WO2008056827A1 - Procédé pour la production d'une bétaïne - Google Patents

Procédé pour la production d'une bétaïne Download PDF

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WO2008056827A1
WO2008056827A1 PCT/JP2007/072237 JP2007072237W WO2008056827A1 WO 2008056827 A1 WO2008056827 A1 WO 2008056827A1 JP 2007072237 W JP2007072237 W JP 2007072237W WO 2008056827 A1 WO2008056827 A1 WO 2008056827A1
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halo
halogen atom
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Kosuke Oishi
Eiji Sato
Hiroyuki Mori
Akira Yoshioka
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Mitsubishi Chemical Corp
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Mitsubishi Rayon Co Ltd
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    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
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    • C07C231/12—Preparation of carboxylic acid amides by reactions not involving the formation of carboxamide groups
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    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C235/06—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing betaine, in particular calcutin.
  • L-Carrotin a kind of betaine, is also called vitamin B T and is an important compound involved in the metabolism of fatty acids in vivo.
  • Heart disease therapeutic agent Japanese Patent Laid-Open No. 5-4-
  • hyperlipidemia treatment agent Japanese Patent Laid-Open No. 54-13-1340 9
  • venous disease treatment agent Japanese Patent Laid-Open No. 5-8-8 8 3 1 2
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 5 7-1 6 5 3 5 2 describes a method for obtaining L-carnitine from D-mannitol as a raw material.
  • 7 2 9 8 3 includes (R, S) 1, 3, 4-epoxybutyric acid ester as a starting material and (R) — 3, 4-epoxybutyric acid ester.
  • the step of introducing a quaternary amino group using trimethylamine into the C 4 skeleton in the carnitine production process is an unavoidable important step, and the yield of this step is the overall yield. Often has a large impact on rate.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2-1 4 2 7 5 8 describes 4 halogenated 3- A method is shown in which methylbutyrate is quaternized with trimethylamine in a ketone solvent and the resulting butyrate derivative is hydrolyzed.
  • This quaternized amination reaction uses alcohol trimethylamine as an alcohol solvent and is allowed to react in an autoclave at a temperature as high as 80 ° C.
  • the dehydration of 4-hydroxygeno-3-hydroxybutyrate proceeds. Therefore, the selectivity is extremely low, about 30-40%, and the reaction time is as long as 20 hours or more. Although it is described that the selectivity is improved by using a ketone solvent, although the selectivity is greatly improved, the reaction time is further increased, and even if it exceeds 50 hours, 4-halogeno 3-hydroxybutyric acid is used. The conversion rate of methyl is only about 80%. When ether type, toluene or the like is used as the solvent, the reaction time is further delayed and the selectivity is not high.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-27995 describes a method of adding quaternary amination by adding 30% trimethylamine aqueous solution to ⁇ -chloro-) 3-hydroxybutyronitrile. After standing overnight at 4 ° C, the solid obtained by filtering the reaction solution under reduced pressure is only about 75% yield of carnitine nitryl chloride with a purity of 100%. I can't say that.
  • JP-A-60-2 5 848 7 4-chloro-3-hydroxybutyronitrile is added with a large excess of anhydrous trimethylamine and reacted in an autoclave at 100 ° C. without solvent.
  • the quaternary amination process with trialkylamine which significantly affects the overall yield in the production process of carnitine and other betaines, is based on the conventional 4-monohalogeno 3-methylhydroxybutyrate ⁇ -chloro-hydroxyl
  • side reactions often proceed, making it difficult to obtain the desired quaternary amination product in high yield. Disclosure of the invention
  • the present invention aims to prevent side reactions significantly in the quaternary amination process, which is important in the production process of betaine such as carcin, and to obtain betaine such as cartine with high yield. To do.
  • AA 2 and A 3 are each independently the same or different and may have a substituent; ⁇ Hydrocarbon group, X 1 is a halogen atom. ]
  • a process for producing a 4-trialkylamino hydride represented by the formula 3-hydroxybutane halide (2) The method according to (1), wherein the trialkylamine is selected from the group consisting of trimethylamine, triethylamine, and triptylamamine.
  • a 1 A 2 and A 3 are each independently the same or different and may have a substituent.
  • X 1 is a halogen atom.
  • a 1 A 2 and A 3 are each, independently of one another, identical or different, Ji ⁇ which may have a substituent 2. It is a hydrocarbon group.
  • the nitrile hydratase is a genus of Achr omo bacter, genus Acido V ora X, genus Agrobacteri um, genus Arthrobacter, The genus Bacillus (B aci 1 1 us), the genus Brevibacterium, the genus Burkholderia, the genus C andida, the genus Caseobacter, the comamonas ( Comamo nas), Corynebacteri um, Dietzia, En terobacter, Erwinia (E rw 1 n 1 a) 3 ⁇ 4, N.
  • X 1 has the above-mentioned meaning.
  • X 2 is the same or different haguchigen atom independently of X 1 .
  • the halohydrin epoxidase is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium, Microbacteiiumj, Agronocterium, Mycobacterium, or Arthrobacter.
  • trialkylamine which is important in the production process of betaine such as carcin is used.
  • 4-halogenated 3-hydroxybutane amide as a substrate, the production of crotonic acid derivatives, which are the main by-product, can be greatly suppressed compared to the conventional method. It becomes possible to produce a carnitine or other betaine at a high rate.
  • AA 2 and A 3 are each independently the same or different, and are optionally substituted C 1 to C 2 Q hydrocarbon groups, and X 1 is a halogen atom. is there.
  • AA 2 and A 3 are each, independently of one another, identical or different, ⁇ may have a substituent ⁇ 2. It is a hydrocarbon group, and X 1 is a halogen atom. ]
  • ⁇ ⁇ 2 and ⁇ 3 are each independently the same or different and may have a substituent. It is a hydrocarbon group.
  • a method for producing betaine or a salt of betaine is provided.
  • a process for producing a bein represented by the following formula (1) comprising a step of quaternizing an amide represented by the following formula (2) and a step of hydrolyzing an amide group.
  • the present invention provides a method for producing betaine represented by the following formula (1), which comprises a step of quaternizing an amide represented by the following formula (2).
  • AA 2 and A 3 are each independently Ci Cs, which may be the same or different and may have a substituent. It is a hydrocarbon group.
  • hydrocarbon group of “hydrocarbon group” may be a sum or unsaturated acyclic group, or a saturated or unsaturated cyclic group. C 1 ⁇ c 2. When the hydrocarbon group is acyclic, it may be linear or branched. “Ci to C 2. Hydrocarbon group” includes C i to C 2 . Alkyl groups, C 2 ⁇ C 2. Alkenyl group, c 2 ⁇ c 2. Alkynyl group, c 4 ⁇ c 2. Alkyl Jenny Le group, c 6 to c 18 Ariru group, C 7 -C 20 alkyl ⁇ aryl group, C 7 ⁇ C 2. Aryl alkyl group, C 3 to C 20 cyclic alkyl group, C 4 to C 2 . A cycloalkenyl group, (Cg Ci. Cycloalkyl) C-dialkyl group, and the like.
  • rc c ⁇ alkyl group means C Ci. It is preferably an alkyl group, Re is more preferably a C 1 -C 6 alkyl group.
  • ⁇ / kill groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl, isopropylene, n-butinole, sec-butyl, tert-butyl, pentinole, hexyl, dodecanyl, etc. .
  • alkenyl group is C 2 -C 1 . It is preferably an alkenyl group, and more preferably a 0 2 to 6 alkyl group. Examples of alkenyl groups include, but are not limited to, vinyl, 1-propenyl, 2-propenyl, iso-propyl, 2-butenyl and the like.
  • C 2 -C 2. Alkyl group is Cs Ci. It is preferably an alkynyl group, more preferably a C 2 to C 6 alkynyl group. Examples of alkyl groups include, but are not limited to, ethynyl, probule, and petityl.
  • alkylgenyl It is preferably a genyl group, and more preferably a C 4 -C 6 alkyl genyl group.
  • alkylgenyl groups include, but are not limited to, 1,
  • C 6 -C 18 aryl group is preferably a C 6 -C 12 aryl group.
  • aryl groups include, but are not limited to, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, indul, biphenylyl, anthryl, phenanthryl, and the like.
  • Alkylaryl group is preferably a c 7 to c 12 alkylaryl group.
  • alkylaryl groups include, but are not limited to: o-trinole, m-trinole, ⁇ -trinole, 2,3-xylyl, 2,4-xylyl, 2,5-xylinole, o-cumenore, m-Kume-Nole, p-Tameninole, mesityl and the like.
  • Arylalkyl group is preferably a c 7 -c 12 aryl alkyl group.
  • arylalkyl groups include, but are not limited to, benzyl, phenethylenore, dipheninolemethyl, tripheninolemethinole, 1-naphthylmethinole, 2-naphthinoremethinole, 2,2-diphenenoreethino. Les, 3-phenylpropyl, 4-phenylbutyl, 5-phenylpentyl, and the like.
  • Cycloalkyl group is Cs Ci.
  • a cycloalkyl group is preferred. Examples of cycloalkyl groups include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and the like.
  • C 4 -C 20 cycloalkenyl group is preferably a C 4 -C 10 cycloalkenyl group.
  • cycloalkenyl groups include, but are not limited to, cycloprobes, cyclobutyrs, cyclopentenyls, cyclohexenyls, and the like.
  • a substituent may be introduced into the “hydrocarbon group”.
  • This substituent for example, Anorekokishi group (e.g., main butoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, etc.), C 6 ⁇ 2 Ariruokishi group (e.g., Fueniruokishi, Nafuchiruokishi, biphenyl Okishi etc.), an amino group, a hydroxyl group, a halogen atom (e.g., fluorine, chlorine, bromine, Iodine) or a silyl group.
  • one or more substituents may be introduced at substitutable positions, and preferably 1 to 4 substituents may be introduced. When the number of substituents is 2 or more, each substituent may be the same or different.
  • AA 2 and A 3 are each independently the same or different and are each a C 1 to C 20 alkyl group, a C 3 to C 20 cycloalkyl group, or a C 6 to C 18 aryl group.
  • it is a group.
  • a salt of betaine is a salt of betaine with a mineral acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or nitric acid, a salt with an organic acid such as fumaric acid or tartaric acid, a base such as sodium hydroxide or potassium hydroxide.
  • a mineral acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or nitric acid
  • a salt with an organic acid such as fumaric acid or tartaric acid
  • a base such as sodium hydroxide or potassium hydroxide.
  • X 1 represents a halogen element, and is a force showing fluorine, chlorine, bromine or iodine, and is more preferably chlorine or bromine from the viewpoint of availability.
  • the aqueous solvent means water or a mixture of water and an organic solvent. is there.
  • the water and organic solvent may be a two-phase system.
  • alcohol solvents such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol and propanol
  • keton solvents such as acetone and methylisobutylketone, ethyl acetate, ethyl propionate
  • metathalic acid Ester solvents such as methyl, hydrocarbon solvents such as pentane, hexane and heptane, aromatic solvents such as benzene, toluene and xylene, chlorine solvents such as dichloromethane and chloroform, acetonitrile and dimethylform Examples thereof include amide, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, and the like, and a mixed solvent thereof may be used.
  • an alcohol solvent having high solubility in water acetonitrile, dimethylformamide, or dimethyl sulfoxide. It is more preferable to use an organic solvent as long as it is soluble in water, and it is particularly preferable to use water alone because the reaction rate increases when the amount of water is large.
  • the production method of the present invention includes a step of passing through 4-halo-3-hydroxybutane amide represented by the following formula (2).
  • “via” means that when an amide represented by the following formula (2) is used as a starting material, and other substances are used as a starting material, but an intermediate represented by the following formula (2): Meaning both via the indicated amide.
  • the production method of 4-halo-3-hydroxybutane amide represented by the above formula (2) is particularly there is no limit.
  • a method obtained by chemical reaction a method of converting to an amide using an ester and ammonia, a method of converting to an amide using an acid halide and ammonia, and a conversion of -tolyl to an amide using an acid or base as a catalyst. Any method can be used.
  • a method for converting nitrile to amide a method using mineral acid such as hydrochloric acid, a method using hydrogen peroxide and an alkali, a method using manganese dioxide, etc. are known. It may be used.
  • the 4-halo-3-hydroxyptyramide represented by the above formula (2) is produced by amidating the 4-halo-3-hydroxypropylonitrile represented by the above formula (3) by the action of nitrile hydratase. You can also. Since this reaction can be carried out under mild conditions, it is possible to suppress the progress of side reactions when using an acid / base catalyst that requires strict conditions or complicated operations.
  • the method for producing 4-halo-3-hydroxypetit-tolyl which is a precursor of the amide represented by the above formula (2).
  • epihalohydrin represented by the following formula (4) A method of synthesizing from hydrocyanic acid (shown in Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 2 — 2 4 1 3 5 7), a method of synthesizing from Epihaguchi hydrin and cyanate (Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 4 — 1 8 2 6 0 7),
  • X 1 has the above-mentioned meaning.
  • X 2 is independently the same as X 1 and is the same or different halogen atom.
  • cyanate it is preferable to use an alkali metal salt of hydrocyanic acid, and it is more preferable to use 'NaCN, KCN, or LiCN.
  • an optically active epihalohydrin represented by the formula (4) it is also possible to produce an optically active 4-monohalo-3-hydroxypetit nitrile.
  • the halohydrin epoxidase is prepared from the 1,3-dihalo-2-propanol represented by the above formula (5) from the 1,3-dihalo-2-propanol represented by the above formula (4).
  • the 1,3-dihalo-2-propanol represented by the above formula (4) There is no particular limitation as long as it has a function of generating nitrile.
  • Microorganisms producing halohydrin epoxidase include the genus Corynebacterium, the genus Microbacterium, the agropa It is a microorganism belonging to the genus Cterium, the genus Mycobacterium and the genus Arthrobacter.
  • microorganisms include Corynebacterium sp.N-1074 (FEEM BP-2643), Microbacterium sp.N-4701 (FERM BP-2644), Agrobacteriu radiobacter AD 1, Mycobacterium sp.GPl, Arthrobacter sp.AD2, and the like.
  • Particularly preferred microorganisms are Corynebacterium sp. N-1074 (FERM BP-2634), and Microbacterium sp. N-4701 (FERM BP-2644).
  • N-4701 shares have been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology), Biological Depositary Center (1-1-1 Tsukuba, Tsukuba 1-1-1) on April 19th, 1999.
  • the accession numbers are FERM BP-2643 and FERM BP-2644.
  • microorganisms obtained by cloning and transforming (introducing) the halohydrin epoxidase gene of the above microorganism are also included as microorganisms producing the above halohydrin epoxidase.
  • halohydrin epoxidase gene is published in, for example, GenBank, and the accession number of the halohydrin epoxidase gene (hheB) derived from Corynebacterium sp. (Corynebacterim) N-1074 is D90350.
  • the halohydrin epoxidase according to the present invention can be obtained by culturing a microorganism having halohydrin epoxidase activity prepared by the above-described method and collecting it from the culture.
  • a medium for culturing microorganisms having halohydrin epoxidase activity a medium that contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by microorganisms and that can efficiently culture transformants. If so, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source include carbohydrates such as gnolecose, fructose, sucrose, and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol.
  • Nitrogen sources include inorganic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate.
  • Ammonium salt of acid or other nitrogen-containing compounds peptone, meat extract, corn steep liquor and the like.
  • the inorganic substance include potassium phosphate, potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, or calcium carbonate.
  • the above microorganisms may be cultured by a conventional method, for example, aerobically cultured at a pH of 4 to 10 and a temperature of 10 to 45 ° C. for 10 to 180 hours. Culturing can be performed by either liquid culture or solid culture.
  • the transformant is preferably cultured at 30 to 40 ° C. under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture.
  • antibiotics such as ampicillin or kana machine and inducers may be added to the medium as needed.
  • the culture obtained by culturing the halohydrin epoxidase prepared by the above method or its treated product is an epihalohydrin represented by the above formula (4) or 1,3-dihalo-2-propanol represented by the above formula (5). From 4 1-halo 3-hydroxy ptyronitrile can be produced.
  • “Processed product” means a microbial cell extract, such as a crushed cell product, a microbial cell treated with a drug, an immobilized microbial cell, or a crude enzyme / purified enzyme.
  • the solvent for the reaction solution is not particularly limited, but the aqueous solvent is generally used.
  • water is preferable, and water or a buffer solution having an optimum enzyme activity pH of about 4 to 1 ° is used.
  • a buffer solution composed of a salt such as phosphoric acid, boric acid, citrate, dartaric acid, malic acid, malonic acid, 0-phthalic acid, succinic acid or acetic acid, ris buffer or Good
  • a buffer solution or the like is preferable.
  • the reaction temperature is preferably 5 to 50 ° C., and the reaction pH is preferably 4 to 10.
  • the reaction temperature is more preferably 10 to 40 ° C.
  • the reaction pH is more preferably pH 6-9.
  • the reaction time is selected as appropriate depending on the concentration of the substrate, etc., the bacterial cell concentration, or other reaction conditions, but it is preferable to set the conditions so that the reaction is completed in 1 to 120 hours. In this reaction, the reaction can proceed more smoothly by neutralizing the chlorine ions produced as the reaction proceeds with an appropriate strength.
  • Cyanide compounds include hydrogen cyanide, potassium cyanide, and sodium cyanide.
  • a compound that generates cyanide ion (CN-) or hydrogen cyanide or a solution thereof when added to a reaction solution such as trium, cyanic acid, or acetone cyanhydrin can be used.
  • the substrate concentration in the reaction solution is preferably from 0.01 to 20 (W / V)%, particularly preferably from 0.01 to L0%, from the viewpoint of enzyme stability. .
  • the amount of cyanide used is preferably 1 to 3 times the amount of the substrate (mole) from the viewpoint of enzyme stability.
  • the 4-halo-3-hydroxypropylonitrile represented by the above formula (3) produced by the method as described above can be collected and purified using a known method. For example, after removing the cells from the reaction solution using a method such as centrifugation, extraction with a solvent such as ethyl acetate and removal of the solvent under reduced pressure results in 4 hello 3-hydroxypropylonitrile. You can get syrup. Coloring often occurs and the reaction solution turns brown, but decolorization may be performed using activated carbon or the like. Further, these syrups can be further purified by distillation under reduced pressure.
