WO2007135284A1 - Utilisation de cellules derivees du tissu adipeux pour la preparation d'un medicament anti-tumoral - Google Patents

Utilisation de cellules derivees du tissu adipeux pour la preparation d'un medicament anti-tumoral Download PDF

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WO2007135284A1
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cancer
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culture
subpopulation
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Pierre Cordelier
Louis Buscail
Louis Casteilla
Béatrice COUSIN-DELARUE
Luc Penicaud
Jean-Marie Peron
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Toulouse
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Toulouse III Paul Sabatier
Universite de Toulouse
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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells

Definitions

  • the present invention relates to the use of cells derived from adipose tissue for the preparation of a drug with anti-tumor action.
  • the effective treatment of cancer remains one of the major challenges of today's medicine.
  • New anti-cancer drugs have been tested, particularly in cancers of the gastrointestinal tract such as pemetrexed (antifolate: cytotoxic agent), vaccines, kinase inhibitors (bryostatin, UCN-Ol, flavopiridol, CI-1040), inhibitors EGFR (cetuximab, gefitinib, GW572016, CI-1033, erlotinib) and VEGF inhibitors (bevacizumab, PTK787 / ZK 222584, angiozyme, ZD6474).
  • pemetrexed anti-cancer drugs
  • vaccines kinase inhibitors
  • kinase inhibitors bryostatin, UCN-Ol, flavopiridol, CI-1040
  • inhibitors EGFR cetuximab, gefitinib, GW572016, CI-1033, erlotinib
  • VEGF inhibitors bevacizumab, PTK787 /
  • cetuximab is a chimeric monoclonal antibody that specifically binds to the extracellular domain of the human epidermal growth factor receptor (EGFR) and inhibits the proliferation of tumor cells expressing EGFR and induces apoptosis.
  • EGFR human epidermal growth factor receptor
  • bevacizumab is an IgG1 monoclonal antibody that binds to VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) and thereby inhibits the binding of VEGF to its receptors, FIt-I (VEGFR-I) and KDR (VEGFR-2), located on the surface of endothelial cells both in vitro and in vivo. It consists of a constant part of human origin and a variable part of murine origin.
  • pancreatic cancer which is the fifth leading cause of cancer death in Western countries
  • the doctor is even more deprived; in addition to aggressiveness and often late clinical revelation, its prognosis is very poor (5-year survival less than 3.5%); moreover, surgical excision is only possible in 10 to 15% of cases.
  • Radiotherapy or chemotherapy have little effect on the survival of patients whose tumor has not been resected (median survival 5-6 months) (Safioleas MC et al., Hepatogastroenterology, 2004, 51 (57)). ): 862-868, Jemal A.
  • Non-resectable pancreatic cancers including pancreatic head cancer, are the subject of palliative bypass, biliary stent placement, or duodenal or even alcoholic analgesics of the celiac plexus. Patient survival remains very low:
  • the current reference treatment is gemcitabine, with which an improvement in clinical signs (pain, transit disorders) is observed, while the vital prognosis remains low (7-10 months)
  • gemcitabine with which an improvement in clinical signs (pain, transit disorders) is observed, while the vital prognosis remains low (7-10 months)
  • pancreatic cancer One of the research pathways to improve the prognosis of pancreatic cancer is to have an effective treatment that is particularly applicable to unresectable tumors in order to reduce the progression of the disease. Clinical investigation protocols using gene therapy or cell therapy have thus been put in place:
  • MULVIHILL et al. ⁇ Gene Therapy, 2001, 8, 308-315 conducted phase I clinical trials, in which they performed the intra-tumor injection, using a computer tomography (CT) device. for computed tomography), in patients with unresectable pancreatic carcinoma, the ONYX-015 adenovirus (dll520), an adenovirus deleted at the ElB-55kD gene which replicates preferentially in the cells tumors lacking p53 protein and kill them. Adenovirus injection is well tolerated but no objective response is demonstrated.
  • CT computer tomography
  • Ad.IL-12 interleukin-12
  • Ad.IL-12 an adenovirus expressing interleukin-12
  • Ad.IL-12 an adenovirus expressing interleukin-12
  • AFIL-12 adenovirus expressing interleukin-12
  • ⁇ Cancer Gene Therapy 2006, 13, 65-73 apply "targeted chemotherapy" to mouse models and show that the injection of said microcapsules associated with ifosfamide administration in mice developing human colorectal cancer associated with carcinomatosis Peritoneal can lead to complete remission of the peritoneal tumor.
  • HEK 293 line tumorigenic human cell line
  • the subject of the present invention is the use of cells isolated from extra-medullary white adipose tissue selected from the group consisting of the stromal-vascular fraction and a sub-population of said stromal-vascular fraction. consisting of adherent cells, for the preparation of an antitumor drug.
  • Adipose tissue exists in different forms in mammals: extra-medullary white adipose tissue, which is the body's main reserve organ, white medullary adipose tissue whose exact role is not known, and thermogenic brown adipose tissue .
  • the white adipose tissue of the adult is a source of abundant cells and easy to obtain. This white adipose tissue consists of two cell fractions:
  • an adipocyte fraction which represents 30% to 60% of the adipose tissue cells and is characterized by the accumulation of triglycerides (fraction of floating cells). This fraction is composed in the vast majority (99%) of differentiated adipocytes and some contaminating macrophages, rich in lipid droplets, and
  • stroma-vascular fraction a non-adipocyte fraction, called stroma-vascular fraction (FSV or in English SVF for "stroma-vascular fraction").
  • the stromal-vascular fraction conventionally used to study the differentiation of preadipocytes into mature adipocytes, is a heterogeneous fraction comprising different subpopulations of cells (PLANAT-BERNARD V. et al., Circulation, 2004, 109, 656-663, ZUK PA, et al., Mol Biol, CeIl, 2002, 13, 4279-95, ERICKSON GR, et al., Biochem Biophys Res Commun, 2002, 290, 763-9, COUSIN B. et al.
  • pancreatic cells (Application US 2003/0124721) or
  • the differentiated cells obtained from the FSV cells find applications in tissue repair, the reconstitution of cell lines and the improvement of the functions of certain tissues.
  • these differentiated cells can be used, depending on the case:
  • - to reconstitute the liver tissue for example in the context of the treatment of progressive degeneration of the liver
  • - to reconstitute cardiac or skeletal muscle tissue particularly in the context of the treatment of myopathies, cardiomyopathies and pathologies related to muscle degeneration (myocardial infarction);
  • adherent cells This subpopulation of adherent cells will thereafter be indifferently referred to as "adherent cell subspecies", “adherent cells”, or “adherent cells of FSV”.
  • FSV is understood to mean the stromal-vascular fraction comprising all the cells constituting it.
  • the expression "cells of the stromal-vascular fraction” includes both the complete stromal-vascular fraction and the adherent cell subpopulation.
  • the adherent cell subpopulation accounts for approximately 50-60% of the total FSV cell population. Surprisingly, both FSV and said adherent cell subpopulation significantly slow tumor progression. This effect is observed not only when the stromal vascular fraction or said adherent cells are injected locally intramuscularly, but also when they are administered systemically, for example parenterally and more specifically intravenously.
  • FSV can be used for the preparation of an anti-tumor drug, with or without expansion, with or without physiological or pharmacological treatment and with or without modification by any manipulation of the gene or protein expression profile.
  • the adherent cells may be used for the preparation of an anti-tumor drug, with or without physiological or pharmacological treatment and with or without modification by any manipulation of the gene or protein expression profile.
  • said cells in addition to the direct anti-tumor effect of the cells of the stromal-vascular fraction, said cells also exert an anti-tumor effect indirectly: in fact, a medium conditioned by the adherent cell subpopulation inhibits the viability of cancer cells. This effect is further amplified when said subpopulation of adherent cells is previously placed in the presence of cancer cells, preferably cells derived from the cancer to be treated.
  • said anti-tumor drug is constituted by said isolated cells, before or after culturing.
  • said subpopulation of adherent cells is obtainable by a process comprising:
  • stromal-vascular fraction obtained from the extra-medullary white adipose tissue; the purification of said stromal-vascular fraction;
  • the isolation of the cells of said subpopulation from said purified fraction by primary cultivation in a suitable liquid medium, selection of the adherent cells on a culture support (plastic, etc.) by elimination of the non-adherent cells , recovery of the cells after confluence, in a suitable medium, centrifugation and recovery of the pellet.
  • said cells are associated with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • said cells can moreover be genetically modified:
  • They may comprise at least one mutation of an autologous gene.
  • said cells may contain at least one copy of a heterologous gene.
  • said cells comprise a heterologous gene, whose translation product is a protein of therapeutic interest, such as an enzyme capable of metabolizing a pro-drug into a toxic active compound (s). ) for the tumor cell.
  • the genetically modified cells are preferably of human origin.
  • said anti-tumor drug is constituted by the culture supernatant of said subpopulation of adherent cells.
  • Said supernatant is a primary culture supernatant or a culture supernatant obtained after one or more passages (secondary culture or subsequent cultures).
  • said supernatant is obtained from a co-culture of the adherent cell subpopulation as defined above with cancer cells or with cells of a cancer cell line.
  • Extra-medullary adipose tissue is of animal origin or of human origin; preferably, both the cells of the stroma-vascular fraction of extra-medullary adipose tissue and the cancerous cells are those of the patient to be treated and have been previously removed from said patient to be treated.
  • Said supernatant is a primary culture supernatant or a culture supernatant obtained after one or more passages (secondary culture or subsequent cultures).
  • said cancer is a solid cancer or a liquid cancer.
  • Solid cancer means any cancer affecting organs such as the liver, pancreas, lungs, kidneys, etc., for which a tumor develops locally and then disperses through the bloodstream or lymphatic system and forms metastases. Solid cancer is opposed to liquid cancers that affect cancers of the blood or lymphatic system.
  • said cancer is a solid cancer of the gastrointestinal tract (pancreatic cancer, gastric cancer, colorectal cancer).
  • Gastrointestinal tract cancer means tumors and / or cancers of the esophagus, stomach, small intestine, large intestine, or colon, as well as cancers or tumors of the accessory glands of the gastrointestinal tract.
  • -intestinal such as liver, gall bladder, common bile duct and pancreas.
  • the anti-tumor drug as defined above is particularly well suited to the treatment of pancreatic cancer, and even more preferably to the treatment of non-operable pancreatic cancer.
  • the antitumor drug according to the invention is preferably used intra-tumorally, but it can also be administered by any other route, possibly by multiple routes, in particular by intravenous, intraperitoneal, topical, transdermal or subcutaneous routes. , intra-arterial, pulmonary, nasopharyngeal or oral, in solution, in aqueous suspension or in powder form or in any other pharmaceutically acceptable form.
