der Gesamtextrakt und eine Fraktion mit monomeren bis trimeren Procyanidinen zeigten die stärkste antivirale Aktivität, die von den Autoren mit einer Störung der Adsorption der Viren an den Zelllinien begründet wird.
Cheng, H. Y, Lin, C. C. u.a. (2002), AntivirChem Chemother. 13(4): 223-229 untersuchten die antiviralen Eigenschaften von Prodelphinidin B-2 -3'-O-gallat, isoliert aus grünem Tee, auf Herpes Simplex Typ 2 kultiviert in VEROZellen. Die signifikante Reduktion der Infektion wird neben der durch den Wirkstoff verursachten Störung der Adsorption an die Wirtszelle auch auf eine Beeinträchtigung der Penetration des Virus zurückgeführt. Die gleichen Resultate wurden auch für die digalloylierte Verbindung Prodelphinidin B-2 -S.S'-O-gallat, isoliert aus Myrica rubra, am gleichen Virusmodell durch Cheng, H. Y, Lin, TC. u.a. (2003) Planta Med. 69(10): 953-956 erzielt. Antivirale Aktivität gegen einen Adenovirus zeigten verschiedene aus grünem Tee isolierte monomere Flavan-3-ole, insbesondere EGCG, aufgezeigt durch Weber u. a., (2003), Antiviral Res. 58(2): 167-173 ). Die höchste Effektivität wurde erzielt, wenn EGCG appliziert wurde beim Übergang von der frühen zur späten Phase der viralen Infektion. Die antivirale Aktivität bei aus Crataegus sinaica isolierten Flavonoiden und Proant- hocyanidinen war besonders ausgeprägt im Bereich der dimeren bis tetrameren PC. Hier konnte eine vollständige HSV-1 Titerreduktion beobachtet werden. Die antivirale Aktivität wurde über die Inhibierung cytopathischer Effekte auf mit Herpes Simplex Virus infizierten VERO-Zellen bestimmt, beschrieben durch Shahat, A. A. u.a. (2002), Planta Med 68: 539-541 . Die antivirale Aktivität gegen einen Influenza- Virus von mit Polyphenolen (Tanninen, Flavonoiden, Catechinen und Proanthocyanidinen) angereicherten Extrakten aus Geranium sanguineum L. wurde von Sokmen, M.u. a. (2005), Life Sciences 76: 2981 -2993 untersucht. Dabei wurden ein methanolischer Gesamtextrakt sowie daraus gewonnene Ethylacetat- und Butanol-Fraktionen eingesetzt, um die Reproduktion von humanen Influenza-Viren (A/Aichi Virus in MDCK= Madin-Darby canine kidney-Zellen) in vitro zu beeinflussen. Gemessen wurde die Reduktion der cytopa- thischen Effekte. Sowohl der Gesamtextrakt als auch die BuOH-Fraktion zeigten eine signifikante Reduzierung der virusinduzierten cytopathischen Effekte.
Ein ethanolischer Extrakt aus den unterirdischen Teilen von Rh. officinale zeigte in vitro antivirale Aktivität gegen HSV. Die minimal inhibierende Dosis lag bei 100 μg/ml, beschrieben durch Wang, Z. W. u.a. (1996), ZhongguoZhong YaoZaZhi 21 (6): 364- 366. Obwohl es eine Reihe von gut charakterisierten antiviralen Wirkstoffen und Formulierungen gibt, besteht weiterhin die Anforderung nach neuen Wirksubstanzen. Zum einen weisen die bekannten Wirkstoffe eine ungenügende Aktivität auf oder werden nicht gut vertragen, zum anderen werden immer mehr Virusstämme resistent. Die bekannten Extraktformulierungen aus Rheum-species- Arten zeigen unzurei- chende antivirale Wirkung.
Das Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Wirkstofffraktionen aus Rheum-species- Arten mit gesteigertem Wirkstoffpotenzial zur Herstellung antiviraler Formulierungen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler Aktivität bereitzustellen, die sich durch gute Verträglichkeit auszeichnen. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler Aktivität aus Rheum-species-Arten gelöst, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Wirkstofffraktionen durch Extraktion der getrockneten und gemahlenen Wurzel- proben mit Methanol erhalten, unter vollständiger Methanolentfernung die gebildete wässrige Phase von lipophilen Begleitstoffen befreit, die gereinigte wässrige Phase mit Ethylacetat ausgeschüttelt und die vereinigte Ethylacetatphase in eine begrenzte Anzahl von Wirkstofffraktionen säulenchromatografisch aufgetrennt und die Wirkstofffraktionen mit gleichem Inhaltsspektrum zusammengefasst werden. Als außerordentlich überraschend hat sich herausgestellt, dass aus dem Ethylacetat Gesamtextrakt von Rheum-spec. durch chromatografische Auftrennung gewonnene einzelne Rhabarberfraktionen eine signifikante Virusinaktivierung bewirken. Als Viren bezeichnet man in der Biologie genetische Elemente in Form von Nukleinsäuren, die als Fremdbestandteile in Zellen von Lebewesen (Wirtszellen) unabhän- gig von deren eigenen Nukleinsäuren mit Hilfe der Replikationseinrichtungen dieser Zellen repliziert werden. Virus-Nukleinsäuren sind entweder Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Viren können als Nukleinsäure in der Wirtszelle und als freies Partikel außerhalb von Zellen vorkommen, wobei letztere Form als Virion bezeichnet wird.
