WO2007121721A2 - Therapeutische zielmoleküle zur entwicklung neuartiger medikamente für degenerative erkrankungen - Google Patents

Therapeutische zielmoleküle zur entwicklung neuartiger medikamente für degenerative erkrankungen Download PDF

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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders

Definitions

  • the present invention generally relates to the field of therapy, prophylaxis and diagnosis of degenerative diseases, in particular neurodegenerative diseases.
  • the present invention relates to genes and proteins which are regulated in cells in connection with chronic oxidative stress and which are used for the therapy, prophylaxis and diagnosis of degenerative diseases, in particular neurodegenerative Erlarankungen.
  • the present invention further relates to the use of genes and proteins regulated in cells in the context of chronic oxidative stress for the screening of candidate substances to identify prophylactic and / or therapeutic agents which enhance the biological activity of genes and / or proteins modulate in the context of chronic oxidative stress in cells.
  • the present invention relates to methods for the diagnosis of degenerative diseases, in particular neurodegenerative diseases, and to methods of identifying prophylactic and / or therapeutic agents which activate the biological activity of genes and / or proteins which are activated in cells in connection with chronic oxidative stress. modulate. Furthermore, the present invention relates to kits for carrying out the diagnostic methods.
  • Aerobic organisms use TüTdre ⁇ ⁇ ü ⁇ fechterr ⁇ ältung the entire karTabolen undi ⁇ abolerr metabolism including oxidation reactions to gain energy from the diet and metabolic metabolites available.
  • Reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) such as superoxide anions, hydroxyl radicals, hydrogen peroxide, peroxynitrites, and nitric oxide are continuously produced in the cells.
  • ROS reactive oxygen species
  • RNS reactive nitrogen species
  • the occurrence or emergence of these reactive molecules must be regulated very precisely in order to prevent uncontrolled oxidation or nitration of biomolecules such as proteins, DNA and lipids in the cells.
  • Nerve cells are particularly susceptible to oxidative stress because of their high energy consumption and their high metabolic activity.
  • the death of nerve cells can have devastating and irreversible effects on the affected person. For example, nerve cell death may occur as a result of stroke, myocardial infarction, traumatic brain and spinal cord injury, infection, inflammatory response, excitotoxicity, ischemia, hypoxia, or other brain or spinal cord deficiency.
  • Neurodegenerative diseases such as Morbus (M) Alzheimer's disease, Lewy Body disorders such as Parkinson's disease, diffuse Lewy Body disorders, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Prion-Erlcrankept (PrD) 5 Creutzfeldt- Jakob's disease, Down syndrome, frontotemporal dementia (FTD), corticobasal degeneration, multi-infarct dementia, progressive supranuclear palsy, multisystem atrophy, and Korsakoff's syndrome.
  • Dying of nerve cells can also be the result of drug effects. For example, prolonged administration of neuroleptics to treat psychotic conditions in patients may result in chronic tardive dyskinesia caused by the increase in free radical concentration in the affected neurons with subsequent degeneration of the neurons.
  • Alzheimer's are characterized by intracellular, predominantly hyperphosphorylated tau protein, neurofibrillary tangles (NFT) and extracellular deposits of amyloid ⁇ (A ⁇ ), j40-42 in_enile_ plaques (SP).
  • a ⁇ amyloid ⁇
  • SP j40-42 in_enile_ plaques
  • the consequence j, sL is a selective loss of cholinergic neurons.
  • plaque-free forms of Alzheimer's disease The inherited forms are predominantly caused by mutations in genes encoding A ⁇ precursor protein (APP) and presenilin (PS1 and PS2, respectively).
  • APP A ⁇ precursor protein
  • PS1 and PS2 presenilin
  • Parkinson's disease is caused by dopamine deficiency due to the death of neurons in the substantia nigra of the brain.
  • Lewy bodies consist predominantly of aggregated ⁇ -synuclein but also contain other proteins, such as ubiquitin C-terminal hydrolase.
  • a familial accumulation of M. Parkinson has been associated with more than 10 chromosomal regions, with mutations in the genes, the ⁇ -synuclein (PARK1), Parkin (PARK2), and DJ-I (PARK7) encode, are clearly l ⁇ ankheitsverursachend.
  • ALS is caused by a progressive loss of motor neurons. 20% of familial forms of the disease are associated with more than 90 mutations in Cu-Zn superoxide dismutase (SOD).
  • Huntington is caused by the fatal extension of a CAG trinucleotide repeat sequence in the gene encoding Huntington's protein. This extension results in the formation of a glutamine-rich abnormal Huntington protein that accumulates intracellularly and aggregates, and the like. in striatal neurons forms.
  • Oxidative stress is therefore critical in the pathogenesis of neurodegenerative diseases
  • the active ingredients used fight only symptoms. However, they can not stop the progression of revenue. In part, significant side effects such as dyskinesias, confusion, etc. are triggered.
  • the medication aims to replace the missing neurotransmitter or to maximize the function of surviving neurons, the number of which is already drastically high at the onset of symptoms, for example in Alzheimer's disease. by more than 50%, is reduced.
  • Inhibitors CEP 13457 and cell replacement therapies (including Spheramine ® ).
  • NMDA receptor antagonist riluzole In ALS, the NMDA receptor antagonist riluzole is used for symptomatic therapy. There is a very small increase in the survival time of 2 months, with the disease leading to death within 2-5 years after diagnosis.
  • the object of the present invention is to provide genes or their products, which are regulated in the context of chronic oxidative stress in the cells. Furthermore, the object of the present invention is to identify by means of these genes or their products active ingredients for the therapy and / or prophylaxis of degenerative, in particular neurodegenerative diseases.
  • Oxygen species can be superoxide anion, hydroxyl radical and H 2 O 2 .
  • Nitrogen species can be peroxynitrite and nitric oxide. These species arise, for example, in the reactions of the respiratory chain in the mitochondria of each cell. The risk of cell damage increases if, for example, a high level of metabolic activity prevails in the brain.
  • the oxygen species are usually eliminated by antioxidant enzymes such as superoxide dismutase, catalase or glutathione peroxidase. However, if this elimination is not completely successful, hydroxyl radicals form superoxide anions and hydrogen peroxide, which can cause severe cell damage and cell death and, finally, neurological degenerative diseases, for example.
  • chronic oxidative stress or “chronic sublethal oxidative stress” refers to the increase in at least one reactive oxygen or nitrogen compound in cells caused by the action of oxidative stressor (s) compared to a control condition, the increase lasting at least 4 hours and lasting up to 35 days or more.
  • oxidative stressor refers to a molecule that produces oxidative stress in cells.
  • derivatives or variants of proteins as used herein refer to amino acid sequences which include one or more deletions, substitutions, additions, insertions and / or natural or unnatural protein modifications as known to those skilled in the art (eg glycosylation or GPI anchor) to a control protein.
  • homologous sequence or “homology” refer to a nucleic acid or protein sequence with significant similarity to a control sequence or fragments thereof, wherein the nucleic acids or proteins having such homologous sequences have an activity or activity comparable to the activity Have nucleic acids or proteins with the comparison sequence.
  • homologue As a homologue
  • Sequences apply to nucleic acid sequences that contain reference sequences or fragments of these
  • Hybridize comparative sequences under stringent or less stringent conditions for stringent and less stringent conditions (for stringent and less stringent conditions, see Sambrook et al., Molecular Cloning, Coed Spring Harbor Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6).
  • An example of stringent hybridization conditions is: hybridization in 4 x SSC at 65 ° C (alternatively in 50% formamide and 4X SSC at 42 ° C), followed by several washes in 0.1 x SSC at 65 ° C for a total of one hour .
  • An example of less stringent hybridization conditions is hybridization in 4 x SSC at 37 ° C, followed by several washing steps in 1 x SSC at room temperature.
  • nucleic acid or protein sequences or fragments thereof should continue to apply nucleic acid or protein sequences or fragments thereof, with the aid of the similarity algorithm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al, Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990) a significant similarity with those as comparison sequences
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al, Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990) a significant similarity with those as comparison sequences
  • the nucleic acid and amino acid sequences used have been found to be significantly similar, as here Used, for example, sequences that have a significance level (Probability) of P ⁇ 10 "5 , using standard parameters in the blast service of the NCBI, when compared to the reference sequences or fragments thereof.
  • the term “modulator” refers to an agent that is capable of altering, in particular increasing or decreasing, the rate of expression of a gene and / or the biological activity of a protein biological activity can be determined directly on the nucleic acid level (eg generated mRNA) and on the protein level (eg.
  • neurodegenerative disease refers to degenerative and neurological diseases such as stroke and multiple sclerosis, as well as neurodegenerative diseases with dying neurons such as dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, ALS or M Huntington's disease also those diseases in which neurodegenerative processes play a role, eg cell degeneration caused by drug action such as tardive dyskinesia, or psychiatric diseases such as schizophrenia or depression.
  • therapeutic target molecule or “drug target”, as used herein, denote genes or proteins that by targeted influence on their expression rate or Cure, delay and / or prophylaxis of diseases used:
  • the present invention relates to genes or proteins which are regulated during chronic sub-lethal oxidative stress conditions and belong to the cytoprotective arsenal of cells.
  • the present invention aims to identify these genes or proteins as well as derivatives derived therefrom, variants, homologs and fragments as well as antibodies directed against them for methods for the therapy, prophylaxis and diagnosis of degenerative diseases, in particular neurodegenerative diseases, as well as for methods for the identification of prophylactic and / or therapeutic agents that modulate the biological activity of these genes and / or proteins.
  • the present invention provides diagnostic kits and the genes and proteins that are regulated in cells in the context of chronic oxidative stress.
  • the kits, genes and proteins are used to treat degenerative diseases and, in particular, neurodegenerative diseases To prevent, treat or diagnose at an early stage by appropriate measures or to reduce the risk of such a disease by this diagnosis.
  • the present invention provides nucleic acids that represent genes that are involved in eukaryotic cells associated with chronic oxidative
  • the present invention encodes the genes encoded by these genes
  • the present invention relates to homologues, derivatives, variants and fragments of the nucleic acids and of the
  • the genes regulated in eukaryotic, preferably human, cells associated with chronic oxidative stress code for MAC30 (meningioma-associated proten), BRB (synonym: 13, ⁇ RGR2), G1P3, LOC222171, CUE domain containing 1 (CUEDCl), Niemann-Pick disease type C2 (NPC2), stearoyl-CoA desaturase (SCD; delta-9-desaturase) and isopentenyl-diphosphate delta isomerase 1 protein (IDI1 isopentenyl diphosphate dimethylallyl diphosphate isomerase 1).
  • the present invention relates to the transcript variants of the respective genes.
  • the nucleic acid sequences for MAC30 preferably relate to the cDNA sequences NCBI Genbank / EMBL _ accession numbers NM 014573, _Bj_X) _4565_5, BC091504, CR613993, CR590967, CR612870, L19183, BC017362 (see Example 1).
  • the nucleic acid sequences for BRI3 preferably relate to the cDNA sequences corresponding to the NCBI Genbank / EMBL accession numbers BCOI 8737, BC071992, AF041430, AB055977, NM_015379, BC062370, AF106966 (see Example 2).
  • the nucleic acid sequences for G1P3 preferably relate to the cDNA sequences corresponding to NCBI Genbank / EMBL accession numbers NM_022872, NM_022873, NM_002038, X02492, AK024814, BN000257, BCO1601, BC015603 and BT006850 (see Example 3).
  • the nucleic acid sequences for LOC222171 preferably relate to the cDNA sequences according to NCBI Genbank / EMBL Accession Numbers BC029131, NM_175887, CR619478, CR608739, CR610203, BC018144, CR604389 (see Example 4).
  • the nucleic acid sequences for CUEDCl preferably relate to the cDNA sequences according to NCBI GenBanlc / EMBL accession numbers NM_017949, AK000746, BC056882, AK000977 (see Example 5).
  • the nucleic acid sequences for Niemann-Pick disease type C2 preferably relate to the cDNA sequences corresponding to NCBI Genbank / EMBL accession numbers NM_006432, BC002532, CR609490, CR608935, CR605546, CR622486, AK222474, CR624497, CR601885, X67698, CR595914 (see example 6).
  • the stearoyl-CoA desaturase (SCD; delta-9-desaturase) nucleic acid sequences preferably relate to the cDNA sequences corresponding to NCBI Geribank / EMBL accession numbers S70284, Y13647, NM_005063, BC005807, AK222862, AB208982, BC062303, AF097514, AB032261 (see example 7).
  • nucleic acid sequences for IDIII areopentenyl diphosphate dimethylallyl diphosphate isomerase 1 preferably relate to the cDNA sequences corresponding to the NCBI
  • the proteins which are regulated in the eukaryotic, preferably human cells, in association with chronic oxidative stress are the expression products of the genes listed above and their transcript variants.
  • amino acid sequences of the protein MAC30 preferably relate to accession numbers NP_055388, AAH91504, AAH45655, AAA16188.
  • the amino acid sequences of the protein Brain protein i3 preferably relate to the accession numbers AAH18737, AAH71992, AAD05167, BAB32785, NP_056194, AAH62370, AAFl 8565, 095415.
  • the protein brain protein i3 must not be confused with the protein with the accession number Q9NQX7, which bears the same designation BRI3, but has no similarity to the protein of this invention.
  • amino acid sequences of the protein interferon involve 6-16 protein preferably the accession numbers NP_075010, NP_075011, NP_002029, AAH15603, CAE12275, AAHI 1601, AAP35496, CAA26322.
  • amino acid sequences of the protein LOC222171 preferably relate to accession numbers AAH29131, NP_787083, EAL24204.
  • the amino acid sequences of the CUE domain-containing 1 protein preferably relate to accession numbers aNP_060419, BAA91357, AAH56882, BAA91452, Q9NWM3.
  • amino acid sequences of the NPC2 protein preferably relate to accession numbers NP_006423, AAH02532, BAD96194, CAA47928, P61916.
  • amino acid sequences of the human SCD protein preferably relate to accession numbers B AA93510, BAD92219, AAH62303, AAD29870, NP_005054, AAH05807, 000767, BAD96582, AAB30631, CAA73998.
  • the amino acid sequences of the human isopentenyl-diphosphate delta isomerase 1 protein preferably relate to accession numbers Q13907, NP_004499, AAH19227, AAK49435, AAK49434, AAK29357, AAH06999.
  • the homologs have a homology of at least 80%, preferably a homology of about 85%, 90%, 95% or 99% with nucleic acids having the sequence according to SEQ ID NO: 1-63 on.
  • the homologs When homologs of the proteins according to the invention are concerned, the homologs have an identity of at least 70%, preferably an identity of about 75%, 85%, 90%, 95% or 99% to proteins having the sequence according to SEQ ID NO: 64 to 113 on.
  • the proteins according to the invention may have modifications. Exemplary modifications include chemically modified amino acids such as naturally occurring (unnatural) amino acids, deletions, mutations and additions in the amino acid sequence, fusion of proteins with heterologous polypeptides (fusion proteins), and chemical and biological modifications of amino acids by naturally occurring and non-occurring ones Structures like Glycosylations, GPI anchors and / or lipidations.
