WO2008044800A1 - Plante mutante et son procédé de production - Google Patents

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WO2008044800A1
WO2008044800A1 PCT/JP2007/070396 JP2007070396W WO2008044800A1 WO 2008044800 A1 WO2008044800 A1 WO 2008044800A1 JP 2007070396 W JP2007070396 W JP 2007070396W WO 2008044800 A1 WO2008044800 A1 WO 2008044800A1
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protein
amino acid
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Rumi Tominaga
Takuji Wada
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to a mutant plant exhibiting a characteristic form and a method for producing the same.
  • Non-Patent Document 1 discloses a CAPRICE book (hereinafter referred to as CPC protein) which is a protein having an R3 MYB motif that is commonly used for root hair cell differentiation in Arabidopsis thaliana.
  • CPC protein a CAPRICE book
  • Non-patent document 2 shows that this CPC protein translocates from non-root hair cells to root hair cells and suppresses the expression of homeodomain-mouth icin zipper gene (GLABRA2).
  • Non-Patent Document 2 Wada, T., Kurata, T., Tominaga, R., Koshino-Kimura, Y.,
  • Tachibana T., Goto, K., Marks, MD, Shimura, Y., and Okada, K. (2002).
  • Role of a positive regulator of root hair development, CAPRICE in Arabidopsis root epidermal cell differentiation.Development 129, 5409-5419.
  • the ENHANCER OF TRY AND CPC1 gene acts redundantly with TRIPTYCH0N and CAPRICE in trichome and root hair cell patterning in Arabidopsis. Dev Biol 268, 506-513.
  • Patent Literature 4 Kirik, V., Simon, M., Wester, K., Schief elbein, J., and Hulskamp, M. (2004a). ENHANCER of TRY and CPC 2 (ETC2) reveals redundancy in the region-specific control of trichome development of Arabidopsis. Plant Mol Biol 55, 389-398.
  • Non-Patent Document 5 Esch, JJ, Chen, ⁇ ⁇ A., Hillestad, M., and Marks, MD (2004). Comparison of TRY and the closely related Atlg01380 gene in controll ing Arabidopsis trichome patterning. Plant J 40, 860- 869. Disclosure of the Invention
  • the present invention aims to analyze the function of a gene having a CPC-like Myb sequence whose function is unknown, and to provide a novel mutant plant based on the obtained knowledge.
  • An object is to provide a manufacturing method.
  • the present invention includes the following.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and functioning as a transcription factor that controls epidermal cell differentiation
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and functioning as a transcription factor that controls epidermal cell differentiation
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and functioning as a transcription factor that controls epidermal cell differentiation
  • Figure 1-1 is a phylogenetic tree showing the relationship between the CPL3 gene and rice-derived orthologs.
  • FIG. 1-12 shows alignments in amino acid sequences of L0C_0s01g43180, LOC-0s01g43230, CPC, TRY, ETC1, ETC2, and CPL3.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the alignment of amino acid sequences of CPC protein, ETC1 protein, ETC2 protein, TRY protein and CPL3 protein, and the T-DNA insertion position in mutants lacking each gene.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the results of measuring the number of root hairs for double mutants and triple mutants for the CPC gene, TYR gene, ETC1 gene, ETC2 gene, and CPL3 gene.
  • Fig. 4 is a characteristic diagram showing the results of measuring the number of trichomes for double mutants and triple mutants for the CPC gene, TYR gene, ETC1 gene, ETC2 gene and CPL3 gene.
  • c P 13-1 mutants, 35S :: CPL3 transformant, the CPL3 :: CPL3 transformant and wild type is a characteristic diagram showing the results of measuring the raw weight in the same growth stage.
  • c P 13-1 mutants, 35S :: CPL3 transformant, CPL3:: CPL3 for transformants ⁇ Pi wildtype is a photograph at the same growth stage.
  • FIG. 7 is a characteristic diagram showing the results of measurement of endoreduplication for cpl3-1 mutant, CPL3 :: CPL3 transformant and wild type.
  • Figure 8 is a characteristic diagram showing the results of measuring the number of true leaves for each mutant and transformant. PT / JP2007 / 07 396. '
  • FIG. 9 is a characteristic diagram showing the results of measuring the days of lottery for each mutant and transformant.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of observation of the phenotype of cells in the leaves and hypocotyls of the cpl3-l mutant, CPL3 :: CPL3 transformant and wild type using an optical microscope.
  • Figure 11 shows the results of a comparison of the number of root hairs in transformants overexpressing the CPC gene, ETC1 gene, ETC2 gene, TRY gene and CPL3 gene under the control of the 35S promoter or under the control of its own promoter.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of observation of the phenotype of cells in the leaves and hypocotyls of the cpl3-l mutant, CPL3 :: CPL3 transformant and wild type using an optical microscope.
  • Figure 11 shows the results of a comparison of the number of root hairs in transformants overexpressing the CPC gene, ETC1 gene, ETC2 gene, TRY gene and CPL3 gene under the control of the 35S promoter or under the control of its own promoter.
  • Figure 12 shows the results of comparing the number of trichomes in transformants overexpressing the CPC gene, ETC1 gene, ETC2 gene, TRY gene, and CPL3 gene under the control of the 35S promoter or under the control of its own promoter.
  • FIG. 12 shows the results of comparing the number of trichomes in transformants overexpressing the CPC gene, ETC1 gene, ETC2 gene, TRY gene, and CPL3 gene under the control of the 35S promoter or under the control of its own promoter.
  • Figure 13 shows the results of examining the expression pattern of each gene using transformants that express GUS protein under the control of the CPC gene, ETC1 gene, ETC2 gene, TRY gene, and CPL3 gene promoter. It is.
  • FIG. 14 shows the results of studying the expression pattern of each gene, RT-PCR and In, using transformants that express GFP fusion protein for the CPC gene, ETC1 gene, ETC2 gene, TRY gene and CPL3 gene.
  • FIG. 6 is a characteristic diagram showing the results of examining the expression pattern of each gene by in situ hybridization.
  • FIG. 15 shows the results of real-time PCR showing the expression levels of C0, FT, S0C1 and CPL3 in cpc, try, etcl, etc2, and cpl3 mutant plants.
  • the mutant plant according to the present invention lacks the function of a specific protein in a wild-type plant.
  • the mutant plant according to the present invention is characterized by large growth compared to the wild type plant. Specifically, the mutant plant according to the present invention is characterized in that when measured for weight when grown to the same degree under the same conditions as the wild-type plant, it is significantly heavier than the wild-type plant. In addition, the mutant plant according to the present invention is characterized in that it shows a faster flowering time compared to a wild-type plant.
  • the loss of protein function means that a gene encoding the protein is deleted from the genome, the expression of the gene encoding the protein is inhibited, and the protein This includes reducing quality activity.
  • a method for deleting a gene encoding a specific protein is not particularly limited, and examples thereof include a method using homologous recombination and a method using transposon.
  • the gene when the gene is deleted, the entire length of the gene may be deleted or a partial deletion may be performed.
  • a method for inhibiting the expression of a gene encoding a specific protein is not particularly limited, but a method of deleting a promoter that controls the expression of the gene, a promoter that controls the expression of the gene is expressed.
  • a method of replacing an inducible promoter, a method of introducing a mutation into a promoter controlling the expression of the gene, a method of degrading the transcript of the gene using RNA interference, and using an antisense RNA And a method for inhibiting the translation of the gene.
  • examples of a method for reducing the activity of a specific protein include a method in which a substance having a function of specifically binding to the protein and suppressing the activity of the protein is allowed to act.
  • examples of the substance include antibodies and inhibitors that can inhibit the function of the protein.
  • a gene registered as At4g01060 in Arabidopsis thaliana is referred to herein as a CPL3 gene as a protein having a CPC-like Myb sequence.
  • the base sequence of the CPL3 gene is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of the CPL3 protein encoded by the CPL3 gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • mutant plant according to the present invention is deficient in the function of the following protein (1), (2) or (3).
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 one or more amino acids are substituted or missing A protein consisting of a deleted, added or inserted amino acid sequence that functions as a transcription factor that regulates epidermal cell differentiation
  • a plurality of amino acids means, for example, 2 to 3 3 amino acid residues, preferably 2 to 15 amino acid residues, more preferably 2 to 5 amino acid residues. .
  • the 3rd to 5th regions, the 21st to 32nd regions, and 7 The seventh and subsequent areas can be listed. Since these regions are regions other than the CPC-like Myb sequence, even if one or more amino acids are substituted, deleted, added or inserted, it is considered that the function of the CPL3 protein is less affected.
