WO2008130263A1 - Monomère et composition destinés à la réception d'hydrogel à faible pourcentage et/ou de l'hydrogel possédant une faible quantité de réticulations transversales, hydrogel et la biopuce basés sur cet hydrogel - Google Patents

Monomère et composition destinés à la réception d'hydrogel à faible pourcentage et/ou de l'hydrogel possédant une faible quantité de réticulations transversales, hydrogel et la biopuce basés sur cet hydrogel Download PDF

Info

Publication number
WO2008130263A1
WO2008130263A1 PCT/RU2007/000196 RU2007000196W WO2008130263A1 WO 2008130263 A1 WO2008130263 A1 WO 2008130263A1 RU 2007000196 W RU2007000196 W RU 2007000196W WO 2008130263 A1 WO2008130263 A1 WO 2008130263A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hydrogel
amino
composition according
compound
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2007/000196
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Sergei Vasilievich Pankov
Alla Yurievna Rubina
Olga Georgievna Somova
Olga Vladimirovna Moiseeeva
Vladimir Romanovich Chechetkin
Nikolai Vladimirovich Sorokin
Maxim Yurievich Donnikov
Veronika Igorevna Butvilovskaya
Elizaveta Vladimirovna Konovalova
Alexandr Sergeevich Zasedatelev
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Molekulyarnoi Biologii Im Va Engeldardta Rossiskoi Akademii Nauk
Original Assignee
Institut Molekulyarnoi Biologii Im Va Engeldardta Rossiskoi Akademii Nauk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Molekulyarnoi Biologii Im Va Engeldardta Rossiskoi Akademii Nauk filed Critical Institut Molekulyarnoi Biologii Im Va Engeldardta Rossiskoi Akademii Nauk
Priority to EP07834945A priority Critical patent/EP2149581A4/en
Priority to PCT/RU2007/000196 priority patent/WO2008130263A1/ru
Publication of WO2008130263A1 publication Critical patent/WO2008130263A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran

Definitions

  • the invention relates to the field of molecular biology, bioorganic chemistry and relates to hydrogels based on cross-linked polymers with oligonucleotides immobilized in them, proteins, nucleic acids or any other biologically significant compounds, as well as biochips based on the proposed hydrogels used in molecular biology for DNA sequencing and mapping detection of mutations, in analytical biochemistry, during immunoassay and a number of other medical applications.
  • the present invention provides low percent hydrogels and hydrogels with a low content of cross-linking with oligonucleotides, proteins, nucleic acids or other biologically significant compounds immobilized therein, obtained by chemically or photochemically initiated radical polymerization of compositions with a low content of a crosslinking agent or a monomer and a crosslinker at the same time.
  • Hydrogels with new properties can be obtained by chemically or photochemically initiating the polymerization of compositions with new monomers based on N-substituted amino sugars and O-substituted Sugars, using known methods for manufacturing biochips (patents RU 2206575, RU 2216547).
  • the present invention relates to a monomer for producing a low percentage hydrogel and / or low hydrogel the content of cross-linking, which is a derivative based on O-substituted sugar and / or N-substituted amino sugar, containing at the hydroxyl or amino group, respectively, an unsaturated residue.
  • the sugar is a low molecular weight carbohydrate class compound selected from the group consisting of monosaccharides and oligosaccharides.
  • the sugar is a compound selected from the group consisting of sucrose, D-glucose, D-allose, D-altrose, D-mannose, D-gulose, D-idose, D-thalose, D-fructose, D- riboses, D-arabinoses, D-xyloses, D-lyxoses, D-erythruloses, D-ribuloses, D-xyluloses, D-psicoses, D-sorboses, D-magatoses or their deoxyanalogue, or their analogue with the L configuration, or a mixture isomers with L and D configurations.
  • the amino sugar is a natural or synthetic sugar in which one or more hydroxyl groups are replaced by an amino group.
  • the amino sugar is a compound selected from the group consisting of 2-amino-2-deoxy-D-glucose, 2-amino-2-decoxy-D-alose, 2-amino-2-desoxy-D-altose, 2-amino-2-desoxy-D-mannose, 2-amino-2-desoxy-D-guillose, 2-amino-2-desoxy-D-idose, 2-amino-2-deoxy-D-talose, 2- amino-2-deoxy-D-galactose, or their analogue with the L-configuration, or a mixture of isomers with the D and L configuration.
  • a monomer containing a multiple bond capable of entering into a photo- or chemically initiated polymerization reaction is contained in the monomer as an unsaturated residue.
  • a methacrylic, acrylic, vinyl, allyl, 4-vinylbenzoyl, or methylene-4-phenyl-vinyl group is used as the unsaturated residue.
  • composition (K) for producing a low percentage hydrogel and / or hydrogel with a low content of cross-linking comprising:
  • M-monomer of the present invention which forms the basis of the formed gel; C-crosslinking agent; P-solvent b.
  • At least one other unsaturated monomer is additionally used as monomer (M).
  • monomer (M) is additionally used as monomer (M).
  • At least one unsaturated compound containing two or more multiple bonds is used as a crosslinking agent (C).
  • at least one unsaturated compound is a compound selected from the group consisting of N, N'-methylenebisacrylamide, N, N '- (1, 2-dihydroxyethylen) bacrylamide, polyethylene glycol diacrylate.
  • the solvent (P) is a solution of an organic and / or inorganic compound.
  • the solvent is selected from the group consisting of an aqueous solution of glycerol, sugar, betaine, polyalcohol; a solution of glycerol, sugar, betaine or polyalcohol in dimethyl sulfoxide (DMSO); a solution of glycerol, sugar, betaine or polyalcohol in dimethylformamide (DMF) ⁇
  • the composition of the present invention further comprises at least one polymerization initiator and / or promoter (Inc).
  • the polymerization initiator and / or promoter is an initiator for chemically initiated polymerization and / or a promoter for photoinitiated polymerization.
  • At least one polymerization initiator and / or promoter is selected from the group consisting of ammonium persulfate, potassium persulfate, hydrogen peroxide, benzoyl peroxide, azoisobutyronitrile (AUN), methylene blue, fluorescein, N, N, N ', N'-tetramethylenediamine, 4- (N, N-dimethylamino) pyridine, triethylamine and acetone.
  • the composition of the present invention further comprises at least one polymerization inhibitor (Ing).
  • the at least one polymerization inhibitor (Ing) is a spontaneous polymerization preventing compound.
  • the at least one spontaneous polymerization preventing compound is a compound selected from the group consisting of i-benzoquinone, o-nitrophenol, p-nitrophenol, nitrobenzene, o-dinitrobenzene, m-dinitrobenzene and p- dinitrobenzene.
  • composition of the present invention further comprises at least one fluorescent dye (Kp).
  • Kp fluorescent dye
  • the dye selected from the group consisting of Texas Red, fluorescein, Cy 5, Cy 3, BODIPY is used as at least one dye.
  • the composition further comprises a biologically significant compound (B).
  • the biologically significant compound (B) is capable of immobilization in a hydrogel at the time of its formation.
  • the composition of the present invention contains, as a biologically significant compound, at least one compound selected from the group consisting of an oligonucleotide, nucleic acid, protein, oligosaccharide, antibody, or low molecular weight ligand.
  • the present invention relates to a hydrogel, which is a low percentage hydrogel and / or a low cross-linking hydrogel obtained by photo- or chemically induced polymerization of a composition of the present invention.
  • the present invention relates to a biochip, which is a substrate with a hydrogel layer immobilized on it in accordance with the present invention.
  • the biochip is characterized in that the hydrogel layer is a continuous layer.
  • the biochip is characterized in that the hydrogel layer is separated by empty spaces into cells.
  • the cells form a regular one-dimensional or two-dimensional structure (array).
  • the biochip is characterized in that the gel layer contains at least one immobilized biologically significant compound.
  • the immobilization of at least one biologically significant compound in the hydrogel layer occurs at the time of formation of the hydrogel during chemically and photochemically initiated polymerization.
  • the immobilization of at least one biologically significant compound in the hydrogel layer is carried out after the hydrogel is formed.
  • the biochip is characterized in that each hydrogel cell of the biochip contains an immobilized fluorescent dye.
  • FIG. 1. shows the appearance of the gel elements of biochips (A, B) obtained by the photoinitiated polymerization method of compositions K1-K84 (see table).
  • Biochips (A, B) were obtained in accordance with example 2 (method 1). Photos taken in visible transmitted light.
  • FIG. 2 shows the result of hybridization of a fluorescently labeled probe (126 n.a.) on an oligonucleotide biochip made using compositions K85, K86.
  • Oligonucleotides 5'-TTC TGG TCC ATG AAT TGG-OCH 2 CH (CH 2 OH) (CH 2 ) 4 - NH 2 (A) and 5'-GTT CTG GTC TAT GAA TTG G -OCH 2 CH (CH 2 OH) (CH 2 ) 4 —NH 2 (B) were immobilized in hydrogels made on the basis of compositions K85, K86.
  • Compositions K85 and K86 were polymerized in accordance with example 2 (method 1). The obtained biochips hybridized for 3 hours with a fluorescently labeled probe (126 IO), fully complementary to the immobilized oligonucleotide (A).
  • FIG. 3 illustrates the comparative efficiency of asymmetric multiplex PCR on gel elements of a biochip.
  • Gel elements are obtained on the basis of one of the compositions known in the literature (K87) (patent RU 2216547) and one of the claimed compositions (K86) (see table. 1).
  • the effectiveness of PCR is evidenced by the magnitude of the fluorescent signal received from the biochip element after the reaction.
  • FIG. 4 (A) shows the appearance of kinetic curves (increase in fluorescence signal over time) obtained in gels of various compositions for the formation of a binary antigen-antibody complex.
  • the serological prostate cancer tumor marker (PSA) labeled with Cy5 fluorescent dye, was chosen.
  • PSA serological prostate cancer tumor marker
  • monoclonal antibodies to this marker in equal concentrations were immobilized.
  • 2-methacrylamido-2-deoxy-D-glucose was used as the main monomer.
  • FIG. 4 (B) shows a fluorescence image of the microchip after analysis.
  • the present invention provides monomers based on O-substituted sugars and N-substituted amino sugars for producing hydrogels by photo- or chemically initiated polymerization.
  • the nature of the monomers is such that it allows to obtain low-percentage hydrogels and gels with a low content of cross-linking using known methods for the manufacture of biochips (patents RU 2206575, RU 2216547).
  • the unsaturated group of the monomer is methacrylic, acrylic, vinyl, allyl, 4-vinylbenzoyl, methylene-4-phenylenvinyl or any other that is capable of reacting photo- or chemically initiated polymerization and is located at the oxygen atom in sugars and nitrogen atom in amines.
  • Sugars are low molecular weight compounds of the carbohydrate class, specifically monosaccharides and oligosaccharides (A. Terney, Modern Organic Chemistry, vol. 2, M .: Mir, 1981, p. 420, 453), such as, for example, sucrose, D-glucose , D- allose, D-altrose, D-mannose, D-gulose, D-idose, D-talose, D-fructose, D-ribose, D-arabinose, D-xylose, D-lyxose, D-erythrulose, D ⁇ -ribulose, D-xylulose, D-psychosis, D-sorbose, D-magatosis or their deoxy analogues, or analogues with L configuration, or mixtures of isomers with L and D configurations.
  • monosaccharides and oligosaccharides such as, for example, sucrose, D-glucose , D-
  • Amino sugars are natural or synthetic sugars in which one or more hydroxyl groups are replaced by an amino group, for example: 2-amino-2-deoxy-D-glucose, 2-amino-2-desoxy-D-allose, 2-amino-2 - deoxy-D-altrose, 2-amino-2-deoxy-D-mannose, 2-amino-2-decoxy-D-guillose, 2-amino-2-desoxy-D-idose, 2-amino-2-deso -D-thalose, 2-amino-2-deoxy-D-galactose or their analogues with the L-configuration or a mixture of isomers with the D and L configuration.
  • O- and N-substituted sugars and amino sugars are obtained by acylating or alkylating sugars and amino sugars with various derivatives of unsaturated carboxylic acids or unsaturated alcohols, or alkyl halides, respectively.
  • Monomers based on O-substituted sugars and N-substituted amino sugars are used to produce low-percentage hydrogels or gels with a low content of cross-linking.
  • Compositions may further include biologically significant compound (B), polymerization initiator or promoter
  • Monomer (M) is an O-substituted sugar or N-substituted amino sugar containing any unsaturated group at the oxygen or nitrogen atom, including methacrylate, acrylic, vinyl, allyl, 4-vinylbenzoyl and methylene-4-phenyl-vinyl, capable of entering into the reaction of photo- or chemically initiated polymerization.
  • mixtures of O-substituted Sugars or N-substituted amino sugars with known monomers for the reaction of photo- or chemically initiated polymerization including with amides or esters of unsaturated acids: methacrylamide, acrylamide, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2 can be used as a monomer -hydroxyethylmethacrylamide, etc.