  • the nucleic acid molecules according to the present invention may be naturally or unnaturally occurring genomic DNA, RNA, cDNA, microRNA, siRNA and homologs, derivatives, fragments and variants, in particular alternative splice variants thereof, or modified, in particular transcriptionally or chemically modified, nucleic acids or peptides Nucleic Acids (PNAs) and the like.
  • the present invention relates to oligonucleotides which as a probe or primer hybridize selectively to the nucleic acids of the invention and can be used for the detection and / or amplification of these nucleic acid molecules in biological sample material.
  • the oligonucleotides may be DNA, PvNA or PNAs.
  • the oligonucleotides consist of at least 6, preferably 6-50, 10-45,
  • oligonucleotides may be modified, for. B. coupled to an enzyme which reacts with a chromophore, fluorescent or luminescent substrate, or linked to
  • the modification of the oligonucleotides may include one or more modifications of the bond between the individual ones
  • Nucleotides for example, phosphorothioates or methylphosphonates.
  • the present invention relates to the use of nucleic acids which are regulated in cells in connection with chronic oxidative stress, or the use of the proteins encoded by these nucleic acids, in medical research, for example in the research of neurodegenerative diseases.
  • the present invention relates to the use of nucleic acids which are regulated in cells in connection with chronic oxidative stress, or the proteins encoded by these nucleic acids, as drug targets for the identification of active substances which enhance the biological activity of genes and / or or modulate proteins that are regulated in cells in association with chronic oxidative stress.
  • the present invention relates to the use of nucleic acids having a sequence according to SEQ ID NO: 1 to 63, as well as homologs, derivatives, variants and fragments thereof, and proteins having a sequence according to SEQ ID NOS: 64 to 113, and homologs, derivatives, variants and fragments thereof.
  • the nucleic acids and proteins to be used may also have modifications as defined herein.
  • the use according to the invention makes it possible to identify therapeutic and / or prophylactic active substances which are active against and / or (chronic) disease-like conditions associated with oxidative stress, in particular cancer, cardiovascular diseases, arteriosclerosis, diabetes mellitus, inflammatory diseases in the immune system, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, premature aging, degenerative and neurological diseases such as stroke and multiple sclerosis, and neurodegenerative diseases with dying nerve cells such as dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, ALS or Huntington's disease Prevent diseases and / or (chronic) crisis-like conditions.
  • cancer cardiovascular diseases, arteriosclerosis, diabetes mellitus, inflammatory diseases in the immune system, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, premature aging, degenerative and neurological diseases such as stroke and multiple sclerosis
  • neurodegenerative diseases with dying nerve cells such as dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, ALS or Huntington's disease Prevent diseases and / or (chronic) crisis-
  • the present invention relates to the use of nucleic acids or proteins regulated in cells in the context of chronic oxidative stress for the identification, monitoring, nosological classification (categorization of disease stages), treatment, diagnosis and / or prognostic evaluation of diseases and disease-like conditions caused by oxidative stress of cells.
  • the present invention relates to the use of NuJdeins Juerrei ⁇ J ⁇ ine_.Se4uenz ⁇ e ⁇ iäJß_d.er SE_QJ33_N ⁇ Ll_bis_63 jiufwejsjn, the Hpmologe ⁇
  • the present invention relates to a diagnostic method for detecting and / or analyzing nucleic acids that are regulated in cells in the context of chronic oxidative stress.
  • the method comprises the following steps: a) isolation of nucleic acids from a sample, b) preparation of cDNA or optionally previous synthesis of cRNA for linear amplification, c) addition of oligonucleotides which are linked to a gene associated with are regulated, and subsequent amplification of the cDNA from step b), d) analysis of the amplification products from step c).
  • the amplified products of step c) can be hybridized to chemically modified oligonucleotides or to complementary nucleic acid sequences on a biochip.
  • the present invention relates to a diagnostic method for detecting and / or analyzing nucleic acids which are regulated in cells in connection with chronic oxidative stress, comprising the following steps:
  • RNA isolation of nucleic acids from a sample where appropriate RNA is labeled directly
  • oligonucleotides directed against a gene which is regulated in connection with chronic oxidative stress and subsequent hybridization with the isolated nucleic acids from step a)
  • c) analysis of the hybridization signals
  • the isolated sample may be a biological sample such as tissue samples such as the brain, or body fluids such as blood, saliva, serum, or cerebrospinal fluid Be RNA.
  • the nucleic acids to be detected may be DNA or RNA that is regulated in cells in association with chronic oxidative stress, with DNA being preferred.
  • the nucleic acid to be detected may particularly preferably be one or more nucleic acids which have a sequence according to SEQ ID NO: 1 to 63, as well as homologs, derivatives, variants and fragments thereof. If the nucleic acid is RNA, reverse transcription of the RNA into cDNA is performed prior to nucleic acid amplification. If the nucleic acid is RNA, reverse transcription and nucleic acid amplification are preferably carried out by RT-PCR.
  • RNA or rRNA is preferably isolated from the sample and the RNA is reverse transcribed into cDNA.
  • an in vitro transcription with a DNA-dependent RNA polymerase is carried out after a first cDNA synthesis, which is followed by another cDNA synthesis with the resulting cRNA.
  • the cDNA is amplified using the methods of the invention to perform a quantitative PCR as known in the art.
  • the expression levels of the nucleic acids which are regulated in cells in connection with chronic oxidative stress, can be detected via oligonucleotides hybridizing to them.
  • the nucleic acid whose expression is to be quantified one or more nucleic acid ⁇ ) having a sequence according to SEQ ID NO: 1 to 63, and homologues, derivatives, variants and fragments thereof.
  • the determination of the expression rate of the nucleic acids allows e.g. the diagnosis of whether oxidative stress was present in the cells from or with which the tested sample was obtained, which in turn provides evidence of identification, monitoring, nosological classification, diagnosis and / or prognostic evaluation of diseases and disease-like conditions caused by oxidative stress Stress caused by cells allows.
  • the methods according to the invention enable the diagnosis of diseases and / or
  • a tehen especially cancer, cardiovascular disease, _ArteripskJbrqse, _Diabetes_j3iellitus i inflammatory diseases of the immune system, rheumatoid arthritis, inflammatory
  • Bowel disease premature aging, degenerative and neurological diseases such as stroke and multiple sclerosis, and neurodegenerative diseases with dying nerve cells such as dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, ALS or Huntington's disease.
  • the methods of the present invention identify, assess, and / or monitor drug side effects that occur as a result of oxidative stress caused by the corresponding drugs.
  • a further aspect of the present invention is a kit for carrying out the analysis and detection methods according to the invention, wherein the kit comprises at least one primer pair for carrying out the nucleic acid amplification according to the method according to the invention.
  • the primers of the corresponding primer pairs each comprise DNA sequences which hybridize to nucleic acids which are associated with chronic oxidative stress in Cells are regulated.
  • the primers each comprise DNA sequences which hybridize to one or more nucleic acids having a sequence according to SEQ ID NO: 1 to 63, as well as homologs, derivatives, variants and fragments thereof.
  • kits according to the invention according to the procedure to be performed for Nukleinklareamplif ⁇ kation suitable reagents such as buffers, nucleotides and enzymes, eg. B. DNA polymerases, and at least one suitable reference nucleic acid (s) include.
  • suitable reagents such as buffers, nucleotides and enzymes, eg. B. DNA polymerases, and at least one suitable reference nucleic acid (s) include.
  • the present invention relates to the use of proteins regulated in cells in the context of chronic oxidative stress for the identification, monitoring, nosological classification, treatment, diagnosis and / or prognostic evaluation of diseases and disease-like conditions caused by oxidative Stress caused by cells.
  • the present invention relates to the use of proteins having a sequence according to SEQ ID NO: 64 to 113, as well as homologs, derivatives, variants and fragments thereof.
  • the present invention relates to an analysis and / or diagnostic method for determining the levels of proteins that are regulated in cells in the context of chronic oxidative stress.
  • the method comprises the following steps:
  • Protein which is regulated in cells in the context of chronic oxidative stress the reference sample being derived from a non-degenerative disease subject
  • an increased amount of the at least one protein in the sample tested in step a), as compared to the amount of the corresponding protein in the reference sample, indicates the presence of a degenerative disease or the risk of developing a degenerative disease.
  • the amount of bias is at least one protein selected from the group of proteins having a sequence according to SEQ ID NOS. 64 to 113, as well as homologs, derivatives, variants and fragments thereof.
  • Quantification is preferably carried out immunologically, for example by means of an ELISA assay, Western blots, RIA, immunohistochemistry or immunocytochemistry.
  • the protein quantity determination according to the invention is carried out immunologically using monoclonal or polyclonal antibodies or other molecules which specifically bind to a protein which is regulated in cells in connection with chronic oxidative stress or bind specifically to a protein which is selected from the group the proteins having a sequence according to SEQ ID NO: 64 to 113, as well as homologs, derivatives, variants and fragments thereof.
  • the molecules may be identical to the therapeutic or prophylactic binders described below and may be biomolecules or chemicals, particularly small chemical molecules, as described below for expression and biological activity modulators, respectively.
  • the determination of quantity can preferably also not be carried out immunologically with NMR or PET probes. Equally preferred is the quantification by mass spectroscopy methods.
  • the proteins to be determined may also have modifications as defined above.
  • the sample is contacted with an antibody or binder, and the amount of the resulting complex of antibody and protein, respectively, and J3mder_und PxQtei] initsMs_des ⁇ ben4 ⁇ n ⁇ can be chemically modified.
  • the antibodies or binders may be covalently coupled to an enzyme that reacts with a (chromophore) substrate, the reaction - and thus the resulting complex of antibody and protein or binder and
  • Protein - can be visualized and detected by means of the resulting fluorescence, luminescence or phosphorescence. Further, the antibodies or binders may be directly labeled with dye,
  • Fluorescence, luminescence or radioactive molecules to be linked or mass spectroscopically effective isotopes so that the detection of the resulting complex of antibody and protein or binder and protein can be visualized directly without intermediate enzymatic reaction step.
  • protein chips for detecting antibodies to proteins regulated in cells in the context of chronic oxidative stress are used in patient material such as blood, serum, CSF, brain, saliva.
  • the protein chips contain antibodies or binders for detecting the proteins according to the invention, which are regulated in cells in connection with chronic oxidative stress, in patient material, such as blood, serum, CSF, brain, saliva.
  • the determination of the protein level of a protein that is regulated in cells in the context of chronic oxidative stress enables the identification, monitoring, nosological classification, diagnosis and / or prognostic evaluation of diseases and disease-like conditions caused by oxidative stress of cells .
  • the method according to the invention makes it possible to diagnose diseases and / or (chronic) disease-like conditions associated with oxidative stress, in particular cancer, cardiovascular diseases, arteriosclerosis, diabetes mellitus, inflammatory diseases in the immune system, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel diseases, premature aging, degenerative and neurological diseases such as stroke and multiple sclerosis as well as neurodegenerative diseases with dying nerve cells such as dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, ALS or Huntington's disease.
  • the method of the present invention identifies, assesses and / or monitors drug side effects that occur as a result of oxidative stress caused by the corresponding drugs.
  • kits comprises at least one monoclonal or polyclonal antibody or other binder which is specific for a protein which is regulated in cells in connection with chronic oxidative stress and is preferably specific for a protein which is selected from the group of proteins, the one sequence according to SEQ ID NO: 64 to 113 and homologues, derivatives, variants and fragments thereof.
  • kit according to the invention can comprise suitable reagents, such as buffers, as well as suitable reference protein (s) according to the protein quantity determination method to be carried out.
  • suitable reagents such as buffers, as well as suitable reference protein (s) according to the protein quantity determination method to be carried out.
  • the kit according to the invention could also contain NMR tags, PET probes, isotope tags for mass spectroscopy and / or aptamers.
  • the present invention relates to the use of nucleic acids that regulate cells in association with chronic oxidative stress be used to identify therapeutic and / or prophylactic agents that modulate the expression of nucleic acids that are regulated in the context of chronic oxidative stress in cells, or modulate the biological activity of the proteins encoded by these nucleic acids.
  • the present invention relates to the use of nucleic acids having a sequence according to SEQ ID NO: 1 to 63 and proteins having sequences according to SEQ ID NO: 64 to 113 and their homologues, derivatives, variants and fragments.
  • the present invention relates to a method for the identification of therapeutic and / or prophylactic agents which regulate the expression of nucleic acids which are regulated in cells in the context of chronic oxidative stress, the method comprising the following steps:
  • a) providing a cell which expresses a nucleic acid which is regulated in cells in connection with chronic oxidative stress b) contacting the cell with a candidate substance and c) comparing the expression of the nucleic acid associated with chronic oxidative stress in Cells is regulated with the expression of a nucleic acid which is regulated in cells in connection with chronic oxidative stress when the candidate substance is not added,
  • the present invention relates to a method of identifying therapeutic and / or prophylactic agents that modulate the biological activity of proteins regulated in cells in the context of chronic oxidative stress, the method comprising the steps of:
  • a binding indicates that it is a potential modulator.
  • the determination of the expression of the nucleic acid or the amount of protein expressed by this nucleic acid by means of an RNA analysis, in particular by a Northern blot, RNA / cDNA hybridization with signal amplification or RT-PCR, or be carried out by protein analysis method, in particular by a Western blot analysis or ELISA.
  • the method of the invention is used to identify therapeutic and / or prophylactic agents using gene libraries, expression libraries, natural product libraries, small chemical molecule libraries, recombinatorially chemically synthesized lead structures, and the like.
  • the candidate substances used according to the invention may be biomolecules or chemicals, in particular my chemical molecules such as are defined below.
  • biomolecules which can act as modulators of expression or biological activity are: nucleic acids such as poly- and oligonucleotides, purines, pyrimidines, polypeptides, antibodies, oligosaccharides, polysaccharides, lipids, fatty acids, steroids or structural analogs, fragments or derivatives thereof and / or combinations thereof.
  • nucleic acids such as poly- and oligonucleotides, purines, pyrimidines, polypeptides, antibodies, oligosaccharides, polysaccharides, lipids, fatty acids, steroids or structural analogs, fragments or derivatives thereof and / or combinations thereof.
  • modulators of expression are: microRNA, siRNA or other molecules of RNA interference (RNAi) known to the person skilled in the art; Oligonucleotides, polynucleotides, antisense
  • Nucleic acids, PNA, aptamers or ribozymes e.g. as transcriptional activators or
  • Modulators of expression may have modifications.
  • modulators of biological activity are: polymeric forms of amino acids of any length (eg, polypeptides, proteins) that include, for example, naturally occurring or unnatural amino acids and occur as a single amino acid chain or as a multimeric molecule; Polypeptides comprising amino acid analogs, modified or derivatized amino acids; Polypeptides having cyclic or bicyclic peptide backbones; Fusion proteins, depsipeptides, PNAs or peptidomimetics. Modulators of biological activity may have modifications.
  • Modulators of biological activity may further have an effect on the binding properties of the proteins.