  • the effective doses will be determined according to the age, the state of health, the weight of the patient and the type of cancer to be treated.
  • the use of the anti-tumor drug, as defined above, can be combined with other therapies, including surgery, radiotherapy, chemotherapy, immunotherapy and differentiating therapies.
  • the anti-tumor effect observed characterized by the slowing or inhibition of tumor growth and the induction of cancer cell death (for example apoptosis) is essentially due to the cells of the cell subpopulation as defined above. high, that is to say the cells present in the stromal-vascular fraction and selected on the basis of their adherence on solid support
  • the antitumor drug as defined above is particularly advantageous for the following reasons: the taking of adipose tissue samples is easy to be performed, for example by liposuction or biopsy under local anesthesia; given its abundance, stocks can easily be formed; in addition, the sampled tissue can be rapidly regenerated in the sampled subject; these properties make the cells derived from adipose tissue particularly suitable for a homologous graft (for example an autologous graft) or a heterologous graft; the removal of adipose tissue and its subsequent use for therapeutic purposes should theoretically encounter no ethical impediment since the sample is minimally invasive and many adipose tissue samples are currently being destroyed; in addition, it should be noted that the hospitalization time required for this sample is reduced (in particular there is no need for cytapheresis or general anesthesia).
  • these cells are transfectable and can be used to express a heterologous gene, especially since they possess a high secretory power. It is therefore possible to use them to express a therapeutic protein, for example an enzyme capable of converting a prodrug into an active drug.
  • the subject of the present invention is also the use of an anti-tumor agent as defined above, namely selected from the group consisting of extra-medullary white adipose tissue cells as defined above, the supernatant culturing said cells or the supernatant of co-culturing said cells with cancer cells or cells of a suitable cancer cell line, as adjuvant in anticancer therapy.
  • an anti-tumor agent as defined above, namely selected from the group consisting of extra-medullary white adipose tissue cells as defined above, the supernatant culturing said cells or the supernatant of co-culturing said cells with cancer cells or cells of a suitable cancer cell line, as adjuvant in anticancer therapy.
  • said supernatant is a primary culture supernatant or a primary co-culture supernatant. It can also be a culture supernatant or co-culture obtained after one or more passages.
  • the subject of the present invention is also the use of an anti-tumor agent as defined above, namely selected from the group consisting of extra-medullary white adipose tissue cells as defined above, the supernatant culturing said cells or the supernatant of a co-culture of said cells with cancer cells or cells of a suitable cancer cell line, for in vitro screening of other anti-tumor drugs, in particular able to act synergistically with said cells or supernatant of said cells.
  • said supernatant is a primary culture supernatant or a primary co-culture supernatant. It can also be a culture supernatant or co-culture obtained after one or more passages.
  • A determination of the tumor weight (mg) after intra-tumoral injection of cells of the stromal-vascular fraction (white) or of PBS (control) (black); ***: p ⁇ 0.001.
  • B photograph of tumors taken after intratumoral injection of the adherent cell subpopulation (right) or PBS (left).
  • FIG. 3 In vivo determination of the percentage of tumor progression after intratumoral (LT., ⁇ ) or systemic (LV., - * -) injection of the adherent cell subpopulation, or injection, either intratumorally or systemically, PBS (control, B). **: p ⁇ 0.01.
  • FIG. 4 In vitro determination of the viability percentage of Capan-1 cells treated with DMEM: F12 OK medium, with culture supernatant of said cell subpopulation (conditioned medium), with coculture supernatant, said sub-population of cells and Capan-1 cells (co-culture medium) or else DMEM: F 12 medium supplemented with 10 ⁇ g / ml of TNF- ⁇ . ***: p ⁇ 0.001.
  • FIG. 5 In Vitro Determination of Apoptosis of Capan-1 Cells Induced by the Cell Culture Supernatant of the Adherent Cell Subpopulation and by the Co-Culture Supernatant of the Cells of the Adherent Cell Subpopulation with Capan-1 cells.
  • A Capan-1 cells placed in the presence of DMEM medium: F12 OK (negative control).
  • B Capan-1 cells treated with the cell culture supernatant of the adherent cell subpopulation.
  • C Cells treated with cell culture supernatant of the subpopulation of adherent cells with Capan-1 cells, according to a ratio Capan-1 / adherent cells of 5/1; D: cells treated with the supernatant of co-culture of cells of the subpopulation of cells adherent with the Capan-1 cells, according to a ratio Capan- 1 / adherent cells of 1/1.
  • - Figure 6 In vivo determination of apoptosis of cancer cells after intratumoral injection of cells of the adherent cell subpopulation. Control pancreatic tumor section (A) or after injection of cells of the adherent cell subpopulation (B).
  • the DMEM F 12-OK medium comprises, for 500 ml of DMEM F12 (reference Gibco 31330 038), 5 ml of ASP (solution ready for use of antibiotics + antifungal agent: Amphotericin 0.25 ⁇ g / ml, Streptomycin 100 ⁇ g / ml, Penicillin G 100 ⁇ g / ml) (reference SIGMA A7292), 0.5 ml of 16 mM biotin (0.016 mM final) (reference SIGMA B4639), 0.5 ml of 18 mM pantothenic acid (P5155 Sigma) (0.018 mM final), 0.5 ml of 100 mM ascorbic acid (A4034 Sigma) (100 ⁇ M final).
  • ASP solution ready for use of antibiotics + antifungal agent: Amphotericin 0.25 ⁇ g / ml, Streptomycin 100 ⁇ g / ml, Penicillin G 100 ⁇ g / ml) (re
  • the digestion buffer contains DMEM F 12-OK, 2% BSA (bovine serum albumin) and 2 mg / ml collagenase (SIGMA reference) at the rate of 10 ml of digestion medium per 3 g of tissue.
  • This buffer is filtered using 0.2 ⁇ m filters (Acrodisc PF 0.8 / 0.2 ⁇ m, ref PALL6224187, VWR).
  • the lysis buffer comprises 100 ml of solution A (2.08 g of Tris buffer pH 7.65 in 100 ml sterile H 2 O) and 900 ml of solution B (8.3 g of NH 4 Cl in 1000 ml H 2 O sterile).
  • the complete RPMI medium is prepared from RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium (Gibco / Invitrogen (ref. 21875034)) supplemented with 10% newborn calf serum (NCS or "newborn calf serum” (Gibco 18010). -159)), 100 ⁇ / ml of penicillin, 100 ⁇ / ml of streptomycin, and 0.25 ⁇ g / ml of fungizone (Invitrogen, 15240-096).
  • the solution of PBS comes from Gibco (ref 14200-067).
  • the trypsin / EDTA solution comes from Gibco (ref. 25300-054).
  • Adipose tissue comes from patients undergoing dermolipectomy or liposuction: For a dermolipectomy:
  • adipose tissue needed is weighed in a sterile box, then all the work is done under a culture hood. The tissue undergoes mechanical dissociation by a very fine chopping by means of scissors, and the fragments obtained are rinsed with PBS.
  • the adipose tissue removed is dissected under a microscope in sterile boxes containing PBS, so as to remove all traces of muscle tissue, and then digested at 37 ° C. for 30 min in digestion medium. Digestion is accelerated by manual agitation every 10 min.
  • the protocol is identical except for the mechanical dissociation step of the tissue using a pair of scissors, which is not necessary.
  • Purification of the stromal-vascular fraction FSV or SVF
  • the mature adipocytes are separated from the pellet containing the SVF cells by centrifugation (600 g, 10 min).
  • the stromal-vascular cells thus isolated (pellet) are resuspended in 2 ml of DMEM medium: F 12 + 10% SVN (Newborn calf serum) and counted (hand counting on blood cell or Coulter particle counter) and cells resuspended in the same medium.
  • the same volume of lysis buffer is added and the cell suspension is centrifuged for 5 minutes at 1600 rpm (500 g). The supernatant is removed and the residue is taken up in DMEM: F 12 OK (from 500 ⁇ l to 1 ml depending on the size of the pellet). 3) Cell culture and obtaining the cell subpopulation
  • the cells are sown in 25 cm 2 flasks (Nunc inclined neck and filter cap, ref 055422, Kevin Dutscher) at the rate of 5 ⁇ 10 5 at 10 6 cells per dish and cultured in DMEM medium: Fl 2 OK.
  • the cells are rinsed with PBS the day after culturing in order to eliminate all the dead and / or non-adherent cells, then they are cultured for 4 to 7 days in DMEM medium: F12 OK + 10% NCS. After confluence (ie after 4 to 7 days of culture), the cells are rinsed with PBS so as to eliminate any trace of medium.
  • the cells are detached with a trypsin / EDTA solution and then counted using a cell counter (Coulter ZI).
  • the cell suspension is centrifuged for 5 min at 1600 rpm (500 g), then the pellet is taken up in a suitable volume of PBS, so as to have a concentration of the order of 10 6 cells / 100 .mu.l.
  • a mouse model of human pancreatic cancer is developed as described below. This model presents an ectopic tumor at the subcutaneous level.
  • Capan-1 cells are derived from liver metastases from human pancreatic adenocarcinomas (ATCC HTB-79). Capan-1 cells are cultured routinely in the complete RPMI culture medium at 37 ° C. and 5% CO 2 , in culture flasks (BD Falcon reference T-175 353028), and are subcultured when they reach 70 ° C. at 80% confluence.
  • Swiss Nude (nu / nu) athymic female mice (Charles River) are 6 to 8 weeks old at the time of the experiment. After reception, the Swiss nu / nu mice are tattooed by ear for later identification and then acclimatized to the breeding conditions for 1 week in A2 environment before experimentation (TIFR31 zootechnic service in Toulouse), according to cycles. diurnal and nocturnal 12 hours. The nu / nu Swiss mice are housed 5 in each cage in ventilated racks.
  • Capan-1 cell culture medium is aspirated and the cells rinsed with 10 ml of sterile PBS. After 5 minutes of incubation at room temperature, the PBS is aspirated, and the cells are dissociated with 3 ml of a trypsin / EDTA solution, for 5 minutes at 37 ° C. The cells are then taken up in 7 ml of complete medium and then dissociated with the pipette after 10 suction / discharge cycles, then harvested in a sterile 50 ml tube (Falcon Blue Max 50 ml 352070). Cells are counted using a Coulter ZI cell counter. The equivalent of 10 7 Capan-1 cells per mouse to be injected is centrifuged for 5 min at 1400 rpm (200 g) under sterile conditions.
  • Capan-1 cells are taken up in 100 ⁇ l of sterile PBS for cell culture. Implantation of Capan-1 tumors
  • mice strictly handled under a PSM hood (Microbiological Safety Station), are identified by their tattooing, weighed and then anesthetized with 0.1% isofluorane (Aerrane, Baxter) for 5 minutes before handling.