  • a plurality of bases corresponds to the above-mentioned “plural amino acids”, for example, 6 to 99 bases, preferably 6 to 45 bases, more preferably 6 to 15 bases. means.
  • the site at which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted also corresponds to the above-mentioned “plural amino acids”, the 9th to 15th regions in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 6 Examples include the 3rd to 9th regions, the 2 3rd region, and the like.
  • the present invention can be applied to any plant body. That is, the present invention can be applied to any plant as long as the wild-type plant has the protein defined as described above.
  • the present invention is particularly preferably a dicotyledonous plant, and particularly preferably applied to a cruciferous plant represented by Arabidopsis thaliana.
  • the cruciferous plants include Chinese cabbage (B. campestris), Komatsuna (B. campestris var. Peruviridis), Kafusina (B. juncea), Takana (B. juncea var. Integl if ol ia) oleracea var. acephala), white button (B. oleracea var. captryta) s cabbage (B. oleracea var. gerphalfera) ⁇ Cornole Fubi (B. oleracea var. Gongylodes), Proccory (B. oleracea var. Italica), Such as turnip (B. rapa s singensai) (B.
  • rapa var. Lancinifolia Mention may be made of plants belonging to the genus Brassica.
  • the cruciferous plants include plants belonging to the genus Nasturtium, such as N. officinale, plants belonging to the genus Lepidium, such as L. sativum, Plants belonging to the genus (Raphanus) such as radish (R. sativus) and R. sativus var. Radicula, plants belonging to the genus (Eruca) such as E. vesicaria, Plants belonging to the genus Wasabia / Eutrema, such as W.
  • the mutant plant according to the present invention is not limited to the dicotyledonous plant as described above, and may be a monocotyledonous plant represented by rice.
  • a gene corresponding to the CPL3 gene can be identified in the rice genome.
  • two orthologs of the CPL3 gene could be identified from the rice genome database.
  • L0CJ L0CJ
  • L0C-0s01g43230 L0C-0s01g43230, both of which are on the first chromosome.
  • the homology between the CPL3 gene and L0C-0s01g43180 was 63% at the amino acid level, and the homology between the CPL3 gene and L0C_0s01g43230 was 59% at the amino acid level.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by L0C—0s01 g 43180 is shown in SEQ ID NO: 3
  • the amino acid sequence of the protein encoded by LOC — 0s01g43230 is shown in SEQ ID NO: 4.
  • L0C_0s01g43180 and L0C_0s01g43230 TRY gene, CPC gene, Homology with ETC1 and ETC2 genes was calculated.
  • LOC—0s01g43180 is 61% at the amino acid level for CPC and 54 ° / amino acid level for ETC2. The homology was 53% at the amino acid level for ETC1 and 51% at the amino acid level for TRY.
  • LOC_Os01 g 43230 has 56% amino acid level for ETC2, 54% amino acid level for CPC, and 49 ° / amino acid level for ETC1. It showed 44% homology at the amino acid level relative to TRY.
  • L0C_0s01g43180 and LOC_Os01g43230 found in the rice genome have the highest homology with CPL3 among proteins containing CPC-like Myb sequences, and can be judged to have a high probability of having the same function as the CPL3 gene in Arabidopsis thaliana. .
  • the mutant plant according to the present invention defined as described above is characterized when it grows larger than the wild type plant. Therefore, according to the present invention, when the plant to be mutagenized is edible, it can be expected to improve the production amount by increasing the size. In addition, according to the present invention, in the case where a substance is produced inside a plant body to be mutated, the productivity of the useful substance can be improved.
  • the substance may be a substance that is naturally produced by a wild-type plant or a substance that is produced by transforming a wild-type plant. .
  • the mutant plant according to the present invention has a feature that the flowering time is earlier than that of the wild type plant. Therefore, since it can promote the formation of fruits and seeds, it has the advantage of being able to harvest multiple crops that can usually be harvested only once a year. In addition, due to the nature of the mutant plant of the present invention, it is possible to reduce the cost required for crop harvesting.
  • Arabidopsis thaliana ecotype Col-0 (hereinafter referred to as wild-type Arabidopsis thaliana) was used as a wild-type plant body.
  • Wisconsin T-DNA From the 07 070396 group a cpl3-l mutant in which a mutation was introduced into the gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 was screened.
  • Transformants expressing the GUS protein were prepared by linking the promoter sequences of these genes and the GUS gene to highly expressed transformants.
  • Table 1 shows the names, base sequences, and sequence numbers of the primers used in this example.
  • a 1.4 kb PCR fragment containing the ETC2 gene was amplified. Furthermore, a 0.8 kb PCR fragment containing the CPL3 gene was amplified using TW1167 and TW1168. Furthermore, RT91 and
  • PCR fragments were each subcloned into pBluescript SK + (Stratagene) using Pyrobest DNA polymerase (Takara, Japan).
  • the prepared plasmids were designated as pBS-ETCl, pBS-ETC2, pBS-CPL3, and pBS-TRY, respectively.
  • a transformant that highly expresses the GFP fusion protein by linking each gene and the GFP gene the following constructs were prepared. Specifically, a 2.3 kb PCR fragment containing the ETC1 gene was amplified using RT67 and RT68, and this was subjected to restriction enzyme treatment with Sail and Smal. Also, RT69 and RT70 were used to amplify a 4. Okb PCR fragment containing the ETC2 gene and digested with Sail and EcoRV. Furthermore, the PCR fragment of 3. Okb was amplified using RT71 and RT72, and this was treated with restriction enzyme with Sal I and EcoRV. Furthermore, 4.
  • Okb PCR fragment was amplified using RT89 and RT90, and this was subjected to restriction enzyme treatment with Sail and Smal. The obtained fragments were transferred to the Sail and EcoRV sites of pBS-2xGFP (Kurata, T et al. Cell-to-cell movement of the CAPRICE protein in Arabidopsis root epidermal cell differentiation.Development 132, 5387-5398 (2005)), respectively.
  • PBS-ETCl 2xGFP
  • pBS_ETC2 2xGFP
  • pBS-CPL3 2xGFP
  • pBS-TRY 2xGFP were prepared.
  • PBS-ETC2 The fragment obtained by treating 2xGFP with Sail and SacII was inserted into the Sail and Smal sites of pJHA212K binary vector. Furthermore, the fragments obtained by treating pBS-CPL3: 2xGFP and pBS-TRY: 2xGFP with Sail and Sacl. Were inserted into the Sail and Sacl sites of the pJHA212K binary vector.
  • the following constructs were prepared. That is, a 1.9 kb PCR fragment containing the promoter region of the ETC1 gene was amplified using RT46 and RT47.
  • RT48 and RT49 were used to amplify the 3. Okb PCR fragment containing the promoter region of the ETC2 gene. Furthermore, a 2.4 kb PCR fragment containing the promoter region of the CPL3 gene was amplified using RT50 and RT51. Furthermore, RT88 and RT89 were used to amplify the 3. Okb PCR fragment containing the TRY gene promoter region. The obtained amplified fragments were each treated with Notl and Accl, and then subcloned into pBS. It fabricated plasmid respectively pBS- ETC1, pBS - ETC2, pBS - CPL3 and was P BS-TRY.
  • the fragments obtained by treating pBS-ETC1 and pBS_CPL3 with Sail and BamHI were inserted into Sail and BamHI sites of ⁇ binary vector (Clontech Laboratories, Inc., CA, USA).
  • the obtained plasmid was designated as ETClpromoter :: GUS and CPL3promoter :: GUS.
  • the fragments obtained by treating pBS-ETC2 and pBS-TRY with Sail and Xbal were inserted into Sail and Xbal sites of ⁇ binary vector.
  • the obtained plasmid was designated as ETC2promoter :: GUS and TRYpromoter :: GUS.
  • ETC1 ETCl: 2xGFP
  • ETC2 ⁇ ETC2: 2xGFP
  • CPL3 CPL3: 2xGFP
  • TRY TRY:: 2xGFP
  • CPL3promoter GUS
  • ETC2promoter GUS
  • TRYpromoter Using GUS, Kurata, T et al.
  • the Y0RE-Y0RE gene regulates multiple aspects of epidermal cell differentiation in Arabidopsis. Plant j 36 , 5 ⁇ -66 (2003).
  • the number of root hairs was slightly reduced in the cpl3-1 mutant.