  • Preferred modulators of biological activity are antibodies, for example polyclonal or monoclonal antibodies, which act agonistically, antagonistically or neutralizing the biological activity of proteins which are regulated in cells in connection with oxidative stress and to which the antibodies bind.
  • the antibodies are of human origin or humanized.
  • the antibodies acting as modulators according to the invention comprise at least one of the following domains: an immunoglobulin variable region, an immunoglobulin constant region, an immunoglobulin heavy chain, an immunoglobulin light chain, and an immunoglobulin antigen binding region.
  • modulators of biological activity also include active fragments of an antibody that specifically bind to an antigen or an epitope of a protein that is regulated in cells in the context of oxidative stress.
  • An active fragment may be a Fab fragment, an Fc fragment, a heavy chain or light chain variable region fragment.
  • modulators of biological activity also include antibodies or active fragments thereof that specifically bind to ligands of a protein that is regulated in cells in the context of oxidative stress and thus modulate the activity of the ligand.
  • modulators of biological activity of proteins regulated in cells in association with oxidative stress may be associated with a therapeutic and / or prophylactic agent. This bond can be covalent.
  • suitable Active ingredients include: radioactive isotopes, nonspecific antioxidants, nerve growth factors and anti-aggregation agents.
  • Examples of chemicals as modulators of the expression of nucleic acids which are regulated in cells in connection with oxidative stress or as modulators of the biological activity of the proteins encoded by these nucleic acids are chemicals of all chemical classes, synthetic, semi-synthetic or naturally occurring , inorganic or organic molecules, small molecules or macromolecular complexes or metallic elements, such as lithium, or gases.
  • Examples of the above-mentioned small chemical molecules are: small organic compounds having a molecular weight of at least about 30 and less than about 5000 daltons.
  • the modulators acting as chemicals and small chemical molecules may have at least one of the following functional groups: hydroxyl, amino, imino, carboxyl or carbonyl group.
  • the chemicals and small chemical molecules acting as modulators may be or have a monocyclic or polycyclic carbon structure or a heterocyclic structure, and / or may be or have an aromatic or polyaromatic structure substituted with at least one of the above-mentioned functional groups.
  • Active substances _the_ the . biological . Modulate activity of proteins that are regulated in cells in the context of chronic oxidative stress, agents that bind to proteins that are regulated in cells in the context of chronic oxidative stress (so-called "binders"). It is preferred to use protein chips comprising proteins which are regulated in cells in connection with chronic oxidative stress, in particular proteins comprising a sequence according to SEQ ID NO: 64 to 113, and derivatives, variants, homologs and fragments thereof.
  • kits for carrying out the method according to the invention for the identification of therapeutic and / or prophylactic agents which regulate the expression of nucleic acids that are regulated in cells in connection with chronic oxidative stress or the biological activity of modulate proteins encoded by these nucleic acids comprising at least one Cell that expresses a nucleic acid that is regulated in cells in the context of chronic oxidative stress.
  • the cell comprises one or more nucleic acids having a sequence according to SEQ ID NOs: 1 to 63, as well as homologs, derivatives, variants and fragments thereof.
  • nucleic acids used in the methods of the present invention which are regulated in cells in connection with chronic oxidative stress, or nucleic acids which encode proteins that are regulated in the context of oxidative stress, and preferably the sequences of SEQ ID NO: 1 to 63, as well as homologs, derivatives, variants and fragments thereof, may be operatively linked to regulatory control elements that promote effective expression, ie Allow transcription and / or translation in host cells and or host organisms.
  • regulatory control elements are, for example, constitutive, inducible, cell- or tissue-specific promoters, as are known to the person skilled in the art as prior art. Further regulatory control elements are terminator sequences and polyadenylation signal sequences.
  • the nucleic acids operatively linked to the regulatory control elements can be present in a vector, for example in a plasmid, cosmid, phagmid, viroid, virus, preferably adenovirus and baculovirus.
  • the nucleic acids functionally linked to the regulatory control elements may be present in the host cells and / or host organisms together with a marker gene, wherein the marker gene, together with the nucleic acids functionally linked to the regulatory control elements, can be located on a vector or on a vector other than this vector may be present.
  • the marker gene-comprising vector is introduced into the host cell or host together with the vector comprising the nucleic acid operatively linked to the regulatory controls.
  • the present invention relates to the use of nucleic acids which are regulated in cells in connection with chronic oxidative stress, or nucleic acids which code for a protein regulated in connection with oxidative stress, and preferably the sequences of SEQ ID NO: 1 to 63 and homologs, derivatives, variants and fragments thereof, for the production of transgenic cells and non-human organisms, preferably a transgenic non-human mammal.
  • Another aspect of the present invention is a cell comprising at least one recombinant nucleic acid associated with chronic oxidative stress in cells or at least one recombinant nucleic acid encoding a protein regulated in association with oxidative stress, preferably having the sequences of SEQ ID NOS: 1 to 63, and homologs, derivatives, variants and fragments thereof, wherein the recombinant nucleic acid is functionally linked to regulatory control elements.
  • Another aspect of the present invention is a non-human organism, preferably a mammal, comprising at least one recombinant nucleic acid which is regulated in cells in association with chronic oxidative stress, or at least one recombinant nucleic acid which has been associated with oxidative stress Protein, and preferably having the sequences of SEQ ID NO: 1 to 63, and homologues, derivatives, variants and fragments thereof, wherein the recombinant nucleic acid is functionally connected to regulatory control elements.
  • nucleic acids and proteins are used which have the sequences according to SEQ ID NO: 1 to 113 and their homologs, derivatives, variants and fragments.
  • the cells were homogenized by ultrasound, centrifuged (20 minutes, 4 0 C, 20,000 xg) and measured the fluorescence of the supernatant.
  • the standard was DCF. All data were normalized with protein concentration.
  • the relative increase in ROS was calculated in relation to the control.
  • ROS were determined with the aid of dihydroethidium (DHE, Sigma Cat. No. D7008)).
  • An aliquot of the scraped cells was mixed with 5 ⁇ M DHE, incubated for 1 hour at 37 ° C, worked up analogously to the DCFDA procedure and the fluorescence of the supernatant determined.
  • the protein-corrected change in mitochondrial ROS was calculated in relation to the untreated control.
  • the concentrations of haloperidol used in the various experiments were between 1.0-25 ⁇ M. However, the concentrations of the stressor may also be higher or lower than the stated range.
  • the MAC30 mRNA increase can be quantified by quantitative real-time RT-PCR (qRTRTPCR) analysis with fluorescence labeling by SYBR-Green 1. After 8 days of cell treatment, the increase is 50% or more and may reach 200% or more with prolonged treatment.
  • MAC30-Forl 5'-AAGCCATCTTCCTTAGCCTCCCAAGTA-S 1
  • MAC-30-Rev2 5'-AAAACCCTGTCTCCACACACAAAAA-S ')
  • a cDNA fragment was amplified, which a coding sequence for a polypeptide having the length of 69 amino acids (Accession- Nummem NPJQ55.3BS .and AAH4565_5) .. Mit_ djes_em primer pair .wurde.
  • the increase in BRI3 mRNA in NT2-N neurons was detected in microarray analyzes using fluorescently labeled cDNA after treatment with haloperidol (as described in Example 1). This increase can be quantified by quantitative real-time RT-PCR (qRTRTPCR) analysis with fluorescence labeling by SYBR-Green 1. The increase is to be noted 3 days after treatment. After 8 days of treatment of the cells, the increase is already 40% or more and can reach up to 200% or more with prolonged treatment.
  • qRTRTPCR quantitative real-time RT-PCR
  • BRI3 mRNA For the analysis of BRI3 mRNA by qRTRTPCR, the PCR primer pair BRB-Forl (5'-CTTTGGGTTCATTTGCTGTTTTG-S ') (SEQ ID NO: 116) and BRI3-Rev2 (S'-CATTAGAAAAAGAGAGCTGGGTGTA-SO) (SEQ ID NO: 117) This pair of primers were used to amplify cDNA-BRB fragments which have coding regions for 125 amino acid polypeptides.
  • BRB-Forl 5'-CTTTGGGTTCATTTGCTGTTTTG-S '
  • BRI3-Rev2 S'-CATTAGAAAAAGAGAGCTGGGTGTA-SO
  • Example 3 The increase in GlP3 mRNA in NT2-N nerve cells can be detected in microarray analyzes with fluorescence-labeled cDNA after treatment with haloperidol (as described in Example 1). This increase was quantified by a quantitative real-time RT-PCR (qRTRTPCR) fluorescence labeling assay by SYBR-Green 1. After 3 days, a significant increase can be detected, which can be 50% or more after 8 days of treatment and up to 400% in the case of further treatment.
  • qRTRTPCR quantitative real-time RT-PCR
  • the PCR primer pair GlP3-Forl 5 1 - GCTATT_CACAGATilCGAACATAGTA-3 :) is suitable.
  • a cDNA fragment having a coding region for a 134 amino acid polypeptide can be amplified.
  • a primer pair was also amplified with a cDNA fragment having a coding region for a polypeptide of length 138 amino acids.
  • this primer pair also amplified a cDNA fragment having a coding region for a polypeptide of 130 amino acids in length. The differences can be explained by small variations in the transcript length in the coding region.
  • LOC222171 mRNA in NT2-N neurons can be detected in microarray analyzes with fluorescently labeled cDNA after treatment with haloperidol (as described in Example 1). This increase was due to a quantitative real-time RT-PCR (qRTRTPCR) analysis with fluorescence labeling quantified by SYBR-Green 1. After 15 days of haloperidol treatment, a significant increase is observed, which is 50% or more and may increase further with prolonged treatment.
  • qRTRTPCR quantitative real-time RT-PCR
  • LOC222171-Forl 5 1 -TGGCTGTTATTTAGGACTCTGTGGAAA-S 1
  • LOC222171-Rev2 5'-TCCCCCACTCCTTCACTTAAGGTATAA-S 1 )
  • CUEDCl mRNA in NT2-N neurons can be detected in microarray analyzes with fluorescently labeled cDNA after treatment of the cells with haloperidol (as described in Example 1). This increase was further quantified by a quantitative real-time RT-PCR (qRTRTPCR) fluorescence labeling assay by SYBR-Green 1. After 15 days of chronic oxidative stress, a more than 30% increase can be detected, which may continue to increase with prolonged treatment.
  • qRTRTPCR quantitative real-time RT-PCR
  • the PCR primer pair CUEDCl-Forl (5 1 - CTTATTCAGGGACAAGCTGAAACACAT-S 1 ) (SEQ ID NO: 122) and CUEDC1-Rev2 (5 1 - AGTGTTTCCTCTTTGACTTCCTCATTTT-3 ') (SEQ ID NO : 123).
  • CUEDCl-Forl 5 1 - CTTATTCAGGGACAAGCTGAAACACAT-S 1
  • CUEDC1-Rev2 5 1 - AGTGTTTCCTCTTTGACTTCCTCATTTT-3 '
  • AK000977 has a deletion in the coding region, resulting in a 28 amino acids shorter polypeptide, which otherwise differs from the other primary structures only by a conservative amino acid exchange at amino acid 47 of the mature protein.
  • Example 6 The increase of NPC2 mRNA in NT2-N neurons after treatment with haloperidol (as described in Example 1) was detected in microarray analyzes with fluorescently labeled cDNA. This increase was quantified by a quantitative real-time RT-PCR (qRTRTPCR) fluorescence labeling assay by SYBR-Green 1. Already after 3 days of treatment a significant increase of the NPC2-mRNA is to be proven in comparison to untreated nerve cells. After 15 days of chronic sub-lethal oxidative stress lies the Increase at 50% or more and may continue to increase with prolonged treatment.
  • qRTRTPCR quantitative real-time RT-PCR
  • NPC2-Forl 5-AATTAACTGCCCTATCCAAAAGAC-S ') (SEQ ID NO: 124) and NPC2-Rev2 (5 1 - CAGAAGAGACTTTGGTTTTGTCAT-S 1 ) (SEQ ID NO: 125).
  • NPC2-Forl 5-AATTAACTGCCCTATCCAAAAGAC-S '
  • NPC2-Rev2 5 1 - CAGAAGAGACTTTGGTTTTGTCAT-S 1
  • a cDNA fragment was also amplified which has a coding region for a polypeptide of length 151 amino acids, which differs by two conservative amino acid substitutions of the former polypeptide.
  • SCD mRNA after treatment of NT2-N nerve cells with haloperidol was detected in microarray analyzes with fluorescently labeled cDNA. This increase was quantified by a quantitative real-time RT-PCR (qRTRTPCR) fluorescence labeling assay by SYBR-Green 1. After 15 days of treatment, an increase in SCD mRNA is detected by 50% or more compared to untreated neurons.
  • qRTRTPCR quantitative real-time RT-PCR
  • the PCR primer pair SCD-Forl (5'-AAAGATGATATATATGACCCCACCT-S ') (SEQ ID NO: 126) and SCD-Rev2 (5'-CCAAGTGTAGCAGAGACATAAGGAT-S') (SEQ ED NO: 127).
  • SCD-Forl 5'-AAAGATGATATATATGACCCCACCT-S ')
  • SCD-Rev2 5'-CCAAGTGTAGCAGAGACATAAGGAT-S'

Landscapes

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Therapie, Prophylaxe und Diagnose degenerativer Erkrankungen, besonders neurodegenerativer Erkrankungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Gene und Proteine, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden und die zur Therapie, Prophylaxe und Diagnose degenerativer Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativer Erkrankungen, eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem die Verwendung von Genen und Proteinen, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, für die Durchmusterung von Kandidatensubstanzen, um prophylaktische und/oder therapeutische Wirkstoffe zu identifizieren, welche die biologische Aktivität von Genen und/oder Proteinen, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen aktiviert werden, modulieren. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Diagnose degenerativer Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativer Erkrankungen, und Verfahren zur Identifizierung von prophylaktischen und/oder therapeutischen Wirkstoffen, welche die biologische Aktivität von Genen und/oder Proteinen, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen aktiviert werden, modulieren. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Kits zur Durchführung der Diagnoseverfahren.

Description

Therapeutische Zielmoleküle zur Entwicklung neuartiger Medikamente für degenerative Erkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Therapie, Prophylaxe und Diagnose degenerativer Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativer Erkrankungen. Im Speziellen betrifft die vorliegende Erfindung Gene und Proteine, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden und die zur Therapie, Prophylaxe und Diagnose degenerativer Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativer Erlαrankungen, eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem die Verwendung von Genen und Proteinen, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, für die Durchmusterung von Kandidatensubstanzen, um prophylaktische und/oder therapeutische Wirkstoffe zu identifizieren, welche die biologische Aktivität von Genen und/oder Proteinen, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen aktiviert werden, modulieren. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Diagnose degenerativer Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativer Erkrankungen, und Verfahren zur Identifizierung von prophylaktischen und/oder therapeutischen Wirkstoffen, welche die biologische Aktivität von Genen und/oder Proteinen, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen aktiviert werden, modulieren. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Kits zur Durchführung der Diagnoseverfahren.