  • the optical purity of the reaction is mild under the conditions, so that the optical purity can be reduced to betaine without lowering the optical purity. It is possible to manufacture.
  • nitrile hydratase is not particularly limited, but is an enzyme that catalyzes a reaction for converting nitrile of 4-halo-3-hydroxypropylonitrile represented by the above formula (3) to amide. According to international enzyme classification, it is an enzyme belonging to lyase.
  • Microorganisms having nitrile hydratase used in the present invention include, for example, the genus Achromobacter, the genus Acidovorax, the genus Agrobacterium, the genus Arthrobacter, the batinoles.
  • Microbial strains assigned ATCC numbers can be easily obtained from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • Microorganisms with I FO numbers are listed in “List of Cultures, 8th edition, 1st edition (1 98 8) J” published by Fermentation Research Institute (IFO). Is available from the Genetic Resource Conservation Division, Biological Resources Division, Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Technology, I.
  • Microorganisms with AM numbers can be obtained from the Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo J Numbering These microorganisms are described in the “Catalog of strains 4th edition (1 9 8 9)” issued by the Institute of Physical and Microbiology, RIKEN, and can be obtained from the Institute of Microorganisms of RIKEN.
  • Microorganisms with HUT numbers are listed in “Catalogue of Cultures, 4th edition (1 9 8 7) j” issued by the Japan Microbial Conservation Federation (J FCC) and can be obtained from the Faculty of Engineering, Hiroshima University. The attached microorganism can be obtained from the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • nitrile hydratase for use in the present invention, further Yamada et al Rhodococcus rhodochrous J one 1 CFERM No. BP-1478 isolated from soil], ⁇ beauty ground port Pakuta S p. SK 1 0 3 [FERMP- 11300), Caseopactor sp. BC 2 3 [FERM P-11261], Syudumonas sp. BC 1 5-2 FERMBP-3320], Syudumonas s p. SK 3 1 [FERMP-11310], Syudomonas s p. S K8 7 [FEBM P-11311], Syudomonas sp.
  • microorganisms cloned and transformed (introduced) by cloning the nitrile hydratase gene of the above-mentioned microorganisms are also included as microorganisms producing the above-mentioned utriyl hydratase.
  • Escherichia coli M 10822 strain (FERM BP-5785)
  • the medium composition for culturing the microorganism producing nitrinole hydratase used in the present invention is not particularly limited, and any medium can be used as long as these microorganisms can normally grow.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, and maltose as carbon sources
  • organic acids such as acetic acid and citrate
  • alcohols such as ethanol and glycerol
  • peptone meat extract, yeast extract, and protein hydrolysate
  • various inorganic and organic acid ammonium salts can be used.
  • inorganic salts, trace metals, vitamins, etc. are used as needed.
  • various nitrile compounds such as 4-chloro-3-hydroxypropylonitrile, propionitol, isobutyric-tolyl, benzyl cyanide, etc.
  • various amide compounds such as hydroxybutamide, propionamide, and isobutaneamide to the medium.
  • the microorganisms may be cultured by a conventional method.
  • the microorganisms are aerobically cultured at a pH of 4 to 10 and a temperature of 10 to 45 ° C. for 10 to 180 hours. Culturing can be performed by either liquid culture or solid culture.
  • an enzyme is allowed to act on 4-halo-3-hydroxypropylonitrile.
  • the method for obtaining 4-halo-3-hydroxybutane amide is not particularly limited, but was obtained by culturing the microorganisms that produced nitrile hydratase obtained as described above or by centrifugation.
  • a method for adding a substrate to a suspension of bacterial cells, a substrate for a suspension of the above-mentioned microorganism treated product for example, crushed bacterial cells, bacterial cell extract, etc.
  • reaction solution adding a substrate to the culture solution when cultivating microorganisms, and simultaneously with the culture Method of performing reaction, microbial culture solution obtained by preparing an aqueous solution of the substrate as described above, microbial cells, processed microbial cells, nitrile hydratase crude enzyme, purified enzyme, or immobilizing them thing
  • the amidation reaction is an exothermic reaction, and the reaction rate is increased by adding a suspension of bacterial cells to the substrate aqueous solution to prevent runaway reaction due to the exotherm. It is preferable to control.
  • the following amidation reaction with nitrile hydratase may be performed.
  • the cyanide compound remaining in the system often deactivates the nitrile hydratase.
  • the amidation reaction of 4-halo-3-hydroxybutyronitrile does not proceed rapidly even when the concentration of hydrocyanic acid in the system is 1 ppm or less, heat-treat the 4-halo-3-hydroxybutyronitrile or its solution. By doing so, the amidation reaction may proceed rapidly.
  • the heating method is not particularly limited as long as the object of the present invention is achieved, and any of pressurization, decompression, and normal pressure conditions can be selected.
  • the solution may be an organic solvent, an aqueous solution, or a mixture thereof.
  • the amidation reaction is usually performed in an aqueous solvent, it is possible to perform the reaction continuously.
  • Heat treatment is preferably performed in an aqueous solvent.
  • the calorie heat time is about 0.1 to 100 hours, preferably 0.5 to 50 hours, and more preferably 1 to 10 hours.
  • the heating temperature can be in a range from about 40 ° C. to a temperature at which 4 1-halo 3-hydroxyptyronitrile does not decompose, and is preferably 60 to: 150 ° C. 4
  • the pH is preferably in the neutral to acidic range, and more preferably in the pH range from 1 to 7, in order to prevent premature rectification.
  • the cyanide ion contained in a very small amount in 4-halo-3-hydroxybutyronitrile is reduced to a metal complex, thereby allowing the amidation reaction to proceed rapidly.
  • a metal that reacts with hydrocyanic acid to form a metal cyanide complex is converted into a solution containing the nitrile or the -tolyl as a metal salt.
  • cyanide is converted to a metal cyanated complex by addition.
  • the metal cobalt, nickel, and zinc are preferable, and the form of the salt is not particularly limited, but examples thereof include nitrate, chloride, sulfate, and carboxylate. A hydrate may also be used.
  • the conditions for the amidation reaction with nitrile hydratase in the present invention are not particularly limited, and the reaction temperature is appropriately determined depending on the enzyme used. In general, it is the temperature at which the reaction solution does not freeze ⁇ 50 ° C. The temperature at which the reaction solution does not freeze depends on the reaction solution in which the amidation reaction is performed. If the reaction is a dilute solution, the temperature can be calculated from the molar concentration (mol / kg) of the solute dissolved in the reaction solution and the value of the molar freezing point depression of the solvent.
  • the amidation reaction of 4-halo-3-hydroxyptyronitrile to 4-halo-3-hydroxybutanamide is carried out in order to suppress the progress of side reactions.
  • the temperature at which the reaction solution does not freeze is preferably about 30 ° C., and the temperature at which the reaction solution does not freeze is particularly preferably about 5 ° C.
  • 4-Halo 3-Hydroxyptyronitrile concentration is not particularly limited, but is usually about 0.11 to 50 (W / V)%, and about 0.1 to 40% is more preferable.
  • the pH of the reaction solution is preferably in the range of 4 to 10, more preferably 6 to 9.
  • reaction time varies depending on the substrate concentration, bacterial cell concentration, and other reaction conditions
  • the 4-halo-3-hydroxybutanamide synthesized as described above can be isolated and purified according to conventional methods such as extraction, column separation, and recrystallization. When a microorganism having nitrile hydratase is used, the cells may be filtered after completion of the reaction. However, 4-halo-3-hydroxybutanamide is unstable in an aqueous solution and should be filtered at a low temperature. There is a need to do. It is more preferable to operate at about 0 to 10 ° C.
  • 4-halo-3-hydroxybutanamide is also an optically active substance. If one of them is excessive, the optical purity can be improved by performing a recrystallization operation of 4-halo-3-hydroxybutane amide.
  • racemic 4-halo-3-hydroxybutanamide is produced, optically active 4-halo-3-hydroxybutanamide can be obtained using an optical resolving agent.
  • the 4-halo-3-hydroxybutaneamide represented by the above formula (2) used in the present invention may be a purified one, or may be in the state of an aqueous solution after the action of etryl hydratase. .
  • isolation and purification may cause further reaction and decrease yield.
  • isolation and purification by column purification, etc. is complicated and has an isolation and purification yield of about 80%, and considering the total yield up to the final product, nitrinorehydratase is effective. It is preferable to use the aqueous solution after the treatment as it is.
  • 4-halo-3-hydroxybutane amide is unstable in aqueous solution, so in order to suppress side reactions, within 48 hours after the production of 4-halo-3-hydroxybutanamide is completed. It is more preferable to proceed to a quaternary amination reaction with trialkylamine, particularly preferably within 10 hours. It is preferable to keep the temperature of the reaction-terminated liquid at 0 to 10 ° C. until contact with trial alkylamine.
  • the method for producing betaine represented by the following formula (1) preferably includes a step of quaternizing an amide represented by the following formula (2) and a step of hydrolyzing the amide group. . Since various side reactions occur in the hydrolysis reaction of compound (2), the 4-quaternary amination step is performed first from the viewpoint of yield improvement, and 4-trialkylamino-3-hydroxybutane represented by compound (2 ') is used. Produce amide halide followed by hydrolysis step.
  • X 1 , A 1 , A 2 and A 3 have the above-mentioned meanings.
  • a trialkylamine such as trimethyl / reamine, triethylamine, or triptylamin in the step of quaternizing the amide represented by the above formula (2).
  • the trialkylamine used in the present invention may be in an anhydrous state or an aqueous solution.
  • the solvent is not particularly limited, but the aqueous solvent is used. It is preferable.
  • the trialkylamine used in this reaction may be anhydrous trialkylamine. Either one of these aqueous solutions may be used. However, when an organic solvent compatible with water is used as the solvent for the 4-halo-3-hydroxybutane amide solution, it is better to use a trialkylamine aqueous solution. And the reaction rate is higher, and it is more preferable to perform the reaction using water alone, so that a higher yield and a higher reaction rate can be obtained.
  • the concentration of 4-halo 3-hydroxybutane amide in the quaternary amination reaction is not particularly limited, but is usually about 0.1 to 50%, more preferably about 1 to 20 ° / 0. .
  • the amount of trialkylamine used is not particularly limited, but is usually 1.0 to 20.0 equivalents (mole) based on 4 1-halo 3-hydroxybutanamide, and 1.1 to About 8.0 equivalent is more preferable.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but is usually about 10 ° C to 60 ° C, more preferably about 0 ° C to 50 ° C.
  • the quaternary amination reaction it may be colored brown.
  • a decolorization operation with activated carbon or the like may be performed.
  • the 4-trialkylamino 1-3-hydroxybutane amide halide represented by the above formula (2 ′) synthesized as described above is subjected to conventional methods such as extraction, column separation, recrystallization, electrodialysis, and ion exchange. It can be isolated and purified.
  • the optically active form of 4-halo-3-hydroxybutyronitrile or 4-nobutaguchi 3-hydroxybutaneamide is used as a precursor or substrate for quaternary amination
  • the above formula (2 ') The 4-trialkylamino-3-hydroxybutane amide halide represented by) is also an optically active substance.
  • the 4-trialkyl represented by the above formula (2 ') The optical purity can be improved by performing a recrystallization operation of the killamino-3-hydroxybutane amide halide.
  • the quaternary amination reaction consists mainly of a reaction in which a dehydrochlorination reaction occurs from a halohydrin compound to produce an epoxy compound, followed by a nucleophilic attack of trialkylamine to produce a quaternary amination product.
  • the isomerization reaction to the acid derivative is a side reaction.
  • the susceptibility of this crotonic acid derivative to the isomerization reaction determines the yield of the quaternary amination product, and it is the electron withdrawing property of the functional group that determines the ease of the isomerization. It is expected to be. Amides have lower electron-withdrawing properties than functional groups such as nitrinole and esters, and isomerization to crotonic acid derivatives is unlikely to occur. For this reason, the ratio of the isomerization reaction from the epoxy compound to the cutotonic acid derivative decreases, and the ratio of nucleophilic attack of the trialkylamine increases accordingly, resulting in a high yield of quaternary amination. It is assumed.
  • the method of the hydrolysis reaction is not particularly limited, and an acid catalyst, Various known methods using a base catalyst can be used.
  • Japanese Patent Publication No. Sho 4 3-2 6 8 4 9 Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 5 5-1 3 2 9 9 has a hydrolysis reaction using oxalic acid
  • Japanese Patent Publication No. Sho 4 3-2 6 8 5 0 has A method of hydrolysis using n-butyl nitrite, glacial acetic acid and hydrochloric acid gas
  • alkali metal hydroxides are alkaline earths from carnitine nitrile chloride.
  • a method of hydrolysis to nitrile ⁇ amide ⁇ carboxylic acid using a base catalyst such as metal hydroxide is shown.
  • JP-A-4-3 2 0 6 7 9 discloses a method using an enzyme that converts rutile amide to L-carnitine. It is limited to any method of acid catalyst, base catalyst and enzyme catalyst. Is not to be done.
  • the main by-product in the hydrolysis reaction of 4-trialkylaminos 3-hydroxybutane amides is crotonobetaine, a dehydrated form.
  • the basic substances used are alkali metal hydroxides, alkaline earth metal hydroxides, alkaline earth metal carbonates or bicarbonates, tertiary amines, quaternary ammonium hydroxys. de, include such basic anion exchange resin, in particular NaOH, KOH, C a (OH ) 2, Na 2 C_ ⁇ 3, K 2 C0 3, triethyl Chiruamin, NH 4 OH, an anion exchange resin IRA-400. These may be used alone or in combination of two or more. In particular, Na OH and KOH are preferable because the reaction can proceed efficiently even at room temperature and there are few by-products of crotonobetaine.
  • the amount of acid and base used may be added so as to be equimolar or more with respect to the 4-monoalkylamino-3-hydroxybutanamide halide represented by the above formula (2 ′). 1.1-5. About 0 equivalent is more preferable.
  • the concentration of the 4-trialkylamino-3-hydroxybutane amide halide represented by the above formula (2 ′) is not particularly limited, but is usually about 1 to 50%, more preferably about 5 to 30%.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but usually 5 to 100 ° C is preferable. When an acid catalyst is used, the production of crotonobetaine is extremely small, so 60 to 100 ° C. is particularly preferable from the viewpoint of reaction time.
  • aqueous solvent is preferable and it is especially preferable to use water alone as a solvent from a viewpoint of reaction rate and side reaction suppression. Further, when the quaternary amino reaction is carried out with an aqueous solvent, it is more preferred to carry out the hydrolysis reaction with an aqueous solvent as it is.
  • the hydrolysis reaction may be colored pale brown. It may also be colored after neutralization after completion of the hydrolysis reaction. For this decolorization, you can also perform a decoloring operation with activated charcoal.
  • Betaine obtained as described above can be isolated and purified according to conventional methods such as extraction, column separation, recrystallization, electrodialysis, and ion exchange.
  • Halo 3-hydroxybutane amide, 4 trialkynoleamino 1-hydroxybutanamide halide, and betaine can be used to improve optical purity by recrystallization operation, etc. Although it is possible, by-products are generated in each reaction step, and it is more preferable to perform the optical purity improving operation collectively by recrystallization operation that also serves as a purification after producing betaine.
  • an optically active epihalohydrin, 4-halo-3-hydroxybutyronitrile risole, 4-halo-3-hydroxybutane amide, 4-trianoloxylamino 3-hydroxybutane amide halide are produced.
  • betaine the corresponding optically active bein can be produced without degrading the optical purity. That is, the present invention is useful as a method for producing optically active betaine, particularly L-carcin.
  • DC P 1,3-dichloro-2-propanol
  • ECH Epoxychlorohydrin
  • CHBN 4-chloro-3-hydroxybutyronitrile
  • CHBA 4-chloro-3-hydroxybutanamide
  • HCAm 4-hydroxycrotonamide
  • C a r Carnitine-tolyl chloride
  • C a r Car-tin
  • C a r Carnitine
  • CB Crotonobetaine
  • HP LC system used in this analysis is as follows.
  • Kahum--Bun temperature 40 ° C
  • optical purity of L-carnitine is expressed by the following formula from the ARE A of D, L-caretine.
  • a closed glass flask equipped with a stirrer, dropping funnel, thermometer and pH meter was charged with 262.3 g of epichlorohydrin and 700 g of water under a nitrogen atmosphere, and reacted at 40 ° C under stirring. While controlling the pH of the solution to be 8, adjust 32.6 wt% sodium cyanate aqueous solution 432.3 g (2.7 mol) and 65 wt% sulfuric acid aqueous solution 203.7 g (1.35 mol 1) for 3 hours. It was dripped at the same time. After the dropwise addition, the mixture was reacted at 40 ° C for 5 hours with stirring. Next, with the glass flask sealed, ethyl acetate 25 Om 1 was added and extraction was performed at 40 ° C.
  • the contents were transferred to a separatory funnel to obtain an organic layer.
  • the obtained organic layer was concentrated under reduced pressure at 50 ° C., and further distilled under reduced pressure to obtain 190.6 g of CHBN.
  • the actual yield of the obtained CHBN was 58.1%.
  • Escherichia coli with halohydrin epoxidase activity JM109 / p ST 1 1 1 (F ERM ABP-10922, see Japanese Patent Laid-Open No. 5-31 7066) is added to LB medium (1% bacto tryptone, 0.5% Bacterial toast extract, 0.5% NaCl, 1 mM I PTG, 50 ⁇ g / m1 ampicillin) in 50 OmL Erlenmeyer flasks each containing 1 O OmL, inoculated into 20 each, 37 ° Cultured with shaking at C for 20 hours.
  • LB medium 1% bacto tryptone, 0.5% Bacterial toast extract, 0.5% NaCl, 1 mM I PTG, 50 ⁇ g / m1 ampicillin
  • PSTll is a BamH I— P st I 1.1 Kb fragment containing the halohydrin epoxidase gene (hhe B) of Corynebacterium sp. It is a joined plasmid.
  • P ST 1 1 1 is described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-3 17066.
  • JM109 / p ST lll is a receipt number F ERM ABP-10922. It has been deposited internationally on March 1, 1991 at the Deposit Center (Tsukuba Sakai Higashi Ibaraki Pref. 1 1 1 1 Central 6).