  • the product of the monomer polymerization is a polymer of linear structure containing one sugar molecule per one or more elementary units of the polymer.
  • a crosslinking agent (C) is any unsaturated compound containing two or more multiple bonds, including: NTV'-methylenebisacrylamide, IV, ./V '- (l, 2-dihydroxyethylene) bacrylamide and polyethylene glycol diacrylate.
  • the polymerization product of the crosslinking agent (C) is a network polymer with a two-dimensional or three-dimensional network.
  • hydrogels In the joint polymerization of monomer (M) and a crosslinking agent (C), net polymers are obtained that swell in an aqueous medium (hydrogels). Depending on the total content (M) and (C), and their mutual ratio, hydrogels can be obtained with the necessary characteristics of diffusion, mechanical strength, degree of swelling, etc.
  • hydrogels can be obtained in which 0 ⁇ M + C ⁇ 3% (for 0 ⁇ C / (C + M) ⁇ 50%) and 0 ⁇ M + C ⁇ 50% (for O ⁇ C / (C + M) ⁇ 3%), without changing the method of manufacturing biochips described in patents RU 2206575, RU 2216547.
  • a biologically significant compound (B) is any compound capable of directly or indirectly binding molecules of a nucleotide, protein, or sugar nature, including: oligonucleotide, nucleic acid, protein (antibody, receptor, etc.), oligosaccharide or low molecular weight ligand .
  • the biologically significant compound (B) is immobilized in a hydrogel at the time of its formation during photo- or chemically initiated polymerization.
  • compound (B) in its structure should contain: or any unsaturated group capable of copolymerizing with a monomer (M) and a crosslinking agent (C), including: acrylamide or methacrylamide; or a group chemically active with respect to the monomer (M) and / or a crosslinking agent (C) and / or intermediates arising from the formation of a crosslinked polymer, including an amino or sulfhydryl group.
  • a biologically significant compound can be immobilized even after the hydrogel has already been formed.
  • the initiators or promoters of radical polymerization are widely known initiators for chemically initiated polymerization and promoters for photoinitiated polymerization, including: ammonium persulfate, potassium persulfate, hydrogen peroxide, benzoyl peroxide, azoisobutyronitrile (ACH), methylene blue, fluorescein, fluorescein N, N ', N'-tetramethylethylenediamine, 4- (N, N-dimethylamino) pyridine, triethylamine and acetone.
  • Polymerization inhibitors are compounds involved in the chain transfer process with the formation of intermediates unable to continue the chain, including: i-benzoquinone, o-nitrophenol, p-nitrophenol, nitrobenzene, o- (m-, p-) -dinitrobenzenes.
  • Inhibitors in the composition (K) are used to prevent spontaneous polymerization during storage of the compositions (K).
  • Solvent (P) is a medium for photo- or chemically initiated polymerization.
  • the solvent can be of organic or inorganic nature, and can also be solutions of organic and inorganic compounds, including: aqueous solutions of glycerol, sugars, betaine, polyalcohols; solutions of glycerol, sugars, betaine or polyalcohols in dimethyl sulfoxide (DMSO); solutions of glycerol, Sugars, betaine or polyalcohols in dimethylformamide (DMF).
  • the main requirements for solvents include a high boiling point, relatively low viscosity and ability to maintain the course of radical polymerization.
  • Fluorescent dye is designed to determine the degree of polymerization process.
  • a fluorescent dye for example, Texas Red, fluorescein, Cy5, Cy3, BODIPY and other fluorescent dyes can be used.
  • compositions (K) containing biologically significant compounds are used for the manufacture of biological microarrays.
  • a biochip is a gel layer formed on a substrate.
  • the gel layer can be separated by empty gaps into cells, each cell may or may not contain immobilized biologically significant compounds, and biologically significant compounds immobilized in different cells may vary in nature and properties.
  • Cells form a regular one-dimensional or two-dimensional structure (array). Biochip cells that do not contain a biologically significant compound can be used to determine the non-specific sorption of the analyzed sample.
  • the manufacture of biological microarrays using the composition (K) containing O-substituted sugars and / or N-substituted amino sugars can be carried out by known methods (for example, disclosed in patents RU 2206575, RU 2216547), including the following steps: a. The manufacture of the composition (K); b. Transfer of the composition (K) to the substrate; at. Photo- or chemically initiated radical polymerization of the composition (K); d. "Washing" the components of the composition (K), not included in the composition of the formed hydrogel; e. "Drying" of the gel elements of the biochip.
  • the stage of preparation of the composition consists in the fact that all components of the composition in certain proportions are thoroughly mixed until a homogeneous solution is formed, degassed, transferred to a container for storage and subsequent application to the substrate, for example, in a microtiter plate and stored at 4 ° C.
  • the step of transferring the compositions (K) to the substrate is that the compositions are transferred in the form of droplets onto the substrate by any device or device in including using an automatic device (robot) equipped with one or more rod-type microdisperses or non-contact jet-type microdisperses.
  • robot automatic device equipped with one or more rod-type microdisperses or non-contact jet-type microdisperses.
  • the substrate can be made of any material currently known, including glass, ceramic, metal and plastic.
  • the surface of the substrate should have either strong adhesive properties or contain active groups capable of participating in the chain transfer reaction during the formation of a hydrogel on its surface.
  • the active group can be any group of organic or inorganic nature, including: methacrylic, acrylic, vinyl, allyl, 4-vinylbenzoyl, methylene-4-phenylenvinyl, amino, sulfo, hydrocarbon, etc.
  • the stage of photo- or chemically initiated radical polymerization consists in the fact that substrates with transferred compositions (K) are irradiated with UV radiation with a wavelength> 254 during photoinitiation or are subjected to various influences for the chemical initiation of polymerization, including: raising the temperature, keeping in the atmosphere with polymerization promoter
  • Photo- or chemical initiation of polymerization is carried out in air or in an oxygen-free atmosphere, including nitrogen, argon and carbon dioxide.
  • the stage of washing the components of the compositions (K), not included in the composition of the formed hydrogel, consists in the fact that the substrates with the compositions (K) are washed with buffer solutions and distilled water after exposure to UV radiation.
  • the stage of drying the gel elements of the biochip consists in the fact that the substrates with immobilized gel elements are dried in air or in a centrifuge and are stored and used in this form.
  • steps d) and e) are optional. So, oligonucleotide biochips obtained using only stages a) -c) can be successfully used for hybridization and PCR. Protein biochips obtained without carrying out stages d) and e) are perfectly preserved and function after long-term storage.
  • Triethylamine (1.52 g, 15.1 mmol) was added to anhydrous methanol (50 ml), followed by 2-amino-2-desoxy-D-glucose hydrochloride (2.75 g, 9.7 mmol).
  • the precipitate formed is filtered off, washed with acetonitrile (2 x 10 ml) and dried in air at room temperature, protected from direct sunlight.
  • Example 2 The manufacture of biochips.
  • Biochips are washed initially in phosphate buffer (0.005 M, pH 7.0) containing Twep 20 (0.1%) and sodium chloride (0.15 M), and then in water.
  • compositions based on N-substituted amino sugar allows to obtain hydrogels (A) in which 0 ⁇ M + C ⁇ 3% (for 0 ⁇ C / (C + M) ⁇ 50%) and 0 ⁇ M + C ⁇ 50% ( for 0 ⁇ C / (C + M) ⁇ 3%). While the use of methacrylamide monomer known in the literature for the manufacture of hydrogels of the same composition does not lead to the desired result (B).
  • compositions are used (Table).
  • a methodology for manufacturing biochips using the composition K88 is used (Table).
  • the resulting composition is transferred in the form of an array of droplets onto glass substrates treated with 3-trimethoxysilylpropylmethyl acrylate using a QARau robot (England, Getetix).
  • Substrates with arrays of droplets are irradiated with UV light with a wavelength of 350 nm and an intensity of 0.06 ⁇ W / cm 2 (GTE lamps F1T8 / 350 BL, Sulvapia, Dapvers, MA) for 50 min at 22 ° C.
  • the biochips are washed before immunoassay in a buffer solution (phosphate-saline buffer 0.01 M containing 0.15 M NaCl, pH 7.2 and 0.1% Tween 20) and then with water. After air drying, the biochips are suitable for use.
  • Example 3 Hybridization on oligonucleotide biochips.
  • Hybridization was carried out with using a buffer (1.5 M guanidine thiocyanate, 0.075 M HEPES (pH 7.5), 7.5 M EDTA) at 37 ° C for three hours. Fluorescent signals from the biochip cells were recorded directly in the hybridization chamber under the solution (Fig. 2) using a fluorescence microscope equipped with a CCD camera.
  • a buffer 1.5 M guanidine thiocyanate, 0.075 M HEPES (pH 7.5), 7.5 M EDTA
  • biochips based on one of the claimed K86 hydrogels are 2 times higher than the hybrid gel known in the literature with a minimum content of monomers and a minimum content of a crosslinking agent - K85 (patent RU 2216547). At the same time, the discriminant relations between perfect and imperfect duplexes do not change significantly.
  • Example 4 Carrying out a multiplex allele-specific polymerase chain reaction (PCR) on the gel elements of the biochip.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Asymmetric multiplex PCR with M. tuberculosis DNA was carried out in the gel elements of the biochip in accordance with the data of a previously published work (Mikhail V.V. et al., J CHn ⁇ grade mecanic ⁇ schreib, 2001, 39 (7): 2531-40).
  • compositions K86 and K87 were used (see Table 1).
  • the regions of three genes were amplified: IS6110 (a gene specific for M. tuberculosis); katG (a gene encoding catalase involved in the metabolism of isoniazid); rpoB (gene of the beta subunit of RNA polymerase, mutations in which determine resistance to isoniazid).
  • the amplified sections were 210 bp and 130 bp long. and 170 bp, respectively.
  • PCR buffer 2.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1 mg / ml BSA, 0,2 mM of each dNTP
  • PE Corroratiop 5U Taq DNA fragment Stoffel- -polymerase
  • Example 5 Conducting direct analysis of tumor markers and kinetic measurements on the gel elements of the biochip.
  • biochips were made, the gel elements of which were made on the basis of compositions K88-K91, in which monoclonal antibodies to the prostate-specific antigen (PSA), serological cancer marker of the prostate gland were immobilized (example 2 (method 2)) .
  • PSA prostate-specific antigen
  • serological cancer marker of the prostate gland were immobilized.
  • four identical gel elements were formed on the biochip for each hydrogel composition containing immobilized antibodies in equal concentrations.
  • the maximum fluorescent signal can be achieved using the composition K88, the minimum signal was obtained from cells with K91 gel.
  • the efficiency of immobilization of antibodies in all gels was approximately the same and amounted to 35-40%.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Description