Aerobe Organismen verwenden TüTdre~Äüϊfechterrϊältung des gesamten käTabolen undiπabolerr Stoffwechsels u.a. Oxidationsreaktionen, um Energie aus der Nahrung zu gewinnen und Stoffwechselmetaboliten zur Verfügung zu stellen. Dabei entstehen in den Zellen laufend reaktive Sauerstoff- (= ROS; reactive oxygen species) und reaktive Stickstoff-Verbindungen (= RNS; reactive nitrogen species) wie Superoxidanionen, Hydroxylradikale, Wasserstoffperoxid, Peroxinitrite und Stickstoffmonoxid. Das Auftreten bzw. Entstehen dieser reaktiven Moleküle muss sehr genau reguliert werden, um eine unkontrollierte Oxidation bzw. Nitrierung von Biomolekülen wie Proteinen, DNA und Lipiden in den Zellen zu verhindern. Bei einem Ungleichgewicht zu Gunsten von ROS und/oder RNS unterliegen die Zellen einem oxidativen Stress, der in unkontrollierter und unerwünschter Weise zur Modifikation von Biomolekülen und damit zum Absterben (Degeneration) der Zellen führen kann. Nervenzellen sind wegen ihres hohen Energieverbrauchs und ihrer hohen Stoffwechselaktivität besonders anfällig gegenüber oxidativem Stress. Das Absterben von Nervenzellen kann für den betroffenen Menschen verheerende und irreversible Auswirkungen haben. Das Absterben von Nervenzellen kann zum Beispiel als Folge eines Schlaganfalls, Herzinfarkts, von traumatischen Hirn- und Rückenmarksverletzungen, Infektionen, Entzündungsreaktionen, Excitotoxizität, Ischemien, Hypoxien oder anderer Mangelversorgungen des Gehirns bzw. Rückenmarks eintreten. Darüber hinaus tritt ein Absterben von Nervenzellen bei neurodegenerativen Erlcrankungen wie Morbus (M) Alzheimer, Lewy Body Erkrankungen wie M. Parkinson, diffusen Lewy Body Erkrankungen, M. Huntington, Amyotropher Lateraler Sklerose (ALS), Prion-Erlcrankungen (PrD)5 Creutzfeldt- Jakob Erkrankung, Down-Syndrom, frontotemporalen Demenzen (FTD), Corticobasalen Degenerationen, Multiinfarkt-Demenzen, progressiver supranukleärer Lähmung, Multisystematrophie und Korsakoffs Syndrom auf. Ein Absterben von Nervenzellen kann ebenso die Folge von Medikamentenwirkungen sein. So kann bei einer längeren Verabreichung von Neuroleptika zur Behandlung psychotischer Zustände bei Patienten eine chronische tardive Dyskinesie auftreten, die durch den Anstieg der Konzentration freier Radikale in den betroffenen Neuronen mit anschließender Degeneration der Neurone hervorgerufen wird.
Die Ursache des selektiven und progressiven Absterbens von Neuronen bei neurodegenerativen Erkrankungen ist nicht geklärt. Die Erkrankungen treten jeweils in einer Höhe von maximal 10% als autosomal vererbte Formen auf und betreffen die Patienten dann vor ihrem 65. Lebensjahr ("earfy onset"). Für M. Alzheimer sind intrazelluläre, hauptsächlich aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein bestehende, neurofibrilläre "tangles" (NFT) und extrazelluläre Ablagerungen von -Amyloid ß (Aß),j40-42 in_senilen_ Plaques (SP) charakteristisch. Die Folge j,sL ein selektiver Verlust cholinerger Neurone. Es existieren jedoch auch Plaque-freie Formen der Alzheimer- Erkrankung. Die vererbten Formen werden überwiegend durch Mutationen in Genen, die das Aß-Vorläufer-Protein (APP) und das Presenilin (PSl bzw. PS2) kodieren, hervorgerufen. Die auf diesem Befund beruhende Amyloid-Hypothese sieht eine veränderte Aß-Homöostase mit der Folge fortschreitender Aß-Ablagerungen und Aß-Aggregationen als Ursache für das Absterben der cholinergen Neurone.
Die Parkinson-Symptomatik wird durch Dopaminmangel, auf Grund des Absterbens von Neuronen in der Substantia nigra des Gehirns hervorgerufen. Auf zellulärer Ebene ist das Auftreten von Lewy Bodies zu beobachten, die überwiegend aus aggregiertem α-Synuclein bestehen, aber auch weitere Proteine, wie Ubiquitin-C-terminale Hydrolase, enthalten. Eine familiäre Häufung von M. Parkinson wurde bisher mit mehr als 10 chromosomalen Regionen assoziiert, wobei Mutationen in den Genen, die α-Synuclein (PARKl), Parkin (PARK2) und DJ-I (PARK7) kodieren, eindeutig lαankheitsverursachend sind.
ALS wird durch einen progressiven Verlust an Motorneuronen verursacht. 20 % der familiären Formen der Erkrankung werden mit mehr als 90 Mutationen in der Cu-Zn-Superoxiddismutase (SOD) assoziiert.
M. Huntington wird durch die fatale Verlängerung einer CAG-Trinuldeotid- Wiederholungssequenz in dem Gen, welches das Huntington-Protein kodiert, verursacht. Diese Verlängerung fuhrt zur Bildung eines Glutamin-reichen anormalen Huntington-Proteins, das intrazellulär aldcumuliert und Aggregate u.a. in Striatalen Neuronen bildet.
Die überwiegende Anzahl neurodegenerativer Erkrankungen tritt jedoch ohne Beteiligung der jeweils bekannten Mutationen als sporadische Form nach dem 65. Lebensjahr ("late onset") auf. Sie werden durch multifaktorielles Zusammenwirken von Umwelteinflüssen und endogenen Faktoren hervorgerufen. Als Hauptrisikofaktor gilt das Alter.
Zellschädigender oxidativer Stress durch ROS und KNS wird in den letzten Jahren zunehmend als krankheitsauslösender oder -fördernder Faktor gesehen. So wurden bei M. Alzheimer und M. Parkinson vermehrt Protein-Nitrierung, Protein-Carbonylierung, Glykoxidierung und Lipidperoxide in Gehirnproben nachgewiesen. Weitere Evidenzen sind ein kompensatorisches Hochregulieren antioxidativer Enzyme und die verstärkte Oxidation von RNA bzw. DNA sowie
Figure imgf000004_0001
hinaus ein reduzierter Spiegel an mitochondrialem Atmungs-Komplex I und intrazellulären Thiolen sowie ein Anstieg von Eisen zu finden. Tiermodelle stützen die oxidative Stress- Hypothese bei der Entstehung von M. Parkinson. So induziert die Verabreichung von 6-OH- Dopamin oder l-Methyl-4-Phenyl-l,2,3,6-Tetrahydropyridin (MPTP) ebenso wie eine chronische Pestizid-Exposition die Degeneration dopaminerger Neurone. Das durch die PARK7- Region kodierte DJ-I -Protein übernimmt in der Zelle eine antioxidative Funktion. Ebenso ist bekannt, dass eine α-Synuclein-Aggregation durch oxidativen Stress hervorgerufen wird. Bei ALS werden im Rückenmark vermehrt Nitrotyrosine, bei M. Huntington im Striaton vermehrt 8-Hydroxy-Desoxyguanosin und Nitrotyrosin als oxidative Stressmarker beobachtet.
Oxidativer Stress ist daher in der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen ein kritisches
Bindeglied zwischen exogenen Faktoren wie Umweltgiften und endogenen Faktoren wie genetischer Prädisposition. Zudem ist bekannt, dass die Effektivität von Radikal- Entgiftungssystemen, wie das Glutathion (GSH)-System, im Alter abnimmt. Eine Therapie, die direkt bei den zellulären Schutzmechanismen gegen diesen Stress eingreift und dadurch neuroprotektiv wirkt, wäre wünschenswert und könnte zukünftig die Krankheitsprogresεion verhindern.
Für neurodegenerative Erkrankungen gibt es derzeit keine effektiven Medikamente. Die eingesetzten Wirkstoffe bekämpfen nur Symptome. Sie können das Fortschreiten der Erlαankungen jedoch nicht stoppen. Zum Teil werden erhebliche Nebenwirkungen wie Dyskinesien, Verwirrtheitszustände, etc. ausgelöst. Die Medikation zielt auf einen Ersatz des fehlenden Neurotransmitters bzw. auf eine Maximierung der Funktion der noch überlebenden Neurone ab, deren Anzahl zu Beginn der Symptome bereits drastisch, bei Alzheimer z.B. um mehr als 50 %, reduziert ist.
60-80 % der Alzheimer-Patienten sprechen auf die Gruppe der Acetylcholinesterase-Hemmer nicht an. Als einzige Alternative steht der NMD A-Rezeptor- Antagonist Memantin zur
Verfügung. In klinischer Entwicklung sind u. a. selektive Liganden für nikotinische
Acetylcholinrezeptoren und NMDA-Rezeptoren, Hemmstoffe der ß- bzw. der γ-Sekretase sowie der Tau- Aggregation, eine Vakzinierung gegen ß-Amyloid, nicht-steroide anti-inflammatorische
Medikamente, Cholesterinspiegel senkende Medikamente (Statine) sowie unspezifische Antioxidanzien (u.a. spin trapping Agenzien).
- B€ϊ-PariaBSθH.--hilit-4i& -K©mbinati«n-vei^evO4D!Qpa4 4-i^ -nur_ca_5
Jahre. Weiterhin werden Dopamin- Agonisten oder Hemmstoffe der Monoamino-Oxidasen oder der Catechol-O-Methyltransferase verabreicht. In klinischer Entwicklung sind u. a. Nervenwachstumsfaktoren, Neuroimmunophiline, unspezifische Antioxidanzien, Kinase-
Hemmer (CEP 1347) sowie Zellersatz-Therapien (u.a. Spheramine®).
Bei ALS wird der NMDA-Rezeptorantagonist Riluzol zur symptomatischen Therapie eingesetzt. Dabei ist eine sehr geringe Verlängerung der Überlebenszeit von 2 Monaten zu beobachten, wobei die Erkrankung innerhalb von 2-5 Jahren nach Diagnose zum Tod führt.
Daher besteht für neurodegenerative Erkrankungen ein großer Bedarf nach neuen Medikamenten mit höherer Effizienz, Spezifität und Verträglichkeit. Insgesamt existiert eine Fülle von
Therapie-Ansätzen, die anti-inflammatorische, anti-aggregatorische, anti-exzitatorische, anti- apoptotische, anti-oxidative, neurotroph-regenerative sowie Transkriptions-/Translations- modifizierende Strategien verfolgen. Ein breit angelegtes therapeutisches Vorgehen, das nach Möglichkeit an mehreren Stellen der degenerativen Kaskade ansetzt, scheint bei der Komplexität der pathophysiologischen Prozesse derzeit am aussichtsreichsten zu sein.
Bisherige anti-oxidative Therapie-Strategien für neurodegenerative Erkrankungen verwenden nur unspezifische Antioxidanzien (wie Vitamin E, Idebenon). Diese brachten jedoch keine Verbesserung der Krankheitssymptomatik. All diesen Ansätzen fehlt die gezielte Modulation von zelleigenen Genen und Proteinen, die eine entscheidende Funktion bei der Bewältigung der Ursachen oder Folgen von oxidativem Stress ausüben und dadurch neuroprotektiv wirken. Die aussichtsreichsten Möglichkeiten, diese Gene bzw. Proteine zu identifizieren, sind Bedingungen, bei denen Zellen gegen oxidativen Stress ankämpfen, aber noch überleben können, d.h. sie unterliegen chronischen und vor allem subletalen oxidativen Stressbedingungen.
Im Licht des dargestellten Stands der Technik besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, Gene bzw. deren Produkte bereitzustellen, die im Zusammenhang mit chronisch oxidativem Stress in den Zellen reguliert werden. Weiter besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, mittels dieser Gene bzw. deren Produkten Wirkstoffe zur Therapie und/oder Prophylaxe von degenerativen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen zu identifizieren.
Diese Aufgabe wird von den in den Patentansprüchen definierten Gegenständen gelöst.
-Unter- τ^dd^tiyem_S.tressl'_versteiit-man die Entstehung von reaktiven Sauerstoffspecies bzw. reaktiven Stickstoffspecies in Zellen oder Geweben. Sauerstoffspecies können Superoxidanion, Hydroxylradikal und H2O2 sein. Stickstoffspecies können Peroxinitrite und Stickstoffmonoxid sein. Diese Species entstehen zum Beispiel bei den Reaktionen der Atmungskette in den Mitochondrien jeder Zelle. Das Risiko einer Zellschädigung steigt, wenn z.B. im Gehirn eine hohe Soffwechselaktivität vorherrscht. Die Sauerstoffspecies werden im Regelfall durch antioxidative Enzyme wie Superoxiddismutase, Katalase oder Glutathionperoxidase eliminiert. Gelingt diese Elimination jedoch nicht vollständig, entstehen Hydroxylradikale Superoxidanionen und Wasserstoffperoxid, welche schwere Zellschäden und Zelltod und schließlich z.B. neurologische degenerative Erkrankungen verursachen können.
Der Begriff „chronischer oxidativer Stress" oder „chronischer subletaler oxidativer Stress", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet die durch eine Einwirkung von oxidativem(n) Stressor(en) bewirkte Zunahme mindestens einer reaktiven Sauerstoff- oder Stickstoffverbindung in Zellen verglichen mit einer Kontollbedingung, wobei die Zunahme mindestens 4 Stunden dauert und bis zu 35 Tage oder länger anhalten kann.
Der Begriff „oxidativer Stressor", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein Molekül, das in Zellen oxidativen Stress erzeugt.
Die Begriffe "Derivat" oder „Variante" von Nukleinsäuren, wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen Nukleinsäuresequenzen, die eine oder mehrere Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen, wie sie dem Fachmann bekannt sind, zu einer Vergleichsnukleinsäure aufweisen.
Die Begriffe "Derivat" oder „Variante" von Proteinen, wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen Aminosäuresequenzen, die eine oder mehrere Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder natürliche bzw. unnatürliche Protein-Modifikationen, wie sie dem Fachmann bekannt sind (z. B. Glykosylierung oder GPI- Anker), zu einem Vergleichsproteins aufweisen.
Die Begriffe „homologe Sequenz" oder „Homologie", wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen eine Nukleinsäure- oder Proteinsequenz mit signifikanter Ähnlichkeit zu einer Vergleichssequenz oder Fragmenten davon, wobei die diese homologen Sequenzen aufweisenden Nukleinsäuren bzw. Proteine eine Aktivität oder Teilaktivität vergleichbar der ΔktiyitäLden Nukleinsäuren bzw. Proteine mit der Vergleichssequenz aufweisen. Als homologe
Sequenzen gelten Nukleinsäuresequenzen, die mit Vergleichssequenzen oder Fragmenten dieser
Vergleichssequenzen unter stringenten oder wenig stringenten Bedingungen hybridisieren (zu stringenten und wenig stringenten Bedingungen siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, CoId Spring Harbour Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6). Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 x SSC bei 65° C (alternativ in 50% Formamid und 4 X SSC bei 42° C), gefolgt von mehreren Waschschritten in 0,1 x SSC bei 65°C für insgesamt eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 x SSC bei 37°C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 x SSC bei Raumtemperatur. Als homologe Sequenzen sollen weiter Nukleinsäure- oder Proteinsequenzen oder Fragmente davon gelten, die unter Zuhilfenahme des Similaritätsalgorithmus BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al, Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990) eine signifikante Ähnlichkeit mit den als Vergleichssequenzen verwendeten Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen aufweisen. Als signifikant ähnlich werden, wie hier verwendet, Sequenzen bezeichnet, die z.B. unter Verwendung von Standardparametern im Blast- Service des NCBI ein Signifikanzniveau (Probäbility) von P < 10"5 aufweisen, wenn Sie mit den Vergleichssequenzen oder Fragmenten davon verglichen werden.
