WO2008026741A1 - Rapid diagnosis method specific to avian influenza virus - Google Patents

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influenza
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Kazuo Takahashi
Yoshinobu Okuno
Hiroshi Nishimura
Takeshi Imoarai
Noriyuki Saito
Tomokuni Taniguchi
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Osaka Municipal Government
Sysmex Corp
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    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus

Definitions

  • the present invention relates to an avian influenza virus detection method and an avian influenza virus detection method.
  • Influenza viruses differ in antigenicity between nucleoprotein (NP) and membrane protein (M)! / ⁇
  • influenza A viruses are also different in amino acid sequence or antigenicity between hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA).
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • HA is classified into 15 types of H;! ⁇ 15
  • NA is classified into 9 types of N;! ⁇ 9, and there are subtypes of the number of combinations.
  • subtypes that infect humans with humans as hosts are HI-3 and N1-2.
  • Influenza A virus (H;! ⁇ 3, Nl ⁇ 2) and influenza B virus (hereinafter sometimes referred to as “human influenza virus”) cause a pandemic every year. ).
  • Influenza A virus infects many mammals and birds as well as humans. Infection of avian birds caused by influenza A virus infecting birds is "Triinfluenza", and all the subtypes of HI ⁇ ; 15, Nl ⁇ 9 are confirmed in the avian influenza virus that causes it Has been. Many avian influenza viruses do not show serious symptoms, but some avian influenza viruses of the H5 and H7 subtypes show severe symptoms when infected with birds. These are called highly pathogenic avian influenza viruses, and there is concern about the possibility of human infection. In addition, some H9 subtypes of influenza virus have been reported to infect and develop humans that have come into contact with poultry infected with the virus. Has been.
  • influenza is diagnosed using a kit for rapidly detecting influenza virus antigens in clinical practice.
  • rapid diagnosis kits include those using the enzyme immunoassay (EIA) and immunochromatography as the principle.
  • EIA enzyme immunoassay
  • the type that detects only the type A virus for example, see JP 2006-67979 A
  • the type that detects both the influenza A virus and influenza B virus the influenza A virus and influenza B virus
  • the rapid diagnosis kit of Patent Document 1 does not distinguish between human influenza A virus and avian influenza virus, and detects a wide range of viruses belonging to influenza A virus. Therefore, if a human shows signs of influenza, it cannot be diagnosed whether it is due to an avian influenza virus or whether it is due to a human influenza virus. For this reason, it is necessary to develop a rapid diagnostic method for avian influenza virus.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and a method for specifically, rapidly and simply detecting an avian influenza virus as distinguished from a human influenza virus, and an immunochromatographic test used therefor.
  • the purpose is to provide ingredients.
  • the present invention relating to the avian influenza virus detection method is not reactive to human influenza A virus HI subtypes, H2 subtypes and H3 subtypes, and human influenza B type viruses.
  • Using a reactive anti-influenza virus antibody to detect avian influenza virus in a sample by immunoassay is a special feature!
  • At least one of the avian influenza virus subtypes to which the anti-influenza virus antibody is reactive is selected from the group consisting of avian influenza virus ⁇ 5 subtype, ⁇ 7 subtype, and ⁇ 9 subtype. It is preferred to be chosen!
  • the anti-influenza virus antibody may be reactive to avian influenza virus of at least 3 to 15 subtypes.
  • an antibody against a nucleoprotein of influenza type 8 virus may be used as the anti-influenza virus antibody.
  • an antibody that recognizes an epitope present in the region of positions 46 to 159 from the N-terminal side of the amino acid sequence of the nucleoprotein of the avian influenza virus can also be used.
  • the anti-influenza virus antibody power is preferably a monoclonal antibody produced by Hypridoma whose international deposit receipt number is FERM ABP-10904 (domestic deposit deposit number: FERM P-20822).
  • the immunological measurement method uses first and second antibodies against influenza virus, and the labeled first antibody and the solid phase are immobilized on a solid phase. Forming a complex containing the immobilized second antibody and influenza virus, and at least the second antibody comprises human influenza
  • Anti-Influenza virus antibodies that are reactive against multiple subtypes of avian influenza virus but not reactive to type A viruses HI, H2 and H3, and human influenza B virus are preferred. Les.
  • the first and second antibodies are not reactive to human influenza A virus HI subtypes, H2 subtypes and H3 subtypes, and human influenza B type viruses.
  • Anti-influenza virus antibodies that are reactive with the mold are preferred.
  • the immunological measurement method is preferably an immunochromatographic method.
  • the immunochromatography method forms a complex containing the second antibody, the labeled first antibody, and influenza virus in a chromatographic membrane carrier on which the second antibody is immobilized.
  • the second antibody is not reactive to human influenza A virus HI subtype, H2 subtype and H3 subtype and human influenza B virus, and Preferably an anti-influenza virus antibody that is reactive to the mold.
  • the present invention relating to an immunochromatographic test device is an immunochromatographic test device for detecting an influenza virus in a sample using the first and second antibodies against the influenza virus.
  • a sample addition member to which the sample is added, and a standard A label holding member carrying a first antibody labeled with a sensing substance, and a chromatographic membrane carrier on which a determination region to which the second antibody is fixed is disposed, wherein the first antibody is a triinfrenenza virus
  • the second antibody is not reactive to human influenza A virus HI subtypes, H2 subtypes and H3 subtypes, and human influenza B type viruses. It is an anti-influenza virus antibody that is reactive to the mold.
  • the labeling substance is preferably an insoluble granular marker.
  • colored synthetic polymer particles or colloidal metal particles are particularly preferred.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of an immunochromatographic test device according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing test results for identifying antigens recognized by monoclonal antibodies 4E3 and 1C10.
  • FIG. 3 Schematic representation of the amino acid sequences of r—Human Flu NP, r—Avian Flu NP, r—Chi Flu NP, r—Ch2 F lu NP, r—Ch3 Flu NP, and r—Ch4 Flu NP
  • FIG. 3 Schematic representation of the amino acid sequences of r—Human Flu NP, r—Avian Flu NP, r—Chi Flu NP, r—Ch2 F lu NP, r—Ch3 Flu NP, and r—Ch4 Flu NP
  • FIG. 4 Diagram showing amino acid sequences 1 to 50 of r-Human Flu NP and r-Avian Flu NP, 12 NPs derived from human influenza virus strains, and 12 NPs derived from avian influenza virus strains. is there.
  • FIG. 5 is also a view showing amino acid sequences from the 51st position to the 100th position.
  • FIG. 6 is also a drawing showing amino acid sequences from the 101st position to the 150th position.
  • FIG. 7 is a view similarly showing amino acid sequences from position 151 to position 200.
  • FIG. 8 is also a drawing showing amino acid sequences from position 201 to position 250.
  • FIG. 9 is a view similarly showing amino acid sequences from position 251 to position 300.
  • FIG. 10 is a view similarly showing the amino acid sequence from position 301 to position 350.
  • FIG. 11 is also a drawing showing amino acid sequences from position 351 to position 400.
  • FIG. 12 is a view similarly showing the amino acid sequence from position 401 to position 450.
  • FIG. 13 is also a drawing showing amino acid sequences from position 451 to position 504.
  • FIG. 14 is a diagram comparing the reactivity of 4E3 and anti-His tag antibodies against each recombinant NP.
  • the method for detecting avian influenza virus is not reactive to human influenza A virus HI subtype, H2 subtype and H3 subtype and human influenza B virus, and a plurality of subtypes of triinfluenza virus. This is a method for detecting avian influenza virus in a sample by an immunoassay using an anti-influenza virus antibody that is reactive to.
  • influenza A virus has not been distinguished until now whether it is a human-derived influenza virus or an avian-derived influenza virus.
  • multiple subtypes of avian influenza virus can be detected.
  • the antibody used in the avian influenza virus detection method does not react with human influenza A virus HI subtype, H2 subtype and H3 subtype, and human influenza B virus, It is an anti-influenza virus antibody that is reactive to subtypes.
  • This anti-influenza virus antibody does not react with human influenza viruses (types A (HI to 3) and B), but reacts with multiple subtypes of avian influenza virus. It is possible to detect an influenza A virus from a bird by distinguishing whether it is human or avian by detecting influenza A type quinoles without distinguishing it from a bird.
  • avian influenza virus subtypes to which the anti-influenza virus antibody reacts at least one of them is preferably selected from the group power consisting of the avian influenza virus H5 subtype, H7 subtype and H9 subtype. . This is because the avian influenza virus H5 subtype, H7 subtype or H9 subtype is an avian influenza virus that has been confirmed to infect humans in the past, and may cause spread of infection in humans.
  • Anti-influenza virus antibody strength At least H3 ⁇ ; It may be reactive to Ruth. In this case, if the avian influenza virus is of the H3 ⁇ ; 15 subtype, it can be detected.
  • Anti-influenza virus antibody power An antibody against the nucleoprotein of influenza A virus is preferred. It is also preferable to use an antibody that recognizes an epitope present in the region of positions 46 to 159 from the N-terminal side of the amino acid sequence of the nucleoprotein of Triinfenza virus as an anti-influenza virus antibody.
  • 4E3 a monoclonal antibody produced by Hypridoma Mouse—Mouse hybridoma 4E3 can be mentioned.
  • the hybridoma is named “Mouse—Mouse hybridoma 4E3” and is displayed under the Budapest Treaty. Under the Budapest Treaty, Ibaraki Prefecture, Tsukuba Tohoku 1-chome 1 1 Chuo No. 6 (zip code 305 8566), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Registration number: FERM ABP— 10904 [Receipt date: 2007 (Heisei 19)] August 30, domestic deposit number: FERM P— 20822, Domestic deposit: 2006 18) February 24].
  • Hypridoma Mouse- Mouse hybridoma 4E3 is 10% urchin fetal i '? Blue, 10 mM L-gnoretamine, 0.25% NaHC O in RPMI 1640 medium (SIGMA R6504), 37 ° C, 5% CO Incubate at
  • the produced 4E3 can be produced by recovering and purifying by a known method.
  • the monoclonal antibody includes fragments thereof, modified antibodies such as chimeric antibodies and humanized antibodies, and mutated antibodies. These fragments, modified antibodies or mutant antibodies also have specificity for multiple subtypes of avian influenza virus similar to the original antibody. These can be prepared by means or methods known to those skilled in the art.
  • An immunological assay is a method for quantitatively measuring a substance by utilizing its ability to bind to an antibody.
  • radioimmunoassay RIA
  • immunoradiometric assay IR (MA) method
  • enzyme immunoassay EIA
  • enzyme immunoassay ELISA
  • homogeneous enzyme immunoassay method fluorescence immunoassay (FIA) method
  • immunofluorescence analysis IFMA
  • fluorescence polarization method fluorescence polarization method
  • CLIA chemiluminescence immunoassay
  • CLIA chemiluminescent enzyme immunoassay
  • immunonotrograph method can be used.
  • the anti-influenza virus antibody used in the immunological assay may be one type or two or more types! /.
  • the sample is not limited as long as it may contain influenza virus, for example, biological samples such as tears, eyelids, sputum, saliva, and stool from a suspected patient, physiological saline, and phosphate buffer. It was mixed with a solvent such as the above, a gauze wiped from the affected area (nasal cavity, pharynx, etc.) of the suspected patient, washed or extracted with the above solvent from a soot or the like, or a washing liquid with the above solvent of the affected area of the suspected patient constitution.
  • a solvent such as the above
  • a gauze wiped from the affected area (nasal cavity, pharynx, etc.) of the suspected patient washed or extracted with the above solvent from a soot or the like, or a washing liquid with the above solvent of the affected area of the suspected patient
  • a washing liquid with the above solvent of the affected area of the suspected patient
  • the first and second antibodies against influenza virus are used, and the labeled first antibody, the second antibody immobilized on a solid phase, and an influenza virus are included. It is preferable to use an immunoassay method based on the sandwich method, which includes a step of forming a complex.
  • the human influenza A virus HI subtype, H2 subtype and H3 subtype and human influenza B virus are not reactive to the above-mentioned subtypes of avian influenza virus.
  • Anti-influenza virus antibodies that are reactive to are used. This is because by constructing a so-called sandwich structure with the first antibody, the avian influenza virus (antigen) and the second antibody, the avian influenza winores in the sample can be measured with high sensitivity.
  • the first and second antibody strengths S are preferably the anti-influenza virus antibodies.
  • the anti-influenza virus antibody for both the first and second antibodies, sensitivity and specificity are increased, and detection accuracy is improved.
  • Immunological measurement methods based on the sandwich method include IRMA method, ELISA method, IF MA method, immunochromatography method and the like.