  • Double mutants for CPC gene and TRY gene, CPC gene and ETC1 In the double mutant for the gene and the triple mutant for the TRY gene, CPL3 gene, and CPC gene, the number of root hairs was greatly reduced or the root hairs were hardly measured.
  • Figure 4 shows the results of counting the number of trichomes for each gene variant and the resulting double and triple mutants.
  • the number of trichomes increased as compared to the wild type, as in the cpc-2 mutant.
  • the number of trichomes was further increased in triple mutants for the TRY gene, CPC gene and CPL3 gene.
  • the quadruple mutants for the TRY gene, CPC gene, ETC1 gene, and CPL3 gene more trichomes were formed, and the entire main surface of the leaf was covered with trichomes.
  • Fig. 5 shows the results of measuring the raw weight of each plant at the same growth stage
  • Fig. 6 shows photographs of each plant at the same time.
  • mutants lacking the CPL3 gene grow larger than the wild type.
  • transformants overexpressing the CPL3 gene grew about 30% compared to the wild type.
  • each mutant lacking the CPC gene, ETC1 gene, ETC2 gene and TRY gene showed only growth equivalent to the wild type.
  • Figure 7 shows the results of verifying the ploidy of each plant.
  • ploidy was measured according to the manufacturer's manual using a Ploidy Analyzer PA Flow Cytometer (Partec) for each plant two weeks after sowing.
  • the peak at 16C is significantly increased.
  • mutants lacking the CPL3 gene exhibit a phenotype such as increased cell size due to improved nuclear doubling.
  • the results of measuring the number of true leaves for each plant are shown in FIG. 8, and the results of measuring the number of days for each plant are shown in FIG.
  • mutants lacking the CPL3 gene bloomed earlier compared to wild type and other mutants and transformants.
  • mutants lacking the CPL3 gene are characterized by large leaf epidermal cells and long hypocotyls compared to wild type and transformants that overexpress the CPL3 gene. Indicated.
  • Table 2 shows the results of measurement of leaf size and number of epithelial cells for each plant.
  • CPL3 : CPL3 9.5 ⁇ 0. 9 311 ⁇ 14 2960 ⁇ 306
  • the mutant lacking the CPL3 gene does not show an increase in the number of cells compared to the wild type but grows larger than the wild type. It became clear that growth in individual cells was promoted compared to the wild type.
  • the CPC gene, ETC1 gene, ETC2 gene, TRY gene, and CPL3 gene were excessive under the control of the 35S promoter or under the control of its own promoter.
  • the number of root hairs in the transformants to be expressed was compared. The results are shown in Figure 11. As shown in Fig. 11, the number of root hairs increased in all transformants constitutively expressed under the control of the 35S promoter compared to the wild type. However, in the transformants expressing the CPL3 gene under the control of the 35S promoter, the number of root hairs increased somewhat moderately compared to other transformants. Furthermore, in the transformant overexpressing the ETC1 gene under the control of the ETC1 promoter, other transformants overexpressing the ETC1 gene under the control of its own promoter and the wild type 07 The number of root hairs increased compared to 070396 type.
  • the expression pattern of each gene was examined using the transformant expressing GUS protein under the control of the promoter of each gene prepared in (Experimental Example 2). The results are shown in Figure 13.
  • the expression pattern of each gene product was examined using the transformant produced in (Experimental Example 2) that highly expresses the GFP fusion protein for each gene. The results are shown in Figure 14.
  • Figure 14 also shows the results of examining the expression pattern of each gene by RT-PCR and in situ hybridization.
  • the products of the CPC gene, TRY gene, and ETC1 gene were specifically accumulated in non-root hair cells in young trichomes and root epidermis.
  • ETC2 and CPL3 gene products are specifically accumulated in epidermal cells including stomatal guard cells on the axial and dorsal axis of the leaf, and are accumulated in the roots and trichomes. There wasn't.
  • the CPL3 gene was expressed more specifically in the stomatal guard cells in the leaves, cotyledons, hypocotyls, and petioles than the ETC2 gene.
  • cpc identified in the same manner as in Example 1, the try, ETCL, ETC2 ⁇ Pi c P 13 Nokkuauto variants, as well as flowering time and leaves CPL3-overexpressing plant prepared in the same manner as in Experimental Example 2 The number was investigated.
  • Table 3 shows the results of investigating the flowering time of each of these mutant plants and the number of leaves at each flowering time. The data show the average SD of at least 10 plants per experiment.
  • FLOWERING LOCUS T FT
  • SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1 SOCl
  • CO CONSTANS
  • RNA Synthesized from 1 ⁇ g total RNA.
  • Real-time PCR was performed with Chromo4 Rea Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) using SYBR Premix Ex Taq (Takara).
  • PCR amplification was performed at a denaturation step of 95 ° C for 30 seconds, followed by 45 cycles for CPL3, 40 cycles for C0, FT, S0C1 and ACT2, 5 seconds at 95 ° C and 30 seconds at 60 ° C.
  • Relative mRNA levels were measured using iQ5 software (Bio-Rad). And normalized to the concentration of ACT2 mRNA.
  • the present invention it is possible to provide a novel mutant plant exhibiting a larger form or earlier flowering time as compared with the wild type and a method for producing the same.
  • the mutant plant according to the present invention since it exhibits a larger form than the wild type, for example, productivity of a substance extracted from the plant can be improved.
  • productivity of a substance extracted from the plant can be improved.
  • the mutant plant according to the present invention since it shows an earlier flowering time compared to the wild type, it is possible to promote the formation of fruits and seeds. is there.
  • due to the nature of the mutant plant of the present invention it is possible to reduce the time required for crop harvesting.

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Description

変異植物体及びその製造方法 技術分野
本発明は、 特徴的な形態を示す変異植物体及ぴその製造方法に関する。 背景技術 明
非特許文献 1には、 シロイヌナズナにおける根毛細胞分化に慣用する R3 MYB モチーフを有するタンパク質である CAPRICE書 (以下、 CPCタンパク質）が開示ざれ ている。 非特許文献 2では、 この CPCタンパク質が非根毛細胞から根毛細胞に細 胞間移行し、 ホメォドメイン -口イシンジッパー遺伝子 （GLABRA2) の発現を抑制 していることが示された。
TRIPTYCHON遺伝子（TRY遺伝子）を含む 4種類の CPC様 Myb配列がシロイヌナズ ナゲノムから見いだされている。 TRY遺伝子欠損株においてトライコームのクラ スターが観察されることから、 TRY タンパク質はトライコーム形成を制御してい る。 Kirikらは、 これら 4種類の CPC様 Myb配列のうち既に 2種 （ETC1及び ETC2 と称される) を同定し、 遺伝学的にこれらと！: PC及び TRYとの関係を解析してい る （非特許文献 3及び非特許文献 4 )。 David Marks のグループは、 TRY 及び Atlg01380 (ETCl)との関係を解析し、 GL3が TRY遺伝子の発現を制御するが ETC1 の発現を制御していないことを示した （非特許文献 5 )。
しかし、 現在、 その他の CPC様 Myb配列からなる遺伝子に関する解析はなされ ておらず、 当該遺伝子の機能は未知である。
非特許文献 1 ada, T. , Tachibana, T. , Shimura, Υ.， and Okada, K. (1997) .
Epidermal cell differentiation in Arabidopsis determined by a Myb homolog,
CPC. Science 277， 1113-1116.
非特許文献 2 Wada, T.， Kurata, T.， Tominaga, R.， Koshino-Kimura, Y. ,
Tachibana, T. , Goto, K.， Marks, M. D. , Shimura, Y.， and Okada, K. (2002) . Role of a positive regulator of root hair development, CAPRICE, in Arabidopsis root epidermal cell differentiation. Development 129, 5409-5419.
非特許文献 3 Kirik, V. , Simon, M. , Huelskarap, M.， and Schief elbein, J. (2004b) . The ENHANCER OF TRY AND CPC1 gene acts redundantly with TRIPTYCH0N and CAPRICE in trichome and root hair cell patterning in Arabidopsis. Dev Biol 268, 506-513.
特許文献 4 Kirik, V. , Simon, M. , Wester, K.， Schief elbein, J. , and Hulskamp, M. (2004a) . ENHANCER of TRY and CPC 2 (ETC2) reveals redundancy in the region-specific control of trichome development of Arabidopsis. Plant Mol Biol 55， 389-398.
