WO2007114252A1 - 蛋白質の測定方法 - Google Patents

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diamond
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Yasuaki Einaga
Tribidasari Ivandini Anggraningrum
Masanobu Chiku
Mikito Yamanuki
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Horiba Ltd
Keio University
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Definitions

  • the present invention relates to a measurement method capable of performing protein detection at high speed by an electrochemical method with high accuracy and high sensitivity with a simple operation and apparatus.
  • Albumin is the most abundant protein in plasma. Urine containing a small amount of albumin is called microalbuminuria, which is urine found in the early stages of diabetic nephropathy. In order to prevent the onset and progression of diabetic nephropathy, it is important to take measures before urinary protein is clearly positive. It is extremely effective for early detection of nephropathy.
  • the determination is performed by agglutinating an anti-prealpmin and an anti-prealbumin-conjugated sensitized (bound) latex.
  • albumin-sensitized latex even when albumin-sensitized latex is added, no aggregation occurs and albumin is sensitized because the urinary albumin is not present, or when it is less than 30 mgZL, the anti-human albumin antibody remains unneutralized. Aggregates by antigen-antibody reaction with latex. By utilizing this property, a very small amount of albumin can be measured.
  • Patent Document 1 JP-A-4-69572
  • Patent Document 2 JP 2003-294679
  • Patent Document 3 JP 2003-294680
  • Patent Document 4 JP 2003-294681 A
  • anti-human albumin antibodies are not suitable for immunoassays such as latex agglutination.
  • it is difficult to perform stable and highly accurate and highly sensitive measurement of the reagent containing antibodies because of the large variation in quality among products.
  • strict reagent management is necessary to perform stable, highly accurate and highly sensitive measurements.
  • strict reagent management places a burden on medical institutions in terms of physical and human resources.
  • an immunosuppressive acidic protein (hereinafter also referred to as IAP), which is an immunosuppressive substance found in the blood of various types of cancer-bearing patients, is a kind of acute phase reactant and is highly concentrated in cancer-bearing patients. Since it shows an increase and shows a high value according to the progression stage, it is possible to make the tumor non-organ specific. Furthermore, IAP has been reported as an index for predicting the effectiveness of adjuvant immunochemotherapy in malignant diseases from the viewpoint of its immunosuppressive activity.
  • C-reactive protein (hereinafter also referred to as CRP) is a protein whose value increases when inflammation or destruction of biological tissue occurs in the body, and binds to C-polysaccharide of pneumococci. . Since the value increases due to inflammation, it is used as a marker protein for various diseases. It also attracts attention as a marker for vascular diseases such as myocardial infarction because it reacts sensitively to vascular inflammation. Myocardial infarction is difficult to predict, and it is expected that a diagnostic method will be established by CRP.
  • the present invention is to provide a measurement method capable of detecting these various proteins with high precision and high sensitivity at high speed by an electrochemical method with a simple operation and apparatus. It is intended.
  • a working electrode and a counter electrode are brought into contact with a sample solution containing a protein to be measured, and an electric current is interposed between the working electrode and the counter electrode.
  • a pressure is applied to measure a current value under the voltage, and the protein is electrochemically analyzed.
  • the inventor has found for the first time that a polymer substance such as a protein can be measured electrochemically using a conductive diamond electrode or the like. Is due to. Since the protein measurement method according to the present invention is an electrochemical analysis method, a reagent containing an antibody is used as in an immunoassay method based on an antigen-antibody reaction such as a latex agglutination method which has been widely used in the past. Not necessarily used. For this reason, it is possible to perform a stable and highly accurate analysis without worrying about a decrease in measurement accuracy and sensitivity due to variations in the quality of reagents such as immunoassays.
  • the protein measuring method according to the present invention can detect a low-concentration protein with high sensitivity by using a boron-doped diamond electrode as a working electrode.
  • protein detection can be performed at high speed with high accuracy and high sensitivity by a simple operation and apparatus.
  • FIG. 1 is a voltammogram showing the results of cyclic voltammetry measurement using ushi serum albumin as a measurement target.
  • FIG. 2 is a voltammogram showing the result of cathodic reduction of diamond electrode after measurement of ushi serum albumin.
  • FIG. 3 is a voltammogram showing the results of cyclic voltammetry measurement using an immunosuppressive acidic protein as a measurement target.
  • FIG. 4 is a voltammogram showing the results of cyclic voltammetry measurement using hemoglobin as the measurement target.
  • FIG. 5 is a voltammogram showing the results of cyclic voltammetry measurement using pepsin as the measurement target.
  • Figure 6 shows the results of cyclic voltammetry measurement using C-reactive protein as the measurement target. It is the voltammogram which shows.
  • FIG. 7 is a schematic view of an electrochemical measurement apparatus showing an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing the configuration of the flow cell of the electrochemical measurement apparatus shown in FIG.
  • FIG. 9 is a calibration curve showing the relationship between albumin concentration (horizontal axis) and current value (vertical axis) obtained by flow injection measurement.
  • FIG. 10 is a voltammogram obtained by cyclic voltammetry measurement obtained by linear sweep (20 mVZs) while changing the concentration of tetrodotoxin.
  • FIG. 11 is a calibration curve showing the relationship between the tetrodotoxin concentration (horizontal axis) and the current value (vertical axis) obtained by applying a voltage that gives the maximum current.
  • the protein to be measured in the present invention is not particularly limited, but the present invention is suitable for a high molecular weight protein having a molecular weight of 10,000 or more.
  • a high molecular weight protein having a molecular weight of 10,000 or more.
  • albumin, IAP, pepsin, hemoglobin, CRP Can be measured with high accuracy and high sensitivity.
  • natural toxins such as tetrodotoxin can also be measured.
  • a conductive diamond electrode or a carbon electrode is used as the working electrode.
  • Examples of the conductive diamond electrode include those having a diamond thin film that is made conductive by mixing elements of Group 13 or Group 15, among which boron, nitrogen, and a group power selected by a linker are selected. Especially preferred is a mixture of at least one kind of element. A boron-doped diamond electrode mixed with boron is suitable.
  • the conductive diamond electrode an electrode having a diamond thin film made conductive by mixing an element belonging to any of group 8, 9, or 10 can be used.
  • Examples of such a conductive diamond electrode include platinum, noradium, nickel, ruthenium, and a mixture of at least one element selected from the group force of iridium force.
  • the concentration of a protein to be measured in a sample solution from the obtained current value is calculated. By comparing the calibration curve of the current value and the obtained current value.
  • the voltage applied between the working electrode and the counter electrode is preferably a voltage that gives a maximum current value.
  • the method may further include a step of regenerating the conductive diamond electrode by cathodic reduction.
  • the electrode dissolves or becomes inactive depending on conditions such as pH in a metal electrode, while foaming due to hydrogen generation occurs in a glassy carbon electrode (hereinafter also referred to as a GC electrode). This causes physical destruction of the electrode.
  • the conductive diamond electrode does not cause physical and chemical damage due to hydrogen generation.
  • Examples of the mechanism for removing the protein adhering to the conductive diamond electrode force by hydrogen generation include the following. (1) By generating hydrogen, the electrode surface can be brought into an acidic environment separately from the pH of the solution, and the protein is decomposed in the acidic environment.
  • Bubbles are generated by the generation of hydrogen, which is a gas at normal temperature and pressure, and proteins are physically separated by the bubbles.
  • the protein measurement method according to the present invention may be based on a two-electrode method using a working electrode and a counter electrode. However, when highly sensitive and highly accurate measurement is performed, a three-electrode using a reference electrode is further used. Control the absolute value of the voltage applied between the working electrode and the counter electrode by bringing the reference electrode into contact with a sample solution containing the protein to be measured, which is preferred by the method.
