WO2007138143A2 - Anticuerpos monoclonales anti-colina quinasa alfa y su uso en técnicas analíticas, de diagnóstico del cáncer y en la preparación de medicamentos - Google Patents

Anticuerpos monoclonales anti-colina quinasa alfa y su uso en técnicas analíticas, de diagnóstico del cáncer y en la preparación de medicamentos Download PDF

Info

Publication number
WO2007138143A2
WO2007138143A2 PCT/ES2007/000364 ES2007000364W WO2007138143A2 WO 2007138143 A2 WO2007138143 A2 WO 2007138143A2 ES 2007000364 W ES2007000364 W ES 2007000364W WO 2007138143 A2 WO2007138143 A2 WO 2007138143A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
monoclonal antibody
human
antibody
choline kinase
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2007/000364
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2007138143A3 (es
Inventor
Ana Ramirez De Molina
David Gallego Ortega
Juan Carlos Lacal Sanjuan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority to EP07788612A priority Critical patent/EP2025686A4/en
Publication of WO2007138143A2 publication Critical patent/WO2007138143A2/es
Publication of WO2007138143A3 publication Critical patent/WO2007138143A3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57557—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of other specific parts of the body, e.g. brain
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases
    • G01N2333/91215—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases with a definite EC number (2.7.1.-)