  • a cell suspension 20.O 2 Og having halohydrin epoxidase activity prepared by the method i) was added, and the reaction was started at 20 ° C.
  • the pH controller was set so that 30% NaOH was added, and 1,3-dichloro- 2 at a ratio of approximately equimolar to the input NaOH.
  • the concentration of 1,3-dichloro-2-propanol in the system should not exceed 0.5mo 1 / kg, and the cyanide ion concentration in the system should be reduced. 1. Not to exceed 1 mo 1 / kg.
  • the nitrile hydratase used in the present invention was prepared as follows.
  • Mouth dococcus with nitrile hydracuse activity (Rhodococcus rhodochrous) J 1 1 (FEEM BP-1478), 30 L jar fermenter (Takasugi 2 wt% glucose at Seisakusho) urea 1 wt%, peptone 0.5% by weight, including yeast extract 0.3 mass 0/0, salts Ihikobaruto 0.05 mass 0/0, 20 medium (H7 0) and aerobically cultured at a temperature of 30 ° C for 60 hours. Bacteria obtained by culturing by the above method are collected by centrifugation, washed twice with 5 OmM phosphate buffer (pH 7.7) in the same amount, suspended, and used for reaction. It was.
  • 5 OmM phosphate buffer pH 7.7
  • CHBN 20 mM phosphate buffer
  • Example 1 2 reaction end solution 1 6. 37 g (containing 2.59 g of Car amide) added 4 8% NaOHa q 2.2 g (26.4 mmo l) at 30 ° C After 8 hours, when the conversion rate of Car-amide reached 80%, the temperature was raised to 40 ° C and the reaction was continued for another 6 hours. After neutralizing the system with HC 1 aq and quantifying (L) -Car and CB in the reaction solution, (L) —C ar was 2.09 g ( Yield 98.5%), and the same 8 was found to be 0.015 g (vs. Car O. 7%) A part of this aqueous solution was taken and dried, When optical purity was measured, it was 94.2% e. E.
  • Example 1 2 reaction finished solution 1 6.37 g (containing 2.59 g of Car-amide) 3 4.01 g (39.6 mmol) of 6% HC laq was added, and the reaction was started at 80 ° C. After 8 hours, the conversion rate of Car-amide reached 100%, and the reaction was completed. After neutralizing the system with NaOH aq, the amount of (L) -Car and CB in the reaction mixture was quantified. (L) -Car 2.11 g (yield 99.4%), CB 0 001 g rate 0. 05%). A part of this aqueous solution was collected and dried, and the optical purity of Car was measured. As a result, it was 94.5% e. E. Industrial applicability
  • a method for producing betaine is provided.
  • the present invention is useful in that side reactions can be prevented much more than before, and betaine such as carnitine can be obtained in high yield.

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Description

ベタインの製造方法 技術分野
本発明は、 ベタイン、 特にカルュチンの製造方法に関する。 背景技術
明
ベタインの一種である L一カル-チンはビタミン B Tとも言われ、 生体内で脂 肪酸の代謝に関係している重要な化合物である。 心臓疾患治療剤 （特開昭 5 4— 書
7 6 8 3 0号） 、 過脂肪質血症治療剤 （特開昭 5 4— 1 1 3 4 0 9号） 、 静脈疾 患治療剤等 （特開昭 5 8— 8 8 3 1 2号） としても注目されてきた。
ベタインの一種であるカル-チンの製造方法としては、 特開昭 5 7 - 1 6 5 3 5 2号には、 D—マンニトールを原料として L—カルニチンを得る方法、 特開昭 6 2— 2 7 2 9 8 3号には、 （R， S ) 一 3 , 4—エポキシ酪酸エステルを出発 として不斉加水分解酵素を用いて選択的に （R) — 3 , 4—エポキシ酪酸エステ ルを単離、 それにトリメチルァミンまたはトリメチルァミン塩酸塩を作用させて L一カル-チンに導く方法、 特表 2 0 0 2 - 5 4 4 2 5 2号には、 （S ) — （一） クロ口コハク酸誘導体を対応する酸無水物に変換後、 トリメチルァミンを用いて L—カル-チンに導く方法、 特表 2 0 0 2— 5 2 9 5 2 8号には、 アルキル一 4 一クロ口一 3—ォキソプチレートをルテェゥム錯体触媒を用いて選択的に不斉 水素還元してアルキル一 （R) — （+) —4—クロロー 3—ヒ ドロキシブチレ一 トを製造、 続いてトリメチルァミンによる 4級ァミノ化反応を経て L一カル-チ ンを得る方法など、 多くの報告がある。
上記特許文献にもあるように、 カルニチン製造工程において C 4骨格にトリメ チルァミン用いて 4級アミノ基を導入する工程は避けて通れない重要な工程で あり、 またこの工程の収率が全体の収率に大きな影響を及ぼすことが多い。 この 4級ァミノ化反応について特開平 2— 1 4 2 7 5 8号には、 4一ハロゲノー 3— ヒ ドロキシ酪酸メチルをケトン溶媒下でトリメチルァミンを用いて 4級ァミノ 化し、 続いて得られた酪酸エステル誘導体を加水分解する方法が示されている。 この 4級化ァミノ化反応はアルコールを溶媒として無水トリメチルァミンを用 い、 オートクレープ中で 8 0°Cもの高温で反応させるが、 4—ノヽロゲノー 3—ヒ ドロキシ酪酸メチルの脱水反応が進行してォレフィンが生成するため、 選択率は 30〜40%程度と著しく低く、 反応時間も 20時間以上と長い。 またケトン溶 媒を用いると選択性が向上すると記述されているが、 選択率は大幅に向上するも のの反応時間はさらに長くなり、 5 0時間を超えても 4一ハロゲノー 3—ヒドロ キシ酪酸メチルの転化率は 80%程度に過ぎない。 溶媒にエーテル系、 トルエン 等を用いた場合は反応時間はさらに遅延する上、 選択率も高くない。
特開平 2— 2 7 9 9 5号には、 γ—クロロー) 3—ヒドロキシブチロニトリノレに 3 0%のトリメチルァミン水溶液を加えて 4級ァミノ化する方法が示されてい る。 4°Cで一晩放置後、 反応液を減圧濾過することで得られる固体は、 純度 1 0 0%のカルニチン二トリルクロライドとしても収率 75%程度に過ぎず、 高収率 であるとはいえない。 特開昭 60— 2 5 848 7号には、 4—クロロー 3—ヒド ロキシブチロニトリルに大過剰の無水トリメチルァミンを加え、 無溶媒で 1 0 0°Cオートクレープ中で反応させ、 カル-チン二トリルクロライドを収率 94% で得る反応が示されているが、 反応条件が厳しく、 反応時間も 2 4時間と長い。 一方、 4級ァミノ化反応ではないがアミノ基を導入する反応例として、 特公昭 5 3— 1 3 6 1 1号には γ—クロロー ーヒ ドロキシブタン酸ァミ ドに約 1 0 0当量という大過剰なアンモニアを用いて 20°C程度で 1 6時間反応をさせ、 γ ーァミノ一 ーヒドロキシブタン酸アミドを得ているが、 大過剰のアンモニアを 使用することと反応時間が長いという点で問題があった。 同様の反応が He t e r o c y c l e s , V o l . 53, N o. 1， 2 0 00に示されており、 （S) — 4一クロロー 3—ヒ ドロキシブタンァミ ドに約 1 0 0当量の大過剰なアンモ ユア水溶液を加えて、 密閉系、 1 20°Cで 8時間作用させ、 アミノ基を導入する 反応が示されているが、 やはり大過剰のアンモニアを使用することと反応時間が 長いという点で問題があった。 このように 4一ハロー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドに大過剰のアンモニアを 作用させて長時間反応させればァミノ基が導入される知見はあったが、 トリアル キルァミンを作用させた場合については全く知られていなかった。
また、 カルニチンなどのべタイン製造工程において全体の収率に大きな影響を 及ぼすトリアルキルァミンによる 4級ァミノ化工程は、 従来の 4一ハロゲノー 3 -ヒ ドロキシ酪酸メチルゃ γ—クロロー ーヒ ドロキシブチロニトリルのトリ メチルァミンによる 4級ァミノ化反応では副反応の進行が多く、 目的の 4級アミ ノ化生成物を高収率で得ることが困難であつた。 発明の開示
そこで本発明では、 カル-チンなどのべタイン製造工程で重要な 4級ァミノ化 工程において副反応を従来よりも大幅に防ぎ、 カル-チンなどのべタインを高収 率で得ることを目的とする。
この従来のカルニチン製造工程における 4級ァミノ化反応の副反応を防止す るため本発明者らが鋭意検討した結果、 4一ハロー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ド を 4級ァミノ化反応の反応基質として用いることで、 プチロニトリルや酪酸エス テルのトリアルキルァミンによる 4級ァミノ化反応時に起こつていた副反応を 大幅に抑えることに成功した。 この 4一ハロー 3—ヒドロキシブタンアミ ドを、 カルニチン製造工程における 4級ァミノ化反応の反応基質として用いてカルニ チンを製造すると、 従来の方法よりも収率が大幅に向上するとともに、 反応時間 も短縮し、 副生成物を大幅に抑えることが可能である。 また、 この製造方法は、 カルニチンのみならず、 一定のベタインに適用可能である。 すなわち、 本発明は以下に関する。
( 1 ) 次式 （2 ) :
Figure imgf000005_0001
[式中、 X1は、 ハロゲン原子である。]
で示される 4一ハロー 3—ヒ ドロキシプタンアミ ドを （NAiAZA3) で示され るトリアルキルァミンで 4級ァミノ化する工程を含む、 次式 （2，） ：
Figure imgf000005_0002
[式中、 A A 2及び A 3は、 それぞれ、 互いに独立し、 同一または異なって、 置換基を有していてもよいじ 〜。^炭化水素基であり、 X1は、 ハロゲン原子で ある。]
で示される 4一トリアルキルァミノー 3—ヒ ドロキシブタンァミ ドハロゲン化 物の製造方法。 (2) 前記トリアルキルァミンが、 トリメチルァミン、 トリェチルァミンおょぴ トリプチルァミンからなる群より選択されるものである、 （1) に記載の方法。
(3) 次式 (2，)
Figure imgf000005_0003
[式中、 A1 A2及び A3は、 それぞれ、 互いに独立し、 同一または異なって、 置換基を有していてもよい
Figure imgf000005_0004
り、 X 1は、ハロゲン原子で ある。] で示される 4一トリアルキルアミノー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドノヽロゲンィ匕 物を加水分解する工程を含む、 次式 （1) ：
Figure imgf000006_0001
[式中、 A1 A2及び A3は、 それぞれ、 互いに独立し、 同一または異なって、 置換基を有していてもよい 〜じ 2。炭化水素基である。]
で示されるベタイン、 またはべタインの塩の製造方法。
(4) A A 2および A 3がメチル基である、 （3) に記載の方法。
(5) 次式 （2)
Figure imgf000006_0002
[式中、 X1は、 ハロゲン原子である。]
で示される 4一ハロー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドは、 次式 （3) ：
Figure imgf000006_0003
[式中、 X1は、 ハロゲン原子である。]
で示される 4一ハロー 3—ヒ ドロキシブチロニトリルをァ
り得られるものである、 （3) または （4) に記載の方法。 (6) アミ ド化が二トリルヒ ドラターゼで処理するものである、 （5) に記載の 方法。 (7) 前記二トリルヒドラターゼが、 ァクロモバクター （Ac h r omo b a c t e r) 属、 ァシドボラックス （A c i d o V o r a X) 属、 ァグロパクテリゥ ム (Ag r o b a c t e r i um) 属、 アースロノくクタ一 (A r t h r o b a c t e r )属、 バチルス （B a c i 1 1 u s ) 属、 ブレビバクテリゥム（B r e v i b a c t e r i um)属、 バークホノレデリァ (Bu r k h o l d e r i a ) 属、 キヤ ンディダ （C a n d i d a) 属、 力セォバクタ一（C a s e o b a c t e r) 属、 コマモナス (C omamo n a s ) 属、 コリネノ クテリゥム (C o r y n e b a c t e r i um)属、 ディーツィァ （D i e t z i a) 属、 ェンテロバクタ一 （En t e r o b a c t e r)属、 エルビニァ （E r w 1 n 1 a ) ¾、 ン才ノヽテノレス e o b a c i l l u s) 属、 ゴルドナ （G o r d o n a) 属、 クレプシエラ （K l e b s i e l a)属、 ミクロアスカス （M i c r o a s c u s)モノレガネラ （M o r g a n e 1 1 a) 属、 ノ ントエア （P a n t o e a) 属、 プロテウス （P r o t e u s ) J禹、 シユードモナス (P s e u d omo n a s ) }禹、 シュ1 ~ドノ力ノレ アイナ (P s e u d o no c a r d i a ) 属、 ロドコッカス (R h q d o c o c c u s) 属、 リゾビゥム （Rh i z o b i um) 属、 セラチア （S e r r a t i a) 属、 ストレプトマイセス （S t r e p t omy c e s) 属、 シクタリジゥム （S y c t a 1 i d i um) 属、 ッカムレラ （Tu k amu r e l l a) 属に属する 微生物からなる群より選択される微生物によって産生される、 （6) に記載の方 法。 (8) 前記 4一ハロー 3—ヒドロキシブタンアミ ドの製造工程力 反応液が凍ら ない温度〜 5 °Cで行われる、 （5) 〜 （7) のいずれか 1項に記載の方法。
(9) 次式 （3)
Figure imgf000008_0001
[式中、 X1は、 ハロゲン原子である。]
で示される 4一ハロー 3—ヒドロキシブチ口-トリルは、 次式 （4) :
Figure imgf000008_0002
[式中、 X1は、 ハロゲン原子である。]
で示されるェピハ口ヒドリン、
または、 次式 （5) ：
Figure imgf000008_0003
[式中、 X1は、 上記の意味を有する。 X2は、 X1と互いに独立し、 同一または 異なつたハ口ゲン原子である。]
で示される 1, 3—ジハロー 2—プロパノールと、
青酸または青酸塩とを反応させる工程により得られるものである、 （5) 〜 （8) のいずれか 1項に記載の方法。
(10) 青酸または青酸塩との反応が酵素触媒の存在下で行われるものである (9) に記載の方法。 (1 1) 前記酵素触媒がハロヒドリンエポキシターゼである （10) に記載の方
(1 2) 次式 （3) ：
Figure imgf000009_0001
[式中、 X1は、 ハロゲン原子である。]
で示される 4一ハロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリルが、 （R) 体過剰で製造さ れる、 （1 1) に記載の方法。
( 1 3 ) 前記ハロヒ ドリ ンエポキシターゼが、 コ リネバタテリ ゥム (Corynebacterium) 属、 ミクロノくクテリゥム (Microbacteiiumj 属、 ァグロノ クテリウム属、 マイコバクテリゥム （Mycobacterium) 属およびアースロバクタ 一 (Arthrobacter) 属に属する微生物からなる群より選択される微生物によって 産生される、 （1 1) または （12) に記載の方法。 本発明によれば、 カル-チン等のベタインの製造工程において重要なトリアル キルアミンを用いた 4級ァミノ化反応を、 4一ハロー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドを基質として用いることにより、 主たる副生生物であるクロトン酸誘導体の生 成を従来よりも大幅に抑えることが可能となり、 高収率でカルニチンなどのベタ ィンを製造することが可能となる。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態について説明する。 以下の実施形態は、 本発明を説 明するための単なる例示であって、 本発明をこの実施形態にのみ限定することは 意図されない。 本発明は、 その要旨を逸脱しない限り、 様々な形態で実施するこ とが可能である。
なお、 本明細書において引用した全ての刊行物、 例えば、 先行技術文献おょぴ 公開公報、 特許公報その他の特許文献は、 その全体が本明細書において参照とし て組み込まれる。 本明細書は、 本願優先権主張の基礎となる特願 2006-303972 号明細書の内容を包含する。 本発明では、 次式 （2)
Figure imgf000010_0001
[式中、 X1は、 ハロゲン原子である。]
で示される 4—ハロー 3—ヒドロキシブタンアミドを （NAiASA3) で示され るトリアルキルァミンで 4級ァミノ化する工程を含む、 次式 （2') ：
Figure imgf000010_0002