Virionen bestehen aus einem Nukleinsäuremolekül, das von einer Hülle (Capsid) umgeben ist. Bei einigen Viren besitzen die Virionen außer der Proteinhülle noch weitere Bestandteile, z.B. eine Lipoproteinhülle. Nachfolgend werden die für die Untersuchung der antiviralen Aktivität von polyphe- nolischen Fraktionen aus Rhabarber verwendeten Viren oder entsprechende Modellviren vorgestellt:
Parvoviren
Das porcine Parvovirus (PPV) wurde als Modellvirus für das humanpathogene Parvo- virus B19 verwendet. Das porcine Parvovirus zählt zur Familie der Parvoviridae und weist eine Größe von 18-25 nm auf. Die Viruscapside haben einen ikosaedrischen Aufbau. Die Viruspartikel bestehen aus 60 Capsomeren und haben an den Ecken etwa 7 nm lange Proteinvorsprünge. Die Virionen sind nicht von einer Membran umhüllt. Im Inneren der Capside ist das einzelsträngige, lineare, virale DNA-Genom enthalten.
Flaviviren
Das Hepatitis-C-Virus wird der Gruppe der Flaviviren zugeordnet. Da HCV nur unter enormen Aufwand in Zellkulturen vermehrt werden kann, ist man in Virusinaktivie- rungsstudien auf den Einsatz von Modellviren angewiesen. Die Genomstruktur des HCV weist auf eine Zugehörigkeit zur Familie der Flaviviren hin . Dabei kann es, wie das Virus der bovinen Diarrhoe (BVDV), dem Genus Pestivirus zugeordnet werden. Die infektiösen Viren der bovinen Diarrhoe haben einen Durchmesser von 40-50 nm. Die sphärischen Capside sind von einer Hüllmembran umgeben. Das Genom besteht aus einzelsträngiger RNA.
Togaviren
Ebenfalls als Modellvirus für HCV wurden das Semliki-Forest-Virus (SFV), welches zur Familie der Togaviren zählt, eingesetzt. Die infektiösen Partikel haben einen Durchmesser von 60-80 nm und bestehen aus ikosaedrischen oder sphärischen Capsiden, die von einer Membranhülle umgeben sind. Das Genom der Togaviren besteht aus einzelsträngiger RNA. Herpesviren
Durch humanpathogene Herpesviren können latente Infektionen hervorgerufen werden. Nach Infektion können Herpesviren lebenslang in Leukozyten persistieren. Das Pseudorabiesvirus (PRV) wurde für diese Untersuchungen als Modellvirus für Herpesviren verwendet.
Die Virionen der Herpesviren haben einen Durchmesser von 150-200 nm und bestehen aus insgesamt mehr als 30 Strukturproteinen. Das Genom liegt in den Virionen als lineare, doppelsträngige DNA vor. Die antivirale Wirkung von Gerbstoffen ist auf deren Interaktion mit Proteinstrukturen an der Virusoberfläche oder der Wirtsoberfläche zurückzuführen, was die Virenadsorption oder -penetration an/ in die Wirtszelle und somit die Virusvermehrung beeinträchtigt. Dabei kann die Virusoberfläche zum einen eine reine Proteinhülle sein. Komplexe Viren sind zum anderen von einer lipidhaltigen Hülle umgeben, die mit Glycoproteinen (Spikes) durchsetzt ist. Diese Glycoproteine sind für die infektiöse Aktivität des Virus mitverantwortlich. Sie werden durch Glucosidasen synthetisiert. Gerbstoffe wirken zum einen durch die Reaktion mit Membranproteinen antiviral, zum anderen wird ihre Toxizität auf die Inhibierung der Glucosidasen und daraus resultierend auf eine Veränderung der zur Infektion nötigen intakten Oberflächen- struktur des Virus zurückgeführt. Dies würde auch erklären, warum umhüllte Viren wie Herpes Simplex empfindlicher gegenüber Gerbstoffen reagieren als hüllenlose Viren.
Die Erfindung wird anhand der Figuren 1 bis 7 näher erläutert. Im Einzelnen zeigen:
Figur 1 : Extraktionsschema für die Aufarbeitung getrockneter, gemahlener Rhabarberwurzeln.
Figur 2: Die chromatografische Auftrennung der sc gewonnenen Ethylacetat-Frakti- on 4 aus Rheum palmatum MAXIM (Fraktion 4 -Variantei 1 ). Die obere Spur zeigt jeweils die Absorption bei 280 nm, die untere bei 242 nm.
Figur 3: Die chromatografische Auftrennung der sc gewonnenen Ethylacetat-Frakti- on 5 aus Rheum-spec. Landsorte Polen 1976 (Fraktion 5- Variante 25), Absorption bei 280 nm.