  • the labeling substance to be bound to the first antibody a radioactive isotope (125 i, 14 c, 32 P , etc.), enzymes (/ 3-galactosidase, Peruokishidaze, alkaline phosphatase, etc.), fluorescent substances (Furuoresein derivatives, Rhodamine derivatives, etc.), insoluble granular markers, etc. It is.
  • the material or shape of the solid phase for immobilizing the second antibody is appropriately selected according to the measurement method.
  • solid phase materials include poly (vinyl chloride), poly (vinylidene fluoride) (PVDF), poly (styrene), styrene / dibutylbenzene copolymer, styrene / maleic anhydride copolymer, nylon, poly (bull alcohol), and polyacrylol.
  • solid phase materials include poly (vinyl chloride), poly (vinylidene fluoride) (PVDF), poly (styrene), styrene / dibutylbenzene copolymer, styrene / maleic anhydride copolymer, nylon, poly (bull alcohol), and polyacrylol.
  • synthetic organic polymer compounds such as amide, polyacrylonitrile, and polypropylene, polysaccharides such as dextran derivatives, agarose gel, and cellulose, and inorganic polymer
  • a functional group such as an amino group, an aminoacyl group, a carboxyl group, an acyl group, a hydroxyl group or a nitrile group.
  • a microtiter plate ELISA plate
  • a flat plate shape such as a disk
  • a particle shape such as a bead
  • a tubular shape such as a test tube or a tube
  • a fibrous shape such as a test tube or a tube
  • a membrane shape can be used as a membrane shape.
  • the immunotomato graph method is preferable because it is easy to operate, does not require a special device, and can perform measurement quickly.
  • a complex containing the second antibody, the labeled first antibody, and influenza virus is formed on a chromatographic membrane carrier on which the second antibody is immobilized.
  • the second antibody is not reactive to human influenza A virus HI subtype, H2 subtype and H3 subtype and human influenza B virus, and Anti-influenza virus antibodies that are reactive with the mold are preferred.
  • the chromatographic membrane carrier in the immunochromatography method, a complex containing the second antibody, the labeled first antibody, and influenza virus is formed on a chromatographic membrane carrier on which the second antibody is immobilized.
  • the second antibody is not reactive to human influenza A virus HI subtype, H2 subtype and H3 subtype and human influenza B virus, and Anti-influenza virus antibodies that are reactive with the mold are preferred.
  • the chromatographic membrane carrier in the chromatographic membrane carrier
  • insoluble particulate markers are preferably used because of the ability to use the above-described labeling substances, among which the color can be determined quickly and easily by observing with the naked eye.
  • An insoluble granular marker is a particle that exhibits a color among the particles used as a labeling substance in the immunochromatography method.
  • colloidal metal particles such as gold colloid and platinum colloid, pigments, etc.
  • Synthetic polymer particles such as colored polystyrene latex (colored synthetic polymer particles), polymer dyed particles, etc. Can be mentioned.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of an immunochromatographic test device according to one embodiment of the present invention.
  • This immunochromatographic test device 1 has a plastic plate having an adhesive layer on its surface, a base material 2 made of a sample, a sample addition member 3 made of a rayon nonwoven fabric, and a label holding made of a nonwoven fabric made of glass fiber.
  • a member 4, a chromatographic membrane carrier 5 made of a nitrocellulose porous body, and an absorbent member 6 made of a cellulose nonwoven fabric are provided.
  • the substrate 2 is used for appropriately arranging the above-described members such as the sample addition member 3 and the label holding member 4, and materials other than plastic, such as paper and glass, can be used.
  • a sample is added to the sample addition member 3.
  • the sample is preferably a force S, a nasal aspirate, a nasal wipe, or a throat wipe, which can use the same sample as that used in the immunoassay.
  • the sample may be diluted with an appropriate solvent such as a buffer and added.
  • As the sample addition member 3 in addition to the rayon nonwoven fabric, for example, a porous synthetic resin sheet or film such as porous polyethylene or porous polypropylene, filter paper, cellulose paper such as cotton cloth, woven fabric or nonwoven fabric, A glass fiber non-woven fabric can be used.
  • the label holding member 4 is disposed in contact with the sample addition member 3, and carries a first antibody labeled with a labeling substance.
  • This first antibody reacts with an object to be measured in the sample and reacts with an antigen antibody.
  • an antibody reactive to avian influenza is used.
  • the antibody is reactive against avian influenza, one or more of them can be used.
  • 4E3 is preferably used. It is also possible to use a combination of 4E3 and other anti-influenza virus antibodies reactive to trifluenza.
  • the labeling substance for labeling the first antibody it is possible to use the same labeling substance as used in the immunological measurement method and the immunochromatography method based on the sandwich method.
  • insoluble granular markers are preferred because color changes can be determined quickly and easily by observing with the naked eye.
  • colored synthetic polymer particles or colloidal metal particles are particularly preferred!
  • the label holding member 4 can be manufactured by impregnating a suspension of the labeled first antibody into a nonwoven fabric of glass fiber and drying it.
  • the sign holding Force S in which a non-woven fabric of glass fiber is used as member 4 is not limited thereto, for example, cellulose cloth (filter paper, nitrocellulose membrane, etc.), porous plastic cloth such as polyethylene, polypropylene, etc. Can also be used.
  • the chromatographic membrane carrier 5 has a determination region 5A that is arranged with a gap from the label holding member 4 and to which a second antibody that reacts with a measurement target and an antigen antibody is fixed.
  • the second antibody is an anti-influenza that is not reactive to human influenza A virus HI subtypes, H2 subtypes and H3 subtypes, and human influenza B virus, and is reactive to multiple subtypes of avian influenza virus.
  • Viral antibody preferably 4E3.
  • the chromatographic membrane carrier 5 is capable of chromatographic development of a measurement target contained in a force sample using a nitrocellulose porous material, and can fix the second antibody forming the determination region 5A.
  • nylon for example, modified nylon having an amino group which may have a carboxyl group, an alkyl group or the like as a substituent
  • P VDF polyvinylidene fluoride
  • the absorbing member 6 is disposed so as to come into contact with the chromatographic membrane carrier 5 and is for absorbing an excess sample.
  • a porous plastic nonwoven fabric made of cotton, filter paper, polyethylene, polypropylene or the like can be used as long as it is made of a material that can quickly absorb and retain liquid.
  • a part of the sample addition member 3 and the surface of the absorbing member 6 are covered with a transparent sheet 7 as shown in FIG.
  • the immunochromatographic test device 1 of the present invention can be produced, for example, as follows. First, the chromatographic membrane carrier 5 is attached to the middle of the base material 2, and the chromatographic membrane carrier 5 is chromatographed at the starting point side (ie, the left side of FIG. The label holding member 4 is pasted on the upstream side of the base material 2 with a gap so as not to contact the end of). Then, the upstream portion of the sample addition member 3 is attached to the uppermost stream portion of the substrate 2, and at the same time, the end point of the chromatographic development of the sample addition member 3 (that is, the right side of FIG.
  • the downstream part is placed on the upper surface of the label holding member 4 and the upstream part of the chromatographic membrane carrier 5 and is attached to the base material 2 between the label holding member 4 and the chromatographic membrane carrier 5.
  • the upstream portion of the absorbent member 6 is placed on the upper surface of the downstream portion of the membrane carrier 5 for the mouthpiece.
  • the downstream portion of the absorbent member 6 is attached to the most downstream portion of the substrate 2.
  • the downstream portion of the sample addition member 3 and the surface of the absorption member 6 are covered with a transparent sheet 7.
  • sample is mixed with an appropriate solvent as necessary to obtain a mixture that can be chromatographed, and the mixture is upstream of the immunochromatographic test device 1 (sample addition member 3) side.
  • sample addition member 3 sample addition member 3
  • the mixed solution passes through the sample addition member 3 and is mixed with the labeled first antibody in the label holding member 4.
  • the label holding member 4 and the first antibody are combined by the antigen-antibody reaction to form a complex.
  • This complex is chromatographed in the chromatographic membrane carrier 5 to reach the determination region 5A, and is captured by an antigen-antibody reaction with the second antibody immobilized thereon.
  • the determination region 5A is colored blue due to the accumulation of the particles, so immediately the presence of the trifluenza virus is visually confirmed. The power S can be confirmed.
  • this immunochromatographic test device 1 does not react with human influenza viruses (types A (HI-3) and type B), and a plurality of subtypes of avian influenza virus. Since reactive anti-influenza virus antibodies are used, if a human is infected with influenza, it is possible to confirm whether the influenza virus that causes the infection is derived from birds.
  • human influenza viruses types A (HI-3) and type B
  • reactive anti-influenza virus antibodies are used, if a human is infected with influenza, it is possible to confirm whether the influenza virus that causes the infection is derived from birds.
  • the chromatographic membrane carrier 5 can include not only one determination region but also two or more determination regions. Further, the chromatographic membrane carrier 5 may include a control part. When the control part is provided, avidin labeled with, for example, red latex particles is held on the label holding member 4, and biotin that specifically binds to avidin is fixed on the control part of the chromatographic membrane carrier 5. Les,. Further, instead of the combination of avidin and biotin, for example, a hapten such as 2,4-dinitrophenol (DNP) and an antibody that recognizes the hapten can be used in combination. At this time, as the hapten, it is preferable to use a hapten that does not exist in the sample used for measurement.
  • DNP 2,4-dinitrophenol
  • the subtype to which the anti-influenza virus antibody used in the method for detecting triinfense virus of the present invention is reactive is not limited to the HI 5 subtype. It includes HI 6 subtypes identified as subtypes of influenza A virus, and HI 7 and later subtypes that will be confirmed in the future.
  • the antibodies used in the immunochromatographic test devices of the examples and comparative examples are the hybridomas described above [Receipt number of international deposit at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST): FERM ABP-10904 (Domestic deposit number: FERM P-20822)] and monoclonal antibody produced by Hypridoma Mouse-Mouse hybridoma 1C10 (hereinafter referred to as “1C 10”).
  • the hybridoma is named “Mouse—Mouse hybridoma 1C10” and is displayed under the Budapest Treaty. Under the Budapest Treaty, Ibaraki Prefecture, Tsukuba Tokuto 1-chome 1 1 Chuo No. 6 (Postal code 30 5—8566), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Office of Patent Biological Depositary: Receipt Number: FERM ABP— 10903 [Receipt Date: 2007 (Heisei 19) August 30, Accession Number for Domestic Deposit: FERM P—20821, Domestic Deposit Date: 2006 (Heisei 18) (Year) February 24].
  • the reactivity of 4E3 or 1C10 against influenza virus was examined by enzyme antibody method using MDCK cells infected with influenza virus. Influenza virus and MDCK cells were incubated for 12 hours in a 96-well microplate well, and MDCK cells were infected with influenza virus. Next, the infected MDCK cells are fixed with ethanol, and the supernatant obtained by culturing the hybridoma producing 4E3 or the supernatant obtained by culturing the hyperidoma producing 1C10 is incubated at room temperature for 30 minutes. Incubated. After incubation, the plate was washed with PBS, and then reacted with peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody for 30 minutes.
  • influenza A viruses isolated from humans 14 types
  • Influenza A viruses isolated from birds 16 types
  • Influenza B viruses 5 types were used.
  • the immunochromatographic test device 1 (hereinafter referred to as the test device) is used according to the following method. ) was produced.
  • the chromatographic membrane carrier 5 after drying was immersed in a blocking solution (phosphate buffer solution (pH 7.0) containing BSA) for blocking. Thereafter, the membrane was washed with a washing solution (phosphate buffer solution (pH 7.0) containing SDS) and dried at 40 ° C. for 120 minutes to obtain a membrane carrier 5 for chromatography.
  • a blocking solution phosphate buffer solution (pH 7.0) containing BSA
  • phosphate buffer solution (pH 7.0) containing SDS phosphate buffer solution (pH 7.0) containing SDS
  • 4E3 is sensitized to blue colored polystyrene latex particles (particle size 0 ⁇ 3 m) and suspended in a dispersion buffer solution (phosphate buffer solution ( ⁇ 7 ⁇ 0) containing BSA and sucrose). 4-3 sensitized latex particles were prepared. The antibody concentration at the time of sensitization was such that 1 mL of latex particles was 200 Hg IgG in 1 mL of latex particles. The 4E3 sensitized latex particles were added to a glass fiber pad and then dried with a vacuum dryer to obtain a label holding member 4.
  • phosphate buffer solution ⁇ 7 ⁇ 0
  • sucrose phosphate buffer solution
  • Example 1 Using the chromatographic membrane carrier 5 and the label holding member 4, the test device of Example 1 was obtained by a conventional method.