  • FIG. 1 shows cyclic voltammetry measurement under the following conditions using urine serum albumin (hereinafter also referred to as BSA) as a measurement object and using a boron-doped diamond electrode as a working electrode. It is the voltammogram which showed the thing in PH7 among the results.
  • Sample solution 300mgZdl BSA (0.1M phosphate buffer (PBS) pH2, 7, 10) Reference electrode; AgZAgCl
  • Potentiostat HSV-100 (Hokuto Denko)
  • the dotted line shows the background of PBS as a carrier solution.
  • the protein measuring method according to the present invention can be carried out, for example, by a measuring apparatus having the following configuration. That is, a measuring device for detecting a protein to be measured in a sample solution, which includes a cell containing a working electrode and a counter electrode, means for applying a voltage to the working electrode and the counter electrode, and the applied voltage
  • a protein measuring apparatus comprising: a means for measuring a current value below; and an obtained current value force; an information processing apparatus for detecting the protein.
  • the working electrode is preferably a conductive diamond electrode, and a boron-doped diamond electrode is more preferable.
  • the cell further includes a reference electrode, and further includes means for controlling the absolute value of the voltage applied between the working electrode and the counter electrode. Also good.
  • the electrode can be regenerated by removing the adsorbed protein by cathodic reduction. is there.
  • the measuring device according to the present invention may be such that the conductive diamond electrode is regenerated by cathodic reduction.
  • a carrier solution having a constant flow rate is brought into contact with the working electrode, the protein to be measured is injected therein, and brought into contact with the working electrode and the counter electrode.
  • a voltage may be applied between the electrodes, a current value under the voltage may be measured, and the protein may be analyzed electrochemically. In this way, it is possible to perform continuous measurement in which adsorption of protein to the electrode surface is difficult to occur, and the measurable concentration range is close to the blood concentration of the human body, which is a preferred measurement method.
  • FIG. 7 shows an embodiment of an apparatus for carrying out the protein measuring method according to the present invention, and is a liquid injection type electrochemical measuring apparatus (flow) using a flow cell for electrochemical measurement. An outline of the analysis apparatus) is shown.
  • Flow injection analysis creates a controlled continuous flow using a metering pump, etc., and performs various reactions, separation, sample injection, etc. in this flow, and has a flow cell installed at the end.
  • components in a solution are analyzed by a detector.
  • the electrochemical measurement apparatus shown in FIG. 7 includes a flow cell 3 incorporating a counter electrode 4, a working electrode 5 and a reference electrode 6 and a pump 2 from the upstream side of the flow path.
  • the working electrode 5 and the reference electrode 6 are connected to a potentiogalvanostat 7, and an information processing device 8 is connected to the potentiogalvanostat 7.
  • a sample solution 1 containing the protein to be measured is flowing while a carrier solution such as PBS is flowing.
  • a carrier solution such as PBS
  • Pump 2 to flow cell 3.
  • a voltage is applied between the working electrode 5 and the counter electrode 4 to A chemical reaction occurs.
  • the electric current value (electric signal) generated by the electrochemical reaction is transmitted to the potentiogalvanostat 7 and the control of the signal at each electrode is detected.
  • the signal detected by the potentio yoga rubanostat 7 is analyzed by the information processing device 8 to detect various proteins and measure the concentration.
  • the sample solution 1 whose measurement has been completed is discharged out of the electrochemical measuring device.
  • Examples of the sample solution 1 include those containing proteins such as anolebumin, IAP, pepsin, hemoglobin, and CRP.
  • examples of albumin containing a marker for diabetic nephropathy include whole blood, serum, plasma, urine and the like.
  • the method for measuring albumin using the electrochemical measurement apparatus can measure without using a measurement reagent containing an anti-albumin antibody as in the conventional immunoassay method using antigen-antibody reaction. . For this reason, measurement can be performed stably with high accuracy and sensitivity without worrying about a decrease in measurement accuracy and measurement sensitivity due to variations in the quality of the measurement reagent. In addition, measurement can be performed without using a measurement reagent containing an anti-albumin antibody, and the structure and operation of the measurement apparatus can be simplified.
  • the electrochemical measuring device can also be used for the sample solution 1 containing a natural poison such as tetrodotoxin, which is a puffer poison.
  • Tetrodotoxin causes paralysis of nerves and muscles by binding to sodium channels, which are sodium ion pathways, and blocking the transmission of nerve information.
  • the sample solution 1 containing tetrodotoxin include a pufferfish tissue paste-like and suspended in a buffer solution.
  • the pump 2 is not particularly limited as long as it can send the sample solution 1 to the flow cell 3 at a constant speed, and for example, a liquid chromatography pump or the like can be used.
  • the working electrode 5, the counter electrode 4, and the reference electrode 6 are exposed in the flow path 31 through which the sample solution 1 flows so that they can come into contact with the sample solution 1. It is configured.
  • the working electrode 5 is a conductive diamond electrode
  • the diamond thin film is exposed in the channel 31 and contacts the sample solution 1.
  • the sample solution 1 enters from the inlet 32 of the channel 31 and flows as indicated by the arrow in the figure, reaching 33 outlets. Then, when a voltage is applied between the working electrode 5 and the counter electrode 4, an electrochemical reaction occurs in the sample solution 1.
  • the working electrode 5 may be a micro electrode or a rotating electrode.
  • a conductive diamond electrode or a carbon electrode can be used as the working electrode 5.
  • Diamond is an inherently excellent insulator. However, by adding Group 13 or Group 15 impurities, semiconductor-to-metal conductivity is exhibited. In the present invention, a diamond having a semiconductor to metal-like conductivity is used as an electrode.
  • Examples of substances mixed to impart conductivity to diamond include the elements of Groups 13 and 15 as described above, more preferably boron, nitrogen, and phosphorus. Boron is preferable.
  • a boron-doped diamond electrode doped with boron at a high concentration has advantageous properties such as a wide potential window (wide oxidation potential and reduction potential) and a low background current compared to other electrode materials. Yes.
  • the boron-doped diamond electrode is excellent in chemical resistance, durability, electrical conductivity, corrosion resistance, and the like.
  • the amount of substances mixed to impart conductivity to these diamonds may be appropriately determined within a range that can impart conductivity to the diamond. For example, 1 x 10 1 2 to 10_ 6 ⁇ cm
  • the amount of addition which is preferably an amount that provides a degree of conductivity, is generally controlled in the manufacturing process.
  • Base materials include Si (for example, single crystal silicon), Mo, W, Nb, Ti, Fe, Au, Ni, Co, AlO, SiC, Si N, ZrO, MgO, graphite, single crystal diamond, cB
  • the thickness of the conductive diamond thin film is not particularly limited, but a thickness of about 1 to about LOO / zm is preferable, and about 5 to 50 ⁇ m is more preferable.
  • the conductive diamond electrode takes the form of a microelectrode! / It ’s okay.
  • the diamond electrode in the form of a microelectrode is a thin end of a thin wire such as Pt, which is cut sharply and further sharpened by electropolishing, and then a thin film of conductive diamond is formed on the end surface. The thing of composition.
  • the conductive diamond thin film can be produced by a chemical vapor deposition method.
  • the chemical vapor deposition method is a method of synthesizing a substance by chemically reacting gas raw materials in a gas phase, and is generally called a C VD (Chemical Vapor Deposition) method. This method is widely used in the semiconductor manufacturing process, and can also be used for the production of the conductive diamond thin film according to the present invention under appropriate modifications.