Figur 4: Die chromatografische Auftrennung der sc gewonnenen Ethylacetat-Frakti- on 9 aus Rheum-spec. Landsorte Polen 1976 (Fraktion 9- Variante 25),
Absorption bei 280 nm.
Figur 5: Inhibierung der Virusaktivität von SFV, PPV, BVDV und PRV durch Rheum Fraktion 4-Variante 11. Figur 6: Inhibierung der Virusaktivität von SFV, PPV1 BVDV und PRV durch Rheum
Fraktion 5-Variante 25. Figur 7 : Inhibierung der Virusaktivität von SFV, PPV, BVDV und PRV durch Rheum
Fraktion 9-Variante 25.
Das Extraktionsschema für die Aufarbeitung getrockneter, gemahlener Rhabarberwurzeln ist in der Figur 1 dargestellt. Zur Gewinnung der Wirkstoffe wird eine bekannte Extraktionsvorschrift, wie sie z.B. in Abb.8 der DE 10132936A1 dargestellt wird, modifiziert. Für die Erzeugung der wässrigen Ausgangsphase wird statt Aceton/Wasser Methanol als Primär-Extraktionsmittel eingesetzt, und diese methanolischen Extrakte werden weiterverwendet. Nach der mehrstufigen extraktiven Aufarbeitung wird eine präparativesäulenchromatographische Fraktionierung des Ethylacetat-Gesamtex- traktes durchgeführt. Für eine Extraktion des Rhabarberwurzel-Materials wurden 1 kg einer getrockneten und gemahlenen Wurzelprobe einer fünfmaligen Wirbelextraktion mit insgesamt etwa 8000 ml Methanol für je 15 min am Ultra-Turrax unterworfen. Die gesammelten Extrakte wurden dann am Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 350C eingeengt, und nach Zugabe von 500 ml Wasser wurde das Methanol vollständig abgezogen. Zur Ausfällung störender lipophiler Substanzen wurde der wässrige Extrakt über Nacht unter Stickstoffbegasung im Kühlschrank bei 5 °C aufbewahrt. Die Fällungen konnten am nächsten Tag abzentrifugiert werden. Zur Abtrennung weiterer lipophiler Begleitstoffe wurde die wässrige Lösung anschließend noch drei Mal mit je 500 ml Petrolether ausgeschüttelt. Die so gereinigte wässrige Phase wurde daraufhin vier Mal mit je 750 ml Ethylacetat ausgeschüttelt, wonach sich in den vereinigten Ethyl- acetat-Phasen vermehrt niedrig oligomerisierte Verbindungen befinden sollten und in der verbleibenden wässrigen Phase Verbindungen mit höherem Oligomerisie- rungsgrad. Sowohl die Ethylacetat- als auch die Wasser-Phase wurden dann am Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 35 °C eingeengt, in wenig Wasser aufge- nommen und anschließend gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten gerbstoffangereicherten Extrakte wurden bis zur weiteren Verwendung unter Stickstoffatmosphäre bei -21 0C aufbewahrt. Die säulenchromatografische (sc) präparative Auftrennung der Ethylacetat - sowie der Wasser-Phase erwies sich als unumgänglich, um das Gesamtspektrum an poly- phenolischen Verbindungen auf eine begrenzte Anzahl an Substanzen einzuschränken.
Zur präparativen Isolierung von Proanthocyanidinen wird schon seit langem die Trennung an Sephadex LH-20 eingesetzt. Als Elutionsmittel haben sich Ethanol oder Alkohol/Wasser-Gemische etabliert. Zur Trennung polymerer Substanzen sind Aceton/Wasser-Gemische (7 : 3; v/v) geeignet.
Die Ethylacetat-Phase wurde in Methanol bzw. Methanol/Wasser gelöst, auf die Säule (Länge 100 cm, Durchmesser 5 cm) aufgegeben und nacheinander mit Etha- nol, Methanol und Aceton/Wasser (7 : 3; v/v) eluiert. Hierfür wurde eine MPLC-AnIa- ge mit Probenaufgabepumpe genutzt. Nach DC Überprüfung der erhaltenen Reagenzglasfraktionen wurden für die einzelnen Genotypen die Fraktionen der Ethy- lacetat - Phase mit gleichem Inhaltsstoffspektrum zusammengefasst. Nach der sc Trennung der Ethylacetat-Phase resultierten z.B. beim GT 11 (Rheum palmatum M.) 11 Fraktionen, beim GT 25 (Rheum spec. Landsorte Polen) 14 Fraktionen.
Für den erfindungsgemäßen Einsatz wurden die Fraktionen 4-Variante 11 (Rheum palmatum M.), Fraktionen 5 bzw. 9-Variante 25 (Rheum spec. Landsorte Polen) benutzt. Für die Charakterisierung der durch säulenchromatografische Vortrennung gewonnenen und hinsichtlich ihrer Wirkung als besonders effektiv einzuschätzenden Fraktionen gelten folgende Bedingungen:
Chromatographie
Stationäre Phase: Synergie 4m Polar RP 80, 250 X 2,0 mm
Mobile Phase: A 0,1 %ige Ameisensäure
B Methanol
Flow: 0,3 ml/min
Gradientenbedingungen: Time (min) %B
0 0
10 10
40 50
41 0
55 0
Detektion: DAD
Über Kalibration mit entsprechenden Standardsubstanzen konnten folgende Substanzen in den sc vorgetrennten Fraktionen aus der Ethylacetatphase - soweit enthalten - quantifiziert werden: Epigallocatechin Catechin Procyanidin B1 Epicatechin Procyanidin B2
Epigallocatechingallat Epicatechingallat.
