WO2009021347A1 - Verwendung von extrakten oder extraktivstoffen aus piper cubeba l. als wirksame bestandteile in einem medikament zur behandlung von krebserkrankungen - Google Patents

Verwendung von extrakten oder extraktivstoffen aus piper cubeba l. als wirksame bestandteile in einem medikament zur behandlung von krebserkrankungen Download PDF

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Matthias-Heinrich Kreuter
Jian Ying Yam
Karin BERGER-BÜTER
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Definitions

  • the present invention relates to the use of extracts or extractives from Piper cubeba L. as active ingredients in a medicament for the treatment of cancer.
  • the unripe fruit is used, from which also kubeben oil, the essential oil of the Kubeben, by steam distillation is obtained.
  • Oleum Cubebae is used in the same indications as the fruits.
  • Piper cubeba L. is used for flavoring liqueurs, ginger bread and honey bread.
  • the product is the essential oil extracted from the unripe fruit.
  • JP 2000-095649 A extracts are described, including from the kubeben fruit, by means of a hydrophilic solvent, for example Acetone, methanol and ethanol, or mixtures thereof with water. Such extracts thus contain both the essential oil and hydrophilic substances.
  • a hydrophilic solvent for example Acetone, methanol and ethanol, or mixtures thereof with water.
  • These extracts are also intended to treat benign prostatic hyperplasia.
  • the cubic extract inhibits 50% of the enzyme at a concentration of 0.79 mg / ml.
  • the fruits thus freed from the essential oil were additionally extracted with 90% aqueous ethanol in order to obtain medium polar extractives.
  • Both the recovered essential oil and the ethanolic secondary extract were then tested for their activities against tumor cells.
  • the recovered essential oil killed all the tumor cells tested. This indicates that the observed cytotoxic effect is nonspecific and thus does not represent an antitumor effect.
  • the ethanolic secondary extract did not directly kill any of the tumor cells tested, but did change their proliferation behavior in some tumor cells.
  • Such tumor cells have been found to be particularly sensitive to the ethanolic secondary extract, which requires sex hormones as growth factors for their growth.
  • examples include the breast cancer cell line MCF 7 and the prostate cancer cell line LnCAP. This observation leads to the conclusion that the antiproliferative effect can not be based primarily on an inhibition of testosterone 5 ⁇ -reductase, since this is insignificant for the growth of the breast cancer cell line MCF7.
  • This extract should be free or nearly free of cytotoxic essential oils.
  • This extract is said to inhibit the growth of, in particular, those tumor cells which require sex hormones as growth factors for their growth.
  • This extract should have anti-androgenic and / or anti-estrogenic effects.
  • This extract is intended to antagonize the effects of the sex hormone dihydrotestosterone, abbreviated to DHT, in particular its proliferation-enhancing and anti-apoptotic action on prostate cancer cells.
  • FIG. 1a shows the anti-proliferative effect of the extract prepared according to Example 1 on LNCap and PC-3 cells.
  • Figure Ib shows the anti-proliferative effect of the pure substance cubebin on LNCap and PC-3 cells.
  • Figure 2 shows the inhibition of DNA synthesis of LNCap cells by the extract prepared according to Example 1.
  • FIG. 3 shows the anti-androgenic effect of the extract prepared according to Example 1 on androgen-dependent cell proliferation on LNCap cells.
  • FIG. 4 shows the anti-androgenic effect of the extract prepared according to Example 1 on the DNA synthesis of LNCap cells.
  • FIG. 5 shows the anti-estrogenic effect of the extract prepared according to Example 1 on the DNA synthesis of MCF-7 cells.
  • FIG. 6a shows the inhibitory effect of the extract prepared according to Example 1 and the pure substance cubebin on the activity of 5 ⁇ -reductase type II.
  • FIG. 6b shows the inhibitory effect of the known 5 ⁇ -reductase inhibitor finasteride on the activity of 5 ⁇ -reductase type II.
  • FIG. 7a shows that TNF- ⁇ is the apoptosis of
  • FIG. 7b shows that the anti-apoptotic effect of DHT is abolished by the extract produced according to example 1.
  • FIG. 8 shows that both the extract prepared according to Example 1 and the pure substance cubebin inhibit the secretion of the prostate-specific antigen (PSA) as a function of the respective dose.
  • PSA prostate-specific antigen
  • FIG. 9 shows that the extract prepared according to Example 1 strongly inhibits the DHT-induced secretion of the prostate-specific antigen (PSA).
  • PSA prostate-specific antigen
  • FIG. 10 shows that the androgen receptor density in LNCap cells is increasingly reduced in a dose-dependent manner both by the treatment with the extract prepared according to Example 1 and by the treatment with the pure substance cubebin.
  • the following examples illustrate the present invention.
  • the thus treated fruits were extracted at a temperature between 20 0 C and 30 0 C for 2 hours with a mixture of 90 parts by weight of ethanol and 10 parts by weight of water with stirring.
  • the weight ratio of drug to extractant mixture was 1: 5.
  • This extract contains 20 m / m% of Cubebin, based on the dry matter content.
  • a liquid extract obtained according to Example 1 was metered into an evaporator at a temperature of 40 0 C, and the concentration was started under vacuum (300 mbar to 20 mbar) and elevated temperature (40 0 C to 55 ° C).
  • the remaining portion of the fluid extract was continuously added to the evaporator until the entire amount of the fluid extract was drawn in and reached a dry matter content of 30 to 40 m / m% in the resulting spissum extract.
  • spissum extract of dark brown color, free-flowing and of homogeneous consistency.
  • the spissum extract had a dry matter content of 36.5 m / m%, which corresponds to an extractive substance content of 7.3 g.
  • This concentrated spissum extract was mixed with 7.8 g of an aqueous 40 m / m% gum arabic solution and then mixed in a dryer under vacuum at a pressure of 150 mbar to 10 mbar and a temperature of 40 ° C. to 55 ° C. dried. This gave 10.4 g of dry ocher brown extract containing 30 m / m% of gum arabic as an excipient.
  • Example 1 derived liquid extract was metered into an evaporator at a temperature of 4O 0 C, and the evaporation was started under vacuum (300 mbar to 20 mbar) and elevated temperature (40 0 C to 55 ° C).