Definitions

  • the invention relates to monoclonal antibodies capable of binding to human choline kinase alpha.
  • the invention relates to monoclonal antibodies AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11, AD12, AD13 and AD14, to the hybridomas that produce them, the compositions containing them , the use thereof to detect and / or quantify the presence of the human choline kinase alpha protein and the methods to perform in vivo diagnoses of the presence of tumors in an individual or to predict their possible evolution that make use of said antibodies.
  • Choline kinase ⁇ (ChoK ⁇ ) is the first enzyme in the Kennedy route for the biosynthesis of phosphatidylcholine (PC), the main phospholipid of biological membranes.
  • PC phosphatidylcholine
  • PCho phosphorylcholine
  • ChoK is overexpressed in a high percentage of cell lines derived from human tumors, as well as in different human tumor tissues such as breast, lung, colon and prostate (5,6). Taken together, these tumors represent more than 70% of the total number of cancer cases in developed countries. The incidence of overexpression or increase in ChoK activity in these four types of cancer ranges between 40% and 60% (5-7). Recently, the authors of the present invention demonstrated not only that the choline kinase alpha protein is increased in the mentioned human tumor tissues (breast, lung, colon and prostate), but it is also increased in other types of tumors such as bladder and hematological tumors .
  • the procedures designed for the early and reliable diagnosis of cancer provide valuable information that can improve the treatment of this disease, helping to achieve an increase in life expectancy.
  • the methods that comprise the determination of ChoK ⁇ overexpression in human tumors could represent a significant advance both in the diagnosis of cancer and in the identification of potential candidates for therapy using ChoK inhibitors.
  • the development of these methods implies the development of appropriate reagents and methodologies that allow the determination of ChoK ⁇ overexpression.
  • a suitable tool for accurately determining an increase in ChoK ⁇ levels in tissue samples could be monoclonal antibodies, which are populations of antibody molecules, all identical, produced by a single cell clone, which have the same specificity, as opposed to polyclonal antibodies or polyserums, which are complex populations of antibodies, formed by different classes of immunoglobulin molecules in which a variety of specificities are present.
  • the present invention provides a set of monoclonal antibodies directed against ChoK ⁇ , useful as tools in various molecular biology techniques, including the analysis of biological samples, as well as in immunohistochemical studies, especially in those carried out on human tissue samples such as part of diagnostic or prognostic methods of the existence of cancer in said tissue, possible use of which evidence is provided.
  • These antibodies constitute a specific tool that allows the detection of ChoK ⁇ without interacting, for example, with another soenzyme with the one that holds a 70% homology, the choline kinase beta.
  • both methods are provided to diagnose the survival time of a patient suffering from cancer and methods of monitoring the effect of cancer therapies, both based on the evaluation of the level of expression of the choline kinase protein alpha by, for example, the determination of the concentration of said protein in tissue samples taken from the patient.
  • the performance of said methods would not be possible with the antibodies known in the state of the art, polyclonal and Npecific, and requires the specificity of monoclonal antibodies whose obtaining and characteristics are described in the present invention, whose existence, as well as their properties, have not been made accessible in any way to the general public at the time of presentation of this report.
  • one aspect of the invention constitutes the monoclonal antibodies AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11, AD12, AD13 and AD14, which specifically bind to the choline kinase protein human alpha
  • a second aspect of the invention constitutes the hybridoma cell lines capable of producing the monoclonal antibodies AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11, AD12, AD13 and AD14.
  • compositions comprising one or more of the monoclonal antibodies AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11, AD12, AD13 and AD14.
  • a further aspect of the invention is the use of monoclonal antibodies AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11, AD12, AD13 and AD14 to detect and / or quantify the presence of choline Human alpha kinase in any sample.
  • Another aspect of the invention is the in vitro diagnostic methods of cancer, particularly breast, lung, colon, prostate, bladder or hematological tumors, which comprise the detection of human choline kinase alpha protein present in a biological sample taken from a human being and / or the quantification of the human choline kinase alpha protein through the use of one or more of the monoclonal antibodies AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11, AD12, AD13 and AD14.
  • test kits for the diagnosis of cancer, the prognosis of its evolution, the monitoring of said evolution or the evaluation of a cancer therapy comprising at least one of the monoclonal antibodies of the invention: AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11, AD12, AD13 and AD14.
  • Figure 1 shows the tests performed during the generation and selection of the monoclonal antibodies and hybridomas of the invention.
  • Part A shows the Western blot analysis of sera from immunized mice (R1, R2, R3, R4, R5 and R6), compared to the results obtained with a preimmune serum (Preimm.) And a polyclonal serum (Poly) ; in all cases, lane 1 corresponds to extracts of human HEK293T cells transfected with an empty vector, which does not express ChoK ⁇ , as a control and lane 2 to HEK293T cells that overexpress ChoK ⁇ because they have been transfected with an expression vector of said protein .
  • Preimm. preimmune serum
  • Poly polyclonal serum
  • Part B shows an example of the ELISA assays performed during the hybridoma selection, the one corresponding to the AD1 antibody hybridoma: the wells of the left column were coated with recombinant ChoK ⁇ and those of the right with GST and were incubated with GST.
  • AD1 supernatant of the hybridoma culture medium corresponding to the AD1 antibody
  • ChoK PoAC Ctrl .- * -
  • polyclonal anti-ChoK ⁇ antibody polyclonal anti-ChoK ⁇ antibody.
  • Part C shows an example of the confirmation of the hybridoma selection by immunocytochemistry (cytospin) of HEK293 cells transfected with a vector that does not express ChoK ⁇ (photo marked as HEK-Ctrl) or with a ChoK ⁇ expression vector (photo marked as HEK + ChoK ⁇ ) that underwent an immunostaining process with the culture supernatant of the same hybridoma.
  • cytospin immunocytochemistry
  • Figure 2 shows an example of immunoassays on Western blots performed with antibodies of the invention.
  • Part A shows the results obtained by incubating used HEK293 cells transfected with an empty vector (lane marked “Vector”) or HEK293 cells transfected with a ChoK ⁇ expression vector (lanes marked as "ChoK ⁇ ) either with a polyclonal anti-ChoK ⁇ antibody (photograph marked” ChoK PoAb ”) or with the monoclonal antibody of the invention (photograph marked” ChoK MoAb ”) indicated on each street.
  • Part B shows the Results obtained by incubating used cells expressing the mouse ⁇ choline kinase, NIH3T3-Tmar-9 (streets marked with number 9) or NIH3T-Tmar-11 (streets marked with number 11) with antibodies AD6 and AD9.
  • Figure 3 shows examples of negative staining (upper left photo), weak (upper right photo) and strong (lower photographs) of samples taken from colorectal tumors on which an immunohistochemical analysis (IHQ) with the AD9, AD6 antibodies was performed , AD1 and AD2 as indicated under each photograph.
  • IHQ immunohistochemical analysis
  • Figure 4 shows the immunohistochemical analysis of lung (1) and breast (2) tumors with representative anti-ChoK ⁇ monoclonal antibodies.
  • the photographs marked with the letters A (1A and 2A) and B (1 B and 2B) correspond to strongly stained tumor tissues, with a slight basal staining of the adjacent normal tissues.
  • the photographs marked with the letter C (1C and 2C) correspond to samples of both types of tumors in which staining with these antibodies useful in immunohistochemistry was negative. Contrast staining was performed with hematoxylin.
  • the invention relates to monoclonal antibodies AD1, AD2, AD3,
  • ChoK ⁇ protein choline kinase alpha
  • its overexpression seems to be involved in the carcinogenesis of breast, lung, colon and prostate tumors in humans, which points towards it as a potential marker of tumors (5,6). Detection and Quantification of their levels, however, requires the development of appropriate tools for this, such as monoclonal antibodies, especially those that have high specificity and sensitivity to this antigen, ChoK ⁇ . Therefore, the invention provides the monoclonal antibodies AD1,
  • AD4 and AD10 effectively bind to the mouse choline kinase (mChoK) in an immunoassay performed on proteins transferred to nitrocellulose membranes, which demonstrates the high specificity of the monoclonal antibodies of the invention, especially AD1, AD2, AD3, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11, AD12 , AD13 and AD14.
  • the corresponding hybridomas capable of producing each of said antibodies are also provided, which allows them to be obtained in large quantities and facilitates their purification.
  • the monoclonal antibodies of the invention constitute a useful and reliable tool to be used in basic assay techniques such as the immunoassay performed on proteins transferred to membranes (technique known as Western blotting and abbreviated WB, of its English name Western blot) and Ia immunoprecipitation (IP), so they could be excellent tools to increase the knowledge of the biology of ChoK ⁇ or for any type of assay in which it is desired to check the presence of said protein and / or perform a quantification of the same.
  • basic assay techniques such as the immunoassay performed on proteins transferred to membranes (technique known as Western blotting and abbreviated WB, of its English name Western blot) and Ia immunoprecipitation (IP), so they could be excellent tools to increase the knowledge of the biology of ChoK ⁇ or for any type of assay in which it is desired to check the presence of said protein and / or perform a quantification of the same.
  • one or more monoclonal antibodies selected from the group of AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11, AD12, AD13 and AD14 for the detection and / or quantification of the protein kinase alpha in any sample.
  • samples that are biological samples understanding as such any sample taken from a human being, either from a tissue of his or from some of the so-called biological fluids, of that the most typical are urine, blood and plasma obtained from it, although any other body fluid, such as cerebrospinal fluid or synovial fluid, is also included within this denomination.
  • the technique used for the detection and / or quantification of the human choline kinase alpha protein by one or more monoclonal antibodies of the invention can be any of the techniques known to those skilled in the art, including those that make use of Western blots, immunoprecipitation or, in the case of tissues, immunohistochemical techniques, of which specific tests with the monoclonal antibodies of the invention are also described in the Examples that appear below.
  • the immunoprecipitation tests carried out to characterize the antibodies of the invention have revealed that the epitopes recognized by each of these antibodies are not the same, since some of them seem to interfere with the enzymatic activity, it is not possible to detect choline kinase enzymatic activity from of choline kinase alpha proteins immunoprecipitated with some of the monoclonal antibodies of the invention, while others (AD1, AD2, AD4, AD5, AD7, AD13 and AD14) do not prevent immunoprecipitated proteins from showing this enzymatic activity when the substrate is provided and the right conditions.
  • these last antibodies are the preferred antibodies to be used in any assay that involves the immunoprecipitation of choline kinase alpha so that said protein retains its choline kinase activity, especially AD1, AD4, AD5, AD7 and AD13, which give rise to a greater degree of enzymatic activity in the immunoprecipitates generated with them.
  • Another technique of clinical importance in which monoclonal antibodies are useful are immunohistochemical studies, a technique that aims to detect and identify in situ biomolecular components that are an integral part of cells and tissues.
  • This technique can be very useful for the in vitro diagnosis of cancer in tissue samples taken from patients, by testing a specific marker, of which its association with cancer.
  • studies indicate that ChoK ⁇ represents a new and important marker of tumors, whose expression appears increased in a significant percentage of tumors, specifically in 40-60% of breast, colon, lung, prostate, bladder tumors or hematological tumors, having also demonstrated both the induction capacity of tumors in vivo from the overexpression of this enzyme and the effectiveness of its inhibition as an antitumor strategy.
  • the monoclonal antibodies of the invention for the detection and / or quantification of ChoK ⁇ protein by immunohistochemical techniques, preferably applied to tissue samples taken from humans, especially In the case of samples of breast, colon, lung or bladder tissue, it also includes, in addition, any method for the diagnosis of cancer, the prognosis of its evolution, the monitoring of said evolution or the evaluation of the response to a treatment in which the ChoK ⁇ protein is detected and / or quantified, by means of the monoclonal antibodies of the invention.
  • the in vivo methods for diagnosing the existence of cancer in a patient, the prognosis of its evolution, the monitoring of said evolution or for the evaluation of the response to a treatment in those that use at least one of the monoclonal antibodies of the invention for the detection and / or the quantification of the human choline kinase alpha protein may be used, being the studies in which both retrospective and prospective methods can be used.
  • the use of the antibodies AD1, AD2, AD4, AD5, AD7, AD13 and AD14 is preferred and, within these, the antibodies AD1, AD4, AD5, AD7 and AD13 are especially preferred, since they are the most sensitive ones shown in the tests performed For the realization of these methods, it is preferred that the samples to be analyzed are tissue samples taken from a human being, especially those taken from the breast, colon, lung or bladder.
  • compositions comprising at least one of the antibodies AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11, AD12, AD13 and AD14 or are also object of the invention. combinations thereof.
  • the antibodies present in these compositions may be bound to different substances or particles, which may be substances or particles that facilitate their detection or substances or particles that facilitate the extraction of the antibody from the medium in which it is found, generally for the purpose of isolate the complexes formed after their reaction with the antibody.