Die Figur 2 zeigt das Chromatogramm der wirksamsten Fraktion aus der sc Tren- nung der Ethylacetat/Phase von Rheum palmatum MAXIM. Die obere Spur zeigt die Absorption bei 280 nm, die untere bei 242 nm. Es wurden beide Wellenlängen zur Quantifizierung verwendet, da die beiden Procyanidine deutlich höhere Absorptionsintensitäten bei 242 nm aufwiesen.
Bei Rheum palmatum MAXIM, konnten quantitativ bestimmt werden:
Catechin Procyanidin B1 Procyanidin B2 Epicatechingallat.
Diese Daten wurden durch gleichzeitige Aufnahme des Total ionenstroms über
Massenspektrometrie abgesichert. Die Identifizierung der Substanzen erfolgte außerdem über den Vergleich der Massenspektren der Standardsubstanzen mit den Massenspektren der bei den Standardretentionszeiten detektierten Peaks.
Im Vergleich mit allen anderen Fraktionen wies die Fraktion 4 isoliert aus Rheum palmatum MAXIM sowohl in der Summe die höchsten Gehalte an quantifizierbaren
Substanzen auf als auch insbesondere die höchsten Gehalte an Epicatechingallat.
Die Abbildungen 3 und 4 zeigen die Chromatogramme der wirksamsten Fraktionen aus der sc Trennung der Ethylacetat/Phase von Rheum spec. Landsorte Polen 1976
(Fraktionen 5 bzw.9- Variante 25). Diese Art konnte nicht näher spezifiziert werden.
Die Chromatogramme stellen die UV-Spur bei 280 nm dar.
Bei Rheum spec. Landsorte Polen 1976 konnten in Fraktion 5 quantitativ bestimmt werden:
Procyanidin B1
Procyanidin B2
Epicatechingallat. In Fraktion 9 waren die als Standards zu Verfügung stehenden Substanzen nicht mehr enthalten. Über Massenspektrometrie wurden höher oligomere polyphenoli- sche Verbindungen, wie digalloylierte dimere Procyanidine und trimere Procyanidine, mit unterschiedlichem Galloylierungsgrad neben weiteren für Rhabarber beschrie- benen Verbindungen, wie z.B. Stilbenderivate, detektiert.
Rheum species ist eine Pflanze, die weltweit vorzufinden ist und sich in verschiedenen Arten seiner Umwelt angepasst hat.
Nachfolgend angeführt ist eine Liste mit allen Rhabarberarten für die erfinderische Lösung,
Variante 01 : Rh. officinale BAILL.; Dolomiten (Münster)
Variante 02: Rh. officinale BAILL.; Vacrutot (Ungarn) Variante 03: Rh. officinale BAILL. ; Kirovsk (UdSSR)
Variante 04: Rh. officinale BAILL.; Medicinal Rhubarb, Wisley (England)
Variante 05: Rh. officinale BAILL.; Dolomiten (Münster)
Variante 09: Rh. palmatum L.; Petersburg (UdSSR)
Variante 10: Rh. rhabarbarum L.; The Sutton Variante 11 : Rh. palmatum Lf. florc rubra MAXIM. Petersburg (UdSSR)
Variante 12: Rh. rhabarbarum L.; Holsteiner Blut
Variante 13: Rh. rhabarbarum L.; Utrecht (Holland)
Variante 14: Rh. rhabarbarum L.; Uppsala (Schweden)
Variante 15: Rh. rhabarbarum L.; KVDR 1986 Variante 16: Rh. rhaponticum L.; Kirovsk (UdSSR)
Variante 17: Rh. rhaponticum L.; Dnepropetrovsk (UdSSR)
Variante 18: Rh. rhaponticum L.; Kirovsk (UdSSR)
Variante 19: Rh. rhaponticum L.; Uppsala (Schweden)
Variante 20: Rh. rhaponticum L.; Petrograd (UdSSR) Variante 21 : Rh. rhaponticum L.; Taplozek (Finnland)
Variante 22: Rh. rhabarbarum L; Kirovsk (UdSSR)
Variante 23: Rh. rhabarbarum L.; China 1956
Variante 24: Rh. rhabarbarum L.; KVDR 1987
Variante 25: Rh. spec. Landsorte Polen 1976 Variante 26: Rh. alexandra VEITCH.; Kirovsk (UdSSR)
Variante 27: Rh. wittrockii LUNDSTR.; Petrograd (UdSSR)
Variante 29: Rh. emod. WOLL.; Petrograd (UdSSR)
Variante 30: Rh. leucorum; Wroclaw (Polen) Variante 31 : Rh. leucorrhizum PALL.; Bukarest (Rumänien) Variante 32: Rh. maximowiczii LOSINSK.; Petrograd (UdSSR) Variante 33: Rh. tataricum l.f. lasi (Rumänien) Variante 34: Rh. undulatum L,; Pruhonice (CSSR) Variante 35: Rh. altaicum LOSINSK. ; Petrograd (UdSSR) Variante 36: Rh. altaicum LOSINSK.; Moskau (UdSSR) Variante 37: Rh. alte Landsorte (Deutschland) Variante 38: Rh. alte Landsorte (Deutschland) Variante 39: Rh. alte Landsorte (Polen) Variante 40: Bastard Rh. rhab. x Rh. raponticum
Variante 41 : Rh. alexandra VEITCH.; Petrograd (UdSSR)
Variante 42: Rh. officinale BAILL.; Landsorte, Slovakisches Erzgebirge.