  • the remaining portion of the fluid extract was added continuously to the evaporator until the entire amount of the fluid extract was drawn in and reached a dry matter content of 10 to 20 m / m% in the resulting spissum extract.
  • spissum extract of dark brown color, free-flowing and of homogeneous consistency.
  • the spissum extract had a dry matter content of 15.7 m / m%, which corresponds to an extractive substance content of 7.3 g.
  • This low-viscosity spissum extract was mixed with 6.8 g medium-chain triglycerides (Ph. Eur.) And 0.5 g soy lecithin ( ⁇ AB 90) and added to an evaporator at a temperature of 40 ° C. The concentration of this mixture was carried out under vacuum (300 mbar to 40 mbar) and elevated temperature (40 0 C to 50 0 C) until a dry matter content of 10 to 80 m / m% was achieved in the resulting spissum extract.
  • this extract was added to LNCap and to PC-3 cells. The treated cells were cultured for 4 days in 10% FBS culture medium.
  • the pure lignan cubebin which is contained in the extract according to the invention prepared according to Example 1 to 20 m / m% of dry matter, was also added to LNCap and PC-3 cells.
  • the treated cells were cultured for 4 days in 10% FBS culture medium.
  • the inhibition is more pronounced in the LNCap cells than in the PC-3 cells.
  • the inhibitory effect of the extract P9605 prepared according to Example 1 is several times stronger than could be explained by its content of cubebin.
  • the extract contains only 20 m / m% of Cubebin, but has a similar (LNCap) or stronger inhibitory effect (PC-3).
  • the extract prepared according to the invention was added to LNCap cells.
  • the treated cells were cultured for 4 days in 10% FBS culture medium. Subsequently, the amount of built-in
  • the extract prepared according to the invention was added to LNCap cells.
  • the treated cells were cultured for 6 days in 10% CSS culture medium.
  • the extract prepared according to the invention over-regulates the stimulating effect of DHT on the cell proliferation of the tumor cells in a dose-dependent manner and, moreover, lowers the basal proliferation of the cells.
  • the extract prepared according to the invention was added to LNCap cells.
  • the treated cells were cultured for 6 days in 10% CSS culture medium.
  • the extract prepared according to the invention over-regulates the stimulating effect of DHT on the DNA synthesis of the tumor cells in a dose-dependent manner and, moreover, lowers the basal DNA synthesis of the cells.
  • MCF-7 cells were cultured for 3 days in 10% CSS culture medium to which different concentrations of estradiol had been added. This cultivation was carried out once without the addition of extract prepared according to the invention and once with the addition of 10 ⁇ g / ml of extract.
  • estradiol enhances the DNA synthesis of breast cancer cells; see the control value at zero.
  • the assay was performed with a homogenate of HEK293 cells expressing the 5 ⁇ -reductase type II overexpress (Reichert W., Hartmann RW and Jose J., 2001, Journal Enzyme Inhibition, Vol. 16, 47-53).
  • the influence of the extract prepared according to the invention and the pure substance cubebin on the activity of the 5 ⁇ -reductase type II was determined by determining the conversion of 3 H-testosterone to 3 H-DHT.
  • control substance used was the known 5 ⁇ -reductase inhibitor "finasteride”.
  • the inhibition is stronger in the extract than in the pure substance Cubebin.
  • the extract inhibits with an ICs O value of 3.6 ⁇ g / ml while the pure substance inhibits cubebin with an IC 50 value of 9.9 ⁇ g / ml.
  • Apoptosis of the cells was measured using a commercial apoptosis immunoassay kit specifically to detect the DNA and histone fragments present as mono- and oligonucleosomes.
  • TNF- ⁇ induces apoptosis of the tumor cells as a function of the dose.
  • PSA prostate-specific antigen
  • LNCap cells were cultured for 2 days in 10% CSS culture medium, to which different concentrations of either the extract prepared according to the invention or the pure substance cubobenzene were added.
  • the secreted PSA amount was measured in the cell supernatant by means of an immunoassay.
  • the amount of DNA was determined.
  • FIG. 8 shows the ratio of the amount of PSA to the amount of DNA in percent.
  • LNCap cells were cultured for 2 days in 10% CSS culture medium to which different concentrations of dihydrotestosterone, abbreviated to DHT, were added. This cultivation was carried out once without the addition of extract prepared according to the invention and once with the addition of 10 ⁇ g / ml of extract.
  • the secreted PSA amount was measured in the cell supernatant by means of an immunoassay.
  • the amount of DNA was determined.
  • FIG. 9 shows the ratio of the amount of PSA to the amount of DNA in percent.
  • LNCap cells were cultured for 2 days in 10% FBS culture medium, to which different concentrations of either the extract prepared according to the invention or the pure substance cubebin were added.
  • FIG. 10 shows the bands of the androgen receptor.
  • the androgen receptor density in LNCap cells is increasingly reduced in a dose-dependent manner both by the treatment with the extract prepared according to the invention and by the treatment with the pure substance Cubebin.
  • Tumor activity of the extracts prepared according to the invention and illustrate the mechanisms of action underlying the activity towards hormone-dependent tumor cells. These examples show the high therapeutic potential of the extracts prepared according to the invention, in particular for the treatment of malignant diseases whose progression is influenced by female or male sex hormones.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Trockenextraktes aus Früchten von Piper cubeba L., welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man in einem ersten Schritt die Früchte von Piper cubeba L. zur Entfernung der ätherischen Öle entweder einer Wasserdampfdestillation unterzieht und das Destillat entfernt oder wenigstens einmal mit einer lipophilen Phase extrahiert und diesen lipophilen Extrakt oder diese lipophilen Extrakte entfernt; in einem zweiten Schritt die so behandelten Früchte wenigstens einmal entweder mit wenigstens einem Alkohol oder mit einem Gemisch aus wenigstens einem Alkohol und Wasser extrahiert; und in einem dritten Schritt die extrahierten Fruchtteile entfernt, den so erhaltenen Extrakt nach der Zugabe eines Hilfsstoffes zuerst auf eine Konzentration an Alkohol zwischen 0,1 und 10 m/m % zu einem Spissumextrakt konzentriert, dann trocknet und gewinnt.