  • substances that facilitate the detection of the antibody are a radioactive molecule, a chromophore, a fluorophore, or an enzyme that catalyzes a reaction that gives rise to an easily detectable product (such as a radioactive molecule, a chromophore or a fluorophore) or starting from a compound in which the decrease in its concentration is also easy to detect (which can also be a radioactive molecule, a chromophore or a fluorophore).
  • an easily detectable product such as a radioactive molecule, a chromophore or a fluorophore
  • a compound in which the decrease in its concentration is also easy to detect which can also be a radioactive molecule, a chromophore or a fluorophore.
  • the typical examples of the substances or particles that facilitate the extraction of the antibody from the medium in which they are found are the metallic particles or the magnetic particles, which allow the isolation of the molecules coupled to them by means of the use of magnetic fields; It is also an example of such substances or particles as any molecule that has a high affinity for another and that allows the antibody to bind to some type of matrix or solid medium to which the second molecule is linked by which the molecule bound to the antibody It has high affinity.
  • compositions of the invention are also those that additionally comprise a second antibody capable of binding to at least one antibody of the invention present in the composition of the invention.
  • the second antibodies that interact with the Fc fragment of the antibodies of the invention are preferred so that they do not interfere with their binding to the human choline kinase alpha antigen.
  • the second antibody can be of any origin, either a goat anti-mouse IgG antibody generated as used in the examples described below, or generated in any other species.
  • the second antibody will be bound to another substance or particle, which may be either a substance that facilitates its detection or a substance or particle that facilitates the extraction of the antibody from the medium in which it is found, generally with the purpose of isolating the complexes formed after their reaction with the antibody.
  • the examples of these substances or particles are the same as those mentioned in the case of the possible substances or particles bound to the antibodies of the invention.
  • a kit for the diagnosis of cancer, the prognosis of its evolution, the monitoring of said evolution or the evaluation of a cancer therapy comprising at least one of the monoclonal antibodies of the invention.
  • kits comprising a second antibody capable of binding to at least one antibody of the invention present in the kit of the invention are preferred.
  • the second antibodies that interact with the Fc fragment of the antibodies of the invention are preferred.
  • the second antibody can be of any origin, either a goat anti-mouse IgG antibody generated as used in the examples described below, or generated in any species other than mouse.
  • the second antibody will be bound to another substance or particle, which may be either a substance that facilitates its detection or a substance or particle that facilitates the extraction of the antibody from the medium in which it is found.
  • the human ChoK ⁇ was carried out as previously described in the form of a GST-ChoK ⁇ fusion protein (5,4,15 ). Briefly, the cDNA encoding human ChoK ⁇ was subcloned into a prokaryotic expression vector, pGEX-4T2, a vector that possesses the coding sequence of glutathione-S-transferase, so that the expression of said vector gives rise to a protein GST-ChoK ⁇ fusion.
  • the presence of the GST protein which has the ability to bind to a semisolid phase of sepharose that carries glutathione together, facilitates the semi-purification of the fusion protein of the rest of the bacterial proteins. Therefore, a standard procedure for purification was followed by the glutathione-sepharose method following the manufacturer's instructions (Amersham Biosciences Europe, Germany). Once the ChoK ⁇ of the GST was released by thrombin proteolysis, the partially purified ChoK ⁇ was resolved by electrophoresis of proteins in polyacrylamide gels with SDS (SDS-PAGE).
  • the area containing the corresponding ChoK ⁇ band was extracted from the gel and the extracted gel fragment was homogenized in PBS with Freund's adjuvant, either complete or incomplete (supplied in both cases by Sigma-Aldrich, MO, USA). ) (1: 1, volume: volume) according to the immunization phase in which it is desired to use the emulsion obtained.
  • mice of the strain Balb / c were immunized intraperitoneally (i.p.), following the following schedule:
  • - Day 1 0.5 ml ip injection of antigen homogenate, containing 100 ⁇ g of purified recombinant ChoK ⁇ with Freund's complete adjuvant.
  • - Day 15 (booster dose 1): 0.5 ml ip injection of antigen homogenate, containing 100 ⁇ g of purified recombinant ChoK ⁇ but, in this case, mixed with incomplete Freund's adjuvant.
  • - Day 30 (booster dose 2): 0.5 ml ip injection of antigen homogenate, containing 100 ⁇ g of purified recombinant ChoK ⁇ mixed with incomplete Freund's adjuvant.
  • mice with a positive immune response against ChoK ⁇ were identified by Western blotting against partially purified protein, as shown in part A of Figure 1. Of all the mice, mice 2 and 2 were selected for fusion. 4 (2 for intravenous injection and 4 for intraperitoneal injection), because they had the least nonspecific bands.
  • - Day 42 boost dose 3: IV injection (mouse 2) or i.p. (mouse 4) of
  • mice were prepared by fusion of splenocytes 3 days after the last booster dose.
  • the spleens were removed aseptically from each of the mice and deposited on a plate containing 10 ml of Dulbecco-modified Eagle's Medium (DMEM) without serum, the tissue was disrupted until most of the cells they had been released, and then the splenocytes were collected discarding the larger pieces of tissue (16).
  • DMEM Dulbecco-modified Eagle's Medium
  • NS-1 myeloma cells were used, which were grown in medium supplemented with 10% serum under standard conditions of temperature and humidity, and with 5% CO 2 .
  • the cells were transferred to fresh medium supplemented with 10% FBS at a final concentration of 5 x 10 6 cells / ml.
  • FBS 10% FBS
  • hybrids of interest were selected keeping the cells 15 days in HAT medium supplemented following the manufacturer's recommendations (GIBCO, Invitrogen, California, USA), medium in which it is produced The cell death of all those cells that do not correspond to hybrid molecules of the two populations between which the fusion has been performed.
  • the hybridomas were cloned by means of the limit dilution technique, of which two consecutive rounds of growth were performed.
  • Multi-well microtiter plates (NUNC, Germany) were coated using 50 ⁇ l / well of recombinant ChoK ⁇ at 5 ⁇ g / ml or GST in distilled water. After one hour of incubation at 37 0 C, the plates were washed with PBS / Tween 20 to 0.05%, and blocked with 10% milk in PBS, place overnight at 4 0 C. The plates were washed and incubated with 50 ⁇ l / well of supernatant for 1 hour at 37 ° C. The wells were washed, and a secondary goat anti-mouse antibody with HRP (horseradish peroxidase) (Dako Cytomation, California) was added to a 1: 1000 dilution. Plates were incubated for 1 hour at 37 0 C, washed and developed using a solution with the colorimetric substrate ABTS (BIO-RAD, California). The reaction was stopped by adding 100 ⁇ l of 0.5% SDS.
  • HRP horserad
  • the selection of positive clones regarding the production of immunoglobulins was carried out by two consecutive methods: ELISA and immunostaining in cytospin.
  • the ELISA was carried out analogously to that described in section 1.4, in order to confirm the results obtained during the cloning process.
  • 14 clones were selected that strongly recognized the antigen by ELISA, which was designated AD1-AD14.
  • cytospin a technique based on the centrifugation of cells on a slide using a cassette and a special rotor ( vasculating), so that the cells are stuck on the slide as whole cells that do not suffer alterations and maintain their original structure.
  • HEK293 human kidney embryonic cells transiently transfected with the expression vector of the ChoK ⁇ gene coding sequence were used as a positive control and cells transfected with the empty vector pCDNA3b as a negative control; both cell lines had been cultured in DMEM medium supplemented with 10% serum under standard conditions of temperature and humidity, and with 5% CO 2.
  • the determination of the class and subclass of the antibodies is useful to predict the properties of the antibody and is necessary to use them properly.
  • the knowledge of these properties facilitates the correct choice of the secondary antibody that recognizes the monoclonal antibody produced, or of the type of resin that effectively binds to the antibody.
  • it is also a first indication of monoclonality (17).
  • the heavy chains of the generated monoclonal antibodies are ⁇ chains of subclass 1 except in the case of monoclonal antibody AD14, which is of subclass 2a, heavy chains that all form antibodies of the class of the immunoglobulins G.
  • the light chains were all of the class K. Therefore, in the following experiments an anti-mouse IgG antibody was used as a secondary antibody.
  • lysis buffer containing 1.5 mM MgCb, 0.2 mM EDA, 0.3 M NaCI, 25 mM HEPES pH 7.5, 20 mM ⁇ -glycerophosphate and Triton X- 100 to 0.1% with a protease inhibitor cocktail, a solution that will be referred to hereinafter as lysis buffer. Equal amounts of used cells were separated (30 ⁇ g) by polyacrylamide gel electrophoresis with 10% SDS (SDS-PAGE) as previously described (5) and the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane. Specific binding was detected using an ECL chemiluminescence detection kit (Amersham) following the manufacturer's instructions.
  • Each culture medium corresponding to one of the 14 selected hybridomas was incubated separately, and as a positive control a polyclonal antiserum generated against human ChoK ⁇ previously described was used (1). 13 of the 14 selected media were positive. Part A of Figure 2 shows a representative experiment of this test. They were not observed cross reactions or nonspecific bands, which is an indication of the specificity of the antibodies.
  • NIH3T3 fibroblasts were used that stably overexpressed the mChoK (NIH3T3-Tmar-9 and NIH3T3-Tmar-11 cells), which were maintained in DMEM medium supplemented with 10% serum under standard conditions of temperature and humidity, and with 5% CO 2 .
  • mChoK mouse ChoK ⁇
  • Immunoprecipitation is one of the most widely used immunochemical techniques.
  • G-Sepharose protein microbeads were coated with each of the generated monoclonal antibodies and their ability to cause the immunoprecipitation of ChoK ⁇ present in used of transfected HEK293 cells was tested.
  • the culture medium of each of the hybridomas was diluted 1: 100 in lysis buffer and incubated with Protein G coated microbeads blocked with BSA (Sigma-Aldrich, MO) for 1 hour at 4 0 C. of three washes in lysis buffer, the cells used were immunoprecipitated with the monoclonal antibodies bound to the microbeads.
  • HEK293 cells were transfected with the plasmid encoding ChoK ⁇ or with the empty vector pCDNA3b as a negative control and the cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% serum under standard conditions of temperature and humidity, and with 5% of CO 2 .
  • DMEM medium supplemented with 10% serum under standard conditions of temperature and humidity, and with 5% of CO 2 .
  • HEK293T (transfected) cells that overexpressed human ChoK ⁇ were centrifuged by the cytospin technique and the sedimented cells were embedded in liquid paraffin, following with them a procedure similar to that usually performed with tissue sections, both in laboratories of research as in the pathological anatomy services of the different hospitals.
  • the cell pellets were dehydrated starting with 50% ethanol for 30 minutes and gradually increasing the concentration of alcohol to 100%.
  • the sediments were introduced in xylene after their inclusion in liquid paraffin, to proceed with their clearance.
  • cytoimmunotintions with monoclonal antibodies of the invention were carried out, obtaining a strong specific cytoplasmic marking in transfected HEK293T / ChoK ⁇ cells. These results indicate that the generated monoclonal antibodies are capable of recognizing ChoK ⁇ also in cells embedded in paraffin, and showing a high affinity for ChoK ⁇ .
  • the antigens were recovered by incubation in 940 ⁇ M EDTA, pH 7.2, for 45 minutes at 155 0 C.
  • the primary anti-ChoK monoclonal antibody was diluted 1: 2 in TBS with 1% BSA.
  • the tissue sections were incubated for 1 hour at room temperature.
  • the sections were immersed in TBS and incubated with the EnVision TM kit (Dako Cytomation, CA), based on peroxosidase, for 30 minutes at room temperature.
  • the samples were then incubated with the diaminobenzidine chromogenic substrate (Dako Cytomation, CA) for 5 minutes at room temperature. Sections were contracted with hematoxylin.
  • Figure 4 shows the results obtained with the AD1 antibody (considered valid for the analysis of ChoK ⁇ expression by immunohistochemistry) in biopsies from cancerous breast tissue (second row, marked with number 2), as well as in biopsies. corresponding to patients who had been diagnosed with lung cancer, among which there were NSCLC and SCLC cancer samples (first row, marked with number 1).
  • the analysis of the stained biopsies shows a strong dizziness of some of the tumor tissues, while in the adjacent normal tissue a slight staining was observed. However, in some biopsies both tumor cells and normal tissue cells showed basal ChoK ⁇ staining.
  • PSI-BLAST a new generation of protein data search programs ". Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Anticuerpos monoclonales anti-colina quinasa alfa y su uso en técnicas analíticas, de diagnóstico del cáncer y en Ia preparación de medicamentos. Los anticuerpos monoclonales AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11, AD12, AD13 y AD14 son altamente específicos y reconocen con elevada sensibilidad Ia proteína colina quinasa alfa humana (ChoKα). Ello permite su uso para Ia detección y/o cuantificación de esta proteína en cualquier tipo de muestra, incluidas muestras biológicas. En particular, permiten el desarrollo de métodos in vito de diagnóstico de cáncer, pronóstico y/o seguimiento de su evolución o evaluación de terapias anticancerígenas en los que se determine el nivel de expresión de ChoKα mediante uno o más de los anticuerpos monoclonales de Ia invención o de kits que los comprendan. Además, AD3, AD8 y AD13, que interfieren con Ia actividad colina quinasa de ChoKα, pueden utilizarse para Ia preparación de medicamentos contra el cáncer.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-COLINA QUINASA ALFA Y
SU USO EN TÉCNICAS ANALÍTICAS, DE DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER Y
EN LA PREPARACIÓN DE MEDICAMENTOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a anticuerpos monoclonales capaces de unirse a Ia colina quinasa alfa humana. Concretamente, Ia invención se refiere a los anticuerpos monoclonales AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14, a los hibridomas que los producen, las composiciones que los contienen, el uso de los mismos para detectar y/o cuantificar Ia presencia de Ia proteína colina quinasa alfa humana y los métodos para realizar diagnósticos in vito de Ia presencia de tumores en un individuo o pronosticar su posible evolución que hagan uso de dichos anticuerpos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La colina quinasa α (ChoKα) es Ia primera enzima de Ia ruta de Kennedy para Ia biosíntesis de fosfatidilcolina (PC), el principal fosfolípido de las membranas biológicas. Hay evidencias consistentes que demuestran Ia implicación de Ia colina quinasa y de su producto, Ia fosforilcolina (PCho), en el proceso de carcinogénesis (1-4).