非特許文献 5 Esch, J. J.， Chen, Μ· A.， Hillestad, M. , and Marks, M. D. (2004) . Comparison of TRY and the closely related Atlg01380 gene in controll ing Arabidopsis trichome patterning. Plant J 40， 860-869. 発明の開示
そこで、 本発明は、 機能が未知の CPC様 Myb配列を有する遺伝子の機能を解析 し、得られた知見に基づいて新規な変異植物体を提供することを目的とし、また、 当該変異植物体の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、 機能が未知の CPC様 Myb配列を有する遺伝子の機能を解析した 結果、 当該遺伝子の欠損株が野生型と比較して特徴的な形態を示すことを見いだ し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下を包含する。
( 1 ) 以下のいずれか 1記載のタンパク質の機能を抑制した変異植物体。
(a) 配列番号 2に示すァミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、 付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、 表皮細胞分化を制御する転写因子と して機能するタンパク質
(c)配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて 1又は複数の 塩基が置換、 欠失、 付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドによ つてコードされ、 表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質 ( 2 ) 上記 （a) 〜 （c) のいずれか 1記載のタンパク質をコードする遺伝子を欠 損していることを特徴とする （1 ) 記載の変異植物体。
( 3 ) 双子葉植物であることを特徴とする （1 ) 記載の変異植物体。
( 4 ) アブラナ科植物であることを特徴とする （1 ) 記載の変異植物体。
( 5 ) 対象とする植物における以下のいずれか 1記載のタンパク質の機能を抑制 する、 変異植物体の製造方法。
(a) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、 付加又は挿入されたァミノ酸配列からなり、 表皮細胞分化を制御する転写因子と して機能するタンパク質
(c)配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて 1又は複数の 塩基が置換、 欠失、 付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドによ つてコードされ、 表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
( 6 ) 上記 （a) 〜 （c) のいずれか 1記載のタンパク質をコードする遺伝子を欠 損させることを特徴とする （5 ) 記載の変異植物体の製造方法。
( 7 ) 上記対象とする植物は双子葉植物であることを特徴とする （5 ) 記載の変 異植物体の製造方法。
( 8 ) 上記対象とする植物はアブラナ科植物であることを特徴とする （5 ) 記載 の変異植物体の製造方法。
( 9 ) 対象とする植物における以下のいずれか 1記載のタンパク質の機能を抑制 することを特徴とする、 野生型と比較して、 より大きな形態又はより早い開花時 期を示す変異植物体の製造方法。
(a) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、 付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、 表皮細胞分化を制御する転写因子と して機能するタンパク質
(c)配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて 1又は複数の 塩基が置換、 欠失、 付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドによ つてコードされ、 表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質 ( 1 0 ) 上記 （a) 〜 （c) のいずれか 1記載のタンパク質をコードする遺伝子を 欠損させることを特徴とする （9 ) 記載の変異植物体の製造方法。
( 1 1 ) 上記対象とする植物は双子葉植物であることを特徴とする （9 ) 記載の 変異植物体の製造方法。
( 1 2 ) 上記対象とする植物はアブラナ科植物であることを特徴とする （9 ) 記 載の変異植物体の製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2006-278988号の明細書 およびノまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1— 1は、 CPL3遺伝子とイネ由来ォーソログとの関係を示す系統樹である。 図 1一 2は、 L0C_0s01g43180、 LOC— 0s01g43230、 CPC、 TRY, ETC1、 ETC2及ぴ CPL3 についてアミノ酸配列におけるァライメントを示す図である。
図 2は、 CPCタンパク質、 ETC1タンパク質、 ETC2タンパク質、 TRYタンパク質 及ぴ CPL3タンパク質のアミノ酸配列におけるァライメント及び、各遺伝子を欠損 する変異体における T-DNA挿入位置を模式的に示す図である。
図 3は、 CPC遺伝子、 TYR遺伝子、 ETC1遺伝子、 ETC2遺伝子及び CPL3遺伝子に 対する二重変異体及ぴ三重変異体について、 根毛の数を計測した結果を示す特性 図である。
図 4は、 CPC遺伝子、 TYR遺伝子、 ETC1遺伝子、 ETC2遺伝子及び CPL3遺伝子に 対する二重変異体及ぴ三重変異体について、 トライコーム数を計測した結果を示 す特性図である。
図 5は、 cP13- 1変異体、 35S :： CPL3形質転換体、 CPL3 :： CPL3形質転換体及び野 生型について、同じ成長段階における生重量を測定した結果を示す特性図である。 図 6は、 cP13- 1変異体、 35S :： CPL3形質転換体、 CPL3 : : CPL3形質転換体及ぴ野 生型について、 同じ成長段階における写真である。
図 7は、 cpl3- 1変異体、 CPL3 :： CPL3形質転換体及ぴ野生型について、核内倍加 を測定した結果を示す特性図である。
図 8は、 各変異体及び形質転換体について本葉数を測定した結果を示す特性図 P T/JP2007/07 396 である。 '
図 9は、 各変異体及び形質転換体について抽台日数を測定した結果を示す特性 図である。
図 1 0は、 cpl3-l変異体、 CPL3 : : CPL3形質転換体及び野生型に いて、葉及び 胚軸における細胞の表現型を光学顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 図 1 1は、 CPC遺伝子、 ETC1遺伝子、 ETC2遺伝子、 TRY遺伝子及び CPL3遺伝子 を 35Sプロモーターの制御下、 又は自身のプロモーターの制御下に過剰発現する 形質転換体における根毛の数を比較した結果を示す特性図である。
図 1 2は、 CPC遺伝子、 ETC1遺伝子、 ETC2遺伝子、 TRY遺伝子及ぴ CPL3遺伝子 を 35Sプロモーターの制御下、 又は自身のプロモーターの制御下に過剰発現する 形質転換体におけるトライコームの数を比較した結果を示す特性図である。
図 1 3は、 CPC遺伝子、 ETC1遺伝子、 ETC2遺伝子、 TRY遺伝子及ぴ CPL3遺伝子 のプロモーター制御下で GUSタンパク質を発現する形質転換体を用いて、 各遺伝 子の発現パターンを検討した結果を示す写真である。
図 1 4は、 CPC遺伝子、 ETC1遺伝子、 ETC2遺伝子、 TRY遺伝子及ぴ CPL3遺伝子 について GFP融合タンパク質を髙発現する形質転換体を用いて、 各遺伝子の発現 パターンを検討した結果及び RT- PCR並びに In situ hybridizationよつて各遺伝 子の発現パターンを検討した結果を示す特性図である。
図 1 5は、 cpc、 try, etcl、 etc2及ぴ cpl3変異植物体における C0、 FT、 S0C1 及ぴ CPL3の発現量を示すリアルタイム PCRの結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明に係る変異植物体は、 野生型の植物体における特定のタンパク質の機能 を欠損させたものである。 本発明に係る変異植物体は、 野生型の植物体と比較し て、 大きく成長といった特徴がある。 具体的に本発明に係る変異植物体は、 野生 型の植物体と同条件で同程度まで育成した時に重量を測定すると、 野生型の植物 体と比較して有意差をもって重いといった特徴がある。 また本発明に係る変異植 物体は、野生型の植物体と比較して、より速い開花時期を示すという特徴がある。 ここで、 本明細書において、 タンパク質の機能を欠損させるとは、 当該タンパ ク質をコードする遺伝子をゲノムから欠損させること、 当該タンパク質をコード する遺伝子の発現を阻害すること、 及び当該タ.ンパク質の活性を低下させること を含む意味である。