Мономер и композиция для получения низкопроцентного гидрогеля и/или гидрогеля с низким содержанием поперечных "сшивок", гидрогель и биочип на его основе.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной биологии, биоорганической химии и касается гидрогелей на основе сетчатых полимеров с иммобилизованными в них олигонуклеотидами, белками, нуклеиновыми кислотами или любыми другими биологически значимыми соединениями, а также биочипов на основе предлагаемых гидрогелей, используемых в молекулярной биологии при секвенировании и картировании ДНК, детектировании мутаций, в аналитической биохимии, при проведении иммуноанализа и ряда других медицинских приложений.
Уровень техники
Известны гидрогели с иммобилизованными биологически активными соединениями на основе сетчатых полимеров, получаемые методом радикальной полимеризации акриламида, метакриламида, N-
[тpиc(гидpoкcимeтил)мeтил]aкpилaмидa, 2-гидpoкcиэтилмeтaкpилaтa в присутствии модифицированных или немодифицированных биологически значимых соединений и различных "сшивающих" агентов, таких как: N,N' -метил енбисакриламид, N,N'-(1,2- дигидроксиэтиленбисакриламид), полиэтиленгликольдиакрилат (ПЭГ ДА) и N,N'- диаллилзамещенный диамид винной кислоты (патенты US 5932711, RU 2175972, US 6656725, RU 2206575, RU 2216547).
Известно, что кислород воздуха ингибирует полимеризацию перечисленных выше мономеров, и для получения гидрогелей с достаточной механической прочностью, при полимеризации на воздухе, необходимо значительно увеличивать общее содержание мономера и сшивающего агента до 10% и выше, как в патенте US 5932711. В данных условиях степень иммобилизации биологически значимого соединения при иммобилизации в капле объемом 1-2 нл не превышает 10%.
Проблема ингибирования полимеризации перечисленных выше мономеров и "сшивающих" агентов кислородом воздуха снимается при полимеризации в атмосфере инертного газа (азот, аргон, углекислый газ и т.д.). В таких условиях можно получить гели с общим содержанием мономера и сшивающего агента > 3%, доля сшивающего агента может быть снижена до 3% (патенты RU 2206575, RU 2216547), а степень иммобилизации в капле объемом 1-2 нл повышена до 50-60%.
Однако для решения ряда задач по гибридизации на гелевых элементах биочипа больших фрагментов ДНК, для увеличения выхода полимеразной цепной реакции при проведении ПЦР на гелевых элементах биочипа, а также для повышения чувствительности количественного иммуноанализа на гелевых элементах биочипа, необходимо получение гидрогелей, пористость которых выше, чем у известных аналогов. Повышения пористости возможно достичь за счет значительного уменьшения в композиции для изготовления гелей содержания "сшивающего" агента или мономера и "сшивающего" агента одновременно. Полимеризация таких композиций не может быть осуществлена с использованием известных композиций (патенты US 5932711, RU 2175972, US 6656725, RU 2206575, RU 2216547), а требует специальных подходов.
Поставленная задача решается предлагаемым изобретением.
Раскрытие изобретения
В результате проведенных обширных научных исследований авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что в качестве мономера для получения низкопроцентных гидрогелей и гидрогелей с низким содержанием поперечных "сшивок" может быть использовано производное на основе O- замещенного сахара и/или N-замещенного аминосахара, содержащее при гидроксильной или аминогруппе, соответственно, непредельный остаток.
В данном изобретении предлагаются низкопроцентные гидрогели и гидрогели с низким содержанием поперечных "сшивок" с иммобилизованными в них олигонуклеотидами, белками, нуклеиновыми кислотами или другими биологически значимыми соединениями, получаемые при химически или фотохимически инициируемой радикальной полимеризации композиций с низким содержанием сшивающего агента или мономера и сшивающего агента одновременно.
Гидрогели с новыми свойствами могут быть получены при химическом или фотохимическом инициировании полимеризации композиций с новыми мономерами на основе N-замещенных аминосахаров и О-замещенных Сахаров, используя известные способы изготовления биочипов (патенты RU 2206575, RU 2216547).
Таким образом, в своем первом аспекте настоящее изобретение относится к мономеру для получения низкопроцентного гидрогеля и/или гидрогеля с низким содержанием поперечных "сшивок", который представляет собой производное на основе О-замещенного сахара и/или N-замещенного аминосахара, содержащее при гидроксильной или аминогруппе, соответственно, непредельный остаток.
В одном из воплощений сахар представляет собой низкомолекулярное соединение класса углеводов, выбранное из группы, состоящей из моносахаридов и олигосахаридов. В предпочтительном воплощении сахар представляет собой соединение, выбранное из группы, состоящей из сахарозы, D-глюкозы, D-аллозы, D- альтрозы, D-маннозы, D-гулозы, D-идозы, D-талозы, D-фруктозы, D-рибозы, D- арабинозы, D-ксилозы, D-ликсозы, D-эритрулозы, D-рибулозы, D-ксилулозы, D- псикозы, D-сорбозы, D-магатозы или их дезоксианалога, или их аналога с L конфигурацией, или смеси изомеров с L и D конфигурациями.
В следующем воплощении аминосахар представляет собой природный или синтетический сахар, в котором одна или несколько гидроксильных групп заменены на аминогруппу. В предпочтительном воплощении аминосахар представляет собой соединение, выбранное из группы, состоящей из 2-aминo-2-дeзoкcи-D-глюкoзы, 2- aминo-2-дeзoкcи-D-aллoзы, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-aльтpoзы, 2-aминo-2-дeзoкcи-D- маннозы, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-гyлoзы, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-идoзы, 2-aминo-2- дезокси-D-талозы, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-гaлaктoзы, или их аналога с L-конфигурацией, или смеси изомеров с D и L конфигурацией.
В следующем воплощении в мономере в качестве непредельного остатка содержится группа, содержащая кратную связь, способную вступать в реакцию фото- или химически инициируемой полимеризации. В предпочтительном воплощении в качестве непредельного остатка используют метакрильную, акрильную, винильную, аллильную, 4-винилбeнзoильнyю, или мeтилeн-4-фeнилeнвинильнyю группу.
В своем следующем аспекте изобретение относится к композиции (К) для получения низкопроцентного гидрогеля и/или гидрогеля с низким содержанием поперечных "сшивок", содержащей:
М-мономер настоящего изобретения, составляющий основу формируемого геля; С-сшивающий агент; Р-растворител ь .
В одном из воплощений в качестве мономера (M) дополнительно используют, по меньшей мере, один другой непредельный мономер. В предпочтительном воплощении в качестве, по меньшей мере, одного другого непредельного мономера используют соединение, выбранное из группы, включающей метакриламид, акриламид, 2-гидpoкcиэтилмeтaкpилaт и 2-гидpoкcиэтилмeтaкpилaмид.
В следующем воплощении в качестве сшивающего агента (С) используют, по меньшей мере, одно непредельное соединение, содержащее две и более кратных связи. В предпочтительном воплощении в качестве, по меньшей мере, одного непредельного соединения используют соединение, выбранное из группы, включающей N,N'- метиленбисакриламид, N,N'-( 1 ,2-дигидpoкcиэтилeн)биcaкpилaмид, полиэтиленгликольдиакрилат.
В следующем воплощении растворитель (P) представляет собой раствор органического и/или неорганического соединения. В предпочтительном воплощении растворитель выбирают из группы, состоящей из водного раствора глицерина, сахара, бетаина, полиспирта; раствора глицерина, сахара, бетаина или полиспирта в диметилсульфоксиде (ДМСО); раствора глицерина, сахара, бетаина или полиспирта в диметилформамиде (ДMФA)Λ
В еще одном из воплощений композиция настоящего изобретения дополнительно содержит, по меньшей мере, один инициатор и/или промотор полимеризации (Инц). В предпочтительном воплощении инициатор и/или промотор полимеризации представляет собой инициатор для химически инициируемой полимеризации и/или промотор для фотоинициированной полимеризации. В наиболее предпочтительном воплощении, по меньшей мере, один инициатор и/или промотор полимеризации выбирают из группы, состоящей из персульфата аммония, персульфата калия, пероксида водорода, бензоилпероксида, азоизобутиронитрила (АЮN), метиленового синего, флуоресцеина, N,N,N',N'-тeтpaмeтилэтилeндиaминa, 4-(N,N- димeтилaминo)пиpидинa, триэтиламина и ацетона.
В еще одном из воплощений композиция настоящего изобретения дополнительно содержит, по меньшей мере, один ингибитор полимеризации (Инг). В предпочтительном воплощении, по меньшей мере, один ингибитор полимеризации (Инг) представляет собой соединение, предотвращающие спонтанную полимеризацию. В наиболее предпочтительном воплощении, по меньшей мере, одно соединение, предотвращающее спонтанную полимеризацию, представляет собой соединение, выбранное из группы, состоящей из и-бензохинона, о-нитрофенола, п- нитрофенола, нитробензола, о-динитробензола, м-динитробензола и п-динитробензола.
В следующем воплощении композиция настоящего изобретения дополнительно содержит, по меньшей мере, один флуоресцентный краситель (Kp). В предпочтительном воплощении в качестве, по меньшей мере, одного красителя используют краситель, выбранный из группы, состоящей из Техаs Rеd, флуоресцеина, Cy 5, Cy 3, BODIPY.
В еще одном из воплощений настоящего изобретения композиция дополнительно содержит биологически значимое соединение (Б). В предпочтительном воплощении биологически значимое соединение (Б) способно к иммобилизации в гидрогеле в момент его формирования. В наиболее предпочтительном воплощении композиция настоящего изобретения содержит в качестве биологически значимого соединения, по меньшей мере, одно соединение, выбранное из группы, состоящей из олигонуклеотида, нуклеиновой кислоты, белка, олигосахарида, антитела или низкомолекулярного лиганда.
В своем следующем аспекте настоящее изобретение относится к гидрогелю, представляющему собой низкопроцентный гидрогель и/или гидрогель с низким содержанием поперечных "сшивок", полученный путем фото- или химически индуцированной полимеризации композиции настоящего изобретения.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к биочипу, представляющему собой подложку с иммобилизованным на нем слоем гидрогеля в соответствии с настоящим изобретением.
В одном из воплощений биочип характеризуется тем, что слой гидрогеля представляет собой сплошной слой.
В альтернативном воплощении биочип характеризуется тем, что слой гидрогеля разделен пустыми промежутками на ячейки. В предпочтительном воплощении ячейки образуют регулярную одномерную или двумерную структуру (массив).
В следующем воплощении биочип характеризуется тем, что слой геля содержит по меньшей мере одно иммобилизованное биологически значимое соединение. В одном из предпочтительных воплощений иммобилизация по меньшей мере одного биологически значимого соединения в слое гидрогеля осуществляется в момент формирования гидрогеля при химически- и фотохимически инициированной полимеризации. В другом из предпочтительных воплощений иммобилизация, по меньшей мере, одного биологически значимого соединения в слое гидрогеля осуществляется после того, как гидрогель сформирован.
В еще одном из воплощений биочип характеризуется тем, что каждая гидрогелевая ячейка биочипа содержит иммобилизованный флуоресцентный краситель. Краткий перечень фигур