  • influenza virus human influenza virus isolated from humans was examined.
  • HA titer is a unit of influenza assay (hemagglutination method) that uses the hemagglutination ability of influenza and shows the activity of infectious viruses.
  • FFU focus forming unit
  • phosphate buffer solution containing sample extraction reagent (0 ⁇ 3w / v% NP-40 (polyoxyethylene (9) octyl phenyl ether) ⁇ 7 ⁇ 3) 150 L of virus solution was added and mixed to prepare a sample.
  • test device was prepared in the same manner as in Example 1 except that 1C10 was used as the first antibody and the second antibody (Comparative Example 1).
  • a test device was prepared in the same manner as in Example 1 except that 4-3 were used as the first antibody and 1C10 was used as the second antibody (Comparative Example 2).
  • Example 2 From Table 2, it was found that the test devices of Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 did not react at all with influenza virus (human influenza virus) isolated from humans! In contrast, Comparative Example 3, which is a commercially available human influenza test kit, showed reactivity against all human influenza viruses tested.
  • influenza virus human influenza virus
  • Test Example 2 Next, it was examined whether the test devices of Example 1 and Comparative Example;! To 3 react with influenza virus (avian influenza virus) isolated from birds.
  • influenza virus avian influenza virus
  • Table 3 shows the virus concentrations in each virus solution. It should be noted that the HA value or FFU in Table 3 is indicated as (1)! /, Indicating that the HA value or FFU has not been measured! /.
  • test device of Example 1 showed reactivity to all tested avian influenza viruses (H3 ⁇ ; 15 subtypes).
  • the test devices of Comparative Examples 1 and 2 reacted only with the avian influenza virus H5 subtype.
  • the test device of Comparative Example 3 (commercially available human influenza test kit) is used for all tested avian influenza viruses. Responsive to Nores.
  • ⁇ 2 can detect only avian influenza virus H5 subtype, whereas 4E3 used in the test device of Example 1 reacts with multiple subtypes of avian influenza virus. , Multiple subtypes of avian influenza virus can be detected. That is, by using the test device of Example 1, it is possible to detect multiple subtypes of avian influenza virus.
  • Example 1 Using the test devices of Example 1 and Comparative Examples;! To 2, a dilution test was conducted with two types of avian influenza virus H5 subtype, and the sensitivity of each test device was examined.
  • avian influenza viruses H5N2 A / Duck / HK / 342/78
  • H5N9 A / Turkey / Ontario / 7732/66
  • the virus solution for avian influenza virus H5N2 was prepared by first preparing a virus solution with a virus concentration of 1 X 10 7 FFU / mL, and further diluting this virus solution as shown in Table 4 below.
  • a virus solution having a concentration was prepared.
  • the virus solution for Trifluenza virus H5N9 was prepared by first preparing a virus solution with a virus concentration of 1 ⁇ 375 ⁇ 10 6 FFU / mL, and further diluting it to obtain the virus solution listed in Table 5 below. A virus solution having a concentration was prepared. A test was conducted in the same manner as in Test Example 1 using this virus solution. The results of avian influenza virus H5N2 are shown in Table 4, and the results of avian influenza virus H5N9 are shown in Table 5.
  • Example 1 using 4E3 as the first and second antibodies is compared to the test devices of Comparative Examples 1 and 2 using 1C10 as the second antibody.
  • the triinfluenza virus H5 subtype can be detected with high sensitivity.
  • Example 1 Using the test device of Example 1, reactivity to avian influenza virus infecting humans was examined.
  • throat swabs were collected from humans infected with the 10 types of avian influenza viruses shown in Table 6 below, inoculated into MDCK cells, and cultured for 4-5 days. After culturing, the supernatant of the obtained culture broth was collected. Using this as a virus solution, the test was conducted in the same manner as in Test Example 1 above. Further, as a comparative example, the above comparative example 3 was used, and the evaluation was performed according to the manual attached to the kit. These results are also shown in Table 6.
  • test device of Example 1 can detect avian influenza virus infecting humans.
  • Example 2 a test device of Example 2 was prepared in which the ability to use two or more types of anti-influenza antibodies as the first antibody should be examined.
  • Example 2 As the first antibody, 4E3 and 1C10 were used in equal amounts, and the test device of Example 2 was obtained in the same manner as in Example 1 above.
  • Example 2 Using the test devices of Example 1 and Example 2, an avian influenza virus different from Test Example 3 was used. The sensitivity of the test device to Nores H5 subtype was examined.
  • avian influenza virus H5N3 (A / Duck / HK / 820/80) was used and diluted with physiological saline to a virus concentration of 3.4 X 10 6 FFU / mL.
  • a similar test was conducted. The results are shown in Table 8. Each band was judged according to the level of blue coloration, classified into five levels: “-”, “W”, “1+”, “2+”, and “3+”. “One”, “W”, “1 +”, “2 +” and “3 +” are based on the measurement values obtained when the bands that appeared were measured with the TRS3000 Membrane Strip Reader (BioDot). The criteria described in Table 7 were set.
  • the ROD value in the table is the value obtained by subtracting the measured value of nitrocellulose membrane as the background from the measured value of the band. By the way, it is “W”, “1 +”, “2 +” and “3 +” that the blue band can be confirmed with the naked eye.
  • Example 1 From Table 8, it was found that the test devices of Example 1 and Example 2 can detect avian influenza viruses with the same sensitivity. This is the power of 4E3 as the first antibody The ability to detect avian influenza virus with a test device that is used in combination with other anti-influenza virus antibodies reactive to avian influenza virus and uses 4E3 as the second antibody. RU The sensitivity of the test device of Example 1 is slightly better.
  • Antigens recognized by the monoclonal antibodies 4E3 and 1C10 used in the above test examples were identified by immunoprecipitation.
  • influenza virus H3 subtype A / Kitakyusyu / 159/93 (H3N2) and influenza virus H5 subtype A / Turkey / Ontario / 7 732/66 (H5N9) were used.
  • 4E3 and 1C10, 7304 which recognizes influenza A virus nucleoprotein (NP), and 41027, an antibody that recognizes influenza B virus nucleoprotein (NP) Capricon) and F49 (Takara Bio Inc.), an antibody that recognizes hemagglutinin (HA) of influenza A virus H3 subtype.
  • MCDK cells confluent in 6 wells were infected with the virus for 1 hour. The supernatant was removed, and 1 mL of a separation medium was added, followed by overnight culture. The cells were collected in a tube with a scraper, centrifuged, and washed with Cold PBS ( ⁇ ). The lysate was added and sonicated to disrupt the cells, and stored as it was on dry ice.
  • the viral protein is first biotinylated.
  • the biotinylated virus protein, antibody and protein A-sepharose are mixed to form a complex of the antibody and biotinylated virus protein that specifically binds to the antibody on protein A-sepharose.
  • Electrophoresis 50 L of electrophoresis buffer was added to the Sepharose and boiled at 100 ° C for 3 minutes. Samples of 10 L each were applied to a gradient gel (5-20%) and electrophoresed (SDS-PAGE) at 30 mA for 90 minutes. The protein in the gel after electrophoresis was transferred to a PVDF membrane at 250 mA for 2 hours. Thereafter, the membrane was blocked with 5% skim milk 'PBS (—) and the membrane was washed three times. The membrane was washed by reacting with 1: 1000 diluted streptavidin POD solution for 30 minutes and detected with 4-clonal naphthol solution. Figure 2 shows the results.
  • Figure 2 force, et al. 4E3 is the same position as the band that appeared in the band force 7304 (antibody that recognizes the nucleoprotein (NP) of type A influenza) that appeared in the 4E3 H5 virus, It was confirmed that the antibody recognizes the nuclear protein (NP) of avian influenza virus (H5N9).
  • 1C10 is an antibody that recognizes hemagglutinin (HA) of avian influenza virus (H5 N9) because it is in the same position as the band that appeared in the F5 band force that appeared in the H5 virus of 1C10. It was.
  • Human influenza virus was infected with MDCK cells using a human influenza virus strain (Puerto Rico / 8/34) obtained from Osaka Prefectural Institute of Public Health, and the infected MDCK cells were cultured.
  • Virus nucleic acids were extracted from the obtained culture supernatant using QIAGEN Magtration system 6GC (QIAGEN) and EZ Virus Mini Kit reagent (QIAGEN). Then, by the RT-PCR method using the following primers (SEQ ID NOs: 1 and 2), a DNA fragment containing the extracted viral nucleic acid strength and the region encoding human influenza virus NP was amplified.
  • Each of the obtained DNA fragments (including the restriction enzyme cleavage site and the sequence encoding 6 histidine residues) was incorporated into the Kpnl / EcoRI site of the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).
  • Type human influenza NP expression vector and wild type avian influenza NP expression vector were prepared.
  • the wild-type human influenza NP expression vector was converted into restriction enzymes (Kpnl and BamHI). ), And after electrophoresis of the resulting fragment, a DNA fragment encoding 159 amino acids on the N-terminal side of human influenza NP, as well as a fragment encoding 339 amino acids on the C-terminal side, six histidine residues, and a vector Each was purified using QIAquick Gel Extraction Kit (QI AGEN).
  • the wild-type human influenza NP expression vector was cleaved with restriction enzymes (Kpnl and ApaLI), and in the same manner as described above, a DNA fragment encoding the 45 amino acids on the N-terminal side of human influenza NP, and C A fragment encoding the vector with the terminal 453 amino acids, 6 histidine residues and the vector was purified.
  • restriction enzymes Kpnl and ApaLI
  • the wild type avian influenza NP expression vector was cleaved with restriction enzymes (Kpnl and ApaLI), and in the same manner as described above, a DNA fragment encoding 45 amino acids on the N-terminal side of avian influenza NP, 453 amino acids on the C-terminal side and 6 amino acids. The fragment encoding the histidine residue and the vector was purified.
  • a DNA fragment encoding 45 amino acids on the N-terminal side of avian influenza NP, as well as 453 amino acids and 6 histidine residues on the C-terminal side of human influenza NP A chimeric NP3 expression vector was constructed by ligating the fragment encoding the vector.
  • a DNA fragment encoding 45 amino acids on the N-terminal side of human influenza NP and a fragment encoding 453 amino acids on the C-terminal side of avian influenza NP, 6 histidine residues and a vector chimera
  • An NP4 expression vector was constructed.
  • the wild-type human influenza NP expression vector, the wild-type trifluenza NP expression vector, the chimeric NP1 expression vector, the chimeric NP2 expression vector, the chimeric NP3 expression vector and the chimeric NP4 expression vector prepared as described above are EndoFree Plas, respectively. Purification was performed using mid Maxi Kit (QIAGEN). Then, using Superfect transfection reagent (QIAGEN), each purified expression vector is introduced into COS 7 cells derived from monkey kidney and cultured in a 5% CO incubator for 48 hours.
  • NP was expressed.
  • the recombinant NP obtained from the wild-type human influenza NP expression vector was designated as r Human Flu NP (SEQ ID NO: 9)
  • the recombinant NP obtained from the wild-type trifluenza NP expression vector was designated as r Avian Flu NP.
  • Figure 3 shows r Human Flu NP (SEQ ID NO: 9), r Avian Flu NP (SEQ ID NO: 10), r-Chl Flu NP (SEQ ID NO: 11), r— Ch2 Flu NP (SEQ ID NO: 12), r — Schematic representation of the amino acid sequences of —Ch3 Flu NP (SEQ ID NO: 13) and r—Ch4 Flu NP (SEQ ID NO: 14).
  • each amino acid sequence IJ has a total length of 504 residues, and the 6 amino acids at the C-terminal (ie, amino acid sequence from position 499 to position 504) are histidines.
  • the first to 498th amino acid sequences of r-Human Flu NP correspond to the full length (498 residues) of the amino acid sequence of human influenza virus NP.
  • the 1st to 498th amino acid sequence of r-Avian Flu NP corresponds to the full length (498 residues) of the amino acid sequence of avian influenza virusless NP.
  • amino acid sequence Nos. 1 to 159 of r-Chi Flu NP correspond to 159 amino acids on the N-terminal side of avian influenza NP
  • amino acid sequences Nos. 160 to 498 correspond to the C-terminal side of human influenza NP. It corresponds to 339 amino acids.
  • the 1st to 159th amino acid sequence of r-Ch2 Flu NP corresponds to 159 amino acids on the N-terminal side of human influenza NP, and the 160th to 498th amino acid sequences are 339 amino acids on the C-terminal side of Trifluenza NP. It corresponds to.