Description

Verwendung von Extrakten oder Extraktivstoffen aus Piper cubeba L. als wirksame Bestandteile in einem Medikament zur Behandlung von Krebserkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwen- düng von Extrakten oder Extraktivstoffen aus Piper cube- ba L. als wirksame Bestandteile in einem Medikament zur Behandlung von Krebserkrankungen.
Verwendungen von Piper cubeba L. Zubereitungen sind beispielsweise beschrieben in Hunnius, Pharmazeuti- sches Wörterbuch, 8. Auflage, 1998, Seiten 1084 bis 1085.
Hierin werden volkstümliche Anwendungen, wie die Behandlung von Kopfschmerzen sowie die Verwendung als Diuretikum, Harndesinfizienz und Stomachikum be- schrieben.
Als Droge wird die unreife Frucht verwendet, aus der auch Kubeben-Öl, das ätherische Öl der Kubeben, durch Wasserdampfdestillation gewonnen wird.
Oleum Cubebae wird in den gleichen Indikatio- nen wie die Früchte eingesetzt.
Gemäss J. Seidemann in "World Spiee Plants", Springer-Verlag, 2005, Seite 291 wird Piper cubeba L. zur Aromatisierung von Likören, Ingwerbrot und Honigbrot verwendet. Als Produkt dient das ätherische Öl, das aus der unreifen Frucht gewonnen wird.
In JP 2000-095649 A werden Extrakte beschrieben, unter anderem auch aus der Kubeben-Frucht, die mittels eines hydrophilen Lösungsmittels, beispielsweise Aceton, Methanol und Ethanol, oder deren Mischungen mit Wasser erhalten werden. Solche Extrakte enthalten somit sowohl das ätherische Öl als auch hydrophile Substanzen.
Diese Extrakte sollen als Testosteron-5α- Reduktasehemmer wirken. Dadurch sollen diese Extrakte den Haarwuchs positiv beeinflussen.
Diese Extrakte sollen auch zur Behandlung von benigner Prostatahyperplasie dienen.
In diesem Dokument werden in Tabelle 1 IC50- Werte aufgeführt, die sich auf die Hemmung der Testoste- ron-5α-Reduktase beziehen.
Der Extrakt aus Kubeben hemmt laut dieser Tabelle das Enzym zu 50% bei einer Konzentration von 0,79 mg/ml .
A. Chatterjee et.al., Jour. Indian Chem. Soc,
Vol. 45, No. 8, 1968, Seiten 723 bis 725 beschreibt die spektralen Eigenschaften der Reinsubstanz Cubebin. Diese chemische Verbindung wurde aus einem alkoholischen Extrakt der entfetteten Früchte von Piper cubeba L. iso- liert.
A. Dasgupta et.al., Quart. J. Crude Drug Res., 18, (1980), No. 1, Seiten 17 bis 25 beschreibt die Verwendung des ätherischen Öles von Piper cubeba L. zur Behandlung von beispielsweise Cystitis, und Gonorrhoe.
Eun-Mi Choi et. al., Journal of Ethnopharmaco- logy, Elsevier Scientific Publishers Ltd., 89, 2003, Seiten 171 bis 175 beschreibt entzündungshemmende Eigenschaften eines mit 80%-igem Methanol hergestellten Ex- traktes aus den getrockneten Früchten von Piper cubeba
L..
Im Rahmen eines Screening-Verfahrens wurde eine Reihe tropischer Arzneipflanzen auf ihre Wirkung ge- genüber Tumorzellen in vitro untersucht.
Völlig überraschend wurde gefunden, dass ein ethanolischer Extrakt aus unreifen Früchten von Kubeben alle getesteten Tumorzellen abtötete.
Da in erster Linie das ätherische Öl der Kube- ben-Früchte medizinisch verwendet wird, war es naheliegend, die Früchte mit einem geeigneten Extraktionsmittel zu extrahieren, um das ätherische Öl zu erhalten.
Dies wurde durch erschöpfende Extraktion mit Hexan realisiert.
Die so vom ätherischen Öl befreiten Früchte wurden der Vollständigkeit halber zusätzlich mit 90%- igem wässrigem Ethanol extrahiert, um mittelpolare Extraktivstoffe zu erhalten.
Sowohl das gewonnene ätherische Öl als auch der ethanolische Sekundärextrakt wurden anschliessend auf ihre Aktivitäten gegenüber Tumorzellen geprüft.
Es wurde wie erwartet festgestellt, dass das gewonnene ätherische Öl alle getesteten Tumorzellen abtötete. Dies deutet darauf hin, dass der beobachtete zy- totoxische Effekt unspezifischer Natur ist und damit keinen Antitumor-Effekt darstellt. Völlig überraschend wurde aber gefunden, dass der ethanolische Sekundärextrakt zwar keine der getesteten Tumorzellen direkt abtötete, aber bei einigen Tumorzellen deren Proliferationsverhalten veränderte.
Solche Tumorzellen erwiesen sich als besonders empfindlich gegenüber dem ethanolischen Sekundärextrakt, die für ihr Wachstum Sexualhormone als Wachstumsfaktoren benötigen. Als Beispiele seien die Brustkrebs-Zelllinie MCF 7 und die Prostatakrebs-Zelllinie LnCAP genannt. Diese Beobachtung lässt den Schluss zu, dass die proli- ferationshemmende Wirkung nicht primär auf einer Hemmung der Testosteron-5α-Reduktase beruhen kann, da diese für das Wachstum der Brustkrebs-Zelllinie MCF 7 unerheblich ist.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus Früchten von Piper cubeba L. zur Verfügung zu stellen.
Dieser Extrakt soll frei oder nahezu frei von zytotoxischen ätherischen Ölen sein.
Dieser Extrakt soll das Wachstum insbesondere von solchen Tumorzellen hemmen, die für ihr Wachstum Sexualhormone als Wachstumsfaktoren benötigen.
Dieser Extrakt soll anti-androgene und/oder anti-östrogene Wirkungen aufweisen.