  • the chemical vapor synthesis of diamond is based on a mixture of carbon-containing gas such as methane and hydrogen. It is carried out by exciting it as a source gas by an excitation source, supplying it on the substrate and depositing it.
  • Examples of the excitation source include a hot filament, microwave, high frequency, direct current glow discharge, direct current arc discharge, and combustion flame. It is also possible to adjust the nucleation density by combining a plurality of these to increase the uniformity of the large area.
  • the raw material contains carbon, which is decomposed and excited by an excitation source to activate C, C, etc.
  • Compounds can be used, and preferred specific examples include CH, CH, CH as gas
  • the chemical vapor synthesis method for adding a substance that imparts conductivity to diamond, for example, a disk of the additive substance is placed in the system and excited in the same manner as the carbon source material.
  • the method is to introduce an additive substance into the phase, add the additive substance to the carbon source in advance, introduce it into the system together with the carbon source, excite it by the excitation source, and introduce the additive substance into the carbon gas phase.
  • the latter method is preferred.
  • the method power to dissolve the acid boron (B 2 O 3) in this and use it as a boron source
  • the concentration of boron is easy and simple.
  • boron when boron is added to the carbon source, about 10-12, OOOppm is common, and about 1,000,000, OOOppm is preferred!
  • a plasma chemical vapor synthesis method is preferably used.
  • This plasma chemical vapor synthesis method has the advantage that the reaction is fast due to the large amount of active energy that causes the chemical reaction. Furthermore, according to this method, a chemical species that does not exist unless it is thermodynamically high is generated, and a reaction at a low temperature is possible. Production of a conductive diamond thin film by the plasma chemical vapor synthesis method can be performed according to the method described in Yano et al., J. Electrochem. Soc., 145 (1998) 1870, for example.
  • the boron-doped diamond electrode used in the present invention can be manufactured, for example, by a manufacturing method using a microwave plasma-assisted CVD method as described below.
  • the specific manufacturing method is as follows. First, inside the chamber filled with hydrogen gas A hydrogen plasma is generated on the surface, a mixed gas of acetone and methanol in which boron species are dissolved is introduced, a carbon source is introduced, and vapor phase growth is performed on a conductive (or semiconductive) substrate such as a silicon substrate. . A silicon substrate ⁇ Si (lOO) ⁇ is used as the substrate, and the substrate surface is textured (for example, polished with 0.5 m diamond powder), and then the substrate is set in a holder of a film forming apparatus. As a film formation source, a mixture of acetone and methanol (liquid, mixing ratio 9: 1) was used, and boron oxide (BO) was added to boron Z carbon (
  • the B / C) ratio is 10 4 ppm. Then, after passing pure H gas as a carrier gas through this film forming source, it is introduced into the chamber 1 and preliminarily supplied with hydrogen (for example,
  • a conductive diamond electrode is used as the working electrode 5
  • an electrode having a diamond thin film that is rendered conductive by mixing of an element belonging to any one of group 8, 9, or 10 is used. May be.
  • the element platinum, palladium, nickel, ruthenium, iridium and the like are preferably used.
  • An ion implantation method can be used to introduce the element into diamond.
  • the metal diamond composite electrode produced by ion implantation is highly stable and does not peel off by ultrasonic cleaning or the like, and has excellent metal dispersibility.
  • a glassy carbon electrode is preferably used.
  • the glassy carbon electrode is suitable for chemicals with good electrical conductivity. It has the same properties as pyrolysis graphite that is stable and impervious to gas, is inexpensive, and has a relatively large overvoltage for hydrogen generation and oxygen generation.
  • Examples of the counter electrode 4 include platinum, carbon, stainless steel, gold, diamond, and SnO.
  • the voltage applied between the working electrode 5 and the counter electrode 4 is preferably a voltage that gives a maximum current value from the viewpoint of measurement efficiency and accuracy.
  • the voltage that gives the maximum current value is a voltage that gives the maximum current value by, for example, cyclic voltammetry.
  • the voltage that gives the maximum current value can also be obtained by the rotating electrode method or the microelectrode method.
  • the rotating electrode method or the microelectrode method is advantageous in that it can further eliminate the possibility of measurement errors due to measurement conditions.
  • the reference electrode 6 a known one can be used, and a standard hydrogen electrode, a silver salt-silver electrode, a mercury mercury chloride electrode, a hydrogen palladium electrode, or the like can be used.
  • the electrochemical measurement apparatus performs the measurement by the three-electrode method provided with the counter electrode 4, the working electrode 5, and the reference electrode 6.
  • the electrochemical measurement apparatus performs the measurement method according to the present invention.
  • the fixed device may be a two-electrode method having only the working electrode 5 and the counter electrode 4.
  • the three-electrode method can control the absolute value of the voltage applied between the working electrode 5 and the counter electrode 4, so that it can perform measurements with high accuracy and sensitivity.
  • two types of electrodes can be used, the working electrode 5 and the counter electrode 4, so that the structure of the flow cell 3 can be simplified and miniaturized, and the measuring cell can be used in a chipped manner. It is also possible to perform simpler measurement.
  • the carrier solution not containing the protein to be measured is passed through the flow cell 3, so that the so-called background current is minimized and stabilized.
  • the diamond electrode is characterized by a low background current.
  • the sample solution 1 is mixed with the carrier solution and flows into the flow cell 3. The flow path through which the carrier solution flows into the flow cell 3 is illustrated.
  • the information processing device 8 includes a CPU, an internal memory, an external storage device such as an HDD, a communication interface such as a modem, a display, an input means such as a mouse and a keyboard, and the like. Then, according to a program set in a predetermined area such as the internal memory or the external storage device, the electrical signal is analyzed to detect the protein and calculate the concentration.
  • the information processing device 8 may be a general-purpose computer or a dedicated device.
  • FIG. 9 shows a boron-doped diamond electrode as the working electrode 5, platinum as the counter electrode 4, a silver / salt / silver silver electrode as the reference electrode 6, and a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) at a constant flow rate.
  • a boron-doped diamond electrode as the working electrode 5, platinum as the counter electrode 4, a silver / salt / silver silver electrode as the reference electrode 6, and a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) at a constant flow rate.
  • FIA flow injection measurement
  • Fig. 10 shows a boron-doped diamond electrode as the working electrode 5, platinum as the counter electrode 4, SCE (saturated calomel electrode) as the reference electrode 6, and tetrodoxin in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0).
  • the voltammogram by cyclic voltammetry obtained by linear sweep (20mVZs) with different concentrations is shown.
  • the maximum current value was around 1.37V.
  • Fig. 11 is a calibration curve showing the relationship between the concentration (horizontal axis) and the current value (vertical axis) obtained by measuring a tetrodotoxin solution with a known concentration by applying a voltage of 1.37V. .
  • a pretreatment operation for removing impurities contained in the sample solution 1 may be performed.
  • the pretreatment operation include a column treatment operation and a centrifugation operation.
  • a batch-type electrochemical measurement device may be used in addition to a cell having a flow type.
  • the electrochemical measurement apparatus is equipped with a separation means such as HPLC, and after separation / purification of the target protein, analysis of the target protein fraction which has been separated and purified is subsequently performed. Even if it is configured to be possible.