[式中、 A A 2及び A 3は、 それぞれ、 互いに独立し、 同一または異なって、 置換基を有していてもよい C1〜C2 Q炭化水素基であり、 X1は、ハロゲン原子で ある。] で示される 4一トリアルキルアミノ一 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドハ口 ゲン化物を製造する方法が提供される。 また、 本発明は、 次式 （2 ') ：
Figure imgf000010_0003
[式中、 A A2及び A3は、 それぞれ、 互いに独立し、 同一または異なって、 置換基を有していてもよい〇 〜〇 2。炭化水素基であり、 X1は、ハロゲン原子で ある。]
で示される 4一トリアルキルアミノー 3—ヒドロキシプタンアミ ドハロゲン化 物を加水分解する工程を含む、 次式 （1) ：
Figure imgf000011_0001
[式中、 Α Α2及び Α3は、それぞれ、互いに独立し、 同一または異なって、 置換基を有していてもよい Ci Cs。炭化水素基である。] で示されるベタイン、 またはベタィンの塩を製造する方法が提供される。
さらに、 本発明において、 下記式 （2) で示されるアミ ドを 4級ァミノ化する 工程と、 アミド基を加水分解する工程とを含む、 下記式 （1) で示されるベタイ ンの製造方法が提供される。
Figure imgf000011_0002
)
[式中、 X1、 A A2及ぴ A3は、 上記の意味を有する。]
本発明では、 下記式 （2) で示されるアミドを 4級ァミノ化する工程を含む、 下 記式 （1) で示されるベタインの製造方法が提供される。
Figure imgf000012_0001
上記式中、 A A 2及び A 3は、 それぞれ、 互いに独立し、 同一または異なつ て、 置換基を有していてもよい Ci Cs。炭化水素基である。
本明細書において、 fCi Cs。炭化水素基」 の炭化水素基は、 和若しくは不 飽和の非環式であってもよいし、 飽和若しくは不飽和の環式であってもよい。 C 1〜c2。炭化水素基が非環式の場合には、 線状でもよいし、 枝分かれでもよい。 「 c i〜 C 2。炭化水素基」には、 C i〜 C 2。アルキル基、 C 2〜 C 2。アルケニル基、 c2〜c2。アルキニル基、 c4〜c2。アルキルジェニル基、 c6〜c18ァリール基、 C7〜C20アルキルァリール基、 C7〜C2。ァリールアルキル基、 C3〜C20シク 口アルキル基、 C4〜C2。シクロアルケニル基、 （Cg Ci。シクロアルキル） C 〜じ^アルキル基などが含まれる。
本明細書において、 rc c^アルキル基」 は、 C Ci。アルキル基である ことが好ましく、 C1〜C6アルキル基であることが更に好ましレ、。 ア^/キル基の 例としては、 制限するわけではないが、 メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピ ノレ、 n—ブチノレ、 s e cーブチル、 t e r t—プチル、 ペンチノレ、 へキシル、 ド デカニル等を挙げることができる。
本明細書において、 「C2〜C2。ァルケ-ル基」 は、 C2〜C1。アルケニル基で あることが好ましく、 〇2〜〇6ァルケ-ル基であることが更に好ましい。 ァルケ ニル基の例としては、 制限するわけではないが、 ビニル、 1一プロぺニル、 2— プロぺニル、 イソプロべ-ル、 2—ブテニル等を挙げることができる。
本明細書において、 「C2〜C2。アルキ-ル基」 は、 Cs Ci。アルキニル基で あることが好ましく、 C2〜C6アルキニル基であることが更に好ましい。 アルキ -ル基の例としては、 制限するわけではないが、 ェチニル、 プロビュル、 プチ二 ル等を挙げることができる。
本明細書において、 「c4〜c2。アルキルジェニル基」 は、 。 〜じ 。アルキル ジェニル基であることが好ましく、 C 4〜 C 6アルキルジェニル基であることが更 に好ましい。 アルキルジェニル基の例としては、 制限するわけではないが、 1 ,
3一ブタジェニル等を挙げることができる。
本明細書において、 「C6〜C18ァリール基」 は、 C6〜C12ァリール基である ことが好ましい。ァリール基の例としては、制限するわけではないが、フエニル、 1一ナフチル、 2—ナフチル、 インデュル、 ビフエ二リル、 アントリル、 フエナ ントリル等を挙げることができる。
本明細書において、 「c7〜c2。アルキルァリール基」 は、 c7〜c12アルキル ァリール基であることが好ましい。 アルキルァリール基の例としては、 制限する わけではないが、 o—トリノレ、 ： m—トリノレ、 ρ—トリノレ、 2, 3—キシリル、 2, 4ーキシリル、 2， 5—キシリノレ、 o—クメニノレ、 m—クメ-ノレ、 p—タメ二ノレ、 メシチル等を挙げることができる。
本明細書において、 「C7〜C2。ァリールアルキル基」 は、 c7〜c12ァリール アルキル基であることが好ましい。 ァリールアルキル基の例としては、 制限する わけではないが、 ベンジル、 フエネチノレ、 ジフエニノレメチル、 トリフエニノレメチ ノレ、 1一ナフチルメチノレ、 2—ナフチノレメチノレ、 2, 2—ジフエニノレエチノレ、 3 —フエニルプロピル、 4一フエ-ルブチル、 5—フエ二ルペンチル等を挙げるこ とができる。
本明細書において、 「C3〜C2。シクロアルキル基」 は、 Cs Ci。シクロアル キル基であることが好ましい。 シクロアルキル基の例としては、 制限するわけで はないが、 シクロプロピル、 シクロブチル、 シク口ペンチル、 シク口へキシル等 を挙げることができる。
本明細書において、 「C4〜C20シクロアルケ-ル基」 は、 C4〜C10シクロア ルケニル基であることが好ましい。 シクロアルケニル基の例としては、 制限する わけではないが、 シクロプロべ-ル、 シクロブテュル、 シクロペンテニル、 シク 口へキセニル等を挙げることができる。
本明細書において、 A1 A2及び A3で示される
Figure imgf000013_0001
。炭化水素基」 に は、 置換基が導入されていてもよい。 この置換基としては、 例えば、 ァノレコキシ基 （例えば、 メ トキシ、 エトキシ、 プロポキシ、 ブトキシ等）、 C 6〜 2ァリールォキシ基 （例えば、 フエニルォキシ、 ナフチルォキシ、 ビフエニル ォキシ等）、 アミノ基、 水酸基、 ハロゲン原子 （例えば、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素） 又はシリル基などを挙げることができる。 この場合、 置換基は、 置換可 能な位置に 1個以上導入されていてもよく、 好ましくは 1個〜 4個導入されてい てもよい。 置換基数が 2個以上である場合、 各置換基は同一であっても異なって いてもよい。
本明細書において、 A A 2及ぴ A 3は、 それぞれ互いに独立し、 同一または 異なって、 C 1〜C 2 0アルキル基、 C 3〜C 2 0シクロアルキル基、 または C 6〜C 1 8ァリール基であることが好ましく、 じ 〜じ 。アルキル基、 C g C i。シク口 ァノレキル基、 または C e C i 2ァリール基であることが更に好ましく、 なかでも メチル基は生体内で脂肪酸の代謝に関係している重要な化合物であるカルニチ ンに導かれることから、 特に好ましい。
本明細書において、 ベタインの塩とは、 ベタインと、 塩酸、 硫酸、 硝酸などの 鉱酸との塩、 フマル酸、 酒石酸などの有機酸との塩、 水酸化ナトリウム、 水酸化 カリウムなどの塩基との塩などを示す。 例えばカルニチン塩酸塩、 カルニチンフ マル酸塩、 カルニチン酒石酸塩などが挙げられる。
上記式中、 X 1は、 ハロゲン元素を指し、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素を示す 力 入手し易さから塩素、 臭素であることがより好ましい。
上記式（3 )で示される 4一ハロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリル、上記式（4 ) で示されるェピハロヒ ドリン、 上記式 （2 ) で示される 4一ハロー 3—ヒドロキ シブタンアミ ド、 上記式 （2，） で示される 4一トリアルキルアミノー 3—ヒ ド ロキシブタンアミ ドハロゲン化物、 上記式 （1 ) で示されるベタインには不斉炭 素が存在するが、 本発明はラセミ体、 光学活性体のどちらでも実施可能である。 また上記のような光学活性な原料を用いたり、 光学活性な化合物を製造して以降 の各反応を行つた場合も、 本発明は温和な条件下での反応が可能であることから. 光学純度を低下させることなくべタインまで製造することができる。
本明細書において水性溶媒とは、 水または、 水と有機溶剤との混合物のことで ある。 水と有機溶剤は二相系でも構わない。 使用される有機溶剤としては特に制 限はないが、 メタノール、 エタノール、 プロパノーノレ、 イソプロパノール、 プタ ノールなどのアルコール系溶媒、 ァセトン、 メチルイソプチ ケトンなどのケト ン系溶媒、 酢酸ェチル、 プロピオン酸ェチル、 メタタリル酸メチルなどのエステ ル系溶媒、 ペンタン、 へキサン、 ヘプタンなどの炭化水素系溶媒、 ベンゼン、 ト ルェン、 キシレンなどの芳香族系溶媒、 ジクロロメタン、 クロ口ホルムなどの塩 素系溶媒、 ァセトニトリル、 ジメチルホルムアミ ド、 テトラヒドロフラン、 ジメ チルスルホキシドなどが挙げられ、 これらの混合溶剤を用いても構わない。 水へ の溶解度が高いアルコール系溶媒、 ァセトニトリル、 ジメチルホルムアミ ド、 ジ メチルスルホキシドを使用することがより好ましい。 水に溶解する範囲で有機溶 剤を使用することがより好ましく、 水が多いと反応速度が速くなることから、 水 を単独で使用することが特に好ましい。
本発明の製造方法では、 下記式 （2 ) で示される 4—ハロー 3—ヒ ドロキシブ タンアミ ドを経由する工程を含む。 本明細書において、 「経由する」 とは、 下記 式 （2 ) で示されるアミ ドを出発物質として用いる場合と、 出発物質としては他 の物を用いるが、 中間体として下記式 （2 ) で示されるアミ ドを経由する場合と の双方を意味する。
Figure imgf000015_0001
[式中、 X 1は、 上記の意味を有する。]
本発明にかかるベタインの製造方法では、 4一ハロー 3—ヒ ドロキシプタンァ ミ ドを 4級ァミノ化反応の基質として用いることが好ましい。 この方法は従来の 方法よりも 4級ァミノ化生成物収率が大幅に改善し、 副生成物を大幅に抑えるこ とが可能である。
上記式 （2 ) で示される 4一ハロー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドの製法は特に 制限はない。 例えば化学的反応により得る方法として、 エステルとアンモニアを 用いてアミ ドに変換する方法、 酸ハロゲン化物とアンモニアを用いてアミドに変 換する方法、 酸や塩基を触媒として-トリルをアミ ドに変換する方法などが挙げ られ、いずれの方法でも構わない。二トリルからアミドに変換する方法としては、 塩酸などの鉱酸ゃギ酸などを使用する方法、 過酸化水素とアルカリを作用させる 方法、 二酸化マンガンを用いる方法などが知られており、 いずれの方法を用いて もよい。
また二トリルヒドラターゼの作用により前記式 （3 ) で示される 4一ハロー 3 ーヒドロキシプチロニトリルをアミ ド化して上記式 （2 ) で示される 4一ハロー 3—ヒドロキシプタンァミドを製造することもできる。 この反応は温和な条件下 で行うことが可能であるため、 厳しい条件や複雑な操作を必要とする酸 ·塩基触 媒を用いた際の副反応の進行を抑制することが可能である。
Figure imgf000016_0001
[式中、 X 1は、 上記の意味を有する。]
上記式 （3 ) で示される 4一ハロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリルに二トリルヒ ドラターゼを作用させた場合、 上記式 （2 ) で示されるアミドからさらに加水分 解反応が起こることはなく、 温和な条件下で、 しかもほぼ定量的に上記式 （2 ) で示されるアミ ドを得ることができる。
本発明において、 上記式 （2 ) で示されるアミ ドの前駆体である、 4一ハロー 3—ヒドロキシプチ口-トリルの製法は特に限定されないが、 たとえば、 下記式 ( 4 ) で示されるェピハロヒドリンと青酸とから合成する方法 （特開 2 0 0 2— 2 4 1 3 5 7に示されている）、 ェピハ口ヒドリンと青酸塩とから合成する方法 (特開 2 0 0 4— 1 8 2 6 0 7参照）、
Figure imgf000017_0001
[式中、 X1は、 上記の意味を有する。]
下記式 （5) で示される 1, 3—ジクロロー 2—プロパノールと青酸とから合成 する方法 （特開平 5— 219965参照）
Figure imgf000017_0002
[式中、 X1は、 上記の意味を有する。 X2は、 X1と互いに独立し、 同一または 異なったハロゲン原子である。]
など、 いずれの方法で合成したものも使用することができる。 ここで、 青酸塩と しては、 青酸のアルカリ金属塩を用いることが好ましく、' N a CN、 KCN、 L i CNを用いることがより好ましい。 また、 前記式 （4) で示されるェピハロヒ ドリンの光学活性体を用いた場合、 光学活性な 4一ハロー 3—ヒドロキシプチ口 二トリルを製造することも可能である。
また、 酵素触媒 （ハロヒドリンエポキシダーゼ） を用いることにより、 前記式 (4) で示されるェピハロヒ ドリンや前記式 （5) で示される 1， 3—ジハロー 2—プロパノールから、 直接光学活性 4—ハロー 3—ヒドロキシプチロニトリル を製造してもよい。
本発明において、 ハロヒドリンエポキシダーゼは前記式 （4) で示されるェピ ノヽロヒドリンゃ前記式（5)で示される 1, 3—ジハロー 2—プロパノールから、 ' 4一ハロー 3—ヒドロキシプチロニトリルを生成する機能を有すれば特に限定 されない。
ハロヒドリンエポキシダーゼを産生する微生物としては、 コリネバクテリゥム (Corynebacterium) 属、 ミクロノくクテリゥム （Microbacterium) 属、 ァグロパ クテリウム属、 マイコバクテリゥム （Mycobacterium) 属およびアースロバクタ 一 (Arthrobacter) 属に属する微生物である。
具体的微生物としては、 コリネバタテリゥム （Corynebacterium) sp.N— 1074 (FEEM BP-2643)、 ミクロバクテリゥム （Microbacterium) sp.N - 4701 (FERM BP-2644)、 ァグロパクテリゥム ラジォバクタ一 （Agrobacteriu radiobacter) AD 1、 マイコパクテリゥム （Mycobacterium) sp.GPlおよぴァ ースロバクタ一 （Arthrobacter) sp.AD2等が挙げられる。
特に好ましい微生物は、 コリネバタテリゥム （Corynebacterium) sp.N- 1074 (FERM BP - 2643)、 及びミクロバタテリゥム （Microbacterium) sp.N - 4701 (FERM BP-2644) である。 N- 4701株は、 独立行政法人産業技術総合研究所特 許生物寄託センター（茨城県つくば巿東 1-1-1中央第 6)に平成 1年 4月 1 9日付 で寄託されており、 その受託番号は FERM BP- 2643及び FERM BP - 2644である。 また、 上記微生物のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子をクローニングし、 形 質転換 （導入） した微生物も、 上記のハロヒドリンエポキシダーゼを産生する微 生物として含まれる。
ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子は、例えば、 GenBankに公表されており、 コリネバタテリゥム sp. (Corynebacteri m) N-1074由来の ハロヒドリンェポ キシダーゼ遺伝子 （hheB) の Accession番号は D90350である。
本発明に係るハロヒドリンエポキシダーゼは、 上述の方法で調製されたハロヒ ドリンエポキシダーゼ活性を有する微生物を培養し、 その培養物から採取するこ とにより得ることができる。
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有する微生物を培養する培地としては、 微 生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効 率的に行うことができる培地であれば、 天然培地、 合成培地のいずれを用いても よい。 炭素源としては、 グノレコース、 フラク トース、 スクロース、 デンプン等の 炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール等のアル コール類が挙げられる。 窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸 アンモユウム、 酢酸アンモ-ゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸若しくは有機 酸のアンモニゥム塩又はその他の含窒素化合物のほか、 ペプトン、 肉エキス、 コ ーンスティープリカ一等が挙げられる。 無機物としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二力リゥム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリゥム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅若しくは炭酸カルシウム等が挙げられる。 上記微生物の培養は常法によればよく、 例えば p H 4〜 1 0、 温度 1 0〜 4 5 °Cの範囲にて好気的に 1 0〜1 8 0 時間培養する。 培養は液体培養、 固体培 養のいずれでも行うことができる。 形質転換体の培養は、 振盪培養又は通気攪拌 培養などの好気的条件下、 3 0〜 4 0 °Cで行うことが好ましい。 培養中は必要に 応じてアンピシリンゃカナマシン等の抗生物質、 インデューサーを培地に添加し てもよレ、。
上記の方法で調製したハロヒ ドリンエポキシダーゼを培養して得られる培養 物またはその処理物は前記式 （4 ) で示されるェピハロヒ ドリンゃ前記式 （5 ) で示される 1， 3—ジハロー 2—プロパノールから、 4一ハロー 3—ヒドロキシ プチロニトリルを製造することができる。 「処理物」 とは、 菌体の破砕物、 薬剤 処理した菌体、 固定化した菌体、 粗酵素 ·精製酵素等の菌体抽出物を意味する。 反応液の溶媒としては、 特に制限はないが、 一般には前記水性溶媒を用いる。 特に水が好ましく、 酵素活性の最適 p H 4〜 1◦の付近である水または緩衝液を 使用する。 緩衝液としては、 例えば、 リン酸、 ホウ酸、 クェン酸、 ダルタル酸、 リンゴ酸、 マロン酸、 0—フタル酸、 コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成さ れる緩衝液、 ris緩衝液あるいはグッド緩衝液等が好ましい。
反応温度は、 5〜5 0 °C、 反応 p H は 4〜 1 0の範囲で行うことが好まし い。 反応温度は、 より好ましくは 1 0〜4 0 °Cである。 反応 p Hは、 より好ま しくは p H 6〜9である。 反応時間は基質等の濃度、 菌体濃度あるいはその他の 反応条件等によって適時選択するが、 1〜1 2 0 時間で終了するように条件を 設定することが好ましい。 尚、 本反応においては、 反応の進行に伴い生成する塩 素イオンを適当なアル力リで中和することでより反応を円滑に進行させること ができる。
また、 シアン化合物としては、 シアン化水素、 シアン化カリウム、 シアン化ナ トリゥム、 シアン酸又はァセトンシアンヒドリン等の反応液中に添加した際にシ アンイオン （CN—） 又はシアン化水素を生じる化合物又はその溶液を用いるこ とができる。
反応液中の基質濃度は、 酵素安定性の観点から 0.01〜20(W/V) %が好ましく、 0.01〜： L0%が特に好ましい。 .