Dieser Extrakt soll die Wirkungen des Sexualhormons Dihydrotestosteron, abgekürzt mit DHT, antagoni- sieren, insbesondere dessen proliferationssteigernde und anti-apoptotische Wirkung auf Prostatakrebszellen. Diese Ziele werden mit der vorliegenden Erfindung erreicht.
Die Erfindung ist durch die Merkmale in den unabhängigen Ansprüchen gekennzeichnet.
Bevorzugte Ausführungsformen werden in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Im folgenden Teil werden mögliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben..
Dabei wird auch Bezug auf die Figuren genom- men.
Figur Ia zeigt den anti-proliferativen Effekt des gemäss Beispiel 1 hergestellten Extraktes auf LNCap und PC-3 Zellen.
Figur Ib zeigt den anti-proliferativen Effekt der Reinsubstanz Cubebin auf LNCap und PC-3 Zellen.
Figur 2 zeigt die Hemmung der DNA-Synthese von LNCap Zellen durch den gemäss Beispiel 1 hergestellten Extrakt.
Figur 3 zeigt den anti-androgenen Effekt des gemäss Beispiel 1 hergestellten Extraktes auf die andro- gen-abhängige Zellproliferation auf LNCap Zellen.
Figur 4 zeigt den anti-androgenen Effekt des gemäss Beispiel 1 hergestellten Extraktes auf die DNA- Synthese von LNCap Zellen. Figur 5 zeigt den anti-östrogenen Effekt des gemäss Beispiel 1 hergestellten Extraktes auf die DNA- Synthese von MCF-7 Zellen.
Figur 6a zeigt den hemmenden Effekt des gemäss Beispiel 1 hergestellten Extraktes und der Reinsubstanz Cubebin auf die Aktivität der 5α-Reduktase Typ II.
Figur 6b zeigt den hemmenden Effekt des bekannten 5α-Reduktase-Inhibitors "Finasterid" auf die Aktivität der 5α-Reduktase Typ II.
Figur 7a zeigt, dass TNF-α die Apoptose der
Tumorzellen in Abhängigkeit von der Dosis induziert, und dass dieser Effekt durch DHT bei den Tumorzellen komplett aufgehoben wird.
Figur 7b zeigt, dass die anti-apoptotische Wirkung von DHT durch den gemäss Beispiel 1 hergestellten Extrakt aufgehoben wird.
Figur 8 zeigt, dass sowohl der gemäss Beispiel 1 hergestellte Extrakt als auch die Reinsubstanz Cubebin die Sekretion des Prostata-spezifischen Antigens (PSA) in Abhängigkeit von der jeweiligen Dosis hemmen.
Figur 9 zeigt, dass der gemäss Beispiel 1 hergestellte Extrakt die durch DHT induzierte Sekretion des Prostata-spezifischen Antigens (PSA) stark inhibiert.
Figur 10 zeigt, dass die Androgenrezeptor- Dichte in LNCap Zellen sowohl durch die Behandlung mit dem gemäss Beispiel 1 hergestellten Extrakt als auch durch die Behandlung mit der Reinsubstanz Cubebin dosisabhängig zunehmend reduziert wird. Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung.
Beispiel 1 (Herstellung eines Flüssig- Extraktes)
110 g unreife, getrocknete Früchte von Piper cubeba L. mit einer Mahlfeinheit von 0,1 mm bis 0, 9 mm wurden bei einer Temperatur zwischen 100C und 200C während 8 Stunden mit 0,5 Litern Hexan unter Rühren extrahiert. Die mit den aetherischen Ölen und hochlipophilen Stoffen beladene Hexanphase wurde anschliessend abgetrennt. Dieser Vorgang wurde nochmals durchgeführt, wobei die Extraktionszeit auf 2 Stunden begrenzt wurde.
Die so entölten Früchte wurden nun im Vakuumschrank bei einer Temperatur von 400C bis zur Gewichts- konstanz getrocknet. Man erhielt 92 g entöltes Drogenmaterial.
Anschliessend wurden die so behandelten Früchte bei einer Temperatur zwischen 200C und 300C während 2 Stunden mit einem Gemisch aus 90 Gewichtsteilen Ethanol und 10 Gewichtsteilen Wasser unter Rühren extrahiert.
Das Gewichtsverhältnis von Droge zu Extraktionsmittelgemisch betrug 1:5.
Die so extrahierte Droge wurde mittels Schichtenfiltration abgetrennt. Man erhielt 380 g dunkelbrau- nen Flüssigextrakt mit einem Trockensubstanzgehalt von 1,92 m/m %, entsprechend einer Extraktivstoffausbeute von 7,3 g absolut aus 92 g entölten Früchten. Dieser Extrakt wird im folgenden Teil mit P9605 bezeichnet.
Dieser Extrakt enthält 20 m/m % an Cubebin, bezogen auf den Trockensubstanzgehalt.
Beispiel 2 (Herstellung eines Trockenextraktes)
Ein gemäss Beispiel 1 gewonnener Flüssigextrakt wurde in einen Verdampfer bei einer Temperatur von 400C zudosiert, und die Einengung wurde unter Vakuum (300 mbar bis 20 mbar) und erhöhter Temperatur (400C bis 55°C) gestartet.
Während der Destillation wurde der verbleibende Teil des Fluidextraktes kontinuierlich in den Verdampfer so lange zudosiert, bis die gesamte Menge des Fluidextraktes eingezogen und bis im erhaltenen Spissu- mextrakt ein Trockensubstanzgehalt von 30 bis 40 m/m % erreicht war.
Man erhielt 20,0 g Spissumextrakt von dunkelbrauner Farbe, freifliessend und von homogener Konsis- tenz. Der Spissumextrakt wies einen Trockensubstanzgehalt von 36,5 m/m % auf, was einem Extraktivstoffgehalt von 7,3 g entspricht.
Dieser konzentrierte Spissumextrakt wurde mit 7,8 g einer wässrigen 40 m/m % Gummi arabicum Lösung ho- mögen vermischt und anschliessend in einem Trockner unter Vakuum bei einem Druck von 150 mbar bis 10 mbar und einer Temperatur von 40°C bis 55°C getrocknet. Man erhielt 10,4 g an ockerbraunem Trockenextrakt mit einem Gehalt an 30 m/m % an Gummi arabicum als Hilfsstoff .