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Abstract

　蛋白質の検出を、簡便な操作及び装置で、高精度かつ高感度に、電気化学的方法により高速で行うことができる測定方法を提供するものであり、測定対象の蛋白質を含有する試料溶液１に、作用電極５及び対電極４を接触させ、前記作用電極５と前記対電極４との間に電圧を印加して、当該電圧下における電流値を測定し、前記蛋白質を電気化学的に分析するようにした。

Description

明 細 書
蛋白質の測定方法
技術分野
[0001] この発明は、蛋白質の検出を、簡便な操作及び装置で、高精度かつ高感度に、電 気化学的方法により高速で行うことができる測定方法に関するものである。
背景技術
[0002] アルブミンは血漿中に最も多く含まれる蛋白質である力 アルブミンを微量に含む 尿はミクロアルブミン尿と呼ばれ、糖尿病性腎症の初期にみられる尿である。糖尿病 性腎症の発症及び進展の防止には、尿蛋白が明らかな陽性を示す前に対策を立て ることが重要であることから、ミクロアルブミン尿の有無を早期に判定することは、糖尿 病性腎症の早期発見に極めて有効である。
[0003] 尿中アルブミン量を測定する方法としては、例えば、特許文献 1に示すように、抗プ レアルプミンと抗プレアルブミンの抗体が結合した感作 (結合)ラテックスとを凝集反応 させて判定を行うラテックス凝集法がある。具体的には、特許文献 1記載のアルブシ ユア（エーザィ株式会社の商品名）のようなアルブミン検出試薬を用いると、尿中アル ブミンが 30mgZL以上のときには抗ヒトアルブミンャギ抗体が完全に中和されるため 、アルブミン感作ラテックスを加えても凝集せず、尿中アルブミンが存在しないか、あ るいは、 30mgZL未満のときには抗ヒトアルブミンャギ抗体は中和されずに残るため 、アルブミン感作ラテックスとの抗原抗体反応によって凝集する。この性質を利用す れば、ごく微量のアルブミンを測定することができる。
特許文献 1 :特開平 4— 69572
特許文献 2：特開 2003 - 294679
特許文献 3：特開 2003 - 294680
特許文献 4：特開 2003 - 294681
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] し力しながら、ラテックス凝集法をはじめとする免疫測定法では抗ヒトアルブミン抗体 を含有する試薬が必要であるが、抗体を含有する試薬は製品ごとの品質のばらつき が大きぐ安定して高精度かつ高感度の測定を行うことが難しい。また、安定して高 精度かつ高感度の測定を行うためには厳密な試薬の管理が必要であるが、厳密な 試薬管理は物的、人的な面力も医療機関の負担となっている。
[0005] 一方、例えば、特許文献 2乃至 4に記載のように、電気化学的に活性な酵素を測定 対象たるアルブミンの抗体に結合させた酵素結合抗体を用いて、その電気化学的な 反応を測定することによって間接的にアルブミンの量を測定する方法も知られている 力 アルブミンは電気化学的な活性は高くはないので、電気化学的な方法により直 接測定することは困難であると考えられていた。さらに電気化学的な測定方法では、 蛋白質の電極表面への吸着による測定への悪影響も懸念される。
[0006] また、各種の担癌患者血中に見出される免疫抑制物質である免疫抑制酸性蛋白 質 (以下 IAPともいう。）は、一種の急性相反応物質として担癌患者において高率に 濃度の増加を示し、進行期に応じて高値を呈することから、臓器非特異的な腫瘍マ 一力一とすることが可能である。更に、 IAPについてはその免疫抑制活性の観点から 、悪性疾患における補助免疫化学療法の有効性予測の指標とする試みも報告され ている。
[0007] 一方、 C反応性蛋白質 (以下 CRPとも 、う。）は、体内で炎症や生体組織の破壊が 生じているときに数値が増加する蛋白質であり、肺炎球菌の C多糖体と結合する。炎 症により数値が上昇することから様々な疾患に対するマーカー蛋白質として使用され る。また、血管の炎症などに鋭敏に反応するために心筋梗塞などの血管性疾患に対 するマーカーとしても注目されている。心筋梗塞などは予知が困難であり、 CRPによ り診断法が確立することが期待されて ヽる。
[0008] これに対し、本発明は、これら種々の蛋白質の検出を、簡便な操作及び装置で、高 精度かつ高感度に、電気化学的方法により高速で行うことができる測定方法を提供 すべく図ったものである。
課題を解決するための手段
[0009] すなわち本発明に係る蛋白質の測定方法は、測定対象の蛋白質を含有する試料 溶液に、作用電極及び対電極を接触させ、前記作用電極と前記対電極との間に電 圧を印加して、当該電圧下における電流値を測定し、前記蛋白質を電気化学的に分 析するものであることを特徴とする。
[0010] 本発明に係る蛋白質の測定方法は、本発明者が、蛋白質のような高分子物質も導 電性ダイヤモンド電極等を用いれば電気化学的に測定可能であることを初めて見出 したことによるものである。本発明に係る蛋白質の測定方法は、電気化学的な分析法 であるので、従来広く用いられて ヽるラテックス凝集法等の抗原抗体反応に基づく免 疫測定法のように、抗体を含む試薬を必ずしも使用しない。このため、免疫測定法の ような試薬の品質がばらつくことによる測定精度や感度の低下を懸念することなぐ安 定して高精度かつ高感度の分析を行うことができる。また、抗体を含む試薬を必ずし も使用しないため分析操作が極めて簡便であり瞬時に分析結果を得ることができる。 更に、少量のサンプルで分析が行え、測定装置の小型化を図ることもできる。本発明 に係る蛋白質の測定方法は、作用電極としてボロンドープダイヤモンド電極を用いる ことにより低濃度の蛋白質も高い感度で検出することができる。
発明の効果
[0011] このように本発明によれば、簡便な操作及び装置で、高精度かつ高感度に、蛋白 質の検出を高速で行うことができる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]図 1はゥシ血清アルブミンを測定対象とするサイクリックボルタンメトリー測定の 結果を示すボルタモグラムである。
[図 2]図 2はゥシ血清アルブミンを測定した後のダイヤモンド電極に対して陰極還元を 施した結果を示すボルタモグラムである。
[図 3]図 3は免疫抑制酸性蛋白質を測定対象とするサイクリックボルタンメトリー測定 の結果を示すボルタモグラムである。
[図 4]図 4はヘモグロビンを測定対象とするサイクリックボルタンメトリー測定の結果を 示すボルタモグラムである。
[図 5]図 5はペプシンを測定対象とするサイクリックボルタンメトリー測定の結果を示す ボルタモグラムである。
[図 6]図 6は C反応性蛋白質を測定対象とするサイクリックボルタンメトリー測定の結果 を示すボルタモグラムである。
[図 7]図 7は本発明の一実施形態を示す電気化学測定装置の概要図である。
[図 8]図 8は図 7に示す電気化学測定装置のフローセルの構成を示す概要図である。
[図 9]図 9はフローインジェクション測定により得られた、アルブミン濃度 (横軸）と電流 値 (縦軸）との関係を示す検量線である。
[図 10]図 10はテトロドトキシンの濃度を変えて直線掃引（20mVZs)により得られた サイクリックボルタンメトリー測定により得られたボルタモグラムである。
[図 11]図 11は最大電流を与える電圧を印加して得られた、テトロドトキシン濃度 (横 軸）と電流値 (縦軸）との関係を示す検量線である。
符号の説明
1 · '試料溶液
2· •ポンプ
3· •フローセノレ
4· •対電極
5· •作用電極