ChoK está sobreexpresada en un elevado porcentaje de líneas celulares derivadas de tumores humanos, así como en diferentes tejidos tumorales humanos tales como mama, pulmón, colon y próstata (5,6). Tomados en conjunto, estos tumores representan más del 70% del número total de casos de cáncer en los países desarrollados. La incidencia de Ia sobreexpresión o incremento de Ia actividad de ChoK en estos cuatro tipos de cáncer oscila entre el 40% y el 60% (5-7). Recientemente, los autores de Ia presente invención demostraron no sólo que Ia proteína colina quinasa alfa está incrementada en los tejidos tumorales humanos mencionados (mama, pulmón, colon y próstata), sino que también está aumentada en otros tipos de tumores como vejiga y tumores hematológicos. Además, Ia sobreexpresión de dicha enzima induce tumores in vivo y parece estar relacionada con Ia severidad del cáncer, el estadio de evolución del mismo y Ia disminución del tiempo de supervivencia de los pacientes que presentan tumores en los que se detecta dicha sobreexpresión. Es más, se ha demostrado que Ia inhibición de Ia ChoKα en particular, tanto mediante inhibidores químicos como mediante ARN de interferencia, representa una estrategia antitumoral efectiva Todo ello indica que ChoKα representa un nuevo e importante marcador de tumores, útil para el diagnóstico, el pronóstico o Ia respuesta al tratamiento. Por ello, en Ia solicitud de patente internacional PCT/ES2006/070047 se proporciona un método para detectar Ia presencia de cáncer en un individuo, para determinar el estadio o Ia severidad de dicho cáncer, o para monitorizar el efecto de Ia terapia administrada a un individuo que presente cáncer, mediante Ia detección y cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa, así como mediante Ia detección y cuantificación del RNA mensajero de dicha enzima o del correspondiente cDNA.
Los procedimientos diseñados para el diagnóstico temprano y fiable del cáncer proporcionan información valiosa que puede mejorar el tratamiento de esta enfermedad, ayudando a lograr un incremento en Ia esperanza de vida. Los métodos que comprendan Ia determinación de Ia sobreexpresión de ChoKα en tumores humanos podrían representar un avance significativo tanto en el diagnóstico del cáncer como en Ia identificación de candidatos potenciales para terapia utilizando inhibidores de ChoK. El desarrollo de estos métodos lleva implícito el desarrollo de reactivos y metodologías apropiadas que permitan Ia determinación de Ia sobreexpresión de ChoKα. Una herramienta adecuada para determinar con precisión un incremento de los niveles de ChoKα en muestras de tejidos podrían ser los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones de moléculas de anticuerpo, todas ellas idénticas, producidas por un único clon de células, que poseen Ia misma especificidad, en contraposición a los anticuerpos policlonales o polisueros, que son poblaciones complejas de anticuerpos, formadas por distintas clases de moléculas de inmunoglobulinas en las que está presente una variedad de especificidades. Se trata de moléculas que han tenido gran éxito como reactivos analíticos, debido a que son sustancias químicamente bien definidas, cuya naturaleza y estructura se conoce con detalle y ello permite Ia formulación de preparaciones estables y facilita los procedimientos para su conjugación a través de trazadores tales como sustancias fluorescentes, enzimas, radioisótopos, oro coloidal, moléculas electrón-densas (ferritina), etc; además, son reactivos que pueden ser preparados de forma pura, en condiciones muy controladas y en grandes cantidades. En particular, los anticuerpos monoclonales son ampliamente utilizados en Ia investigación biomédica y el diagnóstico de muchas enfermedades, incluido el cáncer, y proporcionan alta sensibilidad y especificidad, necesarias ambas para dichos estudios. Sin embargo, no existen referencias publicadas en el Estado de Ia Técnica de anticuerpos monoclonales dirigidos contra ChoKα. Existen anticuerpos comerciales disponibles frente a esta proteína, todos ellos policlonales, cuya especificidad es reducida y, cuando se utilizan en inmunoensayos sobre transferencias Western, dan lugar a muchas bandas inespecíficas. Esta baja especificidad es particularmente problemática cuando se desean realizar ensayos inmunohistoquímicos, en los que es importante que no se produzcan tinciones ¡nespecíficas, por Io que tampoco existen referencias publicadas en el Estado de Ia Técnica en las que se describan ensayos inmunohistoquímicos en los que se detecte Ia proteína ChoKα. Por todo ello, dada Ia demostrada implicación de ChoKα en carcinogénesis humana, existía Ia necesidad de desarrollar anticuerpos monoclonales dirigidos contra Ia colina quinasa alfa, preferentemente de alta especificidad y sensibilidad, con buena capacidad para precipitar Ia proteína colina quinasa alfa de soluciones en las que se encuentre o de interaccionar con dicha proteína en muestras de tejido o soluciones en las que esté presente, (Io que permite Ia aplicación de métodos inmunoquímicos en general y, en particular, de métodos inmunohistoquímicos, para los que hasta ahora no se disponía de herramientas adecuadas y que ayudarían, por ejemplo, al análisis de tumores extirpados. Con ello se facilitaría Ia evaluación de los niveles de ChoKα y el establecimiento de relaciones entre los resultados obtenidos y Ia posible existencia de cáncer en los individuos origen de las muestras analizadas, Ia determinación de su estadio o severidad, el pronóstico de su posible evolución, el seguimiento de dicha evolución o Ia monitorización del efecto de Ia terapia administrada a un individuo que presente cáncer. Dichos anticuerpos serían de utilidad, además, en cualquier procedimiento en el que se desee detectar y/o cuantificar Ia proteína colina quinasa alfa presente en una muestra cualquiera.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un juego de anticuerpos monoclonales dirigidos contra ChoKα, útiles como herramientas en varias técnicas de biología molecular, incluido el análisis de muestras biológicas, así como en estudios inmunohistoquímicos, especialmente en los que se lleven a cabo sobre muestras de tejido humano como parte de métodos de diagnóstico o pronóstico de Ia existencia de cáncer en dicho tejido, posible uso del que se proporcionan evidencias. Estos anticuerpos constituyen una herramienta específica que permite Ia detección de ChoKα sin interaccionar, por ejemplo, con otra ¡soenzima con Ia que guarda un 70% de homología, Ia colina quinasa beta. La disponibilidad de un reactivo específico que diferencia entre una y otra isoenzima permitió Ia realización de los ensayos descritos en Ia solicitud de patente internacional PCT/ES2006/070047, pendiente de publicar, en los que se demuestra que Ia sobreexpresión de ChoKα , y no Ia de ChoKβ, es capaz de inducir carcinogénesis en seres humanos, estando además los niveles de ChoKα relacionados con Ia severidad del cáncer y con una disminución del tiempo de supervivencia de los individuos que presentan tumores con niveles elevados de ChoKα. Por todo ello, en dicha patente internacional se proporcionan tanto métodos para diagnosticar el tiempo de supervivencia de un paciente aquejado de cáncer como métodos de monitorización del efecto de terapias contra el cáncer, basados ambos en Ia evaluación del nivel de expresión de Ia proteína colina quinasa alfa mediante, por ejemplo, Ia determinación de Ia concentración de dicha proteína en muestras de tejido extraídas del paciente. La realización de dichos métodos no sería posible con los anticuerpos conocidos en el estado de Ia técnica, policlonales e ¡nespecíficos, y requiere de Ia especificidad de los anticuerpos monoclonales cuya obtención y características se describen en Ia presente invención, cuya existencia, al igual que sus propiedades, no han sido hechas accesibles de modo alguno para el público en general en el momento de presentación de Ia presente memoria.
Por tanto, un aspecto de Ia invención Io constituyen los anticuerpos monoclonales AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14, que se unen específicamente a Ia proteína colina quinasa alfa humana. Un segundo aspecto de Ia invención Io constituyen las líneas celulares de hibridoma capaces de producir los anticuerpos monoclonales AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
Un aspecto más de Ia invención son las composiciones que comprenden uno o más de los anticuerpos monoclonales AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
Un aspecto adicional de Ia invención es el uso de los anticuerpos monoclonales AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14 para detectar y/o cuantificar Ia presencia de colina quinasa alfa humana en una muestra cualquiera. Otro aspecto más de Ia invención son los métodos de diagnóstico in vitro de cáncer, particularmente cáncer de mama, pulmón, colon, próstata, vejiga o tumores hematológicos, que comprendan Ia detección de proteína colina quinasa alfa humana presente en una muestra biológica tomada de un ser humano y/o Ia cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana mediante el uso de uno o más de los anticuerpos monoclonales AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
Otro aspecto adicional de Ia invención son los kits de ensayo para el diagnóstico del cáncer, el pronóstico de su evolución, el seguimiento de dicha evolución o Ia evaluación de una terapia contra el cáncer que comprendan al menos uno de los anticuerpos monoclonales de Ia invención: AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14. Por último, es también un aspecto de Ia invención el uso de al menos un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre AD3, AD8 y AD11 para Ia fabricación de un medicamento destinado a Ia terapia contra el cáncer.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra las pruebas realizadas durante Ia generación y selección de los anticuerpos monoclonales e hibridomas de Ia invención. La parte A muestra el análisis por transferencia Western de los sueros de los ratones inmunizados (R1 , R2, R3, R4, R5 y R6), comparados con los resultados obtenidos con un suero preinmune (Preinm.) y un suero policlonal (Polic); en todos los casos, Ia calle 1 corresponde a extractos de células humanas HEK293T transfectadas con un vector vacío, que no expresa ChoKα, como control y Ia calle 2 a células HEK293T que sobreexpresan ChoKα por haber sido transfectadas con un vector de expresión de dicha proteína. La parte B muestra un ejemplo de los ensayos de ELISA realizados durante Ia selección de hibridomas, el correspondiente al hibridoma del anticuerpo AD1: los pocilios de Ia columna de Ia izquierda se recubrieron con ChoKα recombinante y los de Ia derecha con GST y fueron incubados con: (Ctrl.- ):anticuerpo monoclonal anti-GST; AD1 : sobrenadante del medio de cultivo del hibridoma correspondiente al anticuerpo AD1 ; ChoK PoAC (Ctrl.-*-): anticuerpo policlonal anti-ChoKα. La parte C muestra un ejemplo de Ia confirmación de Ia selección de hibridomas por inmunocitoquímica (cytospin) de células HEK293 transfectadas con un vector que no expresa ChoKα (foto marcada como HEK- Ctrl) o con un vector de expresión de ChoKα (foto marcada como HEK+ChoKα) que se sometieron a un proceso de inmunotinción con el sobrenadante de cultivo de un mismo hibridoma.
La Figura 2 muestra un ejemplo de inmunoensayos sobre transferencias Western realizados con anticuerpos de Ia invención. La parte A muestra los resultados obtenidos al incubar usados de células HEK293 transfectadas con un vector vacío (calle marcada como "Vector") o de células HEK293 transfectadas con un vector de expresión de ChoKα (calles marcadas como "ChoKα) bien con un anticuerpo policlonal anti-ChoKα (fotografía marcada como "ChoK PoAb") o bien con el anticuerpo monoclonal de Ia invención (fotografía marcada como "ChoK MoAb") que se indica sobre cada calle. La parte B muestra los resultados obtenidos al incubar usados de células que expresan Ia colina quinasa α de ratón, NIH3T3-Tmar-9 (calles marcadas con el número 9) o NIH3T-Tmar-11 (calles marcadas con el número 11) con los anticuerpos AD6 y AD9.
La Figura 3 muestra ejemplos de tinción negativa (fotografía superior izquierda), débil (fotografía superior derecha) y fuerte (fotografías inferiores) de muestras tomadas de tumores colorrectales sobre las cuales se había realizado un análisis inmunohistoquímico (IHQ) con los anticuerpo AD9, AD6, AD1 y AD2 tal como se indica bajo cada fotografía.
La Figura 4 muestra el análisis inmunohistoquímico de tumores de pulmón (1) y mama (2) con anticuerpos monoclonales anti-ChoKα representantivos. En cada uno de los casos, las fotografías marcadas con Ia letras A (1A y 2A) y B (1 B y 2B), corresponden a tejidos tumorales fuertemente teñidos, con una leve tinción basal de los tejidos normales adyacentes. Las fotografías marcadas con Ia letra C (1C y 2C) corresponden a muestras de ambos tipos de tumores en las que Ia tinción con estos anticuerpos útiles en inmunohistoquímica resultó negativa. La tinción de contraste se realizó con hematoxilina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a los anticuerpos monoclonales AD1 , AD2, AD3,
AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14, que son capaces de unirse de forma específica a Ia proteína colina quinasa alfa (ChoKα), enzima implicada en Ia síntesis de fosfolípidos que ha sido implicada en Ia proliferación celular, Ia transformación y Ia progresión de tumores. En particular, su sobreexpresión parece estar implicada en Ia carcinogénesis de tumores de mama, pulmón, colon y próstata en seres humanos, Io que apunta hacia ella como un marcador potencial de tumores (5,6). La detección y cuantificación de sus niveles, sin embargo, requiere el desarrollo de herramientas adecuadas para ello, como pueden ser los anticuerpos monoclonales, en especial aquellos que presenten alta especificidad y sensibilidad frente a este antígeno, ChoKα. Por ello, Ia invención proporciona los anticuerpos monoclonales AD1 ,
AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD 14, cuya especificidad y sensibilidad se demuestra en los Ejemplos que se describen posteriormente. Así, por ejemplo, se observa que, aunque hay un 77% de similitud estructural entre las colina quinasas humana y de ratón (19), sólo los anticuerpos monoclonales AD4 y AD10 se unen de forma eficaz a Ia colina quinasa de ratón (mChoK) en un inmunoensayo realizado sobre proteínas transferidas a membranas de nitrocelulosa, Io que demuestra Ia alta especificidad de los anticuerpos monoclonales de Ia invención, en especial de AD1 , AD2, AD3, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14. También se proporcionan los correspondientes hibridomas capaces de producir cada uno de dichos anticuerpos, Io que permite obtenerlos en grandes cantidades y facilita su purificación.