Der Einsatz der erfindungsgemäßen Wirkstofffraktionen wird an folgendem Ausführungsbeispiel näher erklärt:
Für die Versuchsdurchführung wurden folgende Materialen und Methoden zur Virus- inaktivierung eingesetzt.
Viren und Zellen
Modellviren für humanpathogene Viren: PPV, BVDV, SFV, PRV
Die in nachfolgender Tabelle aufgeführten Viren wurden für die Inaktivierungsexperi- mente verwendet. Ebenfalls aufgelistet sind die Zellkulturen, in denen die Viren vermehrt und titriert wurden.
Figure imgf000011_0001
Tabelle 1 : Auflistung der für die .Experimente eingesetzten Viren, deren Eigen- schatten sowie die für die Vermehrung und Titration entsprechenden
Zelllinien
Folgende Teilschritte wurden für die Virusinaktivierungsversuche durchgeführt:
Kultivierung der Zellen
Bei den verwendeten Zelllinien (Indikatorzellen, siehe Tabelle 2) handelt es sich um adhärente, d.h. in Monolayem wachsende Zellen. Die Zellen unterliegen einer Kontaktinhibition und stellen das Wachstum ein, sobald sie konfluentsind, d.h. ein dichter Zellrasen gewachsen ist. Daher wurden die Zellen subkultiviert, als die Kultur 70 % konfluent war. Die Kultivierung der Zellen erfolgte im Brutschrank bei 370C, 5 % Kohlendioxid und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit. Alle Arbeiten fanden unter sterilen Bedingungen statt. Die Medien wurden vor Gebrauch mit den entsprechenden Zusätzen versehen (siehe Tabelle 2). Alle Zusätze wurden bei - 200C aufbe- wahrt. Das fetale Kälberserum (FKS) wurde zusätzlich vor der Verwendung 30 min bei 560C im Wasserbad Hitze inaktiviert, um vorhandene Komplementfaktoren zu zerstören.
Figure imgf000012_0001
Tabelle 2: Zelllinien zur Vermehrung der Viren
WST-Assay zur Bestimmung der Zytotoxizität
Mit dem Cell-Proliferation Reagent WST- 1 kann die metabolische Aktivität lebender, wachstumfähiger Zellen bestimmt werden. Der Test basiert auf der intrazellulären Reduktion von im WST-Reagenz enthaltenem Tetrazoliumsalz in den dunkelroten Farbstoff Formazan durch mitochondriale Dehydrogenasen. Die Farbstoffmenge kann daher direkt mit der Zahl stoffwechselaktiver Zellen korreliert werden. Eine zytostatische Wirkung lässt sich durch eine verminderte Zellproliferation nachweisen. Die Absorption wurde mit dem WallacVictor bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt. In je einer Mikrotiterplatte (96 Kavitäten) wurden pro Kavität 8000 Zellen der Zelllinien PK13, MDBK, Vera und ML ausgesät. Die letzte Spalte (Spalte 12) enthielt nur Medium und diente als Nullprobe. Weiterhin wurden eine Positivkontrolle (nur Medium und Zellen) sowie zwei weitere Kontrollen, in denen das Medium 5 bzw. 10 % Ethanol enthielt, mitgeführt. Dies war erforderlich, da die zu untersuchenden polyphenolischen Fraktionen zur besseren Löslichkeit mindestens einen Anteil von 5 % Ethanol im Lösungsmittel benötigten.
Es wurden drei Rhabarber-Fraktionen getestet: Fraktion 4 isoliert aus der Rheum Variante 11 , Fraktion 5 und Fraktion 9 isoliert aus der Rheum Variante 25 in den Konzentrationsstufen 0,0025 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,05 %, 0,1 % und 0,5 %. Je 50 μl der jeweiligen Konzentrationsstufe wurden je Fraktion als Doppelbestimmung zu den verschiedenen Zellen pipettiert (ausgenommen der Kontrollen) und diese für 24 Stunden inkubiert. Dann wurden pro Kavität 20 μl WST-1 -Reagenz hinzu pipettiert und sofort die Absorption gemessen. Anschließend erfolgte die Messung der Absorption alle 30 min für die Zeit von 240 min. Bestimmung des Virustiters von PPV, BVDV, SFV und PRV
Die Bestimmung des Virustiters erfolgte mittels Endpunkttitration. Hierzu wurde das virushaltige Material so lange verdünnt, bis kein cytopathischer Effekt (CPE) mehr erkennbar war. Die Bestimmung des Virustiters gliedert sich in die nachfolgenden 4 Arbeitsschritte.