Beispiel 3 (Herstellung einer Trockenextrakt- Ölsuspension)
Ein gemäss Beispiel 1 gewonnener Flüssigextrakt wurde in einen Verdampfer bei einer Temperatur von 4O0C zudosiert, und die Einengung wurde unter Vakuum (300 mbar bis 20 mbar) und erhöhter Temperatur (400C bis 55°C) gestartet.
Während der Destillation wurde der verbleibende Teil des Fluidextraktes kontinuierlich in den Verdampfer so lange zudosiert, bis die gesamte Menge des Fluidextraktes eingezogen und bis im erhaltenen Spissu- mextrakt ein Trockensubstanzgehalt von 10 bis 20 m/m % erreicht war.
Man erhielt 54,0 g Spissumextrakt von dunkelbrauner Farbe, freifliessend und von homogener Konsistenz. Der Spissumextrakt wies einen Trockensubstanzge- halt von 15,7 m/m % auf, was einem Extraktivstoffgehalt von 7,3 g entspricht.
Dieser dünnflüssige Spissumextrakt wurde mit 6,8 g Mittelkettiger Triglyceride (Ph. Eur.) und 0,5 g Soja-Lecithin (ÖAB 90) vermischt und in einen Verdampfer bei einer Temperatur von 400C zudosiert. Die Einengung dieses Gemisches wurde unter Vakuum (300 mbar bis 40 mbar) und erhöhter Temperatur (400C bis 500C) so lange durchgeführt, bis im erhaltenen Spissumextrakt ein Trockensubstanzgehalt von 10 bis 80 m/m % erreicht war. Man erhielt einen dickflüssigen Spissu- mextrakt, der anschliessend in einem Trockner unter Vakuum bei einem Druck von 150 mbar bis 10 mbar und einer Temperatur von 400C bis 55°C getrocknet wurde, bis ein Trockensubstanzgehalt von 99,5 m/m % erreicht war.
Man erhielt 14,9 g an dunkelbrauner Trockenex- trakt-Ölsuspension mit einem Gehalt an 49 m/m % an Mit- telkettigen Triglyceriden und 3,36 m/m % Soja-Lecithin als Hilfsstoffe.
Beispiel 4 (Hemmung der Zeilproliferation)
Mit dem gemäss Beispiel 1 hergestellten Flüssigextrakt P9605 wurden Zellproliferationstests durchgeführt. Als Kontrolle wurde ein typischer Inhaltsstoff der Kubeben-Früchte, das Lignan Cubebin, mitgeführt.
Zur Messung der Hemmung der Zeilproliferation wurde dieser Extrakt zu LNCap und zu PC-3 Zellen zugegeben. Die so behandelten Zellen wurden während 4 Tagen in 10% FBS Kulturmedium kultiviert.
Zum Vergleich wurde das reine Lignan Cubebin, das im erfindungsgemäss hergestellten Extrakt gemäss Beispiel 1 zu 20 m/m % der Trockenmasse enthalten ist, ebenfalls zu LNCap und zu PC-3 Zellen zugegeben. Die so behandelten Zellen wurden während 4 Tagen in 10% FBS Kulturmedium kultiviert.
Dabei wurde gemäss T. Lindl, Zell- und Gewebekultur, 4. überarbeitete Auflage, 2000, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg vorgegangen. Alle erhaltenen Daten sind in Prozent zur Lösungsmittelkontrolle (Test ohne Extrakt und ohne Cube- bin) angegeben; es sind die Mittelwerte mit Standardabweichungen aus 4 Experimenten mit 3-facher Wiederholung angegeben.
Aus den in den Figuren Ia und Ib gezeigten Daten ist ersichtlich, dass sowohl der erfindungsgemäss hergestellte Extrakt als auch die Reinsubstanz Cubebin einen anti-proliferativen Effekt sowohl bei LNCap als auch PC-3 Zellen in Abhängigkeit von der jeweiligen Dosis zeigen.
Die Hemmung ist bei den LNCap-Zellen stärker ausgeprägt als bei den PC-3 Zellen.
Wie aus den Figuren Ia und Ib ersichtlich ist, ist die Hemmwirkung des gemäss Beispiel 1 hergestellten Extraktes P9605 um ein Mehrfaches stärker als dies durch seinen Gehalt an Cubebin erklärbar wäre. Der Extrakt enthält lediglich 20 m/m % an Cubebin, weist aber eine gleichstarke (LNCap) oder stärkere Hemmwirkung (PC-3) auf.
Beispiel 5 (Hemmung der DNA Synthese)
Mit dem gemäss Beispiel 1 hergestellten Flüssigextrakt P9605 wurden DNA-Synthesetests durchgeführt.
Zur Messung der Hemmung der DNA Synthese wurde der erfindungsgemäss hergestellte Extrakt zu LNCap Zellen zugegeben. Die so behandelten Zellen wurden während 4 Tagen in 10% FBS Kulturmedium kultiviert. Anschliessend wurde die Menge an eingebautem
3H-Thymidin gemessen.
Dabei wurde gemäss T. Lindl, Zell- und Gewebekultur, 4. überarbeitete Auflage, 2000, Spektrum Akade- mischer Verlag, Heidelberg vorgegangen.
Alle erhaltenen Daten sind in Prozent zur Lösungsmittelkontrolle (Test ohne Extrakt) angegeben; es sind die Mittelwerte mit Standardabweichungen aus 4 Experimenten mit 3-facher Wiederholung angegeben.
Aus den in Figur 2 gezeigten Daten ist ersichtlich, dass der erfindungsgemäss hergestellte Extrakt die DNA-Synthese in Abhängigkeit der jeweiligen Dosis hemmt.
Beispiel 6 (Anti-androgener Effekt auf die Zeilproliferation)
Der anti-androgene Effekt auf die androgenabhängige Zeilproliferation des gemäss Beispiel 1 hergestellten Flüssigextraktes P9605 wurde bestimmt.
Dabei wurde der erfindungsgemäss hergestellte Extrakt zu LNCap Zellen zugegeben. Die so behandelten Zellen wurden während 6 Tagen in 10% CSS Kulturmedium kultiviert.