Los anticuerpos monoclonales de Ia invención constituyen una herramienta útil y fiable para ser utilizados en técnicas básicas de ensayo tales como el inmunoensayo realizado sobre proteínas transferidas a membranas (técnica conocida como transferencia Western y abreviada WB, de su denominación en inglés Western blot) y Ia inmunoprecipitación (IP), por Io que podrían ser excelentes herramientas para incrementar el conocimiento que se tiene de Ia biología de Ia ChoKα o para cualquier tipo de ensayo en el que se desee comprobar Ia presencia de dicha proteína y/o realizar una cuantificación de Ia misma. Por ello, está comprendido dentro del alcance de Ia invención el uso de uno o más anticuerpos monoclonales seleccionados del grupo de AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14 para Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína quinasa alfa en una muestra cualquiera. Se tiene especial preferencia por las muestras que sean muestras biológicas, entendiendo como tal cualquier muestra tomada de un ser humano, bien de un tejido suyo o de alguno de los llamados fluidos biológicos, de los que los más típicos son Ia orina, Ia sangre y el plasma obtenido de Ia misma, aunque también están comprendidas dentro de esta denominación cualquier otro fluido corporal, como puede ser como el líquido cefalorraquídeo o el líquido sinovial. La técnica utilizada para Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana mediante uno o más anticuerpos monoclonales de Ia invención puede ser cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en Ia técnica, entre las que se incluyen las que hacen uso de transferencias Western, inmunoprecipitación o, en el caso de tejidos, las técnicas inmunohistoquímicas, de las que también se dan describen ensayos concretos con los anticuerpos monoclonales de Ia invención en los Ejemplos que aparecen más adelante.
Los ensayos de inmunoprecipitación realizados para caracterizar los anticuerpos de Ia invención han revelado que los epítopos reconocidos por cada uno de estos anticuerpos no son los mismos, pues algunos de ellos parecen interferir con Ia actividad enzimática, no siendo posible detectar actividad enzimática colina quinasa a partir de proteínas colina quinasa alfa inmunoprecipitadas con algunos de los anticuerpos monoclonales de Ia invención, mientras que otros (AD1 , AD2, AD4, AD5, AD7, AD13 y AD14) no impiden que las proteínas inmunoprecipitadas muestren esta actividad enzimática cuando se les proporciona el sustrato y las condiciones adecuadas. Por ello, estos últimos anticuerpos (AD1 , AD2, AD4, AD5, AD7, AD13 y AD14) son los anticuerpos preferidos para ser utilizados en cualquier ensayo que implique Ia inmunoprecipitación de colina quinasa alfa de manera que dicha proteína conserve su actividad colina quinasa, especialmente AD1 , AD4, AD5, AD7 y AD13, que dan lugar a una mayor grado de actividad enzimática en los inmunoprecipitados generados con ellos.
Otra técnica de importancia clínica en Ia que son útiles los anticuerpos monoclonales son los estudios inmunohistoquímicos, técnica que tiene por objeto Ia detección e identificación in situ de componentes biomoleculares que son parte integral de células y tejidos. Esta técnica puede ser de gran utilidad para el diagnóstico in vitro del cáncer en muestras de tejido tomadas de pacientes, mediante el ensayo de un marcador concreto, del que se conozca su asociación con el cáncer. Como se ha mencionado, los estudios indican que ChoKα representa un nuevo e importante marcador de tumores, cuya expresión aparece incrementanda en un porcentaje importante de tumores, concretamente en un 40-60% de los tumores de mama, colon, pulmón, próstata, vejiga o tumores hematológicos, habiéndose demostrado también tanto Ia capacidad de inducción de tumores in vivo de Ia sobreexpresión de esta enzima como Ia efectividad de su inhibición como estrategia antitumoral. Incluso, se ha observado una relación entre su nivel de expresión y Ia gravedad de los tumores. Por todo ello, están comprendidos dentro del alcance de Ia invención no sólo el uso de los anticuerpos monoclonales de Ia invención para Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína ChoKα mediante técnicas inmunohistoquímicas, aplicadas preferentemente a muestras de tejidos tomadas de seres humanos, especialmente cuando se trate de muestras de tejido de mama, colon, pulmón o vejiga, sino que también está incluido, además, cualquier método para el diagnóstico de cáncer, el pronóstico de su evolución, el seguimiento de dicha evolución o Ia evaluación de Ia respuesta a un tratamiento en el que se detecte y/o cuantifique Ia proteína ChoKα, mediante los anticuerpos monoclonales de Ia invención. El potencial de estos métodos y Ia capacidad de los anticuerpos monoclonales de Ia invención para ser de utilidad en Ia realización de los mismos se demuestra en los ejemplos descritos más adelante, en los que se realizaron ensayos inmunohistoquímicos sobre muestras tomadas de biopsias de pacientes a los que previamente se les había diagnosticado cáncer de mama o pulmón. En Ia mayor parte de los casos, esta técnica permitió distinguir claramente entre el tejido tumoral en el que se sobreexpresa ChoKα (que aparecía fuertemente marcada) del tejido normal circundante, en el que Ia tinción con los anticuerpos anti-ChoKα era sólo tenue. Como se ha comentado, los datos bioquímicos previos de Ia sobreexpresión y el incremento de actividad de ChoKα en tumores humanos demostraron que hay un intervalo del 40% al 60% de incidencia de ChoKα en distintos tipos de cáncer humano (5-7). Por ello, es de esperar que aparezca una tinción basal en los tumores en los que los niveles de ChoKα son similares a los de las células normales circundantes. Por Io tanto, los datos obtenidos en las pruebas inmunohistoquímicas realizadas con los anticuerpos monoclonales anti-ChoKα de Ia invención son consistentes con los datos bioquímicos previos disponibles y avalan Ia utilidad de dichos anticuerpos monoclonales para Ia identificación de células tumorales mediante métodos inmunohistoquímicos y, por ello, su utilidad como herramienta en métodos de diagnóstico de cáncer, pronóstico de su evolución o evaluación de Ia respuesta a un tratamiento. Es por ello que están comprendidos dentro del alcance de Ia invención los métodos in vito para el diagnóstico de Ia existencia de cáncer en un paciente, el pronóstico de su evolución, el seguimiento de dicha evolución o para Ia evaluación de Ia respuesta a un tratamiento en los que se haga uso de al menos uno de los anticuerpos monoclonales de Ia invención para Ia detección y/o Ia cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana, pudiendo ser los estudios en los que se recurra a estos métodos tanto retrospectivos como prospectivos. Se prefiere el uso de los anticuerpos AD1 , AD2, AD4, AD5, AD7, AD13 y AD14 y, dentro de estos, se prefieren especialmente los anticuerpos AD1 , AD4, AD5, AD7 y AD13, por ser los que mayor sensibilidad mostraron en los ensayos realizados. Para Ia realización de estos métodos, se prefiere que las muestras a analizar sean muestras de tejido tomadas de un ser humano, en especial las extraídas de mama, colon, pulmón o vejiga. Por otro lado, en el campo terapéutico, dada Ia utilidad de los inhibidores específicos de ChoKα en estrategias antitumorales, los anticuerpos monoclonales que interfieren con Ia actividad colina quinasa, podrían ser útiles como inhibidores específicos de dicha actividad y, en consecuencia, como compuestos activos antitumorales. En el Ejemplo 2 se demuestra Ia capacidad de los anticuerpos monoclonales de Ia invención AD3, AD8 y AD11 para inhibir Ia actividad enzimática de Ia colina quinasa alfa humana. Por ello, es otro aspecto de Ia invención el uso de al menos un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre AD3, AD8 y AD11 para Ia fabricación de un medicamento destinado a Ia terapia contra el cáncer. Como se ha comentado, son también objeto de Ia invención las composiciones que comprendan al menos uno de los anticuerpos AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14 o combinaciones de los mismos. Los anticuerpos presentes en estas composiciones pueden estar unidos a distintas sustancias o partículas, que pueden ser bien sustancias o partículas que faciliten su detección o bien sustancias o partículas que faciliten Ia extracción del anticuerpo del medio en el que se encuentre, generalmente con Ia finalidad de aislar los complejos formados tras su reacción con el anticuerpo. Son ejemplos de sustancias que facilitan Ia detección del anticuerpo una molécula radiactiva, un cromóforo, un fluoróforo, o una enzima que catalice alguna reacción que dé lugar a un producto de fácil detección (como puede ser una molécula radiactiva, un cromóforo o un fluoróforo) o que parta de un compuesto en el que Ia disminución de su concentración es también fácil de detectar (que puede ser igualmente una molécula radiactiva, un cromóforo o un fluoróforo). Los ejemplos típicos de las sustancias o partículas que facilitan Ia extracción del anticuerpo del medio en el que se encuentren son las partículas metálicas o las partículas magnéticas, que posibilitan el aislamiento de las moléculas acopladas a ellas mediante Ia utilización de campos magnéticos; también es un ejemplo de tales sustancias o partículas como cualquier molécula que posea una alta afinidad por otra y que posibilite que el anticuerpo se una a algún tipo de matriz o medio sólido al cual esté ligada Ia segunda molécula por Ia cual Ia molécula unida al anticuerpo presenta alta afinidad.
Son también realizaciones preferidas de las composiciones de Ia invención aquellas que comprendan adicionalmente un segundo anticuerpo capaz de unirse a al menos un anticuerpo de Ia invención presente en Ia composición de Ia invención. Se prefieren los segundos anticuerpos que interaccionen con el fragmento Fc de los anticuerpos de Ia invención, para que no interfieran con su unión al antígeno colina quinasa alfa humana. El segundo anticuerpo puede ser de cualquier origen, bien un anticuerpo anti-lgG de ratón generado en cabra tal como el utilizado en los ejemplos descritos posteriormente, o generado en cualquier otra especie. Preferiblemente, el segundo anticuerpo estará unido a otra sustancia o partícula, que pueden ser bien una sustancia que faciliten su detección o bien una sustancia o partícula que facilite Ia extracción del anticuerpo del medio en el que se encuentre, generalmente con Ia finalidad de aislar los complejos formados tras su reacción con el anticuerpo. Los ejemplos de estas sustancias o partículas son los mismos que los mencionados en el caso de las posibles sustancias o partículas unidas a los anticuerpos de Ia invención. Finalmente, es también un objeto de Ia invención un kit para el diagnóstico del cáncer, el pronóstico de su evolución, el seguimiento de dicha evoluación o Ia evalución de una terapia contra el cáncer que comprenda al menos uno de los anticuerpos monoclonales de Ia invención. Se prefieren aquellos kits que comprendan un segundo anticuerpo capaz de unirse a al menos un anticuerpo de Ia invención presente en el kit de Ia invención. Como en el caso de las composiciones de Ia invención, se prefieren los segundos anticuerpos que interaccionen con el fragmento Fc de los anticuerpos de Ia invención. El segundo anticuerpo puede ser de cualquier origen, bien un anticuerpo anti-lgG de ratón generado en cabra tal como el utilizado en los ejemplos descritos posteriormente, o generado en cualquier otra especie que no sea ratón. Preferiblemente, el segundo anticuerpo estará unido a otra sustancia o partícula, que pueden ser bien una sustancia que faciliten su detección o bien sustancia o partícula que faciliten Ia extracción del anticuerpo del medio en el que se encuentre.
La invención se explicará ahora con más detalle gracias a los Ejemplos y las Figuras que aparecen a continuación.
EJEMPLOS
Los ejemplos que se describen a continuación describen los procedimientos seguidos para Ia generación de los anticuerpos monoclonales, su caracterización y el ensayo de su capacidad para ser utilizados en pruebas inmunohistoquímicas. Los detalles de los mismos fueron los siguientes: Ejemplo 1.- Generación de anticuerpos monoclonales
La generación de los anticuerpos monoclonales se llevó a cabo en las siguientes fases:
1.1.- Preparación del antígeno La expresión y purificación del antígeno para el cual se desean generar los anticuerpos, Ia ChoKα humana, se llevó a cabo tal como se ha descrito previamente en forma de proteína de fusión GST-ChoKα (5,4,15). Brevemente, se subclonó el cDNA que codifica para Ia ChoKα humana en un vector de expresión procariota, pGEX-4T2, vector que posee Ia secuencia codificante de Ia glutation-S-transferasa, de manera que Ia expresión de dicho vector da lugar a una proteína de fusión GST-ChoKα. La presencia de Ia proteína GST, que tiene capacidad de unirse a una fase semisólida de sefarosa que lleve unido glutation, facilita Ia semipurificación de Ia proteína de fusión del resto de proteínas bacterias. Por ello, se siguió un procedimiento estándar para Ia purificación mediante el método de Ia glutatión-sefarosa siguiendo las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences Europe, Alemania). Una vez liberada Ia ChoKα de Ia GST mediante proteolisis con trombina, Ia ChoKα parcialmente purificada se resolvió mediante electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). Se extrajo del gel Ia zona que contenía Ia banda correspondiente a ChoKα y el fragmento de gel extraído se homogeneizó en PBS con el adyuvante de Freund, bien completo o bien incompleto (suministrado en ambos casos por Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.) (1:1 , volumen:volumen) según Ia fase de inmunización en Ia que se deseara utilizar Ia emulsión obtenida.
1.2.- Inmunización de los ratones
Se inmunizaron por vía intraperitoneal (i.p.) seis ratones de 8 semanas de edad, de Ia cepa Balb/c, siguiendo el siguiente calendario:
- Día 1: inyección i.p. de 0,5 mi de homogeneizado de antígeno, que contenía 100 μg de ChoKα recombinante purificada con adyuvante completo de Freund. - Día 15 (dosis de refuerzo 1): inyección i.p. de 0,5 mi de homogeneizado de antígeno, que contenía 100 μg de ChoKα recombinante purificada pero, en este caso, mezclada con el adyuvante de Freund incompleto. - Día 30 (dosis de refuerzo 2): inyección i.p. de 0,5 mi de homogeneizado de antígeno, que contenía 100 μg de ChoKα recombinante purificada mezclada con el adyuvante de Freund incompleto.
- Día 40 (testado de Ia generación de anticuerpos frente a ChoKα en el suero de los ratones). Los ratones con una respuesta inmune positiva frente a ChoKα se identificaron mediante transferencia tipo Western frente a Ia proteína parcialmente purificada, tal como se muestra en Ia parte A de Ia Figura 1. De todos los ratones, se seleccionaron para Ia fusión los ratones 2 y 4 (el 2 para inyección intravenosa y el 4 para inyección intraperitoneal), por ser los que presentaban menos bandas inespecíficas. - Día 42 (dosis de refuerzo 3): inyección i.v. (ratón 2 ) o i.p. (ratón 4) de
0,5 mi de homogeneizado de antígeno, que contenía 100 μg de ChoKα recombinante purificada mezclada con el adyuvante de Freund incompleto.
- Día 45: Fusión.
1.3.- Fusión
Los ratones seleccionados se prepararon mediante fusión de esplenocitos 3 días después de Ia última dosis de refuerzo. Los bazos se extrajeron de forma aséptica de cada uno de los ratones y se depositaron en una placa que contenía 10 mi de Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) sin suero, se procedió al disrupción del tejido hasta que Ia mayor parte de las células se hubieron liberado, y luego se recogieron los esplenocitos descartando los trozos de tejido de mayor tamaño (16). Para cada fusión se utilizó un total de 108 esplenocitos y 107 células de mieloma NS-1 , que se cultivaron en medio suplementado con 10% de suero en condiciones estándar de temperatura y humedad, y con un 5% de CO2.. Después de 24 horas de incubación, las células se pasaron a medio fresco suplementado con FBS al 10% a una concentración final de 5 x 106 células/ml. Para Ia fusión de células se utilizó 1 mi de DMEM sin suero que contenía 0,5 g de PEG 1500 (Roche) a 5O0C.