I . Aussaat der Zellen
Die Bestimmung des Virustiters erfolgte durch Infektion der entsprechenden Zellen (Tabelle 3) mit verschiedenen Verdünnungen der jeweiligen Virusprobe. Für jede entnommene Probe wurde eine Mikrotiterplatte benötigt. Am Tag vor der Behandlung des jeweiligen Virus mit den Polyphenolen wurden die Zellen in die Mikrotiter- platten eingesät. Für eine Mikrotiterplatte wurden 15 ml Zellsuspension bei einer Einsaat von 150 μl pro Kavität benötigt. Die Platten wurden im Brutschrank (370C, 5 % CO2, 95 % relative Luftfuchtigkeit) aufbewahrt.
2. Herstellung der Verdünnungsreihen für die Titration
Es wurden serielle 1 : 5 Verdünnungen in DMEM (1 % Glutamin, 0,4 % NSP, kein FKS) von den zu untersuchenden Virusproben hergestellt. In einem 96er Proben- röhrchen-Rack (8x 12 Röhrchen) wurden je 600 μl DMEM in den Röhrchen (außer Reihe 1 ) vorgelegt. Reihe 1 enthielt 1 ml der zu untersuchende Virusprobe bzw.500 μl Virus plus 500 μl der jeweiligen Konzentrationsstufe der polyphenolischen Fraktio- nen. Von Reihe 1 ausgehend, wurden mit einer Mehrkanalpipette je 150 μl in die zweite Reihe pipettiert, dreimal gut durchmischt und daraus wiederum 150 μl in die dritte Reihe pipettiert usw. Bei jedem Verdünnungsschritt erfolgte ein Wechsel der Spitzen. Die 12. Reihe enthielt nur Medium und diente als Negativkontrolle.
3. Titration
Die Titration erfolgte in den am Vortag eingesäten Mikrotiterplatten. Es wurden je 50 μl der einzelnen Verdünnungsstufen aus dem 96er Probenröhrchen-Rack auf die Mikrotiterplatten aufgetragen. Für jede Verdünnung wurden 8 Replikate getestet. Die Platten wurden 2 - 5 Tage inkubiert, abhängig von der Inkubationszeit des behandelten Virus. Anschließend erfolgte die mikroskopische Untersuchung auf cytopathi- sche Effekte (CPE). 4. Bestimmung derTissue Culture Infective Dose; TCID50/ml
Die Platten wurden nach der Inkubationszeit mikroskopisch auf cytopathische Effekte (CPE), die durch Virusinfektionen hervorgerufen wurden, untersucht. Positive Reaktionen in den einzelnen Kavitäten der Mikrotiterplatten wurden im Protokoll vermerkt.
Die Berechnung wurde computergestützt auf der Basis der Probitanalyse durchgeführt. Vereinfacht kann für die Bestimmung des Virustiters die Formel nach Spear- man und Kärber angewendet werden:
log10TCID50Λ/olumen = X0 - d/2 + d/n * ∑X,
X0 = Logarithmus der kleinsten Verdünnung, bei der alle Testobjekte positiv reagieren d = der Dosis (verdünnungs) abstand in log10 n = die Zahl der pro Verdünnung eingesetzten Testobjekte
X1 = die Summe aller auf die Infektion positiv reagierender Testobjekte ab und einschließlich X0
Der Virustiter wurde für das Volumen 1 Milliliter berechnet. Da zur Endpunktbestimmung ein Volumen von 50 μl (= 1/20 ml) eingesetzt wurde, musste das Ergebnis noch mit log1020 addiert werden. Ebenfalls war bei der Berechnung zu berücksichtigen, dass die Viren durch die Zugabe der Polyphenole 1 :1 verdünnt waren.
Ergebnisse der Virusinaktivierung
Die in den Ausgangssuspensionen vorhandenen Mengen infektiöser viraler Partikel wurden wie unter 3. beschrieben im klassischen Titrationsverfahren gemessen. Dabei wird jeweils die höchste Verdünnung der Virussuspension ermittelt, die in der Kultur der Indikatorzellen zu 50 % einen zytopathologischen Effekt (CPE) verursacht (50% tissue culture infective doses pro ml (log TCID50AnI)). In den nachfolgenden Abbildungen sind die log TCID50AnI -Werte der Virensuspensionen, der Kontrollen (Positivkontrolle: Virus in Medium mit 5 % Ethanol) sowie der mit den unterschiedli- chen Konzentrationsstufen der Rheum-Fraktionen behandelten Viren dargestellt. Es werden jeweils nur die Konzentrationsstufen gezeigt, bei denen keine Zytotoxizität gegenüber den Indikatorzellen VERO, PK 13, MDBK und ML beobachtet wurde (diese Ergebnisse sind hier nicht aufgeführt). Wie in Figur 5 dargestellt, werden alle Modellviren bei einer Konzentration von 0,05 % durch die Fraktion 4-Variante11 signifikant gehemmt. Dabei scheinen PRV und PPV die empfindlicheren Viren zu sein, da bereits bei 0,01 % eine signifikante Hemmung gegenüber der reinen Virussuspension zu beobachten ist. Fraktion 5-Variante 25 wirkt am stärksten inhibierend auf PPV und BVDV. Alle dargestellten Konzentrationen von 0,05 bis 0,0025 % (Figur 6) zeigen eine Virus inhibierende Wirkung im Vergleich zum Virustiter. Auf PRV wirkt nur die Konzentration 0,01 % Virus inhibierend. Die antivirale Wirksamkeit der Fraktion 5-Variante 25 ist bei dem Virusmodell SFV im Konzentrationsbereich 0,05 bis 0,005 % zu beobachten.