Далее изобретение будет подробнее раскрыто со ссылкой на фигуры, на которых:
Фиг. 1. показывает внешний вид гелевых элементов биочипов (A,Б), полученных методом фотоинициируемой полимеризации композиций K1-K84 (см. табл.). Биочипы (А, Б) получены в соответствии с примером 2 (способ 1). Фотографии получены в видимом проходящем свете.
Фиг. 2 показывает результат гибридизации флуоресцентно меченного зонда (126 н. о.) на олигонуклеотидном биочипе, изготовленном с использованием композиций K85, K86.
Олигонуклеотиды 5'-TTC TGG TCC ATG AAT TGG-OCH2CH(CH2OH)(CH2)4- NH2 (А) и 5'-GTT CTG GTC TAT GAA TTG G -OCH2CH(CH2OH)(CH2)4-NH2 (Б) иммобилизовались в гидрогелях, изготовленных на основе композиций K85, K86. Композиции K85 и K86 полимеризовались в соответствии с примером 2 (способ 1). Полученные биочипы гибридизовались в течение 3 часов с флуоресцентно меченным зондом (126 и.о.), полностью комплементарным иммобилизованному олигонуклеотиду (А).
Фиг. 3 иллюстрирует сравнительную эффективность прохождения асимметричной мультиплексной ПЦР на гелевых элементах биочипа. Гелевые элементы получены на основе одной из известных в литературе композиций (K87) (патент RU 2216547) и одной из заявляемых композиций (K86) (см. табл. 1). Об эффективности прохождения ПЦР свидетельствует величина флуоресцентного сигнала, получаемого с элемента биочипа после прохождения реакции.
Фиг. 4 (А) отображает вид кинетических кривых (рост флуоресцентного сигнала во времени), полученных в гелях различного состава для образования бинарного комплекса антиген-антитело. В качестве антигена был выбран серологический онкомаркер рака простаты (PSA), меченный флуоресцентным красителем Cy5. В гелях на основе композиций K88-K91, иммобилизованы моноклональные антитела к этому маркеру в равных концентрациях. Во всех гелях в качестве основного мономера использовали 2-мeтaкpилaмидo-2-дeзoкcи-D-глюкoзy.
Фиг. 4 (Б) демонстрирует флуоресцентное изображение микрочипа после проведения анализа. Осуществление изобретения
В данном изобретении предлагаются мономеры на основе О-замещенных Сахаров и N-замещенных аминосахаров для получения гидрогелей методом фото- или химически инициируемой полимеризации. Природа мономеров такова, что позволяет получать низкопроцентные гидрогели и гели с низким содержанием поперечных "сшивок" используя известные способы изготовления биочипов (патенты RU 2206575, RU 2216547).
Непредельная группа мономера представляет собой метакрильную, акрильную, винильную, аллильную, 4-винилбeнзoильнyю, мeтилeн-4-фeнилeнвинильнyю или любую другую, способную вступать в реакцию фото- или химически инициируемой полимеризации и находящуюся при атоме кислорода в сахарах и атоме азота в аминосахарах.
Сахара представляют собой низкомолекулярные соединения класса углеводов, конкретно - моносахариды и олигосахариды (А. Терней, Современная органическая химия, т. 2, M.: Мир, 1981, с. 420, 453), такие как, например: сахароза, D-глюкоза, D- аллоза, D-альтроза, D-манноза, D-гулоза, D-идоза, D-талоза, D-фруктоза, D-рибоза, D- арабиноза, D-ксилоза, D-ликсоза, D-эритрулоза, D-рибулоза, D-ксилулоза, D-псикоза, D-сорбоза, D-магатоза или их дезоксианалоги, или аналоги с L конфигурацией, или смеси изомеров с L и D конфигурациями.
Аминосахара представляют собой природные или синтетические сахара, в которых одна или несколько гидроксильных групп заменены на аминогруппу, например: 2-aминo-2-дeзoкcи-D-глюкoзa, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-aллoзa, 2-aминo-2- дезокси-D-альтроза, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-мaннoзa, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-гyлoзa, 2- aминo-2-дeзoкcи-D-идoзa, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-тaлoзa, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-гaлaктoзa или их аналоги с L-конфигурацией или смеси изомеров с D и L конфигурацией.
О- и N-замещенные сахара и аминосахара получают ацилированием или алкилированием Сахаров и аминосахаров различными производными непредельных карбоновых кислот или непредельных спиртов, или алкилгалогенидов, соответственно.
Мономеры на основе О-замещенных Сахаров и N-замещенных аминосахаров используются для получения низкопроцентные гидрогелей или гелей с низким содержанием поперечных "сшивок".
Гидрогели получаются при фото- или химическом инициировании полимеризации композиций (K=M+C+P), включающих мономер (M), сшивающий агент (С) и растворитель (P). Композиции дополнительно могут включать биологически значимое соединение (Б), инициатор или промотор полимеризации
(Инц), ингибитор полимеризации (Инг).
Мономер (M) представляет собой О-замещенный сахар или N-замещенный аминосахар, содержащий при атоме кислорода или азота любую непредельную группу, в том числе: метакрильную, акрильную, винильную, аллильную, 4-винилбeнзoильнyю и мeтилeн-4-фeнилeнвинильнyю, способную вступать в реакцию фото- или химически инициируемой полимеризации.
Кроме того, в качестве мономера могут использоваться смеси О-замещенных Сахаров или N-замещенных аминосахаров с известными мономерами для реакции фото- или химически инициируемой полимеризации, в том числе с амидами или сложными эфирами непредельных кислот: метакриламидом, акриламидом, 2- гидроксиэтилметакрилатом, 2-гидpoкcиэтилмeтaкpилaмидoм и т.д.
Использование различных сочетаний сахарсодержащих мономеров и мономеров, не содержащих сахар, в композиции позволяет получать гидрогели с заданным содержанием сахарных остатков на одно элементарное звено полимера.
Продуктом полимеризации мономера является полимер линейной структуры, содержащий одну молекулу сахара на одно или несколько элементарных звеньев полимера.
Сшивающий агент (С) представляет собой любое непредельное соединение, содержащее две и более кратные связи, в том числе: NТV'-метиленбисакриламид, iV,./V'-(l,2-дигидpoкcиэтилeн)биcaкpилaмид и полиэтиленгликольдиакрилат. Продуктом полимеризации сшивающего агента (С) является сетчатый полимер с двумерной или трехмерной сеткой.
При совместной полимеризации мономера (M) и сшивающего агента (С) получаются сетчатые полимеры, набухающие в водной среде (гидрогели). В зависимости от общего содержания (M) и (С), и их взаимного соотношения можно получать гидрогели с необходимыми характеристиками по диффузии, механической прочности, степени набухания и т.д.
При использовании в качестве мономера (M) О-замещенного сахара и/или N- замещенного аминосахара, а также хорошо известных сшивающих агентов (С) можно получать гидрогели, в которых 0<M+C<3%(пpи0≤C/(C+M)<50%) и 0<M+C<50% (пpиO<C/(C+M)<3%), без изменения способа изготовления биочипов, приведенного в патентах RU 2206575, RU 2216547. Биологически значимое соединение (Б) представляет собой любое соединение, способное непосредственно или опосредовано связывать молекулы нуклеотидной, белковой, или сахарной природы, в том числе: олигонуклеотид, нуклеиновую кислоту, белок (антитело, рецептор и т.д.), олигосахарид или низкомолекулярный лиганд. Предпочтительно биологически значимое соединение (Б) иммобилизуется в гидрогеле в момент его формирования при фото- или химически инициируемой полимеризации. Для иммобилизации соединение (Б) в своей структуре должно содержать: или любую непредельную группу, способную сополимеризоваться с мономером (M) и сшивающим агентом (С), в том числе: акриламидную или метакриламидную; или группу, химически активную по отношению к мономеру (M) и/или сшивающему агенту (С), и/или промежуточным соединениям, возникающим при формировании сетчатого полимера, в том числе: амино- или сульфгидрильную группы. Однако биологически значимое соединение может быть иммобилизовано и после того, как гидрогель уже сформирован.
Инициаторы или промоторы радикальной полимеризации (Инц) представляют собой широко известные инициаторы для химически инициируемой полимеризации и промоторы для фотоинициированной полимеризации, в том числе: персульфат аммония, персульфат калия, пероксид водорода, бензоилпероксид, азоизобутиронитрил (АШN), метиленовый синий, флуоресцеин, N,N,N',N'- тетраметилэтилендиамин, 4-(N,N-димeтилaминo)пиpидин, триэтиламин и ацетон.
Ингибиторы полимеризации (Инг) представляют собой соединения, участвующие в процессе передачи цепи с образованием интермедиатов, не способных продолжать цепь, в том числе: и-бензохинон, о-нитрофенол, п-нитрофенол, нитробензол, o-(м-, п-)-динитpoбeнзoлы.
Ингибиторы в составе композиции (К) используются для предотвращения спонтанной полимеризации при хранении композиций (К).
Растворитель (P) представляет собой среду для проведения фото- или химически инициируемой полимеризации. Растворитель может быть органической или неорганической природы, а также представлять собой растворы органических и неорганических соединений, в том числе: водные растворы глицерина, Сахаров, бетаина, полиспиртов; растворы глицерина, Сахаров, бетаина или полиспиртов в диметилсульфоксиде (ДМСО); растворы глицерина, Сахаров, бетаина или полиспиртов в диметилформамиде (ДМФА). К основным требованиям, предъявляемым к растворителям, следует отнести высокую температуру кипения, относительно невысокую вязкость и способность поддерживать протекание радикальной полимеризации .
Флуоресцентный краситель (Кф) предназначен для определения степени протекания процесса полимеризации. В качестве флуоресцентного красителя может использоваться, например, Техаs Rеd, флуоресцеин, Cy5, СуЗ, BODIPY и другие флуоресцентные красители.
Указанные выше композиции (К), содержащие биологически значимые соединения, используются для изготовления биологических микрочипов.
Биочип представляет собой сформированный на подложке слой геля. Слой геля может быть разделен пустыми промежутками на ячейки, причем каждая из ячеек может содержать, либо не содержать иммобилизованные биологически значимые соединения, а биологически значимые соединения, иммобилизованные в разных ячейках, могут различаться по своей природе и свойствам. Ячейки образуют регулярную одномерную или двумерную структуру (массив). Ячейки биочипа, не содержащие биологически значимое соединение, могут использоваться для определения неспецифической сорбции анализируемого образца.
Изготовление биологических микрочипов с использованием композиции (К), содержащей О-замещенные сахара и/или N-замещенные аминосахара, может быть осуществлено известными способами (например, раскрытыми в патентах RU 2206575, RU 2216547), включающими следующие этапы: а. Изготовление композиции (К); б. Перенос композиции (К) на подложку; в. Фото- или химически инициируемая радикальная полимеризация композиции (К); г. "Отмывка" компонентов композиции (К), не вошедших в состав сформированного гидрогеля; д. "Осушка" гелевых элементов биочипа.
Этап изготовления композиции состоит в том, что все компоненты композиции в определенных соотношениях тщательно перемешиваются до образования гомогенного раствора, дегазируются, переносятся в емкость для хранения и последующего нанесения на подложку, например в микротитровальный планшет и хранятся при 4°C.
Этап переноса композиций (К) на подложку состоит в том, что композиции переносятся в виде капель на подложку любым устройством или приспособлением, в том числе с помощью автоматического устройства (робота), снабженного одним или несколькими микродиспенсерами стержневого типа или бесконтактными микродиспенсерами струйного типа.