Der Begriff „Modulator", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen Wirkstoff, der in der Lage ist, die Expressionsrate eines Gens und/oder die biologische Aktivität eines Proteins zu verändern, insbesondere zu erhöhen oder zu erniedrigen. Die Änderung der Expressionsrate oder der biologischen Aktivität kann dabei direkt mit dem Fachmann bekannten Verfahren auf Nukleinsäureebene (z.B. erzeugte mRNA) und auf Proteinebene (z. B.Westernblot, 2D- Gelelektrophorese oder FRET) ermittelt werden.
Der Begriff „neurodegenerative Erkrankung", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet degenerative und neurologische Krankheiten wie Schlaganfall und Multiple Sklerose sowie neurodegenerative Erkrankungen mit absterbenden Nervenzellen wie Demenz, M. Alzheimer, M. Parkinson, ALS oder M Huntington. Der Begriff neurodegenerative Erkrankung betrifft auch solche Erkrankungen, bei denen neurodegenerative Prozesse eine Rolle spielen, z.B. durch Medikamentenwirkung verursachte Zelldegenerationen wie Tardive Dyskinesie, oder psychiatrische Erkrankungen wie Schizophrenie oder Depression.
Die Begriffe „therapeutisches Zielmolekül" oder „drug target", wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen Gene oder Proteine, die durch gezielte Beeinflussung in ihrer Expressionsrate oder
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Heilung, Verzögerung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen verwendet werden:
Die vorliegende Erfindung betrifft Gene bzw. Proteine, die während chronischen subletalen oxidativen Stressbedingungen reguliert werden und zum cytoprotektiven Arsenal von Zellen gehören. Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, diese Gene bzw. Proteine sowie davon abgeleitete Derivate, Varianten, Homologe und Fragmente sowie gegen diese gerichtete Antikörper für Verfahren zur Therapie, Prophylaxe und Diagnose degenerativer Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativer Erkrankungen, sowie für Verfahren zur Identifizierung von prophylaktischen und/oder therapeutischen Wirkstoffen, welche die biologische Aktivität dieser Gene und/oder Proteine modulieren, zu verwenden. Weiter stellt die vorliegende Erfindung diagnostische Kits und die Gene und Proteine bereit, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden. Die Kits, Gene und Proteine werden dazu verwendet, um degenerative Erkrankungen und im Besonderen neurodegenerative Erkrankungen frühzeitig durch geeignete Maßnahmen zu verhindern, zu therapieren oder zu diagnostizieren bzw. das Risiko einer solchen Erkrankung durch diese Diagnose zu erniedrigen.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Nukleinsäuren bereit, die Gene repräsentieren, die in eukaryotischen Zellen im Zusammenhang mit chronischem oxidativen
Stress reguliert werden. Weiter stellt die vorliegende Erfindung die von diesen Genen kodierten
Proteine bereit. Ferner stellt die vorliegenden Erfindung auch solche Proteine bereit, die im
Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress reguliert werden, ohne dass die Regulation auf der Ebene der Nukleinsäuren einsetzt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente der Nukleinsäuren sowie der von den
Nukleinsäuren kodierten Proteine.
Vorzugsweise kodieren die Gene, die in eukaryotischen vorzugsweise humanen Zellen im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress reguliert werden, für MAC30 (Meningioma- associated protern), BRB (Synonym: 13, ρRGR2), G1P3, LOC222171, CUE domain containing 1 (CUEDCl), Niemann-Pick disease type C2 (NPC2), Stearoyl-CoA Desaturase (SCD; Delta-9- Desaturase) und Isopentenyl-diphosphate delta isomerase 1 Protein (IDIl; = Isopentenyl diphosphate dimethylallyl diphosphate isomerase 1). Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Transkriptvarianten der jeweiligen Gene.
Die Nukleinsäuresequenzen für MAC30 betreffen vorzugsweise die cDNA Sequenzen
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NCBI Genbank/EMBL _ Accession-Nummern NM 014573, _Bj_X)_4565_5, BC091504, CR613993, CR590967, CR612870, L19183, BC017362 (siehe Beispiel 1).
Die Nukleinsäuresequenzen für BRI3 betreffen vorzugsweise die cDNA Sequenzen entsprechend der NCBI Genbank/EMBL Accession-Nummern BCOl 8737, BC071992, AF041430, AB055977, NM_015379, BC062370, AF106966 (siehe Beispiel 2).
Die Nukleinsäuresequenzen für G1P3 betreffen vorzugsweise die cDNA Sequenzen entsprechend der NCBI Genbank/EMBL Accession-Nummern NM_022872, NM_022873, NM_002038, X02492, AK024814, BN000257, BCOl 1601, BC015603 und BT006850 (siehe Beispiel 3).
Die Nukleinsäuresequenzen für LOC222171 betreffen vorzugsweise die cDNA Sequenzen entsprechend der NCBI Genbank/EMBL Accession-Nummern BC029131, NM_175887, CR619478, CR608739, CR610203, BC018144, CR604389 (siehe Beispiel 4).
Die Nukleinsäuresequenzen für CUEDCl betreffen vorzugsweise die cDNA Sequenzen entsprechend der NCBI Genbanlc/EMBL Accession-Nummern NM_017949, AK000746, BC056882, AK000977 (siehe Beispiel 5).
Die Nukleinsäuresequenzen für Niemann-Pick disease type C2 (NPC2) betreffen vorzugsweise die cDNA Sequenzen entsprechend der NCBI Genbank/EMBL Accession-Nummern NM_006432, BC002532, CR609490, CR608935, CR605546, CR622486, AK222474, CR624497, CR601885, X67698, CR595914 (siehe Beispiel 6).
Die Nukleinsäuresequenzen für Stearoyl-CoA Desaturase (SCD; Delta-9-Desaturase) betreffen vorzugsweise die cDNA Sequenzen entsprechend der NCBI Geribank/EMBL Accession- Nummern S70284, Y13647, NM_005063, BC005807, AK222862, AB208982, BC062303, AF097514, AB032261 (siehe Beispiel 7).
Die Nukleinsäuresequenzen für IDIl (Isopentenyl diphosphate dimethylallyl diphosphate isomerase 1) betreffen vorzugsweise die cDNA Sequenzen entsprechend der NCBI
Genbank/EMBL Accession-Nummern NM_004508, BC057827, BC019227, BC022418, BC025375, BC006999, BC005247, AF271720 (siehe Beispiel 8).
Vorzugsweise betreffen, die Proteine^ die jn eukaryotischen vorzugsweise _humanen_Zelleii im_ Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress reguliert werden, die Expressionsprodukte der vorstehend aufgeführten Gene und deren Transkriptvarianten.
Die Aminosäuresequenzen des Proteins MAC30 betreffen vorzugsweise die Accession- Nummern NP_055388, AAH91504, AAH45655, AAA16188.
Die Aminosäuresequenzen des Proteins Brain protein i3 (BRB) betreffen vorzugsweise die Accession Nummern AAH18737, AAH71992, AAD05167, BAB32785, NP_056194, AAH62370, AAFl 8565, 095415. Das Protein brain protein i3 darf nicht mit dem Protein mit der Accession Nummer Q9NQX7 verwechselt werden, das die gleiche Bezeichnung BRI3 trägt, aber keine Ähnlichkeit zu dem Protein dieser Erfindung hat.
Die Aminosäuresequenzen des Proteins Interferon induziertes 6-16 Protein betreffen vorzugsweise die Accession Nummern NP_075010, NP_075011, NP_002029, AAH15603, CAE12275, AAHl 1601, AAP35496, CAA26322.
Die Aminosäuresequenzen des Proteins LOC222171 betreffen vorzugsweise die Accession- Nummern AAH29131, NP_787083, EAL24204.
Die Aminosäuresequenzen des CUE domain-containing 1 Proteins betreffen vorzugsweise die Accession-NummeraNP_060419, BAA91357, AAH56882, BAA91452, Q9NWM3.
Die Aminosäuresequenzen des NPC2 Proteins betreffen vorzugsweise die Accession-Nummern NP_006423, AAH02532, BAD96194, CAA47928, P61916.
Die Aminosäuresequenzen des humanen SCD-Proteins betreffen vorzugsweise die Accession- Nummern B AA93510, BAD92219, AAH62303, AAD29870, NP_005054, AAH05807, 000767, BAD96582, AAB30631, CAA73998.
Die Aminosäuresequenzen des humanen Isopentenyl-diphosphate delta isomerase 1 Proteins (IDIl; = Isopentenyl diphosphate dimethylallyl diphosphate isomerase 1) betreffen vorzugsweise die Accession-Nummern Q13907, NP_004499, AAH19227, AAK49435, AAK49434, AAK29357, AAH06999.
_Yorz]igsweise_b.e_trifrl di^Erimdxm^NiMejnsäuren;, die Sequejκejι_gemäß_d.er_SEQ_rD ,NOjI bis 63 aufweisen sowie Proteine, die Sequenzen gemäß der SEQ ID NO:64 bis 113 aufweisen und deren Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente. Wenn es sich um Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt, weisen die Homologen eine Homologie von mindestens 80%, bevorzugt eine Homologie von etwa 85%, 90%, 95% oder 99% mit Nukleinsäuren mit der Sequenz gemäß der SEQ ID NO:1- 63 auf. Wenn es sich um Homologe der erfindungsgemäßen Proteine handelt, weisen die Homologen eine Identität von mindestens 70%, bevorzugt eine Identität von etwa 75%, 85%, 90%, 95% oder 99% zu Proteinen mit der Sequenz gemäß der SEQ ID NO:64 bis 113 auf. Weiter können die erfindungsgemäßen Proteine Modifikationen aufweisen. Beispielhafte Modifikationen sind chemisch modifizierte Aminosäuren wie in der Natur nicht vorkommende (unnatürliche) Aminosäuren, Deletionen, Mutationen und Additionen in der Aminosäuresequenz, Fusionen der Proteine mit heterologen Polypeptiden (Fusionsproteine) sowie chemische und biologische Modifikationen von Aminosäuren durch in der Natur vorkommende und nicht vorkommende Strukturen wie Glykosilierungen, GPI- Anker und/oder Lipidierungen.
Die Nukleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung können natürlich oder nichtnatürlich vorkommende genomische DNA, RNA, cDNA, microRNA, siRNA sowie Homologe, Derivate, Fragmente und Varianten, insbesondere alternative Splicevarianten, davon sein oder modifizierte, insbesondere transkriptionell oder chemisch modifizierte, Nukleinsäuren oder Peptide Nucleic Acids (PNAs) und dergleichen sein.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Oligonukleotide, die als Sonde oder Primer selektiv an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hybridisieren und zur Detektion und/oder Amplifikation dieser Nukleinsäure-Moleküle in biologischem Probenmaterial verwendet werden können. Die Oligonukleotide können DNA, PvNA oder PNAs sein. Im Fall von DNA oder RNA bestehen die Oligonukleotide aus mindestens 6, vorzugsweise 6-50, 10-45,
12-40, 15-35, 15-30, 20-45, 25-40 aufeinander folgenden Nukleotiden oder können eine komplementäre Antisense-Nukleotidsequenz zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren aufweisen. Die Oligonukleotide können modifiziert sein, z. B. gekoppelt an ein Enzym, das mit einem chromophoren, fluoreszenten oder lumineszenten Substrat reagiert, oder verknüpft mit
Farbstoff-, Fluoreszenz-, Lumineszenz- oder radioaktiven Molekülen und/oder massenspektroskopisch wirksamen Verbindungen (Isotopentags). Weiter kann die Modifikation der Oligonukleotide eine oder mehr Modifikation(en) der Bindung zwischen den einzelnen
Nukleotiden sein, beispielsweise Phosphorothioate oder Methylphosphonate. Die exfmdungsgemäßerL
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elektronischen Biochips in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
hl einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, bzw. die Verwendung der von diesen Nukleinsäuren kodierten Proteine, in der medizinischen Forschung, beispielsweise in der Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, bzw. der von diesen Nukleinsäuren kodierten Proteinen, als Zielmoleküle (drug targets) zur Identifizierung von Wirkstoffen, welche die biologische Aktivität von Genen und/oder Proteinen, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, modulieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung dabei die Verwendung von Nukleinsäuren, die eine Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 1 bis 63 aufweisen, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon, und Proteine, die eine Sequenz gemäß der SEQ ID NO:64 bis 113 aufweisen, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon. Die zu verwendenden Nukleinsäuren und Proteine können auch Modifikationen, wie sie hierin definiert sind, aufweisen.
Die erfindungsgemäße Verwendung ermöglicht die Identifizierung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkstoffen, die gegen Erlαankungen und/oder (chronischen) lcrankheitsähnliche Zustände, die im Zusammenhang mit oxidativem Stress stehen, insbesondere Krebs, Herz-Kreislauf-Erlcrankungen, Arteriosklerose, Diabetes mellitus, entzündliche Erkrankungen im Immunsystem, rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankungen, vorzeitige Alterungsprozesse, degenerative und neurologische Krankheiten wie Schlaganfall und Multiple Sklerose sowie neurodegenerative Erkrankungen mit absterbenden Nervenzellen wie Demenz, M. Alzheimer, M. Parkinson, ALS oder M. Huntington, eingesetzt werden können bzw. diese Erkrankungen und/oder (chronischen) krarikheitsähnliche Zustände verhindern.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Nukleinsäuren oder Proteinen, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, zur Identifizierung, Überwachung, nosologischen Klassifizierung (Kategorisierung der Krankheitsstadien), Behandlung, Diagnose und/oder prognostischen Beurteilung von Erkrankungen und krankheitsähnlichen Zuständen, die durch oxidativen Stress von Zellen verursacht werden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung dabei die Verwendung von NuJdeinsJüreri^J^£ine_.Se4uenz^e^iäJß_d.er SE_QJ33_NθLl_bis_63 jiufwejsjn, spjvie Hpmologe^
Derivate, Varianten und Fragmente davon sowie die Verwendung von Proteinen, die eine
Sequenz gemäß der SEQ ID NO:64 bis 113 aufweisen, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Diagnoseverfahren zur Detektion und/oder Analyse von Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden.