  • This general anesthesia protocol provides comfort in the handling of individuals and ensures the reproducibility of results, while preventing experimental artefacts resulting from the stress of the animal.
  • the Capan-1 cells 100 ⁇ l are injected subcutaneously into the left flank of the animal, using a tuberculin syringe 0.3 ml 29G on 33 mm without dead volume, at the rate of 1 ml / h.
  • mice The site of the injection is disinfected, and the mice reconditioned in clean litter cages. The awakening of the mice under these conditions of experimentation is observed 5 to 7 minutes after anesthesia. Vital signs of injected mice are analyzed macroscopically 24 and 48 h according to the operation. Under these conditions, the measured mortality rate is 0%.
  • the injection of the adherent cell subpopulation is carried out 11 to 14 days after implantation of Capan-1 tumors in athymic mice.
  • mice strictly handled under a PSM hood, are identified by their tattooing, weighed and then anesthetized with 0.1% isofluorane for 5 minutes before manipulation. After observing the falling asleep of the animal, the cells ( 5 ⁇ 10 5 in 50 ⁇ l of PBS) are injected either directly into the tumor or into the tail vein.
  • the cells are injected with a tuberculin syringe 0.3 ml 29G on 33 mm without dead volume, at the rate of 1 ml / h.
  • the cells are in an environment solely of pancreatic tumor cells; they are not in contact with healthy pancreatic tissue.
  • the mice are placed in an injection chamber heated to 50 ° C to facilitate the dilation of the tail vein, and the cells are injected using a device for lymphography without dead volume of 29G in PVC.
  • mice 50 .mu.l of sterile PBS are injected into the control mice either intra-tumorally or systemically.
  • the site of the injection is disinfected, and the mice reconditioned in clean litter cages.
  • Apoptosis of cancer cells is detected on Capan-1 cell cultures or on pancreatic tumor sections from the murine model described in Example 1.4) using the TUNEL technique (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end labeling).
  • TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end labeling
  • This technique is based on the incorporation of labeled nucleotides at the level of Free 3'OH ends of the DNA fragments generated during apoptosis (Gavrieli et al., 1992, Journal of Cell Biology, Vol 119, No. 3, pages 493-501). It is implemented here, using the ApopDETEK kit (EnzoDiagnostic, NY, USA) following the manufacturer's recommendations.
  • EXAMPLE 2 In Vivo Anti-tumor Effect of Cells Derived from Adipose Tissue
  • mice The conditions for preparing the mice, the injection of Capan-1 cells and the injection of the adherent cell subpopulation are described in Example I.
  • the weight of the mice and the growth of the tumors are measured and recorded every 2 days until 14 days after the injection of said cells, the tumor growth being measured in located on the living animal.
  • the percentage of tumor progression is evaluated at 3, 6 and 13 days after intratumoral injection of said cells or of PBS (control) according to the following formula:
  • % of tumor progression at time t [(tumor volume at time t) / (tumor volume at to)] ⁇ 100; to correspond to the injection of the subpopulation of adherent cells or PBS.
  • the experiment is stopped 10 to 15 days after transfer of the adherent cell subpopulation (21 to 39 days after tumor implantation) due to the exponential progression of the control tumors, their ulceration and the risk of high death of the mice bearing these tumors.
  • the tumor weight is also determined. For this, the mice are sacrificed thirteen days after intratumoral injection of the cells and the tumors are removed, weighed and photographed.
  • the values obtained on the one hand for the tumor progression and on the other hand for measuring the weight of the tumor are representative of 3 independent experiments, corresponding to three different preparations of the adherent cell subpopulation, and 5 mice per group .
  • the inventors proceeded with the administration of these cells by the blood route, in order to determine whether they could migrate to site of the tumor and exert their effect.
  • Example I The conditions for preparing the mice and for injecting Capan-1 cells, the adherent cell subpopulation and the PBS are described in Example I. More specifically, the inventors compared the effect of the cells of the subunit. -population administered either directly in tumors Capan-1 (intratumoral injection) or in the tail vein (systemic injection). The size of the tumors is measured as indicated above 3 days after the transfer of the cells from the population. The values obtained are representative of 2 independent experiments corresponding to two preparations of different cells, and 3 or 4 mice per group. The results are illustrated in FIG. 3. They show that the amplitude of the inhibition of the tumor progression measured 3 days after transfer of the FSV cells, when these are injected into the tail vein of the Capan tumor-bearing mice. -1, is comparable to that observed when these cells are directly administered in the tumor (-56% ⁇ 22% vs -65% ⁇ 26%).
  • Capan-1 in the presence of culture supernatant of the adherent cell subpopulation in vitro, to confirm and validate the results obtained in vivo (Example 2).
  • Capan-1 cells are seeded sextupled in flat-bottomed 96-well culture dishes (Nunc 167008), at a rate of 25,000 cells per well in a final volume of 100 ⁇ l, 48 hours later, the cells are rinsed and then treated:
  • the cell culture supernatant of the adherent cell subpopulation is obtained after 48 hours of culture in DMEM: Fl 2 OK medium; the co-culture supernatant of cells of the adherent cell subpopulation and of Capan-1 cells is obtained after 48 hours of a culture of adherent cells and Capan-1 cells in DMEM: F 12OK medium, according to a initial ratio Capan-1 cells / adherent cells of 5/1 or 1/1 (respectively co-culture supernatant 1 and co-culture supernatant 2).
  • the cell viability is measured using the CellTiter 96® AQueous One Solution CeIl Proliferation Assay kit (Promega G3582). The values obtained are representative of 3 independent experiments corresponding to three different subpopulation cell preparations.
  • FIG. 4 show that the medium conditioned by the adherent cell subspecies (culture supernatant) is capable of significantly inhibiting the viability of Capan-1 cells.
  • the supernatant of co-cultures of the subset of adherent cells with Capan-1 cells exhibits a more pronounced inhibitory effect on Capan-1 cell viability than the supernatant conditioned by the adherent cell subpopulation alone. which shows that these cells are able to react to the presence of pancreatic cancer cells.
  • Capan-1 cells are seeded in triplicate and cultured on Labteck 4 wells (Dutscher), at a rate of 50,000 cells per well, in a final volume of 500 ⁇ l, then rinsed and treated with: 500 ⁇ l of DMEM medium: F 12OK or 10% RPMI medium;
  • FIG. 5 Nuclear staining of the Capan-1 cells treated with the culture supernatant of the cells of the adherent cell subpopulation is observed (FIG. 5B). This labeling is not observed for Capan-1 cells placed in the presence of DMEM medium: F12 OK or RPMI 10% ( Figure 5A).
  • DMEM medium F12 OK or RPMI 10%
  • Figure 5C nuclear labeling is more intense (FIG. 5C) and the intensity is further increased by treatment with the co-culture supernatant 2, for which it is observed that in addition to condensation of the cytoplasm.
  • Capan-1 and intratumoral injection of the adherent cell subpopulation are described in Example I.
  • Five days after the injection of the cells of the adherent cell subpopulation pancreatic tumor biopsies are taken and then sections are prepared.
  • tumor sections are prepared from mice that have not received cells from the adherent cell subpopulation. Apoptosis is detected in these two types of preparation using the TUNEL technique as shown in Example 1.7).

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Abstract

Utilisation de cellules isolées du tissu adipeux blanc extra médullaire, sélectionnées dans le groupe constitué par la fraction stroma-vasculaire et une sous-population de ladite fraction stroma-vasculaire constituée par des cellules adhérentes, pour la préparation d'un médicament anti-tumoral.

Description

UTILISATION DE CELLULES DÉRIVÉES DU TISSU ADIPEUX POUR LA PRÉPARATION D'UN MÉDICAMENT ANTI-TUMORAL
La présente Invention est relative à l'utilisation de cellules dérivées du tissu adipeux pour la préparation d'un médicament à action anti-tumorale. Le traitement efficace des cancers reste l'un des défis majeurs de la médecine d'aujourd'hui.
L'efficacité des thérapeutiques conventionnelles chirurgicales ou à visée cytolytique (chimiothérapie et radiothérapie) reste très limitée dans de nombreux cancers. En effet, certains cancers de fréquence élevée (tractus gastro-intestinal, en particulier), sont toujours difficiles à traiter compte tenu de leur aspect massif qui s'oppose à la diffusion des agents thérapeutiques. Leur traitement nécessite donc en premier lieu l'exérèse chirurgicale, suivie d'une chimiothérapie éventuellement associée à une radiothérapie. Toutefois, dans les cas où la chirurgie n'est pas ou plus possible, une chimiothérapie alternative et efficace sans être toxique est nécessaire. Toutefois, les produits disponibles présentent une efficacité limitée ou une toxicité inacceptable. Il existe donc un besoin de nouveaux traitements anti-cancéreux, afin de disposer d'une panoplie suffisamment étendue de traitements, pour augmenter ainsi les chances de guérison.
Dans le cas des cancers du tractus gastro-intestinal (œsophage, estomac, intestin grêle, gros intestin, colon) et de ses glandes annexes (foie, vésicule biliaire, pancréas), par exemple, le manque de traitements curatifs est avéré, lorsque l'exérèse chirurgicale n'est pas ou plus possible. En effet, les traitements existants, qui sont essentiellement basés sur la chimiothérapie (5-fluorouracile ou 5-FU, gemcitabine...), et la radiothérapie, ont un faible impact sur la survie et sont surtout utilisés à des fins palliatives, notamment dans le cas des cancers colorectaux, gastriques et pancréatiques (pour revue, DIAZ-RUBIO, The Oncologist, 2004, 9, 282- 294).
Outre l'absence de traitements efficaces, la toxicité des agents chimiothérapeutiques habituellement utilisés (fluoro-uracile, acide folinique, dérivés du platine, tel qu'oxaliplatine, mitomycine C, par exemple) et les effets secondaires associés à ces traitements représentent un autre inconvénient majeur. De nouveaux anticancéreux ont été testés, notamment dans les cancers du tractus gastro-intestinal tels que le pemetrexed (antifolate : agent cytotoxique), des vaccins, des inhibiteurs de kinase (bryostatin, UCN-Ol, flavopiridol, CI-1040), des inhibiteurs de l'EGFR (cetuximab, gefitinib, GW572016, CI-1033, erlotinib) et des inhibiteurs du VEGF (bevacizumab, PTK787/ZK 222584, angiozyme, ZD6474).
Par exemple :
. le cetuximab est un anticorps monoclonal chimérique qui se lie spécifiquement au domaine extra-cellulaire du récepteur du facteur de croissance épidermique humaine (EGFR) et inhibe la prolifération de cellules tumorales exprimant l'EGFR et induit une apoptose.