Die Fraktion 9-Variante 25 wirkt generell schon ab einer Konzentration von 0,05 % zytotoxisch. Die stärksten antiviralen Effekte für diese Fraktion sind bei PRV zu sehen. Wie in Figur 7 dargestellt, tritt bereits bei der niedrigsten eingesetzten Konzentration eine Reduktion der viralen Aktivität um ca.40 % auf. Bei der höchsten nicht zytotoxischen Konzentration wird eine Reduktion auf ca. 70 % der Ausgangsaktivität erreicht.
Bei PPV und BVDV tritt bei den Konzentrationen 0,01 % bis 0,0025 % eine Hemmung der viralen Aktivität auf, die bei den höchsten eingesetzten Konzentrationen um ca.65 bis 70 % gesenkt wird. Für SFV wirkt nur die Konzentration 0,01 % signifikant Virustiter reduzierend.

Claims

Patentansprüche
1 . Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler Aktivität zur Virusinaktivierung und Desinfektion aus Rheum-species-Arten, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte: a) Extraktion der getrockneten und gemahlenen Wurzelproben mit Methanol, b) Befreiung der gebildeten wässrigen Phase von lipophilen Begleitstoffen unter vollständiger Methanolentfernung nach Zugabe von Wasser, c) Ausschütteln der gereinigten wässrigen Phase mit Ethylacetat, d) säulenchromatografische Auftrennung der vereinigten Ethylacetatphase in eine begrenzte Anzahl von Wirkstofffraktionen, e) Zusammenfassung der Wirkstofffraktionen mit gleichem Inhaltsstoffspektrum, f) Abtrennung einzelner Wirkstofffraktionen zur Verwendung nach Durchführung eines Wirksamkeitsnachweises der Wirkstofffraktionen.
2. Wirkstofffraktionen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Befreiung der gebildeten wässrigen Phase von lipophilen Begleitstoffen durch Ausfällung der lipophilen Begleitstoffe bei 5 0C unter Stick- stoffbegasung erfolgt.
3. Wirkstofffraktionen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die wässrige Phase mit Petrolether ausgeschüttelt wird.
4. Wirkstofffraktionen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Ausschütteln der gereinigten wässrigen Phase mit Ethylacetat die vereinigten Ethylacetatphasen unter Vakuum eingeengt, in wenig Wasser aufge- nommen und anschließend gefriergetrocknet werden.
5. Wirkstofffraktionen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) zursäulenchromatografischen Auftrennung als Elutionsmittel Ethanol, Methanol und ein Gemisch aus Aceton und Wasser eingesetzt werden.
PCT/DE2007/000580 2006-04-03 2007-03-30 Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler aktivität Ceased WO2007112731A1 (de)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/225,942 US20090136603A1 (en) 2006-04-03 2007-03-30 Active component fraction of high antiviral activity
DE502007002678T DE502007002678D1 (de) 2006-04-03 2007-03-30 Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler aktivität
AT07722138T ATE455551T1 (de) 2006-04-03 2007-03-30 Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler aktivität
PL07722138T PL2001494T3 (pl) 2006-04-03 2007-03-30 Frakcje substancji czynnych o wysokiej aktywności przeciwwirusowej
EP07722138A EP2001494B1 (de) 2006-04-03 2007-03-30 Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler aktivität

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102006015573.4 2006-04-03
DE102006015573A DE102006015573A1 (de) 2006-04-03 2006-04-03 Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler Aktivität

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007112731A1 true WO2007112731A1 (de) 2007-10-11

Family

ID=38233524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2007/000580 Ceased WO2007112731A1 (de) 2006-04-03 2007-03-30 Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler aktivität

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20090136603A1 (de)
EP (1) EP2001494B1 (de)
AT (1) ATE455551T1 (de)
DE (2) DE102006015573A1 (de)
PL (1) PL2001494T3 (de)
WO (1) WO2007112731A1 (de)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2161025A1 (de) 2008-09-05 2010-03-10 Engelhard Arzneimittel GmbH & Co. KG Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus Pflanzenmaterial der Art Rumex acetosa L.