1.4.- Selección, cribado y clonación de colonias híbridas Los híbridos de interés se seleccionaron manteniendo las células 15 días en medio HAT suplementado siguiendo las recomendaciones del fabricante (GIBCO, Invitrogen, California, EE.UU.), medio en el cual se produce Ia muerte celular de todas aquellas células que no corresponden a moléculas híbridas de las dos poblaciones entre las que se ha realizado Ia fusión. Los hibridomas se clonaron mediante Ia técnica de dilución límite, de Ia que se realizaron dos rondas consecutivas de crecimiento.
La tercera semana después de Ia fusión, se realizó el cribado de 149 colonias híbridas examinado si producían anticuerpos. Debido a su simplicidad y al elevado número de muestras que se pueden comprobar al mismo tiempo, Ia selección de colonias híbridas positivas respecto a Ia producción de inmunoglobulinas se llevó a cabo mediante ELISA. Los detalles del ELISA se describen a continuación:
Se recubrieron placas multipocillo de microtitulación (NUNC, Alemania) utilizando 50 μl/pocillo de ChoKα recombinante a 5 μg/ml o GST en agua destilada. Después de una hora de incubación a 370C, las placas se lavaron con PBS/Tween 20 al 0,05%, y se bloquearon con leche al 10% en PBS, durante toda Ia noche a 40C. Se lavaron las placas y se incubaron con 50 μl/pocillo de sobrenadante durante 1 hora a 370C. Se lavaron los pocilios, y se añadió un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón con HRP (peroxidasa de rábano) (Dako Cytomation, California), a una dilución 1 :1000. Las placas se incubaron durante 1 hora a 370C, se lavaron y se revelaron utilizando una solución con el sustrato colorimétrico ABTS (BIO-RAD, California). La reacción se paró mediante Ia adición de 100 μl de SDS al 0,5%.
La mayor parte de los sobrenadantes de cultivo de las colonias híbridas presentaba reacción positiva frente al antígeno ChoKα, pero sólo las colonias que mostraron una reacción de color más fuerte que el anticuerpo policlonal fueron seleccionadas para continuar con su análisis. Así, se seleccionaron 19 colonias de hibridomas y se clonaron utilizando Ia técnica de Ia dilución límite. Para asegurar que el cultivo fuera monoclonal, se llevaron a cabo dos rondas consecutivas de subclonación en una placa de 96 pocilios. Se obtuvieron un total de 49 clones positivos, con los se continuó con los ensayos referentes a Ia producción de anticuerpos.
1.5. Selección de clones
La selección de los clones positivos respecto a Ia producción de inmunoglobulinas se llevó a cabo mediante dos métodos consecutivos: ELISA y inmunotinción en cytospin. El ELISA se llevó a cabo de forma análoga a Ia descrita en Ia sección 1.4, con el fin de confirmar los resultados obtenidos durante el proceso de clonación. De los 49 clones iniciales en los que se había comprobado Ia producción de anticuerpos anti-ChoKα, se seleccionaron 14 clones que reconocían con fuerza el antígeno mediante ELISA, a los que se denominó AD1-AD14. Un ejemplo del ELISA de selección, el correspondiente al hibridoma del anticuerpo AD1 , se muestra en Ia parte B de Ia Figura 1.
Para obtener una confirmación adicional de estos resultados y asegurarse de que los anticuerpos seleccionados podían reconocer Ia ChoKα en condiciones nativas, se llevó a cabo una inmunotinción en cytospin, técnica basada en Ia centrifugación de células sobre un portaobjetos utilizando un cásete y un rotor especial (vasculante), de manera que las células quedan pegadas en el portaobjetos como células enteras que no sufren alteraciones y mantienen su estructura original. Para ello, se utilizó como control positivo células embrionarias de riñon humano HEK293 transfectadas de forma transitoria con el vector de expresión de Ia secuencia codificante del gen de ChoKα y como control negativo células transfectadas con el vector vacío pCDNA3b; ambas líneas celulares habían sido cultivadas en medio DMEM suplementado con 10% de suero en condiciones estándar de temperatura y humedad, y con un 5% de CO2.. Para ello, se colocaron en un portaobjetos un total de 2,5 x 104 células HEK293 transfectadas, se cargaron en un tubo de cytospin, y se centrifugaron a 800 rpm durante 3 minutos. En este caso, las células transfectadas se adhieren al portaobjetos por Ia centrifugación de las mismas (cytospin), Io que permite llevar a cabo con ellas un ensayo de inmunodetección (inmunotinción) utilizando el medio de cultivo de hibridomas como anticuerpo primario. Después de bloquear los sitios de unión inespecíficos con una solución bloqueante de peroxidasa, los portaobjetos que contenían las células adheridas se incubaron con los sobrenadantes de las colonias híbridas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras dos lavados con PBS, se aplicó un anticuerpo secundario anti-ratón durante 1 hora a temperatura ambiente y se reveló mediante procedimientos estándar utilizando DAB. Un ejemplo de los resultados obtenidos se muestra en Ia parte C de Ia Figura 1.
Los resultados de las inmunodetecciones realizadas sobre cytospins confirmaron que Ia totalidad de los 14 hibridomas seleccionados producía anticuerpo que reconocen de forma eficiente ChoKα en condiciones nativas. Así, se seleccionaron un total de 14 clones diferentes, todos ellos provenientes de Ia fusión realizada con células procedentes del ratón 4, y que resultaron ser positivos respecto a Ia producción de inmunoglobulinas anti-ChoKα utilizando los dos métodos de cribado. Con estos clones se llevaron a cabo pruebas para su caracterización.
Ejemplo 2.- Caracterización de los anticuerpos monoclonales generados
La caracterización de los hibridomas generados y de los anticuerpos monoclonales que producen se realizó mediante las siguientes técnicas:
- isotipado
- transferencia Western - inmunoprecipitación
Los resultados obtenidos se muestran en Ia Tabla 1. Tabla 1.- Caracterización de los anticuerpos monoclonales AD1-AD14
Figure imgf000021_0001
1 WB: detección de proteínas transferidas a membranas 2 IP: inmunoprecipitación
*: Análisis en el que se aplicó un sistema arbitrario de cuantificación, en el que Ia reactividad obtenida se clasificó en las siguientes categorías:
+++: excelente
++: buena
+: baja
-: sin reacción detectable
10 Los detalles de ejecución de cada una de las pruebas fueron los siguientes:
2.1.- Isotipado
La determinación de Ia clase y Ia subclase de los anticuerpos es útil para i 5 predecir las propiedades del anticuerpo y es necesaria para utilizarlos apropiadamente. El conocimiento de estas propiedades facilita Ia correcta elección del anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo monoclonal producido, o del tipo de resina que se une de forma eficaz al anticuerpo. Además, también es una primera indicación de monoclonalidad (17).
20 Según el esquema de inmunización seguido, sería esperable una respuesta inmune en los ratones tratados en Ia que los anticuerpos producidos fueran predominantemente de Ia clase de las inmunoglobulinas G (18). Los anticuerpos tipo IgG muestran a menudo afinidades mayores por los antígenos que otras clases generadas en una respuesta primaria. Tal como se muestra en Ia Tabla 1 , las cadenas pesadas de los anticuerpos monoclonales generados son cadenas γ de Ia subclase 1 excepto en el caso de anticuerpo monoclonal AD14, que es de Ia subclase 2a, cadenas pesadas que forman todas ellas anticuerpos de Ia clase de las inmunoglobulinas G. Las cadenas ligeras eran todas de Ia clase K. Por ello, en los experimentos siguientes se utilizó un anticuerpo anti-lgG de ratón como anticuerpo secundario.
2.2,- Análisis por transferencia Western (WB)
Las inmunoensayos llevados a cabo sobre proteínas transferidas a membranas son esenciales para establecer Ia auténtica especificidad de los anticuerpos con respecto a Ia proteína de interés (17,18). Por ello, se investigó el uso potencial de los anticuerpos monoclonales producidos en transferencias Western (WB). Con ese objetivo, se transfectaron células HEK293 con el plásmido que contenía Ia secuencia codificante del gen de Ia ChoKα humana o con un vector vacío como control negativo. Muestras de cultivos de estas células se homogeneizaron y usaron en un tampón que contenía MgCb 1 ,5 mM, EDA 0,2 mM, NaCI 0,3 M, HEPES 25 mM pH 7,5, β-glicerofosfato 20 mM y Tritón X-100 al 0,1% con un cóctel de inhibidores de proteasas, solución a Ia que se denominará en adelante tampón de lisis. Se separaron cantidades iguales de usados de células (30 μg) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS al 10% (SDS-PAGE) tal como se ha descrito previamente (5) y se transfirieron las proteínas a una membrana de nitrocelulosa. La unión específica se detectó utilizando un kit de detección por quimioluminiscencia ECL (Amersham) siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada medio de cultivo correspondiente a uno de los 14 hibridomas seleccionados se incubó separadamente, y como control positivo se utilizó un antisuero policlonal generado contra ChoKα humana previamente descrito (1). 13 de los 14 medios seleccionados resultaron positivos. La parte A de Ia Figura 2 muestra un experimento representativo de este ensayo. No se observaron reacciones cruzadas o bandas inespecíficas, Io que es una indicación de Ia especificidad de los anticuerpos.
Adicionalmente, se ensayó si los anticuerpos monoclonales generados eran capaces de reconocer Ia ChoKα de ratón (mChoK). Para ello, se utilizaron fibroblastos NIH3T3 que sobreexpresaban de forma estable Ia mChoK (células NIH3T3-Tmar-9 y NIH3T3-Tmar-11), que se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% de suero en condiciones estándar de temperatura y humedad, y con un 5% de CO2. Se obtuvieron usados de estas células de forma análoga a Ia descrita en el ensayo de Ia transferencia Western de las células HEK293T (transfectadas) recién descrito, que se resolvieron igualmente por Ia técnica de SDS-PAGE, transfiriendo las proteínas a membranas de nitrocelulosa, que fueron incubadas con los 14 medios de cultivo. El experimento, demostró que, aunque hay un 77% de similitud estructural entre las colina quinasas humana y de ratón (19), sólo los anticuerpos monoclonales AD6, AD9 y AD11 fueron capaces de unirse de forma eficaz a Ia mChoK en el inmunoensayo realizado sobre proteínas transferidas a membranas de nitrocelulosa. Los resultados obtenidos con dos de estos anticuerpos, AD6 y AD9, se muestran en Ia parte B de Ia Figura 2.
2.3.- Inmunoprecipitación
La inmunoprecipitación (IP) es una de las técnicas inmunoquímicas más ampliamente utilizadas. Con el fin de caracterizar Ia capacidad de los anticuerpos generados para inmunoprecipitar ChoKα, se recubrieron microperlas de proteína G-Sefarosa con cada uno de los anticuerpos monoclonales generados y se probó su capacidad de provocar Ia inmunoprecipitación de ChoKα presente en usados de células HEK293 transfectadas. Para ello, el medio de cultivo de cada uno de los hibridomas se diluyó 1 :100 en tampón de lisis y se incubó con microperlas recubiertas de Proteína G bloqueada con BSA (Sigma-Aldrich, MO) durante 1 hora a 40C. Después de tres lavados en tampón de lisis, los usados de células se inmunoprecipitaron con los anticuerpos monoclonales ligados a las microperlas. Para cuantificar Ia capacidad relativa de los anticuerpos monoclonales producidos para precipitar ChoKα, se llevó a cabo un ensayo radioactivo in vito de actividad enzimática colina quinasa en los inmunoprecipitados, basado en Ia fosforilación de colina para dar lugar a o-fosfocolina (P-Cho) tal como se ha descrito previamente (12,14), en presencia de cloruro de metil-[14C]-colina (50- 60 μCi/mmol, Amersham Biosciences Europe, Alemania) a 370C durante 30 minutos. Las muestras se resolvieron mediante cromatografía en capa fina (TLC) y se cuantificó Ia 14C-PChO. Puesto que Ia única fuente de actividad ChoK es Ia fracción inmunoprecipitada, si el anticuerpo ha sido eficaz en Ia inmunoprecipitación, habrá actividad ChoK detectable y se generará PCho.
Según se muestra en Ia Tabla 1 , un total de 7 de los 14 anticuerpos monoclonales analizados (AD1 , AD2, AD4, AD5, AD7, AD13, AD14) generaron ChoKα inmunoprecipitada de forma que fuera funcional y Ia enzima inmunoprecipitada fuera completamente activa. Sin embargo, Ia interacción de algunos de los anticuerpos con Ia ChoKα podría interferir con su actividad enzimática y, aun siendo capaz de inmunoprecipitar Ia proteína ChoKα, dar lugar a una valoración negativa en el ensayo de actividad enzimática.
Para evaluar esta última posibilidad, Ia capacidad para inmunoprecipitar ChoKα se determinó también mediante transferencia Western utilizando el anticuerpo policlonal para reaccionar con Ia posible ChoKα inmunoprecipitada por los anticuerpos monoclonales que dieron resultados negativos en el ensayo enzimático. Como se muestra en Ia Tabla 1, los anticuerpos monoclonales AD3 y AD8 y, en menor medida, AD11 , fueron capaces de inmunoprecipitar ChoKα. Estos resultados sugieren que algunos de los anticuerpos monoclonales pueden interferir con Ia actividad enzimática de ChoKα, dando lugar a Ia ausencia de actividad ChoK en los inmunoprecipitados.
Ejemplo 3.- Pruebas inmunohistoquímicas
Finalmente, se analizó el uso potencial de los anticuerpos generados para inmunohistoquímica (IHC). Los anticuerpos monoclonales se ensayaron primero en cytospines de células embebidas en parafina que sobreexpresaban
ChoKα en condiciones experimentales óptimas. Para asegurar concentraciones elevadas del antígeno, se transfectaron células HEK293 con el plásmido que codifica ChoKα o con el vector vacío pCDNA3b como control negativo y se cultivaron las células en medio DMEM suplementado con 10% de suero en condiciones estándar de temperatura y humedad, y con un 5% de CO2. Alrededor de 10 millones de células HEK293T (transfectadas) que sobreexpresaban ChoKα humana se centrifugaron mediante Ia técnica de cytospin y las células sedimentadas se embebieron en parafina líquida, siguiendo con ellas un procedimiento análogo al que se realiza habitualmente con secciones de tejido, tanto en laboratorios de investigación como en los servicios de anatomía patológica de los distintos hospitales. Después de 24 horas de fijación en formalina/acético/alcohol (FAA), los sedimentos celulares de deshidrataron comenzando con etanol al 50% durante 30 minutos e incrementando gradualmente Ia concentración de alcohol al 100%. Los sedimentos se introdujeron en xileno después de su inclusión en parafina líquida, para proceder a su aclaramiento.
A continuación, se llevaron a cabo citoinmunotinciones con anticuerpos monoclonales de Ia invención, obteniéndose un fuerte mareaje citoplasmático específico en células transfectadas HEK293T/ChoKα. Estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales generados son capaces de reconocer ChoKα también en células embebidas en parafina, y mostrando una elevada afinidad por ChoKα.