また、 シアン化合物の使用量は、 酵素安定性の観点から基質の 1〜 3倍量 （モ ル） が好ましい。
以上のような方法で製造された上記式 （3) で示される 4一ハロー 3—ヒドロ キシプチロニトリルは、 公知の方法を用いて採取および精製することができる。 例えば、 反応液から遠心分離等の方法を用いて菌体を除いた後、 酢酸ェチルなど の溶媒で抽出を行い、 減圧下に溶媒を除去することにより 4一ハロー 3—ヒドロ キシプチロニトリルのシロップを得ることができる。 しばしば着色が発生し反応 液が褐色になるが、 活性炭などにより脱色操作を行ってもよい。 また、 これらの シロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。
光学活性な 4一ハロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリルを用いて本発明を実施 する場合、 その光学純度は、 以後の反応が温和な条件であることから、 光学純度 を低下させることなくベタインまで製造することが可能である。
本発明において、 二トリルヒドラターゼは特に限定されないが、 上記式 （3) で示される 4一ハロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリルの二トリルをアミ ドへ変 換する反応を触媒する酵素であり、 国際的な酵素分類によればリアーゼに属する 酵素である。本発明で使用する二トリルヒドラターゼを有する微生物は、例えば、 ァクロモパクター （A c h r omo b a c t e r) 属、 ァシドボラックス （A c i d o v o r a x)属、ァグロノ クテリウム (Ag r o b a c t e r i um)属、 アースロバクタ一（A r t h r o b a c t e r)属、 バチノレス （B a c i l l u s) 属、 ブレビパクテリゥム（B r e v i b a c t e r i um)属、 バークホノレデリア (B u r k h o l d e r i a) 属、 キャンディダ （C a n d i d a) 属、 カセォ ノ クター (C a s e o b a c t e r) 属、 コマモナス (C omamo n a s ) 属、 コリネバクテリゥム（C o r y n e b a c t e r i um)属、 ディーツィァ （D i e t z i a) 属、 ェンテロノ クタ一 (En t e r o b a c t e r) 属、 エノレビ二 ァ （E r w i n i a) 属、 ジォバチルス （G e o b a c i 1 1 u s ) 属、 ゴノレド ナ （Go r d o n a) 属、 クレブシエラ （K 1 e b s i e 1 a ) 属、 ミクロァス カス (M i c r o a s c u s) モノレガネラ (M o r g a n e 1 l a) 属、 ノヽ0ント エア （P a n t o e a) 属、 プロテウス （P r o t e u s) 属、 シユードモナス (P s e u d omo n a s ) 属、 シュードノ力ノレアイナ (P s e u d o n o c a r d i a) 属、 ロドコッカス（R h o d o c o c c u s) 属、 リゾビゥム （R h i z o b i u m) 属、 セラチア （S e r r a t i a) 属、 ス トレプトマイセス （S t r e p t omy c e s) 属、 シクタリジゥム （S y c t a l i d i u m) 属、 ッ カムレラ （Tu k amu r e 1 1 a) 属に属する微生物である。
本発明で使用する二トリルヒ ドラターゼとしては、 具体的には、 アースロバク ター グロビフオルミス (Arthrobacterglobi-forinis)IFO 12138、ブレビバタテリ ゥム へルポラム (Brevibacterium helvolum)ATCC 11822 、 コリネバクテリウ ム フラベシエンス (Corynebacterium flaves.cens)IAM 1642 、 ロ ドコッカス エリス口ポリス (Rhodococcus erythropolis)lFO 12540 および IFO 12539 、ス ト レプトマイセスアルボグリセルス （Streptomyces albogriseolus) HUT 6045、 ス トレプトマイセス クリゾマルス （Streptomyces clwysomallus) HUT 6141、 ス トレプトマイセス シネレオルバ一 （Streptomyces cinereouruber) HUT6142、 ス トレプトマイセス ヂァスタチカス （Streptomyces diastaticus) HUT 6116, ス トレプトマイセス オリバセウス （Streptomyces olivaceus) HUT 6061、 ス ト レ プ ト マ イ セ ス ルブ ロ シ ア ノ ヂ ァ ス タ チカ ス （ Streptomyces rubrocyanodiastaticus) HUT 6117、 クレブシエラ 二ユウモニァェ （Klebsiella pneumoniae) IFO 12019、 IFO 3319、 IFO12059, IAM 1063、 クレブシエラ 二 ユウモニァェ サブスピーシズ 二ユウモ-ァェ (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae) NH-36T2株、 セラチア ピリムシ力 （Serratia plymuthica) IFO 3055、 セラチア マノレセッセンス （Serratia marcescens ) IAM 1105、 エノレビュ ァ キヤロトボラ （Erwinia carotovora) IFO 3057、 ッカムレラ ポー口メタボラ ム （Tukamurella Daurometabolum) JCM 3226, ゴルドナ ルブロペルチンクタ ス (Gordona rubropertinctus) JCM3227、 モルガネラ モノレガニ (Morganella morganii) IFO 3848、 プロテウス プノレガリス （Proteus vulgaris) IFO 3167、 ェンテロパクター エアロジェネス （Enterobacter aerogenes) IFO 12010、 ミク ロアスカス デスモスポラス (Microascus desmosporus)IF06761, キャンディダ グイリエモンディ一 （Candida guilHermondii) NH-2株 (FERM P-11350 号)、 パントエア アグロメランス （Pantoea agglomerans) NH-3株 (FERM P- 11349 号)などが産生する二トリノレヒドラターゼが挙げられる。
なお、 AT CC番号が付与された微生物菌株は、 各々アメリカンタイプカルチ ァーコレクション （ATCC) から容易に入手することができる。 また、 I FO 番号の付された微生物は、 （財）醱酵研究所（I FO)発行の 「List of Cultures, 第 8版、 第 1卷 （1 98 8)J に記載されており、 現在は独立行政法人製品評価 技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門遺伝資源保存課から入 手できる。 I AM番号の付された微生物は東京大学応用微生物学研究所から入手 できる。 J CM番号の付された微生物は、 理化学研究所 系統微生物保存機関発 行の 「Catalog e of strains第 4版 （1 9 8 9)」 に記載されており、 理化学研究 所 系統微生物保存機関より入手できる。 HUT番号の付された微生物は、 日本 微生物保存連盟 （ J FCC) 発行の 「 Catalogue of Cultures, 第 4版 （1 9 8 7)j に記載されており、 広島大学工学部から入手できる。 FERM番号の付され た微生物は、 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターから入 手できる。
さらに、 本発明で使用する二トリルヒドラターゼとしては、 さらに山田らが土 壌より分離したロドコッカス ロドクロウス J一 1 CFERM BP-1478 号〕、 及 びアース口パクター S p. SK 1 0 3 〔FERMP- 11300号〕、カセォパクター s p . B C 2 3 〔FERM P-11261 号〕、 シユードモナス s p . B C 1 5— 2 FERMBP-3320号〕、シユードモナス s p. SK 3 1 〔FERMP-11310号〕、 シユードモナス s p. S K8 7 〔FEBM P-11311号〕、 シユードモナス s p . SK I 3 〔FERMBP-3325号〕、ロドコッカス s p. SK 70 [FERM P- 11304 号〕、 ロドコッカス s p. HR 1 1 〔FERMP-11306号〕 およびロドコッカス s p . S K 4 9 FERM P-11303号〕 などが産生する-トリルヒ ドラターゼも 挙げられる。 これらの細菌は、 それぞれ上記寄託番号にて独立行政法人 産業技 術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
また、 上記微生物の二トリルヒ ドラターゼ遺伝子をクローユングし、 形質転換 (導入） した微生物も、 上記のュトリルヒドラターゼを産生ずる微生物として含 まれる。 例えば、 米国特許第 5807730 号に記載のシュ一ドノカルディア (Pseudonocardia) 属のニト リルヒ ドラクーゼ遺伝子で形質転換した大腸菌 (M 10822株 （FERM BP-5785) ) , 特開平 8-266277号公報記載のァクロモバ クタ一 （Achromobacter) 属のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌 （M T— 1 0 7 7 0株 （FERM P- 14756) )、 特開平 4一 2 1 1 3 7 9号公報記載の口 ドコッカス · 口ドク口ウス （Rhodococcus rhodochrous) 種の二トリノレヒ ドラタ ーゼで形質転換した微生物などが挙げられる。
本発明で使用する二トリノレヒ ドラターゼを産生する微生物を培養するための 培地組成としては、 特に限定されないが、 通常これらの微生物が生育し得るもの ならば何でも使用することができる。 例えば、 炭素源としてグルコース、 フラク トース、 シユークロース、 マルトースなどの糖類、 酢酸、 クェン酸などの有機酸 類、ェタノール、グリセロールなどのアルコール類など、窒素源としてぺプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 タンパク質加水分解物、 アミノ酸類などの天然窒素源の 他に各種無機、 有機酸アンモニゥム塩などが使用でき、 このほか、 無機塩、 微量 金属、 ビタミンなどが必要に応じて適宜使用される。 この際、 より高い酵素活性 を誘導させるために 4一クロロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリル、 プロピオ二ト リル、 ィソブチ口-トリル、 ベンジルシア-ドなどの各種二トリル化合物、 4一 クロ口一 3—ヒ ドロキシブタンァミ ド、 プロピオンァミ ド、 ィソブタンァミ ドな どの各種アミ ド化合物などを培地に添加することがより好ましい。 上記微生物の 培養は常法によればよく、 例えば p H 4〜1 0、 温度 1 0〜4 5 °Cの範囲にて 好気的に 1 0〜1 8 0 時間培養する。 培養は液体培養、 固体培養のいずれでも 行うことができる。
本発明において、 4一ハロー 3—ヒドロキシプチロニトリルに酵素を作用させ て 4—ハロー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドを得る方法としては特に限定されな いが、 上記のようにして得た二トリルヒドラターゼを産生させた微生物の培養液 あるいは遠心分離などにより得た菌体の懸濁液に基質を添加する方法、 前記微生 物菌体処理物 （例えば菌体破砕物、 菌体抽出物など）、 二トリルヒ ドラターゼ粗 酵素、 精製酵素などの懸濁液に基質を添加する方法、 あるいは常法により固定化 した菌体または菌体処理物、 粗酵素、 精製酵素などを反応液に添加する方法、 微 生物の培養時に基質を培養液に添加して培養と同時に反応を行う方法、 基質の水 溶液を調製して上記のようにして得た微生物培養液、 微生物菌体、 微生物菌体処 理物、 二トリルヒ ドラターゼ粗酵素、 精製酵素、 あるいはそれらを固定化したも のを一括若しくは分割して添加する方法などが挙げられるが、 このアミド化反応 が発熱反応であり、 発熱による反応の暴走を防ぐことから菌体の懸濁液を基質の 水溶液に添加し、 反応速度を制御することが好ましい。
ェピハロヒドリンや 1， 3—ジクロロー 2—プロパノールを原料とし、 青酸ま たは青酸塩と作用させて 4一ハロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリルを製造する 方法などで合成した反応終了液をそのまま用いて、 次の二トリルヒ ドラターゼに よるアミド化反応を行ってもよレ、。 この場合、 系内に残存している青酸化合物が 二トリルヒドラターゼを失活させてしまうことがしばしばある。 それを防止する ために予め酸性条件下で加熱、 減圧、 トッピングなどの操作を行い、 系内の青酸 濃度を 1 0 p p m以下、 さらには 1 p p m以下にすることがより好ましい。
さらに、 系内の青酸濃度を 1 p p m以下にしても 4一ハロー 3—ヒドロキシブ チロニトリルのアミド化反応が迅速に進行しない場合は、 4一ハロー 3—ヒドロ キシプチロニトリルまたはその溶液を加熱処理することでアミ ド化反応が迅速 に進行する場合がある。
その加熱方法は、 本発明の目的が達成されれば特に制限はなく、 加圧、 減圧、 常圧条件下のいずれも選択できる。 また 4一ハロー 3—ヒドロキシブチロニトリ ルおよびその溶液を、 その沸点以上に加熱し、 還流又は留去する方法などが挙げ られる。 溶液は有機溶剤でも水溶液でもそれらの混合液でも構わないが、 通常ァ ミド化反応は水溶媒中で行われ、 連続して反応を行うことが可能であることから、 水溶媒中で加熱処理することが好ましい。
カロ熱時間は、 0 . 1〜1 0 0時間程度で、 0 . 5〜5 0時間が好ましく、 さら に好ましくは 1〜1 0時間である。 加熱温度は、 4 0 °C程度から 4一ハロー 3— ヒドロキシプチロニトリルが分解しない温度までの範囲で処理することが可能 であり、 6 0〜： 1 5 0 °Cが好ましい。 4一ハロー 3—ヒドロキシブチロニトリノレ の水溶液を加熱処理する時、 その分角早を防ぐため、 p Hは中性〜酸性領域が好ま しく、 p H 1〜7がより好ましい。
また、 微量の金属塩を添加することで、 4一ハロー 3—ヒドロキシブチロニト リル中に極微量含まれるシアンイオンを金属錯体とすることで低減させること により、アミ ド化反応を迅速に進行させることもできる。金属錯体とする方法は、 該ニトリノレと二トリノレヒドラターゼを接触させる前に、 青酸と反応して金属シァ ン化物錯体を形成する金属を、 該ニトリルまたは該-トリルを含む溶液に金属塩 として添加することにより、 シアンイオンを金属シァノ化錯体とする方法である。 金属としては、 コバルト、 ニッケル、 亜鉛が好ましく、 塩の形態としては、 特に 制限されないが、 硝酸塩、 塩化物、 硫酸塩、 カルボン酸塩が例示できる。 また水 和物を用いてもよい。
微量の金属塩を添加する時には、 4一ハロー 3—ヒドロキシプチロニトリルを 含む溶液に含まれるシアンイオン濃度に応じた量の金属塩を添加する必要があ る。 金属添加量が不十分な場合ではシアンイオンの影響を十分に除去できない。 また、 金属添加量が過剰な場合では逆にアミド化反応を阻害するようである。 ま た、 金属塩の添加後にはュトリノレヒドラターゼが高活性を示す至適 p Hに再度調 節してから、 アミド化反応に移ることが好ましい。
本発明における二トリルヒドラターゼによるアミ ド化反応の条件に特に制限 がなく、 その反応温度は使用する酵素によって適宜決定される。 一般には反応液 が凍らない温度〜 5 0 °C程度である。 「反応液が凍らない温度」 とは、 どのよう な反応液中でアミド化反応を行うかにより、 その温度は異なる。 希薄溶液での反 応であれば、 反応液に溶解している溶質のモル濃度 （mol/kg) と溶媒のモル凝固 点降下の値からその温度は算出できる。 例えば、 水媒体に溶解した 1 4 %程度の 4一ハロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリルをアミ ド化反応に供する場合、 その反 応液が凍らない温度とは、 水の凝固点降下が 1 . 8 5 8、 4一ハロー 3—ヒドロ キシプチロニトリノレのモル濃度 （mol/kg) が 1 . 1 7 1であるので、 凝固点は約 一 2 °C程度となる。 特許第 3 0 1 4 1 7 1号には 4—ハロー 3—ヒドロキシプチ ロニトリルに酵素を作用させて 4一ハロー 3—ヒドロキシブタンアミ ドを合成 する反応温度は、 5〜5 0 °Cと記載されている。 本発明において特にべタインの 製造を行う目的での 4一ハロー 3—ヒドロキシプチロニトリルの 4一ハロー 3 ーヒドロキシブタンアミドへのアミ ド化反応は、 副反応の進行を抑制するために 反応液が凍らない温度〜 3 0 °C程度がより好ましく、 反応液が凍らない温度〜 5 °Cが特に好ましい。 4一ハロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリル濃度は特に限定 されないが、 0 . 0 1 〜5 0 (W/V) %程度が通常で、 0 . 1〜4 0 %程度が より好ましレ、。 反応液の p Hは 4〜1 0の範囲が好ましく、 6〜9で行うことが より好ましい。 反応時間は基質濃度、 菌体濃度あるいはそのほかの反応条件によ つて変わるが、 通常 0 . 5〜1 2 0 時間で終了するように条件を設定すること が好ましく、 副反応の進行を抑制するためにも、 0 . 5〜2 4時間程度、 さらに は 0 . 5〜 1 5時間程度で終了するように設定することがより好ましい。
以上のようにして合成した 4一ハロー 3—ヒドロキシブタンアミドは、 抽出、 カラム分離、 再結晶等の定法に従い、 単離精製することができる。 二トリルヒ ド ラターゼを有する微生物を用いた場合、 反応終了後に菌体等を濾過してもよいが、 4一ハロー 3—ヒドロキシブタンァミ ドは水溶液中で不安定であり、 低温で濾過 操作を行う必要がある。 0〜1 0 °C程度で操作を行うことがより好ましい。
4一ハロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリルの光学活性体をアミ ド化反応の基 質として用いた場合、 4一ハロー 3—ヒドロキシプタンアミドも光学活性体とな るが、 光学活性体のどちらか一方が過剰な状態であれば、 4一ハロー 3—ヒドロ キシブタンアミ ドの再結晶操作などを行えば光学純度を向上させることが可能 である。 またラセミ体の 4一ハロー 3—ヒドロキシブタンアミドを製造した場合 は、 光学分割剤などを用いて光学活性な 4—ハロー 3—ヒドロキシブタンァミド を得ることも可能である。 本発明で使用する上記式 （2 ) で示される 4一ハロー 3—ヒドロキシブタンァ ミ ドは、 精製したものを使用してもよく、 エトリルヒドラターゼを作用させた後 の水溶液の状態でもよい。 但し、 前述のように 4一ハロー 3—ヒドロキシブタン アミドは水溶液中で不安定であり、 単離精製を行うとさらなる反応を起こして収 率の低下を招くことがある。 この点、 カラム精製等による単離精製は、 繁雑な上 8 0 %程度の単離精製収率であること、 また最終生成物までのトータル収率を考 慮すると、 二トリノレヒドラターゼを作用させたあとの水溶液をそのまま使用する ことが好ましい。
前述のように 4一ハロー 3—ヒ ドロキシプタンアミ ドは水溶液中で不安定で あることから、 副反応を抑制するために 4一ハロー 3—ヒドロキシプタンアミド の製造終了後、 4 8時間以内にトリアルキルァミンによる 4級ァミノ化反応に移 ることがより好ましく、 1 0時間以内であることが特に好ましい。 またトリアル キルァミンと接触させるまで、 反応終了液の温度は 0〜1 0 °Cに保つことが好ま しい。
本発明において、 下記式 （1 ) で示されるベタインの製造方法は、 下記式 （2 ) で示されるアミドを 4級ァミノ化する工程と、 アミ ド基を加水分解する工程とを 含むことが好ましい。化合物（ 2 )の加水分解反応は様々な副反応が起こるため、 収率向上の観点から 4級ァミノ化工程を先に行って化合物 （2 ' ) で示される 4 —トリアルキルアミノー 3—ヒドロキシブタンアミ ドハロゲン化物を製造し、 続 いて加水分解工程を行う。
Figure imgf000027_0001
[式中、 X 1、 A 1 , A 2及び A 3は、 上記の意味を有する。] 本発明において、 上記式 （2) で示されるアミドを 4級ァミノ化する工程にお いて、 トリメチ /レアミン、 トリェチルァミン、 トリプチルァミン等のトリアルキ ルァミン （NAiASA3) を使用することが好ましい。 本発明で使用するトリア ルキルアミンは、 無水の状態でも水溶液の状態でも構わない。
4級ァミノ化反応において、 上記式 （2) で示される 4—ハロー 3—ヒドロキ シプタンアミドの溶液を用いて反応を行う場合.、 その溶媒は特に限定されるもの ではないが、 前記水性溶媒を用いることが好ましい。