. le bevacizumab est un anticorps monoclonal de type IgGl qui se lie au VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) et inhibe de ce fait la liaison du VEGF à ses récepteurs, FIt-I (VEGFR-I) et KDR (VEGFR-2), situés à la surface des cellules endothéliales aussi bien in vitro qu'in vivo. Il est constitué d'une partie constante d'origine humaine et d'une partie variable d'origine murine.
Les résultats obtenus avec ces nouveaux produits seuls ou en association ne montrent pas d'amélioration par rapport aux traitements antérieurs, en particulier dans le traitement des cancers du tractus digestif, tant du point de vue de l'efficacité que de la toxicité.
Dans le cas du cancer du pancréas, qui représente la cinquième cause de décès par cancer dans les pays occidentaux, le médecin est encore plus démuni ; outre une agressivité et une révélation clinique souvent tardive, son pronostic est très mauvais (survie à 5 ans inférieure à 3,5 %) ; de surcroît, l'exérèse chirurgicale n'est possible que dans 10 à 15 % des cas. La radiothérapie ou la chimiothérapie n'ont que peu d'effet sur la survie des patients dont la tumeur n'a pas été réséquée (médiane de survie 5-6 mois) (Safioleas MC et al., Hepatogastroenterology, 2004, 51 (57) : 862- 868 ; Jemal A. et al., CA Cancer J Clin, 2002, 52 (1) : 23-47 ; Rosewicz S., et al., Lancet, 1997, 349 (9050) : 485-489., Jafari M. et al., Surg Oncol Clin NAm, 2004, 13 (4) : 751-760, xi ; Kullke MH et al., Curr Treat Options Oncol, 2002, 3 (6) : 449-457). Les cancers du pancréas non-résécables, notamment le cancer de la tête du pancréas, font l'objet de dérivations palliatives, de la mise en place d'endoprothèses biliaires ou duodénales, voire d'alcoolisation antalgique du plexus coeliaque. La survie des patients demeure très faible :
- En cas de cancer localement avancé non-métastatique et non résécable ou de cancer métastatique, le traitement de référence actuel est la gemcitabine, avec laquelle on observe une amélioration des signes cliniques (douleur, troubles du transit) alors que le pronostic vital reste faible (7 à 10 mois) (Safïoleas MC et al., Hepatogastroenterology, 2004, 51 (57) : 862-868 ; Jemal A. et al., CA Cancer J Clin, 2002, 52 (1) : 23-47 ; Rosewicz S., et al., Lancer, 1997, 349 (9050) : 485-489., Jafari M. et al., Surg Oncol Clin NAm, 2004, 13 (4) : 751-760, xi ; Kullke MH et al., Curr Treat Options Oncol, 2002, 3 (6) : 449-457).
- Une des voies de recherche pour améliorer le pronostic du cancer du pancréas est de disposer d'un traitement efficace applicable notamment aux tumeurs non résécables dans le but de réduire la progression de la maladie. Des protocoles d'investigations cliniques utilisant la thérapie génique ou la thérapie cellulaire ont ainsi été mis en place :
. Par exemple, MULVIHILL et al. {Gène Therapy, 2001, 8, 308-315) ont conduit des essais cliniques de phase I, au cours desquels ils ont procédé à l'injection intra-tumorale, à l'aide d'un dispositif de tomographie assistée par ordinateur (CT pour « computed tomography »), chez des patients atteints d'un carcinome de pancréas non-résécable, de l'adéno virus ONYX-015 (dll520), un adénovirus délété au niveau du gène ElB-55kD qui se réplique préférentiellement dans les cellules tumorales dépourvues de protéine p53 et tue celles-ci. L'injection d'adénovirus est bien tolérée mais aucune réponse objective n'est démontrée. Les Auteurs soulignent que la réplication virale intra-tumorale n'est pas assez importante et que l'efficacité des adénovirus pourrait être optimisée en multipliant les injections d'ONYX-015 ou bien en les associant avec un traitement chimiothérapeutique.
. Plus récemment, HECHT et al. (Clinical Cancer Research, 2003, 9, 555-561) ont modifié ce protocole en proposant de remplacer le dispositif de CT, trop encombrant et susceptible de provoquer des complications sérieuses telles que des infections ou des perforations, par l'endoscopie à ultrasons. Cependant, les essais en phases I/II conduits par cette équipe n'ont pas révélé d'amélioration de l'efficacité du traitement par ONYX-015. En outre, des cas de perforations duodénales, dus à l'endoscope ont été observés.
. D'autres adéno virus ont été testés pour traiter des tumeurs digestives. C'est ainsi que l'équipe de SANGRO et al. {Journal ofClinical Oncology, 2004, 22, 8, 1389-1397) a décrit l'injection intra- tumorale d'un adénovirus exprimant l'interleukine 12 (IL- 12), dénommé Ad.IL-12, chez des patients atteints de cancers pancréatiques, colorectaux ou hépatiques. Ces essais de phase I n'ont révélé qu'une activité anti-tumorale modérée. Toujours en orientant ses recherches sur l'expression intra-tumorale d'IL-12 par l'adénovirus Ad.IL-12 (également dénommé AFIL-12), la même équipe a plus récemment testé l'injection intra-tumorale de cellules dendritiques transfectées par l'adénovirus AFIL-12 (MAZZOLINI et al., Journal of Clinical Oncology, 2005, 23, 5, 999-1010). Cependant, des essais cliniques supplémentaires sont nécessaires pour évaluer la réelle efficacité de ce traitement.
. Enfin, l'administration intra-tumorale d'un vecteur adéno viral codant pour le TNF-α associé à une radio-chimiothérapie par 5-FU a également été expérimentée. Cet essai fait état d'une activité anti -tumorale aux doses maximales de vecteur adéno viral -TNF-α (Senzer N. et al., J Clin Oncol, 2004, 22 (4) : 592-601). Toutefois, l'injection d'un vecteur adénoviral s'accompagne généralement d'événements indésirables tels que la fièvre, des nausées, une lymphopénie etc.. Outre les stratégies faisant appel aux adénovirus, des thérapies utilisant l'approche des « gènes-suicide » (en anglais : GDEPT pour « gene-derived enzyme prodrug therapy »), c'est-à-dire associant l'administration d'une pro-drogue et d'un gène dont le produit de traduction métabolise ladite pro-drogue en dérivé(s) actif(s) toxique(s) pour la cellule tumorale, ont également été développées et testées contre des cancers du tractus gastro-intestinal tel que le cancer du pancréas. L'article de GUNZBURG et SALMONS (Acta Biochimica Polonica, 2005, 52, 3, 601-607) fait le point sur cette approche associée à la thérapie cellulaire dans le cadre du cancer du pancréas. Les Auteurs de cet article soulignent le besoin de la mise au point de nouvelles stratégies plus efficaces de traitement du cancer, que les traitements existants. C'est ainsi que les Auteurs de cet article ont proposé d'administrer, dans des cancers du pancréas non-opérables, des microcapsules de sulfate de cellulose contenant des cellules HEK 293 recombinantes exprimant le cytochrome P450 2Bl, en association avec l'ifosfamide et ce pour diminuer les doses efficaces d'ifosfamide, habituellement très toxique, en raison d'une demi-vie très courte de la forme plasmatique active. L'administration des microcapsules est effectuée soit directement dans la tumeur, soit dans la circulation vasculaire alimentant cette tumeur, et permet de concentrer le cytochrome P450 au niveau de ladite tumeur et donc de cibler l'action des métabolites de l'ifosfamide. (LOHR et al., The Lancet, 2001, 357, 1591-1592). Les essais cliniques conduits jusqu'à présent chez l'homme ont montré un doublement de la médiane de survie (LOHR et al., 2001) et un taux de survie multiplié par 3 (LOHR et al., 2001 ; GUNZBURG et SALMONS, 2005). Cependant, les résultats obtenus ne sont pas satisfaisants et ne permettent pas d'augmenter la survie des patients de manière significative (médiane de survie de 10 mois et taux de survie après un an de 35,7 %). Plus récemment, cette technique a été étendue à d'autres types de cancers mais cela reste, pour le moment, limité aux modèles animaux. Ainsi, SAMEL et al. {Cancer Gène Therapy, 2006, 13, 65-73) appliquent la « chimiothérapie ciblée » à des modèles murins et montrent que l'injection desdites microcapsules associée à une administration d'ifosfamide chez des souris développant un cancer colorectal humain associé à une carcinose péritonéale peut conduire à une rémission complète de la tumeur péritonéale.
La thérapie cellulaire mettant en œuvre des cellules microencapsulées présente l'inconvénient majeur d'utiliser une lignée cellulaire humaine tumorigène (lignée HEK 293).
Il existe donc un besoin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses, adaptées à tous les cancers et notamment adaptées au traitement des tumeurs solides, telles que les tumeurs du tractus gastro-intestinal. Les Inventeurs se sont donc donné pour but de proposer un nouveau type de thérapie anticancéreuse, qui, associée à d'autres thérapeutiques, est efficace et moins toxique que les traitements actuellement proposés ; cette thérapie est particulièrement bien adaptée aux cancers du tractus gastro-intestinal, tel que des cancers du pancréas non-opérables. La présente invention a pour objet l'utilisation de cellules isolées du tissu adipeux blanc extra-médullaire, sélectionnées dans le groupe constitué par la fraction stroma-vasculaire et une sous-population de ladite fraction stroma-vasculaire constituée par des cellules adhérentes, pour la préparation d'un médicament antitumoral.
Le tissu adipeux existe sous différentes formes chez les mammifères : le tissu adipeux blanc extra-médullaire qui représente le principal organe de réserve de l'organisme, le tissu adipeux blanc médullaire dont le rôle exact n'est pas connu et le tissu adipeux brun thermogénique.
Du fait de son potentiel d'expansion important qui persiste tout au long de la vie de l'individu, le tissu adipeux blanc de l'adulte constitue une source de cellules abondantes et faciles à obtenir. Ce tissu adipeux blanc est constitué par deux fractions cellulaires :
- une fraction adipocytaire qui représente 30% à 60% des cellules du tissu adipeux et est caractérisée par l'accumulation de triglycérides (fraction de cellules flottantes). Cette fraction est composée en grande majorité (99 %) d'adipocytes différenciés et de quelques macrophages contaminants, riches en gouttelettes lipidiques, et
- une fraction non-adipocytaire, appelée fraction stroma-vasculaire (FSV ou en anglais SVF pour « stroma-vascular fraction »).
Ces deux fractions cellulaires peuvent être séparées par leur différence de densité, selon des procédés tels que ceux décrits par BJÔRNTORP et al. (J. Lipid. Res., 1978, 19, 316-24).