より詳細に、特定のタンパク質をコードする遺伝子を欠損させる方法としては、 特に限定されないが、 相同組換えを用いた方法やトランスポゾンを用いた方法を 挙げることができる。 また、 当該遺伝子を欠損させる場合には、 当該遺伝子の全 長を欠損させても良いし、 部分的に欠損させても良い。
また、 特定のタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する方法としては、 特に限定しないが、 当該遺伝子の発現を制御しているプロモーターを欠損させる 方法、 当該遺伝子の発現を制御しているプロモーターを発現誘導型プロモーター に置換する方法、 当該遺伝子の発現を制御しているプロモーターに突然変異を導 入する方法、 R N A干渉を利用して当該遺伝子の転写産物を分解する方法、 及ぴ アンチセンス R N Aを利用して当該遺伝子の翻訳を阻害する方法を挙げることが できる。
さらに、 特定のタンパク質の活性を低下させる方法としては、 当該タンパク質 に特異的に結合して当該タンパク質の活性を抑制する機能を有する物質を作用さ せる方法を挙げることができる。 当該物質としては、 当該タンパク質の機能を阻 害できる抗体や阻害物質を挙げあることができる。
本発明に係る変異植物体においては、 シロイヌナズナにおいて At4g01060とし て登録された遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を欠損させる。 具体 的に、 At4g01060として登録された遺伝子は、本明細書中、 CPC様 Myb配列を有す るタンパク質として、 CPL3遺伝子と呼ばれる。 CPL3遺伝子の塩基配列を配列番号 1に示し、 CPL3遺伝子によってコードされる CPL3タンパク質のアミノ酸配列を 配列番号 2に示す。
すなわち、 本発明に係る変異植物体は、 以下の （1 )、 ( 2 ) 又は （3 ) のタン パク質の機能が欠損している。
( 1 ) 配列番号 2に示すァミノ酸配列からなるタンパク質
( 2 ) 配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1又は複数のアミノ酸が置換、 欠 失、 付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、 表皮細胞分化を制御する転写因 子として機能するタンパク質
( 3 ) 配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて 1又は複数 の塩基が置換、 欠失、 付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドに よってコードされ、 表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質 ここで、 複数のアミノ酸とは、 例えば 2 〜 3 3個のアミノ酸残基、 好ましくは 2 〜 1 5個のアミノ酸残基、より好ましくは 2 〜 5個のアミノ酸残基を意味する。 また、 1又は複数のアミノ酸が置換、 欠失、 付加又は挿入する部位としては、 配 列番号 2に示すアミノ酸配列において、 3 〜 5番目の領域、 2 1 〜 3 2番目の領 域、 及ぴ 7 7番目以降の領域等を挙げることができる。 これらの領域は、 CPC 様 Myb 配列以外の領域であるため、 1又は複数のアミノ酸が置換、 欠失、 付加又は 挿入されたとしても CPL3タンパク質の機能に影響が少ないと考えられる。
また、 複数の塩基とは、 上述した 『複数のアミノ酸』 に対応して、 例えば 6 〜 9 9個の塩基、 好ましくは 6 〜 4 5個の塩基、 より好ましくは 6 〜 1 5個の塩基 を意味する。 1又は複数の塩基が置換、 欠失、 付加又は挿入する部位もまた、 上 述した 『複数のアミノ酸』 に対応して、 配列番号 1に示す塩基配列において、 9 〜 1 5番目の領域、 6 3 〜 9 6番目の領域、 及び 2 3 1番目以降の領域等を挙げ ることができる。
また、 本発明は、 如何なる植物体にも適用することができる。 すなわち、 本発 明は、 野生型の植物体が上述したように定義されるタンパク質を有している限り 如何なる植物体にも適用することができる。 例えば、 本発明は、 特に双子葉植物 が好ましく、 中でもシロイヌナズナに代表されるアブラナ科植物に対して適用す ることが好ましい。
アブラナ科植物としては、ハクサイ （B. campestris)、 コマツナ（B. campestris var. peruviridis)、カフシナ (B. juncea)、タカナ (B. juncea var. integl if ol ia) ノヽゴロモカンラン (ケーノレ) (B. oleracea var. acephala) 、 ノヽボタン (B. oleracea var. acephala)、 カリフフワ一 (B. oleracea var. botrytis) s キャベツ (B. oleracea var. capitata) メ ャべッ (B. oleracea var. geramif era) ^ コーノレ フビ (B. oleracea var. gongylodes)、プロッコリー (B. oleracea var. italica)、 カブ (B. rapa) sチンゲンサイ (Β· rapa var. chinensis) , ノザヮナ (B. rapa var. hakabura) , ミズナ (B. rapa var. lancinifolia) 及びアブラナ (B. rapa var. nippo-oleifera) 等のアブラナ属 （Brassica) に属する植物を挙げることができ る。また、アブラナ科植物としては、オランダガラシ（タレソン） （N. officinale) 等のオランダガラシ属 （Nasturtium) に属する植物、 コショウソゥ （クレス） （L. sativum) 等のコショゥソゥ属 （Lepidium) に属する植物、 ダイコン （R. sativus) 及ぴノヽッカダイコン (R. sativus var. radicula) 等のダイコン属 (Raphanus) に属する植物、 キバナスズシロ （ノレッコラ） （E. vesicaria) 等のキパナスズシロ 属（Eruca)に属する植物、ヮサビ（W. japonica)等のヮサビ属（Wasabia / Eutrema) に属する植物、 セィヨウヮサビ （ホースラディッシュ） （A. rusticana) 等のセィ ヨウヮサビ属 （Armoracia) に属する植物、 ァラセィ トウ （ス トック） （M. incana) 等のァラセイトゥ属 （Matthiola) に属する植物、 ナズナ （C. bursa- pastor is) 等のナズナ属 （Capsella) に属する植物、 シロイヌナズナ （A. thaliana) 等のシ ロイヌナズナ属（Arabidopsis)に属する植物、ォオアラセィトゥ（ショカツサイ、 ムラサキノヽナナ） (0. violaceus) 等の才才ァラセィ トウ属 (Orychophragraus) こ 属する植物、並びにィヌガラシ属（Rorippa)に属する植物を挙げることができる。 一方、 本発明に係.る変異植物体は、 上述したような双子葉植物に限定されず、 イネに代表される単子葉植物であってもよい。 例えば、 イネゲノムの配列データ. を格納したデータベースに対して、 配列番号 2に示すアミノ酸配列データをキー として検索することによって、 CPL3遺伝子に相当する遺伝子をイネゲノムにおい て同定することができる。 具体的には、 CPL3遺伝子のォーソログをイネゲノムデ ータベースから 2つ同定することができた。 これら 2つのォーソログ遺伝子は、
L0CJ)s01g43180及ぴ L0C— 0s01g43230 として登録され、 共に第一染色体上に存在 している。 CPL3遺伝子と L0C— 0s01g43180 との相同性はアミノ酸レベルで 6 3 % であり、 CPL3遺伝子と L0C_0s01g43230 との相同性はァミノ酸レベルで 5 9 %で あった。 L0C— 0s01g43180によってコードされるタンパク質のァミノ酸配列を配列 番号 3に示し、 LOC_0s01g43230によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列 を配列番号 4に示す。
また、 L0C_0s01g43180及び L0C_0s01g43230について、 TRY遺伝子、 CPC遺伝子、 ETC1遺伝子及ぴ ETC2遺伝子との相同性を計算した。 LOC— 0s01g43180は、 CPCに 対してアミノ酸レベルで 61%、 ETC2に対してァミノ酸レベルで 54°/。、 ETC1に対し てアミノ酸レベルで 53%、 TRYに対してアミノ酸レベルで 51%のホモロジ一を示し た。 LOC_Os01g43230は、 ETC2に対してァミノ酸レベルで 56%、 CPCに対してアミ ノ酸レベルで 54%、 ETC1に対してアミノ酸レベルで 49°/。、 TRYに対してァミノ酸レ ベルで 44%のホモロジ一を示した。 これらの結果を系統樹として図 1— 1に示す。 なお、 図 1 一 2には、 L0C一 0s01g43180、 LOC— 0s01g43230、 CPCゝ TRY, ETC1、 ETC2 及び CPL3についてアミノ酸配列でァラィメントをとつた結果も示している。
このよ う に、 イネゲノムにおいて見いだされた L0C_0s01g43180 及ぴ LOC_Os01g43230は、 CPC様 Myb配列を含むタンパク質のなかで CPL3と最も相同性 が高く、シロイヌナズナにおける CPL3遺伝子と同等の機能を有する蓋然性が高い と判断できる。