4級ァミノ化反応において、 上記式 （2) で示される 4—ハロー 3—ヒドロキ シブタンアミドの溶液を用いて反応を行う場合、 この反応の際に使用するトリア ルキルアミンは、 無水のトリアルキルァミンでもその水溶液でもどちらでも構わ ないが、 4一ハロー 3—ヒドロキシブタンアミ ド溶液の溶媒として、 水と相溶性 のある有機溶剤を用いた場合は、 トリアルキルァミンの水溶液を用いた方が高収 率と高反応速度をもたらすことが多いためより好ましく、 水を単独で用いて反応 を行う方が高収率と高反応速度をもたらすため、 4一ハロー 3—ヒドロキシブタ ンアミ ドの水溶液、 あるいは、 4一ハロー 3—ヒドロキシブチ口-トリルから二 トリルヒドラターゼを作用させて 4一ハロー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドを合 成した反応あがりの水溶液をそのまま用いることが、 特に好ましい。
水性溶媒中で 4級ァミノ化反応を開始する時は、 4一ハロー 3—ヒドロキシブ タンアミ ドにトリアルキルアミンを添加しても、 トリアルキルァミンに 4ーハロ 一 3—ヒドロキシブタンアミ ドを添加しても、 どちらでも構わない。 添加が完了 した後に所定の温度へ上昇させることが好ましい。
4級ァミノ化反応における 4—ハロー 3—ヒドロキシブタンアミ ドの濃度は、 特に限定されるものではないが、 通常 0. 1〜50%程度であり、 1~20°/0程 度がより好ましい。 一方、 トリアルキルァミンの使用量は、 特に限定されるもの ではないが、通常 4一ハロー 3—ヒドロキシブタンアミドに対して 1. 0〜20. 0当量 （モル） であり、 1. 1〜8. 0当量程度がより好ましい。 反応温度は特 に限定されるものではないが、 通常一 10°C〜60°C程度であり、 0°C〜50°C 程度がより好ましい。 またトリメチルァミンなどの沸点が低いトリアルキルアミンを使用する時は、 トリアルキルァミンの揮発によるトリアルキルァミンの減少に注意を払うこと が好ましい。 特に反応に用いるトリアルキルァミンの当量数が、 4一ハロー 3— ヒ ドロキシブタンアミ ドに対して 1 . 2当量以下などの比較的低当量である時、 気化しないように注意を払った場合とそうでない場合との 4一トリアルキルァ ミノー 3—ヒドロキシブタンアミ ドハロゲン化物の収率には顕著な違いが見ら れる。
4級ァミノ化反応では褐色に着色することがある。 この脱色のため、 活性炭な どによる脱色操作を行ってもよい。
以上のようにして合成した上記式 （2 ' ) で示される 4一トリアルキルアミノ 一 3—ヒドロキシブタンアミ ドハロゲン化物は、 抽出、 カラム分離、 再結晶、 電 気透析、 イオン交換法等の定法に従い、 単離精製することができる。
4一ハロー 3—ヒ ドロキシブチロニトリノレまたは 4ーノヽ口一 3—ヒ ドロキシ ブタンアミ ドの光学活性体を 4級ァミノ化反応の前駆体、 若しくは基質として用 いた場合、 上記式 （2 ' ) で示される 4一トリアルキルアミノー 3—ヒドロキシ ブタンアミ ドハロゲン化物も光学活性体となるが、 光学活性体のどちらか一方が 過剰な状態であれば、 上記式 （2 ' ) で示される 4一トリアルキルアミノー 3— ヒ ドロキシブタンアミ ドハロゲン化物の再結晶操作などを行えば光学純度を向 上させることが可能である。 またラセミ体の 4一トリアルキルアミノー 3—ヒド ロキシブタンアミ ドハロゲン化物を製造した場合は、 光学分割剤などを用いて光 学活性な 4一トリアルキルアミノ一 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドハロゲン化物 を得ることも可能である。
4一ハロー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドを基質として用い、 水性溶媒中で 4級 アミノ化反応を行うと、 これまで報告されたような 4一ハロー 3—ヒ ドロキシブ チロニトリルや 4一ハロー 3—ヒ ドロキシ酪酸エステルの 4級ァミノ化反応と 比較して、 格段に 4級ァミノ化生成物の収率が高い。 4級ァミノ化反応は、 ハロ ヒ ドリン化合物から脱塩酸反応が起こってエポキシ化合物が生成した後、 トリア ルキルァミンの求核攻撃により 4級ァミノ化物が生成する反応が主反応、 クロト ン酸誘導体への異性化反応が副反応であると想定される。 このクロトン酸誘導体 への異性ィヒ反応の起こりやすさが 4級ァミノ化生成物の収率の高低を左右し、 異 性化のし易さを決定するのは官能基の電子吸引性であると予想される。 二トリノレ やエステルといった官能基よりもアミ ドの方が電子吸引性が低く、 クロトン酸誘 導体への異性化反応が起こりにくい。 このためエポキシ体→ク口トン酸誘導体へ の異性化反応の割合が減少し、 その分トリアルキルァミンの求核攻撃の割合が上 昇して 4級ァミノ化生成収率が高くなつたものと想定される。
本発明において、 上記式 （2 ' ) で示される 4一トリアルキルァミノ一 3—ヒ ドロキシブタンアミドハロゲン化物を加水分解する工程において、 加水分解反応 の方法は特に限定されず、 酸触媒、 塩基触媒を用いた種々の公知の方法で行うこ とができる。 例えば特公昭 4 3 - 2 6 8 4 9 , 特開昭 5 5— 1 3 2 9 9にはシュ ゥ酸を用いて加水分解反応を行う方法、 特公昭 4 3 - 2 6 8 5 0には n—亜硝酸 ブチルと氷酢酸及び塩酸ガスを用いて加水分解する方法、 特開平 1一 2 8 7 0 6 5には、 カルニチン二トリルクロライドから一貫してアルカリ金属水酸化物ゃァ ルカリ土類金属水酸化物などの塩基触媒を用いて二トリル→ァミド→カルボン 酸への加水分解する方法が示されている。 また特開平 0 4— 3 2 0 6 7 9には力 ル-チンアミドを L一カルニチンに変換する酵素を用いる方法が示されている 力 酸触媒、 塩基触媒、 酵素触媒のいずれの方法にも限定されるものではない。
4一トリアルキルァミノー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドハロゲンィ匕物の加水 分解反応における主な副生成物は、 脱水体であるクロトノベタインである。
4ートリアルキルアミノー 3—ヒ ドロキシプタンアミ ドハロゲン化物の酸触 媒による加水分解反応では、 このクロトノベタインの副生を抑える （対べタイン で 0 . 1 w t %以下） ことが可能であるが、 反応速度が遅いために厳しい反応条 件が必要である。 使用される酸性物質としては、 塩酸、 硫酸、 リン酸、 硝酸など の鉱酸や、 酢酸、 トリフルォロ酢酸などの比較的低炭素数の有機酸などが使用さ れるが、 工業的によく使用される塩酸や硫酸を使用することが好ましい。
4一トリアルキルアミノー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドハロゲン化物の塩基 触媒による加水分解では、 酸触媒の場合よりもクロトノベタインの生成量は多い が、 塩基の種類によっては室温下でも効率よく加水分解反応を進めることができ、 このような穏やかな反応条件下であればクロトノベタインの生成を抑える （対べ タインで 1 w t%以下程度） ことも可能である。 また塩基触媒の場合は副生する アンモニアを気化除去できるため、 加水分解後の中和の際に副生する塩を少なく することが可能になる。使用される塩基性物質としては、アルカリ金属水酸化物、 アル力リ土類金属水酸化物、 アル力リ金属の炭酸塩または重炭酸塩、 第 3級アミ ン、第 4級アンモニゥムヒドロキシド、塩基性陰イオン交換樹脂などが挙げられ、 具体的には NaOH、 KOH、 C a (OH) 2、 Na2C〇3、 K2C03、 トリエ チルァミン、 NH4OH、 陰イオン交換樹脂 I R A— 400などが挙げられる。 これらは単独で用いても、 2種類以上を組み合わせて用いてもよい。 特に N a O H、 KOHは反応を室温下でも効率よく進めることができ、 しかもクロトノベタ ィンの副生が少ないので好ましい。
酸、 塩基の使用量は、 上記式 （2') で示される 4一トリアルキルアミノー 3 —ヒドロキシブタンアミドハロゲン化物に対して等モル以上になるように加え ればよく、 1. 1〜5. 0当量程度がより好ましい。 上記式 （2') で示される 4ートリアルキルアミノー 3—ヒドロキシブタンアミ ドハロゲン化物の濃度は 特に限定されないが、通常は 1〜50%程度で、 5〜30%程度がより好ましい。 反応温度は特に限定されないが、 通常は 5〜100°Cが好ましい。 酸触媒を用い た場合はクロトノベタインの生成は極めて少ないため、 反応時間の観点から 60 〜100°Cが特に好ましい。 また塩基触媒を用いた場合を鋭意検討した結果、 ク 口トノベタインの副生量は反応温度に依存し、 反応温度を低く したほうが生成を 抑えられることがわかった。 よって塩基触媒を用いた場合は、 クロトノベタイン の副生を抑える観点から、 10〜60°Cがより好ましい。
溶媒としては特に制限はないが、 前記水性溶媒が好ましく、 反応速度と副反応 抑制の観点から水単独を溶媒として使用することが特に好ましい。 また 4級ァミ ノ化反応を水性溶媒で行った場合は、 そのまま水性溶媒で加水分解反応を行うこ とがより好ましい。
これまで述べてきた 4一ハロー 3—ヒドロキシプチロニトリルのァミ ド化反 応、 4一ハロー 3—ヒドロキシブタンアミ ドの 4級ァミノ化反応、 4一トリアル キルァミノー 3—ヒドロキシブタンァミドハロゲン化物の加水分解反応は、 反応 速度の観点からいずれも水性溶媒中で行うことが好ましい。 特に、 水単独を反応 溶媒とすることでさらにその効果は顕著となる。 また、 ェピハロ ヒ ドリンまたは 1， 3—ジハロー 2—プロノ ノールから 4一ハロー 3—ヒ ドロキシブチロニトリ ルを合成する反応も、 通常は水性溶媒中で行われる。 よって前述のすべての反応 において水を単独で溶媒として用いると、 出発原料からベタインまでワンポット で反応させることもできるため、 より好ましい。
加水分解反応では、 薄い褐色に着色することがある。 また加水分解反応終了後 の中和後にも着色することがある。 この脱色のため、 活性炭などによる脱色操作 を行ってもよレ、。
上記のようにして得られたベタインは、抽出、カラム分離、再結晶、電気透析、 ィオン交換法等の定法に従い、 単離精製することができる。
4一ハロー 3—ヒ ドロキシプチ口-トリノレ、 4 —ノヽ口一 3—ヒ ドロキシブタン アミ ド、 4—トリアルキルアミノー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドハロゲン化物の 光学活性体を加水分解反応の前駆体、 若しくは基質として用いた場合、 得られた ベタインも光学活性体となるが、 光学活性体のどちらか一方が過剰な状態であれ ば、 ベタインの再結晶操作などを行えば光学純度を向上させることが可能である。 またラセミ体のベタィンを製造した場合は、 光学分割剤などを用いることによつ て、 光学活性なベタインを得ることも可能である。
4一ハロー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ド、 4一トリアルキノレアミノ一 3—ヒ ド ロキシブタンァミドハロゲン化物およびべタインのいずれの段階でも再結晶操 作などで光学純度を向上させることが可能であるが、 各反応工程において副生成 物が発生するため、 ベタインまで製造してから精製を兼ねた再結晶操作などによ り光学純度向上操作をまとめて行うことがより好ましい。
本発明において、 光学活性なェピハロヒドリン、 4一ハロー 3—ヒドロキシブ チロニ ト リゾレ、 4一ハロー 3 —ヒ ドロキシブタンアミ ド、 4ー ト リ アノレキルア ミ ノー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドハロゲン化物を製造または使用してベタイン の製造を行つた場合、 光学純度を低下させることなく対応する光学活性なベタイ ンを生成することができる。 すなわち本発明は、 光学活性なベタイン、 特に L一 カル-チンを製造する方法として有用である。 <実施例 >
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 本発明はこの例のみに限 定されるものではない。
本発明において使用した各種定量分析方法について、 分析方法詳細を以下に示 す。 分析方法 （1)
• 分析対象化合物
今 1, 3—ジクロロー 2—プロパノール （以下 DC Pと略す）
今 ェピクロロヒ ドリン （以下 ECHと略す）
今 4—クロロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリル （以下 CHBNと略す）
• 試料調製方法 ： 反応液を移動相に溶解
• カラム ： I n e r t s i l 〇DS— 3V, 4. 6 mm
I . D. X 2 5 0 mm, 粒径 5 μ m (G Lサイエンス 製）
· カラムオーブン温度 ： 40°C
• 移動相 ： 水 アセトニトリル Zりん酸 = 70Z3 OZO. 1、
丄 m / m 1 n
• 検出器 ： 示差屈折計（R I)
• 注入量 ： 20 μ 1
· 保持時間 ： DCP 1 5. 7m i η
： ECH 1 1 m i n
： CHBN 7. 2m i n 分析方法 （2)
• 分析対象化合物
今 4一クロロー 3—ヒ ドロキシブチロニトリル （以下 CHBNと略す） 今 4一クロロー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ド （以下 CHBAと略す） 今 4ーヒドロキシクロトンアミド （以下 HCAmと略す）
• 試料調製方法 ： 反応液を移動相に溶解
• カラム ： I n e r t s i l OD S - 3 V,
4. 6 mm I . D. X 25 Omm, 粒径 5 μ m (GLサイエンス製）
• カラムオーブン温度： 40。C
• 移動相 ： 0. 05% トリフルォロ酢酸水溶液、 lmL/m i n
• 検出器 ：示差屈折計 (日本分光製 R I— 203 1)
• 注入量 2 0 μ I
• 保持時間 ： CHBN 1 1. Om i n
： CHB A 6. 7 m i n
： HCAm 4. 4 m i n 分析方法 （3)
• 分析対象化合物
力 二チンアミ ドク口ライド （以下 C a r—アミ ドと略す）
カルニチン-トリルクロライド （以下 C a r—二トリルと略す） カル-チン （以下 C a rと略す）
• 試料調製方法 ：反応液を移動相に溶解
• カラム ： S h o d e x I C YK— 421，
4. 6 mm I . D. X 1 25 mm (GLサイエンス 製）
• カラムオーブン温度： 40 °C
• 移動相 ： 3mM HN03 a q/ATN=4/6, lmL/m i 検出器 電気伝導度検出器 （C D— 5 ) S
注入量 2 0 μ I
保持時間 C a r—アミド 1 0. 2 m i n
： C a r一二トリル 8. 9 m i n
： C a r 7. 9 m i n 分析方法 （4)
• 分析対象化合物
カルニチン （以下 C a rと略す）
今 クロトノベタイン （以下 CBと略す）
• 試料調製方法 ：反応液を移動相に溶解
• カラム ： Nu c l e o s i l 1 0 0— 5 N (CH3) 2
4. 6 mm I . D. X 2 5 0 mm (GLサイエンス カラムオーブン温度： 4 0°C
移動相 ： 5 OmM KH2 P04 (p H = 4. 7) a q/ATN
Figure imgf000035_0001
検出器 UV検出器 (2 0 5 nm) 日本分光製 UV— 9 3 0 注入量 5 μ 1
保持時間 C a r
3. 0 m i n 分析方法 （5) (R) 一 CHBN光学純度測定法
(R) 一 CHBNの光学純度は、 以下のようにして測定した。
(R) -CHBN 1 μ 1にジクロロメタン 2 0 /i 1、 ピリジン 2 0 μ 1を加え た後、 （R) — α—メ トキシ一 α— （トリフルォロメチル） フエ二ルァセチルク 口ライド （ΜΤ ΡΑ) 2 μ 1を添カ卩し、 そのまま室温で 5時間撹拌を行った。 反 応終了液にジィソプロピルェ一テル 3 0 0 μ 1を添カ卩し、 続いて 1 N HC 1水 溶液 3 5 0 μ 1を用いて洗浄し、 有機層を回収した。 さらに有機層を飽和炭酸水 素ナトリゥム水溶液 3 5 0 μ Iで洗浄し、 有機層を減圧乾燥、 残渣をィソプロパ ノールに溶解させ、 これを HP LCで分析を行った。
本分析に用いた HP L Cシステムは以下の通りである。
• 分析対象化合物
今 (R) -CHBN MTPAエステル
(S) -CHBN MTPAエステル
• カラム ： P a r t i s i l — 5 (G L S c i e n c e)
4. 6 mm X 2 5 0 mm
カフム才- -ブン温度 ： 4 0°C
移動相 ： へキサン：ィソプロノ、 °ノーノレ = 9 9 : 1、 1 m l /ra i n
検出器 UV 2 5 4 nm
保持時間 ： (R) -CHBN MTPAエステル： 1 1. 9 m i n ： (S) -CHBN MT P Aエステル： 1 3. 0 m i n 分析方法 （6) L—カルニチンの光学純度測定
L一カルニチンの光学純度は、 J. Pharm. Bio. Anal. , 14(1996)1579-1584 に 従い、 以下のようにして測定した。 '
光学純度を測定したいカルニチン乾燥試料に、 2mg/ml の 9一アントロイル- トリノレの DMS O溶 ί夜 1 m I と、 0. 1 m g /m 1キヌクリジンのァセトニトリ ル溶液 1 m 1を加えて溶解し、 8 0 °Cで 9 0分間反応をさせる。 室温まで冷却し た後、 シリカゲル力ートリツジカラム （ 1 c c B o n d E l u t (V a r i a n)) に乗せ、 メタノール Zァセトニトリル = 9 ： 1溶液 10m 1で未反応の 9 一アントロイル-トリル、 キヌクリジンを洗い流す。 続いて 5 πι 1の超純水を流 し、 得られた溶液を以下の HP LCで解析を行う。 分析対象化合物
L一カル-チン
今 D—カル-チン
カラム ： U 1 t r o n E S-OVM (信和化工社製）
2. 0 mmX 1 5 Omm
カラムオープン温度 ： 40°C
移動相 ： ァセトニトリル / 20 mM KH2 P04
(pH=4. 5) =17/83
: 0. 2 m 1 / m i n
· 検検出出器 ： UV 254 nm '
注入量 : 2 5 μ 1
保持時間 ： L一カノレエチン： 6. 8m i n
： D—力ノレ二チン： 5. 2m i n
L一カルニチンの光学純度は上記 D， L—カルェチンの ARE Aから、 下記式に て表される。
光学純度 （％e e) = (L一カルニチン ARE A— D—カルニチン AREA) /
(L—カルニチン ARE A + D—カルニチン ARE A)
X 100 I . 4一クロロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリル （CHBN) 合成
[実施例 1 ]
ェピクロロヒ ドリン +青酸→CHBN合成 （特開 2002— 241357参照)
Figure imgf000037_0001
攪拌機、 温度計、 ジムロート冷却管を備えた 3 Lセパラブルフラスコに、 ェピ クロロヒ ドリン 274. 93 g (2. 97mo l)、 水 1271. 3 g、 硫酸ナ トリウム 191. 75 g (1. 35mo 1 ) を仕込み、 温水浴中で攪拌しながら 内温 50〜60°Cでシアン化水素 72. 3 g (2. 70 m o 1 ) を 1時間かけて 反応液中に直接供給した。 その後、 内温 50〜60°Cで熟成を 6時間行った。 反 応液を水浴で冷却した後、 酢酸ェチル 1 Lで 1回抽出を行った。 有機層を減圧下 に濃縮し、 CHBNの粗生成物を 249. 33 g得た。 GC分析の結果、 純度 8 0. 9%、 収率 62. 5%であった。 上記の抽出 CHBN (粗生成物） を単蒸留 により精製を行い、 精製品 187. 51 gを得た。
[実施例 2]
ェピクロロヒドリン +青酸ナトリゥム→CHBN合成 （特開 2004-1826
07参照)
Figure imgf000038_0001
撹拌機、 滴下漏斗、 温度計、 pH計を備えた密閉型のガラスフラスコに、 窒素 雰囲気下でェピクロロヒドリン 262. 3 g、 水 700 gを仕込み、 撹拌下に 4 0 °Cで反応液の pHが 8となるように制御しながら 30. 6 w t %青酸ナトリウ ム水溶液 432. 3 g (2. 7mo l )と 65w t %硫酸水溶液 203. 7 g ( 1. 35mo 1) を 3時間かけて同時に滴下した。 滴下後、 撹拌下 40°Cで 5時間反 応させた。 次いで、 ガラスフラスコを密閉したまま酢酸ェチル 25 Om 1を加え て 40°Cで抽出操作を行った。 内容物を分液漏斗に移して有機層を取得し、 得ら れた有機層を減圧下 50°Cで濃縮し、 さらに減圧蒸留を行って CHBN 190. 6 gを得た。 得られた CHBNの実得収率は 58. 1%であった。
[実施例 3]
1 , 3—ジクロ口一 2—プロパノール +青酸ナトリゥム→CHBN合成 CN
Figure imgf000039_0001
1 ) ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養
ハロヒ ドリンエポキシダーゼ活性を持つ大腸菌 (Escherichia coli) JM109/ p ST 1 1 1 (F ERM ABP— 10922、特開平 5— 31 7066号参照） を、 LB培地（1%バク ト トリプトン、 0. 5%バク トイース トエキス、 0. 5% Na C l、 1 mM I PTG、 50 μ g/m 1アンピシリン)が l O OmLずつ入 れた 50 OmL容三角フラスコ、 20本それぞれに植菌し、 3 7 °Cで 20時間振 盪培養した。 20本分の培養菌体を遠心分離により集菌し、 集菌した菌体を 50 mM トリス—硫酸緩衝液 （pH 8. 0) で洗浄し、 50mM トリスー硫酸緩 衝液 （pH 8. 0) を 20 gになるように加え、 懸濁した。 この菌体懸濁液 0.