  • the 1st to 45th amino acid sequence of r-Ch3 Flu NP corresponds to 45 amino acids on the N-terminal side of avian influenza NP, and the 46th to 498th amino acid sequences are 453 amino acids on the C-terminal side of human influenza NP. It corresponds to.
  • the 1st to 45th amino acid sequence of r-Ch4 Flu NP corresponds to 45 amino acids on the N-terminal side of human influenza NP, and the 46th to 498th amino acid sequences are 453 amino acids on the C-terminal side of avian influenza NP. It corresponds to.
  • the r-Human Flu NP and r-Avian Flu NP produced this time, and the following 12 human influenza virus strain NPs and the following 12 avian influenza virus strain NP amino acids
  • the acid sequence is shown in FIGS.
  • Each COS-7 cell expressing the recombinant NP prepared in (1) was detached from the petri dish with Trypsin-EDTA solution (manufactured by Sigma), and each COS-7 cell was washed with PBS. Each COS-7 cell after washing was suspended in an appropriate amount of PBS to prepare a cell suspension. An appropriate amount of the cell suspension was spotted on a slide glass, air-dried and fixed with acetone. The 4E3 antibody solution (PBS containing 10 g / ml 4E3, 1% BSA) was dropped onto the slide glass after fixation with acetone, and COS-7 cells on the slide glass were reacted with 4E3.
  • Trypsin-EDTA solution manufactured by Sigma
  • Each COS-7 cell after washing was suspended in an appropriate amount of PBS to prepare a cell suspension.
  • An appropriate amount of the cell suspension was spotted on a slide glass, air-dried and fixed with acetone.
  • the 4E3 antibody solution PBS containing 10 g / ml 4E
  • FITC-labeled anti-mouse Ig antibody diluted 100-fold with PBS containing 1% BSA was dropped onto a slide glass. Then, the reactivity of 4E3 to each recombinant NP expressed in COS-7 cells was examined by observing a slide glass under a fluorescence microscope.
  • 4E3 does not react with r- Human Flu NP, r- Ch2 Flu NP, and r- Ch3 Flu NP, but reacts with r- Avian Flu NP, r Chi Flu NP, and r- Ch4 Flu NP.
  • 4E3 is the amino acid of avian influenza virus NP.
  • the force S showed reactivity to the nuclear protein containing the 46-position of the noic acid sequence, and the non-reactive nuclear protein showed no reactivity. From this, it can be presumed that 4E3 recognizes and replies to an epitope existing in a specific region (amino acid sequence 46 to 159) on the N-terminal side of avian influenza virus NP.
  • avian influenza virus can be specifically, rapidly and easily detected by distinguishing between human influenza virus and avian influenza virus.

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Description

特異的な迅速診断法
Figure imgf000003_0001
[0001] 本発明は、トリインフルエンザウイルス検出方法及びトリインフルエンザウイルスを検
Figure imgf000003_0002
背景技術
[0002] インフルエンザウイルスは、核タンパク質（NP)と膜タンパク質（M)の抗原性の違!/ヽ
明
により A型、 B型、及び C型に分類される。このうちのインフルエンザ A型ウィルスは、 さらにへマグルチニン (HA)とノイラミニダーゼ（NA)のアミノ酸配列又は抗原性の違
書
いにより、 HAは H；!〜 15の 15種類、 NAは N；!〜 9の 9種類に分類され、その組み合 わせの数の亜型が存在する。この中で、ヒトを宿主としてヒトに感染する亜型は、 HI 〜3、 Nl〜2である。そして、インフルエンザ A型ウィルス（H；!〜 3、 Nl〜2)及びイン フルェンザ B型ウィルス（以下、「ヒトインフルエンザウイルス」ということもある）が、毎 年大流行を引き起こす、いわゆるインフルエンザ（ヒトインフルエンザ）の原因となるも のである。
[0003] インフルエンザ A型ウィルスはヒトだけでなぐ多くの哺乳動物及び鳥類にも感染す る。インフルエンザ A型ウィルスが鳥類に感染して起きる鳥類の感染症が「トリインフ ルェンザ」であり、その原因となるトリインフルエンザウイルスには、 HI〜； 15、 Nl〜9 のすベての亜型が確認されている。トリインフルエンザウイルスの多くは重篤な症状を 示さないが、 H5及び H7亜型のトリインフルエンザウイルスの中には、鳥に感染した 場合に重篤な症状を示すものもある。これらは高病原性トリインフルエンザウイルスと 呼ばれるものであり、ヒトへの感染の可能性が危惧されている。また、 H9亜型のトリイ ンフルェンザウィルスの中には、ウィルスに感染した家禽と接触したヒトへの感染、発 病が報告されている例もあるため、ヒトでの感染の拡大が危惧されている。
[0004] 現在、臨床ではインフルエンザウイルス抗原を迅速に検出するキットを用いてインフ ルェンザの診断が行われている。このような迅速診断キットとしては、酵素ィムノアツ セィ（EIA)、ィムノクロマトグラフ法を原理として用いたものが挙げられ、インフルェン ザ A型ウィルスのみを検出するもの（例えば、特開 2006— 67979号公報参照）、イン フルェンザ A型ウィルスとインフルエンザ B型ウィルスとをまとめて検出するもの、イン フルェンザ A型ウィルスとインフルエンザ B型ウィルスとを別々に検出するものなどが ある。
[0005] しかしながら、特許文献 1の迅速診断キットは、ヒトインフルエンザ A型ウィルスであ るかトリインフルエンザウイルスであるかを区別せず、インフルエンザ A型ウィルスに 属する広範囲のウィルスを検出するものである。従って、ヒトがインフルエンザの徴候 を示した場合、それがトリインフルエンザウイルスによるものなの力、、あるいはヒトインフ ルェンザウィルスによるものであるかを診断することができない。このためトリインフル ェンザウィルスの迅速な診断法の開発が必要とされている。
発明の開示
[0006] 本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、ヒトインフルエンザウイルスと 区別して、トリインフルエンザウイルスを特異的、迅速かつ簡便に検出する方法及び これに用いるィムノクロマトグラフ法用試験具を提供することを目的としている。
[0007] 本発明は上記目的を達成するために次の技術的手段を講じた。
トリインフルエンザウイルス検出方法に係る本発明は、ヒトインフルエンザ A型ウィル ス HI亜型、 H2亜型及び H3亜型並びにヒトインフルエンザ B型ウィルスに反応性を 示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザゥ ィルス抗体を用いて、免疫学的測定法により、試料中のトリインフルエンザウイルスを 検出することを特 ί毁として!/、る。
[0008] 上記トリインフルエンザウイルス検出方法は、前記抗インフルエンザウイルス抗体が 反応性を示すトリインフルエンザウイルス亜型のうち、少なくとも 1つがトリインフルェン ザウィルス Η5亜型、 Η7亜型及び Η9亜型からなる群から選ばれることが好まし!/、。 上記トリインフルエンザウイルス検出方法にお!/、て、前記抗インフルエンザウイルス 抗体が、少なくとも Η3〜； 15亜型のトリインフルエンザウイルスに反応性を示すもので あってもよい。
[0009] 上記トリインフルエンザウイルス検出方法において、前記抗インフルエンザウイルス 抗体として、インフルエンザ Α型ウィルスの核タンパク質に対する抗体を用いることが でき、また、トリインフルエンザウイルスの核タンパク質のアミノ酸配列の N末端側から 第 46位〜第 159位の領域に存在するェピトープを認識する抗体を用いることもでき また、上記トリインフルエンザウイルス検出方法において、前記抗インフルエンザゥ ィルス抗体力 国際寄託の受領番号が FERM ABP— 10904 (国内寄託の受託番 号： FERM P— 20822)であるハイプリドーマにより産生されるモノクローナル抗体 であることが好ましい。
[0010] さらに、上記トリインフルエンザウイルス検出方法は、前記免疫学的測定法が、イン フルェンザウィルスに対する第一及び第二の抗体を用い、標識された前記第一の抗 体と固相に固定された前記第二の抗体とインフルエンザウイルスとを含む複合体を 形成させる工程を含んでおり、且つ少なくとも前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザ
A型ウィルス HI亜型、 H2亜型及び H3亜型並びにヒトインフルエンザ B型ウィルスに 反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗ィンフ ルェンザウィルス抗体であることが好ましレ、。
[0011] 前記第一及び第二の抗体が、ヒトインフルエンザ A型ウィルス HI亜型、 H2亜型及 び H3亜型並びにヒトインフルエンザ B型ウィルスに反応性を示さず、トリインフルェン ザウィルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることが 好ましい。
[0012] 前記免疫学的測定法が、ィムノクロマトグラフ法であることが好ましい。
前記ィムノクロマトグラフ法が、前記第二の抗体が固定されたクロマト用膜担体にお いて、当該第二の抗体と標識された前記第一の抗体とインフルエンザウイルスとを含 む複合体を形成させる工程を含んでおり、且つ前記第二の抗体が、ヒトインフルェン ザ A型ウィルス HI亜型、 H2亜型及び H3亜型並びにヒトインフルエンザ B型ウィルス に反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗イン フルェンザウィルス抗体であることが好ましレ、。
[0013] ィムノクロマトグラフ法用試験具に係る本発明は、インフルエンザウイルスに対する 第一及び第二の抗体を利用して試料中のインフルエンザウイルスを検出するための ィムノクロマトグラフ法用試験具であって、前記試料を添加する試料添加部材と、標 識物質で標識された第一の抗体を担持する標識保持部材と、第二の抗体が固定さ れた判定領域を配置したクロマト用膜担体とを有し、前記第一の抗体が、トリインフノレ ェンザウィルスに反応性を示し、前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザ A型ウィルス HI亜型、 H2亜型及び H3亜型並びにヒトインフルエンザ B型ウィルスに反応性を示 さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイ ノレス抗体であることを特徴としてレ、る。
[0014] 上記ィムノクロマトグラフ法用試験具において、前記標識物質が、不溶性粒状マー カーであることが好ましい。また、その中でも特に、着色合成高分子粒子又はコロイド 状金属粒子であることが好ましレ、。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]本発明の 1つの実施形態に係るィムノクロマトグラフ法用試験具の断面図である