Das Verfahren umfasst dabei die folgenden Schritte: a) Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe, b) Herstellung von cDNA oder optional vorherige Synthese von cRNA zur linearen Amplifizierung, c) Zugabe von Oligonukleotiden, die gegen ein Gen, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativem Stress reguliert ist, gerichtet sind und anschließende Amplifizierung der cDNA aus Schritt b), d) Analyse der Amplifikationsprodukte aus Schritt c).
Falls für die Analyse eine Signalverstärkung nötig ist, können die amplifϊzierten Produkte aus Schritt c) mit chemisch modifizierten Oligonukleotiden oder mit komplementären Nukleinsäuresequenzen auf einem Biochip hybridisiert werden.
In einer weiteren Ausfuhrungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Diagnoseverfahreri zur Detektion und/oder Analyse von Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, umfassend die folgenden Schritte:
a) Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe, wobei gegebenenfalls RNA direkt markiert wird, b) Zugabe von Oligonukleotiden, die gegen ein Gen, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativem Stress reguliert ist, gerichtet sind und anschließende Hybridisierung mit den isolierten Nukleinsäuren aus Schritt a), c) Analyse der Hybridisierungssignale.
Bei der isolierten Probe kann es sich um eine biologische Probe wie z.B. Gewebeproben wie des Gehirns, oder Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel, Serum oder cerebrospinaler Flüssigkeit
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RNA sein.
Bei den zu detektierenden Nukleinsäuren kann es sich um DNA oder RNA handeln, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, wobei DNA bevorzugt ist. Insbesondere bevorzugt kann hierbei die zu detektierende Nukleinsäure eine oder mehrere Nukleinsäuren sein, die eine Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 1 bis 63 aufweisen, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon. Wenn es sich bei der Nukleinsäure um RNA handelt, erfolgt vor der Nuklemsäureamplifikation eine reverse Trankription der RNA in cDNA. Wenn es sich bei der Nukleinsäure um RNA handelt, erfolgt die reverse Transkription und Nukleinsäureamplifikation vorzugsweise mittels einer RT-PCR.
Vorzugsweise erfolgt mit den erfindungsgemäßen Verfahren die Bestimmung der Höhe der Expressionsrate einer oder mehrerer Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden. Dazu wird vorzugsweise Gesamt-RNA oder rnRNA aus der Probe isoliert und die RNA revers in cDNA transkribiert. Zur linearen Amplifizierung wird nach einer ersten cDNA-Synthese eine in vitro Transkription mit einer DNA abhängigen RNA-Polymerase durchgerührt, an die sich eine weitere cDNA-Synthese mit der entstandenen cRNA anschließt. Zur direkten Markierung wird an die RNA z. B. alkalische Phosphatase gekoppelt und nachfolgend die Enzymaktivität detektiert. Vorzugsweise wird die cDNA dazu unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren amplifiziert, wobei eine quantitative PCR ausgeführt wird, wie sie im Stand der Technik bekannt ist. Ferner können die Expressionsraten der Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, über an sie hybridisierende Oligonukleotide nachgewiesen werden. Vorzugsweise ist dabei die Nukleinsäure, deren Expression zu quantifizieren ist, eine oder mehrere Nukleinsäure^), die eine Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 1 bis 63 aufweisen, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon.
Die Bestimmung der Expressionsrate der Nukleinsäuren ermöglicht z.B. die Diagnose, ob in den Zellen, aus oder mit denen die getestete Probe gewonnen wurde, oxidativer Stress vorlag, was in Folge eine Aussage über Identifizierung, Überwachung, nosologischen Klassifizierung, Diagnose und/oder prognostischen Beurteilung von Erkrankungen und krankheitsähnlichen Zuständen, die durch oxidativen Stress von Zellen verursacht werden, ermöglicht. Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die Diagnose von Erkrankungen und/oder
(chronischen) krankheitsähnlichen Zuständen, die im Zusammenhang mit oxidativem Stress
Atehen» insbesondere Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, _ArteripskJbrqse,_Diabetes_j3iellitusi entzündliche Erkrankungen im Immunsystem, rheumatoide Arthritis, entzündliche
Darmerkrankungen, vorzeitige Alterungsprozesse, degenerative und neurologische Krankheiten wie Schlaganfall und Multiple Sklerose sowie neurodegenerative Erkrankungen mit absterbenden Nervenzellen wie Demenz, M. Alzheimer, M. Parkinson, ALS oder M. Huntington. Weiter erfolgt mit den erfindungsgemäßen Verfahren die Identifizierung, Beurteilung und/oder Überwachung von Medikamentennebenwirkungen, die infolge von oxidativem Stress auftreten, der von den entsprechenden Medikamenten verursacht wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Durchführung der erfindungsgemäßen Analyse- und Detektionsverfahren, wobei das Kit mindestens ein Primerpaar zur Durchführung der Nukleinsäureamplifikation gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren umfasst. Dabei umfassen die Primer der entsprechenden Primerpaare jeweils DNA-Sequenzen, die an Nukleinsäuren hybridisieren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden. Vorzugsweise umfassen die Primer jeweils DNA-Sequenzen, die an eine oder mehr Nukleinsäure^) hybridisieren, die eine Sequenz gemäß der SEQ ID NO :1 bis 63 aufweisen, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon. Ferner kann das erfindungsgemäße Kit entsprechend des auszuführenden Verfahrens zur Nukleinsäureamplifϊkation geeignete Reagenzien wie Puffer, Nukleotide und Enzyme, z. B. DNA-Polymerasen, sowie mindestens eine geeignete Referenznuldeinsäure(n) umfassen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Proteinen, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, zur Identifizierung, Überwachung, nosologischen Klassifizierung, Behandlung, Diagnose und/oder prognostischen Beurteilung von Erkrankungen und krankheitsähnlichen Zuständen, die durch oxidativen Stress von Zellen verursacht werden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung dabei die Verwendung von Proteinen, die eine Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 64 bis 113 aufweisen, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Analyse- und/oder Diagnoseverfahren zur Bestimmung der Mengen der Proteine, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden. Das Verfahren umfasst dabei die folgenden Schritte:
a) Diirchfuhrung einer Mengenbestimmung mindestens eines Proteins, das im
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isolierten Probe, vorzugsweise aus biologischem Material wie Gehirn, CSF, Blut, Speichel. b) Vergleich mit den in einer Referenzprobe bestimmten Mengen mindestens eines
Proteins, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, wobei die Referenzprobe von einem nicht an einer degenerativen Erkrankung leidenden Subjekt stammt,
wobei eine erhöhte Menge des mindestens einen Proteins in der in Schritt a) getesteten Probe im Vergleich zu der Menge des entsprechenden Proteins in der Referenzprobe auf das Vorliegen einer degenerativen Erkrankung oder das Risiko, an einer degenerativen Erkrankung zu erkranken, hinweist.
Vorzugsweise erfolgt die Mengenbestirrrmung mindestens eines Proteins, das ausgewählt wird aus der Gruppe der Proteine, die eine Sequenz gemäß der SEQ HD NO.64 bis 113 aufweisen, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon.
Die Durchführung einer Mengenbestimmung erfolgt vorzugsweise immunologisch, beispielsweise mittels eines ELISA-Assays, Western-Blots, RIA, Immunhistochemie oder Immuncytochemie. Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Proteinmengenbestimmung immunologisch unter Verwendung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper oder anderer Moleküle durchgeführt, die spezifisch an ein Protein, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, binden bzw. spezifisch an ein Protein binden, das ausgewählt wird aus der Gruppe der Proteine, die eine Sequenz gemäß der SEQ DD NO: 64 bis 113 aufweisen, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon. Die Moleküle können mit den nachstehend beschriebenen therapeutischen oder prophylaktischen Bindern identisch sein und können Biomoleküle oder Chemikalien, insbesondere kleine chemische Moleküle sein, wie für Modulatoren der Expression bzw. biologischen Aktivität nachstehend beschrieben wird. Die Mengenbestimmung kann bevorzugt auch nicht immunologisch mit NMR- oder PET-Sonden erfolgen. Ebenso bevorzugt ist die Quantifizierung mittels Massenspektroskopie-Methoden. Die zu bestimmenden Proteine können auch Modifikationen, wie oben definiert sind, aufweisen.
In einer bevorzugten Ausfiihrungsform wird die Probe mit einem Antikörper oder Binder in Kontakt gebracht und die Menge des entstehenden Komplexes aus Antikörper und Protein bzw. J3mder_undPxQtei]iinitMs_des^ben4^n^^ können chemisch modifiziert sein. Die Antikörper oder Binder können beispielsweise kovalent mit einem Enzym gekoppelt sein, das mit einem (chromophoren) Substrat reagiert, wobei die Reaktion - und damit der entstandene Komplex aus Antikörper und Protein bzw. Binder und
Protein - mittels der resultierenden Fluoreszenz, Lumineszenz oder Phosphoreszenz visualisiert und nachgewiesen werden kann. Weiter können die Antikörper oder Binder direkt mit Farbstoff-,
Fluoreszenz-, Lumineszenz- oder radioaktiven Molekülen verknüpft sein bzw. massenspektroskopisch wirksame Isotopen enthalten, so dass der Nachweis des entstandenen Komplexes aus Antikörper und Protein bzw. Binder und Protein direkt ohne zwischengeschalteten enzymatischen Reaktionsschritt visualisiert werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Proteinchips zur Detektion von Antikörpern gegen Proteine, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, in Patientenmaterial, wie Blut, Serum, CSF, Gehirn, Speichel verwendet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die Proteinchips Antikörper bzw. Binder zur Detektion der erfindungsgemäßen Proteine, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, in Patientenmaterial, wie Blut, Serum, CSF, Gehirn, Speichel.
Die Bestimmung der Proteinmenge eines Proteins, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, ermöglicht die Identifizierung, Überwachung, nosologische Klassifizierung, Diagnose und/oder prognostischen Beurteilung von Erkrankungen und kranldieitsähnlichen Zuständen, die durch oxidativen Stress von Zellen verursacht werden, ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Diagnose von Erkrankungen und/oder (chronischen) krankheitsähnlichen Zuständen, die im Zusammenhang mit oxidativem Stress stehen, insbesondere Krebs, Herz-Kxeislauf-Erkrankungen, Arteriosklerose, Diabetes mellitus, entzündliche Erkrankungen im Immunsystem, rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankungen, vorzeitige Alterungsprozesse, degenerative und neurologische Krankheiten wie Schlaganfall und Multiple Sklerose sowie neurodegenerative Erkrankungen mit absterbenden Nervenzellen wie Demenz, M. Alzheimer, M. Parkinson, ALS oder M. Huntington. Weiter erfolgt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Identifizierung, Beurteilung und/oder Überwachung von Medikamentennebenwirkungen, die infolge von oxidativem Stress auftreten, der von den entsprechenden Medikamenten verursacht wird.
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des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Mengenbestimmung mindestens eines Proteins, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen, Stress in Zellen reguliert wird. Das Kit umfasst dabei mindestens einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper oder anderen Binder, der für ein Protein, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, spezifisch ist und vorzugsweise für ein Protein spezifisch ist, das ausgewählt wird aus der Gruppe der Proteine, die eine Sequenz gemäß der SEQ ID NO:64 bis 113 sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon. Ferner kann das erfindungsgemäße Kit entsprechend des auszuführenden Verfahrens zur Proteinmengenbestimmung geeignete Reagenzien wie Puffer sowie (ein) geeignete(s) Referenzprotein(e) umfassen. Der erfindungsgemäße Kit könnte ferner NMR-Tags, PET-Sonden, Isotopentags für Massenspektroskopie und/oder Aptamere enthalten.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, zur Identifizierung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkstoffen, welche die Expression von Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, bzw. die die biologische Aktivität der von diesen Nukleinsäuren kodierten Proteinen modulieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung dabei die Verwendung von Nukleinsäuren, die eine Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 1 bis 63 aufweisen sowie Proteine, die Sequenzen gemäß der SEQ ID NO:64 bis 113 aufweisen und deren Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente.
In einer Ausfuhrungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkstoffen, welche die Expression von Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
a) Bereitstellen einer Zelle, die eine Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, exprimiert b) in Kontakt bringen der Zelle mit einer Kandidatensubstanz und c) Vergleichen der Expression der Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, mit der Expression einer Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, wenn die Kandidatensubstanz nicht hinzugefügt wird,
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Nuklemsäure^ _cüe_ ύn chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, anzeigt, dass die Kandidatensubstanz ein Modulator der Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkstoffen, die die biologische Aktivität von Proteinen modulieren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
a) Bereitstellen einer Zelle, die ein Protein, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, enthält bzw. Immobilisieren mindestens eines Proteins, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird auf einem Trägermaterial b) in Kontakt bringen der Zelle bzw. des Proteins auf dem Trägermaterial mit einer Kandidatensubstanz und c) Detektion der Menge der gebundenen Kandidatensubstanz an ein Protein, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird mittels biophysikalischer Methoden wie Plasmon-Surface-Resonanz, FRET, quantitative
HPLC, BioAssays und Massenspektroskopie,
wobei eine Bindung anzeigt, dass es sich um einen potentiellen Modulator handelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Bestimmung der Expression der Nukleinsäure bzw. die Menge des von dieser Nukleinsäure exprimierten Proteins mittels einer RNA-Analyse, insbesondere durch einen Northern-Blot, eine RNA/cDNA Hybridisierung mit evtl. Signalverstärkung oder eine RT-PCR, oder mittels Proteinanalyseverfahren, insbesondere durch eine Western-Blot-Analyse oder ELISA durchgeführt werden.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkstoffen unter Verwendung von Genbanken, Expressionsbanken, Naturstoffbanken, Banken mit kleinen chemischen Molekülen, rekombinatorisch chemisch hergestellten Leitstrukturen und dergleichen ausgeführt.
Die erfindungsgemäß verwendeten Kandidatensubstanzen können Biomoleküle oder Chemikalien .sein, insbesondere Meine chemische Moleküle wie _sie nachstehend definiert sind.
Beispiele für Biomoleküle, die als Modulatoren der Expression bzw. biologischen Aktivität wirken können, sind: Nukleinsäuren wie PoIy- und Oligonukleotide, Purine, Pyrimidine, Polypeptide, Antikörper, Oligosaccharide, Polysaccharide, Lipide, Fettsäuren, Steroide oder strukturelle Analoga, Fragmente oder Derivate davon und/oder Kombinationen daraus.
Beispiele für Modulatoren der Expression sind: micro-RNA, siRNA oder weitere dem Fachmann bekannte Moleküle der RNA-Interferenz (RNAi); Oligonukleotide, Polynukleotide, Antisense-
Nukleinsäuren, PNA, Aptamere oder Ribozyme, die z.B. als Transkriptionsaktivatoren oder
-inhibitoren bzw. Translationsaktivatoren oder -inhibitoren spezifische Auswirkungen auf die
Transkription und/oder Translation von Nukleinsäuren haben, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden. Modulatoren der Expression können Modifizierungen aufweisen. Beispiele für Modulatoren der biologischen Aktivität sind: polymere Formen von Aminosäuren beliebiger Länge (z.B. Polypeptide, Proteine), die beispielsweise natürlich vorkommende oder unnatürliche Aminosäuren beinhalten und als einzelne Aminosäurekette oder als multimeres Molekül vorkommen; Polypeptide umfassend Aminosäure-Analoga, modifizierte oder derivatisierte Aminosäuren; Polypeptide mit zyklischem oder bizyklischem Peptid-Rückgrat; Fusionsproteine, Depsipeptide, PNAs oder Peptidomimetika. Modulatoren der biologischen Aktivität können Modifizierungen aufweisen.