La fraction stroma-vasculaire, classiquement utilisée pour étudier la différenciation des préadipocytes en adipocytes matures, est une fraction hétérogène comprenant différentes sous-populations de cellules (PLANAT-BERNARD V. et al., Circulation, 2004, 109, 656-663 ; ZUK PA. et al., Mol. Biol. CeIl, 2002, 13, 4279-95 ; ERICKSON GR. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 290, 763-9 ; COUSIN B. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 301, 1016-22 ; SAFFORD KM. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 294, 371-9 ; Demande Internationale WO 02/055678 et Demande Américaine US 2003/0082152).
Plus précisément, les Inventeurs et d'autres équipes ont précédemment montré qu'il est possible d'induire la différenciation des cellules indifférenciées de la FSV en différents types de cellules différenciées. Les cellules FSV sont en effet capables de se différencier en cellules exprimant des marqueurs spécifiques :
- des cellules hématopoïétiques (Demande Internationale WO 02/055678, Demande Européenne EP 1 077 254 ; Brevet US 6,555,374, Demande Internationale WO 01 /62901 ),
- des cellules musculaires lisses ou squelettiques (Demande Internationale WO 02/055678, Demande Européenne EP 1 077 254 ; Brevet US 6,555,374),
- des cellules musculaires cardiaques (Demande Internationale WO 02/055678),
- des cellules endothéliales, hépatiques, neuronales ou astrogliales (Demande Internationale WO 01/62901),
- des cellules pancréatiques (Demande US 2003/0124721 ) ou
- des cellules stromales intra-oculaires (Demande Internationale WO 03/039481).
De plus, une sous-population de cellules homogènes de la FSV exprimant les antigènes de surface CD 13 et HLA ABC est capable de se différencier en cellules endothéliales (Demande Internationale WO 2005/025584).
Selon l'ensemble de ces publications, les cellules différenciées obtenues à partir des cellules FSV trouvent applications dans la réparation tissulaire, la reconstitution de lignées cellulaires et l'amélioration des fonctions de certains tissus. Ainsi, ces cellules différenciées peuvent être utilisées, selon les cas :
- pour reconstituer les lignées hématopoïétiques dans le cadre du traitement des maladies dans lesquelles on observe une déplétion médullaire, par exemple pour repeupler la moelle osseuse de patients immunodéprimés suite à un traitement anticancéreux tel qu'un traitement par irradiation ;
- pour réparer ou reconstruire le tissu nerveux, par exemple dans le cadre du traitement de pathologies cérébrales, tels qu'un accident vasculaire cérébral, la maladie d'Alzheimer ou la maladie de Parkinson ; - pour reconstituer le tissus hépatique, par exemple dans le cadre du traitement d'une dégénérescence progressive du foie ; - pour reconstituer le tissu musculaire cardiaque ou squelettique, notamment dans le cadre du traitement de myopathies, des cardiomyopathies et des pathologies liées à une dégénérescence musculaire (infarctus du myocarde) ;
- pour améliorer les fonctions du tissu pancréatique observé dans certains désordres endocrines du pancréas ;
- pour la réparation ou la reconstruction du tissu intra-oculaire dans le cadre du traitement de lésions du tissu cornéen ou du tissu conjonctif, par exemple après la résection d'une tumeur ; et
- pour reconstruire totalement ou partiellement un réseau vasculaire fonctionnel, notamment dans le cadre du traitement de l'ischémie.
Pour la reconstitution des lignées hématopoïétiques et la réparation du tissu nerveux ou hépatique la Demande Internationale WO 01/62901 préconise également d'injecter les cellules stromales indifférenciées, et non les cellules différenciées. De façon surprenante, les Inventeurs ont maintenant mis en évidence l'activité anti-tumorale des cellules du tissu adipeux blanc extra-médullaire sélectionnées dans le groupe constitué par la fraction stroma-vasculaire et une sous- population de cellules isolées de ladite fraction stroma-vasculaire, constituée par les cellules qui, après mise en culture primaire de ladite FSV, adhèrent au support de culture.
Cette sous-population de cellules adhérentes sera par la suite indifféremment désignée par les termes « sous-population de cellules adhérentes », « cellules adhérentes », ou « cellules adhérentes de la FSV ».
Dans la suite « ensemble des cellules de la FSV » ou « FSV » ont la même signification.
Au sens de la présente invention, on entend par FSV, la fraction stroma-vasculaire comprenant l'ensemble des cellules la constituant. Dans la suite, et sauf précision contraire, l'expression « cellules de la fraction stroma-vasculaire » inclut aussi bien la fraction stroma-vasculaire complète que la sous-population de cellules adhérentes.
La sous-population de cellules adhérentes représente environ 50 à 60 % de la population cellulaire totale de la FSV. De manière surprenante, aussi bien la FSV que ladite sous-population de cellules adhérentes ralentissent de manière significative la progression tumorale. Cet effet est observé non seulement lorsque la fraction stroma- vasculaire ou lesdites cellules adhérentes sont injectées localement au niveau intra- tumoral, mais également lorsqu'elles sont administrées de façon systémique, par exemple par voie parentérale et plus précisément par voie intra- veineuse.
Également de manière surprenante, la FSV peut être utilisée pour la préparation d'un médicament anti-tumoral, avec ou sans expansion, avec ou sans traitement physiologique ou pharmacologique et avec ou sans modification par une quelconque manipulation du profil d'expression génique ou protéique ; les cellules adhérentes peuvent être utilisées pour la préparation d'un médicament anti -tumoral, avec ou sans traitement physiologique ou pharmacologique et avec ou sans modification par une quelconque manipulation du profil d'expression génique ou protéique. Également de manière surprenante, outre l'effet anti-tumoral direct des cellules de la fraction stroma-vasculaire, lesdites cellules exercent également un effet anti-tumoral de façon indirecte : en effet, un milieu conditionné par la sous- population de cellules adhérentes inhibe la viabilité des cellules cancéreuses. Cet effet est en outre amplifié lorsque ladite sous-population de cellules adhérentes est préalablement mise en présence de cellules cancéreuses, de préférence des cellules issues du cancer à traiter.
Les Inventeurs ont en outre montré que, de manière étonnante, cet effet anti-tumoral est associé à une induction in vitro et in vivo de la mort cellulaire des cellules cancéreuses. De manière remarquable, il n'est pas nécessaire d'induire la différenciation des cellules FSV ou de les faire surexprimer un facteur particulier pour qu'elles exercent leur effet anti-tumoral. L'effet est observé lorsqu'on met en œuvre lesdites cellules FSV après leur purification ou bien après une culture primaire et sélection des cellules adhérentes. Selon une disposition avantageuse de ladite utilisation, ledit médicament anti-tumoral est constitué par lesdites cellules isolées, avant ou après mise en culture. Conformément à l'invention, ladite sous-population de cellules adhérentes est susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant :
- l'obtention de la fraction stroma-vasculaire à partir du tissu adipeux blanc extra-médullaire ; - la purification de ladite fraction stroma-vasculaire ;
- l'isolement des cellules de ladite sous-population à partir de ladite fraction purifiée par mise en culture primaire dans un milieu liquide convenable, sélection des cellules adhérentes sur un support de culture (plastique...) par élimination des cellules non-adhérentes, récupération des cellules après confluence, dans un milieu convenable, centrifugation et récupération du culot.
Un exemple du procédé d'obtention de ces cellules est décrit dans l'article de BJORNTORP et al. (cité plus haut).
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, lesdites cellules sont associées à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Conformément à l'invention, lesdites cellules peuvent de surcroît être génétiquement modifiées :
- Elles peuvent comprendre au moins une mutation d'un gène autologue.
- Elles peuvent contenir au moins une copie d'un gène hétérologue. Selon un autre mode de réalisation avantageux, lesdites cellules comprennent un gène hétérologue, dont le produit de traduction est une protéine d'intérêt thérapeutique, telle qu'une enzyme capable de métaboliser une pro-drogue en composé(s) actifs) toxique(s) pour la cellule tumorale.
Lesdites cellules génétiquement modifiées sont de préférence d'origine humaine.
Selon une autre disposition avantageuse de ladite utilisation, ledit médicament anti-tumoral est constitué par le surnageant de culture de ladite souspopulation de cellules adhérentes.
Ledit surnageant est un surnageant de culture primaire ou un surnageant de culture obtenu après un ou plusieurs passages (culture secondaire ou cultures ultérieures). Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit surnageant est obtenu à partir d'une co-culture de la sous-population de cellules adhérentes telle que définie plus haut avec des cellules cancéreuses ou avec des cellules d'une lignée cellulaire cancéreuse. Le tissu adipeux extra-médullaire est d'origine animale ou d'origine humaine ; de préférence, aussi bien les cellules de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux extra-médullaire que les cellules cancéreuses sont celles du patient à traiter et ont été préalablement prélevées chez ledit patient à traiter.
Ledit surnageant est un surnageant de culture primaire ou un surnageant de culture obtenu après un ou plusieurs passages (culture secondaire ou cultures ultérieures).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit cancer est un cancer solide ou un cancer liquide.
On entend par cancer solide, tout cancer touchant les organes tels que le foie, le pancréas, les poumons, les reins etc., pour lesquels une tumeur se développe localement puis se disperse par la circulation sanguine ou lymphatique et forme des métastases. Cancer solide s'oppose aux cancers liquides qui concernent les cancers du sang ou du système lymphatique.
Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit cancer est un cancer solide du tractus gastro-intestinal (cancer du pancréas, cancer gastrique, cancer colo-rectal).
On entend par cancer du tractus gastro-intestinal les tumeurs et /ou cancers de l'œsophage, de l'estomac, de l'intestin grêle, du gros intestin, ou du colon ainsi que les cancers ou tumeurs des glandes annexes du tractus gastro-intestinal telles que le foie, la vésicule biliaire, le canal cholédoque et le pancréas.
De manière préférée, le médicament anti-tumoral tel que défini ci- dessus est particulièrement bien adapté au traitement du cancer du pancréas, et de manière encore plus préférée au traitement du cancer du pancréas non-opérable.
Dans un tel cas, lorsque l'on utilise une co-culture de la sous- population de cellules adhérentes et d'une lignée cellulaire cancéreuse, cette dernière est avantageusement la lignée de cellules pancréatique Capan-1 (ATCC HTB-79). Le médicament anti-tumoral selon l'invention est utilisé préférentiellement par voie intra-tumorale, mais il peut aussi être administré par toutes autres voies, éventuellement par voies multiples, notamment par voies intraveineuse, intra-péritonéale, topique, transdermique, sous-cutanée, intra-artérielle, pulmonaire, naso-pharyngée ou orale, en solution, en suspension aqueuse ou en poudre ou sous toute autre forme pharmaceutiquement acceptable.