Diese Kultivierung erfolgte einmal ohne die Hinzugabe von Dihydrotestosteron, abgekürzt mit DHT, und einmal mit der Hinzugabe von 1 nM DHT. Anschliessend wurde der Einfluss des erfin- dungsgemäss hergestellten Extraktes auf die Zellprolife- ration der Tumorzellen anhand des DNA-Gehaltes bestimmt.
Alle erhaltenen Daten sind in Prozent zur Lö- sungsmittelkontrolle (Test ohne Extrakt) angegeben; es sind die Mittelwerte mit Standardabweichungen aus 4 Experimenten mit 3-facher Wiederholung angegeben.
Aus den in Figur 3 gezeigten Daten ist ersichtlich, dass der erfindungsgemäss hergestellte Ex- trakt den stimulierenden Effekt von DHT auf die Zellpro- liferation der Tumorzellen dosisabhängig übersteuert und darüber hinaus die basale Proliferation der Zellen absenkt .
Es ist bekannt, dass DHT die Zeilproliferation steigert; siehe den Kontrollwert bei null.
Beispiel 7 (Anti-androgener Effekt auf die DNA-Synthese)
Der anti-androgene Effekt auf die DNA-Synthese des gemäss Beispiel 1 hergestellten Flüssigextraktes P9605 wurde bestimmt.
Dabei wurde der erfindungsgemäss hergestellte Extrakt zu LNCap Zellen zugegeben. Die so behandelten Zellen wurden während 6 Tagen in 10% CSS Kulturmedium kultiviert .
Diese Kultivierung erfolgte einmal ohne die
Hinzugabe von Dihydrotestosteron, abgekürzt mit DHT, und einmal mit der Hinzugabe von 1 nM DHT. Anschliessend wurde die Menge an eingebautem 3H-Thymidin gemessen.
Dabei wurde gemäss T. Lindl, Zell- und Gewebekultur, 4. überarbeitete Auflage, 2000, Spektrum Akade- mischer Verlag, Heidelberg vorgegangen.
Alle erhaltenen Daten sind in Prozent zur Lösungsmittelkontrolle (Test ohne Extrakt) angegeben; es sind die Mittelwerte mit Standardabweichungen aus 4 Experimenten mit 3-facher Wiederholung angegeben.
Aus den in Figur 4 gezeigten Daten ist ersichtlich, dass der erfindungsgemäss hergestellte Extrakt den stimulierenden Effekt von DHT auf die DNA- Synthese der Tumorzellen dosisabhängig übersteuert und darüber hinaus die basale DNA-Synthese der Zellen ab- senkt.
Es ist bekannt, dass DHT die DNA-Synthese steigert; siehe den Kontrollwert bei null.
Beispiel 8 (Anti-östrogener Effekt auf die DNA-Synthese von Brustkrebszellen)
Der anti-östrogene Effekt auf die DNA-Synthese von Brustkrebszellen des gemäss Beispiel 1 hergestellten Flüssigextraktes P9605 wurde bestimmt.
Dabei wurden MCF-7 Zellen während 3 Tagen in 10% CSS Kulturmedium, welchem unterschiedliche Konzent- rationen von Östradiol zugegeben wurden, kultiviert. Diese Kultivierung erfolgte einmal ohne die Hinzugabe von erfindungsgemäss hergestelltem Extrakt und einmal mit der Hinzugabe von 10 μg/ml an Extrakt.
Anschliessend wurde die Menge an eingebautem 3H-Thymidin gemessen.
Dabei wurde gemäss T. Lindl, Zell- und Gewebekultur, 4. überarbeitete Auflage, 2000, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg vorgegangen.
Alle erhaltenen Daten sind in DPM (radioakti- ver Zerfall pro Minute; degradation per minute) angegeben; es sind die Mittelwerte mit Standardabweichungen aus 4 Experimenten mit 3-facher Wiederholung angegeben.
Aus den in Figur 5 gezeigten Daten ist ersichtlich, dass der erfindungsgemäss hergestellte Ex- trakt die Stimulation der DNA-Synthese von Brustkrebszellen durch Östradiol komplett oder nahezu komplett unterbindet.
Es ist bekannt, dass Östradiol die DNA- Synthese von Brustkrebszellen steigert; siehe den Kon- trollwert bei null.
Beispiel 9 (Inhibition der 5α-Reduktase Typ II Aktivität)
Die Inhibition der 5α-Reduktase Typ II Aktivität mittels des gemäss Beispiel 1 hergestellten Flüssig- extraktes P9605 wurde bestimmt.
Der Assay wurde mit einem Homogenat aus HEK293 Zellen durchgeführt, welche die 5α-Reduktase Typ II überexprimieren (Reichert W., Hartmann R.W. und Jose J.; 2001, Journal Enzyme Inhibition, Vol. 16, 47-53).
Der Einfluss des erfindungsgemäss hergestellten Extraktes und der Reinsubstanz Cubebin auf die Akti- vität der 5α-Reduktase Typ II wurde mittels der Bestimmung der Umwandlung von 3H-Testosteron zu 3H-DHT bestimmt.
Als Kontrollsubstanz diente der bekannte 5α- Reduktase-Inhibitor "Finasterid" .
Alle erhaltenen Daten sind in Prozent zur Lösungsmittelkontrolle (Test ohne Extrakt) angegeben; es sind die Mittelwerte mit Standardabweichungen aus 4 Experimenten mit 3-facher Wiederholung angegeben.
Aus den in Figur 6a gezeigten Daten ist er- sichtlich, dass sowohl der erfindungsgemäss hergestellte Extrakt als auch die Reinsubstanz Cubebin einen hemmenden Effekt auf die Aktivität der 5α-Reduktase Typ II zeigen.
Die Hemmung ist beim Extrakt stärker als bei der Reinsubstanz Cubebin.
Der Extrakt hemmt mit einem ICsO-Wert von 3,6 μg/ml, währenddem die Reinsubstanz Cubebin mit einem ICso-Wert von 9,9 μg/ml hemmt.