6· •参照電極
7· •ポテンショガルバノスタツト
8· •情報処理装置
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明において測定対象となる蛋白質としては特に限定されないが、本発明は分 子量が 10, 000以上である高分子蛋白質に好適であり、例えば、アルブミン、 IAP、 ペプシン、ヘモグロビン、 CRP等を高精度かつ高感度に測定することができる。また 、本発明によれば、テトロドトキシン等の天然毒も測定可能である。
[0015] 本発明に係る蛋白質の測定方法では、作用電極として導電性ダイヤモンド電極や カーボン電極が用いられる。
[0016] 前記導電性ダイヤモンド電極としては、 13族又は 15族の元素の混入により導電性 とされたダイヤモンド薄膜を有するものが挙げられ、なかでも、ホウ素、窒素、及び、リ ンカ なる群力 選択される少なくとも一種の元素を混入したものが好ましぐ特に、 ホウ素を混入したボロンドープダイヤモンド電極が好適である。
[0017] また、前記導電性ダイヤモンド電極としては、 8族、 9族又は 10族のいずれかの族に 属する元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものを使用するこ ともでき、このような導電性ダイヤモンド電極としては、白金、ノ《ラジウム、ニッケル、ル テ-ゥム、及び、イリジウム力 なる群力 選択される少なくとも一種の元素が混入さ れたものが挙げられる。
[0018] 本発明に係る蛋白質の測定方法にぉ ヽて、得られた電流値から試料溶液中の測 定対象である蛋白質の濃度を算出するには、予め作成された測定対象の蛋白質の 濃度と電流値との検量線と、得られた電流値とを対比することによる。
[0019] 前記作用電極と対電極との間に印加する電圧は、最大電流値を与える電圧である ことが好ましい。
[0020] 本発明に係る蛋白質の測定方法において、作用電極が導電性ダイヤモンド電極で ある場合は、更に導電性ダイヤモンド電極を陰極還元して再生する工程を有してもよ い。
[0021] ダイヤモンドはあらゆる酸、塩基などに侵されな 、ため、導電性ダイヤモンド電極に 対してもピラニア洗浄などの強力な洗浄を行うことが可能であるが、酸や塩基を使用 することは危険性、環境負荷等の観点力 適当ではなぐ蛋白質の酸ィ匕により表面が 被毒した導電性ダイヤモンド電極を再生する方法としては安全で環境への負荷も少 な 、陰極還元を用いることが好ま 、。
[0022] 陰極還元により導電性ダイヤモンド電極を再生させるには、例えば、電解質を溶解 させた水溶液を使用し、導電性ダイヤモンド電極へマイナスの高電位を印加して電 極表面力も水の電気分解による水素を発生させることによる。
[0023] 水素を発生させると、金属電極では pHなどの条件によっては電極が溶解又は不活 性ィ匕してしまい、一方グラッシ一カーボン電極（以下 GC電極ともいう。）では水素発 生による発泡により電極の物理的破壊が起こる。し力しながら、導電性ダイヤモンド電 極では水素発生による物理的、化学的ダメージは生じない。
[0024] 水素発生により導電性ダイヤモンド電極力 付着蛋白質を除去するメカニズムとし ては、以下のようなことが挙げられる。 (1)水素発生により、溶液の pHとは別に電極表面を酸性環境にすることができ、酸 性環境下において蛋白質が分解される。
(2)水素発生の際、化学的に活性な水素ラジカルが発生し、この水素ラジカルにより 蛋白質が化学的に分解される。
(3)常温常圧において気体である水素が発生することにより気泡が発生し、この気泡 により蛋白質が物理的に剥離される。
以上の 3つのメカニズムにより陰極還元による導電性ダイヤモンド電極の再生が可能 になる。
[0025] なお、インシュリン等の分子量約 6000以下の低分子蛋白質を測定対象とした場合 は、蛋白質の吸着による導電性ダイヤモンド電極の感度低下は 3〜4回程度の測定 の後に生じるが、 CRP等の分子量 10000以上の高分子蛋白質を測定対象とした場 合は、 1回の測定で導電性ダイヤモンド電極の感度低下が生じる。これは、分子量が 大きいほど電極への吸着が著しいためと思われる。また、導電性ダイヤモンド電極を 再生するための陰極還元においても、インシュリン等の低分子蛋白質を測定対象とし た場合は IV程度の比較的低電圧で再生可能であるのに対して、 CRP等の高分子 蛋白質を測定対象とした場合では 3V程度の高電圧が必要となる。
[0026] 本発明に係る蛋白質の測定方法は、作用電極及び対電極を用いる二電極法によ るものでもよいが、高感度及び高精度の測定を行う場合は、更に参照電極を用いる 三電極法によるのが好ましぐ測定対象の蛋白質を含有する試料溶液に、更に参照 電極を接触させることにより、作用電極と対電極との間に印加する電圧の絶対値を制 御してちょい。
[0027] 図 1は、ゥシ血清アルブミン (以下 BSAともいう。 )を測定対象とし、作用電極として ボロンドープダイヤモンド電極を用いて、以下の条件のもとでサイクリックボルタンメト リー測定を行った結果のうち、 PH7におけるものを示したボルタモグラムである。 試料溶液； 300mgZdl BSA (0. 1Mリン酸緩衝液（PBS) pH2、 7、 10) 参照極; AgZAgCl
対極；白金
ポテンシォスタツト； HSV— 100 (北斗電工製） ここで点線はキャリア溶液である PBSによるバックグラウンドを示している。
[0028] 図 1に示すとおり、 0. 75V付近にはっきりとした酸ィ匕ピークが確認できた力 サイク ルを重ねるごとに酸ィ匕電流が小さくなつた。これはボロンドープダイヤモンド電極表面 に BSAが吸着したことに起因すると考えられた。
[0029] このため、 BSAを測定した後のダイヤモンド電極に対して陰極還元を施し、電極の 復活を試みた。 1M PBSを溶液として使用し— 3V、 lOminの条件にて陰極還元を 行ったところ、図 2に示すように、電極の活性が回復することが明ら力となった。
[0030] 更に、 IAPを対象として電気化学測定を行ったところ、図 3に示すように、 pH7にお
V、て BS Aと同様の酸ィ匕ピークが得られた。
[0031] その他にヘモグロビン、ペプシン、 CRPの 3種類のタンパク質について、それぞれ B
SAと同様に pH2、 7、 10の条件でサイクリックボルタンメトリー測定を行ったところ、図
4、 5、 6に示すように、明瞭な酸化ピークが確認された。
[0032] 本発明に係る蛋白質の測定方法は、例えば以下のような構成を有する測定装置に よって実施することができる。即ち、試料溶液中の測定対象の蛋白質を検出するため の測定装置であって、作用電極及び対電極を内蔵するセルと、前記作用電極及び 前記対電極に電圧を印加する手段と、当該印加電圧下における電流値を測定する 手段と、得られた電流値力 前記蛋白質を検出する情報処理装置とを備えている蛋 白質の測定装置である。
[0033] 当該測定装置にお!/、て、作用電極は、導電性ダイヤモンド電極であることが好まし ぐなかでも、ボロンドープダイヤモンド電極がより好ましい。
[0034] また、本測定装置は、セルが更に参照電極を内蔵しており、更に作用電極と対電 極との間に印加する電圧の絶対値を制御する手段を備えているものであってもよい。
[0035] ところで、一度測定を行うとダイヤモンド電極に蛋白質が吸着して電極としての能力 を失うが、その場合には陰極還元を行い吸着した蛋白質を除去することにより電極を 再生することが可能である。本発明に係る測定装置は、このように導電性ダイヤモン ド電極が陰極還元により再生されたものであっても良い。