Les doses efficaces seront déterminées en fonction de l'âge, de l'état de santé, du poids du patient et du type de cancer à traiter.
Conformément à l'invention, l'utilisation du médicament anti- tumoral, tel que défini ci-dessus, peut être combinée avec d'autres thérapies, notamment la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie, l'immunothérapie et les thérapies différenciantes.
L'effet anti-tumoral observé, caractérisé par le ralentissement ou l'inhibition de la croissance tumorale et l'induction de la mort des cellules cancéreuses (par exemple apoptose) est essentiellement dû aux cellules de la sous-population cellulaire telle que définie plus haut, c'est-à-dire aux cellules présentes dans la fraction stroma-vasculaire et sélectionnées sur la base de leur adhérence sur support solide
(support de culture) lors d'une culture primaire des cellules FSV ; toutefois aussi bien l'ensemble de la fraction stroma-vasculaire que les cellules de ladite sous-population peuvent être mises en œuvre dans l'invention.
Le médicament anti-tumoral tel que défini ci-dessus (sous-population de cellules adhérentes FSV, ou surnageant de culture des cellules de ladite sous- population) est particulièrement avantageux pour les raisons suivantes : le prélèvement d'échantillons de tissu adipeux est facile à réaliser, par exemple par liposuccion ou par biopsie sous anesthésie locale ; compte tenu de son abondance, des stocks peuvent être aisément constitués ; en outre, le tissu prélevé peut être rapidement régénéré chez le sujet prélevé ; ces propriétés rendent les cellules dérivées du tissu adipeux particulièrement adaptées à une greffe homologue (par exemple greffe autologue) ou hétérologue ; le prélèvement de tissu adipeux et son utilisation ultérieure à des fins thérapeutique ne devraient théoriquement rencontrer aucun obstacle d'ordre éthique puisque le prélèvement est peu invasif et beaucoup de prélèvements de tissus adipeux sont actuellement détruits ; en outre, il convient de noter que le temps d'hospitalisation nécessaire audit prélèvement est réduit (notamment il n'est pas besoin de recourir à une cytaphérèse ou à une anesthésie générale). il est possible de maintenir et multiplier, voire immortaliser ces cellules in vitro dans un milieu défini ; par ailleurs, ces cellules sont transfectables et peuvent être utilisées pour exprimer un gène hétérologue, d'autant plus qu'elles possèdent un fort pouvoir sécréteur. Il est donc possible de les utiliser pour exprimer une protéine thérapeutique, par exemple une enzyme capable de convertir une prodrogue en drogue active.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un agent anti-tumoral tel que défini ci-dessus, à savoir sélectionné dans le groupe constitué par des cellules du tissu adipeux blanc extra-médullaire telles que définies ci-dessus, le surnageant de culture desdites cellules ou le surnageant d'une co-culture desdites cellules avec des cellules cancéreuses ou des cellules d'une lignée cellulaire cancéreuse convenable, comme adjuvant en thérapie anticancéreuse.
De préférence, ledit surnageant est un surnageant de culture primaire ou un surnageant de co-culture primaire. Il peut également s'agir d'un surnageant de culture ou de co-culture obtenu après un ou plusieurs passages.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un agent anti-tumoral tel que défini ci-dessus, à savoir sélectionné dans le groupe constitué par des cellules du tissu adipeux blanc extra-médullaire telle que définie ci-dessus, le surnageant de culture desdites cellules ou le surnageant d'une co-culture desdites cellules avec des cellules cancéreuses ou des cellules d'une lignée cellulaire cancéreuse convenable, pour cribler in vitro d'autres médicaments anti-tumoraux, notamment aptes à agir en synergie avec lesdites cellules ou surnageant desdites cellules. De préférence, ledit surnageant est un surnageant de culture primaire ou un surnageant de co-culture primaire. Il peut également s'agir d'un surnageant de culture ou de co-culture obtenu après un ou plusieurs passages. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - Figure 1 : Détermination in vivo de la progression tumorale après injection intra-tumorale de la sous-population de cellules de la FSV sélectionnées sur la base de leur adhérence sur le support de culture (D) ou de PBS (M). Abscisses : nombre de jours après l'injection ; ordonnées : pourcentage de progression tumorale. * : p<0,05, *** : p<0,001. - Figure 2 : Diminution in vivo du poids de la tumeur pancréatique après injection intra-tumorale de la sous-population de cellules adhérentes. A : détermination du poids de la tumeur (mg) après injection intra-tumorale de cellules de la fraction stroma-vasculaire (blanc) ou de PBS (contrôle) (noir) ; *** : p<0,001. B : photographie de tumeurs prélevées après injection intra-tumorale de la sous-population de cellules adhérentes (droite) ou de PBS (gauche).
- Figure 3 : Détermination in vivo du pourcentage de progression tumorale après injection intra-tumorale (LT. ; Δ) ou systémique (LV. ; -*- ) de la sous- population de cellules adhérentes, ou injection, soit intratumorale soit systémique, de PBS (Témoin ; B). ** : p<0,01. - Figure 4 : Détermination in vitro du pourcentage de viabilité des cellules Capan-1 traitées par du milieu DMEM:F12 OK, par du surnageant de culture de ladite sous-population de cellules (milieu conditionné), par du surnageant de co- culture de ladite sous-population de cellules et de cellules Capan-1 (milieu de co- culture) ou bien par du milieu DMEM : F 12 supplémenté de 10 μg/ml de TNF-α. *** : p<0,001.
- Figure 5 : Détermination in vitro de l'apoptose des cellules Capan-1 induite par le surnageant de culture de cellules de la sous-population de cellules adhérentes et par le surnageant de co-culture des cellules de la sous-population de cellules adhérentes avec les cellules Capan-1. A : cellules Capan-1 mises en présence de milieu DMEM : F12 OK (témoin négatif). B : cellules Capan-1 traitées par le surnageant de culture de cellules de la sous-population de cellules adhérentes. C : cellules traitées par le surnageant de co-culture de cellules de la sous-population de cellules adhérentes avec les cellules Capan-1, selon un ratio Capan-1 /cellules adhérentes de 5/1 ; D : cellules traitées par le surnageant de co-culture de cellules de la sous-population de cellules adhérentes avec les cellules Capan-1, selon un ratio Capan- 1 /cellules adhérentes de 1/1. - Figure 6 : Détermination in vivo de l'apoptose des cellules cancéreuses après injection intra-tumorale de cellules de la sous-population de cellules adhérentes. Coupe de tumeur pancréatique témoin (A) ou après injection des cellules de la sous-population de cellules adhérentes (B).
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Matériels et Méthodes 1) Milieux utilisés
- Le milieu DMEM F 12-OK comprend pour 500 ml de DMEM F12 (référence Gibco 31330 038), 5 ml d'ASP (solution prête à l'emploi d'antibiotiques+antifongique : Amphotéricine 0,25 μg/ml, Streptomycine 100 μg/ml, Pénicilline G 100 μg/ml) (référence SIGMA A7292), 0,5 ml de biotine à 16 mM (0,016 mM final) (référence SIGMA B4639), 0,5 ml d'acide panthoténique à 18 mM (P5155 Sigma) (0,018 mM final), 0,5 ml d'acide ascorbique à 100 mM (A4034 Sigma) (100 μM final).
- Le tampon de digestion contient du DMEM F 12-OK, 2 % de BSA (albumine sérique bovine) et 2 mg/ml de collagénase (référence SIGMA) à raison de 10 ml de milieu de digestion pour 3 g de tissu. Ce tampon est filtré à l'aide de filtres 0,2 μm (Acrodisc PF 0.8/0.2 μm, ref PALL6224187, VWR). - Le tampon de lyse comprend 100 ml de solution A (2,08 g de tampon Tris pH 7,65 dans 100 ml H2O stérile) et 900 ml de solution B (8,3 g de NH4Cl dans 1000 ml H2O stérile).
- Le milieu RPMI complet est préparé à partir de milieu RPMI (Roswell Park Mémorial Institute) 1640 (Gibco/Invitrogen (réf 21875034)) supplémenté de 10 % de sérum de veau nouveau-né (NCS ou « newborn calf sérum » (Gibco 18010-159)), de 100 μ/ml de pénicilline, 100 μ/ml de streptomycine, et 0,25 μg/ml de fungizone (Invitrogen, 15240-096). - La solution de PBS provient de chez Gibco (réf 14200-067).
- La solution de trypsine/EDTA provient de chez Gibco (réf 25300- 054).
2) Obtention de la fraction stroma-vasculaire Digestion
Le tissu adipeux provient de patients qui subissent une dermolipectomie ou une liposuccion : Pour une dermolipectomie :
La quantité de tissu adipeux nécessaire est pesée dans une boîte stérile, puis l'ensemble du travail est fait sous hotte de culture. Le tissu subit une dissociation mécanique par un hachage très fin au moyen de ciseaux, et les fragments obtenus sont rincés avec du PBS.
Le tissu adipeux prélevé est disséqué sous microscope dans des boites stériles contenant du PBS, de manière à enlever toute trace de tissu musculaire, puis digéré à 37°C pendant 30 min, dans du milieu de digestion. La digestion est accélérée par une agitation manuelle toutes les 10 min. Pour une liposuccion :
Le protocole est identique à l'exception de l'étape de dissociation mécanique du tissu à l'aide d'une paire de ciseaux, qui n'est pas nécessaire. Purification de la fraction stroma-vasculaire (FSV ou SVF)
Après élimination des fragments non digérés par filtration (filtres de
25 μm, (PA 25/21, 25 μm, Tissage de Tissus Techniques, Sailly-Saillisel), les adipocytes matures sont séparés du culot contenant les cellules de la SVF par centrifugation (600 g, 10 min). Les cellules stroma-vasculaires ainsi isolées (culot) sont remises en suspension dans 2 ml de milieu DMEM:F 12 + 10 % de SVN (Sérum de Veau Nouveau-né) et comptées (comptage manuel sur cellule hématimétrique ou compteur à particule Coulter) et les cellules remises en suspension dans le même milieu. Le même volume de tampon de lyse est ajouté et la suspension cellulaire est centrifugée 5 minutes à 1600 rpm (500 g). Le surnageant est éliminé et le culot repris dans du DMEM:F 12 OK (de 500 μl à 1 ml en fonction de la taille du culot). 3) Culture cellulaire et obtention de la sous-population cellulaire
Après obtention de la fraction stroma vasculaire (FSV) brute, selon la méthode décrite ci-dessus, les cellules sont ensemencées dans des flacons de 25 cm2 (Nunc col incliné et bouchon filtrant, ref 055422, Dominique Dutscher) à raison de 5x105 à 106 cellules par boîte et mises en culture dans le milieu DMEM : Fl 2 OK. Les cellules sont rincées avec du PBS le lendemain de la mise en culture afin d'éliminer toutes les cellules mortes et/ou non adhérentes, puis elles sont cultivées pendant 4 à 7 jours dans du milieu DMEM:F12 OK + 10 % NCS. Après confluence (soit après 4 à 7 jours de culture), les cellules sont rincées avec du PBS de manière à éliminer toute trace de milieu. Les cellules sont décollées à l'aide d'une solution de trypsine/EDTA puis comptées à l'aide d'un compteur de cellules (Coulter ZI). La suspension cellulaire est centrifugée 5 min à 1600 rpm (500 g), puis le culot est repris dans un volume adéquat de PBS, de manière à avoir une concentration de l'ordre de 106 cellules/ 100 μl.