Der Verlauf der Dosis-Wirkungskurve des Ex- traktes und der Reinsubstanz Cubebin sind analog zum Verlauf der Dosis-Wirkungskurve des bekannten 5α- Reduktase-Inhibitors "Finasterid" (Figur 6b) . Beispiel 10 (Steigerung von Apoptose)
Die Induktion von Apoptose mittels des gemäss Beispiel 1 hergestellten Flüssigextraktes P9605 wurde bestimmt .
Als Vorversuch wurde zur Messung der Induktion der Apoptose der Tumor-Nekrose-Faktor TNF-α alleine sowie in Kombination mit 100 nM Dihydrotestosteron, abgekürzt mit DHT, zu LNCap Zellen zugegeben. Die so behandelten Zellen wurden während 2 Tagen in 10% FBS Kultur- medium kultiviert.
Die Apoptose der Zellen wurde mittels Anwendung eines kommerziellen Apoptose-Immuno-Assay-Kits gemessen, bei dem spezifisch die DNA- und Histon- Fragmente, die als Mono- und Oligonucleosome vorliegen, detektiert werden.
Aus den in Figur 7a gezeigten Daten ist ersichtlich, dass TNF-α die Apoptose der Tumorzellen in Abhängigkeit von der Dosis induziert.
Dieser Effekt wird durch DHT bei den Tumorzel- len komplett oder nahezu komplett aufgehoben.
Analoge Versuche wurden mit DHT alleine sowie in Kombination mit 10 μg/ml des erfindungsgemäss hergestellten Extraktes durchgeführt.
Aus den in Figur 7b gezeigten Daten ist er- sichtlich, dass die anti-apoptotische Wirkung von DHT durch den erfindungsgemäss hergestellten Extrakt aufgehoben wird. Beispiel 11 (Inhibition der Sekretion des Prostata-spezifischen Antigens)
Die Inhibition des Prostata-spezifischen Antigens (PSA) mittels des gemäss Beispiel 1 hergestellten Flüssigextraktes P9605 wurde bestimmt.
Dabei wurden in einem Versuch LNCap Zellen während 2 Tagen in 10% CSS Kulturmedium, welchem unterschiedliche Konzentrationen entweder des erfindungsge- mäss hergestellten Extraktes oder der Reinsubstanz Cube- bin zugegeben wurden, kultiviert.
Anschliessend wurde die sekretierte PSA Menge im Zellüberstand mittels eines Immuno-Assays gemessen. Zusätzlich wurde die DNA-Menge bestimmt.
In Figur 8 wird das Verhältnis der Menge PSA zur Menge DNA in Prozent angegeben.
Es sind die Mittelwerte mit Standardabweichungen aus 4 Experimenten mit 3-facher Wiederholung angegeben.
Aus den in Figur 8 gezeigten Daten ist er- sichtlich, dass sowohl der Extrakt als auch die Reinsubstanz Cubebin die Sekretion des Prostata-spezifischen Antigens (PSA) in Abhängigkeit von der jeweiligen Dosis hemmen .
In einem zweiten Versuch wurden LNCap Zellen während 2 Tagen in 10% CSS Kulturmedium, welchem unterschiedliche Konzentrationen von Dihydrotestosteron, abgekürzt mit DHT, zugegeben wurden, kultiviert. Diese Kultivierung erfolgte einmal ohne die Hinzugabe von erfindungsgemäss hergestelltem Extrakt und einmal mit der Hinzugabe von 10 μg/ml an Extrakt.
Anschliessend wurde die sekretierte PSA Menge im Zeilüberstand mittels eines Immuno-Assays gemessen. Zusätzlich wurde die DNA-Menge bestimmt.
In Figur 9 wird das Verhältnis der Menge PSA zur Menge DNA in Prozent angegeben.
Es sind die Mittelwerte mit Standardabweichun- gen aus 4 Experimenten mit 3-facher Wiederholung angegeben.
Aus den in Figur 9 gezeigten Daten ist ersichtlich, dass die durch DHT induzierte Sekretion des Prostata-spezifischen Antigens (PSA) durch den erfin- dungsgemäss hergestellten Extrakt stark inhibiert wird.
Beispiel 12 (Bildung von Androgenrezeptoren)
Die Beeinflussung der Bildung von Antrogenre- zeptoren mittels des gemäss Beispiel 1 hergestellten Flüssigextraktes P9605 wurde bestimmt.
Dabei wurden in einem Versuch LNCap Zellen während 2 Tagen in 10% FBS Kulturmedium, welchem unterschiedliche Konzentrationen entweder des erfindungsgemäss hergestellten Extraktes oder der Reinsubstanz Cube- bin zugegeben wurden, kultiviert.
Anschliessend wurde die Änderung der Androgen- rezeptor-Menge mittels Westernblot Analyse bestimmt. In Figur 10 sind die Banden des Androgenrezep- tors gezeigt.
Die Androgenrezeptor-Dichte in LNCap Zellen wird sowohl durch die Behandlung mit dem erfindungsge- mäss hergestellten Extrakt als auch durch die Behandlung mit der Reinsubstanz Cubebin dosisabhängig zunehmend reduziert.
Schlussfolgerungen
Anhand der Beispiele 1 bis 3 wird aufgezeigt, durch welche Kombinationen von Verfahrensschritten sich Extrakte aus Kubeben-Früchten herstellen lassen, die frei oder nahezu frei von aetherischem Öl sind, neue Eigenschaften aufweisen und die Ziele der vorliegenden Erfindung erreichen.
Die Beispiele 4 bis 12 demonstrieren die Anti-
_ tumoraktivität der erfindungsgemäss hergestellten Extrakte und illustrieren die Wirkmechanismen, die der Aktivität gegenüber hormonabhängigen Tumorzellen zugrunde liegen. Diese Beispiele zeigen das hohe therapeutische Potenzial der erfindungsgemäss hergestellten Extrakte, insbesondere zur Therapie von malignen Erkrankungen, deren Progression von weiblichen oder männlichen Sexualhormonen beeinflusst wird.