DE102012001867A1 (de) 2012-01-24 2013-07-25 Hochschule Anhalt (Fh) Antifungale Formulierungen zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten
BR112015028983A2 (pt) * 2013-05-20 2017-07-25 Indus Biotech Private Ltd método para controlar fibrose hepática, vírus da hepatite c e afecção associada
CN103800483A (zh) * 2014-02-26 2014-05-21 天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂 一种消肿解毒通便止血中药提取物的制备方法
CN105816533A (zh) 2015-01-08 2016-08-03 昆明制药集团股份有限公司 一种提取茋类化合物的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4670265A (en) * 1983-07-22 1987-06-02 Sydiskis Robert J Aloe emodin and other anthraquinones and anthraquinone-like compounds from plants virucidal against herpes simplex viruses
EP0568001A2 (de) * 1992-04-27 1993-11-03 Showa Shell Sekiyu Kabushiki Kaisha Ein Roharzneimittel enthaltende antivirales Mittel
DE10132936A1 (de) * 2001-07-06 2003-01-30 Andreas Hensel Galloylierte Proanthocyanidine, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung in Kosmetika und als Wirkstoffe zur Förderung der Zellproliferation

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0890360B1 (de) * 1997-04-21 2003-01-02 Dabur Research Foundation Polypflanzliche pharmazeutische Zusammensetzungen geeignet in der Behandlung der Hepatitis E und Hepatitis B Virus-Infektion zusammenhängenden Zustände

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4670265A (en) * 1983-07-22 1987-06-02 Sydiskis Robert J Aloe emodin and other anthraquinones and anthraquinone-like compounds from plants virucidal against herpes simplex viruses
EP0568001A2 (de) * 1992-04-27 1993-11-03 Showa Shell Sekiyu Kabushiki Kaisha Ein Roharzneimittel enthaltende antivirales Mittel
DE10132936A1 (de) * 2001-07-06 2003-01-30 Andreas Hensel Galloylierte Proanthocyanidine, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung in Kosmetika und als Wirkstoffe zur Förderung der Zellproliferation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE BIOSIS [online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 1996, WANG ZHIYU WANG GUITING ET AL: "Anti-herpes virus action of ethanol-extract from the root and rhizome of Rheum officinale Baill", XP002443326, Database accession no. PREV199699156976 *
ZHONGGUO ZHONGYAO ZAZHI, vol. 21, no. 6, 1996, pages 364 - 366, 384, ISSN: 1001-5302 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2001494B1 (de) 2010-01-20
DE502007002678D1 (de) 2010-03-11
ATE455551T1 (de) 2010-02-15
DE102006015573A1 (de) 2007-10-04
EP2001494A1 (de) 2008-12-17
PL2001494T3 (pl) 2010-06-30
US20090136603A1 (en) 2009-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3788016T2 (de) Antivirale pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltende Hypericine oder Pseudohypericine.
Amoros et al. In vitro antiviral activity of propolis
Sokmen et al. In vitro antioxidant activity of polyphenol extracts with antiviral properties from Geranium sanguineum L
Vijayan et al. Antiviral activity of medicinal plants of Nilgiris
EP1294389B1 (de) Therapeutische verwendung von extrakten aus sophora flavescens oder sophora subprostrata
CN103816296B (zh) 紫珠总苷提取物及其制备方法和用途
CN102727563B (zh) 大戟属植物具有抗hiv潜伏作用的有效部位及其应用
EP2001494B1 (de) Wirkstofffraktionen mit hoher antiviraler aktivität
WO2002024145A9 (en) Antiviral substances from plant cuticular and epicuticular material
DE10138929A1 (de) Artischockenblätterextrakte
Gomes et al. Biological assessment (antiviral and antioxidant) and acute toxicity of essential oils from Drimys angustifolia and D. brasiliensis
CN111018821B (zh) 双黄酮类化合物及其制备方法和用途
EP1294388A1 (de) EXTRAKTE AUS i SOPHORA /i -ARTEN, VERFAHREN ZU IHRER HERSTELLUNG UND VERWENDUNG
WO2009135880A1 (de) Zistrosenextrakt mit angereicherten sekundären pflanzeninhaltsstoffen
Dureja et al. Free radical scavenging potential and total phenolic and flavonoid content of Ziziphus mauritiana and Ziziphus nummularia fruit extracts
DE3879688T2 (de) Anti-retrovirales arzneimittel.
CN113440563B (zh) 一种复方鱼腥草喷雾剂及其制备方法和应用
Chen et al. On the Ca++-Antagonistic Principles of the Flower Buds of Magnolia fargesii1
DE3525363C2 (de)
DE69625804T2 (de) Aus aloe barbadensis isoliertes cinnamoyl-c-glykosid chromon
US20100298251A1 (en) Wound-healing agent containing momordicae semen extract
EP1651244B1 (de) Verwendung von Extrakten aus Wurzeln von Pelargonium sidoides und/oder Pelargonium Reniforme
Thompson Herbal extracts and compounds active against herpes simplex virus
DE102010026684A1 (de) Hemmung des Überlebens von Knochenkrebs durch Cyclohexenonverbindungen aus Antrodia camphorata
EP3352763B1 (de) Substanz zur prophylaxe und behandlung von infektionen durch influenzaviren

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07722138

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WD Withdrawal of designations after international publication

Designated state(s): DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12225942

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007722138

Country of ref document: EP