25 gを50mM トリスー硫酸緩衝液 （pH 8. 0) 1 00m Lに加え、 さら に 5 OmMとなるように 1, 3—ジクロロー 2—プロパノールを加え、 20°Cで 1 0分間反応した。 H P L Cにより反応液中のェピクロロヒドリンの量を測定し たところ、 1 lmMであった。
なお、 p STl l lは、 コリネバクテリゥム （C o r y n e b a c t e r i u m) s p . N— 1 074のハロヒ ドリンエポキシダーゼ遺伝子 （h h e B) を 含む B amH I— P s t I 1. 1 Kb 断片を pUC 1 18 に結合させたプラス ミ ドである。 また、 p ST 1 1 1は、 特開平 5— 3 1 7066公報に記載されて おり、 JM109/p ST l l lは、受領番号 F ERM ABP— 10922とし て、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (茨城県つくば巿東 1 一 1一 1中央第 6)に平成 3年 3月 1日付けで国際寄託されている。 ii) 1， 3—ジクロロー 2—プロパノールからの （R) — CHBNの合成
pH電極、 ならびに pHコントローラ一により制御されたアルカリ投入配管を 装着した 50 OmL容フラスコに水 170. 6 g、 lmo l /k g トリスー硫 酸緩衝液 （ρΗ8. 0) 33. 5 g、 6mo 1 /k g N a C N水溶液 57. 0 gを入れ、 98 %硫酸 1 5. 5 gで、 pH8. 0に調整した。 1， 3—ジクロ ロー 2—プロパノール 1 3. 3 gを入れ、 均一に溶解するまで攪拌した。
系内の pHを 7. 9〜8. 0に維持するよう、 emo lZk g N a C N水溶 液を投入するように pHコントローラーを設定し、 i) で調製したハロヒ ドリン エポキシダーゼ活性を持つ菌体懸濁液 47. 2 g (18. 9 kU) を加え、 20°C で反応を開始した。
20°Cで系内の pHを 7. 9〜8. 0に維持しながら、反応開始直後より、 1， 3—ジクロロー 2 _プロパノー 6. 7 gを 4. 5時間かけて均等に滴下した。 その後、 20°Cで系内の p Hを 7. 9〜8. 0に維持しながら、 1. 5時間（反 応開始から 6時間）反応させた。反応終了時、 6mo lZk g Na CN水溶液は、 54. 4 g投入されており、 反応液の全量は 428. 2 gであった。 このとき、 反応系内の 1， 3—ジクロ口—2—プロパノールの濃度は 3. 7% (1 5. 8 g) であり、 4一クロロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリルの濃度は 7. 1 % (30. 4 g； 収率 65. 6 %) であった。 また、 このときの 4一クロ口一 3—ヒドロキ シブチロニトリルの光学純度は 92 % e eの （R) —体過剰であった。
この反応液を塩酸で pH= 5. 0に調節し、 60°C、 140 t o r rで減圧し て 1 1時間 HCNの除去を行い、 反応系内の HCNを硝酸銀で滴定、 1 p pm以 下であることを確認した。
[実施例 4]
1, 3—ジクロロー 2—プロパノール +青酸→CHBN合成
Figure imgf000040_0001
i )ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養は実施例 3と同様に行 つた。 ii) 1, 3—ジクロ口一 2—プロパノールからの （R) — CHBNの合成 p H電極、 ならびに p Hコントローラ一により制御されたアルカリ投入配管を 装着した 300mL4つ口フラスコに水 127. 55 g、 HCN4. 41 g (0. 1632 mo 1 ) を入れ、 30 %N a OH 0. 65 g (0. 0049 m o 1 ) で、 pH7. 5に調整した。 1， 3—ジクロロー 2—プロパノール 10. 00 g (0. 0775mo 1 ) を入れ、 均一に溶解するまで攪拌した。
上記 i ) の方法により調製したハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ菌体懸 濁液 20. O O gを加え、 20°Cで反応を開始した。 系内の pHを 7. 5〜7. 6に維持するよう、 30%NaOHを投入するように pHコントローラーを設定 し、 投入された N a OHとほぼ等モルの割合で 1， 3—ジクロロー 2—プロパノ ール， HCNを追加していくことで、 系内の 1 , 3—ジクロロー 2—プロパノ ールの濃度を 0. 5mo 1 /k gを超えないよう、 また、 系内のシアンイオン濃度 を 1. 1 m o 1 /k gを超えないようにした。
23時間後、 4 _クロロー 3—ヒドロキシプチ口-トリルを 0. 753mo l /k g蓄積することができ、 その光学純度は 94. 8 % e . e. の （R) —体過乗 lj であった。 反応により消費された 1， 3—ジクロロー 2—プロパノールからの収 率は 96. 3%であった。
この反応液を塩酸で pH= 5. 0に調節し、 60°C、 140 t o r rで減圧し て 1 1時間 HCNの除去を行い、 反応系内の HCNを硝酸銀で滴定、 1 p p m以 下であることを確認した。
Π. 4一ハロー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ド合成
[実施例 5 ]
本発明で使用した二トリルヒドラターゼは、 以下のようにして調製した。
(培養及び反応用菌体液の調製方法）
二トリルヒドラクーゼ活性を有する口ドコッカス 口ドク口ウス (Rhodococcus rhodochrous) J一 1 (FEEM BP- 1478)を、 30 L容ジャーファーメンター （高杉 製作所社製） にてグルコース 2質量％、 尿素 1質量％、 ペプトン 0. 5質量％、 酵母エキス 0. 3質量0 /0、塩ィヒコバルト 0. 05質量0 /0を含む、 20 の培地（ H7. 0) に植菌し、 温度 30°Cで好気的に 60時間培養した。 上記の方法によ り培養して得た菌体を遠心分離により集菌し、 5 OmMリン酸緩衝液（pH 7. 7) にて同量で 2回洗浄後、 懸濁し、 反応用菌体液とした。
[実施例 6]
CHBN (実施例 1) →CHBA合成
Figure imgf000042_0001
実施例 1で合成した精製品 CHBN ： 16 g (1 34mmo 1 ) を採取し、 1 30 で 2時間加熱を行つた。冷却後、 20 mMのリン酸パッファー（pH=7. 5) 84 gを加え、 実施例 5で調製した J一 1菌を 200 L滴下し氷浴下 2 °C で反応を開始した。 3時間後 CHBNの転化率は 1 00%に達し、 CHBAが 1 8. 3 g (収率 99. 3%) 生成していることを確認した。
上記反応終了液 50. 1 g (CHBA9. 20 g含有） を採取し、 セライト 5 g を加えてエバポレーターで 40°Cで乾固した。 残渣をシリカゲル 30 gの上に乗 せ、 酢酸ェチル 400 gをキャリア一として流して溶出させた。 溶出した酢酸ェ チル溶液をエバポレーターで乾固し、 CHBAの白色固体を 7. 27 g (単離収 率 79 %) で得た。
[実施例 Ί ]
CHBN (実施例 2) →CHBA合成
Figure imgf000042_0002
実施例 2で合成した蒸留品 CHB N : 1. 6 g (1 3. 4 mm o 1 ) を採取し、 2 OmMのリン酸バッファー （pH=7. 5) 8. 4 gを加え、 C o C 1 2 · 6 H20の lmgZm l水溶液を 388 1添加して 2時間撹拌した後、 実施例 5 で調製した J一 1菌を 滴下し氷浴下で反応を開始した。 3時間後 C H B Nの転化率は 100%に達し、 CHBAが 1. 84 g (収率 99. 8%) 生成し ていることを確認した。
[実施例 8]
CHBN (実施例 3) →CHBA合成
OH OH
f 二トリルヒドラタ；ゼ C /CONH2
実施例 3で合成した （R) — CHBN7 溶液： 10. 0 g ((R、 S) 一 CH BN濃度 1 6. 7%、 1 3. 97mmo 1含有） を採取し、 1 00°Cで 4時間加 熱を行った。 冷却後、 N a OHa qで中和して pH=7. 02とし、 実施例 5で 調製した J一 1菌を 63 μ L滴下し氷浴下で反応を開始した。 2時間後 CHB.N の転化率は 1 00%に達し、 （R) — CHBAが 1. 91 g (収率 99. 4%) 生成していることを確認した。
[実施例 9 ]
CHBN (実施例 4) →CHBA合成
Figure imgf000043_0001
実施例 4で合成した （R) — CHBN水溶液： 50. 0 g ((R、 S) 一 CH BN濃度 14. 0%、 58. 6mmo 1含有） を採取し、 C o C 12 · 6H20の 1 m g/m 1水溶液を 1. 7 m l添カ卩した後、 N a OH a qで中和して pH=7. 06とし、 2時間撹拌した。 その後実施例 5で調製した J一 1菌を 270 μ L滴 下し氷浴下で反応を開始した。 2時間後 CHBNの転化率は 1 00%に達し、 (R) —CHBAが 8. 04 g (収率 99. 7 %)生成していることを確認した。
DI. CHB Aの 4級ァミノ化反応 （カルニチンアミドク口ライド合成）
[実施例 10]
CHBA (精製品） の 4級ァミノ化反応
OH OH
1 ノ C0NH2 N CI- Me3+Nゝ „ 実施例 6で合成した精製品 CHB A： 1. 84 g (1 3. 4mmo 1 ) に純水 を加えて 10. 2 gにし、 30%トリメチルァミン水溶液 3. 1 5 g (16. 0 mmo 1) を加え、 30°Cで反応を開始した。 4時間後 C H B Aの転化率は 10 0%に達し、 C a r—アミドが 2. 48 g (収率 94. 0%)、 HCAn^SO. 071 g (収率 5. 2%) 生成していることを確認した。
[比較例 1 ]
CHBN (実施例 1精製品） の 4級ァミノ化反応
Figure imgf000044_0001
実施例 1で合成した精製品 CH B N： 1. 6 g (13. 4 mm o 1 ) に純水を 加えて 10. 2 gにし、 30%トリメチルァミン水溶液 6. 60 g (3 3. 5 m mo 1 )を加え、 30°Cで反応を開始した。 7時間後 CHBNの転化率は 100% 一二トリルが 1. 56 g (収率 65. 1%) 生成していることを
[比較例 2]
4—クロロー 3—ヒドロキシ酪酸メチルの 4級ァミノ化反応
OH OH
CI. ,COOCH3 3 CI" Me^N, 'COO—
4一クロ口 _3—ヒ ドロキシ酪酸メチル： 2. 0 g (13. lmmo 1) に純 水を加えて 1 0. 0 gにし、 30 %トリメチルァミン水溶液 5. 1 6 g (26. 2mmo 1) を加え、 30°Cで反応を開始した。 反応途中で γ—ヒ ドロキシプチ 口ラクトンが観測され、 7時間後 4一クロロー 3—ヒドロキシ酪酸メチルの転化 率は 100%に達した。 この時エステルのメチル基と Τ ーヒ ドロキシブチロラタ トンが消滅していることを確認、 〇 & 3：が0. 36 g (収率 1 7. 1%) 生成し ていることを確認した。 1 H，l 3 C—NMR測定により、 C a rの他に 3， 4一 ジヒドロキシ酪酸が生成していることを確認した。
[実施例 1 1 ]
CHBA (実施例 7水溶液） の 4級ァミノ化反応 ONH2
Figure imgf000045_0001
実施例 7の反応終了液 1 0. 18 g (CHBA1. 84 g含有） に 30%トリ メチルァミン水溶液 21. 1 5 g (107. 3 mm o 1 ) を加え、 30 °Cで反応 を開始した。 0. 75時間後 CHB Aの転化率は 1 00%に達し、 C a r—アミ ドカ S2. 55 g (収率 96. 9%)、 HCAn^SO. 05 7 g (収率 4. 2 %) 生成していることを確認した。
[実施例 12 ]
CHBA (実施例 9水溶液） の 4級ァミノ化反応 OH
。 1 ノ CONH2 NM CI- Me3+N
実施例 9の反応終了直後 26. 0 g (CHBA4. 0 2 g含有） を取り出し、 ただちに 30%トリメチルァミン水溶液 8. 3 g (35. 0 mm o 1 ) を加え、 30°Cの水浴につけて反応を開始した。 4時間後 CHBAの転化率は 100%に 達し、 C a r—アミ ドが 5. 42 g (収率 94. 4%)、 HCAn^S0. 1 5 g
(収率 5. 0%) 生成していることを確認した。
[実施例 13]
CHBA (実施例 9水溶液） の 4級ァミノ化反応
Figure imgf000046_0001
実施例 9の反応終了直後、 26. 0 g (CHBA4. 02 g含有） を取り出し て 20°Cで 15時間放置した。 HP LC分析の結果、 CHBAは 2. 84 gに減 少していた。 そのまま 30%トリメチルァミン水溶液 8. 3 g (35. Ommo 1 ) を加え、 30°Cの水浴につけて反応を開始した。 4時間後 CHBAの転化率 は 1 00%に達し、 C a r—アミドが 3. 84 g (収率 94. 6%)、 HC Am が 0. 10 g (収率 4. 8%) 生成していることを確認した。 実施例 9のアミド 化反応終了直後の CHBA量 （4. 02 g) を基準にすると、 Ca r—アミドの 収率は 66. 8%、 HCAmの収率は 3. 4%である。 以上 4級ァミノ化反応をまとめると以下のようになる。 CHBAを基質として 用いて 4級ァミノ化反応を用レ、る優位性は明らかである。
Figure imgf000047_0002
IV. カル-チンアミ ドク口ライ ドの加水分解反応
[実施例 14]
C a r—アミ ド （実施例 10水溶液） の加水分解反応
Figure imgf000047_0001
実施例 10の反応終了液 1 3. 20 g (C a r—アミ ド 2. 45 g含有） に 3 0%NaOHa qを 2. 68 g (20. Ommo l) カ卩え、 50°Cで反応を開始 した。 5時間後、 C a r—アミ ドの転化率は 1 00%に達し、 反応を終了した。 系内を HC 1 a qで中和後、 エバポレーターで減圧して水を除去し、 次いでエタ ノー/レ 1 Om 1を加えてさらに水を共沸除去させた。 このエタノールによる水の 共沸除去操作を計 3回行い、 析出した白色固体に再度エタノール 10m lを加え てよく撹拌する。 溶けない白色固体は Na C 1であり、 これを吸引濾過で濾別し て濾液中の C a rを定量すると、 C a r 1. 94 g (収率 96. 6 %)、 CB 0. 03 g (対 C a r l. 5 w t %) が生成していることがわかった。
[実施例 1 5]
C a r _アミド （実施例 1 2) →C a r合成
Figure imgf000048_0001
o°" 実施例 1 2の反応終了液 1 6. 37 g (C a r—アミド 2. 59 g含有） に 4 8%NaOHa qを 2. 2 g (26. 4mmo l) 加え、 30°Cで反応を開始し た。 8時間後、 C a r—アミ ドの転化率が 80%に達した後 40°Cに昇温して、 さらに 6時間反応をさせたところ、 C a r—アミドの転化率が 100%に達し、 反応を終了した。 系内を HC 1 a qで中和後、 反応液中の （L) 一 C a rと CB を定量すると、 （L) —C a rが 2. 09 g (収率 98. 5%)、 じ8が0. 01 5 g (対 C a r O. 7%) 生成していることがわかった。 この水溶液の一部を採 取して乾燥させ、 C a rの光学純度を測定したところ、 94. 2 % e . e. であ つに。
[実施例 1 6 ]
C a r—アミド （実施例 1 2) →C a r合成
M
Figure imgf000048_0002
実施例 1 2の反応終了液 1 6. 37 g (C a r—アミド 2. 59 g含有） に 3 6%HC l a qを 4. 01 g (39. 6mmo l) 加え、 80°Cで反応を開始し た。 8時間後、 C a r—アミドの転化率が 100%に達し、 反応を終了した。 系 内を N a OH a qで中和後、反応液中の（L) —Ca rと CBを定量すると、 （L) -C a r 2. 1 1 g (収率 99. 4%)、 CB 0. 001 g 率 0. 05%) が生成していることがわかった。 この水溶液の一部を採取して乾燥させ、 Ca r の光学純度を測定したところ、 94. 5 % e . e. であった。 産業上の利用可能性
本発明により、 ベタインの製造方法が提供される。 本発明は、 副反応を従来よ りも大幅に防ぎ、 カルニチン等のベタインを高収率で得ることができる点で有用 である。

Claims

求 の 範 次式 (2) ：
Figure imgf000050_0001
[式中、 X1は、 ハロゲン原子である。]
で示される 4一ハロー 3—ヒ ドロキシブタンアミドを （NA1A2A3) で 示されるトリアルキルァミンで 4級ァミノ化する工程を含む、 次式 （2') ：
Figure imgf000050_0002
[式中、 A1 A2及ぴ A3は、 それぞれ、 互いに独立し、 同一または異な つて、 置換基を有していてもよい C C 。炭化水素基であり、 X1は、 ハ ロゲン原子である。]
で示される 4一トリアルキルアミノー 3 _ヒ ドロキシブタンアミ ドハロゲ ン化物の製造方法。
2. 前記トリアルキルァミンが、 トリメチノレアミン、 トリェチルァミンおょぴ トリブチルァミンからなる群より選択されるものである、 請求項 1に記載 の方法。
3. 次式 （2') [式中、 A A2及び A3は、 それぞれ、 互いに独立し、 同一または異な つて、 置換基を有していてもよい。 〜じ^炭化水素基であり、 X1は、 ハ ロゲン原子である。]
で示される 4一トリアルキルアミノー 3—ヒ ドロキシブタンアミ ドハロゲ ン化物を加水分解する工程を含む、 次式 （1) ：
Figure imgf000051_0001
[式中、 A A2及び A3は、 それぞれ、 互いに独立し、 同一または異な つて、 置換基を有していてもよい 〜じ 2。炭化水素基である。] で示されるベタイン、 またはべタインの塩の製造方法。 A2および A3がメチル基である、 請求項 3に記載の方法。
Figure imgf000051_0002
(2)
Figure imgf000051_0003
[式中、 X1は、 ハロゲン原子である。]
で示される 4一ハロー 3—ヒドロキシブタンァ
Figure imgf000052_0001
[式中、 X1は、 ハロゲン原子である。]
で示される 4一ハロー 3—ヒ ドロキシプチロニトリルをアミド化する工程 により得られるものである、 請求項 3または 4に記載の方法。