Подложка может быть изготовлена из любого материала, известного в настоящее время, в том числе: стекла, керамики, металла и пластика. Поверхность подложки должна обладать или сильными адгезивными свойствами, или содержать активные группы, способные участвовать в реакции передачи цепи при формировании гидрогеля на ее поверхности. В качестве активной группы может выступать любая группа органической или неорганической природы, в том числе: метакрильная, акрильная, винильная, аллильная, 4-винилбeнзoильнaя, мeтилeн-4-фeнилeнвинильнaя, амино-, сульфо, углеводородная и т.д.
Этап фото- или химически инициируемой радикальной полимеризации состоит в том, что подложки с перенесенными композициями (К) облучаются УФ излучением с длиной волны >254 при фотоинициировании или подвергаются различным воздействиям для химического инициирования полимеризации, в том числе: повышению температуры, выдерживанию в атмосфере с промотором полимеризации и.д.
Фото- или химическое инициирование полимеризации осуществляется на воздухе или в бескислородной атмосфере в том числе: азоте, аргоне и углекислом газе.
Этап отмывки компонентов композиций (К), не вошедших в состав сформированного гидрогеля, состоит в том, что подложки с композициями (К) после экспозиции УФ излучением отмываются буферными растворами и дистиллированной водой.
Этап осушки гелевых элементов биочипа состоит в том, что подложки с иммобилизованными гелевыми элементами высушиваются на воздухе или на центрифуге и в таком виде хранятся и используются.
В ряде случаев стадии г) и д) являются необязательными. Так, олигонуклеотидные биочипы, полученные с использованием только стадий a)-в), могут успешно использоваться для проведения гибридизаций и ПЦР. Белковые биочипы, полученные без проведения стадий г) и д), прекрасно сохраняются и функционируют после длительного хранения.
Далее изобретение будет пояснено с помощью примеров, иллюстрирующих предпочтительные варианты осуществления изобретения. Эти примеры не должны восприниматься как ограничивающие объем изобретения. Специалисты в данной области смогут найти многочисленные улучшения, которые также входят в объем притязаний данного изобретения и которые отражены в формуле изобретения.
Примеры Пример 1. Синтез 2-мeтaкpилaмидo-2-дeзoкcи-D-глюкoзы.
К безводному метанолу (50 мл) добавляют триэтиламин (1,52 г, 15,1 ммоль), а затем гидрохлорид 2-aминo-2-дeзoкcи-D-глюкoзы (2,75 г, 9,7 ммоля). К образовавшейся суспензии при перемешивании приливают ангидрид метакриловой киcлoты(2,43 г, 15,7 ммоля) и продолжают перемешивать 12 часов при комнатной температуре. По истечении времени раствор отфильтровывают, а фильтрат упаривают при T=65°C до объема (17 мл) и оставляют при T=-15°C на 12 часов. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают ацетонитрилом (2χ10 мл) и высушивают на воздухе при комнатной температуре, защищая от прямых солнечных лучей. Продукт представляет собой белый аморфный порошок. Выход 1,86 г (61%), Tпл.=205-206°C.
Спектр 1H ЯМР (Д2O), δ: 1,76 (с, ЗН, CH3), 3,26-3,81 (м, 7H, H2, 2H3, H4, H5, 2H6), 5,09 (д, J= 3,43 Гц, IH, H1), 5,30 (с, IH, CH2=); 5,52 (с, IH, CH2=).
Рассчитано для C16H29NO5: С: 60,93%; H: 9,27%. Найдено: С: 60,85%; H: 9,32%.
Пример 2. Изготовление биочипов.
Способ 1. Изготовление олигонуклеотидных биочипов
Для изготовления биочипов используют различные по составу композиции (Таблица). В качестве примера приведена методика изготовления биочипов с использованием композиции K86.
К смеси 2-мeтaкpилaмидo-2-дeзoкcи-D-глюкoзы (29,85χ10~3 г, 9,46χ10~5 моль) и ΛζN'-метиленбисакриламида (0,15xl0~3 г, 0,97><10"6 моля) приливают раствор N,N,Λf',7V-тeтpaмeтилэтилeндиaминa в деионизованной воде (370 мкл, 13,5%), перемешивают до полного растворения сухих компонентов. Затем приливают глицерин (500 мкл) и раствор олигонуклеотида в воде (100 мкл, C=2000 пмоль/мкл.). Смесь тщательно перемешивают до образования гомогенного раствора. Полученную композицию переносят на полимерные подложки (ПЕТФ) с помощью робота QАrrау (Англия, фирма "Gепеtiх") в виде массива капель. Подложки с массивами капель облучают УФ-светом (λ=312 нм, 45мин, T=40°C) в среде сухого аргона.
Биочипы отмывают первоначально в фосфатном буфере (0,005 M, рН 7,0), содержащем Тwееп 20 (0,1%) и хлористый натрий (0,15 M), а затем в воде.
После высушивания на воздухе биочипы пригодны для использования. Полученные биочипы фотографировали в видимом проходящем свете. Как видно из Фиг. 1, использование композиций на основе N-замещенного аминосахара позволяет получать гидрогели (А) в которых 0<M+C<3%(пpи0≤C/(C+M)<50%) и 0<M+C≤50%(пpи0<C/(C+M)<3%). В то время как использование известного в литературе мономера метакриламида для изготовления гидрогелей такого же состава не приводит к желаемому результату (Б).
Способ 2. Изготовление белковых биочипов.
Для изготовления биочипов используют различные по составу композиции (Таблица). В качестве примера приведена методика изготовления биочипов с использованием композиции K88.
К смеси 2-мeтaкpилaмидo-2-дeзoкcи-D-глюкoзы (29,25χ10~3 г, 9,27χ10"5 моль), iЧN'-метиленбисакриламида (0,525* 10"3 г, 3,395χlO~6 моля) и 2- акрилоксоэтилметакрилата (0,225x10"3 г, 1,223x10"6 моля) приливают раствор ΛζΛ^N'.N'-тетраметилэтилендиамина в деионизованной воде (370 мкл, 3,24%), перемешивают до полного растворения сухих компонентов. Затем приливают глицерин (500 мкл) и раствор белка в воде (100 мкл, C=I мг/мл). Смесь тщательно перемешивают до образования гомогенного раствора.
Полученную композицию переносят в виде массива капель на стеклянные подложки, обработанные 3-тpимeтoкcиcилилпpoпилмeтaкpилaтoм, с помощью робота QАrrау (Англия, фирма "Gепеtiх").
Подложки с массивами капель облучают УФ-светом с длиной волны 350 нм и интенсивностью 0,06 мкВт/см2 (GTE лампы F1T8/350 BL, Sуlvапiа, Dапvеrs, MA) в течение 50 мин при 220C. Перед проведением иммуноанализа биочипы отмывают в буферном растворе (фосфатно-солевой буфер 0,01 M содержащий 0,15 M NaCl, рН 7,2 и 0,1% Тwееп 20) и затем водой. После высушивания на воздухе биочипы пригодны для использования.
Пример 3. Проведение гибридизации на олигонуклеотидных биочипах. Флуоресцентно меченный по 5 '-концу красителем Cy5 одноцепочечный фрагмент ДНК гена rроВ M. tиbеrсиlоsis длиной 126 нуклеотидов, полученный методом двухстадийной ПЦР (Мikhаilоviсh V. и др., J. CHn. МiсrоЫоl, 2001, 39(7): 2531-40), гибридизовали на олигонуклеотидном биочипе, изготовленном с использованием композиций K85 и K86 и олигонуклеотидов: 5'-TTC TGG TCC ATG AAT TGG- OCH2CH(CH2OH)(CH2)4-NH2 (A), 5'-GTT CTG GTC TAT GAA TTG G- OCH2CH(CH2OH)(CH2)4-NH2 (Б) (пример 2 (способ I)). Гибридизацию проводили с использованием буфера (1,5 M гуанидинтиоцианат, 0,075 M HEPES (рН 7,5), 7,5 M ЭДТА) при 37°C в течение трех часов. Флуоресцентные сигналы с ячеек биочипа регистрировали непосредственно в гибридизационной камере под раствором (Фиг. 2), используя флуоресцентный микроскоп, оснащенный ПЗС-камерой.
Из приведенного рисунка видно, что даже для небольшого по величине фрагмента ДНК (126 н.о.) биочипы на основе одного из заявляемых гидрогелей K86 в 2 раза превышают по гибридизационному сигналу известный в литературе гидрогель с минимальным содержанием мономеров и минимальным содержанием сшивающего агента - K85 (патент RU 2216547). При этом дискриминантные отношения между совершенным и несовершенным дуплексами существенно не изменяются.
Пример 4. Проведение мультиплексной аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) на гелевых элементах биочипа.
Асимметричная мультиплексная ПЦР с ДНК M. tиbеrсиlоsis проводилась в гелевых элементах биочипа в соответствии с данными ранее опубликованной работы (Мikhаilоviсh V. и др., J CHn Мiсrоbiоl, 2001, 39(7): 2531-40). Для изготовления биочипов использовались композиции K86 и K87(cм. Таб. 1). С помощью трех пар праймеров амплифицировались участки трех генов: IS6110 (ген, специфичный для M. tиbеrсиlоsis); kаtG (ген, кодирующий каталазу, участвующую в метаболизме изониазида); rроВ (ген бета-субъединицы РНК-полимеразы, мутации в котором обусловливают устойчивость к изониазиду). Длины амплифицируемых участков составили 210 п.о., 130 п. о. и 170 п. о., соответственно.
Прямые праймеры с последовательностями дикого типа, или содержащие на 3' конце однонуклеотидную замену, характеризующую мутантный вариант, иммобилизовались в ячейках биочипа. Обратные праймеры содержали флуоресцентную метку на 5 '-конце и находились в реакционной смеси.
Для проведения ПЦР использовался буфер (2,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl, 10 мМ Тris-НСl (рН 8,3), 1 мг/мл BSA, 0,2 мМ каждого дНТФ) с добавлением 5U Stоffеl- фрагмента Таq ДНК-полимеразы (PE Соrроrаtiоп). В качестве матрицы использовали 105 копий геномной ДНК Мусоbасtеriиm tиbеrсиlоsis. Параметры термоциклирования: начальный прогрев - 2 мин при 95°C, далее - 35 циклов по 30 с при 95°C; 60 с при 630C; 40 с при 72°C. Регистрацию результатов после завершения ПЦР производили с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного ПЗС-камерой.
Наибольший флуоресцентный сигнал наблюдался в ячейках, в которых происходила достройка иммобилизованного праймера до стабильного совершенного дуплекса с наработанным в ходе ПЦР флуоресцентно меченным одноцепочечным фрагментом ДНК каждого из генов (Фиг. 3). Кроме того, из рисунка видно, что величина флуоресцентного сигнала на гидрогелях, получаемых из композиции K86, более чем в 4 раза превышает величину сигнала на гидрогелях из композиции K87, что свидетельствует о большей эффективности прохождения ПЦР.
Пример 5. Проведение прямого анализа онкомаркеров и кинетические измерения на гелевых элементах биочипа.
Для проведения прямого анализа онкомаркеров и кинетических измерений были изготовлены биочипы, гелевые элементы которых изготавливались на основе композиций K88-K91, в которых иммобилизовали моноклональные антитела к простата-специфическому антигену (ПСА), серологическому онкомаркеру рака предстательной железы (пример 2 (способ 2)). Для контроля воспроизводимости результатов на биочипе формировались по четыре одинаковых гелевых элемента для каждой композиции гидрогеля, содержащей иммобилизованные антитела в равных концентрациях.
Прямой анализ и кинетические измерения проводили в фосфатно-солевом буфере (C=0,01 M, 0,15 M NaCl, рН 7,2), содержащем 0,15% поливинилового спирта, 0,15% и 100 нг/мл онкомаркера. Флуоресцентные сигналы от гелевых элементов регистрировали непосредственно в гибридизационной камере под раствором, используя флуоресцентный микроскоп, оснащенный ПЗС-камерой. Кинетические измерения проводили с интервалом в 15 мин в течение 20 ч при температуре 2O0C.
Как видно из рисунка (Фиг. 4), максимального флуоресцентного сигнала удается достичь при использовании композиции K88, минимальный сигнал был получен от ячеек с гелем K91. Эффективность иммобилизации антител во всех гелях была примерно одинакова и составляла 35-40%.
Все патентные документы, публикации, научные статьи, и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание путем отсыпки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем отсылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на конкретные воплощения, специалисту в данной области будет понятно, что могут быть произведены различные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема данного изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001