〇
[図 2]モノクローナル抗体 4E3及び 1C10が認識する抗原を特定するための試験結 果を示す図である。
[図 3]r— Human Flu NP、 r— Avian Flu NP、 r— Chi Flu NP、 r— Ch2 F lu NP、 r—Ch3 Flu NP、及び r— Ch4 Flu NPのアミノ酸配列を模式的に示 す図である。
[図 4]r— Human Flu NP及び r— Avian Flu NP、並びに、 12種類のヒトインフ ルェンザウィルス株由来 NP及び 12種類のトリインフルエンザウイルス株由来 NPの アミノ酸配列第 1位から第 50位を示す図である。
[図 5]同じくアミノ酸配列第 51位から第 100位を示す図である。
[図 6]同じくアミノ酸配列第 101位から第 150位を示す図である。
[図 7]同じくアミノ酸配列第 151位から第 200位を示す図である。
[図 8]同じくアミノ酸配列第 201位から第 250位を示す図である。
[図 9]同じくアミノ酸配列第 251位から第 300位を示す図である。
[図 10]同じくアミノ酸配列第 301位から第 350位を示す図である。
[図 11]同じくアミノ酸配列第 351位から第 400位を示す図である。
[図 12]同じくアミノ酸配列第 401位から第 450位を示す図である。 [図 13]同じくアミノ酸配列第 451位から第 504位を示す図である。
[図 14]各遺伝子組換え NPに対する 4E3及び抗 Hisタグ抗体の反応性を比較した図 である。
発明を実施するための最良の形態
[0016] トリインフルエンザウイルス検出方法は、ヒトインフルエンザ A型ウィルス HI亜型、 H 2亜型及び H3亜型並びにヒトインフルエンザ B型ウィルスに反応性を示さず、トリイン フルェンザウィルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体を 用いて、免疫学的測定法により、試料中のトリインフルエンザウイルスを検出する方法 である。
この検出方法によれば、上記のような抗体を用いているので、今まではヒト由来のィ ンフルェンザウィルスであるかトリ由来のインフルエンザウイルスであるかを区別する ことなくインフルエンザ A型ウィルスとしてしか検出できなかったのに比べ、ヒトインフ ルェンザウィルスとトリインフルエンザウイルスとを区別して、複数種の亜型のトリイン フルェンザウィルスを検出することができる。
[0017] トリインフルエンザウイルス検出方法に用いられる抗体は、ヒトインフルエンザ A型ゥ ィルス HI亜型、 H2亜型及び H3亜型並びにヒトインフルエンザ B型ウィルスに反応 性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルェ ンザウィルス抗体である。この抗インフルエンザウイルス抗体は、ヒトインフルエンザゥ ィルス（A型（HI〜3亜型）及び B型）とは反応せず、トリインフルエンザウイルスの複 数の亜型に反応するので、今までヒト由来かトリ由来かを区別することなくインフルェ ンザ A型ゥイノレスを検出してレ、たものを、ヒト由来かトリ由来かを区別してトリ由来のィ ンフルェンザ A型ウィルスを検出することができる。
[0018] 抗インフルエンザウイルス抗体が反応性を示すトリインフルエンザウイルス亜型のう ち、少なくとも 1つがトリインフルエンザウイルス H5亜型、 H7亜型及び H9亜型からな る群力、ら選ばれること力好ましい。トリインフルエンザウイルス H5亜型、 H7亜型又は H9亜型は、過去にヒトへの感染が確認されたことがあるトリインフルエンザウイルスで あり、ヒトでの感染拡大を引き起こす可能性があるからである。
抗インフルエンザウイルス抗体力 少なくとも H3〜； 15亜型のトリインフルエンザウイ ルスに反応性を示すものであってもよい。この場合、トリインフルエンザウイルスが H3 〜； 15亜型のものであれば検出することができる。
抗インフルエンザウイルス抗体力 インフルエンザ A型ウィルスの核タンパク質に対 する抗体であることが好ましい。また、抗インフルエンザウイルス抗体として、トリインフ ルェンザウィルスの核タンパク質のアミノ酸配列の N末端側から第 46位〜第 159位 の領域に存在するェピトープを認識する抗体を用いることも好ましい。
[0019] 抗インフルエンザウイルス抗体の具体例として、ハイプリドーマ Mouse— Mouse h ybridoma 4E3により産生されるモノクローナル抗体（以下、「4E3」という）が挙げら れる。
当該ハイブリドーマは、 Mouse— Mouse hybridoma 4E3と命名'表示され、ブ ダペスト条約の下、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1 1 中央第 6 (郵便番号 305 8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受領番 号： FERM ABP— 10904〔受領日： 2007年（平成 19年） 8月 30日、国内寄託の受 託番号： FERM P— 20822、国内寄託曰： 2006年（平成 18年） 2月 24曰〕として寄 託されている。
このハイプリドーマは、マウス骨髄腫細胞由来株とマウスリンパ球との融合細胞であ り、インフルエンザ A型ウィルス H3〜 15亜型の核タンパク質（NP)に結合するモノク ローナル抗体（4E3)を産生する。 4E3は、例えばハイプリドーマ Mouse— Mouse hybridoma 4E3を 10%ゥシ胎児 i'?青、 10mM Lーグノレタミン、 0. 25% NaHC Oを含む RPMI 1640培地（SIGMA R6504)中、 37°C、 5% COにて培養し、
3 2 産生された 4E3を公知の方法にて回収及び精製することにより、製造することができ このモノクローナル抗体は、そのフラグメント、及びそのキメラ抗体及びヒト化抗体等 の改変抗体並びに変異抗体を含む。これらのフラグメント、改変抗体又は変異抗体も また、元の抗体と同様のトリインフルエンザウイルスの複数の亜型に対する特異性を 有するものである。これらは、当業者により既知の手段又は方法により製造され得る。
[0020] 免疫学的測定法 (ィムノアツセィ）は、抗体との結合能力を利用して物質を定量的に 測定する方法であり、例えば、ラジオィムノアッセィ (RIA)法、免疫放射定量測定 (IR MA)法、酵素ィムノアッセィ (EIA)法、酵素免疫測定 (ELISA)法、均一系酵素免 疫測定法、蛍光ィムノアッセィ (FIA)法、免疫蛍光分析 (IFMA)法、蛍光偏光法、 化学発光ィムノアッセィ (CLIA)法、化学発光酵素ィムノアッセィ (CLEIA)法、ィムノ タトロマトグラフ法を用いることができる。免疫学的測定法において用いられる上記抗 インフルエンザウイルス抗体は、 1種類でも 2種類以上であってもよ!/、。
[0021] 試料は、インフルエンザウイルスが含まれる可能性があるものであればよぐ例えば 被疑患者からの涙、 目脂、喀痰、唾液及び大便等の生体試料を、生理食塩水、リン 酸緩衝液等の溶媒と混合したもの、被疑患者の患部（鼻腔、咽頭等）を清拭したガー ゼ、スヮブ等から前記の溶媒で洗浄又は抽出したもの、又は被疑患者の患部の前記 溶媒による洗浄液であってもよレ、。
[0022] 免疫学的測定法の中でも、インフルエンザウイルスに対する第一及び第二の抗体 を用い、標識された前記第一の抗体と固相に固定された前記第二の抗体とインフノレ ェンザウィルスとを含む複合体を形成させる工程を含む、サンドイッチ法を測定原理 とする免疫学的測定法を用いることが好ましレ、。
ここで、少なくとも前記第二の抗体として、上述のヒトインフルエンザ A型ウィルス HI 亜型、 H2亜型及び H3亜型並びにヒトインフルエンザ B型ウィルスに反応性を示さず 、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス 抗体が使用される。第一の抗体とトリインフルエンザウイルス（抗原）と第二の抗体とで いわゆるサンドイッチ構造を構築させることにより、試料中のトリインフルエンザウイノレ スを高感度で測定することができるからである。
前記第一及び第二の抗体力 S、前記抗インフルエンザウイルス抗体であることが好ま しレ、。第一及び第二の抗体の両方に前記抗インフルエンザウイルス抗体を使用する ことにより、感度及び特異性が上がり、検出精度が向上する。
[0023] サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法には、 IRMA法、 ELISA法、 IF MA法、ィムノクロマトグラフ法等が含まれる。
第一の抗体に結合させる標識物質としては、放射性同位元素 (125i、 14c、 32P等）、 酵素（ /3—ガラクトシターゼ、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光物 質 (フルォレセイン誘導体、ローダミン誘導体等）、不溶性粒状マーカー等が挙げら れる。
第二の抗体を固定する固相の素材又は形状は、測定法に応じて適宜選択される。 固相の素材としては、例えば、ポリ塩化ビュル、ポリフッ化ビニリデン（PVDF)、ポリス チレン、スチレンンージビュルベンゼン共重合体、スチレンン一無水マレイン酸共重 合体、ナイロン、ポリビュルアルコール、ポリアクリノレアミド、ポリアタリロニトリノレ、ポリプ ロピレン等の合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体、ァガロースゲル、セル口 ース等の多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーン等の無機高分子化合物が挙げられ る。これらは、さらにアミノ基、アミノアシル基、カルキシル基、ァシル基、水酸基、ニト 口基等の官能基が導入されたものであってもよい。固相の形状としては、例えば、マ イクロタイタ一プレート（ELISAプレート）、ディスク等の平板状、ビーズ等の粒子状、 試験管、チューブ等の管状、繊維状、膜状にすること力 Sできる。
サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法の中では、操作が簡便で、特別 な装置が不要であり、迅速に測定を行うことができることから、ィムノクトマトグラフ法が 好ましい。
前記ィムノクロマトグラフ法は、前記第二の抗体が固定されたクロマト用膜担体にお いて、当該第二の抗体と標識された前記第一の抗体とインフルエンザウイルスとを含 む複合体を形成させる工程を含んでおり、且つ前記第二の抗体が、ヒトインフルェン ザ A型ウィルス HI亜型、 H2亜型及び H3亜型並びにヒトインフルエンザ B型ウィルス に反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗イン フルェンザウィルス抗体であることが好ましい。この場合、クロマト用膜担体において
、第一抗体と抗原と第二抗体との複合体 (サンドイッチ構造)が形成されるため、第一 抗体の標識を認識することによりトリインフルエンザウイルスを検出することができる。 ィムノクロマトグラフ法においても、上述の標識物質を使用することができる力 その 中でも色を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できることから、不溶性粒 状マーカーが好ましく用いられる。不溶性粒状マーカーは、ィムノクロマトグラフ法で 標識物質として使用されている粒子のうち、それ自身が色を呈する粒子のことであり、 例えば、金コロイド、白金コロイド等のコロイド状金属粒子、顔料等で着色されたポリス チレンラテックス等の合成高分子粒子 (着色合成高分子粒子）、重合染色粒子等が 挙げられる。
[0025] 図 1は、本発明の 1つの実施形態に係るィムノクロマトグラフ法用試験具の断面図で ある。このィムノクロマトグラフ法用試験具 1は、表面に粘着層を有するプラスチック板 力、らなる基材 2上に、レーヨンの不織布からなる試料添加部材 3と、ガラス繊維の不織 布からなる標識保持部材 4と、ニトロセルロースの多孔体からなるクロマト用膜担体 5と 、セルロースの不織布からなる吸収部材 6とを備える。
[0026] 基材 2は、試料添加部材 3や標識保持部材 4等の上記部材を適切に配置するため のものであり、プラスチック以外にも紙、ガラス等の材質のものを用いることができる。 試料添加部材 3には試料が添加される。試料としては上記免疫学的測定法で用い られる試料と同様のものを使用することができる力 S、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液又は咽 頭拭い液が好ましい。試料は、緩衝液等の適当な溶媒で希釈して添加してもよい。 試料添加部材 3としては、レーヨンの不織布以外にも、例えば、多孔質ポリエチレン、 多孔質ポリプロピレン等の多孔質合成樹脂のシート又はフィルム、濾紙、綿布等のセ ルロース製の紙、織布又は不織布、ガラス繊維の不織布を用いることができる。
[0027] 標識保持部材 4は、試料添加部材 3に接触して配置され、標識物質で標識された 第一の抗体が担持されている。この第一の抗体は、試料中の測定対象と抗原抗体反 応するものであり、ここではトリインフルエンザに反応性を示す抗体が使用される。トリ インフルエンザに反応性を示す抗体であれば、 1種類又は 2種類以上を使用すること 力できる。第一の抗体として、好ましくは 4E3が使用される。また、 4E3と他のトリイン フルェンザに反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体を組み合わせて使用する ことあでさる。