[0036] また、一定流速のキャリア溶液を作用電極に接触させておき、そこに測定対象であ る蛋白質を注入して、前記作用電極及び対電極と接触させ、前記作用電極と前記対 電極との間に電圧を印加して、当該電圧下における電流値を測定し、前記蛋白質を 電気化学的に分析するようにしてもよい。このようにすれば、蛋白質の電極表面への 吸着が生じにくぐ連続した測定が可能となり、さらにその測定可能濃度域は人体の 血中濃度に近 、ので好ま 、測定方法となる。
[0037] 以下、本発明に用いる電気化学測定装置の一実施形態を図面を参照して説明す る。
[0038] 図 7は本発明に係る蛋白質の測定方法を実施するための装置の一実施形態を示 すものであり、電気化学測定用のフローセルを用いた液体注入型の電気化学測定 装置 (フローインジヱクシヨン分析装置）の概略を示して 、る。
[0039] フローインジェクション分析は、定量ポンプ等を用いて制御された連続流れをつくり だし、この流れの中で種々の反応、分離や試料注入等を行い、末端に設置したフロ 一セルを備えた検出器により溶液中の成分を分析する方法である。
[0040] 図 7に示す電気化学測定装置は、流路の上流側から、対電極 4、作用電極 5及び 参照電極 6が内蔵されたフローセル 3、ポンプ 2が配置されており、対電極 4、作用電 極 5及び参照電極 6は、ポテンシヨガルバノスタツト 7に接続され、更にポテンショガル バノスタツト 7には情報処理装置 8が接続されている。
[0041] 図 7に示す電気化学測定装置を用いて測定対象である蛋白質の濃度を測定する 場合、まず、 PBSなどのキャリア溶液が流れている中に、測定対象の蛋白質を含む 試料溶液 1を、ポンプ 2によってフローセル 3に送る。フローセル 3内において、内蔵さ れた対電極 4、作用電極 5及び参照電極 6が試料溶液 1に接触した状態で、作用電 極 5と対電極 4との間に電圧が印加されることにより電気化学的反応が起こる。当該 電気化学的反応によって生じた電流値 (電気信号）はポテンショガルバノスタツト 7に 伝達し各電極における信号の制御 '検出が行われる。ポテンシヨガルバノスタツト 7で 検出された信号は情報処理装置 8により解析され、各種蛋白質の検出、濃度の測定 が行われる。測定が終了した試料溶液 1は電気化学測定装置外に排出される。
[0042] 前記試料溶液 1としては、ァノレブミン、 IAP、ペプシン、ヘモグロビン、 CRP等の蛋 白質を含有するものを挙げることができる。このうち、糖尿病性腎症のマーカーとなる アルブミンを含有するものとしては、例えば全血、血清、血漿、尿等が挙げられる。前 記電気化学測定装置を用いてアルブミンを測定する方法は、従来の抗原抗体反応 を利用した免疫測定方法のように、抗アルブミン抗体を含む測定試薬を必ずしも使 用せずに測定を行うことができる。このため、測定試薬の品質のばらつきによる測定 精度や測定感度の低下を懸念することなく、安定して高!ヽ精度及び感度で測定を行 うことができる。また、抗アルブミン抗体を含む測定試薬を使用せずに測定することも 可能となり、測定装置の構造及び操作も簡便なものとすることができる。
[0043] 更に、前記電気化学測定装置はフグ毒であるテトロドトキシン等の天然毒を含有す る試料溶液 1を測定対象とすることもできる。テトロドトキシンはナトリウムイオンの経路 であるナトリウムチャンネルに結合してその神経情報の伝達を妨げることにより、神経 や筋肉の麻痺を引き起こすものである。本発明に係る測定方法によれば、簡便にテト ロドトキシンの有無が測定できるので、フグを食す際の安全性を高めることができる。 テトロドトキシンを含有する試料溶液 1としては、例えばフグの組織をペースト状にし 緩衝液に懸濁させたもの等を挙げることができる。
[0044] 前記ポンプ 2としては一定速度で試料溶液 1をフローセル 3に送ることができるもの であれば特に限定されず、例えば液体クロマトグラフィー用ポンプ等を用いることがで きる。
[0045] 前記フローセル 3は、図 8に示すように、作用電極 5、対電極 4、及び、参照電極 6が 、試料溶液 1が流れる流路 31内に露出され、試料溶液 1と接触できるよう構成されて いる。作用電極 5が導電性ダイヤモンド電極である場合、ダイヤモンド薄膜が、流路 3 1内に露出され、試料溶液 1と接触する。試料溶液 1は、流路 31の流入口 32から入り 、図中の矢印のように流れ、流出口 33〖こ至る。そして、作用電極 5と対電極 4との間 に電圧が印加されることにより、試料溶液 1中で電気化学的反応が起こる。作用電極 5の形態は、マイクロ電極であってもよぐ回転電極であってもよい。
[0046] 前記作用電極 5としては、導電性ダイヤモンド電極やカーボン電極を用いることが できる。
[0047] ダイヤモンドは本来優れた絶縁体である。し力しながら、 13族や 15族の不純物を 添加することによって、半導体〜金属様の導電性を示すようになる。本発明では、半 導体〜金属様の導電性を示すダイヤモンドを電極として使用する。 [0048] このようなダイヤモンドに導電性を付与するために混入する物質としては、上記の通 り 13族及び 15族の元素が挙げられ、より好ましくはホウ素、窒素、リンが挙げられ、更 に好ましくはホウ素である。高濃度でホウ素をドープしたボロンドープダイヤモンド電 極は、電位窓が広く（酸化電位及び還元電位が広い）、他の電極材料と比較してバッ クグラウンド電流が低いといった有利な性質を有している。また、ボロンドープダイヤ モンド電極は、化学的耐性、耐久性、電気伝導度、耐腐食性等にも優れている。
[0049] これらのダイヤモンドに導電性を付与するために混入する物質の添加量は、ダイヤ モンドに導電性を付与できる範囲で適宜決定されてよいが、例えば 1 X 10一2〜 10_6 Ω cm程度の導電性を与える量であることが好ましぐ当該添加量は一般的には製造 工程において制御される。
[0050] 導電性ダイヤモンドそれ自体を基材の支持によらず電極とすることも可能であるが、 基材上に導電性ダイヤモンドの薄膜を形成し、この薄膜に導線を接続させ、電極とす ることが好ましい。基材としては、 Si (例えば、単結晶シリコン）、 Mo、 W、 Nb、 Ti、 Fe 、 Au、 Ni、 Co、 Al O、 SiC、 Si N、 ZrO、 MgO、黒鉛、単結晶ダイヤモンド、 cB
2 3 3 4 2
N、石英ガラス等が挙げられ、特に単結晶シリコン、 Mo、 W、 Nb、 Ti、 SiC、単結晶 ダイヤモンドが好適に用いられる。
[0051] 導電性ダイヤモンド薄膜の厚さは、特に限定されないが、 1〜： LOO /z m程度の厚さ が好ましぐより好ましくは 5〜50 μ m程度である。
[0052] 本発明にお 、ては、導電性ダイヤモンド電極は、マイクロ電極の形態をとつて！/、て もよい。ここで、マイクロ電極形態のダイヤモンド電極とは、 Pt等の細線の末端 ¾|¾利 に切断し、電解研磨により末端を更に鋭利にした後、その末端表面に導電性ダイヤ モンドの薄膜を形成した構成のものを 、う。
[0053] 導電性ダイヤモンド薄膜は、化学気相成長法により製造することができる。化学気 相成長法とは、気相中で気体原料を化学反応させて物質を合成する方法であり、 C VD (Chemical Vapor Deposition)法と一般に呼ばれる。この方法は、半導体製 造プロセスにおいて広く利用されており、本発明における導電性ダイヤモンド薄膜の 製造にも合目的な改変のもと利用可能である。
[0054] ダイヤモンドの化学気相合成は、メタン等の含炭素気体と水素を混合したものを原 料気体として、それを励起源により励起させ、基板上に供給して堆積させることにより 行われる。