以上のように定義した本発明に係る変異植物体は、 野生型の植物体と比較して 大きく成長するといつた特徴がある。 従って、 本発明によれば、 変異導入対象の 植物体が食用であるような場合には大型化による生産量の向上を期待することが できる。 また、 本発明によれば、 変異導入対象の植物体内部で物質を生産する様 な場合には、 当該有用物質の生産性を向上させることができる。 ここで、 物質と しては、 野生型の植物体が本来的に産生する物質であってもよいし、 野生型の植 物体を形質転換することによって産生されるような物質であってもよい。
また本発明に係る変異植物体は、 野生型の植物体と比較してより開花時期が早 いという特徴を有する。 したがって、 果実や種子の形成を促進できるため、 通常 年一回しか収穫できない作物を複数回収穫可能であるという利点を有する。 また このような本発明の変異植物体の性質により、 作物の収穫までにかかる時間ゃコ ストの削減が可能である。
以下、 実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、 本発明の技術的範囲は 以下の実施例によって限定されるものではない。
(実験例 1 ) CPL3遺伝子を欠損した変異植物体のスクリ一二ング
本実施例では、野生型の植物体として Arabidopsis thaliana ecotype Col- 0 (以 下、野生型シロイヌナズナと称する）を使用した。本実施例では、 Wisconsin T-DNA 07 070396 群のなかから、 配列番号 1に示す塩基配列を含む遺伝子に変異が導入された cpl3-l変異体をスクリ一二ングした。
また、 本例では、 SALK T-DNA 群のなかから、 TRY 遺伝子に変異が導入された try- 29760変異体、 ETC1遺伝子に変異が導入された etcl- 1変異体及ぴ ETC2遺伝 子に変異が導入された etc2- 40390 変異体を単離した。 また、 Kurata, T ら Cell-to-cell movement of the CAPRICE protein in Arabidopsis root epidermal cell differentiation. Development 132， 5387-5398 (2005)に開示された、 CPC 遺伝子に変異が導入された cpc - 2 変異体を準備した。 得られた変異体における T-DNA挿入部位を図 2に示す。
(実験例 2 ) 形質転換植物の作製
本実施例では、 CPC遺伝子、 ETC1遺伝子、 ETC2遺伝子、 TRY遺伝子及び CPL3 遺伝子を 35Sプロモーターの制御下に恒常的に発現する形質転換体、 これら遺伝 子ど GFP遺伝子とを連結して GFP融合タンパク質を高発現する形質転換体及びこ れら遺伝子のプロモーター配列と GUS遺伝子とを連結して GUSタンパク質を発現 する形質転換体を作製した。
本例で使用したプライマーの名前、 塩基配列及ぴ配列番号の一覽を表 1に示し た。
表 1
96
プライマ一名 配列 （5' →3' ) 配列番号
ΤΒΊ 165 ATATGGTACCAATAAAAAATAAATCAC 配列番号 5
TW1166 TGCTTGTCGACTGTATACACTAA 配列番号 6
TW1167 ATATGGTACCTTTAACATAGAAACCGAC 配列番号 7
TW1168 ATATGTCGACATCTACGACTTAGCTTC 配列番号 8
TW1169 ATATGGTACCACTTCATGTTCTTCCCTT 配列番号 9
111170 ATATGTCGACAAGCCAATACATATCCA 配列番号 1 0
RT46 GGCCAGTCGACAGAAAACTCACTCACTATTCACATC 配列番号 1 1
RT47 CGAGGATCCACGCTGCGTATTCATCTCAA 配列番号 1 2
RT48 GGCCAGTCGACGCTTGGCTAGCTCATAAACG 配列番号 1 3
RT49 CGATCTAGAACGGTTGGTATTATCCATAACTACT 配列番号 1 4
RT50 GGCCAGTCGACCAGCCCTGAAAACAGCTAAGAA 配列番号 1 5
RT51 CGAGGATCCGCGATGGTTATCCATGTCAAAC 配列番号 1 6
RT67 ATATGTCGACAGAAAACTCACTCACTATTCACATC 配列番号 1 7
T68 ATATCCCGGGACGTAATTGAGATCTTCGATGATTC 配列番号 1 8
RT69 ATATGTCGACGCTAGCTCATAAACGTTGGTACG 配列番号 1 9
RT70 ATATGATATCCAATTTTAGATTTTCTTGGAGATTAAG 配列番号 2 0
RT71 ATATGTCGACCAGCCCTGAAAACAGCTAAGAA 配列番号 2 1
RT72 ATATGATATCATTTTTCATGACCCAAAACCTCT 配列番号 2 2
RT73 CGATGGATAACACTGACCGTCGTC 配列番号 2 3
RT88 - ATATGGATCCACGGTCAGTGTTATCCATTACTATT ' 配列番号 2 4
RT89 ATATGTCGACCTCAATATATCAAATTCAAACATTCA 配列番号 2 5
RT90 ATATCCCGGGGGAAGGATAGATAGAAAAGCGAG 配列番号 2 6
RT91 ATATGGATCCGTTGGACATTTCCTTCTCTCTC 配列番号 2 7
RT92 ATATGTCGACCTAACCGCATGGATTAAAGTTG 配列番号 2 8
RT122 GCGATCGTAAATCTTTGTGTACTAAG 配列番号 2 9
RT123 CTCAGGAACAAAACTGCAGAATTAC 配列番号 3 0 .
RT124 GATAATACCAACCGTCTTCGTCTTC 配列番号 3 1
RT125 TTCTTGGAGATTAAGAGGAGAAGTAG 配列番号 3 2
RT126 GATAACCATCGCAGGACTAAGC 配列番号 3 3
RT127 TACAACGGAATATAATCGAAACAATC 配列番号 3 4
RT128 CTTCTTGTTTCTCGAGATTTATTCTC 配列番号 3 5
T129 AATAGTAATTCAAGGACAGGTACATTTC 配列番号 3 6
各遺伝子を 35Sプロモーターの制御下に恒常的に発現する形質転換体を得るた め、以下の構築物を作製した。すなわち、まず、 TW1169及ぴ TW1170を用いて ETC1 遺伝子を含む 0. 7kbの PCR断片を増幅した。 また、 TW1165及び TW1166を用いて
ETC2遺伝子を含む 1. 4kbの PCR断片を増幅した。 さらに、 TW1167及ぴ TW1168を 用いて CPL3遺伝子を含む 0. 8kbの PCR断片を増幅した。 さらにまた、 RT91及ぴ
RT92を用いて TRY遺伝子を含む 1. 4kbの PCR断片を増幅した。 次に、 得られた各 P2007/070396
PCR断片を、 Pyrobest DNA polymerase (Takara, Japan)を用いて pBluescript SK+ (Stratagene)にそれぞれサブクローンした。 作製されたプラスミ ドをそれぞれ pBS-ETCl、 pBS - ETC2、 pBS- CPL3及び pBS - TRYとした。
次に、 pBS- ETC1、 pBS- ETC2及ぴ pBS- CPL3を Acc65I及び Sailで処理して得ら れた断片を、 pCHF3 バイナリベクター（Jarvis, P ら An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus. Science 282, 100-103 (199.8) )の Acc65I及ぴ Sailサイトに揷入し、 35S : : ETC1、 35S : : ETC2及 ぴ 35S : : CPL3 コンス トラタトを作製した。 また、 pBS- TRYに対しては、 BamHI及ぴ Sailで処理する以外は同様にして 35S : : TRYコンス トラタトを作製した。
各遺伝子と GFP遺伝子とを連結して GFP融合タンパク質を高発現する形質転換 体を得るため、 以下のコンス トラク トを作製した。 すなわち、 RT67及び RT68を 用いて ETC1遺伝子を含む 2. 3kbの PCR断片を増幅し、これを Sail及び Smalで制 限酵素処理した。また、 RT69及ぴ RT70を用いて、 ETC2遺伝子を含む 4. Okbの PCR 断片を増幅し、これを Sail及び EcoRVを用いて消化した。 さらに、 RT71及ぴ RT72 を用いて 3. Okbの PCR断片を増幅し、これを Sal I及ぴ EcoRVで制限酵素処理した。 さらにまた、 RT89及ぴ RT90を用いて 4. Okbの PCR断片を増幅し、 これを Sail及 び Smal で制限酵素処理した。 得られた断片を pBS- 2xGFP (Kurata, T ら Cell-to-cell movement of the CAPRICE protein in Arabidopsi s root epidermal cell differentiation. Development 132, 5387 - 5398 (2005) )の Sail及び EcoRV サイ トにそれぞれ揷入し、 pBS- ETCl : 2xGFP、 pBS_ETC2： 2xGFP、 pBS-CPL3： 2xGFP及 ぴ pBS- TRY： 2xGFPを作製した。
次に、 pBS-ETCl : 2xGFPを Sail及び Xbalで処理して得られた断片を pJHA212K ノ sィナリベクタ1 ~ (Yoo, S. Υら The 35S promoter used in a selectable marker gene of a plant transformation vector affects the expression of the transgene.