第一の抗体を標識する標識物質としては、上記サンドイッチ法を測定原理とする免 疫学的測定法及びィムノクロマトグラフ法で用いられる標識物質と同様のものを使用 すること力 Sできる。その中でも色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に 判定できることから不溶性粒状マーカーが好ましぐその中でも特に着色合成高分子 粒子又はコロイド状金属粒子が好まし!/、。
当該標識保持部材 4は、標識された第一の抗体の懸濁液をガラス繊維の不織布に 含浸せしめ、これを乾燥させること等によって作製すること力 Sできる。なお、標識保持 部材 4としてガラス繊維の不織布が用いられている力 S、これに限定されるものではなく 、例えば、セルロース類の布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピ レン等の多孔質プラスチック布等も使用することができる。
[0028] クロマト用膜担体 5は、標識保持部材 4と間隔を介して配置され、測定対象と抗原抗 体反応する第二の抗体が固定された判定領域 5Aを有する。第二の抗体は、ヒトイン フルェンザ A型ウィルス HI亜型、 H2亜型及び H3亜型並びにヒトインフルエンザ B 型ウィルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を 示す抗インフルエンザウイルス抗体であり、好ましくは 4E3である。
クロマト用膜担体 5として、ニトロセルロースの多孔体を用いている力 試料に含まれ る測定対象をクロマト展開可能で、かつ、上記判定領域 5Aを形成する第二の抗体を 固定可能なものであればいかなるものであってもよぐ他のセルロース（例えば、セル ロースアセテート）の膜、ナイロン (例えば、カルボキシル基、アルキル基等を置換基 として有してもよいァミノ基が導入された修飾ナイロン）の膜、ポリフッ化ビニリデン (P VDF)膜等を使用することもできる。
吸収部材 6は、クロマト用膜担体 5と接触するように配置されており、過剰試料を吸 収するためのものである。吸収部材 6は、液体を速やかに吸収し、保持できる材質の ものであればよぐ綿布、濾紙、ポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラス チック不織布等を使用することができる。そして、試料添加部材 3の一部及び吸収部 材 6の表面は、図 1に示されるように透明シート 7で覆われている。
[0029] 本発明のィムノクロマトグラフ法用試験具 1は、例えば以下のように作製することが できる。まず、クロマト用膜担体 5を基材 2の中程に貼着し、当該クロマト用膜担体 5の クロマト展開の開始点側（すなわち、図 1の左側、以下「上流側」と!/、う）の末端と接触 しないように間隔をあけて標識保持部材 4を基材 2の上流側に貼着する。そして、試 料添加部材 3の上流側部分を基材 2の最上流側部分に貼着し、それと同時に当該試 料添加部材 3のクロマト展開の終了点側（すなわち、図 1の右側、以下「下流側」とい う）部分を標識保持部材 4及びクロマト用膜担体 5の上流側部分の上面に載置すると ともに、標識保持部材 4とクロマト用膜担体 5との間にある基材 2に貼着する。また、ク 口マト用膜担体 5の下流側部分の上面に吸収部材 6の上流側部分を載置するととも に、当該吸収部材 6の下流側部分を基材 2の最下流側部分に貼着する。そして、試 料添加部材 3の下流側部分及び吸収部材 6の表面を透明シート 7で覆う。
[0030] 力べして、試料を必要に応じて適当な溶媒と混合してクロマト展開可能な混合液とし 、当該混合液に前記ィムノクロマトグラフ法用試験具 1の上流 (試料添加部材 3)側を 浸すと、当該混合液は、試料添加部材 3を通過して標識保持部材 4において、標識 された第一の抗体と混合される。
その際、前記混合液中にトリインフルエンザウイルス (抗原）が存在すれば、抗原抗 体反応により標識保持部材 4と第一の抗体とが結合して複合体が形成される。
この複合体は、クロマト用膜担体 5中をクロマト展開されて判定領域 5Aに到達し、そ こに固定された第二の抗体と抗原抗体反応して捕捉される。
このとき、標識物質として青色ラテックス粒子等の着色合成高分子粒子が使用され ていれば、当該粒子の集積により判定領域 5Aが青色に着色するので、直ちにトリイ ンフルェンザウィルスの存在を目視により確認すること力 Sできる。
このように、このィムノクロマトグラフ法用試験具 1を使用すれば、ヒトインフルエンザ ウィルス（A型（HI〜3亜型）及び B型）とは反応せず、トリインフルエンザウイルスの 複数の亜型に反応する抗インフルエンザウイルス抗体が用いられているので、ヒトが インフルエンザに感染した場合、その原因となるインフルエンザウイルスがトリ由来の ものであるか否かを確認することができる。
[0031] なお、クロマト用膜担体 5は、判定領域を 1つだけでなく 2つ以上備えることも可能で ある。また、クロマト用膜担体 5は、対照部を備えていてもよい。対照部を備える場合、 標識保持部材 4に、例えば、赤色ラテックス粒子で標識されたアビジンを保持し、クロ マト用膜担体 5の対照部に、アビジンと特異的に結合するビォチンを固定すればょレ、 。また、アビジンとビォチンの組み合わせの代わりに、例えば、 2, 4—ジニトロフエノー ル (DNP)等のハプテンとそのハプテンを認識する抗体とを組み合わせて使用するこ とができる。このとき、ハプテンとしては、測定に使用する試料中に存在しないハプテ ンを使用することが好ましい。
[0032] また、本発明のトリインフスェンザウィルス検出方法に用いられる抗インフルエンザ ウィルス抗体が反応性を示す亜型は、 HI 5亜型までに限定されるわけではなぐ現 在インフルエンザ A型ウィルスの亜型として確認されている HI 6亜型、さらには将来 確認されるであろう HI 7以降の亜型についても含まれる。
実施例
以下の実施例、比較例及び試験例により本発明をさらに具体的に説明するが、本 発明はこれらに限定されるものではない。
実施例及び比較例のィムノクロマトグラフ用試験具に使用する抗体は、先に説明し たハイブリドーマ〔独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにお ける国際寄託の受領番号： FERM ABP— 10904 (国内寄託の受託番号： FERM P— 20822)〕により産生されるモノクローナル抗体 4E3、およびハイプリドーマ Mo use -Mouse hybridoma 1C10により産生されるモノクローナル抗体（以下、「1C 10」という）である。
当該ハイブリドーマは、 Mouse— Mouse hybridoma 1C10と命名'表示され、 ブダペスト条約の下、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1 1 中央第 6 (郵便番号 30 5— 8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受領 番号： FERM ABP— 10903〔受領日： 2007年（平成 19年） 8月 30日、国内寄託の 受託番号： FERM P— 20821、国内寄託日： 2006年（平成 18年） 2月 24日〕として 寄託されている。
ここで、インフルエンザウイルスが感染した MDCK細胞を用いて、酵素抗体法によ りインフルエンザウイルスに対する 4E3又は 1 C 10の反応性を調べた。 96ウェルマィ クロプレートのゥエルにおいてインフルエンザウイルスと MDCK細胞を 12時間インキ ュベーシヨンし、 MDCK細胞にインフルエンザウイルスを感染させた。次に、感染し た MDCK細胞をエタノールで固定し、 4E3を生産するハイブリドーマを培養して得ら れる上清又は 1C10を生産するハイプリドーマを培養して得られる上清と 30分間室 温にてインキュベーションした。インキュベーション後、 PBSで洗浄し、次にペルォキ シダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を 30分間反応させた。反応後、 PBSで洗 浄し、ジァミノベンチジンを添加して抗マウス免疫グロブリン抗体を視覚化した。この 方法では、 MDCK細胞に感染させたインフルエンザウイルスと 4E3又は 1 C 10の抗 体とが結合した場合には抗マウス免疫グロブリン抗体の標識が検出されるが、結合し な力 た場合には標識が検出されない。なお、インフルエンザウイルスとしては、表 1 に示したようにヒトから分離したインフルエンザ A型ウィルス（14種類） トリから分離し たインフルエンザ A型ウィルス（16種類） インフルエンザ B型ウィルス（5種類）を使
^¾し 7
その結果を表 1に示す。表 1において、 MDCK細胞に感染させたインフルエンザゥ ィルスと抗体との結合が認められたものを（+ )、結合が認められな力 たものを（一） とした。
[表 1]
Figure imgf000016_0001
ZL0L90/L00ZdT/13d ム9蘭 OOZ OAV [0035] 表 1より、 4E3はトリから分離されたインフルエンザ A型ウィルス H3〜； 15亜型に反応 性を示すことが確認された。また、 1C10はトリから分離されたインフルエンザ A型ウイ ルス H5亜型のみに反応性を示すことが確認された。
[0036] 実施例 1
標識物質で標識される第一の抗体及びクロマト用膜担体 5に固定される第二の抗 体として上述した 4E3を使用し、以下の方法に従ってィムノクロマトグラフ用試験具 1 (以下、試験具という）を作製した。
まず、図 1に示すように、ニトロセルロースメンブレンからなるクロマト用膜担体 5の判 定領域 5Aに、抗体塗布機（BioDot社）を用いて、リン酸緩衝液（pH7. 0)で 2. Omg /mLの濃度になるように希釈した 4E3を塗布し、 50°Cで 30分間乾燥させた。
乾燥後のクロマト用膜担体 5をブロッキング液 (BSAを含有するリン酸緩衝液 (pH7 . 0) )に浸漬し、ブロッキングを行った。その後、洗浄液（SDSを含有するリン酸緩衝 液 (pH7. 0) )で洗浄し、 40°Cで 120分間乾燥させ、クロマト用膜担体 5を得た。
[0037] 次に、 4E3を青色着色ポリスチレンラテックス粒子（粒径 0· 3 m)に感作し、分散 用緩衝液 (BSA及びシユークロースを含有するリン酸緩衝液 (ρΗ7· 0) )に懸濁し、 4 Ε3感作ラテックス粒子を作製した。感作する際の抗体の濃度は、 1 %ラテックス粒子 lmLに 200 H g IgGとなる濃度であった。この 4E3感作ラテックス粒子を、ガラス繊 維製パッドに添加後、真空乾燥機で乾燥させ、標識保持部材 4を得た。
そして、このクロマト用膜担体 5及び標識保持部材 4を用いて、常法により、実施例 1 の試験具を得た。
[0038] 試験例 1
実施例 1の試験具を用い、ヒトから分離されたインフルエンザウイルス（ヒトインフル ェンザウィルス）に対する反応性を検討した。
(1) 本試験例では、下記の表 2に示した 19種類のヒトインフルエンザウイルスを鶏卵 培養し、得られたウィルスを生理食塩水で希釈したものをウィルス液として用いた。ゥ ィルス液中のウィルス濃度は HA価又は FFUで表される。各ウィルス液中のウィルス 濃度は、表 2の通りである。 HA価は、インフルエンザのもつ赤血球凝集能を利用した インフルエンザ定量法（赤血球凝集法）の単位で、感染性のあるウィルスの活性を示 す基準であり、 FFU(focus forming unit)は、細胞に感染したウィルスを免疫染色する ことによって確認できるウィルス感染細胞数から算出されたウィルス数を表す単位で ある。なお、表 2中の HA価又は FFUにおいて（一）と示されているのは、 HA価又は FFUが未測定であることを表して!/、る。
(2) 次に、検体抽出試薬（0· 3w/v% NP— 40 (ポリオキシエチレン（9)オタチル フエニルエーテル）を含むリン酸緩衝液 ρΗ7· 3) 800 ,1 Lに、所定濃度のウィルス液 150 Lを加えて混合し、試料とした。
(3) 上記（2)で調製した試料約 200 μ Lをガラス試験管に滴下し、そこに上記方法 で作製した試験具 1の上流 (試料添加部材 3)側を入れて放置し、約 10分後に判定 領域 5Αにおける呈色を肉眼で判定した。判定は、呈色が認められたものを（+ )、呈 色が認められな力 たものを（一）として評価した。これらの結果を表 2に示す。
[0039] なお、比較例として、第一の抗体及び第二の抗体として上記 1C10を用い、それ以 外は実施例 1と同様にして試験具を作製した（比較例 1)。また、第一の抗体として 4Ε 3、第二の抗体として 1C10を用い、それ以外は実施例 1と同様にして試験具を作製 した（比較例 2)。
また、市販されているヒト用インフルエンザ検査キットであるポクテム インフルェン ザ Α/Β (シスメッタス）を比較例 3とした。比較例；!〜 2につレ、ては上記試験例 1と同 様にして評価を行った。比較例 3については、キットに付属するマニュアルに従って 評価を行った。これらの結果を表 2に併せて示す。
[0040] [表 2]
Figure imgf000019_0001
[0041] 表 2から、実施例 1、比較例 1及び比較例 2の試験具は、ヒトから分離されたインフル ェンザウィルス（ヒトインフルエンザウイルス）とは全く反応しな!/、ことがわかった。これ に対して、市販のヒト用インフルエンザ検査キットである比較例 3は、試験したすべて のヒトインフルエンザウイルスに対して反応性を示した。
[0042] 試験例 2 次に、実施例 1、比較例;!〜 3の試験具が、トリから分離されたインフルエンザウィル ス（トリインフルエンザウイルス）と反応するかを検討した。
本試験例では、下記の表 3に示した 17種類のヒトインフルエンザウイルスを鶏卵培 養し、得られたウィルスを生理食塩水で希釈したものをウィルス液として用いた。各ゥ ィルス液中のウィルス濃度は、表 3の通りである。なお、表 3中の HA価又は FFUに ぉレ、て（一）と示されて!/、るのは、 HA価又は FFUが未測定であることを表して!/、る。
[表 3]
Figure imgf000021_0001