[0055] 励起源としては、熱フィラメント、マイクロ波、高周波、直流グロ一放電、直流アーク 放電、燃焼炎等が挙げられる。また、これらを複数組み合わせて核生成密度を調整 し、大面積ィ匕ゃ均一化をは力ることも可能である。
[0056] 原料としては、炭素が含まれており、励起源により分解'励起されて、 C、 C等の活
2 性な炭素、及び、 CH、 CH、 CH、 C H等の炭化水素ラジカルを生じさせる種々の
2 3 2 2
化合物を用いることができ、好ましい具体例としては、気体として CH、 C H、 C H
4 2 2 2 4
、 CO、 CF、液体として CH OH、 C H OH、 (CH ) CO、固体として黒鉛、フラーレ
4 3 2 5 3 2
ン等が挙げられる。
[0057] 化学気相合成法にぉ ヽて、ダイヤモンドに導電性を付与する物質の添カ卩は、例え ば添加物質のディスクを系内に置き、炭素源原料と同様に励起させ、炭素気相に添 加物質を導入する方法、炭素源に予め添加物質を添加し、系内に炭素源と共に導 入し、励起源により励起し、炭素気相に添加物質を導入する方法等により行うことが できる。なかでも、後者の方法が好ましい。とりわけ、炭素源としてアセトン、メタノール 等の液体を用いる場合、これに酸ィ匕ボロン (B O )を溶解してボロン源とする方法力
2 3
ボロンの濃度の制御が容易で、かつ簡便であることから好ましい。化学気相合成法に おいて、炭素源にホウ素を添加する場合、 10-12, OOOppm程度が一般的である 1, 000〜10, OOOppm程度力好まし!/ヽ。
[0058] 化学気相合成法としては、プラズマ化学気相合成法が好適に用いられる。このブラ ズマ化学気相合成法は、化学反応を引き起こす活性ィ匕エネルギーが大きぐ反応が 速いとの利点を有する。更に、この方法によれば、熱力学的に高温でなければ存在 しない化学種を生成して、低い温度での反応が可能となる。プラズマ化学気相合成 法による導電性ダイヤモンド薄膜の製造は、例えば、 Yano et al. , J. Electroche m. Soc. , 145 (1998) 1870に記載の方法に従って行うこと力 Sできる。
[0059] 本発明で用いるボロンドープダイヤモンド電極は、例えば、次に説明するようなマイ クロ波プラズマアシスト CVD法を用いた製造方法により製造することができる。具体 的な製造方法としては、以下の通りである。まず、水素ガスが充満したチャンバ一内 に水素プラズマを生成し、そこにボロン種を溶解したアセトンとメタノールの混合ガス を導入し、炭素源を導入し、例えばシリコン基板等の導電性 (又は半導電性)基板上 に気相成長させる。基板としてはシリコン基板 {Si(lOO) }を用い、基板表面をテクス チヤ一処理 (例えば、 0. 5 mのダイヤモンド粉による研磨）した後、基板を成膜装置 のホルダーにセットする。成膜用ソースとしては、アセトンとメタノールの混合物（液体 で、混合比は体積比 9 : 1)を用い、この混合物に酸化ホウ素 (B O )をホウ素 Z炭素（
2 3
B/C)比で 104ppmとなるように溶解する。そして、この成膜用ソースにキャリアーガ スとして純 Hガスを通した後、チャンバ一内に導入し、予め別ラインで水素（例えば、
2
532mlZmin)を流して所定圧力（例えば、 115Torr= 115 X 133. 322Pa)となる ように調整する。そして、 2. 45GHzのマイクロ波電力を注入し、放電させた後、電力 力 kWとなるように調整する。そして、安定したところで、成膜用ソースにキャリアーガ スとして純 Hガス（例えば、 15mlZmin)を流して成膜を行う。
2
[0060] 上記のマイクロ波プラズマアシスト CVD法を用いた製造方法により、成膜速度 1〜4 μ mZ時で、約 30 mの厚さとなるまでダイヤモンド薄膜の成膜を行ったところ、基 板の加熱は行わなかった力 定常状態において約 850〜950°Cの温度となっている ことが観察された。また、得られたダイヤモンド薄膜のラマンスペクトルをとると、 1333 cm—1に単一ピークのみが観察された。また、電気伝導度は約 10_3 Ω «η程度であり 、0. 5Μ硫酸中においてサイクリックボルタモグラムを測定した結果、 1. 25〜+ 2 . 3V (対 SHE (標準水素電極)）と、広 、電位窓を有することが確認できた。
[0061] 前記作用電極 5として導電性ダイヤモンド電極を用いる場合、 8族、 9族又は 10族 のうちいずれかの族に属する元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有 するものを使用してもよい。前記元素としては、白金、パラジウム、ニッケル、ルテユウ ム、イリジウム等が好適に用いられる。
[0062] ダイヤモンドに前記元素を導入するには、イオン注入法を用いることができる。ィォ ン注入法により製造された金属 ダイヤモンド複合電極は、安定性が高く超音波洗 浄等によっても金属が剥離せず、また、金属の分散性にも優れている。
[0063] 前記作用電極 5としてカーボン電極を用いる場合は、例えばグラッシ一カーボン電 極が好適に用いられる。グラッシ一カーボン電極は、電気伝導度がよぐ化学薬品に 安定で、ガスを通さないという熱分解グラフアイトと同様な性質を有し、しかも安価で、 水素発生や酸素発生に対して過電圧が比較的大きい等の特徴を有する。
[0064] 前記対電極 4としては、例えば白金、炭素、ステンレス、金、ダイヤモンド、 SnO等
2 を用いることができる。
[0065] 前記作用電極 5と対電極 4との間に印加する電圧は、測定効率及び精度の観点か ら、最大電流値を与える電圧であることが好ましい。ここで、最大電流値を与える電圧 とは、例えばサイクリックボルタンメトリーにより、最大電流値を与える電圧である。また 、最大電流値を与える電圧は、回転電極法又はマイクロ電極法により求めることもで きる。回転電極法又はマイクロ電極法によれば、測定条件等による測定誤差の可能 性をより排除できる点で有利である。
[0066] 前記参照電極 6としては公知のものを利用することができ、標準水素電極、銀塩ィ匕 銀電極、水銀塩化水銀電極、水素パラジウム電極等を用いることができる。
[0067] 前記電気化学測定装置は、対電極 4、作用電極 5及び参照電極 6が備わった三電 極法による測定を行うものであるが、本発明に係る測定方法を行うための電気化学測 定装置としては、作用電極 5及び対電極 4のみを備えた二電極法によるものであって もよい。三電極法の方が、作用電極 5と対電極 4との間に印加する電圧の絶対値を制 御することができるので、精度及び感度の高い測定を行うことが可能である力 ニ電 極法によれば、用 、る電極が作用電極 5及び対電極 4の 2種類の電極ですむので、 フローセル 3の構造を単純化、小型化することができ、測定セルをチップィ匕し使い捨 てとすることも可能で、より簡便な測定を行いうる。
[0068] 蛋白質の測定に際しては、まず、測定対象の蛋白質を含有しないキャリア溶液のみ をフローセル 3に流し、いわゆるバックグラウンド電流をできるだけ小さくし、かつ安定 させる。ここで、ダイヤモンド電極はバックグラウンド電流が小さいことを特長とする。 次に、試料溶液 1を前記キャリア溶液に混合させてフローセル 3に流す。なお、前記 キャリア溶液がフローセル 3に流れ込む流路は図示して ヽな 、。
[0069] 次いで、前記作用電極 5と対電極 4との間に電圧を印加することにより、測定対象の 蛋白質が作用電極 5上で酸化又は還元され、酸化還元反応に伴う電流が発生する。 この電流（電気信号）はポテンショガルバノスタツト 7に伝達し、ポテンショガルバノスタ ット 7で検出された信号は情報処理装置 8により解析される。