Betrachtet man die Wirkstärke (IC50: 3,6 μg/ml) der erfindungsgemäss hergestellten Extrakte gegenüber der humanen 5α-Reduktase im Vergleich zu der in JP 2000- 095649 A (IC50: 790 μg/ml) angeführten Aktivität, so zeigt sich, dass die erfindungsgemäss hergestellten Extrakte eine etwa 200-fach höhere Aktivität aufweisen und somit auch für die Behandlung der Prostatahyperplasie vollkommen neue Möglichkeiten eröffnen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Trockenextraktes aus Früchten von Piper cubeba L. ,
dadurch gekennzeichnet, dass man
- in einem ersten Schritt die Früchte von Piper cubeba L, zur Entfernung der ätherischen Öle entweder
- einer Wasserdampfdestillation unterzieht und das Destillat entfernt oder
— wenigstens einmal mit einer lipophilen Phase extrahiert und diesen lipophilen Extrakt oder diese lipophilen Extrakte entfernt,
- in einem zweiten Schritt die so behandelten Früchte wenigstens einmal entweder mit wenigstens einem Alkohol oder mit einem Gemisch aus wenigstens einem Alkohol und Wasser extrahiert, und
- in einem dritten Schritt die extrahierten Fruchtteile entfernt, den so erhaltenen Extrakt nach der Zugabe eines Hilfsstoffes zuerst auf eine Konzentration an Alkohol zwischen 0,1 und 10 m/m % zu einem Spissu- mextrakt konzentriert, dann trocknet und gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die unreifen Früchte von Piper cubeba L. verwendet werden, und unmittelbar vor der Extraktion ge- mahlen und in gemahlener Form extrahiert werden, insbesondere mit einer Mahlfeinheit von 0,1 mm bis 0,9 mm.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass im ersten Schritt als Ii- pophile Phase entweder überkritisches CO2 oder ein gerader oder verzweigter Kohlenwasserstoff mit 4 bis 9 Koh- lenstoffatomen, insbesondere Hexan oder Isopentan, verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass im ersten Schritt pro Gewichtsteil zu extrahierende Früchte von 1 bis 20 Ge- wichtsteile, insbesondere von 6 bis 12 Gewichtsteile, an lipophiler Phase eingesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass im ersten Schritt die Extraktion mit der lipophilen Phase bei einer Temperatur von 00C bis 500C, insbesondere von 5°C bis 15°C, und während einer Zeit von 2 bis 4 Stunden erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass im zweiten Schritt der Alkohol ein Alkohol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist, insbesondere Ethanol, und dass das Gemisch aus wenigstens einem Alkohol und Wasser aus 50 bis 90 m/m % Alkohol und 50 bis 10 m/m % Wasser, vorzugsweise aus 80 bis 90 m/m % Alkohol und 20 bis 10 m/m % Wasser, besteht, wobei Ethanol bevorzugt ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass im zweiten Schritt pro Gewichtsteil zu extrahierende Früchte von 1 bis 20 Gewichtsteile, insbesondere von 6 bis 12 Gewichtsteile, an wenigstens einem Alkohol oder einem Gemisch aus wenigs- tens einem Alkohol und Wasser eingesetzt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass im zweiten Schritt die Extraktion mit wenigstens einem Alkohol oder mit einem Gemisch aus wenigstens einem Alkohol und Wasser bei einer Temperatur von 200C bis 600C und während einer Zeit von 2 bis 4 Stunden erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der im dritten Schritt verwendete Hilfsstoffes ein Trocknungshilfsstoff ist, bei- spielsweise Mannitol, und dass auf eine Konzentration an Alkohol von 5 m/m % konzentriert wird, und dass die Trocknung durch Sprühtrocknung, Bandtrocknung oder Schaufeltrocknung erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der im dritten Schritt erhaltene Extrakt frei oder nahezu frei von α-Cubeben (α-cubebene) und ß-Cubeben (ß-cubebene) ist.
11. Verwendung von Extrakten oder Extraktivstoffen aus Piper cubeba L. , wobei diese Extrakte oder diese Extraktivstoffe anti-androgene und/oder antiÖstrogene Wirkungen aufweisen, als wirksame Bestandteile in einem Medikament zur Behandlung wenigstens einer Krankheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Krebserkrankungen, insbesondere Prostatakrebs, Hoden- krebs, Brustkrebs, Gebärmutterkrebs, einschliesslich deren Metastasen.
12. Verwendung eines Extraktes, welcher gemäss dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 erhalten worden ist, als wirksamer Bestandteil in einem Medika- ment zur Behandlung wenigstens einer Krankheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Krebserkrankungen, insbesondere Prostatakrebs, Hodenkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterkrebs, einschliesslich deren Metastasen, und benigner Prostatahyperplasie.
13. Verwendung eines Extraktes, welcher gemäss dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 erhalten worden ist, wobei dieser Extrakt die Wirkungen des Sexualhormons Dihydrotestosteron, abgekürzt mit DHT, antago- nisiert, insbesondere dessen proliferationssteigernde und anti-apoptotische Wirkung auf Prostatakrebszellen, als wirksamer Bestandteil in einem Medikament zur Behandlung von Prostatakrebs, einschliesslich dessen Metastasen, oder von benigner Prostatahyperplasie.
14. Medikament zur Behandlung wenigstens einer Krankheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Krebserkrankungen, insbesondere Prostatakrebs, Hodenkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterkrebs, einschliesslich deren Metastasen, und benigner Prostatahyperplasie, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Extrakt oder Extraktivstoffe aus Piper cubeba L. als wirksame Bestandteile enthält, wobei dieser Extrakt oder diese Extraktivstoffe anti-androgene und/oder anti-östrogene Wirkungen aufweisen.
15. Medikament nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die wirksamen Bestandteile in einem Extrakt enthalten sind, welcher gemäss dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 erhalten worden ist.
16. Verwendung eines Extraktes, welcher gemäss dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 erhalten worden ist, wobei dieser Extrakt die Wirkungen des Sexu- alhormons Dihydrotestosteron, abgekürzt mit DHT, antago- nisiert, insbesondere dessen proliferationssteigernde und anti-apoptotische Wirkung auf Prostatakrebszellen, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Prostatakrebs, einschliesslich dessen Metastasen, oder von benigner Prostatahyperplasie.
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