Modulatoren der biologischen Aktivität können weiter eine Wirkung auf die Bindungseigenschaften der Proteine haben.
Bevorzugte Modulatoren der biologischen Aktivität sind Antikörper, beispielsweise polyklonale oder monoklonale Antikörper, die agonistisch, antagonistisch oder neutralisierend auf die biologische Aktivität von Proteinen wirken, die im Zusammenhang mit oxidativen Stress in Zellen reguliert sind und an die die Antikörper binden. Vorzugsweise sind die Antikörper humanen Ursprungs oder humanisiert. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäß als Modulatoren wirkenden Antikörper mindestens eine der folgenden Domänen: variable Region eines Immunglobulins, konstante Region eines Immunglobulins, schwere Kette eines Immunglobulins, leichte Kette eines Immunglobulins und antigenbindene Region eines Immunglobulins.
Weiter beinhalten Modulatoren der biologischen Aktivität auch aktive Fragmente eines Antikörpers, die spezifisch an ein Antigen oder ein Epitop eines Proteins binden, das im Zusammenhang mit oxidativen Stress in Zellen reguliert wird. Ein aktives Fragment kann ein Fab-Fragment, ein Fc-Fragment, ein Fragment des variablen Bereichs der schweren Kette oder der leichten Kette sein.
Weiter beinhalten Modulatoren der biologischen Aktivität auch Antikörper oder aktive Fragmente davon, die spezifisch an Liganden eines Proteins binden, das im Zusammenhang mit oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, und somit die Aktivität des Liganden modulieren.
Die Modulatoren der biologischen Aktivität von Proteinen, die im Zusammenhang mit oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, können mit einem therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkstoff verbunden sein. Diese Bindung kann kovalent sein. Geeignete Wirkstoffe sind beispielsweise: radioaktive Isotope, unspezifische Antioxidanzien, Nervenwachstumsfaktoren sowie Aggregationshemmer.
Beispiele für Chemikalien als Modulatoren der Expression von Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, bzw. als Modulatoren der biologischen Aktivität der von diesen Nukleinsäuren kodierten Proteine sind: Chemikalien aus allen chemischen Klassen, synthetische, halb-synthetische oder natürlich vorkommende, anorganische oder organische Moleküle, kleine Moleküle oder makromolekulare Komplexe oder metallische Elemente, wie Lithium, oder Gase. Beispiele für oben genannte kleine chemische Moleküle sind: kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mindestens etwa 30 und weniger als etwa 5000 Dalton.
Für die Interaktion mit Nukleinsäuren oder Proteinen, insbesondere über Wasserstoffbrückenbindungen, können die als Modulatoren wirkenden Chemikalien und kleinen chemischen Moleküle mindestens eine der folgenden funktionellen Gruppen aufweisen: Hydroxyl-, Amino-, Imino-, Carboxyl- oder Carbonyl-Gruppe. Ferner können die als Modulatoren wirkenden Chemikalien und kleinen chemischen Moleküle eine monozyklische oder polyzyklische Kohlenstoffstruktur oder eine heterozyklische Struktur sein oder aufweisen, und/oder eine aromatische oder polyaromatische Struktur sein oder aufweisen, die mit mindestens einer der oben genannten funktionellen Gruppen substituiert ist.
In siner_he_vχjrzugten Ausfuhrungsform sind. Wirkstoffe, _die_ die. biologische .Aktivität von Proteinen modulieren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, Wirkstoffe, die an Proteine binden, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden (so genannte „Binder"). Um. solche Binder zu identifizieren, werden bevorzugt Proteinchips verwendet, die Proteine umfassen, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, insbesondere Proteine, die eine Sequenz gemäß der SEQ E) NO:64 bis 113 umfassen sowie Derivate, Varianten, Homologe und Fragmente davon.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkstoffen, welche die Expression von Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, bzw. die die biologische Aktivität der von diesen Nukleinsäuren kodierten Proteinen modulieren, wobei das Kit mindestens eine Zelle umfasst, die eine Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, exprimiert. Vorzugsweise umfasst die Zelle eine oder mehr Nukleinsäure(n), die eine Sequenz gemäß der SEQ ID NO :1 bis 63 aufweisen, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon.
Die für die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, bzw. Nukleinsäuren die für Proteine kodieren, die im Zusammenhang mit oxidativen Streß reguliert werden, und die vorzugsweise die Sequenzen der SEQ ED NO: 1 bis 63 aufweisen, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon, können funktional mit regulatorischen Kontrollelementen verbunden sein, die eine effektive Expression, d.h. Transkription und/oder Translation in Wirtszellen und oder Wirtsorganismen erlauben. Regulatorische Kontrollelemente sind beispielsweise konstitutive, induzierbare, zell- oder gewebespezifische Promotoren, wie sie dem Fachmann als Stand der Technik bekannt sind. Weitere regulatorische Kontrollelemente sind Terminatorsequenzen und Polyadenylierungssignalsequenzen. Die mit den regulatorischen Kontrollelementen funktional verbundenen Nukleinsäuren können in einem Vektor, beispielsweise in einem Plasmid, Cosmid, Phagmid, Viroid, Virus, vorzugsweise Adenovirus und Baculovirus, vorliegen. Weiter können die mit den regulatorischen Kontrollelementen funktional verbundenen Nukleinsäuren in den Wirtszellen und/oder Wirtsorganismen zusammen mit einem Markergen vorliegen, wobei das Markergen zusammen mit den mit den regulatorischen Kontrollelementen funktional verbundenen Nukleinsäuren auf einem Vektor oder auf einem ran diesem y^ktor.unterschiejilicherLzwsilen Vektor vorliegen kann. Jm zweiten Fall wird der Markergen-umfassende Vektor zusammen mit dem Vektor, der die mit den regulatorischen Kontrollelementen funktional verbundene Nukleinsäure umfasst, in die Wirtszelle oder den Wirtsorganismus eingebracht.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert sind, bzw. Nukleinsäuren, die ein im Zusammenhang mit oxidativem Stress reguliertes Protein kodieren, und die vorzugsweise die Sequenzen der SEQ ED NO: 1 bis 63 aufweisen, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon, zur Herstellung transgener Zellen und nicht-humaner Organismen, vorzugsweise eines transgenen nicht-humanen Säugertiers.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, umfassend mindestens eine rekombinante Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, bzw. mindestens 1 rekombinante Nukleinsäure, die ein im Zusammenhang mit oxidativem Stress reguliertes Protein kodiert, und die vorzugsweise die Sequenzen der SEQ HD NO: 1 bis 63 aufweist, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon, wobei die rekombinante Nukleinsäure mit regulatorischen Kontrollelementen funktional verbunden ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein nicht-humaner Organismus, vorzugsweise ein Säugetier, umfassend mindestens eine rekombinante Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, bzw. mindestens 1 rekombinante Nukleinsäure, die ein im Zusammenhang mit oxidativem Stress regulierte Protein kodiert, und die vorzugsweise die Sequenzen der SEQ ID NO :1 bis 63 aufweist, sowie Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente davon, wobei die rekombinanten Nukleinsäure mit regulatorischen Kontrollelementen funktional verbunden ist.
Ein weiterer Aspekt ist die therapeutische Verwendung von Nukleinsäuren und Proteinen, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, in der Medizin. Vorzugsweise werden dabei Nukleinsäuren und Proteine verwendet, welche die Sequenzen gemäß SEQ ID NO :1 bis 113 aufweisen sowie deren Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente.
Beispiele
Beispiel 1 :
Die Zunahme der MAC30-mRNA in NT2-N Nervenzellen (Andrews P. W., Dev. Biol., 103, pp
285 - 293, 1984; Pleasure S. J., Page C, Lee V.M.-Y., J. Neurosci., 12, pp 1802 - 1815, 1992) wurde in Micro-Array-Analysen unter Verwendung fluoreszenzmarkierter cDNA nach Behandlung der Zellen unter serumfreien Bedingungen mit chronisch subletalen Konzentrationen des oxidativen Stressors Haloperidol (Fa Sigma; Katalog-Nr. H-1512). nachgewiesen. Geeignete Bedingungen für eine optimale Überlebensrate der Zellen wurden mit dem Live/Dead-Viabilitäts/Cytotoxizitäts Test (Firma Molecular Probes) gemäß der Anleitung des Herstellers ermittelt. Bei einer Konzentration des oxidativen Stressors im Bereich von 1,0 - 25 μM waren mehr als 75% der Nervenzellen mehr als 3 Tage nach dem Zeitpunkt der Probennahme für Expressionproflling Experimente mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese bzw. DNA-Microarrays lebend. Zur weiteren Charakterisierung der Auswirkung auf die Zellen wurde der Gehalt an ROS und RNS sowie der Redoxstatus der Zellen ermittelt. Zur Bestimmung von Gesamtzell-ROS wurde 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein-Diacetat (Fa. Sigma, Katalog-Nr. D6883) eingesetzt. Zellen einer 10 cm Schale wurden in PBS abgekratzt, ein Aliquot mit 5 μM DCFDA versetzt und 1 h bei 37°C inkubiert. Anschliessend wurden die Zellen per Ultraschall homogenisiert, zentrifugiert (20 Minuten, 40C, 20.000 x g) und die Fluoreszenz des Überstandes vermessen. Als Standard diente DCF. Alle Daten wurden mit der Proteinkonzentration normalisert. Die relative Zunahme an ROS wurde im Verhältnis zur Kontrolle berechnet. Weiterhin wurden ROS mit Hilfe von Dihydroethidium (DHE; Fa. Sigma Kat.-Nr. D7008)) bestimmt. Ein Aliquot der abgeschabten Zellen wurden mit 5 μM DHE versetzt, 1 Stunde bei 37°C inkubiert, analog der DCFDA-Prozedur aufgearbeitet und die Fluoreszenz des Überstandes bestimmt. Die proteinbereinigte Veränderung an mitochondrialen ROS wurde in Relation zur unbehandelten Kontrolle berechnet.
Die in die verschiedenen Experimente eingesetzten Konzentrationen an Haloperidol lagen zwischen 1,0 - 25 μM. Die Konzentrationen des Stressors können aber auch höher oder niedriger als der angegebene Bereich sein. Die MAC30-mRNA Zunahme kann durch eine quantitative Real-time RT-PCR (qRTRTPCR) Analyse mit Fluoreszenzmarkierung durch SYBR-Green 1 quantifiziert werden. Nach 8-tägiger Behandlung der Zellen beträgt die Zunahme 50 % oder mehr und kann bei längerer Behandlung bis zu 200 % oder mehr erreichen. Für die Analyse der MAC30 mRNA durch qRTRTPCR wurde das PCR-Primer Paar MAC30-Forl (5'- AAGCCATCTTCCTTAGCCTCCCAAGTA-S1) (SEQ ID NO: 114) und MAC-30-Rev2 (5'-AAAACCCTGTCTCCACACACACAAAAA-S') (SEQ ID NO: 115) eingesetzt. Mit diesem Primer-Paar wurde ein cDNA-Fragment amplifiziert, das eine kodierende Sequenz für ein Polypeptid der Länge 69 Aminosäuren aufweist (Accession- Nummem NPJQ55.3BS .und AAH4565_5).. Mit_ djes_em Primerpaar, .wurde .auch _ ein cDNA- Fragment amplifiziert, das eine kodierende Sequenz für ein Polypeptid der Länge 176 Aminosäuren aufweist (Accession-Nummer AAH91504). Darüber hinaus wurde mit diesem Primerpaar ein cDNA-Fragment amplifiziert, das eine kodierende Sequenz für ein Polypeptid der Länge 189 Aminosäuren aufweist (Accession-Nummer AAA16188). Bei diesen Fragmenten handelt es sich um unterschiedlich lange Teilstücke desselben Proteins, die bis auf einen Aminosäureaustausch identisch sind. Die unterschiedlichen Längen beruhen auf der unterschiedlichen Position des ersten ATG-Startcodons, das in NP_055388 und AAH45655 auf Grund einer Sequenzvariation später auftritt. Im Falle von AAA16188 beginnt der offene Leserahmen (ORF) mit dem ersten Codon in der Sequenz, das kein ATG darstellt. AAH91504 nutzt hingegen das erste ATG dieser Sequenz. Darüber hinaus können mit diesem Primerpaar weitere mRNAs nachgewiesen werden, die weitere unterschiedlich lange MAC30-Proteine kodieren und eine Ähnlichkeit von mindestens 50 % aufweisen. Beispiel 2:
Die Zunahme der BRI3-mRNA in NT2-N Nervenzellen wurde in Micro-Array- Analysen unter Verwendung von fluoreszenzmarkierter cDNA nach Behandlung mit Haloperidol (wie in Beispiel 1 beschrieben) nachgewiesen. Diese Zunahme kann durch eine quantitative Real-time RT-PCR (qRTRTPCR) Analyse mit Fluoreszenzmarkierung durch SYBR-Green 1 quantifiziert werden. Die Zunahme ist 3 Tage nach Behandlung festzustellen. Nach 8-tägiger Behandlung der Zellen beträgt die Zunahme bereits 40 % oder mehr und kann bei längerer Behandlung bis zu 200 % oder mehr erreichen. Für die Analyse der BRI3 mRNA durch qRTRTPCR eignet sich das PCR-Primer Paar BRB-Forl (5'-CTTTGGGTTCATTTGCTGTTTTG-S ') (SEQ ID NO: 116) und BRI3-Rev2 (S'-CATTAGAAAAAGAGAGCTGGGTGTA-SO (SEQ ID NO: 117). Mit diesem Primer-Paar wurden cDNA-BRB -Fragmente amplifiziert, die kodierende Bereiche für Polypeptide der Länge 125 Aminosäuren aufweisen.
Beispiel 3: Die Zunahme der GlP3-mRNA in NT2-N Nervenzellen kann in Micro-Array- Analysen mit fluoreszenzmarkierter cDNA nach Behandlung mit Haloperidol (wie in Beispiel 1 beschrieben) nachgewiesen werden. Diese Zunahme wurde durch eine quantitative Real-time RT-PCR (qRTRTPCR) Analyse mit Fluoreszenzmarkierung durch SYBR-Green 1 quantifiziert. Bereits nach 3 Tagen ist eine deutliche Zunahme nachzuweisen, die nach 8-tägiger Behandlung 50 % oder mehr und bei weiterer Behandlung bis zu 400 % betragen kann. Für die Analyse der G1P3 mRNA durch qRTRTPCR eignet sich das PCR-Primer Paar GlP3-Forl (51- GCTATT_CACAGATilCGAACATAGTA-3:). CSEQ ID _ NO: 118). . . und _G1P3-Rev2 . (5.1- GGAGAGTGATAGACAAAGTTCTGGA-S1) (SEQ ID NO: 119). Mit diesem Primer-Paar kann ein cDNA-Fragment amplifiziert werden, das einen kodierenden Bereich für ein Polypeptid der Länge 134 Aminosäuren aufweist. Mit diesem Primerpaar wurde auch ein cDNA-Fragment amplifiziert, das einen kodierenden Bereich für ein Polypeptid einer Länge 138 Arninosäuren aufweist. Darüber hinaus wurde mit diesem Primerpaar auch ein cDNA-Fragment amplifiziert, das einen kodierenden Bereich für ein Polypeptid einer Länge 130 Aminosäuren aufweist. Die Unterschiede lassen sich durch geringe Variationen in der Transkriptlänge im kodierenden Bereich erklären.