6. アミ ド化が二トリルヒドラターゼで処理するものである、 請求項 5に記 載の方法。
7. 前記二トリノレヒ ドラターゼが、 ァクロモノくクタ一 （Ac h r omo b a c t e r ) 属、 ァシドボラックス （A c i d o V o r a X) 属、 ァグロバタ テリゥム （Ag r o b a c t e r i um) 属、 アースロバクタ一（A r t h r o b a c t e r)属、 バチルス （B a c i 1 1 u s ) 属、 プレビパクテリ ゥム (B r e v i b a c t e r i um)属、 ノ ークホノレデリァ （B u r k h o 1 d e r Ϊ a) 属、 キャンディダ （C a n d i d a) 属、 力セォバクタ 一 (C a s e o b a c t e r) 属、 コマモナス (C omamo n a s) 晨、 コリネバクテリゥム（C o r y n e b a c t e r i um)属、 ディーツィァ
(D i e t z i a ) 属、 ェンテロノくクター (En t e r o b a c t e r) 属、 エルビニァ （E r w i n i a) 属、 ジォバチルス （G e o b a c i 1 1 u s ) 属、 ゴルドナ （G o r d o n a ) 属、 クレプシエラ （K 1 e b s i e 1 a) 属、 ミクロァスカス （M i c r o a s c u s) モルガネラ （M o r g a n e l l a) 属、 ノ、。ントエア （P a n t o e a) 属、 プロテウス
(P r o t e u s) 属、 シユードモナス (P s e u d omo n a s)属、 シ ユードノカノレディナ (P s e u d o n o c a r d i a) 属、 ロドコッカス (R h o d o c o c c u s) 属、 リゾビゥム （R h i z o b i u m) 属、 セ ラチア （S e r r a t i a) 属、 ストレプトマイセス （S t r e p t om y c e s ) 属、 シクタリジゥム （S y c t a 1 i d i um) 属、 ッカムレ ラ （Tu k amu r e l l a) 属に属する微生物からなる群より選択され る微生物によって産生される、 請求項 6に記載の方法。
8. 前記 4一ハロー 3—ヒドロキシブタンアミドの製造工程が、 反応液が凍ら ない温度〜 5 °Cで行われる、 請求項 5〜 7のいずれか 1項に記載の方法。
9. 次式 （3) ：
Figure imgf000053_0001
[式中、 X1は、 ハロゲン原子である。]
で示される 4一ハロー 3—ヒドロキシプチロニトリルは、 次式 （4) :
Figure imgf000053_0002
[式中、 X1は、 ハロゲン原子である。]
で示されるェピハロヒ ドリン
または、 次式 （5) ：
Figure imgf000053_0003
[式中、 X1は、 上記の意味を有する。 X2は、 X1と互いに独立し、 同一 または異なつたハロゲン原子である。] で示される 1 , 3—ジハロー 2—プロパノールと、
青酸または青酸塩とを反応させる工程により得られるものである、 請求項 5〜 8のいずれか 1項に記載の方法。 1 0 . 青酸または青酸塩との反応が酵素触媒の存在下で行われるものである請 求項 9に記載の方法。 前記酵素触媒がハロヒドリンエポキシターゼである請求項 1 0に記載の
1 2 . 次式 ( 3 )
Figure imgf000054_0001
[式中、 X 1は、 ハロゲン原子である。]
で示される 4一ハロー 3—ヒドロキシブチロニトリルが、 （R ) 体過剰で 製造される、 請求項 1 1に記載の方法。
3 前記ハロ ヒ ドリ ンエポキシターゼが、 コ リ ネパクテ リ ゥム (Corynebacterium) 属、 ミクロノくクテリゥム (Microbacterium) 為、 ァ グロバクテリウム属、 マイコバクテリゥム （Mycobacterium) 属およびァ ースロバクタ一 (Arthrobacter) 属に属する微生物からなる群より選択さ れる微生物によって産生される、 請求項 1 1または 1 2に記載の方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008133198A (ja) * 2006-11-27 2008-06-12 Mitsubishi Rayon Co Ltd Ｌ−カルニチンの製造方法
JP2010143857A (ja) * 2008-12-18 2010-07-01 Mitsubishi Rayon Co Ltd カルニチンの精製方法
JP2011503132A (ja) * 2007-11-16 2011-01-27 ロンザ リミテッド ベタインの製造方法
CN119345743A (zh) * 2024-12-23 2025-01-24 山东瑞弘生物科技股份有限公司 一种甜菜碱磷酸盐提纯装置和提纯方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104768919B (zh) 2012-11-16 2018-05-18 隆萨有限公司 使包含甜菜碱的组合物脱色的方法
CN103012177B (zh) * 2012-12-17 2015-04-08 苏州浩波科技股份有限公司 左旋肉碱的制备方法

Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4911828A (ja) * 1972-05-11 1974-02-01
JPS5476830A (en) 1977-11-03 1979-06-19 Sigma Tau Ind Farmaceuti Cardial disease treating agent
JPS54113409A (en) 1978-02-03 1979-09-05 Sigma Tau Ind Farmaceuti Treating agent for hyperlipoid disease
JPS5513299A (en) 1978-07-10 1980-01-30 Cavazza Claudio Manufacture of camphoric acid carnitine amide
JPS57165352A (en) 1981-03-18 1982-10-12 Anic Spa Manufacture of l-carnitine
JPS5888312A (ja) 1981-11-06 1983-05-26 シグマ―タウ・インダストリエ・ファルマシゥティシェ・リウニテ・ソシエタ・ペル・アチオーニ カルニチンまたは低級アシルカルニチンからなる静脈疾患治療剤
JPS60258487A (ja) 1984-05-26 1985-12-20 バスフ　アクチェン　ゲゼルシャフト カルニチン又はカルニチンアミドの水溶液の製法
JPS62272983A (ja) 1986-03-14 1987-11-27 イステイトウト・グイド・ドネガニ・ソチエタ・ペル・アツイオニ ３，４−エポキシ酪酸エステルから出発するｌ−（−）−カルニチンクロライドの製造方法
JPH01287065A (ja) 1988-05-13 1989-11-17 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd カルニチンの製造方法
JPH0227995A (ja) 1988-07-15 1990-01-30 Earth Chem Corp Ltd ｌ‐カルニチンクロライドの製造法
JPH02142758A (ja) 1988-11-24 1990-05-31 Takasago Internatl Corp カルニチンメチルエステルハライドの製造方法
JPH0314171B2 (ja) 1982-04-13 1991-02-26 Mitsubishi Electric Corp
JPH04211379A (ja) 1990-02-28 1992-08-03 Teruhiko Beppu ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体
JPH04278089A (ja) * 1991-03-04 1992-10-02 Nitto Chem Ind Co Ltd ハロヒドリンエポキシダ−ゼ遺伝子を有する組換え体プラ　　　　　　　　　　スミドおよび該プラスミドにより形質転換された微生物
JPH04320679A (ja) 1991-02-28 1992-11-11 Degussa Ag Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼを生産する微生物、微生物学的に生産されたｌ‐カルニチン‐アミダーゼ、その取得方法およびｌ‐カルニチンへのｄｌ‐および／またはカルニチンアミドの酵素的変換方法
JPH04365491A (ja) * 1991-06-06 1992-12-17 Nitto Chem Ind Co Ltd ４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造法
JPH05219965A (ja) 1992-02-10 1993-08-31 Nitto Chem Ind Co Ltd 光学活性ハロヒドリンの製造法
JPH05317066A (ja) 1991-03-04 1993-12-03 Hideaki Yamada ハロヒドリンエポキシダ−ゼ遺伝子を有する組換え体プラ スミドにより形質転換された微生物による３−ヒドロキシ ニトリル化合物の製造法
JPH08266277A (ja) 1995-03-29 1996-10-15 Mitsui Toatsu Chem Inc 形質転換体を用いたアミド化合物の製造法
US5807730A (en) 1996-02-14 1998-09-15 Mitsui Chemicals, Inc. Nitrile hydratase
JP2002241357A (ja) 2001-02-19 2002-08-28 Mitsubishi Rayon Co Ltd ４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法
JP2002529528A (ja) 1998-11-16 2002-09-10 シグマ−タウ・インドゥストリエ・ファルマチェウチケ・リウニテ・ソシエタ・ペル・アチオニ Ｌ−カルニチンの製造のための工業的方法
JP2002544252A (ja) 1999-05-18 2002-12-24 シグマ−タウ・インドゥストリエ・ファルマチェウチケ・リウニテ・ソシエタ・ペル・アチオニ Ｓ−（−）−クロロコハク酸またはその誘導体からｒ−（−）−カルニチンを調製するための方法
JP2004182607A (ja) 2002-11-29 2004-07-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd ４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法
JP2006303972A (ja) 2005-04-21 2006-11-02 Toshiba Digital Media Engineering Corp 課金システム

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE659194A (ja) * 1965-02-03 1965-08-03
JPS5920379B2 (ja) 1976-07-23 1984-05-12 三菱重工業株式会社 粉体の充填方法
IE51711B1 (en) 1977-11-03 1987-03-04 Sigma Tau Ind Farmaceuti Carnitine derivatives
JP2840722B2 (ja) * 1989-07-20 1998-12-24 日東化学工業株式会社 ４‐ハロ‐３‐ヒドロキシブチロニトリルの製造法

Patent Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4911828A (ja) * 1972-05-11 1974-02-01
JPS5313611B2 (ja) 1972-05-11 1978-05-11
JPS5476830A (en) 1977-11-03 1979-06-19 Sigma Tau Ind Farmaceuti Cardial disease treating agent
JPS54113409A (en) 1978-02-03 1979-09-05 Sigma Tau Ind Farmaceuti Treating agent for hyperlipoid disease
JPS5513299A (en) 1978-07-10 1980-01-30 Cavazza Claudio Manufacture of camphoric acid carnitine amide
JPS57165352A (en) 1981-03-18 1982-10-12 Anic Spa Manufacture of l-carnitine
JPS5888312A (ja) 1981-11-06 1983-05-26 シグマ―タウ・インダストリエ・ファルマシゥティシェ・リウニテ・ソシエタ・ペル・アチオーニ カルニチンまたは低級アシルカルニチンからなる静脈疾患治療剤
JPH0314171B2 (ja) 1982-04-13 1991-02-26 Mitsubishi Electric Corp
JPS60258487A (ja) 1984-05-26 1985-12-20 バスフ　アクチェン　ゲゼルシャフト カルニチン又はカルニチンアミドの水溶液の製法
JPS62272983A (ja) 1986-03-14 1987-11-27 イステイトウト・グイド・ドネガニ・ソチエタ・ペル・アツイオニ ３，４−エポキシ酪酸エステルから出発するｌ−（−）−カルニチンクロライドの製造方法
JPH01287065A (ja) 1988-05-13 1989-11-17 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd カルニチンの製造方法
JPH0227995A (ja) 1988-07-15 1990-01-30 Earth Chem Corp Ltd ｌ‐カルニチンクロライドの製造法
JPH02142758A (ja) 1988-11-24 1990-05-31 Takasago Internatl Corp カルニチンメチルエステルハライドの製造方法
JPH04211379A (ja) 1990-02-28 1992-08-03 Teruhiko Beppu ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体
JPH04320679A (ja) 1991-02-28 1992-11-11 Degussa Ag Ｌ‐カルニチン‐アミダーゼを生産する微生物、微生物学的に生産されたｌ‐カルニチン‐アミダーゼ、その取得方法およびｌ‐カルニチンへのｄｌ‐および／またはカルニチンアミドの酵素的変換方法
JPH05317066A (ja) 1991-03-04 1993-12-03 Hideaki Yamada ハロヒドリンエポキシダ−ゼ遺伝子を有する組換え体プラ スミドにより形質転換された微生物による３−ヒドロキシ ニトリル化合物の製造法
JPH04278089A (ja) * 1991-03-04 1992-10-02 Nitto Chem Ind Co Ltd ハロヒドリンエポキシダ−ゼ遺伝子を有する組換え体プラ　　　　　　　　　　スミドおよび該プラスミドにより形質転換された微生物
JPH04365491A (ja) * 1991-06-06 1992-12-17 Nitto Chem Ind Co Ltd ４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造法
JPH05219965A (ja) 1992-02-10 1993-08-31 Nitto Chem Ind Co Ltd 光学活性ハロヒドリンの製造法
JPH08266277A (ja) 1995-03-29 1996-10-15 Mitsui Toatsu Chem Inc 形質転換体を用いたアミド化合物の製造法
US5807730A (en) 1996-02-14 1998-09-15 Mitsui Chemicals, Inc. Nitrile hydratase
JP2002529528A (ja) 1998-11-16 2002-09-10 シグマ−タウ・インドゥストリエ・ファルマチェウチケ・リウニテ・ソシエタ・ペル・アチオニ Ｌ−カルニチンの製造のための工業的方法
JP2002544252A (ja) 1999-05-18 2002-12-24 シグマ−タウ・インドゥストリエ・ファルマチェウチケ・リウニテ・ソシエタ・ペル・アチオニ Ｓ−（−）−クロロコハク酸またはその誘導体からｒ−（−）−カルニチンを調製するための方法
JP2002241357A (ja) 2001-02-19 2002-08-28 Mitsubishi Rayon Co Ltd ４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法
JP2004182607A (ja) 2002-11-29 2004-07-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd ４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法
JP2006303972A (ja) 2005-04-21 2006-11-02 Toshiba Digital Media Engineering Corp 課金システム

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Microorganisms with IFO number are listed in the List of Cultures", vol. 1, 1988, INSTITUTE FOR FENNENTATION
HETEROCYCLES, vol. 53, no. 1, 2000
J. PHARM. BIO. ANAL., vol. 14, 1996, pages 1579 - 1584
See also references of EP2096103A4 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008133198A (ja) * 2006-11-27 2008-06-12 Mitsubishi Rayon Co Ltd Ｌ−カルニチンの製造方法
JP2011503132A (ja) * 2007-11-16 2011-01-27 ロンザ リミテッド ベタインの製造方法
JP2010143857A (ja) * 2008-12-18 2010-07-01 Mitsubishi Rayon Co Ltd カルニチンの精製方法
CN119345743A (zh) * 2024-12-23 2025-01-24 山东瑞弘生物科技股份有限公司 一种甜菜碱磷酸盐提纯装置和提纯方法

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