Puesto que ChoKα ha sido descrita recientemente como un nuevo oncogén (4) con alta incidencia en el cáncer humano (5-7), se ensayó también el uso potencial de los anticuerpos monoclonales en el diagnóstico del cáncer mediante análisis inmunohistoquímico (IHC) de muestras humanas, llevando a cabo pruebas inmunohistoquímicas de tinción de ChoKα en unas cuantas biopsias, de pacientes del Hospital La Paz (Madrid, España) a los que previamente se les había diagnosticado cáncer de mama y que se habían almacenado embebidas en parafina según el procedimiento estándar. Los bloques de parafina de las distintas muestras se cortaron en secciones de 5 μm. Posteriormente, se desparafinaron las secciones y se bloqueó Ia actividad peroxidasa endógena por incubación en H2O2 al 3% en metanol durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los antígenos se recuperaron mediante Ia incubación en EDTA 940 μM, pH 7,2, durante 45 minutos a 1550C. El anticuerpo monoclonal primario anti-ChoK se diluyó 1 :2 en TBS con BSA al 1%. Las secciones de tejido se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se sumergieron en TBS y se incubaron con el kit de EnVision™ (Dako Cytomation, CA), basado en peroxosidasa, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se incubaron luego con el sustrato cromógeno diaminobencidina (Dako Cytomation, CA) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina. En Ia Figura 3 pueden observarse los resultados obtenidos con muestras tomadas de tumores colorrectales de distintos pacientes, en los que se puede observar un ejemplo de anticuerpo no válido para inmunohistoquímica, AD9 (tinción negativa), un anticuerpo no recomendable para su uso en esta técnica al mostrar un patrón de tinción débil, AD6, y dos ejemplos de anticuerpos, AD6 y AD1 , considerados como buenos para su uso en inmunohistoquímica, por dar lugar a una fuerte tinción del tejido tumoral y tinción basal baja del tejido normal adyacente.
En Ia Figura 4 pueden observarse los resultados obtenidos con el anticuerpo AD1 (considerado válido para el análisis de Ia expresión de ChoKα por inmunohistoquímica) en biopsias procedentes de tejido de mama cancerosa (segunda fila, marcada con el número 2), así como en biopsias correspondientes a pacientes a los que se les había diagnosticado cáncer de pulmón, entre las que había muestras de cáncer NSCLC y SCLC (primera fila, marcada con el número 1). El análisis de las biopsias teñidas muestra un fuerte mareaje de algunos de los tejidos tumorales, mientras que en el tejido normal adyacente se observó una tenue tinción. Sin embargo, en algunas biopsias tanto las células tumorales como las de tejido normal mostraron tinción basal de ChoKα. Estos resultados están en consonancia con estudios previos de los autores de Ia invención, en los que un 40-60% de los tumores de mama, pulmón, colon y próstata mostraron un incremento de los niveles de ChoKα o de Ia actividad colina quinasa. De los 14 anticuerpos monoclonales, con 10 de ellos se obtuvo inmunotinción, dando lugar a resultados similares en muestras correspondientes a los mismos tejidos, mientras que los 4 restantes resultaron dieron resultados negativos en el análisis IHQ. El comportamiento de cada uno de los anticuerpos se resume en Ia Tabla 2.
Tabla 2.- Comportamiento de los anticuerpos monoclonales en ensayos inmunohistoquímicos
Figure imgf000027_0001
*: La valoración dada a Ia reactividad obtenida fue: +++ excelente ++ buena + baja -: sin reacción detectable
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Bhakoo KK, Williams SR, Florian CL, Land H, Noble MD. Immortalization and transformation are associated with specific alterations in choline metabolism. Cáncer Res. 1996; 56:4630-5.
2. Nakagami K, Uchida T, Ohwada S, Koibuchi Y, Suda Y, Sekine T, Morishita Y. Increased choline kinase activity and elevated phosphocholine levéis in human colon cáncer. Jpn J Cáncer Res. 1999 ; 90:419-24.
3. Cuadrado A, Carnero A, Dolfi F, Jiménez B, Lacal JC. Phosphorylcholine: a novel second messenger essential for mitogenic activity of growth factors. Oncogene. 1993; 8:2959-68.
4. Ramírez de Molina A, Gallego-Ortega D, Sarmentero J, Banez-Coronel M, Martin-Cantalejo Y, Lacal JC. Choline kinase is a novel oncogene that potentiates RhoA-induced carcinogenesis. Cáncer Res. 2005 JuI 1;65(13):5647-53
5. Ramírez de Molina A, Gutiérrez R, Ramos MA, Silva JM, Silva J, Bonilla F, Sánchez JJ, Lacal JC. Increased choline kinase activity in human breast carcinomas: clinical evidence for a potential novel antitumor strategy. Oncogene. 2002; 21 :4317-22.
6. Ramírez de Molina A, Rodriguez-Gonzalez A, Gutiérrez R, Martinez-Pineiro L, Sánchez J, Bonilla F, Rosell R, Lacal J. Overexpression of choline kínase is a frequent feature in human tumor-derived cell lines and in lung, prostate, and colorectal human cancers. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 296:580-3.
7. Ramírez de Molina A, Banez-Coronel M, Gutiérrez R, Rodriguez-Gonzalez A, Olmeda D, Megias D, Lacal JC. Choline kínase activation is a critical requirement for the proliferation of prímary human mammary epithelíal cells and breast tumor progression. Cáncer Res. 2004; 64:6732-9
8. Rodriguez-Gonzalez A, Ramírez de Molina A, Fernandez F, Lacal JC. Choline kinase inhibition induces the ¡ncrease in ceramides resulting in a híghly specific and selective cytotoxíc antitumoral strategy as a potential mechanism of action. Oncogene. 2004; 23:8247-59.
9. Rodriguez-Gonzalez A, Ramírez de Molina A, Banez-Coronel M, Megias D, Lacal JC. Inhíbitíon of choline kínase renders a highly selective cytotoxic effect in tumour cells through a mitochondríal independent mechanísm. lnt J Oncol. 2005; 26:999-1008. 10. Ramírez de Molina A, Rodríguez-González A, Penalva V, Lucas L, Lacal JC. Inhibítion of ChoK is an efficíent antitumor strategy for Harvey-, Kírsten-, and N-ras- transformed cells. Biochem Biophys Res Commun. 2001 ; 285:873-9.
11. Hernandez-Alcoceba R, Saniger L, Campos J, Nunez MC, Khaless F, Gallo MA, Espinosa A, Lacal JC. Choline kínase inhibítors as a novel approach for antiproliferative drug desígn. Oncogene. 1997; 15:2289-301.
12. Hernandez-Alcoceba R, Fernandez F, Lacal JC. In vivo antitumor actívity of choline kinase inhibitors: a novel target for anticancer drug discovery. Cáncer Res.
1999; 59:3112-8.
13. Rodriguez-Gonzalez A, de Molina AR1 Fernandez F, Ramos MA, Nunez M del C, Campos J, Lacal JC. Inhibition of choline kinase as a specific cytotoxic strategy in oncogene-transformed cells. Oncogene. 2003; 22:8803-12.
14. Ramírez de Molina A, Penalva V, Lucas L, Lacal JC. Regulation of choline kínase activity by Ras proteíns involves RaI-GDS and PI3K. Oncogene. 2002 Jan 31 ;21 (6):937-46.
15. Hosaka K, Tanaka S, Nikawa J, Yamashíta S. Cloning of a human choline kinase cDNA by complementation of the yeast cki mutatíon. FEBS Lett. 1992; 304:229-32.
16. Kδhler G. and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefíned specificity. Nature, 256:495, 1975.
17. Hurrell J. G. R. Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Boca Ratón, FL, 1985, 240.
18. Harlow, E and Lañe, D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, N.Y.
19. Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Scháffer, Jinghuí Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and
PSI-BLAST: a new generatíon of protein datábase search programs". Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal específico para Ia proteína colina quinasa alfa humana que se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
2. Una línea celular de hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal específico para Ia proteína colina quinasa alfa humana que se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 yAD14.
3. Línea celular de hibridoma según Ia reivindicación 2, obtenida mediante Ia fusión con Ia línea de mieloma de ratón NS- 1 de células de bazo de ratones Balb/c inmunizados con Ia proteína colina quinasa alfa humana.
4. Una composición que comprende al menos un anticuerpo monoclonal específico para Ia proteína colina quinasa alfa humana que se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14, o combinaciones de los mismos.
5. Composición según Ia reivindicación 3, en Ia que el anticuerpo monoclonal está unido a otra sustancia o partícula.
6. Composición según Ia reivindicación 5, en Ia que el anticuerpo monoclonal está unido a una sustancia que facilita su detección.
7. Composición según Ia reivindicación 6, en Ia que el anticuerpo monoclonal está unido a una molécula radioactiva, un cromóforo, un fluoróforo o una enzima que cataliza un reacción en Ia que se produce un cromóforo o fluoróforo o en Ia que desaparece un cromóforo o un fluoróforo.
8. Composición según Ia reivindicación 5, en Ia que el anticuerpo monoclonal está unido a una sustancia o partícula que facilita su extracción del medio en el que se encuentra.
9. Composición según Ia reivindicación 8, en Ia que el anticuerpo monoclonal está unido a una partícula metálica o una partícula magnética.
10. Composición según Ia reivindicación 4, que comprende adicionalmente un segundo anticuerpo capaz de unirse a al menos un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14 que esté presente en dicha composición.
11. Composición según Ia reivindicación 10, en Ia que el segundo anticuerpo es un anticuerpo que se une al fragmento Fc de las inmunoglobulinas G de ratón.
12. Composición según Ia reivindicación 10 u 11 , en Ia que el segundo anticuerpo está unido a una sustancia o partícula que facilita su detección o facilita su extracción del medio en el que se encuentre.
13. Composición según Ia reivindicación 12, en Ia que el segundo anticuerpo está unido a una molécula radioactiva, un cromóforo, un fluoróforo o una enzima que cataliza un reacción en Ia que se produce un cromóforo o fluoróforo o en Ia que desaparece un cromóforo o un fluoróforo.
14. Composición según Ia reivindicación 12, en Ia que el segundo anticuerpo está unido a una partícula metálica o una partícula magnética.
15. Uso de al menos un anticuerpo de Ia reivindicación 1 o de una composición de las reivindicaciones 4 a 14 que Io contenga para detectar y/o cuantificar Ia proteína colina quinasa alfa humana en una muestra cualquiera.
16. Uso según Ia reivindicación 15, en el que Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana en una muestra cualquiera se produce mediante un inmunoensayo en el que las proteínas presentes en Ia muestra a analizar han sido previamente objeto de transferencia Western.
17. Uso según Ia reivindicación 16, en el que el anticuerpo monoclonal utilizado en el inmunoensayo se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
18. Uso según Ia reivindicación 15, en el que en el que Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana en una muestra cualquiera se produce tras Ia inmunoprecipitación de Ia misma.
19. Uso según Ia reivindicación 18, en el que en el que el anticuerpo monoclonal usado para Ia inmunoprecipitación se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD7, AD8, AD11 , AD13 y AD14.
20. Uso según Ia reivindicación 18, en el que Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa tras Ia inmunoprecipitación de Ia misma comprende una etapa en Ia que se ensaya Ia actividad colina quinasa alfa humana detectable en el inmunoprecipitado.
21. Uso según Ia reivindicación 20, en el que el anticuerpo monoclonal usado para Ia inmunoprecipitación se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD4, AD5, AD7, AD13 y AD14.
22. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 , en el que Ia muestra es una muestra biológica de un ser humano.
23. Uso según Ia reivindicación 22, en el que Ia muestra biológica es una muestra de un fluido biológico de un ser humano.
24. Uso según Ia reivindicación 22, en el que Ia muestra biológica es una muestra de tejido tomada de un ser humano.
25. Uso según Ia reivindicación 15, en el que Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana se produce mediante técnicas inmunohistoquímicas.
26. Uso según Ia reivindicación 25, en el que Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana se produce sobre una muestra de tejido tomada de un ser humano.
27. Uso según Ia reivindicación 26, en el que el anticuerpo monoclonal utilizado para Ia realización de las técnicas inmunohistoquímicas se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD10, AD14.
28. Uso según Ia reivindicación 26 ó 27, en el que el tejido del que se ha extraído Ia muestra es tejido de mama, pulmón, colon, próstata, vejiga o de un tumor hematológico.
29. Un método para realizar in vito el diagnóstico de cáncer, el pronóstico de su evolución, el seguimiento de dicha evolución o para comprobar Ia efectividad de un tratamiento anticancerígeno, que comprende Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana en una muestra biológica de un ser humano mediante un anticuerpo monoclonal que se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
30. Método según Ia reivindicación 29, en el que Ia muestra biológica es una muestra de tejido tomada de un ser humano.
31. Método según Ia reivindicación 30, en el que Ia muestra de tejido es de tejido de mama, pulmón, colon, próstata, vejiga o de un tumor hematológico.
32. Método según Ia reivindicación 30 ó 31, en el que Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana se realiza mediante técnicas inmunohistoquímicas.
33. Método según Ia reivindicación 32, en el que Ia detección del anticuerpo monoclonal unido a Ia proteína quinasa alfa humana se realiza mediante un segundo anticuerpo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal.
34. Método según Ia reivindicación 33, en el que el segundo anticuerpo monoclonal capaz de unirse al anticuerpo monoclonal está unido a una molécula radioactiva, un cromóforo, un fluoróforo o una enzima que cataliza una reacción en Ia que se produce un cromóforo o fluoróforo o en Ia que desaparece un cromóforo o un fluoróforo.
35. Método según Ia reivindicación 33 ó 34, en el que el segundo anticuerpo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal específico para Ia colina quinasa alfa humana en un anticuerpo que se une al fragmento Fc de las inmunoglobulinas G de ratón.
36. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en el que el anticuerpo monoclonal específico para Ia colina quinasa alfa humana utilizado para Ia realización de las técnicas inmunohistoquímicas se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD10 y AD14.
37. Un kit para realizar ¡n vitro el diagnóstico de cáncer, el pronóstico de su evolución, el seguimiento de Ia misma o para comprobar Ia efectividad de un tratamiento anticancerígeno en una muestra biológica de un ser humano que comprende al menos un anticuerpo monoclonal de Ia reivindicación 1.
38. Kit según la reivindicación 37, que comprende adicionalmente un segundo anticuerpo capaz de unirse a al menos un anticuerpo monoclonal de Ia reivindicación 1 que esté presente en el kit.
39. Kit según Ia reivindicación 38, en el que el segundo anticuerpo capaz de unirse a al menos un anticuerpo monoclonal de Ia reivindicación 1 está unido a una molécula radioactiva, un cromóforo, un fluoróforo o una enzima que cataliza una reacción en Ia que se produce un cromóforo o fluoróforo o en Ia que desaparece un cromóforo o un fluoróforo.
40. Kit según Ia reivindicación 38 ó 39, en el que el segundo anticuerpo capaz de unirse a al menos un anticuerpo monoclonal de Ia reivindicación 1 presente en el kit es un anticuerpo que se une al fragmento Fc de las inmunoglobulinas G de ratón.
41. Uso de al menos un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo de AD3, AD8 y AD11 para Ia fabricación de una medicamento para Ia terapia contra el cáncer.
42. Uso según Ia reivindicación 41, en el que el cáncer es cáncer de mama, pulmón, colon, próstata, vejiga o un tumor hematológico.
PCT/ES2007/000364 2006-05-29 2007-05-28 Anticuerpos monoclonales anti-colina quinasa alfa y su uso en técnicas analíticas, de diagnóstico del cáncer y en la preparación de medicamentos Ceased WO2007138143A2 (es)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07788612A EP2025686A4 (en) 2006-05-29 2007-05-28 MONOCLONAL ALPHA ANTICHOLIN KINASE ANTIBODIES AND ITS USE IN ANALYTICAL METHODS FOR THE DIAGNOSIS OF CANCER AND FOR THE MANUFACTURE OF MEDICINE PRODUCTS