4) Lignée Capan-1 et modèle murin du cancer du pancréas humain
Un modèle murin du cancer du pancréas humain est mis au point comme indiqué ci-après. Ce modèle présente une tumeur ectopique au niveau sous- cutané.
- Lignée Capan-1
Les cellules Capan-1 sont dérivées de métastases hépatiques d'adénocarcinomes pancréatiques humains (ATCC HTB-79). Les cellules Capan-1 sont cultivées en routine dans le milieu de culture RPMI complet à 37°C et 5 % de CO2, dans des flacons de cultures (référence BD Falcon T- 175 353028), et sont repiquées lorsqu'elles atteignent 70 à 80 % de confluence.
- Souris Swiss nu/nu
Les souris femelles athymiques Swiss Nude (nu/nu) (Charles River) sont âgées de 6 à 8 semaines au moment de l'expérimentation. Après réception, les souris Swiss nu/nu sont tatouées à l'oreille pour identification ultérieure, puis acclimatées aux conditions d'élevage pendant 1 semaine en environnement A2 avant expérimentation (service de zootechnie de TIFR31 à Toulouse), selon des cycles diurnes et nocturnes de 12 heures. Les souris Swiss nu/nu sont hébergées au nombre de 5 par cages sur portoir ventilé.
- Injection des cellules Capan-1 Préparation des suspensions cellulaires injectables Le milieu de culture de cellules Capan-1 est aspiré et les cellules rincées par 10 ml de PBS stérile. Après 5 minutes d'incubation à température ambiante, le PBS est aspiré, et les cellules sont dissociées à l'aide de 3 ml d'une solution de trypsine/EDTA, pendant 5 minutes à 37°C. Les cellules sont ensuite reprises dans 7 ml de milieu complet puis dissociées à la pipette après 10 cycles d'aspiration/refoulement, puis récoltées dans un tube de 50 ml stérile (Falcon Blue Max 50 ml 352070). Les cellules sont comptées à l'aide d'un compteur de cellules Z.I. Coulter. L'équivalent de 107 cellules Capan-1 par souris à injecter est centrifugé pendant 5 min à 1400 rpm (200 g) en conditions stériles.
Le surnageant est éliminé, puis le culot est repris dans 25 ml de milieu complet puis dissocié à la pipette après 10 cycles d'aspiration/refoulement afin d'éliminer toute trace de trypsine. Après une centrifugation de 5 min à 1400 rpm (200 g), le surnageant est éliminé, et le culot est soumis à 3 cycles de lavages dans du milieu RPMI afin d'éliminer toute trace de sérum. Enfin, 107 cellules Capan-1 sont reprises dans 100 μl de PBS stérile pour culture cellulaire. Implantation des tumeurs Capan-1
Les souris, strictement manipulées sous hotte PSM (Poste de Sécurité Microbiologique), sont identifiées grâce à leur tatouage, pesées, puis anesthésiées par isofluorane 0,1 % (Aerrane, Baxter) pendant 5 minutes avant manipulation. Ce protocole d'anesthésie générale permet un confort dans la manipulation des individus et assure la reproductibilité des résultats, tout en prévenant des artefacts expérimentaux consécutifs au stress de l'animal. Après constatation de l'endormissement de l'animal, les cellules Capan-1 (100 μl) sont injectées en sous-cutané dans le flanc gauche de l'animal, à l'aide d'une seringue tuberculine 0,3 ml 29G sur 33 mm sans volume mort, à la vitesse de 1 ml/h. Le site de l'injection est désinfecté, et les souris reconditionnées dans des cages à litière propre. Le réveil des souris dans ces conditions d'expérimentation est constaté 5 à 7 minutes après anesthésie. Les signes vitaux des souris injectées sont analysés macroscopiquement 24 et 48 h suivant l'opération. Dans ces conditions, le taux de mortalité mesuré est de 0 %.
5) Injection des cellules de la sous-population de cellules adhérentes
L'injection de la sous-population de cellules adhérentes est réalisée 11 à 14 jours après implantation des tumeurs Capan-1 dans les souris athymiques
Swiss nu/nu. Le volume moyen des tumeurs est alors de 250±18 mm3. Comme indiqué précédemment, les souris, strictement manipulées sous hotte PSM, sont identifiées grâce à leur tatouage, pesées, puis anesthésiées par isofluorane 0,1 % pendant 5 minutes avant manipulation. Après constatation de l'endormissement de l'animal, les cellules (5x105 dans 50 μl de PBS) sont injectées soit directement dans la tumeur, soit dans la veine caudale.
Pour la greffe intratumorale, les cellules sont injectées à l'aide d'une seringue tuberculine 0,3 ml 29G sur 33 mm sans volume mort, à la vitesse de 1 ml/h. Dans ce contexte, les cellules sont dans un environnement uniquement de cellules tumorales pancréatiques ; elles ne sont pas en contact avec le tissu pancréatique sain. Pour l'injection intraveineuse, les souris sont placées en chambre d'injection chauffée à 50°C pour faciliter la dilatation de la veine caudale, et les cellules sont injectées à l'aide d'un dispositif pour lymphographie sans volume mort de calibre 29G en PVC.
Dans les deux cas, 50 μl de PBS stérile sont injectés dans les souris contrôles soit au niveau intra-tumoral soit par voie systémique. Le site de l'injection est désinfecté, et les souris reconditionnées dans des cages à litière propre.
6) Analyse statistique
L'analyse statistique est réalisée à l'aide du logiciel Graphpad Instat V3.05. L'analyse de variance est réalisée par le test unilatéral ANOVA complété par un test de comparaisons multiples Srudent-Newman-Keuls. Une probabilité inférieure à 0.05 est considérée comme statistiquement significative.
7) Détection de Vapoptose par la technique TUNEL
L'apoptose des cellules cancéreuses est détectée sur des cultures de cellules Capan-1 ou sur des coupes de tumeurs pancréatiques provenant du modèle murin décrit dans l'Exemple 1.4) à l'aide de la technique TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end labeling). Cette technique est basée sur l'incorporation de nucléotides marqués au niveau des extrémités 3'OH libres des fragments d'ADN générés lors de l'apoptose (Gavrieli et al, 1992, the Journal of CeIl Biology, Vol. 119, n°3, pages 493-501). Elle est mise en œuvre ici, à l'aide du kit ApopDETEK (EnzoDiagnostic, NY, USA) en suivant les recommandations du fabricant. EXEMPLE 2 : Effet anti-tumoral in vivo des cellules dérivées du tissu adipeux
L'effet anti-tumoral des cellules de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux extra-médullaire est évalué lorsque lesdites cellules sont injectées au niveau intra-tumoral ou par voie systémique chez des souris Swiss nu/nu développant une tumeur pancréatique dérivée des cellules Capan-1. 1) Injection intra-tumorale
Les conditions de préparation des souris, de l'injection des cellules Capan-1 et de l'injection de la sous-population de cellules adhérentes sont décrites dans l'Exemple I.
Après l'injection de la sous-population de cellules adhérentes, le poids des souris et la croissance des tumeurs sont mesurés et répertoriés tous les 2 jours et ce jusqu'à 14 jours suivant l'injection desdites cellules, la croissance tumorale étant mesurée in situ sur l'animal vivant. La mesure des longueurs (L) et largeurs (1) des tumeurs Capan-1 est réalisée à l'aide d'un pied à coulisse, selon le calcul suivant : Volume tumoral (mm3) = L2 (mm) x 1 (mm) x 0,52 Le pourcentage de progression tumorale est évalué 3, 6 et 13 jours après injection intra-tumorale desdites cellules ou de PBS (contrôle) selon la formule suivante :
% de progression tumoral au temps t = [(volume tumoral au temps t)/( volume tumoral à to)]xlOO ; to correspondant à l'injection de la sous-population de cellules adhérentes ou de PBS.
L'expérimentation est stoppée 10 à 15 jours après transfert de la sous-population de cellules adhérentes (21 à 39 jours après implantation des tumeurs) en raison de la progression exponentielle des tumeurs témoins, de leur ulcération et du risque de décès élevé des souris portant ces tumeurs. Outre la détermination de la progression tumorale au moyen de la mesure de la taille de la tumeur, le poids de la tumeur est également déterminé. Pour cela, les souris sont sacrifiées treize jours après injection intra-tumorale des cellules et les tumeurs sont prélevées, pesées et photographiées.
Les valeurs obtenues d'une part pour la progression tumorale et d'autre part pour la mesure du poids de la tumeur sont représentatives de 3 expériences indépendantes, correspondant à trois préparations différentes de la sous-population de cellules adhérentes, et 5 souris par groupe.
Les résultats du test d'inhibition de la progression tumorale sont illustrés dans la figure 1. Ils montrent une diminution drastique et significative de la taille des tumeurs Capan-1 de 46 % ± 13 %, 38 % ± 8 % et 57 % ± 14 % respectivement 3, 6 et 13 jours après l'injection des cellules de la sous-population. Ces données montrent un effet anti-tumoral se manifestant par la diminution drastique de la progression des tumeurs pancréatiques Capan-1 après transfert intra- tumoral de cellules. L'expérience n'a pu être poursuivie en raison de la croissance exponentielle et de l'ulcération des tumeurs témoins. Les résultats relatifs à la mesure du poids et de la taille des tumeurs
13 jours après l'injection de la sous-population de cellules adhérentes sont illustrés dans la figure 2. Ils montrent une diminution de 50 % ± 0,1 % du poids des tumeurs Capan-1 après injection intra-tumorale desdites cellules. Ces résultats sont en accord avec ceux relatifs au pourcentage de progression tumorale, obtenus à partir de la mesure extrinsèque de la taille des tumeurs (figure 1) et confirment donc le rôle antitumoral des différentes cellules lorsque celles-ci sont injectées au niveau intra-tumoral. 2) Injection systémique
Parallèlement à ces études de diminution de la progression tumorale par une injection intra-tumorale de la sous-population de cellules adhérentes, les Inventeurs ont procédé à l'administration de ces cellules par voie sanguine, afin de déterminer si elles pouvaient migrer jusqu'au site de la tumeur et y exercer leur effet.