Claims

Формула изобретения
1. Мономер для получения низкопроцентного гидрогеля и/или гидрогеля с низким содержанием поперечных "сшивок", представляющий собой производное на основе О-замещенного сахара и/или N-замещенного аминосахара, содержащее при гидроксильной или аминогруппе, соответственно, непредельный остаток.
2. Мономер по 1, характеризующийся тем, что сахар представляет собой низкомолекулярное соединение класса углеводов, выбранное из группы, состоящей из моносахаридов и олигосахаридов.
3. Мономер по п. 2, характеризующийся тем, что сахар представляет собой соединение, выбранное из группы, состоящей из сахарозы, D-глюкозы, D- аллозы, D-альтрозы, D-маннозы, D-гулозы, D-идозы, D-талозы, D-фруктозы, D- рибозы, D-арабинозы, D-ксилозы, D-ликсозы, D-эритрулозы, D-рибулозы, D- ксилулозы, D-псикозы, D-сорбозы, D-магатозы или их дезоксианалога, или их аналога с L конфигурацией, или смеси изомеров с L и D конфигурациями.
4. Мономер по п. 1, характеризующийся тем, что аминосахар представляет собой природный или синтетический сахар, в котором одна или несколько гидроксильных групп заменены на аминогруппу.
5. Мономер по п. 4, характеризующийся тем, что аминосахар представляет собой соединение, выбранное из группы, состоящей из 2-aминo-2-дeзoкcи-D-глюкoзы, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-aллoзы, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-aльтpoзы, 2-aминo-2- дезокси-D-маннозы, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-гyлoзы, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-идoзы, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-тaлoзы, 2-aминo-2-дeзoкcи-D-гaлaктoзы, или их аналога с L-конфигурацией, или смеси изомеров с D и L конфигурацией.
6. Мономер по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве непредельного остатка используют группу, содержащую кратную связь, способную вступать в реакцию фото- или химически инициируемой полимеризации.
7. Мономер по 6, характеризующийся тем, что в качестве непредельного остатка используют метакрильную, акрильную, винильную, аллильную, A- винилбензоильную, или мeтилeн-4-фeнилeнвинильнyю группу.
8. Композиция (К) для получения низкопроцентного гидрогеля и/или гидрогеля с низким содержанием поперечных "сшивок", содержащая:
М-мономер по любому из пп. 1-7, составляющий основу формируемого геля; С-сшивающий агент; Р-растворитель .
9. Композиция по п. 8, характеризующаяся тем, что в качестве мономера (M) дополнительно используют, по меньшей мере, один другой непредельный мономер.
10. Композиция по п. 9, характеризующаяся тем, что в качестве указанного, по меньшей мере, одного другого непредельного мономера используют соединение, выбранное из группы, включающей метакриламид, акриламид, 2- гидроксиэтилметакрилат и 2-гидpoкcиэтилмeтaкpилaмид.
11. Композиция по п. 8, характеризующаяся тем, что в качестве сшивающего агента (С) используют, по меньшей мере, одно непредельное соединение, содержащее две и более кратных связи.
12. Композиция по п. 11, характеризующаяся тем, что в качестве указанного, по меньшей мере, одного непредельного соединения используют соединение, выбранное из группы, включающей ΛW-метиленбисакриламид, N,N'-(l,2- дигидpoкcиэтилeн)биcaкpилaмид, полиэтиленгликольдиакрилат.
13. Композиция по п. 8, характеризующаяся тем, что растворитель (P) представляет собой раствор органического и/или неорганического соединения.
14. Композиция по п. 13, характеризующаяся тем, что растворитель выбирают из группы, состоящей из водного раствора глицерина, сахара, бетаина, полиспирта; раствора глицерина, сахара, бетаина или полиспирта в диметилсульфоксиде (ДМСО); раствора глицерина, сахара, бетаина или полиспирта в диметилформамиде (ДМФА).
15. Композиция по п. 8, характеризующаяся тем, что она дополнительно содержит, по меньшей мере, один инициатор и/или промотор полимеризации (Инц).
16. Композиция по п. 15, характеризующаяся тем, что инициатор и/или промотор полимеризации представляет собой инициатор для химически инициируемой полимеризации и/или промотор для фотоинициированной полимеризации.
17. Композиция по п. 16, характеризующаяся тем, что, по меньшей мере, один инициатор и/или промотор полимеризации выбирают из группы, состоящей из персульфата аммония, персульфата калия, пероксида водорода, бензоилпероксида, азоизобутиронитрила (AEBN), метиленового синего, флуоресцеина, N,N,N',N'- тетраметилэтилендиамина, 4-(ΛζN-димeтилaминo)пиpидинa, триэтиламина и ацетона.
18. Композиция по п. 8, характеризующаяся тем, что она дополнительно содержит, по меньшей мере, один ингибитор полимеризации (Инг).
19. Композиция по п. 18, характеризующаяся тем, что указанный, по меньшей мере, один ингибитор полимеризации (Инг) представляет собой соединение, предотвращающие спонтанную полимеризацию.
20. Композиция по п. 19, характеризующаяся тем, что указанное, по меньшей мере, одно соединение, предотвращающее спонтанную полимерзизацию, представляет собой соединение, выбранное из группы, состоящей из и-бензохинона, о- нитрофенола, п-нитрофенола, нитробензола, о-динитробензола, м-динитробензола и п-динитробензола.
21. Композиция по п. 8, характеризующаяся тем, что она дополнительно содержит, по меньшей мере, один флуоресцентный краситель (Kp).
22. Композиция по п. 21, характеризующаяся тем, что в качестве указанного, по меньшей мере, одного красителя используют краситель, выбранный из группы, состоящей из Техаs Rеd, флуоресцеина, Cy 5, Cy 3, BODIPY.,
23. Композиция по любому из пп. 8-22, характеризующаяся тем, что она дополнительно содержит биологически значимое соединение (Б).
24. Композиция по п. 23, характеризующаяся тем, что биологически значимое соединение (Б) способно к иммобилизации в гидрогеле в момент его формирования.
25. Композиция по любому из пп. 23 и 24, характеризующаяся тем, что в качестве биологически значимого соединения композиция содержит, по меньшей мере, одно соединение, выбранное из группы, состоящей из олигонуклеотида, нуклеиновой кислоты, белка, олигосахарида, антитела или низкомолекулярного лиганда.
26. Гидрогель, представляющий собой низкопроцентный гидрогель и/или гидрогель с низким содержанием поперечных "сшивок", полученный путем фото- или химически индуцированной полимеризации композиции по любому из пп. 8-25.
27. Биочип, представляющий собой подложку с иммобилизованным на нем слоем гидрогеля по п. 26.
28. Биочип по п. 27, характеризующийся тем, что слой гидрогеля представляет собой сплошной слой.
29. Биочип по п. 27, характеризующийся тем, что слой гидрогеля разделен пустыми промежутками на ячейки.
30. Биочип по п. 29, характеризующийся тем, что ячейки образуют регулярную одномерную или двумерную структуру (массив).
31. Биочип по п. 27, характеризующийся тем, что слой геля содержит по меньшей мере одно иммобилизованное биологически значимое соединение.
32. Биочип по п. 31, характеризующийся тем, что иммобилизация по меньшей мере одного биологически значимого соединения в слое гидрогеля осуществляется в момент формирования гидрогеля при химически- и фотохимически инициированной полимеризации.
33. Биочип по п. 31, характеризующийся тем, что иммобилизация по меньшей мере одного биологически значимого соединения в слое гидрогеля осуществляется после того, как гидрогель сформирован.
34. Биочип по любому из пп. 29-33, характеризующийся тем, что каждая гидрогелевая ячейка биочипа содержит иммобилизованный флуоресцентный краситель.
PCT/RU2007/000196 2007-04-20 2007-04-20 Monomère et composition destinés à la réception d'hydrogel à faible pourcentage et/ou de l'hydrogel possédant une faible quantité de réticulations transversales, hydrogel et la biopuce basés sur cet hydrogel Ceased WO2008130263A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07834945A EP2149581A4 (en) 2007-04-20 2007-04-20 MONOMER AND COMPOSITION FOR PREPARING A LOW-PROPER HYDROGEL AND / OR A HYDROGEL WITH A LOW CROSS-LINKING CONTENT, HYDROGEL, AND BIOCHIP BASED THEREFROM
PCT/RU2007/000196 WO2008130263A1 (fr) 2007-04-20 2007-04-20 Monomère et composition destinés à la réception d'hydrogel à faible pourcentage et/ou de l'hydrogel possédant une faible quantité de réticulations transversales, hydrogel et la biopuce basés sur cet hydrogel