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200601407 2006-05-29
ES200601407 2006-05-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2007138143A2 true WO2007138143A2 (es) 2007-12-06
WO2007138143A3 WO2007138143A3 (es) 2008-02-21

Family

ID=38779731

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2007/000364 Ceased WO2007138143A2 (es) 2006-05-29 2007-05-28 Anticuerpos monoclonales anti-colina quinasa alfa y su uso en técnicas analíticas, de diagnóstico del cáncer y en la preparación de medicamentos

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP2025686A4 (es)
WO (1) WO2007138143A2 (es)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015028662A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) Compositions and methods for characterization and amelioration of rheumatoid arthritis
WO2025196502A1 (en) 2024-03-20 2025-09-25 North Carolina Agricultural & Technical State University Choline kinase inhibitors as a therapeutic treatment for obesity

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106290895A (zh) * 2016-07-26 2017-01-04 王红阳 Chka蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用、试剂盒及方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006108905A1 (es) 2005-04-13 2006-10-19 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Método in vitro para identificar compuestos para terapia del cáncer

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2263152T3 (es) * 1994-06-09 2006-12-01 Licentia Oy Anticuerpo monoclonal contra el receptor flt4 tirosina quinasa y su uso en diagnostico y terapia.
JPWO2003010542A1 (ja) * 2001-07-25 2004-11-18 三菱ウェルファーマ株式会社 癌診断薬
WO2006010497A2 (en) * 2004-07-28 2006-02-02 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with choline kinase (chk)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006108905A1 (es) 2005-04-13 2006-10-19 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Método in vitro para identificar compuestos para terapia del cáncer

Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALTSCHUL, STEPHEN F. ET AL.: "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402, XP002905950, DOI: doi:10.1093/nar/25.17.3389
BHAKOO KK ET AL.: "Immortalization and transformation are associated with specific alterations in choline metabolism", CANCER RES., vol. 56, 1996, pages 4630 - 5
CUADRADO A ET AL.: "Phosphorylcholine: a novel second messenger essential for mitogenic activity of growth factors", ONCOGENE, vol. 8, 1993, pages 2959 - 68
HARLOW, E; LANE, D.: "Antibodies: A Laboratory Manual.", 1988, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
HERNANDEZ-ALCOCEBA R ET AL.: "Choline kinase inhibitors as a novel approach for antiproliferative drug design", ONCOGENE, vol. 15, 1997, pages 2289 - 301
HERNANDEZ-ALCOCEBA R; FERNANDEZ F; LACAL JC: "In vivo antitumor activity of choline kinase inhibitors: a novel target for anticancer drug discovery", CANCER RES., vol. 59, 1999, pages 3112 - 8
HOSAKA K ET AL.: "Cloning of a human choline kinase cDNA by complementation of the yeast cki mutation", FEBS LETT., vol. 304, 1992, pages 229 - 32
HURRELL J.G.R.: "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", 1985, CRC PRESS, pages: 240
K6HLER G.; MILSTEIN C.: "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", NATURE, vol. 256, 1975, pages 495, XP002024548
NAKAGAMI K ET AL.: "Increased choline kinase activity and elevated phosphocholine levels in human colon cancer", JPN J CANCER RES., vol. 90, 1999, pages 419 - 24, XP009089882
RAMIREZ DE MOLINA A ET AL.: "Choline kinase activation is a critical requirement for the proliferation of primary human mammary epithelial cells and breast tumor progression", CANCER RES., vol. 64, 2004, pages 6732 - 9, XP003020096, DOI: doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-0489
RAMIREZ DE MOLINA A ET AL.: "Choline kinase is a novel oncogene that potentiates RhoA- induced carcinogenesis", CANCER RES., vol. 65, no. 13, 1 July 2005 (2005-07-01), pages 5647 - 53, XP008102216, DOI: doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-4416
RAMIREZ DE MOLINA A ET AL.: "Increased choline kinase activity in human breast carcinomas: clinical evidence for a potential novel antitumor strategy", ONCOGENE, vol. 21, 2002, pages 4317 - 22, XP002481127
RAMIREZ DE MOLINA A ET AL.: "Inhibition of ChoK is an efficient antitumor strategy for Harvey-, Kirsten-, and N-ras- transformed cells", BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 285, 2001, pages 873 - 9
RAMIREZ DE MOLINA A ET AL.: "Overexpression of choline kinase is a frequent feature in human tumor-derived cell lines and in lung, prostate, and colorectal human cancers", BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 296, 2002, pages 580 - 3, XP003020095, DOI: doi:10.1016/S0006-291X(02)00920-8
RAMIREZ DE MOLINA A ET AL.: "Regulation of choline kinase activity by Ras proteins involves Ral-GDS and P13K", ONCOGENE, vol. 21, no. 6, 31 January 2002 (2002-01-31), pages 937 - 46
RODRIGUEZ-GONZALEZ A ET AL.: "Choline kinase inhibition induces the increase in ceramides resulting in a highly specific and selective cytotoxic antitumoral strategy as a potential mechanism of action", ONCOGENE
RODRIGUEZ-GONZALEZ A ET AL.: "Inhibition of choline kinase as a specific cytotoxic strategy in oncogene-transformed cells", ONCOGENE, vol. 22, 2003, pages 8803 - 12
RODRIGUEZ-GONZALEZ A ET AL.: "Inhibition of choline kinase renders a highly selective cytotoxic effect in tumour cells through a mitochondrial independent mechanism", INT J ONCOL., vol. 26, 2005, pages 999 - 1008
See also references of EP2025686A4

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015028662A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) Compositions and methods for characterization and amelioration of rheumatoid arthritis
WO2025196502A1 (en) 2024-03-20 2025-09-25 North Carolina Agricultural & Technical State University Choline kinase inhibitors as a therapeutic treatment for obesity

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007138143A3 (es) 2008-02-21
EP2025686A4 (en) 2009-12-23
EP2025686A2 (en) 2009-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2720483T3 (es) Sistemas y procedimientos de anticuerpos anti p40
CN103688173B (zh) 利用5"‑核苷酸酶检测包涵体肌炎的用途
KR20120041175A (ko) 미량 존재하는 인간 혈장 단백질 바이오마커의 신규 패널을 이용한 간성 섬유증의 임상적 진단
AU2010212772B2 (en) Prediction of response to platinum-based therapy
JP4948728B2 (ja) 癌診断用抗体
JP5893037B2 (ja) Ｂｒａｆｖ６００ｅに特異的に結合する抗体を使用する癌の診断のための手段及び方法
BR112012014954B1 (pt) Metodo para diagnosticar tumor maligno
Murphy et al. Epitope presentation is an important determinant of the utility of antigens identified from protein arrays in the development of autoantibody diagnostic assays
Shiozawa et al. Dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 promotes tumor angiogenesis in lung adenocarcinoma
US20210277142A1 (en) Monoclonal antibodies binding mcm5
CN102472753B (zh) 基于组蛋白macroH2A同工型预测癌症复发风险的诊断方法
US20210231669A1 (en) Method for diagnosing pancreatic cancer using methionyl-trna synthetase, and pancreatic cancer diagnostic kit using same
WO2009113674A1 (ja) 膀胱癌の診断
WO2011108628A1 (ja) 胃癌検出用マーカー及び胃癌検出方法
EP3144676B1 (en) Kit comprising antibody specifically binding to complement factor b protein and antibody specifically binding to carbohydrate antigen 19-9 protein for diagnosing pancreatic cancer
EP2025686A2 (en) Alpha anticholine kinase monoclonal antibodies and their use in analytical techniques for the diagnosis of cancer and the preparation of medicinal products
KR101594287B1 (ko) 보체인자 b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트
US9127054B2 (en) Immunoassay of cofilin 1 protein
JP7709703B2 (ja) 膵臓がんの検出方法及び検出試薬
JP2008122276A (ja) コラーゲン特異的分子シャペロンｈｓｐ４７の測定方法
JP2004198313A (ja) 甲状腺腫瘍の診断用キット
ES2714866T3 (es) Anticuerpos que reconocen el dominio central de la ADN polimerasa Pol Zeta y sus usos para el diagnóstico del cáncer
WO2018034332A1 (ja) ＥｐｈＡ２ Ｎ末端フラグメント抗体
CN106191022B (zh) 一种肿瘤特异抗原及其应用
CN121620532A (zh) 一种适用于免疫组化检测cd228的诊断抗体

Legal Events

Date Code Title Description
DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007788612

Country of ref document: EP