Les conditions de préparation des souris et d'injection des cellules Capan-1, de la sous-population de cellules adhérentes et du PBS sont décrites dans l'Exemple I. Plus précisément, les Inventeurs ont comparé l'effet des cellules de la sous-population administrées soit directement dans les tumeurs Capan-1 (injection intra-tumorale) soit dans la veine caudale (injection systémique). La taille des tumeurs est mesurée comme indiqué ci-dessus 3 jours après le transfert des cellules de la sous- population. Les valeurs obtenues sont représentatives de 2 expériences indépendantes correspondant à deux préparations de cellules différentes, et 3 ou 4 souris par groupe. Les résultats sont illustrés dans la figure 3. Ils montrent que l'amplitude de l'inhibition de la progression tumorale mesurée 3 jours après transfert des cellules de la FSV, lorsque celles-ci sont injectées dans la veine caudale des souris porteuses de tumeurs Capan-1, est comparable à celle observé lorsque ces cellules sont directement administrées dans la tumeur (-56 % ± 22 % vs -65 % ± 26 %).
Ces résultats sont en faveur d'un effet anti-tumoral in vivo des cellules de la sous-population lorsque celles-ci sont injectées par voie systémique. L'ensemble des résultat présentés dans l'Exemple 2, montrant l'inhibition de la progression tumorale par les cellules de la sous-population injectées localement au niveau intra-tumoral ou bien administrées par voies systémique au niveau de la veine locale suggère fortement un rôle anti-tumoral des cellules de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux blanc extra-médullaire. En outre, ces résultats montrent le ciblage de la tumeur pancréatique par les cellules de la FSV sélectionnées sur la base de leur adhérence sur le support de culture lorsque celles-ci sont administrées à distance dans la circulation sanguine systémique. EXEMPLE 3 : Mesure de la viabilité ceUulaire Les Inventeurs ont également mesuré la viabilité des cellules
Capan-1 en présence de surnageant de cultures de la sous-population de cellules adhérentes in vitro, afin de confirmer et de valider les résultats obtenus in vivo (Exemple 2).
Les cellules Capan-1 sont ensemencées en sextuplés dans des boîtes de culture 96 puits à fond plat (Nunc 167008), à raison de 25000 cellules par puits dans un volume final de 100 μl, 48 h après, les cellules sont rincées puis traitées :
- par 100 μl de milieu RPMI sans sérum (témoin négatif, non représenté sur la figure
4) ;
- par 100 μl de milieu RPMI complet (témoin positif, non représenté sur la figure 4) ; - par 100 μl de milieu DMEM : Fl 2 supplémenté de 10 μg/ml de TNF-α (témoin positif d'inhibition de la viabilité) ;
- par 100 μl de milieu DMEM : Fl 2 OK - par 100 μl de surnageant de culture de cellules de la sous-population de cellules adhérentes ; ou
- par 100 μl de surnageant de co-culture de cellules de la sous-population de cellules adhérentes et de cellules Capan-1. Le surnageant de culture de cellules de la sous-population de cellules adhérentes est obtenu après 48 heures de culture dans le milieu DMEM : Fl 2 OK ; le surnageant de co-culture de cellules de la sous-population de cellules adhérentes et de cellules Capan-1 est obtenu après 48 heures d'une culture de cellules adhérentes et de cellules Capan-1 dans le milieu DMEM : F 12OK, selon un rapport initial cellules Capan-1 /cellules adhérentes de 5/1 ou de 1/1 (respectivement surnageant de co-culture 1 et surnageant de co-culture 2).
Deux jours (48 h) après, la mesure de la viabilité cellulaire est réalisée à l'aide du kit CellTiter 96® AQueous One Solution CeIl Prolifération Assay (Promega G3582). Les valeurs obtenues sont représentatives de 3 expériences indépendantes correspondant à trois préparations de cellules de sous-population différentes.
Les résultats sont illustrés dans la figure 4. Ils montrent que le milieu conditionné par la sous-population de cellules adhérentes (surnageant de culture) est capable d'inhiber de façon significative la viabilité des cellules Capan-1. De plus, le surnageant de co-cultures de la sous-population de cellules adhérentes avec des cellules Capan-1 présente un effet inhibiteur sur la viabilité des cellules Capan-1 plus prononcé que le surnageant conditionné par la sous-population de cellules adhérentes seules, ce qui montre que ces cellules sont capables de réagir à la présence de cellules cancéreuses pancréatiques. Ces résultats sont en faveur d'un effet anti-tumoral d'un milieu conditionné par les cellules de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux blanc extra-médullaire, ledit effet pouvant être amplifié lorsque les cellules sont activées par des cellules cancéreuses telles que les cellules de la lignée Capan-1. EXEMPLE 4 : Induction de l'apoptose Les Inventeurs ont recherché si l'effet anti-tumoral des cellules de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux blanc extra-médullaire et des surnageants de culture et de co-culture est dû à l'induction de l'apoptose des cellules cancéreuses. 1) Induction in vitro de l'apoptose des cellules Capan-1
Les cellules Capan-1 sont ensemencées en triplicate et cultivées sur Labteck 4 puits (Dutscher), à raison de 50 000 cellules par puits, dans un volume final de 500 μl, puis rincées et sont traitées par : - 500 μl de milieu DMEM : F 12OK ou de milieu RPMI 10 % ;
- 500 μl de surnageant de culture de cellules de la sous-population de cellules adhérentes ;
- 500 μl de surnageant de co-culture 1 ;
- 500 μl de surnageant de co-culture 2 ; Le surnageant de culture de cellules de la sous-population de cellules adhérentes est obtenu comme indiqué dans l'Exemple 3.
24 heures après, l'apoptose est évaluée par la technique TUNEL comme indiqué dans l'Exemple 1.7).
Les résultats sont illustrés sur la Figure 5. On observe un marquage nucléaire des cellules Capan-1 traitées par le surnageant de culture des cellules de la sous-population de cellules adhérentes (Figure 5B). Ce marquage n'est pas observé pour les cellules Capan-1 mises en présence de milieu DMEM : F12 OK ou de RPMI 10 % (Figure 5A). Pour les cellules Capan-1 traitées par le surnageant de co-culture 1, le marquage nucléaire est plus intense (Figure 5C) et l'intensité est encore augmentée par un traitement avec le surnageant de co-culture 2, pour lequel on observe en outre une condensation du cytoplasme (Figure 5D). Ces résultats montrent une augmentation quantitative de la fragmentation de I1ADN en présence de surnageant de co-culture, et donc une augmentation de l'apoptose des cellules Capan-1. Ces résultats montrent donc que le surnageant de culture des cellules de la sous-population de cellules adhérentes, et le surnageant de co-culture des cellules de la sous-population de cellules adhérentes sont capables d'induire in vitro l'apoptose des cellules Capan-1.
2) Induction in vivo de l'apoptose des cellules cancéreuses pancréatiques Les conditions de préparation des souris, de l'injection des cellules
Capan-1 et de l'injection intra-tumorale de la sous-population de cellules adhérentes sont décrites dans l'Exemple I. Cinq jours après l'injection des cellules de la sous-population de cellules adhérentes, des biopsies de tumeur pancréatique sont prélevées puis des coupes sont préparées. Pour le témoin négatif, des coupes de tumeurs sont préparées à partir de souris n'ayant pas reçu de cellules de la sous-population de cellules adhérentes. L'apoptose est détectée dans ces deux types de préparation à l'aide de la technique TUNEL comme indiqué dans l'Exemple 1.7).
Les résultats sont indiqués dans la Figue 6.
Aucun marquage n'est détecté dans les coupes de tumeurs provenant des souris témoin (Figure 6A). En revanche, on observe un marquage nucléaire pour de nombreuses cellules cancéreuses provenant de souris ayant subi l'injection de cellules de la sous-population de cellules adhérentes (Figure 6B) ce qui montre l'entrée en apoptose de ces cellules.
Ces résultats indiquent que les cellules de la sous-population des cellules adhérentes sont capables d'induire in vivo l'apoptose des cellules cancéreuses.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Utilisation de cellules isolées du tissu adipeux blanc extra-médullaire, sélectionnées dans le groupe constitué par la fraction stroma- vasculaire et une sous-population de ladite fraction stroma-vasculaire constituée par des cellules adhérentes, pour la préparation d'un médicament anti-tumoral.
2°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite sous-population de cellules adhérentes est susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant :
- l'obtention de la fraction stroma-vasculaire à partir du tissu adipeux blanc extra-médullaire ;
- la purification de ladite fraction stroma-vasculaire ;
- l'isolement de ladite sous-population de cellules à partir de ladite fraction purifiée par mise en culture primaire dans un milieu liquide convenable, sélection des cellules adhérentes sur un support de culture, récupération des cellules après confluence, dans un milieu convenable, centrifugation et récupération du culot.
3°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdites cellules sont associées à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
4°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que lesdites cellules comprennent un gène hétérologue, dont le produit de traduction est une protéine d'intérêt thérapeutique, telle qu'une enzyme capable de métaboliser une pro-drogue en composé(s) actif(s) toxique(s) pour la cellule tumorale.
5°) Utilisation selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit médicament anti-tumoral est constitué par le surnageant de culture de ladite sous- population de cellules adhérentes.
6°) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit surnageant est obtenu à partir d'une co-culture de ladite sous-population de cellules avec des cellules cancéreuses ou avec des cellules d'une lignée cellulaire cancéreuse. 7°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit cancer est un cancer solide ou un cancer liquide. 8°) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit cancer est un cancer solide du tractus gastro-intestinal (cancer du pancréas, cancer gastrique, cancer colo-rectal).
9°) Utilisation d'un agent anti -tumoral tel que défini aux revendications 1 à 6, à savoir sélectionné dans le groupe constitué par des cellules du tissu adipeux blanc extra-médullaire telles que définies à la revendication 1, le surnageant de culture desdites cellules ou le surnageant d'une co-culture desdites cellules avec des cellules cancéreuses ou des cellules d'une lignée cellulaire cancéreuse convenable, pour la préparation d'un adjuvant en thérapie anti cancéreuse. 10°) Utilisation d'un agent anti-tumoral tel que défini aux revendications 1 à 6, à savoir sélectionné dans le groupe constitué par des cellules du tissu adipeux blanc extra-médullaire telles que définies à la revendication 1, le surnageant de culture desdites cellules ou le surnageant d'une co-culture desdites cellules avec des cellules cancéreuses ou des cellules d'une lignée cellulaire cancéreuse convenable, pour cribler in vitro d'autres médicaments anti-tumoraux, notamment aptes à agir en synergie avec lesdites cellules ou surnageant desdites cellules.
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