Beispiel 4:
Die Zunahme der LOC222171-mRNA in NT2-N Nervenzellen kann in Micro-Array- Analysen mit fluoreszenzmarkierter cDNA nach Behandlung mit Haloperidol (wie in Beispiel 1 beschrieben) nachgewiesen werden. Diese Zunahme wurde durch eine quantitative Real-time RT-PCR (qRTRTPCR) Analyse mit Fluoreszenzmarkierung durch SYBR-Green 1 quantifiziert. Nach 15 Tagen Haloperidol-Behandlung ist eine deutliche Zunahme nachzuweisen, die 50 % oder mehr beträgt und bei längerer Behandlung weiter ansteigen kann. Für die Analyse der LOC222171 mRNA durch qRTRTPCR eignet sich das PCR-Primer Paar LOC222171-Forl (51- TGGCTGTTATTTAGGACTCTGTGGAAA-S1) (SEQ ID NO: 120) und LOC222171-Rev2 (5'- TCCCCCACTCCTTCACTTAAGGTATAA-S1) (SEQ ID NO: 121). Mit diesem Primer-Paar kann ein cDNA-Fragment amplifiziert werden, das einen kodierenden Bereich für ein Polypeptid der Länge 129 Aminosäuren aufweist.
Beispiel 5:
Die Zunahme der CUEDCl -mRNA in NT2-N Nervenzellen kann in Micro-Array- Analysen mit fluoreszenzmarkierter cDNA nach Behandlung der Zellen mit Haloperidol (wie in Beispiel 1 beschrieben) nachgewiesen werden. Diese Zunahme wurde mit einer quantitativen Real-time RT-PCR (qRTRTPCR) Analyse mit Fluoreszenzmarkierung durch SYBR-Green 1 näher quantifiziert. Nach 15 Tagen chronischen oxidativen Stresses ist eine mehr als 30 % ige Zunahme nachzuweisen, die bei längerer Behandlung weiter ansteigen kann. Für die Analyse der CUEDCl mRNA durch qRTRTPCR eignet sich das PCR-Primerpaar CUEDCl-Forl (51- CTTATTCAGGGACAAGCTGAAACACAT-S1) (SEQ ID NO: 122) und CUEDC1-Rev2 (51- AGTGTTTCCTCTTTGACTTCCTCATTTT-3') (SEQ ID NO: 123). Mit diesem Primer-Paar kann ein cDNA-Fragment amplifiziert werden, das einen kodierenden Bereich für ein Polypeptid der Länge 386 Aminosäuren aufweist. Mit diesem Primerpaar kann auch ein cDNA-Fragment amplifiziert werden, .das. .einen kodierenden Bereich, für . ein Polypeptid . der. Länge 358 Aminosäuren aufweist. Die Möglichkeit zwei Polypeptide nachzuweisen, liegt daran, dass AK000977 eine Deletion im kodierenden Bereich aufweist, wodurch ein um 28 Aminosäuren kürzeres Polypeptid entsteht, das sich ansonsten nur durch einen konservativen Aminosäureaustausch bei Aminosäure 47 des reifen Proteins von den anderen Primärstrukturen unterscheidet.
Beispiel 6: Die Zunahme der NPC2-mRNA in NT2-N Nervenzellen nach Behandlung mit Haloperidol (wie in Beispiel 1 beschrieben) wurde in Micro-Array-Analysen mit fluoreszenzmarkierter cDNA nachgewiesen. Diese Zunahme wurde durch eine quantitative Real-time RT-PCR (qRTRTPCR) Analyse mit Fluoreszenzmarkierung durch SYBR-Green 1 quantifiziert. Bereits nach 3 Tagen Behandlung ist eine signifikante Zunahme der NPC2-mRNA im Vergleich zu unbehandelten Nervenzellen nachzuweisen. Nach 15 Tagen chronischen subletalen oxidativen Stresses liegt die Zunahme bei 50 % oder mehr und kann bei längerer Behandlung weiter ansteigen. Für die Analyse der NPC2-mRNA durch qRTRTPCR eignet sich das PCR-Primer Paar NPC2-Forl (5 - AATTAACTGCCCTATCCAAAAAGAC-S') (SEQ ID NO: 124) und NPC2-Rev2 (51- CAGAAGAGACTTTGGTTTTTGTCAT-S1) (SEQ ID NO: 125). Mit diesem Primer-Paar wurde ein cDNA-Fragment amplifiziert, das einen kodierenden Bereich für ein Polypeptid der Länge 151 Aminosäuren aufweist. Mit diesem Primerpaar wurde auch ein cDNA-Fragment amplifiziert, das einen kodierenden Bereich für ein Polypeptid der Länge 151 Aminosäuren aufweist, welches sich durch zwei konservative Aminosäureaustausche vom erstgenannten Polypeptid unterscheidet.
Beispiel 7:
Die Zunahme der SCD-mRNA nach Behandlung von NT2-N Nervenzellen mit Haloperidol (wie in Beispiel 1 beschrieben) wurde in Micro-Array-Analysen mit fluoreszenzmarkierter cDNA nachgewiesen. Diese Zunahme wurde durch eine quantitative Real-time RT-PCR (qRTRTPCR) Analyse mit Fluoreszenzmarkierung durch SYBR-Green 1 quantifiziert. Nach 15-tägiger Behandlung ist eine Zunahme der SCD-mRNA um 50 % oder mehr im Vergleich zu unbehandelten Nervenzellen nachzuweisen. Für die Analyse der SCD-mRNA durch qRTRTPCR eignet sich das PCR-Primer Paar SCD-Forl (5'-AAAGATGATATATATGACCCCACCT-S') (SEQ ID NO: 126) und SCD-Rev2 (5'-CCAAGTGTAGCAGAGACATAAGGAT-S') (SEQ ED NO: 127). Mit diesem Primer-Paar wurde ein cDNA-Fragment amplifiziert, das einen kodierenden Bereich für ein Polypeptid der Länge 359 Aminosäuren aufweist. Mit diesem
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arnplifiziert,_das_einen.ko.dieren.den Bereich_fur ein Polypeptid der Länge 366 Aminosäuren aufweist. Mit diesem Primer-Paar wurde darüber hinaus ein cDNA-Fragment amplifiziert, das einen kodierenden Bereich für ein Polypeptid der Länge 355 Aminosäuren aufweist. Mit diesem Primer-Paar wird ferner ein cDNA-Fragment amplifiziert, das einen kodierenden Bereich für ein Polypeptid der Länge 237 Aminosäuren aufweist.
Beispiel 8: Die Zunahme des IDIl Proteins (IDIl = Isopentenyl-diphosphate delta isomerase 1; = Isopentenyl diphosphate dimethylallyl diphosphate isomerase 1) nach Behandlung von NT2-N Nervenzellen mit Haloperidol (wie in Beispiel 1 beschrieben) wurde mit einer 2 dimensionalen Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließender massenspektroskopischer Identifizierung des Proteinspots nachgewiesen. Während einer 15 tägigen Behandlung mit Haloperidol nimmt IDIl-Protein um 30 % oder mehr in seiner Menge zu.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Nukleinsäuren oder der von diesen Nukleinsäuren kodierten Proteine, wobei die Nukleinsäuren und/oder die Proteine im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, zur Identifizierung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkstoffen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von degenerativen Erkrankungen, Identifizierung, Überwachung, nosologischen Klassifizierung, Diagnose, prognostischen Beurteilung und Therapie von degenerativen Erkrankungen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuren eine Sequenz gemäß SEQ ID NO:1- 63 und die Proteine eine Sequenz gemäß SEQ ID NO:64-113 aufweisen, sowie deren Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die degenerative Erkrankung eine neurodegenerative Erkrankung ist.
4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die neurodegenerative Erkrankung M. Alzheimer, eine Lewy Body Erkrankungen wie M. Parkinson, eine diffuse Lewy Body Erkrankung, M. Huntington, Amyotrophe Laterale Sklerose (ALS), Prion-Erkrankung (PrD), Creutzfeldt- Jakob Erkrankung, Down-Syndrom, firontotemporale Demenz (FTD), Corticobasale
Degeneration, Multiinfarkt-Demenz, progressive supranukleäre Lähmung, . Multisystematrophie und_Kors_akpffs Syndrom ist.
5. Verfahren zur Identifizierung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkstoffen, welche die Expression von Nukleinsäuren und/oder Proteinen, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, modulieren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Zelle, die eine Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, exprimiert b) in Kontakt bringen der Zelle mit einer Kandidatensubstanz und c) Vergleichen der Expression der Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, mit der Expression einer
Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, wenn die Kandidatensub stanz nicht hinzugefügt wird, wobei eine Veränderung der Expression der Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, anzeigt, dass die Kandidatensubstanz ein Modulator der Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, ist.
6. Verfahren zur Identifizierung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkstoffen, die die biologische Aktivität von Proteinen modulieren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Zelle, die ein Protein, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, enthält bzw. Immobilisieren mindestens eines Proteins, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird auf einem Trägermaterial b) in Kontakt bringen der Zelle bzw. des Proteins auf dem Trägermaterial mit einer Kandidatensubstanz und c) Detektion der Menge der gebundenen Kandidatensubstanz an ein Protein, das im
Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird mittels biophysikalischer Methoden wie Plasmon-Surface-Resonanz, FRET, quantitative HPLC, BioAssays und Massenspektroskopie, wobei eine Bindung anzeigt, dass es sich um einen potentiellen Modulator handelt.
7. Kit zur Durchfuhrung des Verfahrens nach Anspruch 5 oder 6 zur Identifizierung von - therapeutischen . und/oder prophylaktischen . Wirkstoffen, welche . die. Expje_ssion von
Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, bzw. die die biologische Aktivität der von diesen Nukleinsäuren kodierten Proteinen modulieren, umfassend mindestens eine Zelle, die eine Nukleinsäure, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, exprimiert.
8. Verfahren zur Detektion und/oder Analyse von Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, umfassend die folgenden Schritte: a) Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe, b) Herstellung von cDNA oder optional vorherige Synthese von cRNA zur linearen Amplifizierung, c) Zugabe von Oligonukleotiden, die gegen ein Gen, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativem Stress reguliert ist, gerichtet sind und anschließende Amplifizierung der cDNA aus Schritt b), d) Analyse der Amplifikationsprodukte aus Schritt c).
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Analyse mittels einer Hybridisierung von chemisch modifizierten Oligonukleotiden oder mit komplementären Nuldeinsäuresequenzen auf einem Biochip durchgeführt wird.
10. Verfahren zur Detektion und/oder Analyse von Nukleinsäuren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, umfassend die folgenden Schritte: a) Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe, wobei gegebenenfalls RNA direkt markiert wird, b) Zugabe von Oligonukleotiden, die gegen ein Gen, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativem Stress reguliert ist, gerichtet sind und anschließende Hybridisierung mit den isolierten Nukleinsäuren aus Schritt a), c) Analyse der Hybridisierungssignale.
11. Analyse- und/oder Diagnoseverfahren zur Bestimmung der Mengen der Proteine, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden, umfassend die folgenden Schritte: a) Durchführung einer Mengenbestimmung mindestens eines Proteins, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, in einer isolierten Probe, b) Vergleich .mit den. in. einer Rgfetenzprpbe _ bestimmten Mengen mindestens eines Proteins, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, wobei die Referenzprobe von einem nicht an einer degenerativen Erkrankung leidenden Subjekt stammt, wobei eine erhöhte Menge des mindestens einen Proteins in der in Schritt a) getesteten Probe im Vergleich zu der Menge des entsprechenden Proteins in der Referenzprobe auf das Vorliegen einer degenerativen Erkrankung oder das Risiko, an einer degenerativen Erkrankung zu erkranken, hinweist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe eine biologische Probe z.B. Gewebeprobe wie des Gehirns, oder Körperflüssigkeit wie Blut, Speichel, Serum oder cerebrospinaler Flüssigkeit (CSF) ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 und 8 bis 12, wobei die Nukleinsäuren ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO.l bis 63, und deren Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente, und/oder wobei die Proteine ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Proteinen mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO:64 bis 113, und deren Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente.
14. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 8-10 und 13, umfassend mindestens einen Primerpaar, wobei die Primer des mindestens einen Primerpaares an Nukleinsäuren hybridisieren, die im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert werden.
15. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 11 bis 13, umfassend mindestens einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper oder anderen Binder, der für ein Protein, das im Zusammenhang mit chronischem oxidativen Stress in Zellen reguliert wird, spezifisch ist und gegebenenfalls ein geeignetes Referenzprotein sowie ferner NMR-Tags, PET- Sonden, Isotopentags für Massenspektroskopie und/oder Aptamere.
16. Zelle, umfassend mindestens eine rekombinante Nukleinsäure, die eine der SEQ ID NO :1 bis 63" aufweist, sowie deren Homologe, Derivate, Varianten und Fragmente, wobei die rekombinante Nukleinsäure mit regulatorischen Kontrollelementen funktional verbunden ist.
17. Nicht-humaner transgener Organismus, umfassend mindestens eine rekombinante Nukleinsäure .die. eine -der JSEQ- ID_NRs;l bis_63.aufweist, sowie deren. Homojoge, .Derivate, Varianten und Fragmente, wobei die rekombinanten Nukleinsäure mit regulatorischen Kontrollelementen funktional verbunden ist.
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CN109652524A (zh) * 2018-11-09 2019-04-19 山西中医药大学 类风湿关节炎大鼠模型中chrna7基因生物信息分析的试验方法
WO2024190850A1 (ja) * 2023-03-14 2024-09-19 富士フイルム株式会社 酸化ストレスによる傷害を受けた神経細胞の製造方法およびその応用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU8580598A (en) * 1997-07-22 1999-02-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of neuropsychiatric di sorders
US6333148B1 (en) * 1998-05-01 2001-12-25 University Of Kentucky Research Genes encoding several poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) enzymes, the proteins and fragments thereof, and antibodies immunoreactive therewith
DE10127008C1 (de) * 2001-06-05 2003-06-12 Thomas Rohrmeier Zellpopulationen zur Auffindung neuronaler Targets und potentieller Wirkstoffe
WO2003025122A2 (en) * 2001-08-13 2003-03-27 University Of Kentucky Research Foundation Gene expression profile biomarkers and therapeutic targets for brain aging and age-related cognitive impairment
AU2003279799A1 (en) * 2002-10-03 2004-04-23 Burrill, John, D. Proteins associated with cell growth, differentiation, and death

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