Planta 221, 523-530 (2005) )の Sail 及び Xbal サイ トに揷入した。 また、
PBS-ETC2： 2xGFPを Sail及び SacIIで処理して得られた断片を pJHA212Kパイナリ ベクターの Sail 及び Smal サイ トに揷入した。 さらに、 pBS-CPL3： 2xGFP 及ぴ pBS-TRY : 2xGFPをそれぞれ Sail及ぴ Sacl.で処理して得られた断片を pJHA212Kバ イナリベクタ一の Sail及び Saclサイ トに揷入した。 各遺伝子のプロモーター配列と GUS遺伝子とを連結して GUSタンパク質を発現 する形質転換体を得るため、 以下の構築物を作製した。 すなわち、 RT46及び RT47 を用いて ETC1遺伝子のプロモーター領域を含む 1. 9kbの PCR断片を増幅した。ま た、 RT48及ぴ RT49を用いて ETC2遺伝子のプロモーター領域を含む 3. Okbの PCR 断片を増幅した。 さらに、 RT50及ぴ RT51を用いて CPL3遺伝子のプロモーター領 域を含む 2. 4kbの PCR断片を増幅した。 さらにまた、 RT88及び RT89を用いて TRY 遺伝子のプロモーター領域を含む 3. Okbの PCR断片を増幅した。 得られた増幅断 片をそれぞれ Notl及ぴ Acclで処理した後、 pBSにサブクローンした。 作製され たプラスミ ドをそれぞれ pBS- ETC1、 pBS - ETC2、 pBS - CPL3及び PBS-TRYとした。 次に、 pBS- ETC1及び pBS_CPL3を Sail及び BamHIで処理して得られた断片を ρΒΙΙΟΙバイナリベクター（Clontech Laboratories, Inc. , CA， USA)の Sail及ぴ BamHI サイ トに揷入した。 得られたプラスミ ドを ETClpromoter：： GUS 及ぴ CPL3promoter :： GUSとした。 また、 pBS- ETC2及び pBS- TRYを Sail及び Xbalで処 理して得られた断片を ρΒΙΙΟΙバイナリベクターの Sail及ぴ Xbalサイ トに揷入し た。 得られたプラスミドを ETC2promoter :： GUS及ぴ TRYpromoter :： GUSとした。
以上の よ う に して得られた 35S : : ETC1、 35S : : ETC2、 35S : : CPL3、 ETC1 : : ETCl : 2xGFP、 ETC2： ·· ETC2 : 2xGFP、 CPL3：： CPL3： 2xGFP、 TRY：： TRY： 2xGFP、 ETClpromoter :： GUS 、 CPL3promoter：： GUS 、 ETC2promoter：： GUS 及 ぴ TRYpromoter :： GUSを用いて、 Kurata, Tら The Y0RE-Y0RE gene regulates multiple aspects of epidermal cell differentiation in Arabidopsis. Plant j 36， 5ΰ— 66 (2003)に開示された方法に従って形質転換した。
〔実施例 1〕 CPL 3遺伝子を欠損する変異体における表現型
(実験例 1 ) で単離した etcl- 1変異体、 etc2- 40390変異体及び cpl3-l変異体 のホモ接合体を F2世代において PCRを用いて同定することで、 CPC遺伝子、 TRY 遺伝子、 ETC1遺伝子、 ETC2遺伝子及び CPL3遺伝子に対する二重変異体及び三重 変異体を同定した。 各遺伝子の変異体、 得られた二重変異体及び三重変異体につ いて、 根毛の数を計測した結果を図 3に示す。
図 3から判るように、 cpl3- 1変異体においては、 根毛の数が僅かに減少してい た。 また、 CPC遺伝子及ぴ TRY遺伝子に対する二重変異株、 CPC遺伝子及び ETC1 遺伝子に対する二重変異株、 並びに TRY遺伝子、 CPL3遺伝子及び CPC遺伝子に対 する三重変異株においては、 根毛の数が大幅に減少しているか、 根毛が殆ど計測 されなかった。
各遺伝子の変異体、 得られた二重変異体及び三重変異体について、 トライコー ムの数を計測した結果を図 4に示す。 図 4から判るように、 cpl3- 1変異体におい ては、 cpc- 2 変異体と同様に野生型と比較してトライコーム数が増加していた。 また、 TRY遺伝子、 CPC遺伝子及ぴ CPL3遺伝子に対する三重変異体においては、 更にトライコーム数が増加していた。 さらに、 TRY遺伝子、 CPC遺伝子、 ETC1遺 伝子及び CPL3遺伝子に対する四重変異体においては、更に多くのトライコームが 形成され葉の主面全体がトライコームで覆われていた。
また、 （実験例 1) で単離した cpl3-l変異体、 及び （実験例 2 ) で作製した形 質転換体について成長を観測した。
各植物について同じ成長段階における生重量を測定した結果を図 5に示し、 各 植物の同時期における写真を図 6に示す。 図 5及び 6から分かるように、 CPL3遺 伝子を欠損する変異体は野生型と比較して大きく成長している。 これに対して、 CPL3遺伝子を過剰に発現する形質転換体は、野生型と比較して 30%程度の成長で あった。 なお、 結果を図示しないが、 CPC遺伝子、 ETC1遺伝子、 ETC2遺伝子及び TRY 遺伝子を欠損する各変異体においては、 野生型と同等の成長しか示さなかつ た。
また、 これら各植物について倍数性を検証した結果を図 7に示す。 なお、 倍数 性は、 播種から 2週間経過後の各植物について、 Ploidy Analtzer PA Flow Cytometer (Partec) を使用して製造元マニュアルに従って測定した。 図 7から分 かるように、 CPL3遺伝子を欠損する変異体においては、 16Cのピークが著しく上 昇している。 この結果から、 CPL3遺伝子を欠損する変異体は、 核内倍化が向上す ることにより細胞のサイズ向上といった表現型を示していることが示唆された。 さらに、 各植物について本葉数を測定した結果を図 8に示し、 各植物の抽台日 数を測定した結果を図 9に示す。 図 8及び 9から分かるように、 CPL3遺伝子を欠 損する変異体は、 野生型及びその他の変異体ならびに形質転換体と比較して早咲 きであった。 さらに、 各植物について、 葉及び胚軸における細胞の表現型を光学顕微鏡を用 いて観察した。 その結果を図 1 0に示す。 図 1 0から分かるように、 CPL3遺伝子 を欠損する変異体においては、野生型及び CPL3遺伝子を過剰発現する形質転換体 と比較して、 葉の表皮細胞が大きく、 且つ胚軸が長いといった特徴を示した。 ま た、 各植物について、 葉のサイズ、 上皮細胞数を計測した結果を表 2に示す。
表 2
遺伝子型 葉のサイズ 上皮細胞 上皮細胞
(mm2) (数 mm-2) /葉
Col-0 16. 8± 0. 3 181 ± 19 3035 ± 311
cpl3 19. 0± 1. 3 158± 26 3014± 535
CPL3: :CPL3 9. 5± 0. 9 311 ± 14 2960±306
なお、 上皮細胞数の測定に際しては、 播種から 2週間経過した後、 第 3葉を採 取し、 抱水ク口ラール （重量） ： グリセロール （容量） ：水 （容量） を 8： 2： 1で 含む洗浄液で洗浄し、 Zeiss Axio plan2 (Carl Zwiss、 Germany) を用いて可視化 した。 表 2の数値は、 5枚の葉について計測した平均を示している。
図 1 0及び表 2に示した結果より、 CPL3遺伝子を欠損した変異体においては、 野生型と比較して細胞数の増加は見られないものの野生型と比較して大きく成長 していることから、 野生型と比較して個々の細胞における成長が促進されている ことが明らかとなった。
〔実施例 2〕
本実施例では、 （実験例 2 ) で作製した形質転換体を用いて、 CPC遺伝子、 ETC1 遺伝子、 ETC2遺伝子、 TRY遺伝子及び CPL3遺伝子を 35Sプロモーターの制御下、 又は自身のプロモーターの制御下に過剰発現する形質転換体における根毛の数を 比較した。 結果を図 1 1に示す。 図 1 1に示すように、 35S プロモーターの制御 下に恒常的に発現する全ての形質転換体において、 野生型と比較して根毛の数が 増加した。 しかし、 35Sプロモーターの制御下に CPL3遺伝子を発現する形質転換 体においては、他の形質転換体と比較して根毛の数が増加がやや緩やかであった。 さらに、 ETC1プロモーターの制御下に ETC1遺伝子を過剰発現する形質転換体に おいては、 自身のプロモーターの制御下に過剰発現する他の形質転換体及び野生 07 070396 型と比較して根毛の数が増加した。
また、 同様にして各形質転換体におけるトライコームの数を測定した結果を図
1 2に示す。 図 1 2に示すように、 ETC2プロモーターの制御下に ETC2遺伝子を 過剰発現する形質転換体を除いて全ての形質転換体において、 トライコームが完 全に欠失していた。 ETC2プロモーターの制御下に ETC2遺伝子を過剰発現する形 質転換体も、 野生型と比較すると トライコーム数が大幅に減少していた。
〔実施例 3〕
本実施例では、 （実験例 2 ) で作製した、 各遺伝子のプロモーター制御下で GUS タンパク質を発現する形質転換体を用いて、各遺伝子の発現パターンを検討した。 その結果を図 1 3に示す。 また、 （実験例 2 ) で作製した、 各遺伝子について GFP 融合タンパク質を高発現する形質転換体を用いて、 各遺伝子産物の発現パターン を検討した。 結果を図 1 4に示す。 また、 図 1 4には、 RT- PCR 及び In situ hybridizationによつて各遺伝子の発現パタ一ンを検討した結果も示す。