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2007/000196 WO2008130263A1 (fr) 2007-04-20 2007-04-20 Monomère et composition destinés à la réception d'hydrogel à faible pourcentage et/ou de l'hydrogel possédant une faible quantité de réticulations transversales, hydrogel et la biopuce basés sur cet hydrogel

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008130263A1 true WO2008130263A1 (fr) 2008-10-30

Family

ID=39875703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2007/000196 Ceased WO2008130263A1 (fr) 2007-04-20 2007-04-20 Monomère et composition destinés à la réception d'hydrogel à faible pourcentage et/ou de l'hydrogel possédant une faible quantité de réticulations transversales, hydrogel et la biopuce basés sur cet hydrogel

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP2149581A4 (ru)
WO (1) WO2008130263A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101864046B (zh) * 2010-06-11 2012-09-26 华南理工大学 氨基葡萄糖改性聚乙二醇双丙烯酸酯水凝胶及其制备方法与应用
DE102023136339A1 (de) * 2023-12-21 2025-06-26 Schott Technical Glass Solutions Gmbh Verfahren und Beschichtungssystem zur Immobilisierung von Biomolekülen

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2798053A (en) * 1952-09-03 1957-07-02 Goodrich Co B F Carboxylic polymers
WO1990011306A1 (en) * 1989-03-28 1990-10-04 Ciba-Geigy Ag Hydrogels based on sugar alcohol monomers
US5932711A (en) 1997-03-05 1999-08-03 Mosaic Technologies, Inc. Nucleic acid-containing polymerizable complex
RU2175972C2 (ru) 1999-12-28 2001-11-20 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа
RU2198686C2 (ru) * 1996-10-16 2003-02-20 Органогель Канада ЛТЕЕ Полимерный гидрогель акриламидного сополимера терапевтического применения и способ его получения
RU2206575C2 (ru) 2001-07-25 2003-06-20 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Композиция для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях, способ приготовления композиции, биочип, способ проведения пцр на биочипе
RU2216547C2 (ru) 2001-10-16 2003-11-20 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления
US6656725B2 (en) 2001-08-15 2003-12-02 The University Of Chicago Method of fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization
WO2005017180A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Immobilization of oligonucleotides and proteins in sugar-containing hydrogels

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2798053A (en) * 1952-09-03 1957-07-02 Goodrich Co B F Carboxylic polymers
WO1990011306A1 (en) * 1989-03-28 1990-10-04 Ciba-Geigy Ag Hydrogels based on sugar alcohol monomers
RU2198686C2 (ru) * 1996-10-16 2003-02-20 Органогель Канада ЛТЕЕ Полимерный гидрогель акриламидного сополимера терапевтического применения и способ его получения
US5932711A (en) 1997-03-05 1999-08-03 Mosaic Technologies, Inc. Nucleic acid-containing polymerizable complex
RU2175972C2 (ru) 1999-12-28 2001-11-20 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа
RU2206575C2 (ru) 2001-07-25 2003-06-20 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Композиция для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях, способ приготовления композиции, биочип, способ проведения пцр на биочипе
US6656725B2 (en) 2001-08-15 2003-12-02 The University Of Chicago Method of fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization
RU2216547C2 (ru) 2001-10-16 2003-11-20 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления
WO2005017180A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Immobilization of oligonucleotides and proteins in sugar-containing hydrogels

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIKHAILOVICH V. ET AL., J.CLIN. MICROBIOL., vol. 39, no. 7, 2001, pages 2531 - 40
See also references of EP2149581A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2149581A4 (en) 2010-04-14
EP2149581A1 (en) 2010-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6180770B1 (en) Nucleic acid-containing polymerizable complex
US6692912B1 (en) Nucleic acid-containing polymerizable complex
CN109734946B (zh) 无催化剂的表面官能化和聚合物接枝
RU2636465C2 (ru) Способ конъюгирования полимерной частицы
RU2216547C2 (ru) Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления
JP2007525571A (ja) 修飾分子アレイ
US20040241713A1 (en) Composition for immobilization of biological macromolecules in hydrogels, a method for preparing a composition, a biochip, and a method for performing the PCR over biochip
KR20140137366A (ko) 분석 적용용 고분자 스카폴드
WO2013147320A1 (ja) βグロビン遺伝子の変異を検出するためのマイクロアレイ及びその検出方法
JP2002531106A (ja) 不連続プライマ−伸長による核酸反復配列の長さ決定
US6255051B1 (en) Multiple sequential polynucleotide displacement reactions for signal amplification and processing
KR101272447B1 (ko) Ｄｎａ 사슬 신장방법, ｄｎａ 사슬 증폭방법 및 ｄｎａ사슬 신장용 마이크로어레이
JP2002060671A (ja) 新規コーティング樹脂板
US20060118754A1 (en) Stabilizing a polyelectrolyte multilayer
EP2149581A1 (en) Monomer and composition for producing low-percentage hydrogel and/or hydrogel having a low cross linkage content, a hydrogel and a biochip based thereon
US9267171B2 (en) DNA photolithography with cinnamate crosslinkers
CN1620515A (zh) 核酸的合成后标记及其用途
JP4534818B2 (ja) バイオマテリアル用高分子化合物およびそれを用いた高分子溶液
JP2001122892A (ja) 核酸固定化高分子ゲル及びその製造法
JP4916689B2 (ja) Ｄｎａ鎖増幅方法
JP2003248000A (ja) 生体高分子固定化担体を用いた分析方法、および生体高分子固定化担体
JP2001178460A (ja) 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ
JP2001136972A (ja) 核酸固定化高分子ゲル及びその製造方法
JP2003322650A (ja) 濃縮を利用した高感度検出技術
JP2007101185A (ja) ２種類以上の置換（メタ）アクリルアミド誘導体にプローブが固定されたゲル及びそれを用いたマイクロアレイ

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07834945

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007834945

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009134972

Country of ref document: RU