この情報処理装置 8は、 CPU,内部メモリ、 HDD等の外部記憶装置、モデム等の通 信インタフェース、ディスプレイ、マウスやキーボードといった入力手段等を有する。 そして、前記内部メモリや外部記憶装置等の所定領域に設定したプログラムにしたが つて電気信号を解析し、蛋白質の検出や濃度の算出を行う。かかる情報処理装置 8 は、汎用のコンピュータであってもよぐ専用のものであってもよい。
[0070] 図 9は、作用電極 5としてボロンドープダイヤモンド電極、対電極 4として白金、参照 電極 6として銀/塩ィ匕銀電極を用い、一定流速の 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH7. 0)を 電極と接触させてぉ 、たところへ BSAを注入するフローインジェクション測定（以下 F IAとも ヽぅ。）で得られた BSAの濃度 (横軸）と電流値 (縦軸）との関係を示す検量線 である。当該 FIAでは、はじめに印加する電位を 0. 4〜1. OVまで 0. IV刻みで変化 させ SZB比を測定したところ、 0. 8Vにて SZB比が最大となったため、測定は全て 0 . 7Vにて行った。その結果濃度 5mgZdl〜3000mgZdlの範囲において直線な検 量線が得られた。 FIAによれば、作用電極にアルブミンが吸着しにくいため、検量線 に示すようにアルブミン濃度と電流との間に良い比例関係が得られる。また、測定可 能な濃度域が人体の血中濃度域に近い値であるため、好ましい測定方法の 1つであ る。
[0071] 図 10は作用電極 5としてボロンドープダイヤモンド電極、対電極 4として白金、参照 電極 6として SCE (飽和カロメル電極）を用い、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH7. 0)中での テトロドキシンの濃度を変えて直線掃引（20mVZs)により得られたサイクリックボルタ ンメトリーによるボルタモグラムを示す。測定対象がテトロドトキシンである場合の最大 電流値は 1. 37V付近にあった。また、図 11は、 1. 37Vの電圧を印加して、既知の 濃度のテトロドトキシン溶液を測定して得られた濃度 (横軸)と電流値 (縦軸)との関係 を示す検量線である。
[0072] 導電性ダイヤモンド電極を用いて低分子物質の検出を行うことは既に報告されてい たが、導電性ダイヤモンド電極を用いて蛋白質等の高分子物質を検出することが可 能であるか否かは従来全く知られていな力つた。上記の通り、導電性ダイヤモンド電 極により、アルブミン、 IAP、ペプシン、ヘモグロビン、 CRP等の蛋白質ゃテトロドトキ シン等の天然毒を測定することも可能であることは本発明者により初めて見出された 知見である。
[0073] 本発明に係る測定方法を実施するに際しては、試料溶液 1に含まれる夾雑物を除 去するための前処理操作が行われてもよい。前記前処理操作としては、例えば、カラ ム処理操作や遠心分離操作等を挙げることができる。試料溶液 1から共雑物を除去 するための前処理操作を行うことにより、測定精度や測定感度を更に向上することが 可能となる。
[0074] なお、本発明は前記実施形態に限られるものではなぐ例えば、セルがフロー型で あるもの以外にバッチ型の電気化学測定装置を使用してもよい。
[0075] また本発明に係る電気化学測定装置が、 HPLC等の分離手段を備えて 、て、目的 蛋白質の分離'精製を行なった後、引き続き分離'精製した目的蛋白質画分の分析 を行なうことが可能なように構成してあってもょ 、。
産業上の利用可能性
[0076] 本発明によって、簡便な操作及び装置で、高精度かつ高感度に、種々の蛋白質の 検出、濃度測定を高速で行うことが可能である。

Claims

請求の範囲
[I] 測定対象の蛋白質を含有する試料溶液に、作用電極及び対電極を接触させ、前 記作用電極と前記対電極との間に電圧を印加して、当該電圧下における電流値を 測定し、前記蛋白質を電気化学的に分析する蛋白質の測定方法。
[2] 蛋白質は、アルブミン、免疫抑制酸性蛋白質、ペプシン、ヘモグロビン、及び、 C反 応性蛋白質力 なる群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 1記載の蛋白質の測 定方法。
[3] 作用電極は、導電性ダイヤモンド電極又はカーボン電極である請求項 1記載の蛋 白質の測定方法。
[4] 導電性ダイヤモンド電極は、 13族又は 15族の元素の混入により導電性とされたダ ィャモンド薄膜を有するものである請求項 3記載の蛋白質の測定方法。
[5] 導電性ダイヤモンド電極は、ホウ素、窒素、及び、リンカ なる群力 選択される少 なくとも一種の元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものである 請求項 3記載の蛋白質の測定方法。
[6] 導電性ダイヤモンド電極は、ボロンドープダイヤモンド電極である請求項 3記載の蛋 白質の測定方法。
[7] 導電性ダイヤモンド電極は、 8族、 9族又は 10族のいずれかの族に属する元素の 混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものである請求項 3記載の蛋白 質の測定方法。
[8] 導電性ダイヤモンド電極は、白金、ノ《ラジウム、ニッケル、ルテニウム、及び、イリジ ゥム力 なる群力 選択される少なくとも一種の元素の混入により導電性とされたダイ ャモンド薄膜を有するものである請求項 3記載の蛋白質の測定方法。
[9] 予め作成された測定対象の蛋白質の濃度と電流値との検量線と、得られた電流値 とを対比することにより、得られた電流値から試料溶液中の測定対象の蛋白質の濃 度を算出する請求項 1記載の蛋白質の測定方法。
[10] 作用電極と対電極との間に印加する電圧は、最大電流値を与える電圧である請求 項 1記載の蛋白質の測定方法。
[II] 測定対象の蛋白質を含有する試料溶液に、更に参照電極を接触させて、作用電 極と対電極との間に印加する電圧の絶対値を制御する請求項 1記載の蛋白質の測 定方法。
[12] 導電性ダイヤモンド電極を陰極還元して再生する工程を有する請求項 3記載の蛋 白質の測定方法。
[13] 試料溶液中の測定対象の蛋白質を検出するための測定装置であって、
作用電極及び対電極を内蔵するセルと、
前記作用電極及び前記対電極に電圧を印加する手段と、
当該印加電圧下における電流値を測定する手段と、
得られた電流値から前記蛋白質を検出する情報処理装置と、を備えている蛋白質 の測定装置。
[14] 作用電極は、導電性ダイヤモンド電極である請求項 13記載の蛋白質の測定装置。
[15] 導電性ダイヤモンド電極は、ボロンドープダイヤモンド電極である請求項 14記載の 蛋白質の測定装置。
[16] セルは更に参照電極を内蔵しており、
更に作用電極と対電極との間に印加する電圧の絶対値を制御する手段を備えてい る請求項 13記載の蛋白質の測定装置。
[17] 導電性ダイヤモンド電極を、陰極還元により再生する手段を備えたものである請求 項 14記載の蛋白質の測定装置。
[18] 分離手段を備えている請求項 13記載の蛋白質の測定装置。
[19] 一定流速のキャリア溶液を作用電極に接触させておき、そこに測定対象である蛋白 質を注入して、前記作用電極及び対電極と接触させ、前記作用電極と前記対電極と の間に電圧を印加して、当該電圧下における電流値を測定し、前記蛋白質を電気化 学的に分析する蛋白質の測定方法。
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