図 1 3及び 1 4に示すように、 CPC遺伝子、 TRY遺伝子および ETC1遺伝子の産 物は、 若い葉のトライコーム及び根表皮における非根毛細胞 （Hairless Cell) に 特異的に蓄積していた。 また、 ETC2遺伝子及ぴ CPL3遺伝子の産物は、 葉におけ る向軸側及び背軸側の気孔孔辺細胞を含む表皮細胞に特異的に蓄積しており、 根 及びトライコームには蓄積していなかった。 特に、 ETC2遺伝子よりも CPL3遺伝 子は、 葉、 子葉、 胚軸及び葉柄における気孔孔辺細胞に限定的に発現していた。 〔実施例 4〕
本実施例では、実施例 1と同様にして同定した cpc、 try, etcl、 etc2及ぴ cP13 ノックァゥト変異体、並びに実験例 2と同様にして作製した CPL3過剰発現植物体 の開花時期及び葉数を調査した。
これらの各変異植物体の開花時期、 及び各開花時期における葉数を調査した結 果を表 3に示す。 なお、データは 1実験当たり少なくとも 10個体の植物の平均士 SDを示す。
表 3 遺伝子型 開花時期 葉数
(日）
Col-0 37. 6±0. 5 17· 4±0. 6
cpl3 28· 9±0. 5 8. 2±0. 3
cpc 39. 6±0. 5 19. 2±0. 6
try 36. 0±0. 8 14· 3±0. 6
etcl 40· 6±0. 8 19. 3±0. 8
etc2 39. 0±0. 5 14. 1 ± 1. 9
35S:CPL3 41. 1± 1. 1 28. 5± 1. 7
表 3に示されるように、 cpl3ノックァゥト変異植物体は野生型よりも早く開花 し（28. 9 ±0. 5対 37. 6±0. 5日）、葉数はより少なかった（8. 2± 0. 3対 17. 4±0. 6)。 他方、 cpc、 try, etcl及ぴ etc2変異植物体は、野生型と有意差はなかつた（表 3)。 35S : CPL3 トランスジエニック植物は野生型よりわずかに遅く開花し （41. 1 ± 1. 1 対 37. 6± 0. 5)、 葉数はより多かった （28. 5± 1. 7対 17. 4± 0. 6)。
さらに、 開花に対する CPL3遺伝子の効果を明確にするために、 花成 （開花） の 制御において中心的な役割を果たすことがわかっている FLOWERING LOCUS T (FT) , SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1 (SOCl)及ぴ CONSTANS (CO) (Bagnall, Annals of Botany 71， 75， 1993 ; Lee b , Genes & development 14, 2366-2376, 2000； Koornneef ら， Mol Gen Genet 229, 57-66, 1991) の発現を、 CPL3発現を改変した 植物系銃においてリアルタイム PCRを用いて調査した。
リアルタイム PCR は以下のように実施した。 全 RNA を RNeasy plant mini kit (Qiagen)を用いて抽出した。 オンカラム DN ァーゼ I 消化は、 RNeasy mini
Handbook に記載されるプロトコールに従って RNA精製の間に行った。 第一鎖の cDNAを、 20 し反応混合液中、 Prime Script RT regent kit (Takara) を用いて、
1 μ gの全 RNAから合成した。 リアルタイム PCRは、 SYBR Premix Ex Taq (Takara) を用いて Chromo4 Reaト Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) で実施した。 PCR増幅は、 95°C30秒の変性ステップ、 その後の 95°Cで 5秒、 60°C で 30秒の、 CPL3については 45サイクル、 C0、 FT、 S0C1及ぴ ACT2については 40 サイクルとした。 mRNAの相対レベルは、 iQ5ソフトウェア （Bio - Rad) によって計 算し、 ACT2 mRNAの濃度に標準化した。
cP13ノックアウト変異体における FT及び S0C1の発現は、 葉の発育の間、 長日 (LD)条件下で、 野生型と比較してより高かった。 21 日齢の葉において、 cpl3ノッ クアウト変異体における FTの発現は、 野生型よりも、 約 7. 5倍高く、 S0C1の発 現は 3. 2倍高かった （図 15A及ぴ 15B) 。 cP13ノックアウト変異体における CO の発現は野生型と有意差はなかった （図 15C) 。 これらの結果は、 FT 及び S0C1 発現を抑制することによる開花調節に CPL3が関与していることを示す。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 野生型と比較して、 より大きな形態又はより早い開花時期を 示す新規な変異植物体及びその製造方法を提供することができる。 本発明に係る 変異植物体によれば、 野生型と比較して大きな形態を示すため、 例えば、 植物体 から抽出される物質の生産性を向上させることができる。 また本発明に係る変異 植物体によれば、 野生型と比較してより早い開花時期を示すため、 果実や種子の 形成を促進でき、 例えば通常年一回しか収穫できない作物が複数回収穫可能であ る。 またこのような本発明の変異植物体の性質により、 作物の収穫までにかかる 時間ゃコストの削減が可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 以下のいずれか 1記載のタンパク質の機能を抑制した変異植物体。
( 1 ) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
( 2 ) 配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1又は複数のアミノ酸が置換、 欠 失、 付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、 表皮細胞分化を制御する転写因 子として機能するタンパク質
( 3 ) 配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて 1又は複数 の塩基が置換、 欠失、 付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドに よってコードされ、 表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
2 . 上記 （1 ) 〜 （3 ) のいずれか 1記載のタンパク質をコードする遺伝子 を欠損していることを特徴とする請求項 1記載の変異植物体。
3 . 双子葉植物であることを特徴とする請求項 1記載の変異植物体。
4 . アブラナ科植物であることを特徴とする請求項 1記載の変異植物体。
5 . 対象とする植物における以下のいずれか 1記載のタンパク質の機能を抑 制する、 変異植物体の製造方法。
( 1 ) 配列番号 2に示すァミノ酸配列からなるタンパク質
( 2 ) 配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1又は複数のアミノ酸が置換、 欠 失、 付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、 表皮細胞分化を制御する転写因 子として機能するタンパク質
( 3 ) 配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて 1又は複数 の塩基が置換、 欠失、 付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドに よってコードされ、 表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
6 . 上記 （1 ) 〜 （3 ) のいずれか 1記載のタンパク質をコードする遺伝子 を欠損させることを特徴とする請求項 5記載の変異植物体の製造方法。
7 . 上記対象とする植物は双子葉植物であることを特徴とする請求項 5記載 の変異植物体の製造方法。
8 . 上記対象とする植物はアブラナ科植物であることを特徴とする請求項 5 記載の変異植物体の製造方法。
9 . 対象とする植物における以下のいずれか 1記載のタンパク質の機能を抑 制することを特徴とする、 野生型と比較して、 より大きな形態又はより早い開花 時期を示す変異植物体の製造方法。
( 1 ) 配列番号 2に示すァミノ酸配列からなるタンパク質
( 2 ) 配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1又は複数のアミノ酸が置換、 欠 失、 付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、 表皮細胞分化を制御する転写因 子として機能するタンパク質
( 3 ) 配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて 1又は複数 の塩基が置換、 欠失、 付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドに よってコードされ、 表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
1 0 . 上記 （1 ) 〜 （3 ) のいずれか 1記載のタンパク質をコードする遺伝 子を欠損させることを特徴とする請求項 9記載の変異植物体の製造方法。
1 1 . 上記対象とする植物は双子葉植物であることを特徴とする請求項 9記 载の変異植物体の製造方法。
1 2 . 上記対象とする植物はアブラナ科植物であることを特徴とする請求項 9記載の変異植物体の製造方法。
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