表 3から、実施例 1の試験具は、試験したトリインフルエンザウイルス（H3〜； 15亜型 )すべてに対して反応性を示すことがわかった。これに対して、比較例 1及び 2の試験 具は、トリインフルエンザウイルス H5亜型としか反応しなかった。比較例 3の試験具（ 市販のヒト用インフルエンザ検査キット）は、試験したすべてのトリインフルエンザウイ ノレスに対して反応性を示した。
試験例 1及び試験例 2の結果から、実施例 1及び比較例;!〜 2の試験具は、ヒトイン フルェンザウィルス（A型（HI〜3亜型）及び B型）とは反応せず、トリインフルエンザ ウィルスに反応する抗インフルエンザウイルス抗体（4E3又は 1 C 10)を第二の抗体と して用いて!/、るので、今までの試験具（比較例 3)力 Sヒト由来のインフルエンザウイルス であるかトリ由来のインフルエンザウイルスであるかを区別することなくインフルエンザ A型ウィルスとして検出していたのに対して、ヒト由来かトリ由来かを区別してトリ由来 のインフルエンザ A型ウィルスを検出することができる。さらに、比較例；!〜 2の試験具 ではトリインフルエンザウイルス H5亜型しか検出できないのに対し、実施例 1の試験 具に使用されている 4E3はトリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応するので 、トリインフルエンザウイルスの複数種の亜型を検出することができる。すなわち、実 施例 1の試験具を用いることで、トリインフルエンザウイルスの複数種の亜型を検出す ることが可能になる。
[0045] 試験例 3
実施例 1、比較例;!〜 2の試験具を用い、 2種類のトリインフルエンザウイルス H5亜 型で希釈試験を行い、各試験具の感度を調べた。
本試験例では、トリインフルエンザウイルス H5N2 (A/Duck/HK/342/78) 及び H5N9 (A/Turkey/Ontario/ 7732/66)を生理食塩水で希釈したものを ウィルス液として用いた。具体的には、トリインフルエンザウイルス H5N2のウィルス液 は、まず 1 · 1 X 107FFU/mLのウィルス濃度となるウィルス液を調製し、さらにこれ を段階希釈して下記の表 4に記載のウィルス濃度となるウィルス液を調製した。トリイ ンフルェンザウィルス H5N9のウィルス液は、まず 1 · 375 X 106FFU/mLのウィル ス濃度となるウィルス液を調製し、さらにこれを段階希釈して下記の表 5に記載のウイ ノレス濃度となるウィルス液を調製した。このウィルス液を用いて、上記試験例 1と同様 に試験を行った。トリインフルエンザウイルス H5N2の結果を表 4に、トリインフルェン ザウィルス H5N9の結果を表 5に示す。
[0046] [表 4] //:/ O ί/-0/-90/-00ί1£ ϊ9ίο800ίAV ^
Figure imgf000023_0001
[g¾ [ ^oo]
ZL0L90/L00Zd /lDd ZZ ム9蘭 OOZ OAV
Figure imgf000025_0001
[0048] 表 4及び表 5より、第一及び第二の抗体として 4E3を使用した実施例 1の試験具は 、第二の抗体として 1C10を使用した比較例 1及び 2の試験具に比べて、トリインフル ェンザウィルス H5亜型を感度よく検出できることがわかった。
[0049] 試験例 4
実施例 1の試験具を用レ、、ヒトに感染したトリインフルエンザウイルスに対する反応 性を検討した。
本試験例では、下記の表 6に示した 10種類のトリインフルエンザウイルスに感染し たヒトから咽頭拭い液を採取し、 MDCK細胞に接種して 4〜5日培養した。培養後、 得られた培養液の上清を回収した。これをウィルス液として用い、上記試験例 1と同 様に試験を行った。また、比較例として、上記比較例 3を用い、キットに付属するマ二 ュアルに従って評価を行った。これらの結果を表 6に併せて示す。
[0050] [表 6]
比較例 3
ウィルス株 実施例 1
Flu A Flu B
1. Flu A/H5
+ 一 +
SP/33/04
2. Flu A/H5
十 一 十
SP/83/04
3. Flu A/H5
十 一 十
KAN/353/04
4. Flu A/H5
+ 一 +
KK/494/04
5. Flu A/H5
十 一 十
SP/528/04
6. Flu A/H5
+ 一 +
NKRM/1035/04
7. Flu A/H5
+ 一 +
PCBR/ 1623/04
8. Flu A/H5
十 一 十
PCB/2031/04
9. Flu A/H5
十 一 十
SKT/2964/04
10. Flu A/H5
+ 一 +
TH/878/05
[0051] 表 6より、実施例 1の試験具は、ヒトに感染したトリインフルエンザウイルスを検出する ことができることがわかった。
[0052] 次に、第一の抗体として、 2種類以上の抗インフルエンザ抗体を使用することが可 能である力、を検討すベぐ実施例 2の試験具を作製した。
実施例 2
第一の抗体として、 4E3と 1C10とを等量ずつ使用し、それ以外は上記実施例 1と 同様にして、実施例 2の試験具を得た。
[0053] 試験例 5
実施例 1及び実施例 2の試験具を用い、試験例 3とは異なるトリインフルエンザウイ ノレス H5亜型に対する試験具の感度を調べた。
本試験例では、トリインフルエンザウイルス H5N3 (A/Duck/HK/820/80)を 用い、生理食塩水で希釈してウィルス濃度 3. 4 X 106FFU/mLとした以外は、試験 例 3と同様に試験を行った。その結果を表 8に示す。なお、各バンドは、青色の呈色 度合いに応じて、「―」、「W」、「1 +」、「2 +」及び「3 +」の 5段階に区別して判定した 。 「一」、「W」、「1 +」、「2 +」及び「3 +」は、出現したバンドを、 TRS3000 Membr ane Strip Reader (BioDot社）で測定した場合に得られる測定値に基づいて、表 7に記載の基準で設定した。表中の ROD値とは、バンドの測定値からニトロセルロー スメンプレンの濃淡を測定した値をバックグラウンドとして差し引いた値である。ちなみ に、青色のバンドを肉眼で確認することができるのは、「W」、「1 +」、「2 +」及び「3 + 」である。
[0054] [表 7]
Figure imgf000028_0001
[0055] [表 8]
Figure imgf000028_0002
[0056] 表 8から、実施例 1及び実施例 2の試験具は、同程度の感度でトリインフルエンザゥ ィルスを検出することができることがわかった。このこと力、ら、第一の抗体として 4E3と トリインフルエンザウイルスに反応性を示す他の抗インフルエンザウイルス抗体との組 み合わせで使用し、第二の抗体として 4E3を使用した試験具でも、トリインフルエンザ ウィルスを検出すること力 Sできること力 Sわ力、る。なお、感度は実施例 1の試験具の方が やや良い。
[0057] 試験例 6
免疫沈降法により、上記試験例で使用したモノクローナル抗体 4E3及び 1C10が 認識する抗原を特定した。
ウィルスとして、インフルエンザウイルス H3亜型である A/Kitakyusyu/159/9 3 (H3N2)、及びインフルエンザウイルス H5亜型である A/Turkey/Ontario/7 732/66 (H5N9)を使用した。
抗体として、上記 4E3及び 1C10、インフルエンザ A型ウィルスの核タンパク質（NP )を認識する抗体である 7304 (Medix Biochemica社）、インフルエンザ B型ウィル スの核タンパク質（NP)を認識する抗体である 41027 (Capricon社）、及びインフル ェンザ A型ウィルス H3亜型のへマグルチニン（HA)を認識する抗体である F49 (タカ ラバイオ (株)）を使用した。
[0058] 1. ウィルス感染
6wellにコンフルェントになった MCDK細胞に上記ウィルスを 1時間感染させた。 上清を除去し、分離用培地を lmL加えて一昼夜培養した。スクレーパーで細胞をチ ユーブに回収し、遠心後、 Cold PBS (―)で洗浄した。溶解液を加えてソニケーショ ンして細胞を破砕し、そのままドライアイスで保存した。
2.標識及び免疫沈降
Cellular Labeling and immunoprecipitation kit (Roche Diagnostics社 )を使用し、このキット付属のマニュアルに従って標識及び免疫沈降を行った。ここで は、まずウィルスのタンパク質をビォチン化する。そして、ビォチン化ウィルスタンパク 質、抗体及びプロテイン A—セファロースを混合して、プロテイン A—セファロース上 に抗体と当該抗体に特異的に結合するビォチン化ウィルスタンパク質との複合体を 形成させる。
3.電気泳動 上記セファロースに 50 Lの電気泳動バッファーを添加し、 100°Cで 3分間ボイル した。 10 Lずつサンプルをグラジェントゲル（5— 20%)にアプライし、 30mAで 90 分間電気泳動（SDS— PAGE)した。電気泳動後のゲル中のタンパク質を、 250mA 、 2時間で PVDFメンブレンに転写した。その後、 5%スキムミルク 'PBS (—）でブロッ キングし、メンブレンを 3回洗浄した。 1： 1000希釈したストレプトアビジン POD溶 液で 30分間反応させてメンブレンを洗浄し、 4 クロ口ナフトール液で検出した。その 結果を図 2に示す。
[0059] 図 2力、ら、 4E3の H5ウィルスのところで出現したバンド力 7304 (A型インフルェン ザの核タンパク質 (NP)を認識する抗体）で出現したバンドと同じ位置であることから 、 4E3がトリインフルエンザウイルス（H5N9)の核タンパク質（NP)を認識する抗体で あることが確認された。また、 1C10の H5ウィルスのところで出現したバンド力 F49 で出現したバンドと同じ位置であることから、 1C10がトリインフルエンザウイルス (H5 N9)のへマグルチニン (HA)を認識する抗体であることが確認された。
[0060] 試験例 7
上記試験例で使用したモノクローナル抗体である 4E3が認識するェピトープを特定 することを目的として以下のような実験を行った。
[0061] ( 1 )遺伝子組換え核タンパク質 (NP)の作製
大阪府立公衆衛生研究所から入手したヒトインフルエンザウイルス株（Puerto Ric o/8/34)を用いて、ヒトインフルエンザウイルスを MDCK細胞に感染させ、感染し た MDCK細胞を培養した。得られた培養上清から QIAGEN Magtration syste m 6GC (QIAGEN)及び EZ Virus Mini Kit試薬（QIAGEN)を用いてウィル ス核酸を抽出した。そして、以下のプライマー（配列番号 1及び 2)を用いた RT— PC R法により、抽出したウィルス核酸力、らヒトインフルエンザウイルス NPをコードする領 域を含む DNA断片を増幅した。
フォワードプライマー： 5，- ATGGCGTCCCAAGGCACCAA- 3，（配列番号 1) リバースプライマー： 5 ' -TTAATTGTCGTACTCCTCTGCA-3 ' (配列番号 2) 上記で増幅したヒトインフルエンザウイルス NPをコードする領域を含む DNA断片 に、制限酵素（Kpnl及び EcoRI)により切断される部位及び 6つのヒスチジン残基を コードする配列を付加するために、以下のようなプライマー（配列番号 3及び 4)を用 いて PCRを行った。
フォワードプライマー： 5， - ATGGTACCATGGCGTCCCAAGGCACCAA- 3，（配列 番号 3)
ACTCCTCTGCATT-3' (配列番号 4)
ゆえに、本試験例で得られる遺伝子組換え NPは C末端に 6個のヒスチジン残基が 付加される。
[0062] 大阪府立公衆衛生研究所から入手したトリインフルエンザウイルス株（H5N9/On tario/7732/1966)感染細胞を培養し、得られた培養上清から上記と同様の方 法でウィルス核酸を抽出した。そして、以下のプライマー（配列番号 5及び 6)を用い た RT— PCR法により、抽出したウィルス核酸からトリインフルエンザウイルス NPをコ ードする領域を含む DNA断片を増幅した。
フォワードプライマー： 5，- ATGGCGTCTCAAGGCACCAAAC-3' (配列番号 5) リバースプライマー： 5， - TTAATTGTCATATTCCTCTGCATTG- 3，（配列番号 6) 上記で増幅したトリインフルエンザウイルス NPをコードする領域を含む DNA断片 に、制限酵素（Kpnl及び EcoRI)により切断される部位及び 6つのヒスチジン残基を コードする配列を付加するために、以下のようなプライマー（配列番号 7及び 8)を用 いて PCRを行った。
フォワードプライマー： 5，- ATGGTACCATGGCGTCTCAAGGCACCAAAC- 3，（配 列番号 7)
ATTCCTCTGCATTGTC-3 ' (酉己歹 IJ番号 8)
得られた各 DNA断片（制限酵素切断部位及び 6つのヒスチジン残基をコードする 配列を含む）を、真核細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+ ) (Invitrogen)の Kpnl /EcoRI部位に組込み、野生型ヒトインフルエンザ NP発現ベクター及び野生型トリ インフルエンザ NP発現ベクターを作製した。
[0063] 次に、野生型ヒトインフルエンザ NP発現ベクターを制限酵素（Kpnlおよび BamHI )で切断し、得られた断片を電気泳動した後、ヒトインフルエンザ NPの N末端側 159 アミノ酸をコードする DNA断片、並びに、 C末端側 339アミノ酸と 6つのヒスチジン残 基とベクターとをコードする断片をそれぞれ QIAquick Gel Extraction Kit (QI AGEN)を用いて精製した。
同様にして、野生型トリインフルエンザ NP発現ベクターを制限酵素（Kpnlおよび B amHI)処理し、得られた断片を電気泳動した後、トリインフルエンザ NPの N末端側 1 59アミノ酸をコードする DNA断片、並びに、 C末端側 339アミノ酸と 6つのヒスチジン 残基とベクターとをコードする断片をそれぞれ精製した。
[0064] DNA Ligation kit (タカラバイオ）を用いて、トリインフルエンザ NPの N末端側 1 59アミノ酸をコードする DNA断片、並びに、ヒトインフルエンザ NPの C末端側 339ァ ミノ酸と 6つのヒスチジン残基とベクターとをコードする断片をライゲーシヨンすることに より、キメラ NP1の発現ベクターを構築した。
同様にして、ヒトインフルエンザ NPの N末端側 159アミノ酸をコードする DNA断片 、並びに、トリインフルエンザ NPの C末端側 339アミノ酸と 6つのヒスチジン残基とベタ ターとをコードする断片をライゲーシヨンすることにより、キメラ NP2の発現ベクターを 構築した。
[0065] 次に、野生型ヒトインフルエンザ NP発現ベクターを制限酵素（Kpnlおよび ApaLI) で切断し、上記と同様にして、ヒトインフルエンザ NPの N末端側 45アミノ酸をコードす る DNA断片、並びに、 C末端側 453アミノ酸と 6つのヒスチジン残基とベクターをコー ドする断片を精製した。
さらに、野生型トリインフルエンザ NP発現ベクターを制限酵素（Kpnlおよび ApaLI )で切断し、上記と同様にして、トリインフルエンザ NPの N末端側 45アミノ酸をコード する DNA断片と C末端側 453アミノ酸と 6つのヒスチジン残基とベクターをコードする 断片を精製した。
[0066] DNA Ligation kit (タカラバイオ）を用いて、トリインフルエンザ NPの N末端側 4 5アミノ酸をコードする DNA断片、並びに、ヒトインフルエンザ NPの C末端側 453アミ ノ酸と 6つのヒスチジン残基とベクターをコードする断片をライゲーシヨンすることにより 、キメラ NP3の発現ベクターを構築した。 同様にして、ヒトインフルエンザ NPの N末端側 45アミノ酸をコードする DNA断片、 並びに、トリインフルエンザ NPの C末端側 453アミノ酸と 6つのヒスチジン残基とベタ ターをコードする断片をライゲーシヨンすることにより、キメラ NP4の発現ベクターを構 築した。
[0067] 上記のようにして作製した野生型ヒトインフルエンザ NP発現ベクター、野生型トリイ ンフルェンザ NP発現ベクター、キメラ NP1発現ベクター、キメラ NP2発現ベクター、 キメラ NP3発現ベクター及びキメラ NP4発現ベクターは、それぞれ EndoFree Plas mid Maxi Kit (QIAGEN)を用いて精製した。そして、 Superfect transfection reagent (QIAGEN)を用いて、精製後の各発現ベクターをサル腎臓由来の COS 7細胞に導入し、 5% COインキュベーター内で 48時間培養し、各遺伝子組換え
2
NPを発現させた。このうち、野生型ヒトインフルエンザ NP発現ベクターから得られた 遺伝子組換え NPを r Human Flu NP (配列番号 9)とし、野生型トリインフルェン ザ NP発現ベクターから得られた遺伝子組換え NPを r Avian Flu NP (配列番号 10)とし、キメラ NP1発現ベクターから得られた遺伝子組換え NPを r— Chi Flu N P (配列番号 11)とし、キメラ NP2発現ベクターから得られた遺伝子組換え NPを r C h2 Flu NP (配列番号 12)とし、キメラ NP3発現ベクターから得られた遺伝子組換 え NPを r—Ch3 Flu NP (配列番号 13)とし、キメラ NP4発現ベクター力、ら得られた 遺伝子組換え NPを r Ch4 Flu NP (配列番号 14)とした。
[0068] 図 3は、 r Human Flu NP (配列番号 9)、 r Avian Flu NP (配列番号 10) , r-Chl Flu NP (配列番号 11)、 r— Ch2 Flu NP (配列番号 12)、 r— Ch3 F lu NP (配列番号 13)、及び r— Ch4 Flu NP (配列番号 14)のアミノ酸配列を模 式的に示したものである。図 3で示しているように、何れのアミノ酸配歹 IJも全長 504残 基であり、 C末端のアミノ酸 6残基 (すなわちアミノ酸配列第 499位から第 504位）がヒ スチジンになっている。
[0069] そして、 r— Human Flu NPのアミノ酸配列第 1位から第 498位は、ヒトインフルェ ンザウィルス NPのアミノ酸配列の全長（498残基）に相当する。
r- Avian Flu NPのアミノ酸配列第 1位から第 498位は、トリインフルエンザウイ ノレス NPのアミノ酸配列の全長（498残基）に相当する。 また、 r— Chi Flu NPのアミノ酸配列第 1位から第 159位は、トリインフルエンザ NPの N末端側 159アミノ酸に相当し、アミノ酸配列第 160位から第 498位は、ヒトイン フルェンザ NPの C末端側 339アミノ酸に相当する。
r-Ch2 Flu NP のアミノ酸配列第 1位から第 159位は、ヒトインフルエンザ NP の N末端側 159アミノ酸に相当し、アミノ酸配列第 160位から第 498位は、トリインフ ルェンザ NPの C末端側 339アミノ酸に相当する。
r-Ch3 Flu NP のアミノ酸配列第 1位から第 45位は、トリインフルエンザ NPの N末端側 45アミノ酸に相当し、アミノ酸配列第 46位から第 498位は、ヒトインフルェン ザ NPの C末端側 453アミノ酸に相当する。
r-Ch4 Flu NPのアミノ酸配列第 1位から第 45位は、ヒトインフルエンザ NPの N 末端側 45アミノ酸に相当し、アミノ酸配列第 46位から第 498位は、トリインフルエンザ NPの C末端側 453アミノ酸に相当する。また、参考までに、今回作製した r— Huma n Flu NP及び r— Avian Flu NP、並びに、下記の 12種類のヒトインフルエンザ ウィルス株由来 NP及び下記の 12種類のトリインフルエンザウイルス株由来 NPのアミ ノ酸配列を図 4〜図 13に示す。
ヒトインフルエンザウイルス株：
A/HongKong/ 117/1977 (H1N1)
Figure imgf000034_0001
A/NewYork/ 5/2004 (H3N2)
A/PuertoRico/8/34 (H1N1)
A/Kiev/ 59/ 79 (H1N1)
A/Beijing/353/1989 (H3N2)
A/Brazil/ 11 / 1978 (HI N 1 )
A/Victoria/15681/59 (H2N2)
A/NewCaledonia/20/1999 (HlNl)
A/Panama/2007/1999 (H3N2) [0071] トリインフルエンザウイルス株：
A/Duck/ Australia/341/83 (HI 5N8)
A/gull/Maryland/704/1977 (H13N6)
A/pintail/Alberta/49/2003 (H12N5)
A/duck/England/ 1956 (H11N6)
A/pintailduck/ ALB/584/1984 (H10N6)
A/shorebird/DE/261/2003 (H9N5)
A/turkey/Ontario/6118/1968 (H8N4)
A/chicken/Germany/R28/03 (H7N7)
A/shearwater/ Australia/1972 (H6N5)
A/blackduck/NewYork/184/1988 (H5N2)
[0072] (2)反応性の比較
( 1 )で調製した遺伝子組換え NPを発現する各 COS— 7細胞を Trypsin— EDTA 溶液（Sigma社製）によりシャーレから剥がし、各 COS— 7細胞を PBSで洗浄した。 洗浄後の各 COS— 7細胞を適量の PBS中に懸濁させ、細胞浮遊液を調製した。細 胞浮遊液をスライドグラスに適量スポットし、風乾後アセトンで固定した。アセトン固定 後のスライドグラスに 4E3抗体液（10 g/mlの 4E3、 1 %BSAを含む PBS)を滴下 し、スライドグラス上の COS— 7細胞と 4E3とを反応させた。次に、 1 %BSAを含む P BSで 100倍希釈した FITC標識抗マウス Ig抗体（DAKO)をスライドグラスに滴下し た。そして、蛍光顕微鏡下でスライドグラスを観察することにより、 COS— 7細胞で発 現している各遺伝子組換え NPに対する 4E3の反応性を調べた。
なお、対照として、 4E3の代わりに抗 Hisタグ抗体（PentaHis、 QIAGEN)を用い た。結果を図 14に示す。
[0073] 図 14より、 4E3は、 r— Human Flu NP、 r— Ch2 Flu NP及び r— Ch3 Flu NPに反応せず、 r— Avian Flu NP、 r Chi Flu NP及び r— Ch4 Flu NP に反応することが分かった。すなわち、 4E3は、トリインフルエンザウイルス NPのアミ ノ酸配列 46位〜 159位を含む核タンパク質には反応性を示す力 S、含まない核タンパ ク質には反応性を示さないことが分力、つた。このことから、 4E3がトリインフルエンザゥ ィルス NPの N末端側の特定の領域（アミノ酸配列 46位〜 159位）内に存在するェピ トープを認識してレヽると推定できる。
本発明によれば、ヒトインフルエンザウイルスとトリインフルエンザウイルスとを区別し て、トリインフルエンザウイルスを特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。

Claims

請求の範囲
[1] ヒトインフルエンザ A型ウィルス HI亜型、 H2亜型及び H3亜型並びにヒトインフル ェンザ B型ウィルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反 応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体を用いて、免疫学的測定法により、試料中 のトリインフルエンザウイルスを検出することを特徴とするトリインフルエンザウイルス 検出方法。
[2] 前記抗インフルエンザウイルス抗体が反応性を示すトリインフルエンザウイルス亜型 のうち、少なくとも 1つがトリインフルエンザウイルス H5亜型、 H7亜型及び H9亜型か らなる群から選ばれる請求項 1に記載の方法。
[3] 前記抗インフルエンザウイルス抗体力 少なくとも H3〜； 15亜型のトリインフルェン ザウィルスに反応性を示す請求項 1に記載の方法。
[4] 前記抗インフルエンザウイルス抗体力 インフルエンザ A型ウィルスの核タンパク質 に対する抗体である請求項 1に記載の方法。
[5] 前記抗インフルエンザウイルス抗体力 トリインフルエンザウイルスの核タンパク質の アミノ酸配列の N末端側から第 46位〜第 159位の領域に存在するェピトープを認識 する抗体である請求項 1に記載の方法。
[6] 前記抗インフルエンザウイルス抗体力 国際寄託の受領番号が FERM ABP- 1 0904 (国内寄託の受託番号： FERM P— 20822)であるハイプリドーマにより産生 されるモノクローナル抗体である請求項 1に記載の方法。
[7] 前記免疫学的測定法が、インフルエンザウイルスに対する第一及び第二の抗体を 用い、標識された前記第一の抗体と固相に固定された前記第二の抗体とインフルェ ンザウィルスとを含む複合体を形成させる工程を含んでおり、且つ少なくとも前記第 二の抗体が、ヒトインフルエンザ A型ウィルス HI亜型、 H2亜型及び H3亜型並びにヒ トインフルエンザ B型ウィルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の 亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体である請求項 1に記載の方法。
[8] 前記第一及び第二の抗体が、ヒトインフルエンザ A型ウィルス HI亜型、 H2亜型及 び H3亜型並びにヒトインフルエンザ B型ウィルスに反応性を示さず、トリインフルェン ザウィルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体である請求 項 7に記載の方法。
[9] 前記免疫学的測定法が、ィムノクロマトグラフ法である請求項 7又は 8に記載の方法
[10] 前記ィムノクロマトグラフ法が、前記第二の抗体が固定されたクロマト用膜担体にお いて、当該第二の抗体と標識された前記第一の抗体とインフルエンザウイルスとを含 む複合体を形成させる工程を含んでおり、且つ前記第二の抗体が、ヒトインフルェン ザ A型ウィルス HI亜型、 H2亜型及び H3亜型並びにヒトインフルエンザ B型ウィルス に反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗イン フルェンザウィルス抗体である請求項 9に記載の方法。
[11] インフルエンザウイルスに対する第一及び第二の抗体を利用して試料中のトリイン フルェンザウィルスを検出するためのィムノクロマトグラフ法用試験具であって、 前記試料を添加する試料添加部材と、
標識物質で標識された第一の抗体を担持する標識保持部材と、
第二の抗体が固定された判定領域を配置したクロマト用膜担体とを有し、 前記第一の抗体が、トリインフルエンザウイルスに反応性を示し、
前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザ A型ウィルス HI亜型、 H2亜型及び H3亜 型並びにヒトインフルエンザ B型ウィルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウィル スの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることを特徴とす るィムノクロマトグラフ法用試験具。
[12] 前記標識物質が、不溶性粒状マーカーである請求項 11に記載のィムノクロマトダラ フ法用試験具。
[13] 前記不溶性粒状マーカーが、着色合成高分子粒子又はコロイド状金属粒子である 請求項 12に記載のィムノクロマトグラフ法用試験具。
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